KR20080063280A - 다수의 세포 이하의 성분을 검출하고 정량화하는 방법 - Google Patents

다수의 세포 이하의 성분을 검출하고 정량화하는 방법 Download PDF

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KR20080063280A
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Abstract

세포 샘플로부터 다수의 특정한 형광 신호를 검출 및 정량화하는 방법이 제공된다. 그 방법은 면역 조직 화학 및 형광 면역염색 보합 기술을 결합한다. 그 방법은 염색체 및 단백질과 같은 세포의 특정한 세포 이하의 성분을 확인하는 데 사용된다.
형광 면역염색 보합 기술, 유전자 타겟팅, 핵산 탐침, 휘도 히스토그램

Description

다수의 세포 이하의 성분을 검출하고 정량화하는 방법{METHOD FOR DETECTING AND QUANTITATING MULTIPLE SUBCELLULAR COMPONENTS}
관련 출원의 참조
본 출원은 2005년 9월 22일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 11/233,200에 대한 우선권을 주장하며, 이 출원은 2002년 5월 17일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 10/130,559의 일부 계속 출원이며, 일부 계속 출원은 1999년 11월 18일자로 출원된 PCT/US99/27608(WO01/37192)의 국내 단계 출원이며, 그리고 2004년 9월 22일자로 출원된 미국 가특허 출원 시리얼 번호 60/612,067의 이점을 주장하며, 이의 개시내용은 본 개시내용에 상반되지 않는 범위까지 그 전체로서 여기서 참조로써 포함된다.
본 발명은 면역염색법(immunostaining) 및 형광-라벨된 동소 보합법(fluorescence-labeled in situ hybridization technique)을 사용해서 다수의 세포 이하의 성분을 검출하고 정량화하는 방법에 관한 것이다. 특히, 면역 염색에 동소 보합을 결합함에 의해 모계 혈액 샘플에서 태아의 헤모글로빈과 같은 세포내의 세포 이하의 성분을 검출할 수 있다. 그 방법은 유전자 질병의 태아기 및/또는 착상전 진단에 유용하다.
세포 및 그 성분을 염색 및 분석하는 다수의 기술이 존재한다. 다수의 그런 기술을 동시에 적용하는 능력은 특별히 관심있는 유전자 질병의 진단에서 표본을 상세하게 검사하는 데 매우 유리하다. 그러나, 어떠한 종래 기술의 결합도 단독으로 사용된 하나의 기술보다 장점을 갖지 못한다. 특별히 관심있는 것 중에서, 예를 들어, 면역염색법 및 형광 동소 보합법(fluorescent in situ hybridization; FISH) 분석을 생물학적인 표본에 동시 적용하는 능력은 전위도(potntial)를 제공하여 예를 들어, 동일 세포의 특정한 단백질 및 핵산 성분의 정량 데이터를 동시에 얻는다. 그러나, 종래 또는 표준의 면역염색법 및 FISH 프로토콜은 서로 배타적이다. 성공적인 FISH 분석에 요구되는 엄격한 조건은, 일반적으로 중요한 인식가능한 항원의 체류(retention)에 적합하지 않거나 세포 성분을 알맞게 검출하기 위한 안정된 항체 기반 신호의 유지에 적합하지 않다는 것이다. 그러므로, 유전자 타겟팅을 시각화 및 정량 기술과 함께 사용하는 유전자 질병의 진단에서 더 우수한 기술을 개발할 필요성이 대두 되었다.
본 발명의 요약
본 출원에서 면역 염색법 및 동소 보합 분석용의 생물학적 샘플을 준비하는 단일 연속 방법이 제공된다.
일 실시형태에서, 세포내에서 다수의 세포 성분을 확인하는 방법이 제공되며, 이 방법은,
세포 샘플을 적어도 하나의 항체와 반응시키며, 여기서 각각의 항체는 특정한 세포 성분과 결합하고 특정한 형광 신호를 발생시키는 단계;
상기 세포 샘플을 하나 이상의 핵산 탐침을 사용해서 동소 보합에 의해 처리하며, 여기서 각각의 핵산 탐침은 상기 세포내에서 타겟 핵산 시퀀스와 보합하도록 구성되고 특정한 형광 신호를 발생시키는 단계;
상기 반응되고 처리된 세포 샘플의 하나 이상의 이미지를 발생시키는 단계; 및
상기 이미지(들)에서 상기 항체 및 상기 핵산 탐침 모두에 대응하는 형광 신호를 검출 및 분석하는 단계를 포함한다.
첨부 도면에서 같은 도면 부호는 같은 구성요소를 나타낸다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태의 방법을 요약한 흐름도.
도 2는 본 발명의 한 양태의 일 실시형태에서 사용된 분석 시스템의 블럭도.
도 3은 제 1신호를 검출하는 스테이지Ⅰ의 흐름도.
도 4a 및 4b는 그 제 1신호를 검출하는 스테이지Ⅱ의 흐름도.
도 5는 제 2신호 검출의 흐름도.
도 6은, 연속 스미어(smear) 기술을 사용해서, 본 발명의 일 실시형태를 예시하는 장치를 변형시킨 개략도.
도 7은 본 발명의 한 양태의 일 실시형태에서 사용된 분석 및 반응물 분배 시스템의 블럭도.
도 8은 다수 대물렌즈 현미경 시스템(multiple objective microscopy system)에서 본 발명의 일 실시형태의 아웃라인도시도.
도 9는 이미지 "합성" 방법의 도시도.
도 10은 본 발명의 일 실시형태에서 조정 단계의 흐름도.
도 11은 본 발명의 일 실시형태의 선처리 단계의 흐름도.
도 12a 및 12b는 본 발명의 일 실시형태의 주요 처리 단계의 흐름도.
도 13는 세포내에서 FISH를 사용해서 X 및 Y 염색체를 그리고 면역 염색법으로 태아 헤모글로빈을 확인하기 위해 실시예 1에서 설명된 바와 같은 본 발명의 방법에서 준비된 세포의 결합된 면역염색법 및 FISH 분석의 포토마이크로그래프.
본 발명의 상세한 설명
본원에 예시된 실시형태에서, 세포 샘플에서 세포의 세포 이하의 성분을 검출하고 정량화하는 방법이 제공된다. 그 방법은 세포를 포함하는 다양한 생물학적인 샘플, 예를 들어, 혈액 샘플에 적용될 수 있고, 특히 모계 혈액에서 유전자 질병의 진단에 적용될 수 있다.
일 실시형태에서, 그 방법은, 신호들이 사용된 각 항체 대해 특정하며 이후의 이어지는 형광 동소 보합(FISH) 분석용 세포 샘플의 처리를 계속하는, 면역 염색법에서 하나 이상의 항체로부터 발생된 형광 신호를 생성하는 것을 포함한다. 일 실시형태에서, 그 방법은 원하거나 특정한 형광물질(flurophore)을 사용된 FISH 탐침용으로 선택하는 것을 포함하고, 이는 생성된 각각의 그리고 모든 형광 신호를 불연속적으로 시각화 및 정량화하고, 면역조직화학적 신호 및 FISH 신호 모두가 세 포 샘플로부터 형광성을 띄게 한다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 타겟 핵산에 의해 형성된 유전자 상태가 샘플에 있는 지를 검출하기 위해 컴퓨터 시스템을 동작시키는 방법이 제공된다. 그 방법은 물체를 카운트함과 함께 탐침의 사용, 및 샘플에 보합된 그 탐침의 디지털화된 이미지와 통계적인 기대값의 분석을 포함하여 유전자 상태가 있는 지를 검출한다. 그 카운팅은 예를 들어, 유전자 기형이 검출되는 빈도를 카운팅하고 그 카운트를 특정한 조직 형태, 세포 형태 또는 샘플에서 기형의 통계적인 기대값에 비교한다. 그 카운팅은 유전자 기형이 발생하는 빈도를 카운팅하고 그 카운트를 동일한 샘플에서 세포 형태가 발생하는 빈도에 또는 동일한 샘플에서 정상 핵산이 발생하는 빈도에 비교하는 것을 포함한다. 그 카운팅은 하나 이상의 다른 유전자 기형이 단일 세포에 발생하는 빈도를 카운트하는 것을 포함한다. 그 컴퓨터 시스템은 또한 세포 형태를 확인하고, 세포를 카운트하고, 세포 형태 등을 검사하고, 그리고 그 정보를 유전자 기형의 카운트와 비교 또는 상호관련시키기 위해 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 적어도 하나의 타겟 핵산에 의해 형성된 유전자 상태가 고정된 샘플에 있는 지를 검출하기 위해 컴퓨터 시스템을 동작시키는 방법이 제공되고, 그 방법은, 관심있는 제 1물체를 검출하기 위해 형광체로 라벨된(fluorophor-labeled) 탐침을 타겟 핵산 및 형광 면역염색에 특이적으로 보합하기 위한 조건하에서 FISH을 거치는, 고정된 샘플의 디지털화된 이미지, 양호하게는 컬러 이미지를 수신하는 단계; 제 1물체들, 예를 들어, 세포 성분을 분리하기 위해 컴퓨터의 그 이미지를 처리하는 단계; 그 타겟 핵산과 관련된 관심 표시 탐침의 제 1물체를 특 정하게 설정된 특성내에서 결정하는 단계; 탐침 신호를 갖는 관심있는 제 1물체를 카운트하는 단계; 유전자 상태가 존재하는 지를 검출하기 위해 통계적인 기대값에 대해 제 1물체, 예를 들어 세포의 카운트를 분석하는 단계를 포함한다. 그 방법은 다수의 유전자 조건에 적응가능한 데, 여기서 그 유전자 상태가 인간의 3염색체성21(trisomy21)인 것을 포함한다. 앞선 설명에 덧붙여서, 통계적인 기대값이 예를 들어 조직 형태를 토대로 될 수 있음을 알 수 있다. 그 컴퓨터는 검사되는 세포의 조직 형태를 확인하기 위해 사용될 수 있으나, 그 조직 형태도 공지될 수 있다.
어떤 실시형태에서, 상기 수신하는 단계는 수신된 컬러 이미지내의 각 화소 위치에서 적색, 녹색 및 청색 농도를 표시하는 적색, 녹색 및 청색 화소의 이미지 파일을 생성하는 단계를 더 포함한다. 어떤 실시형태에서, 상기 처리하는 단계는 배경내의 복수의 화소를 수동으로 선택하는 단계와; 그 배경내의 일부에 대응하는 컬러 농도값 범위를 결정하는 단계와; 상기 결정된 범위내의 컬러 농도값을 갖는 이미지의 그 영역을 그 배경으로서 확인하는 단계를 더 포함한다. 어떤 실시형태에서, 측정하는 단계전에, 컬러 이미지를 필터링하기 위한 컴퓨터의 처리가 있어서 컬러 이미지에서의 다크(dark) 화소의 컬러 농도값을 더 라이트(light)되게 하고 컬러 이미지에서의 라이트 화소의 컬러 농도값을 더 다크하게 할 수 있다. 그 필터링하는 단계는 그 컬러 이미지를 호올(hole) 충전 필터를 통해 통과시키고; 그 충전된 컬러 이미지를 미란(erosion) 필터를 통해 통과시키고; 영역 주변의 아웃라인을 한정하기 위해 그 미란되어 충전된 컬러 이미지상에서 분리 동작을 수행하고; 논리적인 NOT 동작을 수행함에 의해 그 아웃라인내에서 화소를 선택하고; 그 선택 된 화소 및 그 충전된 컬러 이미지간의 논리적인 AND 동작을 수행하는 것을 더 포함한다.
어떤 실시형태에서, 그 유전자 상태가 타겟 핵산 대 제 2핵산의 비율에 의해 또한 형성된다. 그후에, 그 방법은 제 2핵산과 관련되어 특정하게 설정된(predetermined) 특성을 갖는 제 2물체를 식별하고; 식별된 제 2물체를 카운트하는 것을 더 포함하고; 여기서 제 1물체의 카운트를 분석하는 것은 제 1물체의 카운트 대 제 2물체의 카운트의 비율을 발견하는 것을 더 포함한다. 어떤 실시형태에서, 그 타겟 핵산은 우성 형질을 형성하고 제 2핵산은 대응하는 열성 형질을 형성한다. 그 실시형태의 방법은 발견된 비율에 따라 유전자 상태를 우성 형질을 지니거나, 열성 형질을 지니거나, 우성 형질을 지니고 그 열성 형질을 이송하는 것으로 표시하는 것을 포함한다. 타겟 핵산이 제 2핵산의 재배열일 때, 그 방법은 재배열되고 재배열 안된 핵산 간의 차단 지대와 보합하기 위해 탐침을 선택하는 것을 더 포함한다. 결국에, 그 방법은 유전자 상태를 발견된 비율에 관련된 심각도 수준으로 표시하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따라, 타겟-특이성(target-specific) 형광체로 라벨된 세포-함유 샘플에서 타겟 물질의 발생을 카운트하도록 컴퓨터 시스템에 지시하는, 컴퓨터 명령의 시퀀스를 내부에 고정한, 컴퓨터로 판독가능한 저장 매체를 포함하는 컴퓨터 소프트웨어 제품이 제공되고, 그 명령은, 형광체로 라벨된 샘플의 디지털화된 컬러 이미지를 수신하고; 그 형광체로 라벨된 샘플의 컬러 이미지를 얻고; 그 컬러 이미지의 배경으로부터 관심있는 물체를 분리하고; 특정한 특성을 갖 는 물체를 계산하기 위해 관심있는 물체의 파라미터를 측정하고; 그 유전자 기형을 결정하기 위해 통계적으로 기대된 계산에 대해 물체의 계산을 분석하는 단계를 지시한다. 그 명령은 상기 설명된 방법상의 모든 변형을 구현하기 위해 만들어질 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태에 따라, 타겟-특이성 형광체로 라벨된 세포를 포함 샘플의 이미지를 분석하는 장치가 제공되고, 그 장치는 이미지 처리 소프트웨어를 실행하는 컴퓨터 시스템과; 이미지 처리 명령의 시퀀스를 고정시킨 저장 매체를 포함하고, 그 이미지 처리 명령의 시퀀스는, 형광체로 라벨된 샘플의 디지털화된 컬러 이미지를 수신하고, 그 형광체로 라벨된 샘플의 컬러 이미지를 얻고, 그 컬러 이미지의 배경으로부터 관심있는 물체를 분리하고, 특정한 특성을 갖는 물체를 계산하기 위해 관심있는 물체의 파라미터를 측정하고; 그 유전자 기형을 결정하기 위해 통계적으로 기대된 계산에 대해 물체의 계산을 분석하는 것을 포함한다. 다시, 그 명령이 상기 설명된 모든 변형을 구현하기 위해 변형될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 체액 또는 조직 샘플 이미지 데이터를 처리하는 컴퓨터로 구현된 방법이 제공되고, 그 방법은, 제 1배율로된 체액 또는 조직 샘플의 이미지를 표시하는 제 1이미지 데이터 세트의 서브세트를 생성하는 단계; 제 2데이터 세트의 서브세트를 컴퓨터 메모리에 저장하는 단계; 타겟 핵산과 관련되어 특정하게 설정된 특성을 갖는 물체를 확인하기 위해 관심있는 물체의 크기 및 컬러 파라미터를 측정하고, 그 측정하는 단계에서 확인된 물체를 카운트하고, 유전자 기형이 존재하는 지를 검출하기 위해 통계적으로 기대된 카운트에 대해 물체의 카운트를 분석하는 단계를 포함하고, 그 서브세트는 제 2배율로된 후보 블롭(blob)의 이미지를 표시하는 제 2이미지 데이터의 서브세트를 생성하는 레어(rare) 세포를 포함할 수 있는 후보 블롭을 표시하고, 제 2데이터 세트의 서브세트가 레어 세포를 표시한다.
일 실시형태에서, 컬러 이미지를 필터링하기 위해 컴퓨터에서 측정, 처리하는 단계를 포함하는 방법이 제공되어 컬러 이미지에서의 다크(dark) 화소의 컬러 농도값을 더 라이트(light)되게 하고 컬러 이미지에서의 라이트 화소의 컬러 농도값을 더 다크하게 한다. 그 필터링하는 단계는 그 컬러 이미지를 호올(hole) 충전 필터를 통해 통과시키고; 그 충전된 컬러 이미지를 미란(erosion) 필터를 통해 통과시키고; 영역 주변의 아웃라인을 한정하기 위해 그 미란되어 충전된 컬러 이미지상에서 분리 동작을 수행하고; 논리적인 NOT 동작을 수행함에 의해 그 아웃라인내에서 화소를 선택하고; 그 선택된 화소 및 그 충전된 컬러 이미지간의 논리적인 AND 동작을 수행하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 제 1이미지 데이터 세트의 서브세트는 컴퓨터화된 마이크로스코픽 시각 시스템(microscopic vision system)을 사용해서 체액 또는 조직 샘플로부터 단층 세포의 광학 필드를 관찰함에 의해 생성될 수 있어서 레어 세포의 존재를 표시하는 신호를 검출한다. 일 실시형태에서, 그 방법은 수신된 컬러 이미지내의 각 화소 위치에서 적색, 녹색 및 청색 농도를 표시하는 적색, 녹색 및 청색 화소의 이미지 파일도 생성할 수 있다. 본 발명의 어떤 측면에 따라, 그 처리는 배경내의 복수의 화소를 수동으로 선택하고; 그 배경의 일부에 대응하는 컬러 농도값 범위를 결정하고; 결정된 범위내의 컬러 농도값을 갖는 이미지의 그 영역을 배경으로서 확인하는 것을 더 포함한다. 일 실시형태에서, 그 신호는 그것이 상당한 신호 레벨인지를 결정하기 위해 측정될 수 있다. 제 1 및/또는 2 이미지 데이터 서브세트는 본원에서 설명된 바와 같이 컴퓨터에 의해 제어 및 처리용에 더 적합한 표시로 변환될 수 있다. 그 이미지 데이터는 예를 들어, RGB(Red Green Blue) 신호로부터 HLS(Hue Luminescene Saturation) 신호로 변환된다. 필터 및/또는 마스크는 기선택된 기준을 충족하는 그 세포를 구별하고 충족하지 않는 것을 제거하여, 예를 들어, 레어 세포를 확인하기 위해 사용된다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 연구실 서비스를 동작시키는 방법이 제공되고, 그 방법은, 체액 또는 조직 샘플을 수납하고, 체액 또는 조직 샘플 스미어를 생성하고, 스미어에서 관심있는 물체를 형광 면역염색으로 면역염색하는 단계와; 진단이 중요한 핵산 시퀀스와 보합하도록 설계된 형광 탐침으로 그 스미어를 처리하는 단계와; 컴퓨터화된 마이크로스코프를 동작시키는 단계를 포함하여, 소프트웨어 프로그램이 면역염색 및 핵산 탐침에 의해 발생된 형광 신호를 토대로 진단이 중요한 보합된 핵산 시퀀스를 갖는 관심있는 물체를 자동으로 확인한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 컴퓨터에 의해 실행될 때 진단이 중요한 핵산 시퀀스를 갖는 관심있는 물체를 검출하는 단계의 성능을 지시하는 명령의 시퀀스를 내부에 고정한, 컴퓨터로 판독가능한 저장 매체를 포함하는 컴퓨터 소프트웨어 제품이 제공된다. 그 단계는, 제 1배율로된 체액 또는 조직 샘플의 이미지를 표시하는 제 1이미지 데이터 세트의 서브세트를 생성하고 - 그 서브세트는 세포 또 는 레어 세포(10,000개 세포중 1개 미만)와 같이 관심있는 물체를 포함할 수 있는 후보 블롭을 표시함 -, 제 2배율로된 후보 블롭의 이미지를 표시하는 제 2이미지 데이터세트의 서브세트를 생성하고 - 그 제 2이미지 데이터세트의 서브세트가 관심있는 물체를 표시함 -, 그 제 2데이터 세트의 서브세트를 컴퓨터 메모리에 저장하고, 타겟핵산과 관련되는 설정된 특성을 갖는 물체를 확인하기 위해 관심있는 물체와 관련되는 진단 관심의 핵산 시퀀스로 지향된 형광 핵산 탐침과 관련된 형광을 측정하고; 측정하는 단계에서 확인된 물체를 카운트하고; 유전자 기형이 존재하는 지를 검출하기 위해 통계적으로 기대된 카운트에 대해 물체의 카운트를 분석하는 것을 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에 따라, 세포의 샘플을 진단 절차용으로 준비하는 방법이 제공된다. 세포의 샘플이 얻어지고 기판에서 단층으로 고정되고, 세포의 샘플이 10,000개 세포 전체에서 1이하로(즉, 0.01 % 이하) 샘플에 존재하는 레어 세포를 포함한다. 그 단층이 레어 세포에 지향된 형광 면역염색으로 면역염색된 후 질병 상태 또는 기형과 관련된 핵산 시퀀스에 지향된 형광 탐침으로 처리된다. 세포 샘플중 적어도 일부를 커버하는 광학 필드가 관심있는 핵산 시퀀스 및 레어 세포의 존재를 표시하는 형광 신호에 대해 컴퓨터화된 마이크로스코픽 시각 시스템을 사용해서 관찰된다. 각 신호가 검출되고, 신호를 검출하는 좌표가 진단 절차용으로 확인된다. 질병 상태 또는 기형과 관련된 핵산 시퀀스를 표시하는 레어 세포의 카운트가 진단을 하기 위해 사용될 수 있다. 시험 진단은 컴퓨터화된 마이크로스코픽 시스템에 의해 자동으로 이루어질 수 있다. 일 실시형태에서 레어 세포가 세포중 0.001 % 이하로 존재한다. 다른 실시형태에서 레어 세포가 0.0001 %, 0.00001 % 또는 심지어 0.000001 % 이하로 존재한다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 검출 및 진단되는 레어 세포 형태가 동물 또는 환자의 조직 또는 세포 샘플에서 발견된 암 세포이다. 그 샘플은 세포를 포함한 혈액 또는 다른 체액이거나 조직 생체검사일 수 있다. 본 실시형태의 예시로서, 섹션 5, 인피아(infia)에서 설명된 암 세포 마커 예를 들어, GM4 단백질, 텔로머라제 단백질 또는 핵산, 및 p53 단백질 또는 핵산은 본 발명을 특정하게 적용함에 의해 결정되는 방법으로 제 1또는 2신호의 발생에서 사용된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 레어 세포 형태가 샘플에서 존재할 때, 본 발명의 방법은 80% 이상의 빈도로 레어 세포 형태를 검출한다. 다른 실시형태에서, 검출 빈도가 85%, 90%, 95% 및 99% 이상이다.
본 발명의 일 실시형태에 따라, 진단 절차용으로 혈액의 샘플을 준비하는 방법이 제공되고, 그 방법은, 자연적으로 존재하는 태아 세포 농도를 함유한 언인리치드(unenriched) 모계 혈액의 샘플의 스미어를 준비하는 단계; 상기 스미어를 상기 태아 세포로 지향된 형광 면역염색으로 처리하는 단계; 상기 스미어를 관심있는 핵산 시퀀스에 지향된 형광 핵산 탐침으로 처리하는 단계; 컴퓨터화된 마이크로스코픽 시각 시스템을 태아 세포의 존재를 표시하는 형광 신호용으로 사용해서 스미어의 일부를 커버하는 광학 필드를 관찰하는 단계; 상기 핵산 탐침의 형광 신호에 의해 관심있는 핵산 시퀀스를 갖는 태아 세포를 확인하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 그 신호가 레어 세포를 형태적으로 측정하기 위해 더 처리 된다. 다른 실시형태에서, 그 세포가 레어 세포와 다른 세포를 광학적으로 구별을 잘 하도록 라벨로 처리된다. 본 실시형태에서, 그 신호는, 예를 들어, 레어 세포에 선택적으로 결합하는 라벨로부터 될 수 있다. 다른 실시형태에서, 진단 절차는 확인된 좌표로 이동하고, 그 이미지가 격리된 레어 세포일 때까지, 광학 필드를 확대하는 것을 포함한다.
어떤 실시형태에서, 광학 필드가 모든 세포를 거의 커버하는 세포의 일부 시퀀스에 대해 스테핑된다(stepped). 그것은 예를 들어, 컴퓨터화된 마이크로스코픽 시각 시스템의 렌즈에 대한 컴퓨터화된 마이크로스코픽 비젼 시스템의 제어하에서 그 세포를 기판상에 이동함에 의해 성취될 수 있다. 다른 실시형태에서, 제 1신호를 얻는 좌표가 확인된 후, 그 좌표의 레어 세포는, 그 좌표가 확인된 후, 구체적으로 접촉된다.
어떤 실시형태에서, 그 진단 신호가 레어 세포를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시형태에서, 위치한 신호가 레어 세포를 확인하기 위해 사용될 수 있고, 진단 신호는 세포를 위치시킨 후 얻어진다.
일 실시형태에서, 레어 세포가 10,000개 세포 전체에서 1개 이하로(즉, 세포의 0.01 % 이하) 샘플에 존재한다. 다른 실시형태에서, 레어 세포가 0.001 %, 0.00001 % 또는 심지어 0.000001 % 이하로 존재한다. 하나의 특정하게 중요한 실시형태에서, 레어 세포가 모계 혈액의 세포 샘플에서 태아 세포이다. 양호하게는, 그 샘플은 0.001 %, 0.0001 %, 0.00001 %, 0.000001 % 또는 심지어 0.0000001 % 이하일 수 있는 자연적으로 존재하는 태아 세포 농도를 함유한다.
앞선 실시형태에서, 그 세포는 기판으로 조정될 수 있는 좌표 시스템을 가질 수 있는 예를 들어, 마이크로스코프 슬라이드 또는 기판상에서 준비될수 있어서 하나의 단계에서 확인된 레어 세포의 좌표가 다른 단계에서 나중에 복귀될 수 있다. 비슷하게, 실시형태의 기판은 그 폭의 10배의 길이를 갖고, 그 기판이 하나의 방향으로 실질적으로 기다랗게 된다. 그 길이는 폭의 20배도 될 수 있다. 그 기판은 유연한 막으로 될 수 있고, 하나의 중요한 실시형태에서, 스미어된 모계 혈액을 상대적으로 큰 볼륨으로부터 제공하는 바와 같이 세포를 상대적으로 큰 볼륨으로 이송할 수 있는 기다랗고 유연한 막이다. 앞선 실시형태에서, 면역염색으로부터의 형광신호 및 핵산 탐침으로부터의 형광 신호가 선택될 수 있어서 그들이 둘다 존재할때 서로 마스크하지 않는다.
실시형태에 따라, 그 방법은 언인리치드 또는 인리치드 샘플, 예를 들어, 자연적으로 존재하는 태아 세포를 포함하는 모계 혈액을 사용할 수 있다.
본 발명은 첨부 도면에 관련해서 본 발명의 상세한 설명 및 다양한 실시형태를 읽은 후 이해될 것이다. 상세한 설명이 본 발명을 태아 세포, 레어 세포 형태, 및 체액으로서의 혈액 또는 조직 샘플에 대해 설명하지만, 본 발명은 특히 그 샘플을 단층 세포로서 기판상에 적층하는 어떤 세포 형태 및 어떤 체액 또는 조직 샘플을 토대로 진단하도록, 그리고 사실상 이를 포함하도록 적용될 수 있음을 당업자는 알 것이다.
본 발명의 범위내에 있는 체액 및 조직 샘플은 혈액, 조직 생체검사, 스피널(spinal) 체액, 뇌막 체액, 소변, 폐포 체액 등을 포함하나 그것들로 제한되지 않는다. 그 세포가 단층으로 자연적으로 존재하지 않는 그 조직 샘플에 대해, 그 세포가 이 기술에 숙련된 자에게 공지된 표준 기술에 의해 해리될(dissociated) 수 있다. 그 기술은 조직의 트립신, 교원질 분해효소 또는 디파제 처리를 포함하나 그들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 본 발명은 태아 세포를 검출 및 진단하기 위해 사용된다. 형광 면역염색은 예시된 실시형태에서 사용되어 세포 확인을 표시할 수 있다. 예를 들어, 면역염색은 예를 들어, 헤모글로빈 ε- 체인, 즉 태아성 헤모글로빈에 대해 항체에 결합된 형광 염료일 수 있다. 또한, 세포 인식 알고리즘을 사용하는 것과 관련해서 핵이 있는 적혈구의 특성적인 형태에 대한 각 세포 유사성 치수(metric)는 세포를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
진단은 핵산 탐침 신호를 토대로 한다(또는 면역염색 신호 및 핵산 신호의 결합을 토대로 함).
예시된 실시형태에서, FISH는 레어 세포 형태, 예를 들어 태아 세포의 변성 테스트 DNA를 변성 DIG(dioxygenin)로 라벨된 게놈 탐침과 보합하는 것을 포함한다. 테스트 DNA를 포함하는 샘플은 세척되어 형광 물질에 결합된 안티-DIG 항체에 결합되게 된다. 선택적으로, 형광 물질(예를 들어, FITC)의 제 2층이 형광 물질과 결합된 안티-팹(Fab) 항체와의 배양에 의해 추가된다. 일 실시형태에서, FISH는 레어 세포의 변성 DNA를 특정한 형광 물질로 직접적으로 라벨된 특정한 타겟 DNA 지대와 상동인(homologous) DNA 시퀀스를 포함하는 형광으로 라벨된 탐침와 보합하는 것을 포함한다.
자동화된 샘플 분석은 관심있는 광학 필드 물체를 다른 물체 및 배경으로부터 구별하는 장치 및 방법에 의해 수행될 수 있다. 자동화된 시스템의 예는 1994년 10월 4일에 발간된 출원인의 미국 특허 제 5,352,613호에 개시된다. 또한, 물체가 한번 확인되면, 물체 또는 그 물체에 대해 관심있는 다른 파라미터를 포함하는 화소에 대해 적색, 녹색, 청색 성분의 결합인 컬러가 측정 및 저장될 수 있다.
유전자 상태의 자동화된 샘플 분석 및 진단이 다음과 같이 진행될 수 있다. 즉, (ⅰ) 형광물질로 라벨된 탐침을 타겟 핵산에 특이적으로 보합하기 위한 조건하에서 FISH를 거치게 되는 고정된 샘플의 디지털화된 컬러 이미지를 수신하고; (ⅱ) 컬러 이미지에서 관심있는 물체를 배경으로부터 분리하기 위해 컴퓨터에서 컬러 이미지를 처리하고; (ⅲ) 특정한 특성을 갖는 물체를 확인하는 관심있는 물체의 파라미터를 측정하고; (ⅳ) 식별된 물체를 카운트하고; (ⅴ) 유전자 상태를 결정하기 위해 통계적으로 기대된 카운트에 대해 물체의 카운트를 분석한다. 그 방법은 염색체 수 및/또는 배열에서 변형과 관련된 유전자 조건을 진단하는 데 유용하다. 그러므로, 예를 들어, 본 발명은 재배열된 염색체 세그먼트 및 세그먼트를 전위시킨 염색체를 검출하는 라벨된 탐침의 결합을 사용해서 염색체 재배열을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 더 일반적으로, 3염색체성, 유전자 확장 및 전위, 결실 및 삽입을 포함하는 재배열이 알맞게 선택된 형광 탐침과 연결해서 본 발명의 이런 양태를 구체화하는 방법을 사용해서 검출될 수 있다.
본원에서 사용했듯이, "유전자 기형"은 정상 염색체 보체(complement)를 갖는 개체인 건강한 물체로부터 얻어진 염색체의 대응하는 수 및/또는 배열에 대해 하나 이상의 염색체의 수 및/또는 배열의 변형을 말한다. 유전자 기형은 최소로는 약 15 베이스 쌍이고 최대로는 염색체 전체의 핵산 시퀀스에 의해 특성지어지는 예를 들어, 염색체 추가, 결실, 확장, 전위 및 재배열을 포함한다. 유전자 기형은 포인트 돌연변이도 포함한다.
그 방법은 내부에 포함된 세포 및 세포 이하의 성분의 구조 완전성(integrity)을 보전하기 위한 방법에서 처리되었던 솔리드 서포트(solid support)에 부착된 샘플인 고정된 샘플에서 하나 이상의 유전자 기형을 결정하는 데 사용한다. 샘플을 포함한 세포를 솔리드 서포트, 예를 들어 유리 슬라이드에 고정하는 방법이 당업자에게 공지되어 있다.
그 샘플은 유전자 기형을 표시하는 분포인 적어도 하나의 타겟 핵산을 포함할 수 있다. "분포"는 타겟 핵산을 포함하도록 공지된 하나 이상의 핵산(예를 들어, 염색체)에서 타겟 핵산의 존재, 부재, 상대적인 양, 및/또는 상대적인 위치를 의미한다. 일 실시형태에서, 타겟 핵산은 3염색체성21을 표시하고, 그러므로, 그 방법이 다운 증후군을 진단하는 데 유용하다. 실시형태에서, 다운 증후군 분석용의 샘플이 모계 말초 혈액에서 인출된다. 특히, 세포가 표준 절차에 따라 말초 혈액에서 격리되고, 세포는 표준 절차(예를 들어, 실시예를 참조)에 따라 솔리드 서포트에 부착되어 타겟 핵산을 검출한다.
FISH는 타겟 핵산에 특이적으로 보합하도록 그리고 이에 의해 타겟 핵산의 시각화를 용이하게 하도록 하기 위해 형광체로 라벨된 탐침을 사용하는 핵산 보합 기술을 말한다. 그 방법은 당업자에게 공지되고 미국 특허 제 5,225,326호; 미국 특허 출원 제 07/668,751호; PCT WO 94/02646호에 개시되고, 그 모든 내용이 참고문헌으로 본원과 결부된다. 일반적으로, 동소 보합은 예를 들어, 조직을 단일 세포 레벨로 포함하는 바와 같은 핵산-포 함 샘플에서 핵산의 분포를 결정하기 위해 유용하다. 그런 기술은 세포내에 포함된 특정한 유전자의 존재, 부재 및/또는 배열을 검출할 뿐만 아니라 핵형 결정(karyotyping) 적용예에 사용된다. 그러나, 핵형을 결정할 때, 샘플의 세포가 중기(또는 휴지기)까지 증식하게 되어 동소 보합 반응의 수행을 위해 세포를 솔리드 서포트에 부착하기에 앞서서 "중기-확산"을 얻는다.
요약하면, FISH는 그 샘플을 솔리드 서포트에 고정시키고 그리고 적어도 침전제 및/또는 가교결합제를 포함하는 매체와 그 샘플을 접촉함에 의해 거기에 함유된 성분의 구조 완전성을 보전하는 것을 포함한다. 그 샘플을 "고정"하는 데 유용한 예시되는 작용제는 실시예에서 설명된다. 대안적인 고정제(fixative)는 당업자에게 공지되고 예를 들어, 상기 주지된 특허 및/또는 특허 공보에서 설명된다.
동소 보합은 타겟 핵산을 변성시킴에 의해 수행될 수 있어서 그것이 보합 용액에 함유된 보체 탐침에 보합할 수 있다. 그 고정된 샘플이 변성제 및 보합 용액과 동시에 또는 시퀀스적으로 접촉될 수 있다. 그러므로, 일 실시형태에서, 고정된 샘플이 변성제 및 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 탐침을 함유하는 보합 용액과 접촉된다. 그 탐침은 타겟 핵산의 뉴클레오티드 시퀀스에 적어도 거의 보체적인 뉴클레오티드 시퀀스를 갖는다. 보합 용액은 하나 이상의 보합 안정화제, 완충제 및 선택적인 멤브레인 세공-형성제를 선택적으로 함유할 수 있다. 특정한 탐침을 특정한 타겟 핵산에 보합시키는 보합 조건의 최적화가 당업자의 수준에서 가능하게 된 다.
탐침에서, "거의 보체적이라는" 문구는 본 발명을 실시하기 위해 사용된 보합 조건하에서 탐침을 핵산 타겟에 특이적으로 보합시키기에 충분하지만 탐침을 비-타겟 핵산 시퀀스에 회합하지 않도록 하는 보체성의 양을 말한다. 한다. 그 조건이 동소 보합의 기술에서 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명을 유용하게 하는 유전자 기형은 정상 염색체 보체를 갖는 개체로부터 얻어진 염색체에 대해 하나 이상의 염색체의 수 및/또는 배열의 변형이 있는 것을 포함한다. 본 발명에 의해 검출될 수 있는 예시된 염색체는 인간의 X 염색체, Y 염색체 및 염색체13, 18, 21를 포함한다. 예를 들어, 타겟 핵산은 전체 염색체, 예를 들어 염색체21일 수 있고, 염색체(타겟 핵산의 "분포")의 3복제의 존재가 유전자 기형인 다운 증후군을 표시한다. 타겟 핵산(예를 들어, 염색체)에 특이적으로 보합하기에 유용한 예시된 탐침은 유전자 기형을 진단하는 염색체에 위치될 수 있는 탐침이다. 예를 들어, Harrison's Principle of Internal Medicine, 12th edition, ed. Wilson et al., McGraw Hill, N.Y., N.Y.(1991)를 참조.
본 발명의 일 실시형태는 예를 들어, 모계 말초 혈액, 태반 조직, 융모막 융모, 양수 및 배아 조직에 존재하는 태아 세포에서 3염색체성21(하기에서 논의됨)을 검출함에 의해 다운 증후군의 태아기 진단에 관한 것이다. 그러나, 본 발명의 방법은 태아 세포의 분석으로 제한되지 않는다. 그러므로, 예를 들어, 타겟 핵산을 포함하는 세포가 진핵 세포(예를 들어, 혈액, 피부, 폐로부터 인출된 세포를 포함하고 종양 소스뿐만 아니라 정상 소스를 포함하는 인간의 세포); 원핵 세포(예를 들 어, 박테리아) 및 식물 세포일 수 있다. 일 실시형태에 따라, 본 발명은 다양한 바이러스 종(strain)을 구별하기 위해 사용된다. 본 실시형태에 따라, 타겟 핵산이 비-외피형 바이러스 또는 외피형 바이러스(지질 단백질 멤브레인와 같은 비-외피형 멤브레인을 갖는)에서 있을 수 있다. 예를 들어, Asgari.supra를 참조. 본 발명에 의해 검출될 수 있는 예시된 바이러스가 인간의 면역결핍 바이러스, 간염 바이러스 및 포진 바이러스를 포함한다.
올리고뉴클레오티드 탐침이 표준 실시에 따라 형광체(형광 "태그" 또는 "라벨")로 라벨될 수 있다. 그 형광체는 탐침에 직접적으로 부착될 수 있거나(즉, 공유 결합) 거기에 간접적으로 부착된다(예를 들어, 비오틴이 탐침에 부착될 수 있고 그 형광체가 아비딘에 공유적으로 부착될 수 있고; 비오틴으로 라벨된 탐침 및 형광체로 라벨된 아비딘이 본 발명의 방법에서 형광체로 라벨된 탐침으로 기능할 수 있는 착물을 형성할 수 있다).
본 발명의 방법 및 장치에 따라 사용될 수 있는 형광체가 당업자에게 잘 공지되어 있다. 그것은 4,6-디아미디노-2페닐인돌(DIPA), 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate)(FITC) 및 로다민을 포함한다. 예를 들어, 실시예를 참조. Gribnau 등에 의해 1983년 2월 15일에 발간된 미국 특허 제 4,373,932호를 참조, 그 내용은 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 예시된 형광체의 목록에 대해 참조용으로 본원과 결부된다. 여기 및 방출 스펙트럼을 서로 달리하는 형광체의 존재가 단일 고정된 샘플에서 하나 이상의 타겟 핵산의 동시 시각화를 가능하게 한다. 하기에서 설명했듯이, 예시된 형광체쌍이 사용될 수 있어서 동일하게 고정된 샘플에서 2개의 다른 핵산 타겟을 동시에 가시화한다.
타겟 핵산의 분포가 유전자 기형을 표시한다. 예를 들어, Asgari.supra를 참조. 검출될 수 있는 유전자 기형은 돌연변이, 결실, 추가, 증폭, 전좌 및 재배열을 포함한다. 예를 들어, 결실이 광학 필드에서 형광 신호의 부재를 검출함에 의해 식별될 수 있다. 유전자 시퀀스의 결실을 검출하기 위해, 탐침의 개체군이 정상 세포에서는 존재하나 비정상 세포에서는 부재하는 타겟 핵산에 보체적으로 준비된다. 그 탐침이 고정된 샘플에서 핵산에 보합하면, 그 시퀀스가 검출되고 그 세포가 그 시퀀스에 대해 정상으로 지정된다. 그러나, 탐침이 고정된 샘플에 보합하지 못하면, 그 신호는 검출되지 않고 그 세포가 그 시퀀스에 대해 비정상으로 지정된다. 알맞은 대조구가 당업자에게 공지된 표준 실시에 따라 동소 보합 반응에서 포함된다.
타겟 핵산의 추가와 관련된 유전자 기형이 예를 들어, 형광체로 라벨된 탐침을 염색체(타겟 핵산)의 폴리뉴클레오티드 반복 세그먼트로의 결합을 검출함에 의해 확인될 수 있다. 유전자 시퀀스(예를 들어, 3염색체성21)의 추가를 검출하기 위해, 탐침의 개체군이 타겟 핵산에 보체적으로 준비된다. 염색체21의 3복제를 포함하는 고정된 세포에 라벨된 탐침의 보합은 실시예에서 논의된 바와 같이 표시된다.
증폭, 돌연변이, 전좌 및 재배열은 정상 시퀀스 및 증폭, 돌연변이, 전좌 또는 재배열을 의심하는 시퀀스간의 핵산 타겟에서 차단 포인트에 특이적으로 결합할 수 있는 탐침을 선택하고 상기 설명된 절차를 수행함에 의해 확인될 수 있다. 그 방법에서, 형광 신호가 테스트되는 샘플에서 유전자 기형의 존재 또는 부재를 표시 하기 위해 교대로 사용될 수 있는 타겟 핵산에 기여될 수 있다. 그 탐침은 정상 개체의 DNA에서는 차단 포인트에 걸쳐서 핵산 시퀀스에 보체적인 시퀀스를 가지나, 비정상 개체의 DNA에서는 그렇치 않다. 유전자 기형을 검출하는 탐침은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
이용될 수 있는 컴퓨터 제어된 시스템의 실시형태의 새로운 특징은 같은 광학 특성을 갖는 2개 이상의 대물 렌즈의 어레이이다. 그 렌즈가 행으로 배열되고 그들 각각이 자체의 z-축 이동 메카니즘을 가져서, 그들이 개체별로 포커스된다. 그 시스템은 알맞은 메카니즘으로 설비될 수 있어서 다수의 대물 홀더가 교체될 수 있어 일반적인 단일-렌즈에 의해 커버할 수 있는 동일한 확대의 필요성을 다양하게 맞춘다.
각 대물 렌즈가 자체의 CCD 카메라에 연결될 수 있다. 각 카메라가 이미지 획득 장치에 연결될 수 있다. 획득된 각 광학 필드에 대해, 컴퓨터가 미세한 샘플의 물리적인 위치를 기록할 수 있다. 그것은 컴퓨터 제어된 x-y의 기계적인 스테이지를 사용해서 이루어질 수 있다. 카메라에 의해 제공된 이미지가 디지털화되어 호스트 컴퓨터 메모리에 저장된다.
컴퓨터는 모터로 구동된 스테이지의 위치뿐만 아니라 사용시 대물렌즈-어레이 특성의 트랙을 유지할 수 있다. 각 이미지의 저장된 특징이 컴퓨터 메모리에서 가상 패치워크의 올바른 위치의 이미지, 즉 "합성된" 이미지를 맞출때 사용될 수 있다.
호스트 컴퓨터 시스템은 알맞은 디바이스 드라이버를 통해 시스템의 모든 기 계적인 구성요소를 제어하는 소프트웨어 시스템에 의해 구동될 수 있다. 소프트웨어는 컴퓨터 메모리에서 디지털화된 이미지를 구성하고 부가적인 알고리즘으로 처리하는 구성된 이미지를 공급하는 이미지 구성 알고리즘을 포함할 수 있다. 이미지 분해를 통해, 특정 샘플에 특유한 합성 및 이미지 처리의 특정한 특성이 검출될 수 있다.
일 실시형태에서 면역염색 신호 및 탐침 신호가 동시에 검출된다. 그 신호가 분리해서 처리된다(면역염색용의 다른 형광 물질 및 탐침으로부터의 신호가 분리 처리됨). 일 실시형태에서, 단일 세트의 좌표에서 면역염색 및 탐침 신호의 동시 존재 또는 2개의 구성요소(예를 들어, 파트너 신호에 의한 신호의 소멸)의 상호연동에서 발생하는 단일 신호가 진단 목적을 위해 사용될 수 있다.
일반적으로 면역염색 신호를 발생시키기 위해 사용된 재료 및 기술은 (진단을 허용불가능하게 하는 정도로) 제 2탐침을 발생시키기 위해 사용된 재료 및 기술과 역으로 간섭하지 않아야 하고, 역으로도 마찬가지다. 면역염색 또는 탐침 손상이 없어야하고 진단을 허용불가능하게 하는 정도로 측정되도록 세포 특징이 변경되지 않아야한다. 결국에, 세포에 대한 어떤 다른 바람직하거나 요구된 처리는, 진단을 허용불가능하게 하는 정도로, 제 1 및 2신호를 발생시키기 위해 사용된 재료 또는 기술을 간섭하지 않아야 한다. 그 제한내에서, 제 1및 2신호의 알맞은 발생기는 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 레어 세포 형태를 검출할때, 본 발명의 방법은 80% 이상의 빈도에서 레어 세포 형태를 검출한다. 다른 실시형태에서, 검출 빈도는 85%, 90%, 95% 및 99% 이상이다.
개체의 대립 유전자(allele)의 태깅을 위한 단일 형광 물질이 동시에 테스트될 수 있는 돌연변이수에 대한 상한을 생성할 수 있지만, 결합된 화학적 성질의 사용은 동시에 태그되고 검출될 수 있는 대립 유전자의 특정한 돌연변이수로 적용될 수 있다. 본 발명의 범위내에 있는 염색체 기형은 3염색체성21, 18, 13 및 XXX, XXY, XYY와 같은 성 염색체 변형을 포함하나 그것들로 제한되지 않는다. 결합된 화학적 성질을 사용해서, 본 발명의 방법은 유전자 장애에서 관찰된 전좌 및 암을 포함하는 다수의 재배열을 진단하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 범위내에 있는 멘델의 장애는 연결 조직의 방광 섬유증, 색소 침착증, 고지혈증, 마르팡 증후군 및 다른 유전성 장애, 이상 혈색소증, 태이색스 증후군 또는 돌연변이로 공지된 다른 유전자 장애를 포함하나 그것들로 제한되지 않는다. 결합된 화학적 성질의 염료 사용은 다수의 대립 유전자의 동시 태깅 및 검출을 가능하게 하여 천식과 같은 일반적인 장애의 소질 유전 및/또는 예를 들어 전립선, 유방, 결장, 폐, 백혈병, 임파종 등과 같은 암에 특정되는 다수의 분자 마커의 존재를 확정한다.
본 발명의 하나의 사용예가 암 분야이다. 특정 형태의 암 세포는 암이 아닌 세포의 배경에 대해 형태적으로 인식될 수 있다. 그러므로 암 세포의 형태가 제 1신호로서 사용될 수 있다. 열 쇼크 단백질은 최악성 암으로 표시된 마커이다. 열 쇼트 단백질에 특정되는, 형광적으로 태그된 항체와 같은, 라벨된 항체는 제 1신호를 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 유사하게, 전립선 특이 항원과 같은 특수한 조직 또는 특수한 암에 특정되는 항원과, 전립선 특이 항원과 같은 암 또는 조직 항원에 특이적인 항체가 있어서 그 암 세포에 대한 제 1신호를 발생시키기 위해 사용될 수 있다.
그러므로, 다른 세포의 배경에서 레어 암 세포가 본 발명에 따라 확인되고 특징지어진다. 그 특징화는 암 위험 등에 관한 유전자 변화의 마커의 존재를 결정함에 의한 암 세포의 존재 진단 확정, 암 형태의 결정, 암 위험의 결정을 포함할 수 있다.
유전자 변화의 마커는 암 위험의 평가를 가능하게 한다. 그들은 발암제(carcinogenic agent)에 노출에 대한 정보를 제공한다. 그들은 칼시노젠에 대한 노출에 의해 야기된 선행 변화를 검출할 수 있고 암 진행의 특정하게 높은 위험을 갖는 개체를 확인할 수 있다. 그런 마커는 방광암에서는 염색체9상에 LOH를 포함하결장 종양형성에서는 염색체 결실 및 염색체7, 17 및 8 수득/손실이 검출된다.
폐암의 진행은 다수의 유전자 변화를 필요로 한다. 종양 유전자의 활성화는 K-ras 및 myc를 포함한다. 종양 억제유전자 유전자의 불활성화가 Rb, p53 및 CDKN2를 포함한다. 변형중인 특정한 유전자 확인은 악성이 되는 세포의 선행 검출에 대해 유용하고 약 및 유전자를 토대로 한 치료에 대해 잠재성 타겟 확인을 가능하게 한다.
3염색체성을 결정할 때, 본 발명은 단일 세포에서 3염색체성의 존재를 결정하고, 및/또는 세포의 개체군에서 3염색체성을 가지는 단일 세포의 빈도를 결정한다(어떤 세포가 3염색체성인 것을 알지 못하고 행해진다; 즉, 카운트된 세포의 총수 및 카운트된 염색체의 총수가 카운트됨). 3염색체성의 존재 또는 3염색체성과 관련된 상태의 위험이 평가될 수 있었다.
중요한 인식은 관련된 진단 정보를 출력하기 위해 신호를 카운트하고 다른 정보(예를 들어, 다른 신호 카운트, 다른 조직 형태의 예측된 신호 빈도에 대한 통계 정보 등)에 비교할 수 있다는 것이다.
본 발명은 신호쌍을 확인하는 것과 관련해서 설명되고, 그 쌍중 하나가 태아 세포와 같은 타겟 레어 세포를 확인하고, 나머지는 유전자 결함을 갖는 태아 세포와 같은 세포 상태를 평가할 때 유용하다. 소정의 실시형태에 따라, 단일 신호만이 검출될 필요가 있다. 예를 들어, 태아 세포가 Y 염색체를 이송하고 진단이 Y 염색체의 기형인 경우에, 유전자 기형을 식별하는 신호는 태아 세포를 확인하는 것과 같게 될 수 있다. 다른 예로서, 단일 신호는 관찰된 형질이 열성 형질인 환경에서 적용될 수 있다. 신호쌍은 다른 유전자에서 2개 이상의 돌연변이의 존재에 의해 진단되는 상태의 존재 또는 2개의 대립 유전자의 존재를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 그런 환경에서 신호쌍(또는 여러개의 신호)은 표현형 및 그 표현형을 갖는 세포를 모두 확인할 수 있다. 그 실시형태는 당업자에게는 명백하다.
예시된 실시형태
실시예 1
다음의 절차는 면역염색 기술을 사용해서 태아 헤모글로빈을 함유하는 세포의 존재에 대해 혈액 샘플을 분석하고 형광 라벨된 동소 보합 기술에 의해 같은 세포에서 X 및 Y 염색체의 존재를 결정한다.
세포가 현미경 분석에 알맞은 솔리드 서포트상에 적층되고 메탄올로 고정된다. 공기 건조를 한후에, 세포가 PBS(phosphate buffered saline)에서 린스(rinse)되고 PBS의 2% 포름알데히드에서 또한 고정된다. 그후에, 세포가 PBS에서 시퀀스적으로 세척된후, Tween®20을 함유한 pH 7.6인 TBS(Tris-Buffered Saline)에 의해 세척된다. 잉여 액체를 제거한 후, 차단 병원체가 추가되고 슬라이드가 습기찬 챔버에서 배양된다. 차단액(blocking solution)을 제거한 후, 차단제의 1차 항체의 희석물이 추가되고 세포가 습기찬 챔버에서 30 내지 120분 동안 배양된다. 그후에, 항체 용액을 제거하고 Tween®20을 함유한 pH 7.6인 TBS(Tris-Buffered Saline)에서 수회 세척된다. 잉여 액체를 제거한 후, 차단제의 항-마우스(anti-mouse) 2차 항체의 희석물이 추가되고 세포가 습기찬 챔버에서 30 내지 120분 동안 배양된다. 그후에, 항체 용액을 제거하고 세포가 Tween®20을 함유한 pH 7.6인 TBS(Tris-Buffered Saline)에서 수회 세척된다. 잉여 액체를 제거한 후, 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase)(AP) 버퍼에서 HNPP/신속한 적색 염료의 새롭게 필터링된 용액을 추가하고 그 세포 샘플을 10분동안 배양한다. 염색 용액을 제거하고 세포가 Tween®20을 함유한 pH 7.6인 TBS(Tris-Buffered Saline)에서 세척된 후 Tween®20을 함유한 pH 7.6인 TBS에서 DAPI의 용액에서 세척된다. 세포가 Tween®20을 함유한 pH 7.6인 TBS(Tris-Buffered Saline)에서 2번 세척된 후 표준 식염 구연산염에서 잉여 액체가 제거되고 세포가 공기 건조된다. 그후에, 세포가 5분동안 37℃로 미리-가열된 0.005% 펩신에서 배양된다. 이어서, 세포가 5분동안 PBS의 50 mM MgCl2 에서 세척된후, PBS에서 2번 세척되고, 잉여 액체를 제거하고 세포가 건조된다. 보합에서 DNA 및 RNA와 같이, 형광적으로 라벨된 FISH 탐침의 용액이 추가되고, 커버슬립이 세포를 함유한 슬라이드 상부에 적용되고, 세포가 2.5분동안 74℃에서 배양된후, 습기찬 챔버에서 4 내지 16시간동안 37℃로 배양된다. 커버슬립을 제거하고 세포가 2분동안 실온에서 0.4X 표준 식염 구연산염에서 세척된다. 잉여 액체를 제거한 후, 세포가 현미경 관찰 및 분석용으로 공기건조되고 설치된다.
실시예 2
장치
도 1의 블럭도는 본 발명의 양태를 구체화하는 데 알맞은 실시형태 시스템의 기본 구성요소를 도시한다. 그런 시스템의 기본 구성요소는 X-Y 스테이지(201)와, 수은 광원(203)과, 모터로 구동된 대물 렌즈 터릿(대물경 삽입부)(207)을 장착한 형광 현미경(205)과, 컬러 CCD 카메라(209)와, 개인 컴퓨터(PC) 시스템(211)과, 하나 이상의 모니터(213, 215)를 포함한다.
시스템의 개별 요소는 표준 구성요소로서 주문 제작하거나 시중에서 구입할 수 있다. 각 요소는 상세하게 설명된다.
X-Y 스테이지(201)는 선택된 현미경(205)와 함께 사용하기에 적합한 모터 구동 위치 스테이지이다. 양호하게는, X-Y 스테이지(201)는 특정하게 컴파일된 소프트웨어 명령을 사용해서 전자적으로 제어되고 개인 컴퓨터에 연결될 수 있는 모터 구동 스테이지일 수 있다. 전자적으로 제어된 X-Y 스테이지(201)를 사용할 때, PC(211)의 확장 버스로 플러그된 스테이지 제어기 회로 카드가 그 스테이지(201)를 PC(211)로 연결한다. 스테이지(201)는 수동으로 구동될 수 있어야한다. 본원에서 설명된 바와 같은 전자 제어된 스테이지는 예를 들어, 올림푸스사(도꾜, 일본)뿐만 아니라 다른 제조회사인 LUDL사(뉴욕, 미국)를 포함하는 현미경 제조회사에 의해 생산된다.
현미경(205)은 예를 들어, 반사광 형광 반사경(203) 및 20x 및 오일 담금 60x 또는 63x 대물 렌즈를 갖고 최대 배율 600x를 제공하는 모터 구동된 대물 렌즈 터릿(207)을 장착한 형광 현미경이다. 모터 구동된 대물경 삽입부(207)는 PC(211)에 양호하게 연결되고 특정하게 컴파일된 소프트웨어 명령을 사용해서 연속 배율간에 전자적으로 스위치된다. 전자 제어되어 모터 구동된 대물경 삽입부(207)의 사용시, PC(211)의 확장 버스로 플러그된 대물경 삽입부 제어기 회로 카드는 스테이지(201)를 PC(211)에 연결한다. 현미경(205) 및 스테이지(201)는 완전한 광학 필드를 실질적으로 평탄한 조도로 제공할 수 있는 수은 광원(203)을 포함하도록 세트된다.
현미경(205)은 카메라(209)에 보여지는 이미지를 생성한다. 카메라(209)는 전자 출력을 제공하기 위해 연결된 컬러 3-칩 CCD 카메라 또는 다른 카메라이고 높은 감광도 및 해상도를 제공할 수 있다. 카메라(209)의 출력은 PC(211)에 설치된 프레임 그래버 및 이미지 처리기 회로판에 공급된다. 알맞은 카메라는 소니 930(일본의 소니사 제조)이다.
다양한 프레임 그래버 시스템은 본 발명과 연결되어 사용된다. 프레임 그래버는 예를 들어, MATROX사(캐나다의 몬트리얼 소재)에서 시판한 MATROX IM-CLD(컬 러 이미지 포획 모듈) 및 MATROX IM-640(이미지 처리 모듈)을 결합시킨 보드 세트이다. MATROX IM-640 모듈은 보드상의 하드웨어를 지지한 이미지 처리 능력에 특징이 있다. 이런 능력은 MATROX IMAGINGLIBRARY(MIL) 소프트웨어 패키지의 능력을 고무시킨다. 그러므로, 그것은 MIL 기반의 소프트웨어 알고리즘을 신속하게 실행시킨다. MATROX 보드는 전용 SVGA 모니터에 디스플레이를 지원한다. 전용 모니터는 PC 시스템(211)와 함께 사용된 모니터와 더불어 제공된다. MATROX 이미지 처리 보드와 함께 사용하는 데 알맞은 모니터인 SVGA 모니터가 사용될 수 있다. 본 발명과 연결해서 사용가능한 하나의 전용 모니터는 ViewSonic 4E(Walnut Creek, CA) SVGA 모니터이다. 처리 및 저장 능력을 충분히 향상시키기 위해, PC(211)는 적어도 32 MB RAM 및 적어도 2GB의 하드 디스크 드라이브 저장 공간를 갖는 INTEL PENTIUM 기반의 PC이다. PC(211)는 모니터를 더 포함한다. 본원에서 설명된 특정한 특성을 제외하고는, PC(211)는 종래의 것이고 키보드, 프린터 및 도시 안된 다른 바람직한 주변 장치를 포함할 수 있다.
PC(211)는 MATROX IMAGINGLIBRARY(MIL)을 사용해서 MICROSOFT C++로 컴파일된 스미어 분석 소프트웨어 프로그램을 실행할 수 있다. MIL는 기능의 소프트웨어 라이브러리이고, 프레임 그래버(211)의 동작을 제어하고 PC(211)에 연속 저장하기 위해 프레임 그래버(211)에 의해 디스크 파일로서 포획된 이미지를 처리하는 것을 포함한다. MIL는 필터링, 물체 선택 및 각종 측정 기능과 같은 이미지 처리 임무를 수행하는 데 특히 알맞은 다수의 특정화된 이미지 처리 루틴을 포함한다. 스미어 분석 소프트웨어 프로그램은 WINDOWS95 애플리케이션으로 구동할 수 있다. 프로그 램 프롬프트 및 측정 결과가 컴퓨터 모니터(213)상에 표시되는 반면에, 이미징 하드웨어(211)를 통해 획득된 이미지가 전용 이미지 모니터(215)상에 표시된다.
스미어 분석 프로그램을 사용해서 현미경 이미지를 처리하기 위해, 그 시스템은 우선 조정된다. 그 조정은 하나의 현미경, 카메라 등으로부터 다른 것으로의 변경뿐만 아니라 날마다의 성능 변화를 보상한다. 그 위상동안 조정 이미지가 보여지고 다음의 조정 파라미터가 다음과 같이 세트된다. 즉,
- 시스템의 컬러 응답;
- 태아 세포에 대해 스캔되는 스미어를 포함하는 슬라이드상에서 영역의 치수 또는 경계;
- 배율 20x 및 60x(또는 63x)를 사용할 때 광학 필드의 실제 치수;
- 배율 20x 및 60x(또는 63x)를 사용할 때 최소 및 최대 태아 핵 영역;
물체 확인 신호의 검출
검출 알고리즘은 2개의 스테이지에서 동작한다. 그 첫째는 도 2의 흐름도의 실시형태에서 예시된 프리스캔 스테이지Ⅰ이고, 거기에서 가능한 태아 세포 위치가 저배율 및 고속을 사용해서 확인된다. 20x 대물렌즈는 예를 들어, 선택되고 태아 세포의 조사가 시작된다:
- 그 프로그램은 자동화된 스테이지(도 2의 201)를 기설정된 시작점(예를 들어, 스미어를 함유하는 슬라이드의 코너들중 하나)으로 이동시킨다(단계 301).
- 기설정된 시작점에서 스테이지의 x-y 위치가 광학 필드에 기록된다(단계 303).
- 그 광학 필드가 CCD 카메라(209)를 사용해서 얻어지고(단계 305) RGB(적색/ 녹색/청색) 이미지로서 PC(211)로 이송된다.
- RGB 이미지는 ILLS(색조/휘도/채도) 표시로 이송된다(단계 307).
- 색조 성분은 흑백 이미지로서 2진 양자화되어(단계 309) 190 및 255 범위의 색조값이 0(흑색)으로 표시되는 관심 영역(블롭)으로 세트되는 반면에, 모든 다른 화소값이 255(백색, 배경)로 세트된다. 그 블롭은 가능한 태아 세포 핵 영역을 표시한다.
- 2진 양자화된 이미지의 각 블롭 영역이 측정된다. 20x 배율에서, 그것이 약 20 내지 200 화소 크기의 범위외이면, 블롭 화소가 값 255(배경)로 세트되고; 그들은 더 처리되지 않는다(단계 311, 313, 315 및 317).
- 중력의 각 블롭 중심의 좌표(CG)는 커스텀 MATROX 기능을 사용해서 계산된다(단계 319). 블롭의 중력 중심은 블롭 형태의 재료의 얇고 일정한 밀도 시트의 컷아웃을 균형화시키는 지점이다. 그 좌표가 현재의 광학 필드의 z-y 위치를 따라 데이터베이스에 저장되어, 그 블롭이 더 높은 배율을 사용해서 다음의 처리 스테이지에서 다시 위치될 수 있다.
- 추가의 광학 필드는 각 연속하는 광학 필드의 x-y 위치를 유사하게 기록하면서 처리되서야, 완전한 슬라이드가 커버된다(단계 321 및 323).
도 3a 및 3b의 실시형태 흐름도에서 예시된 스테이지Ⅱ는 다음의 최종 태아 세포 인식 처리를 포함한다. 즉.
- 63x 배율이 선택된다(단계 401).
- 그 프로그램은 자동화된 스테이지(도 2의 201)로 이동하여 가능한 태아 세포 핵 영역인 이미 발견된 CG의 제 1위치 좌표가 광학 필드의 중심이다(단계 403).
- 그 광학 필드가 CCD 카메라를 사용해서 얻어지고(도 2의 209) 컴퓨터에 RGB 이미지로서 이송된다(단계 405).
- RGB 이미지는 HLS 모델로 변환된다(단계 407).
- 그 프로그램은 휘도값을 각 가능한 휘도값과 같게 되는 화소수를 카운트함에 의해 휘도 히스토그램을 발생시킨다(단계 409). 그 카운트가 각 인덱스에 대응하는 그레이-레벨값을 갖는 화소 카운트를 포함한 길이 256의 어레이로서 그 어레이에 저장된다.
- 다음에, 그 프로그램은 어레이에 저장된 값으로 표시한 바와 같이 휘도 분포 곡선을 분석하고(단계 411), 최종 정점을 위치시킨다. 그 정점은 이미지에서 플라즈마 영역을 표시하는 화소값을 포함하게 된다. 휘도 분포 곡선을 분석하는 기능은, 곡선을 유연하게 하기 위해 9-포인트 이동 평균을 계산하고; 포인트 10 그레이-레벨값에 의해 형성된 라인의 탄젠트를 멀리 계산하고; 그 라인의 경사를 각도로 계산하고; 연속점을 발견하고 - 연속점이 최소(곡선의 계곡) 또는 1로 표시되거나 최대(곡선의 정점)이면 곡선은 제로 경사이고 그 지점(그레이-레벨)을 -1로 세트하고 - ; 그레이-레벨값의 어레이에서 1 ora-1의 위치를 발견함에 의해 곡선에서 계곡 또는 정점의 위치를 발견한다.
- 그 프로그램은 분포의 최종 정점전에 발생하는 휘도 분포의 계곡에 있는 화소의 그레이-레벨값을 컷-오프값으로서 세트한다(단계 413).
- 그 컷-오프값을 사용할 때, 그 프로그램은 제 2 이진 양자화된 이미지를 생성한다(단계 415). 그것은 흑백 이미지이고, 그 흑백 이미지에서 컷 오프 지점보다 낮은 그레이-레벨값을 갖는 휘도 이미지의 화소에 대응하는 화소가 255(백색)로 세트되고 컷 오프 지점보다 높은 그레이-레벨값을 갖는 휘도 이미지의 화소에 대응하는 화소가 0(흑색)으로 세트된다. 그 이미지의 백색 블롭은 세포로서 처리되는 반면에 흑색 영역이 비-세포 영역으로서 처리된다.
- 닫히는(closing) 필터가 제 2 이진 양자화된 이미지에 사용되고(단계 417); 그 방법에서 백색 영역내의 흑점인 호올이 닫혀진다.
- 그 프로그램은 세포 영역을 측정한다. 세포의 어떤 영역이 200 화소이하라면 그 세포가 배제되고, 즉 그 세포를 구성하는 화소가 화소값(255)(흑색)으로 세트된다(단계 419).
- MIL에서 발견된 호올 충전 기능은 나머지 블롭에 사용된다(단계 421).
- 처리한 후, 최종 이진 양자화된 이미지가 마스크이고 그것의 백색 영역이 세포만을 표시한다.
- 적혈구가 HLS 이미지의 채도 구성요소를 토대로 백색 혈액 세포와는 구별된다. 그 마스크가 처리를 세포 영역만으로 제한하기 위해 사용된다.
- 그 프로그램은 화소수를 카운트하고 화소수의 채도값이 각 가능한 채도값이다. 카운트가 각 인덱스에 대응하는 그레이-레벨값을 갖는 화소의 카운트를 포함하는 길이256의 어레이로서 어레이로 저장된다(단계 423).
- 그 프로그램은 어레이에 저장된 값에 의해 표시한 바와 같이 채도 분포 곡선을 분석하고(단계 425), 제 1정점을 위치시킨다. 그 정점은 백색 혈액 세포에 포함된 영역을 표시하는 화소값을 포함한다.
- 그 정점 뒤의 제 1최소(계곡)와 일치하는 그레이-레벨값이 컷-오프 지점으로 세트된다(단계 427).
- 그 컷-오프값을 사용할 때 그 프로그램은 제 3 이진 양자화된 이미지를 생성한다(단계 429). 컷-오프 지점보다 높은 그레이-레벨값을 갖는 채도 이미지의 화소에 대응하는 화소는 255(백색)로 세트된다. 그들은 적혈구 영역을 구성한다. 컷-오프 지점보다 낮은 그레이-레벨값을 갖는 채도 이미지의 화소에 대응하는 화소는 0(흑색)로 세트된다. 그 제 3 이진 양자화된 이미지의 백색 블롭은 적혈구에 있는 영역에 대한 시드(seed)이다.
- 닫히는 필터가 제 3 이진 양자화된 이미지에 적용되고(단계 431); 그 방법에서 백색 영역내의 흑점인 호올이 닫혀진다.
- MIL에서 발견된 호올 충전 기능이 나머지 블롭에 사용된다(단계 433).
- 처리한 후, 최종 이진 양자화된 이미지가 백색 혈액 세포만을 포함하는 새로운 마스크이다.
- MIL의 삭제 경계 블롭 기능은 나머지 블롭에 적용되고(단계 435), 이미지 영역의 경계와 일치하는 화소를 포함하는 것을 제거한다. 그런 블롭이 이미지 영역의 경계와 일치할 때 얼마나 많은 세포가 소실되었는 지를 알지 못할 때, 그 블롭이 더 처리될 수 없다.
- 미란 필터가 그 마스크에 6번 사용되어; 연결된 블롭(백색 혈액 세포 시드)이 연결되지 않는다(단계 437).
- "두꺼운(thick)" 필터가 14번 사용된다(단계 439). "두꺼운" 필터는 팽창 필터와 같다. 즉, 그것은 블롭 주변에서 화소의 행을 연속해서 추가함에 의해 블롭 크기를 증가시킨다. 성장하는 블롭이 그것 다음에 성장하는 인접한 블롭과 만나면, 두꺼운 필터는 2개의 성장하는 블롭을 연결하지 못한다. 그러므로 인접한 블롭이 분리될 수 있다.
- (모든 세포를 포함하는) 제 1 이진 양자화된 마스크 및 (백색 혈액 세포의 분리된 시드를 포함하는) 제 3 이진 양자화된 마스크가 RECONSTRUCTFROMSEED MIL 오퍼레이터와 결합된다. 그렇게 구성된 제 4마스크가 제 3마스크에 의해 허여되는 제 1마스크로부터 복제된 블롭(세포)을 포함하며 백색 혈액 세포를 표시한다(단계 441).
- 제 4마스크의 블롭이 그 영역 및 완폐성(compactness)에 대해 측정되고: 영역(A)이 블롭에서 화소수이고; 완폐성이 블롭의 외주(p) 및 영역(A)으로부터 인출되고, 그것이 p2/4(A)이다. 그 형태의 소용돌이가 심할수록, 그 값이 커진다. 원은 최소 완폐성값(1.0)을 갖는다. 외주는 대각선 에찌(edge)를 디지털화할 때 생성되는 계단 효과에 대해 이루어진 허용 오차를 가지며 블롭에서 에찌의 총 길이이다(인사이드코너가 2.0 이 아닌 1.414로서 카운트된다). 블롭은, 그 영역이 1000 및 8000 화소이기만 하면, 제 4마스크에서 유지되고 그들이 3이하의 완폐성을 가져서, 상대적으로 거친 아웃라인의 세포로 된다. 이미지의 경계를 터치하는 블롭이 더 처리되지 않는다(단계 443).
- 제 4마스크는 다음의 방법(단계 445,447,449 및 451)으로 색조 구성요소에 사용된다. 즉,
- 색조 성분으로부터의 화소가 그 색조값을 유지하는 새로운 이미지에 복제되고, 그 좌표가 "마스크"에서 백색(255) 화소와 일치하는 경우에; 새로운 이미지의 모든 다른 화소가 0(흑색)로 세트된다(단계 445).
- 인접한 비(non)-0 화소 영역 각각의 화소값, 즉 적혈구의 이미지에 대응하는 그 블롭이 190 및 255간의 값으로 체크된다. 각 블롭내의 그 화소수가 카운트된다(단계 447).
- 거기에 200개 이상의 화소가 있다면, 블롭이 핵이 있는 적혈구를 표시한다. 이러한 각 셀의 중력 중심의 좌표가 저장된다. 마스크가 2진 양자화되어 비-0값을 갖는 모든 화소가 255(백색)로 세트되고; 그 마스크가 분리된 TIFF(Tagged Image File Format)로서 저장된다(단계 449).
- 그 프로그램은 이전 단계동안 저장된 좌표와 일치하지 않는 가능한 태아 세포에 대한 다음에 저장된 좌표로 이동한다. 핵이 있는 기설정된 적혈구수가 확인될 때까지, 모든 처리가 반복된다. 혈액 슬라이드에 대한 각종의 특성 코드와 함께 그 결과가 최종 텍스트 파일에 저장되고, 그 결과가 각 마스크 파일의 이름 및 핵이 있는 적혈구 좌표를 포함한다. 좌표를 저장한 핵이 있는 적혈구가 발견된 태아 세포이다(단계 451).
태아 세포와 같은 관심있는 물체가 식별된 후, 제 2신호가 상기 설명했듯이 예를 들어, 동소 PCR 또는 PCR 동소 보합 또는 FISH에 의해 발생된다.
진단 신호의 검출
동소 PCR 또는 PCR 동소 보합 처리된 세포를 포함하는 스미어는 스테이지에 위치된다(도 2의 201). 필요하다면 조정 단계가 전과 같이 실행된다. 조정은 하나의 현미경, 카메라 등으로부터 다른 것으로의 변경뿐만 아니라 날마다의 성능 변화를 소프트웨어로 하여금 보상하도록 한다. 실시형태 방법에서 진단 신호의 검출은 다음과 같이 도 4의 흐름도에서 도시했듯이 이루어진다. 즉,
- 배율 대물 렌즈 60x(63x)가 선택된다(단계 501).
- x-y 스테이지가 상기 설명했듯이 제 1신호의 검출로부터 컴파일된 최종 파일로부터의 데이터에 따라 제 1태아 세포 위치로 이동된다(단계 503).
- 광학 필드가 CCD 카메라(도 2의 209)를 사용해서 얻어지고 RGB 이미지로서 컴퓨터(도 2의 2,211)로 이송된다(단계 505).
- RGB 이미지는 HLS 모델로 변환된다(단계 507).
- 흑백 마스크를 포함하는 TIFF 파일이 분리된 이미지로서 로드된다(단계 509).
- 마스크의 백색 영역에 대응하지 않는 색조 성분의 화소가 0(흑색)로 세트된다(단계 511).
- 태아 세포를 표시하는 나머지 영역이 PCR에 따라 발생된 신호에 대응하는 화소값를 조사한다. 예를 들어, 그 신호는 적색인 알칼리 포스파타아제의 존재로 인해 발생하는 컬러일 수 있다. 색조 성분의 비 흑색 영역이 0 내지 30 범위의 화 소값으로 조사된다(단계 513).
- 그 스테이지는 다음에 비-처리된 태아 세포로 이동되고 상기 처리가 반복된다(단계 515).
PC(211)는 프레임 그래버 및 이미지 처리기 회로(217)의 동작을 제어하는 SIMPLE로 불리우는 소프트웨어 프로그램을 실행한다. SIMPLE은 프레임 그래버 및 이미지 처리기 회로(217)에 의해 포획된 이미지도 처리하고 이어서 이미지 및 처리된 데이터를 디스크 파일로서 PC(211)에 저장한다. SIMPLE은 필터링, 물체 선택 및 측정과 같은 이미지 처리 임무를 수행하는 데 특히 적합한 전문화된 루틴을 아이콘 기반의 환경에 제공한다. 대부분의 SIMPLE 임무가 마우스 또는 트랙볼(도시 안됨)과 같은 PC(211)에 연결된 포인팅 장치를 사용해서 인간 오프레이터에 의해 지시된다.
SIMPLE을 사용해서 이미지를 처리하기 위해, 다수의 이미지 조정 단계가 이루어진다. 실시형태에서, FISH를 사용해서 알맞게 염료 처리된 새로운 슬라이드가 형광 현미경에 놓여진다. 핵 또는 염색체 영역인 인식되는 관심있는 물체가 특정한 염색 특성을 갖는다. 다수의 타겟이 형광 검출 절차를 결합함에 의해 특정한 표본에서 동시에 윤곽이 그려질 수 있다. 즉, 다른 표본이 다른 파장으로 형광을 내는 다른 형광체로 라벨되면, 소프트웨어 프로그램은 다른 형광체를 방출하는 물체를 분리해서 확인하기 위해 제조될 수 있고, 제공된 완전한 컬러 정보가 이미지에 사용가능하다. 다른 형광체에 대해 다른 친화도(affinity)를 갖는 타겟이 방출된 컬러 결합에 의해 변이될 수 있다. 각 타겟이 2개 이상의 형광체에 대응하는 파장으 로 방출할 수 있으나 각 밀도가 다르다. 그러므로, 현미경 이미지의 모든 3색 성분이 처리시 사용된다.
현미경에 삽입된 각 새로운 표본에 대해, 선처리 절차가 우선 실행된다. 도 11은 본 발명의 그 실시형태의 선처리 단계를 도시한다. 선처리가 소프트웨어로 하여금 표본 단위의 변형을 보상하기 위해 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, FISH 처리된 세포를 포함하는 슬라이드가 X-Y 스테이지(201)로 위치된다. X-Y 스테이지(201)는 레어 세포를 포함하기 위해 발견된 초기 관찰 위치로 이동된다. 특정 형태의 설정된 레어 세포수가 측정되서야 처리 루프가 반복 실행된다. 본 발명이 의도되는 적용예에서, 다수의 염색체 DNA 타겟을 확인할 때, 20-100개의 핵들이 처리되었다. 그 핵들내의 염색체 영역의 측정을 표시하는 데이터가 ASCⅡ 파일에서 수집될 수 있다.
필터링 단계(12000)는 다음과 같이 화소 단위로 동작할 수 있다. 단계(12001)에서, 호올 충전 필터가 이미지에 사용된다. SIMPLE 언어를 통해 이용가능한 그 필터는, 라이트 물체 내의 다크 영역을 조사함에 의해 더 라이트한 형광 염색체 내에서 다크 호올이 나타난 때를 결정한다. 그 영역이 라이트 업된다. 호올 충전 필터의 출력은 미란 필터에 대한 입력으로서 사용될 뿐만 아니라 일시적인 이미지 파일(12101)에서 유지된다(단계 12003). SIMPLE 언어를 통해 또한 가용한 미란 필터링이 소핵의 중심 화소를 핵(kernel)의 아주 다크한 화소로 대체한다. 3×3으로 사용된 핵이 사용된다. 분리된 동작이 다음에 수행되어(단계 12005), 그들이 충족할 때까지 물체를 성장시키나, 그렇치 않을 때는 병합시키지 않는다. 그 단계 는 모든 물체의 에찌를 형성하여 아웃라인도 생성한다. 논리적인 NOT 동작은 그 아웃라인보다 차라리 선택되는 아웃라인내에서 화소를 발생시킨다(단계 12007). 결국에, 단계(12009)에서, 단계 (12007)의 결과는 저장된 일시적인 이미지 파일(12101)과 논리적으로 ANDed된다. 그것은 일시적인 이미지 파일(12101) 및 유지되는 단계(12007)의 출력에서 형성되는 그 화소만을 발생시킨다.
형광 검출 절차의 결합이 사용되면, 2개 이상의 염색체 영역이 핵마다 검출될 수 있다. 그러므로, 염색체21에 대해 2개의 염색체 영역, 염색체18에 대해 다른 2개의 염색체 영역, 염색체X에 대해 하나, 염색체Y에 대해 하나를 인식하는 것이 가능하여, 보합 신호의 계산에 의해 검출된 가능한 수치 변형의 복귀를 가능하게 한다. 보합 신호의 계산은 SIMPLE의 외부에 있는 애플케이션 프로그램을 통해 20100개의 핵의 측정을 완성한 후 실행될 수 있고, 그 SIMPLE는 CLIPPER(COMPUTER ASSOCIATION, CA)를 사용해서 컴파일된다. 그 프로그램은 측정 결과 ASCⅡ파일을 판독하고 그 RGB 컬러 결합에 따라 검출된 염색체 영역을 분류한다. 2개 이상의 다른 형광체가 결합해서 사용될 때, RGB 컬러값의 다른 결합이 다른 타겟을 구별하기 위해 사용될 수 있고, 그 일부 타겟이 하나 이상의 형광체에 의해 라벨된다. 예를 들어, 타겟이 적색 및 녹색 형광체로 염색될 수 있으나, 하나의 타겟이 형광체를 수납하여 30% 적색 및 70% 녹색을 방출하고 다른 타겟이 형광체를 수납하여 70% 적색 및 30% 녹색을 방출하는 반면에, 제 3타겟이 형광체를 수납하여 적색만을 방출한다. 3개의 타겟이 그 상대적인 방출을 토대로 구별될 수 있다. 염색체21과 같은 특정 염색체에 대응하는 염색체 영역을 표시하는 신호수가 오퍼레이터에 의해 선택 된 통계적으로 중요한 레벨에 대해 2이상이면, 특정 샘플에서 3염색체성21을 증가시킬 가능성을 확인하는 보고가 이루어된다.
본 발명이 세포-함유 샘플에서 염색체 기형의 임상 검출과 관련해서 설명되지만, 본원에 개시된 그 이미지 처리 방법은 다른 임상 적용예를 갖는다. 예를 들어, 설명된 이미지 처리 단계가 사용되어 소변검사 처리를 자동화한다. 본 출원의 기술이 1993년 10월 7일에 출원된 출원 제 08/132,804호의 그것과 결합될 때, 광범위한 세포 형태가 시각화되어 형태를 토대로 분석된다. 세포 형태는 세포 형태가 생리적인 상태와 상관되는 조건을 진단할 목적으로 관찰될 수 있다. 그 조건이 당업자에게 공지된다. 예를 들어, Harrison, supra를 참조. 각종의 세포 특성 및 기형이 그 기술를 토대로 검출된다. 결국에, 그 샘플이 혈액 샘플, 혈청 샘플, 오줌 샘플 또는 자궁 경부로부터의 세포 샘플로부터 인출될 때, 특정한 샘플 소스가 본 발명을 제한하지 않는다. 본원에서 설명된 세포 시각화 및 이미지 분석 기술이 개체 세포 분석에 의해 또는 격리된 세포의 형태 또는 다른 특징에 의해 검출가능한 상태에 대해 사용될 수 있다.
인간의 태아 헤모글로빈(Research Dignostic Inc., NJ) 및 태아 엡실런 헤모글로빈 체인(Immuno-Rx, GA)에 특정된 항체는 시판되고 있고 형광적으로 라벨된 항체로서 사용될 수 있거나 형광 신호가 형광적으로 라벨된 제 2항체를 사용해서 발생될 수 있다. 형광성 광이 본 기술에서 공지했듯이 레어 세포에 대한 다른 형태의 염료 및 라벨에 의해 생성될 수 있다. 그 처리 단계에서 요구되는 형태의 형광 염료가 본 기술에서 공지되고, 더 상세하게 설명되지 않는다.
컴퓨터 및 이미지 처리 기술은 계속해서 변한다. 상기 설명된 방법 및 장치의 필요성을 충족하는 새로운 기술은 본원에서 상세하게 설명하지 않지만 본 발명내에서 명백히 성취되어 진다. 예를 들어, 소정의 종래의 화소 및 이미지 파일 포맷이 상기에서 언급되나, 다른 것도 사용된다. 이미지 파일이 현재 본 기술에 공지된 JPEG 또는 GIF를 사용해서 압축되고 다른 기술은 개발중이다. 처리가 동시 사용된 HLS 공간을 대신해서 RGB 컬러 기재 공간에서 수행될 수 있다. 다른 컬러 공간도, 특히 필요한 특성 검출을 향상시킬때, 숙련자에 의해 사용된다.
본 발명은 다수의 특정한 실시형태와 연결해서 설명되었다. 추가의 변형이 당업자에게 명백하고 본 발명의 범위내에 있으며, 그것은 본원에 첨부된 청구범위 및 그 등가물에 의해서만 제한된다.
본 발명의 실시형태에서, 예를 들어, 태아기의 염색체 기형 및 착상전 유전자 진단, 또는 배아 또는 태아 세포의 성 염색체 검출에 대해 세포의 세포 이하의 성분의 분석 예가 예시된다.
도 13은 세포에서 X 및 Y 염색체의 확인 및 태아 헤모그로빈의 존재에 대해 세포에서 결합된 면역염색 및 FISH 분석의 포토마이크로그래프이다. 태아 헤모글로빈은 그 도면의 하부 우측 4분원에서 세포의 세포질 전부 및 세포로부터 검출된 오랜지 형광 신호에 의해 도시된 샘플에 존재한다. X 및 Y 염색체가 세포의 핵에서 각각 녹색 아쿠아 적색(green aqua red) 형광 도트로 도시된다.

Claims (15)

  1. 세포내에서 다수의 세포 성분을 확인하는 방법에 있어서,
    세포 샘플을 적어도 하나의 항체와 반응시키며, 여기서 각각의 항체는 특정한 세포 성분과 결합하고 특정한 형광 신호를 발생시키는 단계;
    상기 세포 샘플을 하나 이상의 핵산 탐침을 사용해서 동소 보합에 의해 처리하며, 여기서 각각의 핵산 탐침은 상기 세포내에서 타겟 핵산 시퀀스와 보합하도록 구성되고 특정한 형광 신호를 발생시키는 단계;
    상기 반응되고 처리된 세포 샘플의 하나 이상의 이미지를 발생시키는 단계; 및
    상기 이미지(들)에서 상기 항체 및 상기 핵산 탐침 모두에 대응하는 형광 신호를 검출 및 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포내에서 다수의 세포 성분을 확인하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 세포 샘플이 혈액 샘플인 것을 특징으로 하는 세포내에서 다수의 세포 성분을 확인하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 혈액 샘플이 말초 혈액 샘플인 것을 특징으로 하는 세포내에서 다수의 세포 성분을 확인하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 혈액 샘플이 임신한 여자의 것인 것을 특징으로 하는 세포내에서 다수의 세포 성분을 확인하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    대조구와 비교된 상기 형광 신호를 정량화하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포내에서 다수의 세포 성분을 확인하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 하나 이상의 핵산 탐침이 상기 세포 샘플의 X 및/또는 Y 염색체에 보합하도록 구성되는 것을 특징으로 하는 세포내에서 다수의 세포 성분을 확인하는 방법.
  7. 적어도 하나의 타겟 핵산에 의해 형성된 유전자 상태가 세포 샘플에 있는 지를 검출하기 위해 컴퓨터 시스템을 동작시키는 방법에 있어서,
    핵산에 타겟되는 보합된 형광 물질로 라벨된 탐침 및 관심있는 세포의 비-핵산 성분에 지향된 형광 면역염색을 갖는 고정된 샘플을 이미징하는 단계 - 상기 탐침 및 면역염색의 형광 라벨이 다름 - 와;
    상기 샘플로부터 형광을 검출하는 단계와;
    상기 면역염색 및 상기 탐침으로부터의 형광을 표시하는 관심있는 물체수를 결정하는 단계와;
    상기 면역염색 및 상기 탐침 모두로부터의 형광을 보여주는 세포의 통계적인 기대 빈도로부터 유전자 상태가 있는 지를 결정하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 적어도 하나의 타겟 핵산에 의해 형성된 유전자 상태가 세포 샘플에 있는 지를 검출하기 위해 컴퓨터 시스템을 동작시키는 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 핵산 탐침이 상기 세포 샘플의 X 및/또는 Y 염색체에 보합되도록 구성되는 것을 특징으로 하는 적어도 하나의 타겟 핵산에 의해 형성된 유전자 상태가 세포 샘플에 있는 지를 검출하기 위해 컴퓨터 시스템을 동작시키는 방법.
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 면역염색이 태아 헤모글로빈에 결합하는 것을 특징으로 하는 적어도 하나의 타겟 핵산에 의해 형성된 유전자 상태가 세포 샘플에 있는 지를 검출하기 위해 컴퓨터 시스템을 동작시키는 방법.
  10. 자연적으로 존재하는 태아 세포 농도를 함유한 모계 혈액의 샘플을 준비하는 방법에 있어서,
    상기 샘플을 관심있는 세포의 비-핵산 성분에 지향된 형광 면역염색으로 처리하는 단계와;
    상기 샘플을 관심있는 핵산 시퀀스에 지향된 형광 핵산 탐침으로 처리하는 단계와;
    상기 형광 면역염색 및 상기 형광 핵산 탐침으로부터 형광 신호를 검출하도록 작동 구성된, 컴퓨터화된 마이크로스코픽 시각 시스템을 사용해서 세포 샘플의 일부를 커버하는 광학 필드를 관찰하는 단계와;
    상기 형광 신호 검출에 의해 관심있는 핵산 시퀀스를 갖는 관심있는 세포를 확인하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 자연적으로 존재하는 태아 세포 농도를 함유한 모계 혈액의 샘플을 준비하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 관심있는 세포가 태아 세포인 것을 특징으로 하는 자연적으로 존재하는 태아 세포 농도를 함유한 모계 혈액의 샘플을 준비하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 태아 세포가 모계 혈액에서 인출되는 것을 특징으로 하는 자연적으로 존재하는 태아 세포 농도를 함유한 모계 혈액의 샘플을 준비하는 방법.
  13. 제 10항에 있어서,
    상기 핵산 탐침이 X 및/또는 Y 염색체 DNA 시퀀스를 포함하는 것을 특징으로 하는 자연적으로 존재하는 태아 세포 농도를 함유한 모계 혈액의 샘플을 준비하는 방법.
  14. 제 10항에 있어서,
    상기 컴퓨터화된 시각 시스템이 하나의 대물 렌즈를 사용해서 상기 면역염색 및 상기 핵산 탐침으로부터 형광 신호를 얻는 것을 특징으로 하는 자연적으로 존재하는 태아 세포 농도를 함유한 모계 혈액의 샘플을 준비하는 방법.
  15. 제 10항에 있어서,
    관심있는 핵산 시퀀스를 갖는 것으로 확인된 관심있는 세포의 수를 토대로 시험 진단을 자동 발생시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 자연적으로 존재하는 태아 세포 농도를 함유한 모계 혈액의 샘플을 준비하는 방법.
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