CN103649713B - 由可编程性定量检定所处理的样本的图像分析方法和体系 - Google Patents

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Abstract

公开的是由可编程性定量检定或更具体地稳健的可编程性定量点检定（PDQA）所处理的样本的图像分析方法和体系，其中PDQA使得样本能够在各种条件和应用下被成像和评价。针对免疫组化应用的具体实施方式提供更加定量的对包括组织样品的生物样品进行成像和评价的方法。

Description

由可编程性定量检定所处理的样本的图像分析方法和体系
相关申请
本申请基于35U.S.C.§119(e)要求于2010年11月29日提交的美国临时专利申请第61/417,821号的优先权的权益，其公开内容引入本文以作参考。
技术领域
本公开涉及样本的定量染色和成像，更具体地，本公开涉及组织化学染色的组织样本的定量染色和成像。
背景技术
分析科学的进展使得可以从生物样本中提取许多种信息。例如，可能可以评价健康，诊断疾病状态，鉴定可能的未来健康问题，预测治疗响应，并提供与样本获得来源的个体的基因组成相关的信息。
组织化学染色使得可以突出样本的形态学特征，并且在一些情况下可以对样本检测靶标分子的存在并使其可视化。例如，在本文也称作IHC的免疫组化染色利用基于抗体的检测体系来检测样本内蛋白的存在并使其可视化，其中针对该蛋白开发抗体。
而且，数字显微成像的进展使得能够捕获、处理和分析显微图像。
然而，组织化学染色的分析大多被认为是非定量的或最多半定量的。在使分析更加定量的尝试中，已利用组织化学染色的图像分析。例如，数字图像分析体系可以测量预定颜色阈值内的染色强度。尽管这样的体系可以帮助例如减少不同观察者之间的评分差异，但这样的分析体系遭受如下事实的影响，即样本图像内光学上可分辨的对象的形状和大小的偏差与染色之前样本中所存在特征的固有形状和大小的偏差（其通常比较高）一样高。
因此，一些常规的图像分析算法避免了根据大小和形状将对象分类的尝试，并且主要关注样本内不同颜色染色的比率。其它图像分析算法尝试了使用相当复杂的对象识别技术，其也须处理天然出现的样本内特征的形状和大小的偏差。
因此，需要开发克服了常规检定和成像体系的限制和缺点的样本成像方法和体系。
发明内容
在当前公开的实施方式中，描述数个示例性方法和体系，其可用于对样本进行成像和分析。
一个示例性的公开实施方式可以包括对样本的至少一个目的区域中的至少一个靶标分子的表达进行光学定量的方法。该方法可以包括在样本的部位处产生光学可识别的点，其中至少一个点对应于单一靶标分子。点的特征可在于大小和形状的原位可编程性特征以及至少一个额外的可编程性光学特征，并且在给定区域内的部位处产生的点的数目可以代表该区域内靶标分子总群的部分子群（sub-population）。该方法还可包括对样本成像，在图像内选择至少一个目的区域，在该至少一个目的区域内识别至少一个点，以及在该至少一个目的区域内对点进行定量。
在本公开的另一示例性实施方式中，用于对样本的至少一个目的区域中至少一个靶标分子的表达进行光学定量的体系可以包括用于检测样本中该至少一个靶标分子的部分子群的第一试剂盒，以及用于在样本的部位处产生光学可识别的点的第二试剂盒，其中至少一个点对应于单一靶标分子。点的特征可在于大小和形状的原位可编程性特征以及至少一个额外的可编程性光学特征。在给定区域内的部位处产生的点的数目可以代表该区域内靶标分子总群的部分子群。这样的体系也可以包括：适于使用第一试剂盒和第二试剂盒执行染色方案的染色器、适于对样本成像的成像器、以及配置成在至少一个目的区域内识别至少一个点并在该至少一个目的区域内对点进行定量的处理器。
在又一示例性实施方式中，对样本的至少一个目的区域中至少一个靶标分子的表达进行光学定量的方法可以包括在样本的部位处产生光学可识别的点。至少一个点可对应于单一靶标分子。点的特征可在于大小和形状的原位可编程性特征以及至少一个额外的可编程性光学特征。在给定区域内的部位处产生的点的数目可以代表该区域内靶标分子总群的部分子群。各个点可以代表预定统计界限内的预定数目的靶标分子。该方法还可包括对样本成像，在图像内选择至少一个目的区域，在该至少一个目的区域内识别至少一个点，以及在该至少一个目的区域内对点进行定量。
在又一实施方式中，用于对样本的至少一个目的区域中至少一个靶标分子的表达进行光学定量的体系可以包括用于检测样本中该至少一个靶标分子的部分子群的第一试剂盒，以及用于在样本的部位处产生光学可识别的点的第二试剂盒，其中至少一个点对应于单一靶标分子。点的特征可在于大小和形状的原位可编程性特征以及至少一个额外的可编程性光学特征。在给定区域内的部位处产生的点的数目可以代表该区域内该至少一个靶标分子总群的部分子群。各个点可以代表预定统计界限内的预定数目的靶标分子。该体系还可包括：适于使用第一试剂盒和第二试剂盒执行染色方案的染色器、适于对样本成像的成像器、以及配置成在至少一个目的区域内识别至少一个点并在该至少一个目的区域内对点进行定量的处理器。
在又一实施方式中，对样本的至少一个目的区域中至少一个靶标分子的表达进行光学定量的方法可以包括使用成像器对样本成像，在图像内选择至少一个目的区域，以及在该至少一个目的区域内样本的部位处识别至少一个光学可识别的点，其中至少一个点对应于单一靶标分子。点的特征可在于大小和形状的原位可编程性特征以及至少一个额外的可编程性光学特征来。在给定区域内的部位处识别的点的数目可以代表该区域内靶标分子总群的部分子群。点可以代表预定统计界限内的预定数目的靶标分子。该方法还可包括基于至少一个识别出的点执行至少一个图像分析步骤。
在又一示例性实施方式中，用于对样本的至少一个目的区域中至少一个靶标分子的表达进行光学定量的体系可以包括适于对样本成像的成像器以及至少一个处理器，处理器配置成在图像内选择至少一个目的区域、在该至少一个目的区域内样本的部位处识别至少一个光学可识别的点，其中至少一个点对应于单一靶标分子。点的特征可在于大小和形状的原位可编程性特征以及至少一个额外的可编程性光学特征。在给定区域内的部位处识别的点的数目可以代表该区域内靶标分子总群的部分子群。各个点可以代表预定统计界限内的预定数目的靶标分子。处理器还可配置成基于至少一个识别出的点执行至少一个图像分析步骤。
在另外的实施方式中，对组织样本中多重（multiplexed）诊断指示物进行光学定量的方法可以包括在组织样本中至少一个目的区域内产生第一多重诊断指示物。第一多重诊断指示物可以包括样本部位处的第一组光学可识别的点，其中至少一个点对应于单一第一靶标分子。第一组点的特征可在于大小和形状的原位可编程性特征以及至少一个额外的可编程性光学特征。在给定区域内的部位处产生的第一组点可以代表该区域内第一靶标分子总群的部分子群。该方法还可包括在该至少一个目的区域内产生第二多重诊断指示物，对样本成像，以及评价第一多重诊断指示物和第二多重诊断指示物。评价第一多重诊断指示物可以包括在该至少一个目的区域内识别至少一个第一组点，以及在该至少一个目的区域内对第一组点进行定量。该方法还可包括至少部分基于第一和第二多重诊断指示物评价结果来确定组织样本的总体诊断评价。
附图说明
图1示出包括显微镜片扫描仪的用于处理样本的体系和试剂盒。
图2A示出对通过常规染色而染色的样本进行评分的手动和自动图像分析结果的比较图。
图2B是使用常规免疫组化进行染色的组织的图像。
图2C是示出作为白色像素的棕色染色组织和作为黑色像素的背景的处理图像。
图3A是通过常规免疫组化检定染色的样本（左板块）和通过可编程性点定量检定染色的样本（右板块）的图示，其示出各个检定在具有不同水平的靶标表达的区域中看起来如何。
图3B将基于强度定量的常规IHC染色（左板块）与基于点定量的PDQA染色（左板块）进行比较。
图3b示出根据传统HRP-DAB法和根据示例性实施方式的组织学片子的示例性染色。
图4示出对通过可编程性定量检定所处理的样本的图像进行分析的方法的实施方式的操作步骤。
图5A-5C是通过常规免疫组化染色的癌症状态已知的对照细胞系的图像。
图5AA-5CC是通过可编程性定量检定所处理的癌症状态已知的对照细胞系的图像。
图5D示出显示通过可编程性定量检定所处理的对照细胞系的图像分析结果的一致性的表。
图6A-6D描绘四个不同分辨率下的通过可编程性定量检定所处理的一个样本的图像的一个视野。
图6E示出在图6A-6D中所描绘的在不同分辨率下拍摄的图像中对视野的图像分析结果基本上匹配的表。
图7A示出在具有由可编程性定量检定所处理的对照细胞系的片子上方焦点外两步拍摄的图像。
图7B示出在具有由可编程性定量检定所处理的对照细胞系的片子下方焦点外两步拍摄的图像。
图7C示出在五个不同焦平面拍摄的图像（包括图7A和7B中所示的那些）中对一个视野的图像分析结果基本上匹配的表。
图8A示出手动识别和注释斑点（blob）的以具有由邻位连接检定所处理的对照细胞系的片子为焦点而拍摄的图像。
图8B示出图8A的图像，其中通过图像分析软件识别和注释斑点。
图8C示出通过人工计数和通过图像分析软件来识别和注释斑点的以具有由邻位连接检定所处理的对照细胞系的片子为焦点而拍摄的图像的比较结果表。
图9A描绘通过可编程性定量检定所处理的组织样本的图像。
图9B描绘呈现通过可编程性定量检定所处理的组织样本的图像内的点群的统计学边界（statistical bounding）的点大小柱状图。
图10A描绘通过可编程性定量检定所处理的组织样本的图像。
图10B描绘图10A所示图像内的点的对象伸长率（elongation）的柱状图。
图10C描绘图10A所示图像内的点的对象紧密度的柱状图。
图10D描绘图10A所示图像内的点的对象最小最大费雷特比率（feret ratio）的柱状图。
图10E是使用共聚集显微镜得到的PDQA点图像的XY2D图像。
图10F示出PDQA点的Z-轴横截面视图。
图11A描绘通过可编程性定量检定所处理的组织样本的图像。
图11B描绘图11A所示图像内的点的对象伸长率的柱状图。
图11C描绘图11A所示图像内的点的对象紧密度的柱状图。
图11D描绘图11A所示图像内的点的对象最小最大费雷特比率的柱状图。
图12A示出通过可编程性定量检定所处理的样本的图像。
图12B示出区分靶标点与图12A所示的人为物1206的处理图像。
图12C示出以PDQA点作为至少一种多重组分的执行多重诊断的方法的操作步骤。
图13A示出通过执行图像分析以对至少两类对象进行分类和计数并考虑所分类对象的数量进行评分从而评价样本的方法的实施方式的操作步骤。
图13B示出具有靶标点和参考点的样本的图像，其中靶标点和参考点具有将靶标点和参考点区分开的光学特征（例如颜色）。
图13C示出进行靶标点与参考点之间的对比度增强和背景减少的处理的图像。
图13D和13E示出在相同片子上使用常规IHC进行多重化（multiplexed）的PDQA点。
图14A是由可编程性定量检定所处理的对照细胞系样本的图像。
图14B是由邻位连接检定所处理的对照细胞系样本的图像。
图15示出由可编程性定量检定所处理的样本的图像并示出癌区域的放大图，其中通过点重叠而突出高靶标表达水平。
图16A示出由可编程性定量检定所处理的样本的图像，其中背景染色与细胞核复染相关。
图16B示出通过图像分析友好型的复染法的实施方式处理的背景减少的样本的图像。
图17A-17B示出通过被编程为呈现颜色偏移光学特征的可编程性定量检定进行染色的样本的图像。
图17C-17D示出被编程为分别具有相对较高和较低的清晰度的点。
图17E是被编程为具有清晰周边和低背景的PDQA点的图像。
图17F是被编程为具有清晰周边的PDQA点的图像。
图17G是被编程为具有较不清晰的周边的PDQA点的图像。
图18A-18B示出由被编程为呈现同心环（ringedness）光学特征的可编程性定量检定所处理的样本的图像。
图18C-18E示出关于环状衍射特征的焦深的效果。
图18F-18G示出呈现环状衍射特征的PDQA点的RGB强度特性组成。
图18H和18I示出可编程以产生明视场照明中的圆形点以及环形形状的PDQA点。
图19示出通过图像分析以对对象进行分类和计数并通过使用统计测度调整点计数来评价图像的方法的实施方式中的操作步骤。
图20A示出由可编程性定量检定所处理的样本的图像。
图20B-20C示出从使用圆形结构元素的图像处理方法的实施方式得到的图像处理结果。
图21A示出在变化的预分析处理条件下对靶标点和用于稳健性与质量控制的参考点成像的方法的比率实施方式的操作步骤。
图21B示出在正常的预分析处理条件下分析具有靶标点和用于稳健性与质量控制的参考点的图像的方法的比率实施方式。
图21C示出在抑制靶标和参照物的可得性的改变的预分析处理条件下分析具有靶标点和用于稳健性与质量控制的参考点的图像的方法的比率实施方式。
图22示出由被编程为产生具有与多个靶标对应的多个编程颜色的点的可编程性定量检定所处理的样本的图像的成像分析方法。
图23示出由被编程为产生具有与多个靶标对应的多个编程大小的点的可编程性定量检定所处理的样本的图像的成像分析方法。
图24A-B示出通过红色和绿色定量荧光检定进行染色的样本的图像，其提供可编程性点各自连接到单一靶标分子的证据。
图25A-25D示出以可编程性定量检定使用降低浓度的第二标记抗体处理四次的样本的图像。
图26示出使用由可编程性定量检定所处理的样本的图像分析方法的实施方式而产生的点计数和点强度的线性。
图27示出每细胞的预测点数与每细胞的测量点数的比较图。
图28A-28B描绘对样本执行图像分析的实施方式，该样本通过将液体经过多孔基质然后由可编程性定量检定来处理携载样本的基质而产生。
图29描绘由可编程性定量检定使用可检测的标记物处理生化加密印刷（encrypted printing）的图像分析结果的实施方式。
具体实施方式
定义
如本文所使用的可编程性的（programmable）是指可改变的或可变化的，以响应于化学反应条件的有意变化而产生预定集合或范围的结果，其中化学反应条件包括化学组分、温度、时间、浓度、化学反应、免疫化学反应等。
如本文所使用的定量的是指包括可测量数据的检定或图像。例如，图像可以包括许多离散对象，并且这些对象可以通过计数、测量其形状或大小、测量其在图像的区域内出现的频率以及任何其它将客观的数值分类应用于数据的方式来进行测量。
如本文所使用的定量是指对量进行测量或确定，从而表示为量或者以定量的项进行表示。例如，定量可以包括：计数，测量宽度、长度、直径和面积，测量形状，计算密度，计算频率，计算距离，以及执行任何其它定量测量或与本公开一致的测定。
所使用的成像在本文中是指通过光学手段包括明视场显微术、荧光显微术、全息成像、摄影、相位全息成像、相差显微术、共聚焦显微术、3D显微术、反卷积显微术来查看或拍摄图像。如本文所使用的成像器是指任何适用于成像的体系或装置。
所使用的评价是指评估、估计（质量、值或程度）、测量、评分或判断。评价样本内或样本的目的区域内的靶标分子表达可涉及生成或产生评分。评分可以是，例如绝对靶标表达水平，即与相对靶标表达水平相对，与样本内靶标分子的总数成比例并代表样本内靶标分子的总数的靶标表达评分。评价还可以包括生成与常规病理学评分例如Allred评分相关的临床上有意义的复合评分。
如本文所使用的局部化（localized）是指固定于（样本）的特定部分；聚集或集中到一个点或部分，出现在或限制于样本的某个或某些特定部分。局部化是指在样本图像的子区域或样本图像的目的区域内找到的对象和特征。例如，局部化的表达水平可指表征子区域的表达水平。
原位是指出现在样本处或其环境附近。
如本文所使用的光学可识别是指基于光学特征可检测或可识别。光学可识别可指通过光学手段拍摄的图像中的特征，或者可指通过人眼在有或没有视觉辅助的情况下可检测或可识别的特征。
如本文所使用的光学特征是指通过光学手段包括明视场显微术、荧光显微术、全息成像、摄影、相位全息成像、相差显微术、共聚焦显微术、3D显微术、反卷积显微术和人视觉可辨识的特征。
如本文所使用的光学中性（neutral）结果是指不是光学特征的结果。
如本文所使用的点（dot）是指具有基本上圆形的形状包括圆、球、裁剪圆（clippedcircle）或裁剪球（clipped sphere）的光学可识别的对象。
如本文所使用的部分点是指形状为基本上圆形形状（包括圆或球）的一部分的光学可识别对象。部分点可以包括弧、裁剪圆或裁剪球。
如本文所使用的点簇是指包括至少部分重叠的点的光学可识别对象。
如本文所使用的词语“靶标”是指目的对象，其可以存在于样品中并且特征可在于特定的物理和/或功能特征。如本文所使用的靶标分子可指由目的分子构成的靶标。在本公开的上下文中，术语“靶标”和“靶标分子”可涉及基本上相同的实体或分子的全部集合（pool），或者可涉及单个实体或分子。
如本文所使用的部位是结合剂会与其结合的样本内固定靶标分子例如表位、抗原等的位置。与结合剂（直接或间接）结合的靶标分子的单个单元可以构成本发明的单个靶标部位。可以通过在点数与靶标分子的量之间显示基本线性相关来确立点是否与单一靶标分子对应。
如本文所使用的术语“结合剂”是指能够与靶标分子的单个单元（例如靶标蛋白的单独分子）直接或间接特异结合的分子。结合剂可以包括可检测标记物，例如荧光物质、半抗原、酶等。例如，结合剂可以包括酶标记物，其在暴露于适当底物时，在酶标记物的部位处引起可检测沉淀形成。贯穿本公开，任何可考虑使用特定标记物例如酶的实施方式应理解为考虑使用其它任何适当的标记物。在其它实施例和实施方式部分中描述了适当标记物的其它实例。
如本文所使用的基本上是指比该值大一定量，该量通常会因化学过程、温度等的无意变化而出现。
如本文所使用的斑点（blob）被定义为一组连接的对象像素，其中对象像素是具有非零权重的任何像素。
如本文所使用的术语“处理器”可以包括对输入执行逻辑操作的电路。例如，这样的处理器可以包括一个或多个集成电路、微芯片、微控制器、微处理器、所有或部分中央处理单元（CPU）、图形处理单元（GPU）、数字信号处理器（DSP）、现场可编程门阵列（FPGA）或其它适合于执行指令或执行逻辑操作的电路。如果处理器接入、被编程为具有、包括、或者另外制成能够实施用于执行动作的指令，则处理器可以配置成执行动作。处理器可以直接通过永久或暂时保持于处理器中的信息，或者通过由处理器接入或提供至处理器的指令，而被提供这样的指令。提供至处理器的指令可以以计算机程序的形式提供，计算机程序包括有形地实施在信息载体例如在机器可读存储装置或任何有形计算机可读介质中的指令。可以以任何形式的编程语言包括编译或解释语言来写入计算机程序，并且可以以任何形式包括作为独立程序或作为一个或多个模块、部件、子程序或其它适用于计算环境的单元进行部署。至少一个处理器可以包括专用硬件、通用硬件、或这两者的组合，以执行相关指令。处理器还可以包括集成通信接口，或者可以包括与处理器分开的单独的通信接口。至少一个处理器可以配置成通过与存储单元或存储装置的连接来执行指定功能，在存储单元或存储装置中存储有执行该功能的指令。
前述定义并不意在限制所定义术语的范围，而仅是对所定义术语提供一些示例性可能。所定义术语的其它实施例和实施方式可以在本公开的其它实施例和实施方式部分中找到。
现在将详细地参考本发明，其实施例图示在附图中。在以下描述中提到的实施不表示所有与主张权利的发明相一致的实施。相反，它们仅是一些与本发明的某些实施方式一致的实施例。
与本发明一致的体系和方法可以确定与病理学实验室处理一个或多个样本的一个或多个方面相关的性能数据。如本文所使用的术语“样本”广泛地指出于在实验室中执行操作的目的而获得的任何材料或材料部分。例如，实验室可以接收从生物中移取的样本并制备样本用于分析、测试和/或储存。示例性类型的样本包括取自动物或人的组织或其它生物样品。另外，样本可以包括在本公开的其它实施例和实施方式部分中进一步描述的其它类型的样本。如本文所使用的词语“片或片子（slide）”可指在其上封有样本的片子，并且可以包括任何类型的封片介质、盖玻片、以及任何其它适用于携载样本的支承物。
图1示出用于处理样本的体系100和试剂盒112。体系100可用于产生由可编程性点定量检定所处理的样本图像。在本文件的其它实施例和实施方式部分中描述了包括可编程性点定量检定的试剂盒112的示例性实施方式。
试剂盒112可以包括用于在单个检测到的靶标分子的部位处产生光学可识别点的试剂。点的特征在于多个可编程性光学特征例如大小、形状、颜色、色调、饱和度、强度、清晰度、相移、同心环、球形度、面积、周长、长度、宽度、取向、轴比、弗雷特直径、伸长率、圆度、圆形度、偏心度、光衍射、焦点、荧光和紧密性。
许多样本例如人细胞相对于每一细胞包括成百上千个不同类型的蛋白分子。在本发明的实施方式中，可以在靶标分子总群的部分子群的部位处产生可编程性点。检定可以编程为具有点产生率，使得各个点可以表示单个分子、数百或数千个被检测分子、或甚至更多。
因为可编程性点定量检定的实施方式具有可编程性光学特征例如大小和形状和其它特征例如颜色，因此在一些情况下可以检测期望的可编程性光学特征，甚至通过使用常规的显微镜片扫描仪例如扫描器101来评价样本内的区域靶标分子表达；然而，低成本显微镜或其它光学检测体系或者甚至人视觉可能足以检测通过可编程性定量点检定进行染色的样本的光学特征。
此外，可以使用用于处理常规染色的免疫组化（“IHC”）片、通过苏木精和曙红染色的片子（在本文中也称作H&E片）、或封固于片子或任何类型的样本载体上的任何类型的样本的相同类型的仪器和过程，完成样本的处理。染色器110可以是自动处理片子的自动染色器。染色器110可以与染色器网络107连接，染色器网络107又可以与工作站108连接，其可作为服务器或客户端或组合的客户端/服务器。染色器网络107可经由网络硬件106与片子扫描器101连接，该片子扫描器101可具有与扫描器101位于一处或位于远处的观察端102。任何网络连接可以包括局域或广域连接，其包括互联网或其它公用网络。图像存储和处理硬件可以集成到扫描器101内或者可以是单独的工作站104。
图2A示出对通过常规染色而染色的样本进行评分的手动和自动图像分析结果的比较图。手动评价的IHC染色202与荧光原位杂交的一致性通常在约60%到大于90%变动。使用自动细胞成像体系和附随的算法（也称作ACIS）帮助提高所有参加的病理学家间的一致性。
图2B是使用常规免疫组化进行染色的组织的图像。作为实例，对HER2的Her2表达的手动评价或评分可以如下进行评价：对于在<10%的肿瘤细胞中具有膜染色的样本，评价0表示正常水平的Her2；对于在>10%的细胞中具有微弱或不完整膜染色的样本，评价1+；对于在>10%的细胞中具有弱或中等的完整或不完整染色的样本，评价2+；在>10%的细胞中具有强的完整膜染色的样本，评价3+。评分为3+的肿瘤被当做明显是HER2-阳性案例；评分为0/1+的肿瘤可被指定为HER2-阴性案例；边缘性案例（2+）可能需要通过荧光原位杂交进行进一步研究，以评价它们是否显示基因增殖。与样本内的开放空间或与结缔组织相对应的像素被当做背景222。在强烈过表达HER2的位置，可以看见与深染的组织细胞膜224相对应的像素。
图2C是由图2B生成的处理图，其示出如下实例，其中图像被分割成表示为白色像素242的棕色染色组织，并且所有其它像素被当做表示为黑色像素244的背景。
图3A是通过常规免疫组化检定染色（例如，如以上关于Her2IHC染色所述的）的样本图像301以及通过可编程性点定量检定染色的样本图像300的图示。其它实施例和实施方式部分描述了化学组合物、用于产生和利用可编程性点定量检定的一些实施方式的方案和方法。
对于图像301和300二者，椭圆区域303包括相对较高的靶标表达区域，椭圆区域305包括中等水平的靶标表达区域，并且椭圆区域307包括相对较低的靶标表达区域。通常可通过评价染色的强度和面积来手动或数字地执行对常规图像301的图像分析。例如，在常规图像301的区域303内，高染色强度，即例如区域302处指示的深染色表明较高的靶标表达水平。在常规图像301的区域305内，部分区域例如区域304内的深染色强度表明该区域内中等水平的靶标表达。在区域307内，小区域306内的中等染色表明该区域内的低靶标表达水平。
在本发明的一个实施方式中，示出通过可编程性定量检定处理的样本的定量图像300。可编程性定量检定产生定量图像300，其在区域303内具有大量的点308。该图像是定量的，因为在成像之前，图像300区域303内的高靶标表达水平已有效地转化成离散的定量对象，即可以进行成像、识别和分类的点，从而评价样本内的靶标分子的区域水平。图像300区域305内的点310较少且更加分散，表明中等水平的区域靶标表达水平。图像300区域307内的大开放区域312（在此产生的点相对较少且这些点有些分散）指示较低的靶标分子表达水平。
图3B描绘两个组织样本的比较。在左方，通过常规IHC染色进行染色的组织切片示于图像320中。在右方，通过可编程性点定量检定的实施方式染色的组织切片示于图像330中。还示出重叠于图像320上的矩形边界框322。边界框322还放大示出，其内描绘出癌细胞的常规IHC染色的图示。如经由图像320和边界框322的放大图示中可见，可以在细胞的周边即细胞膜附近观察到深染色。HER2/neu（也称为ErbB-2）代表“人表皮生长因子受体2”，其是在乳腺癌中产生较高侵略性的蛋白。其为ErbB蛋白家族的成员，ErbB蛋白家族更通常地被称作表皮生长因子受体家族。在放大边界框322内的图示中，两段细胞膜326和324被描绘为黑线，表示深染色的膜，这从显微照片图像320可见。在常规IHC的典型实例中，在组织切片上孵育靶标蛋白的一抗。然后，在组织切片上孵育在直接IHC方法中与一抗结合的酶标记物（例如辣根过氧化物酶），或者在间接IHC方法中与一抗结合的二抗。酶标记物与底物反应，以在结合有酶的位置产生染色沉淀，例如二氨基联苯胺（DAB）产生棕色染色。在靶标蛋白的表达较高的位置，沉淀更多的色原，引起染色的强度或深度更高。常规IHC的图像分析通常包括测量染色的强度，该染色强度通常指示靶标蛋白的表达水平。
在图像330中，描绘通过可编程性点定量检定（PDQA）进行的染色。在一个典型的PDQA染色间接方法中，如常规IHC那样施加一抗，以检测组织切片内的靶标抗原并与其结合。然后施加二抗。然而，对于PDQA的实施方式，仅预定部分的二抗被标记。在最终染色步骤之前，出现放大反应，导致从单个结合靶标抗原的部位径向延伸的强烈的球形沉淀，这导致在预定部分的靶标抗原部位的部位处形成具有可编程性的大小和形状的光学上可区别的点。下面在其它实施例和实施方式部分中描述示例性实施方式的更详细说明。
从图像分析角度出发，结果是，代替如在对IHC染色组织的图像分析中通常进行的通过测量非离散染色的强度来确定样本内的区域靶标蛋白表达，对于PDQA，通过识别具有编程性的大小、形状以及其它可编程性的光学可识别特征例如颜色、强度、清晰度、折射特性等，然后对点进行定量（例如通过计数或其它定量方法），来测量表达水平。因为带标签抗体的比例是已知的，点定量步骤的结果可以用于在统计学误差界限内对于组织区域计算靶标抗原的绝对表达水平。在其它实施例和实施方式部分中提供PDQA的实施方式可如何用于确定绝对靶标抗原表达水平的其它详细描述和实施例。
在常规IHC染色中，通过靶标抗原所位于的组织成分的大小和形状来初步确定图像内染色对象的大小和形状。这在图33b的边界框322中图示，此时染色区域的形状遵循细胞膜的形状，且染色的大小是表达充足的靶标抗原结果被染色的细胞膜的大小。
相比之下，如边界框332中图示的通过PDQA产生的点具有大小、形状、以及其它统计学上一致且可预料地通常不依赖于组织组分的大小和形状（例如在本实施例中，表达充足的靶标抗原从而导致一抗结合的细胞膜的大小和形状）的可编程性的光学可识别特征。
图4示出对通过可编程性定量检定所处理的样本的图像进行分析的方法400的实施方式的操作步骤。在一些实施方式中，获得样本404。如果需要可执行预分析步骤（图4中未示出但关于图21A-21C更详细地讨论），之后通过可编程性点定量检定执行处理即染色406。染色包括在样本内或样本上产生光学可识别或可识别的对象。例如，在一些实施方式中，在部位处例如部分子群的靶标部位处产生大小适合于对样本图像执行图像分析的基本呈圆形的点。
然后对染色或处理样本进行成像408，例如经由常规显微镜或人视觉而光学成像的图像情形。在一些实施方式中，例如通过具有附接的数字摄像机的显微镜或显微镜片扫描器，可对染色或处理的样本进行数字成像。
再次手动或数字地选择图像内的目的区域410，需要对该区域评价靶标表达水平。
然后可以手动或自动地或者在一些实施方式中半自动地分析图像。可以在样本内或样本上产生化学编程为具有光学可分辨或可识别特征的例如点的对象。在一些情况下，对象可以重叠或形成簇例如点簇。分析图像的步骤412可以包括预处理，例如背景减除或反卷积。步骤412还可以包括分割。分割可以是手动的或自动的。分割可以基于以许多可能的色彩空间中的一种、或以黑色和白色、或以灰度的像素的强度。还可以使用基于边缘的分割，例如基于内核的分割或使用结构元素的分割。还可以基于图像能量、概率模型、约束模型、或内部/外部功能的原则，使用基于区域的分割。
作为步骤412的一部分，可以基于任何可编程性光学特征对图像执行特征提取，即对象检测或识别。例如在一些实施方式中，产生的对象是基本圆形的点。在其它实施方式中，对象可在光学上呈现为同心环。这将会关于图17A-17B和图18A-18C进一步地讨论。
步骤412还可以包括例如基于形状或强度的过滤操作。
步骤412还可以包括对象分类操作，例如构建Voronoi图表或分析核或周边。经由三角剖分和网格生成的点追踪是结构分析的其它实例。
对于常规IHC染色，经常使用染色的颜色或色调作为主要参数来执行分割，以分割出未染色的组织和染色的组织。通常，色调或颜色在以下范围内的图像像素被认为是背景像素，即在预定为与未染色的结缔组织对应或与切片内的开放未染色区域对应或与不存在组织的片子区域对应的范围内。同样地，色调或颜色在预定为与所选染料对应的范围内的图像像素被鉴定为进一步分析的像素。进一步分析可包括强度测量、对象识别或任何数目的图像处理分析。然而，在PDQA染色的实施方式中，不需要首先按染色的颜色或色调来分割图像。由于通过PDQA染色产生的点具有光学可识别且不依赖于颜色的可编程性大小和形状，因此可以首先通过大小和形状接着通过按颜色或色调的进一步分类来识别点的可编程性特征。或者，对光学可编程性特征组的识别和定量可以以多个参数同时地或以任意期望的顺序发生。可以找到用于识别具有一定形状或大小的对象的图像分析技术。作为一个例子，霍夫变换是用于检测圆的技术。存在广义版本和概率版本的霍夫变换。也可以使用椭圆拟合法。
图像的分类可以包括步骤414，对目的区域内的对象进行定量。在一些实施方式中，定量步骤可以包括例如点计数、归一化点计数、每单位面积的点计数、每细胞的点计数、每细胞核的点计数、每区域的点计数、或不同类型的对象或点的比例计数。还可以通过对点区域、染色像素区域、与样本特征相关的点位置、与其它点相关的点位置、或与包括形态学特征的其它特征相关的点位置进行定量来完成定量。
还值得注意的是如下事实，即由于PDQA点可以被编程为具有基本上圆形的形状和预定范围内的大小，因此可以对各个点计算中心点或点的原点。在对各个点以数学法指定点的原点并使用任何可得的可编程性特征对点分类后，就可以使用几何分析技术，其不需要考虑点的大小和形状的计算，而是使用各类点的原点坐标来执行计算。原点之间的距离、原点的区域密度等可以用于进一步的计算和分析。
通过使用无监督学习技术（例如聚类，其使用k均值、k最近邻、主成分分析（PCA）、独立成分分析（ICA）、奇异值分解（SVD）、矩阵分解、神经网络、贝叶斯方法、期望最大化、自组织映射（SOM）、基于图的方法例如抓取分割（grab cut）或归一化割、信息理论法例如MDL、最小信息长度（MML）、核PCA变型以及其它技术），或者直接或在聚类（使用神经网络、核方法、贝叶斯方法、决策树、推进、SVM、随机算法）之后使用监督方法，可以一起利用所有特征（大小、形状、颜色、强度、清晰度、折射特性等）以分出一种或多种点（单个或多重）。也可以使用半监督算法，其将包括这些技术中的大部分。
可以显示样本的图像、处理图像、或图形数据、数值数据或文本数据。
基于步骤412和414中执行的图像分析对样本图像或图像区域进行评价或评分的步骤416涉及生成或产生评分。在一些实施方式中，评分可以是绝对靶标表达水平，即与相对靶标表达水平相对，与样本内靶标分子的总数成比例并代表样本内靶标分子的总数的靶标表达评分。
评价或评分的步骤416还可以包括生成与常规病理学评分例如Allred评分相关的临床上有意义的复合评分。
图5A-5C是通过常规免疫组化染色的癌症状态已知的对照细胞系的图像。表现了具有不同水平的Her2表达的人乳腺癌细胞系。呈现这些图像用于之后与使用可编程性点定量检定的定量染色进行比较。
图5A是细胞系MDA-231的图像，细胞系MDA-231是不表达高水平Her2的乳腺癌细胞的例子。图5A以及图5B和5C显示使用苏木精复染为蓝色的细胞503，其中苏木精使得细胞核在图像中呈现深蓝色。不存在细胞的背景区域508可以或可以不呈现为具有一些弱蓝色苏木精染色或背景染色。在图5A中，没有明显的棕色二氨基联苯胺（下文为DAB）染色。
在图5B中，在某些细胞膜的弧或部分，部分膜染色504可见为棕色DAB染色，表明低水平的靶标表达（在此实施例中为Her2）。细胞系MDA-175用作为对照细胞系，以提供应评分为1+的染色类型的视觉例子。其还可以用作为检查染色过程的质量控制机构。如果对照细胞系MDA-175经受规定的处理方案且条件正常，预期会看见与图5B的图像相似的图像。
图5C的图像显示在目的区域内约>10%SK-BR-3细胞的完全膜染色；因此，如图5C所示的细胞系SK-BR-3评分为3+，即Her2阳性。
因此，可以手动或在图像分析体系的帮助下对图5A-5C的图像进行评价/评分。然而，染色区域的大小并非经可编程性定量检定而产生。相反，通过样本固有结构的大小和形状以及在该结构内的靶标表达的相关水平来确定染色区域的大小和形状。
图5AA-5CC是通过可编程性定量检定所处理的癌症状态已知的对照细胞系的图像。
在图5AA中，可以看见具有深蓝色染色核例如核503的蓝色复染细胞。蓝色染色核的数目可以充当可用作参考的细胞估计数目。还可以看见非样本区域508或背景。取决于照明条件，在背景区域508中可能可见淡蓝色。在某些条件下这可能需要额外的过滤，使得具有淡蓝色的像素不会无意地与目的对象例如蓝色的染色核一起分类。对于核503和背景，通过样本的大小和形状以及其周围环境来确定染色的大小和形状。
值得注意地，对于经可编程性点定量检定（也提及为可编程性离散定量检定或PDQA）所处理的图像的分析方法的实施方式，产生例如图5AA中所示的点509的点。对于PDQA（也称作单分子检测或PDQA），点的大小和形状不是通过样本的大小和形状或其周围环境来确定的。将产生的点的大小和形状可被原位（即，当PDQA试剂在处理即染色样本时）编程。其它光学特征或特性例如点颜色可被编程到PDQA中，使得更容易地对点光学识别。例如，点509具有微红色调，其因与背景508的淡蓝色和核503的深蓝染色不同而可被识别。
因此，在本实施例中产生的点的光学特征有意地是可编程性的和一致的。其大小和形状不依赖于样本内或样本周围的元件的大小和形状。点的大小、形状或颜色也不显著地依赖于样本内的靶标表达水平。这能够使得更容易地对点进行光学检测和/或识别/分类，而不管样本的性质或状态。
值得注意地，点的数目事实上依赖于给定区域的靶标表达水平，或与参照例如细胞核数目进行比较。而且，点的定位和点之间的距离与区域靶标表达水平相关。通过可编程性点定量检定来处理高水平的靶标表达，以在高表达区域内产生更多的点。
如预期，图5BB显示对于评分为1+的癌细胞系产生比图5AA中具有较低Her2靶标表达的癌细胞系更多的点511。
图5CC显示显著更高数目的红点514，并且可以看见一些双点或点簇例如点簇515，其中三个点形成位于细胞膜弧形部分的弧。
图5D示出表530，其显示通过可编程性定量检定所处理的对照细胞系的图像分析结果的一致性。
表530的550列容纳所使用的癌细胞系的名称，从540行中的最低靶标表达细胞系MDA-231开始，接下来在540行中是高一些的靶标表达细胞系MDA-175，在底部544行中是最高靶标表达细胞系SK-BR-3。
560列显示对各个细胞系从0至3+的指定评分。
570列显示图像的目的区域内的PDQA点数，该点数通过图像的目的区域内的核数而归一化。
580列显示如在科学出版物中所概括的相对于每一细胞的靶标分子即Her2受体数目。
值得注意地，通过可编程性点定量检定所定量的不同细胞系中的点/核比值570与580列所示细胞系中的受体数目/细胞比值显著一致。
给定靶标表达水平的PDQA点数可以被编程。在一些实施方式中，给定靶标表达水平的点数可以被编程，使得在最高预期的靶标表达水平下，存在一些点的重叠，但这些点仍然大体可被识别为单独的点而非主要为点簇。在其它实施方式中，给定表达水平的点数可以被编程为产生显著量的普遍重叠的点和大面积的点簇。这种情况的例子可在图15所示的图像中看到。
图6A-6D描绘四个不同分辨率下的通过可编程性定量检定所处理的一个样本的图像的一个视野。
图6A示出在视野604中对PDQA染色片摄取的图像。使用40X设定602拍摄图像。40X设定相当于使用40X物镜，其对于许多数字显微镜体系和扫描器提供每像素约0.25微米的分辨率。对着淡背景606，可以看见蓝色复染核609以及染成红色的PDQA点608。
图6B是在20X设定612下成像的完全相同显微镜片和细胞系样本的图像。图6B示出视野614中的图像。图6B的图像具有较大的整体视野，即对较大部分的显微镜片和样本进行了成像。然而，视野614与图6A中所示的视野604相同。因此，光学可识别对象和特征例如染成红色的PDQA点618是与在图6A所示图像中见到的点608相同的点。同样地，图6B的蓝色复染核619是与图6A中所见相同的核609。相应视野624和634分别示于以10X成像的图6C和以4X成像的图6D中。
图6E示出在图6A-6D中所描绘的在不同分辨率下拍摄的图像中对视野的图像分析结果基本上匹配的表。640、642、644和648行含有分别与图6A、6B、6C和6D的图像相关的数据。
表660列示出在视野604、614、624和634中计数的点数，其中视野604、614、624和634实际上是分别以40X、20X、10X和4X设定对相同片子拍摄的相同视野。手动计数的点数在所有情况下均是18。
表665列示出使用图像分析方法的自动实施方式计数的点数。在图像分析算法中设定用于点色调的阈值参数。然后对对象即点进行自动识别、分类和计数，如在表665列中显示的结果为，在以四个非常不同的分辨率采集的所有四个图像中鉴定出相同的点。值得注意地，使用的图像分析和计数算法对于所有四个图像而言相同。这表明，通过适当地对所产生点的大小、形状、和颜色编程，编程的光学特征的稳健性和清晰性可使得图像分析能够在较低的分辨率例如10X或者甚至4X下可靠地进行而错误率小于10%，如表670列中所示。
对通过可编程性定量检定（其包括点光学特征可编程性）所处理的图像的分析方法和体系的实施方式的优点可以在675和680列中看到，其中可以看出对于以40X设定采集的图像，存储、数据传输和显微镜载物台定位要求比以10X或4X设定采集图像的相应要求大得多。
因为PDQA点可被编程为具有即使在相对较低的放大倍率（例如4X）时也可容易定量的大小，因此执行全片分析的数据量和处理要求大大降低。为实现待处理数据和所需处理的甚至更大的减小，可以对各个点确定原点，之后可以使用原点而非使用分类为属于各个点的所有像素来执行定量以及其它类型的密度、几何和比率定量/评价。
为展示PDQA染色和成像的另一方面，图7A示出具有由可编程性定量检定所处理的对照细胞系的片子的图像。图7A中所示的图像是在焦点外上方两步采集的，即显微镜的焦平面比指定为焦点对准或0的焦平面更高。
该处理通过首先将显微镜聚焦于焦深来完成，在焦深处大多数可见细胞的边缘清楚且清晰。然后，在采集图7A的图像时，将显微镜逐步移到焦点外上方两步，且在采集图7B的图像时，将显微镜逐步移到焦点外下方两步。如之前，在图7A和图7B中均可以清楚地看到红色染色点706和蓝色复染核704，即使是在焦点外上方两步采集图7A的图像且在焦点外下方两步采集图7B的图像。
图7C示出在五个不同焦平面（即焦点对准、焦点上方一步和两步、以及焦点下方一步和两步，如表760列所示）拍摄的图像中对一个视野的图像分析结果基本上匹配的表。740行中的数据对应于图7A中所示的图像，且748行中的数据对应于图7B中所示的图像。
770列示出基于主观预先建立的关于何时对点计数以及何时不对点计数的标准，在五个焦平面的各个处采集的手动点计数。例如，在使用的手动计数方法中，呈现为非常弥散且非常淡的红色的一组像素不被计数，特别是如果其呈现为与其它对象例如细胞周边或细胞核分离时不被计数。例如在切片过程中细胞被切片机切割时，可以观察到这样的现象，使得仅极小的细胞外周边保留。当通过PDQA对这样的细胞部分染色时，事实上可能在单个靶标分子的部位处中心围绕检测抗体的结合点而形成点。然而，因为未保持在结缔组织基质（matrix）或组织基质（substrate）内的细胞被染色，因此形成的点可能不具有其附着的基质，因此在染色过程的后面部分中可被部分或完全洗掉。
如会预期的，图像焦点对准的程度可影响被成像的对象的色调、强度、或清晰度。然而，如770列所示，在所有聚焦水平手动计数的点数非常接近于相同。而且，使用自动点计数方法的实施方式计数的点数在各聚焦水平间也非常接近于相同。而且，如780列中所示的通过自动算法计数的点数基本上与手动计数770对应。未对自动点计数780作调整，这表明任何重叠点被计为单个对象，即使在手动点计数中其可被看成例如两个单独的点。因此可以看出相对较高的成功率，即在740、742、744、746和748行中所示的各个焦深下，通过自动方法计数的点数与手动计数的点数匹配较好（参见770、780和790列）。而且，在各焦深下的如790列所示的成功率通常大于90%。
出于比较目的，在图8A和8B中，使用用于生成图7A、7B和7C中所示图像和结果的相似样本和图像设定来采集另一组图像。然而，使用邻位连接检定或PLA在图像内产生染色斑点。该检定靶向到样本内表达Her2的染色部位处。但检定自身以及所产生的图像与图8A和8B中所示的图像基本上不同，在图8A和8B中待成像的样本通过可编程性点定量检定来处理。
而且，在PLA染色的比较情形中，焦点对准而非在焦点外不同步采集图像8A和8B。换句话说，图8A和8B中所示的图像对应于图8C所示表中的824行所指的焦点对准图像。以不同焦深采集其它图像，但这些单独图像未显示于附图中。然而，来自这些在相同的特定焦点下采集的图像的数据显示于图8C中。
图8A是焦点对准而采集的图像，其中具有在手动斑点计数过程中安置的红点。图8B是与图8A相同的图像，但是在经自动图像分析所鉴定的斑点的周围自动添加红色周界。邻位连接检定可以得自OlinkBioscience of Uppsala,Sweden。使用的检定物是靶向到染色Her2分子的DuoLink Q。称作BlobFinder的对象计数软件也可以得自Olink。
在图8A的图像中，使用与以上关于图7A和7B描述的标准基本上相近的标准来对斑点进行手动计数。在图7A中，清晰的鲜红色点806不是检定产生的斑点。相反，它们是作为手动计数过程的一部分而添加的手动安置的图像标记物。观察者在图像内他或她察觉已形成斑点的位置处放置圆形红点。
图8B示出具有通过图像分析软件鉴定和注释的斑点的图8A的图像。在一些区域例如区域804和806中，手动鉴定斑点，并且将红点手动安置在图8A图像中的斑点的上方，并且在图8B的区域即804和806中自动识别相应斑点。应注意的是，手动安置的点是具有均一大小的圆形点，并不代表在大小和形状上看起来显著不同的斑点的大小。还应注意的是，在区域例如区域803处手动鉴定的斑点与将要通过用于对图8B中的斑点计数的自动计数算法在斑点处分类和计数的周围像素没有充分光学不同。
而且，如在图8A和8B中所见，还可以观察到无染色或淡背景802的区域。一些区域例如区域804呈现为有染色，但不清楚染色是较暗背景染色（即沉积在靶标分子部位以外的部位的色原）的结果，或者为染色是靶标分子部位但是基本上重叠于如下点，在该点如图8A的图像中手动执行或通过如图8B所示的自动分析均不可容易识别单独小斑点。
图8C示出通过人工计数和通过图像分析软件来识别和注释斑点的以具有由邻位连接检定所处理的对照细胞系的片子为焦点而拍摄的图像的比较结果表。在对于各个焦深的手动斑点计数850之间可以看到显著差异。而且，如860列所示可以观察到各焦深下的自动斑点计数的差异，并且如870列的各行所述可以在手动和自动斑点计数之间观察到差异。
图9A描绘通过可编程性定量检定所处理的组织样本的图像。在结缔组织区域900处可以观察到一些背景染色。亮红色圆点被编程为在Her2靶标部位处产生，例如可以在902和903处的细胞膜附近观察到。902和903处的一些点呈现为形成点簇，但仍可识别为具有编程的大小和形状的点。然而，通过图像分析软件进行的自动点识别可能需要点计数调整步骤，以便改善自动点计数，因为未调整的点计数算法可能将这些团簇计数为比预期具有更大区域且具有点簇光学特征特性（即，呈现为重叠的圆点且潜在地具有如在902和903处可察觉的较暗、更强的编程色调的染色）的单个对象。
图9B描绘呈现通过可编程性定量检定所处理的组织样本的图像内的点群的统计学边界的点大小柱状图。在这种情况下用于实施PDQA点用图像分析方法实施方式的软件是JMicroVision，其由Nicolas Roduit,University of Geneva,Department of Geology,13,rue des ,1205Geneva,Switzerland公布且在www.jmicrovision.com下载可得。使用JMicroVision在其用于分析时的版本和设定可识别的最小对象是最小面积为十像素的对象。如在图9B的908处可见，通过软件识别和分类的约20个对象落入面积在10～16.15像素的范围内的对象仓（bin）中。然而，如在图9B中可见，对象的大小被编程，使得对于给定分辨率的成像，中值点大小906即点面积与最小可测量点大小/面积之间的分隔以及相对正态分布的形状从统计上排除如下可能性，即显著部分的点包括面积低于最小可识别面积即低于10像素的点。
图10A描绘通过可编程性定量检定所处理的组织样本的图像。存在暗红色点1004，以及蓝色复染细胞1002和较深蓝色复染细胞核1006。还观察到具有相对较淡蓝色背景染色的未染色区域1000。使用可得自Matrox Electronic Systems Ltd.,1055St-Regis Blvd.,Dorval,Quebec,Canada,H9P2T4的Matrox Inspector和Matrox Image Library图像分析软件来识别点。产生点，分割图像并对点进行识别和分类。获得并用图形表示点的光学特征测量结果。
例如，图10B描绘图10A所示图像内的点的对象伸长率的柱状图。如在图10B的1010处可见，大部分的分类点具有约1.0的伸长率，其为圆的伸长率。当然，例如1003和1005的点簇取决于重叠量可具有更接近2.0的伸长率，其中在点簇处重叠点可被分类为单个单独对象。
图10C描绘图10A所示图像内的点的对象紧密度的柱状图。紧密度是对象面积与具有相同周界的圆的面积的比率。因此，具有平滑周边的圆或基本上圆形的对象会具有1.0或接近1.0的紧密度测量结果。具有粗糙或锯齿状周边的圆形对象取决于影响周界测量的缺口深度会具有较大的紧密度测量结果。如在图10C中1012处可见，大部分的PDQA点具有编程的基本上圆形形状，结果得到约1.2的紧密度。
图10D描绘图10A所示图像内的点的对象最小最大费雷特比率的柱状图。最小最大费雷特比率是比较任意角度下对象的两条平行切线之间的距离的测量。在一些情况下，其可以对对象的形状提供更灵敏的测量结果。此外，圆形对象的最小最大费雷特比率会是1.0。如图10D中1014处所示，大部分对象具有约1.0的最小最大费雷特比率。
图10E是通过对组织样本中PDQA点的共聚集显微术分析生成的图像。在该分析中，使用DAB作为色原来产生PDQA点。当在XY平面中观察时，PDQA点基本上呈现为圆形。当在组织截面中即在XZ或YZ平面中观察时，可以观察到点事实上基本上为球形。而且，点在Z-轴上贯穿组织相对均匀地分布。PDQA点的三维大致球形形状是另外的在执行图像处理和检定定量化时可利用的光学可识别特性。
出于比较目的，图11A描绘通过邻位连接检定或PLA所处理的组织样本的图像。图像获自检定提供者的电子公开出版物。可以观察到蓝色复染细胞1102和1106，以及不具有明显有意染色的区域例如区域1100。其它区域例如区域1103呈现为具有有些弥散的淡红色调，但没有明显的可容易识别的对象。可以观察到具有各种形状、大小、强度和色调的斑点，如1105处的淡红棕色斑点和1107处的深棕椭圆斑点。
图11B描绘图11A所示图像内的斑点的对象伸长率的柱状图。
图11C描绘图11A所示图像内的点的对象紧密度的柱状图。
图11D描绘图11A所示图像内的点的对象最小最大费雷特比率的柱状图。
如在图11B、11C和11D中可观察到，斑点可计数但不呈现为具有足以沿着关于本发明各个实施方式中所描述的可编程性定量点检定而描述的线来执行斑点计数调整的编程的形状、大小和色调。
图12A示出通过可编程性定量检定所处理的样本的图像，其中图像包括靶标点例如红色圆点1204和1205以及人为物1206。可注意到的是，在图12A和12B的图像中，不存在明显的细胞或细胞核深蓝色复染。人为物1206呈现为黑色对象。作为例子，对象1206可呈现为黑色对象，因为其作为颗粒留在样本表面且光不容易经其通过。
图12B示出区分出图12A中所示靶标点和人为物的处理图像。点1207和1208显示为形状和位置与通过可编程性点定量检定而产生且示于图12A中的点1204和1205相同的黄色点。可注意到的是，人为物1206不被识别为PDQA点，即使其具有与包括点1207和1208的点簇的形状和大小相似的形状和大小。因此，可以看出，除大小和形状的可编程性光学特征外，其它可编程性特征例如色调、饱和度、强度等也可以被编程以帮助从其它对象即人为物中分离或分割出目的对象，即点。
图12C示出对于样本区域对多重诊断检定评分的方法的实施方式的操作步骤。在步骤1214中，在第一靶标的部分子群的部位处执行第一多重诊断检定方案。例如，在一些实施方式中，执行PDQA方案，其中第一靶标是her2蛋白。将Her2蛋白的一抗施加于乳腺癌组织。施加预定部分的标记二抗，引起报道物和交联剂的沉淀，其在之后显色地可视化。
在步骤1216中，执行其它多重诊断检定方案。例如，在一些实施方式中，第n个多重诊断检定可以包括在1～M靶标部位的部分子群处产生的PDQA点。
然而，可以执行和评价多重检定，其中仅一个多重检定组分包括PDQA点。1～M其它多重检定中的任一者可以包括产生和评价具有不同可编程性光学特性的PDQA点。或者，1～M检定中的任一者可以包括其它染色方案，其中染色图型的大小和形状遵循组织中找到染色靶标的位置的大小和形状，而不是具有可编程性的形状如PDQA点的圆形形状。其它实施方式可以包括H&E染色以突出组织的形态。其它实施方式可以包括原位杂交，其中对某些基因染色。还可以执行包括组织化学检定的特殊染色方案。可编程性点定量检定可以在以任意期望顺序的其它检定的任意组合之前、之后或与之一起执行。
如果在步骤1218中不再执行更多的多重检定，则可以在步骤1220中对样本成像。
在步骤1222中，可以由病理学家或技术人员手动、自动或半自动地选择目的区域。所选的目的区域的一个实例可以是整个片子。如以上关于图6A-6E所讨论的，全片分析因PDQA点的容易光学分辨的性质可以需要少得多的数据点和大大减小的计算力。
可以使用任何适当的技术例如以上关于图4描述的那些，来完成第一多重检定的定量，例如对第一PDQA点进行计数和从PDQA点簇中获得点计数。
当在步骤1228中没有更多的评价1226需执行时，可执行步骤1230。
在步骤1230中，可通过在算法上将步骤1224的PDQA定量结果与步骤1228的M迭代结果结合，来产生评分。
图13A示出通过执行图像分析以对至少两类对象进行分类和计数并考虑所分类对象的数量进行评分从而评价样本的多重方法的实施方式的操作步骤。
图13A的方法的实施方式与图4中所体现的关于图4描述的方法相似。除使用可编程性点定量检定来处理样本以在与单个类型的分子（如Her2）相关的靶标部位处检测和产生点之外，该实施方式包括步骤1310，其包括对样本执行第二原位可编程性点定量检定染色以产生具有至少一种光学特征的第二类基本圆形的靶标点，该至少一种光学特征可用于从第一类靶标点中单独识别出第二类靶标点。而且，分析图像的步骤1316包括基于可编程性光学特征鉴定出至少两类对象。
图13B示出具有多重靶标点和参考点的样本的图像，其中多重靶标点和参考点具有区分出第一类靶标点和第二类靶标点的光学特征。第一类或第二类靶标点可以是参考点。对如图13A中示出的第一染色步骤1308加以编程并执行，以在第一靶标类型的分子部位处产生红点1334，并且对如图13A中示出的第二染色步骤1310加以编程并执行，以在第二类型的靶标分子部位处产生蓝点1332。
图13C示出处理图像，其中在图像分析软件中修改了对比度和伽马设定，以增强呈现为密集填充点和点簇的第一类蓝色靶标点1342与呈现为轻微填充的点和点簇轮廓的第二类红色靶标点1344之间的对比。图像处理还可以用于减少不存在细胞的区域1340的背景颜色。
图13D是如图12C中描绘的多重染色的实施方式的图像，其中根据步骤1214执行用于对her2蛋白定量的PDQA检定并且其中根据图12C的步骤1216对相同组织执行her2蛋白的常规IHC染色。
在her2抗原的部位处产生的PDQA点1350示于图13D中并且在相应图像图13E中显示相同点，其中已使用图像处理技术处理图13E以在灰度类型的图中增强点的可分辨性和常规IHC染色。
可以在图13D的图像以及相应的增强图像图13E上看见常规IHC膜染色1352。
这种类型的多重评价出于数种原因可能是有用的。例如，可看出具有最高PDQA点密度的区域对应于常规IHC膜染色最可见的区域。
还可以看到一些PDQA点例如点1354，其呈现为在核外部在与细胞膜一致且常规IHC染色并不显而易见的位置处。这个证据倾向于证实，在靶标表达水平太低以至通过使用常规IHC染色方案进行染色不容易观察到的区域，主要的PDQA点以较不密集的隔开的形式可分辨。
图14A是由可编程性定量检定所处理的对照细胞系样本的图像。在这种情况下，Her2对照细胞系被染色；细胞核1404被复染成蓝色并且通过PDQA对Her2靶标分子染色以产生足够大而能光学识别的点1406。
为进行比较，图14B是由邻位连接检定所处理的Her2对照细胞系样本的图像。成像设定与用于采集图14A的图像的成像设定相同。然而，在1410和1411处可见的斑点并不必然可容易分类为单个、显著较大且不同形状的斑点，或者可选地分类为连接/重叠的斑点。
在一些实施方式中，如图15中所示，可能可以在有图像处理或没有任何图像处理的情况下评价目的区域以及区域靶标表达水平。图15示出由可编程性定量检定所处理的样本的图像1500。还示出放大的图像1510、1520和1530，其中癌区域1502显示高靶标表达水平并且通过许多暗红色重叠点1502、1505、1506和1508突出。因为PDQA点被编程为具有包括大小、形状、颜色等的光学特征，因此可以通过使用几何对象识别算法来确认样本的较大结构部件。打个比方，在几何对象面部识别过程中，例如眼睛、嘴唇、面部轮廓等的特征可以具有可预测范围的形状、大小、颜色等。因此，通过分析所识别对象即眼睛、鼻子等之间的空间几何关系，可以在算法上识别面部。
因此，如在图15中可清楚观察到的，通过PDQA的可编程性光学特性可以显著增强在病理应用（例如在组织中）中使用几何对象识别的能力。
图16A示出由可编程性定量检定所处理的样本的图像，其中1600处的淡蓝色背景染色与例如1602处的深蓝色细胞核复染相关。在图16A的图像中1604处也可观察到PDQA点。
图16B示出具有减少的背景染色（即1606处所示）的样本的图像。通过“图像分析”-友好型增强复染法的实施方式来处理图16的图像中的样本。在增强复染法的实施方式中，对细胞中的组蛋白靶标执行IHC染色，以产生相对均匀的染色。背景染色减少，因为在细胞外的区域中没找到或极少找到组蛋白直接抗体。增强复染法的使用可以与使用PDQA的靶标染色结合，并且可以产生比H&E复染可需要更少或更简单图像处理的图像，从而使得能够明显地根据形态学特征将靶标对象一致地分类。
图17A-17B示出通过被编程为呈现颜色偏移光学特征的可编程性定量检定进行染色的样本的图像。无PDQA点的区域1700在图17A的图像中具有大致相同的色调，其中图17A以稍高于“焦点对准”水平的焦深进行成像，如在1700处的细胞边缘的相对模糊可以观察到的，其与图17B的图像的区域1701处所示的相同细胞边缘的清晰线成对比。在图17A的图像中1702处可以观察到不在通过PDQA染色的部位处的某些暗点1702。在图17B的图像中没有找到相似的斑点，表明焦平面移动。
PDQA的实施方式可以被编程为产生颜色随焦距变化而变化的点。在图17A中1704处可以看见具有深蓝色周界的鲜红色点。当以不同焦平面成像时，如图17B中所见，例如点1706的点呈现为深蓝色，并且既看不见鲜红色的中心也看不见成对比的外周边。
点的周边的清晰度也可以被编程。在PDQA的实施方式中，通过在最终染色步骤中使用短时间（原位可编程性）和高连接体浓度（预编程）和高过氧化氢（预编程），获得高边缘对比度的染色图样，如图17C中所示，并且点呈现为具有相当均一的光强度，边缘税利且无“晕”。另一方面，可以使用Fast Red在十分钟内执行最后染色步骤，并且边缘会更弥散，且围绕强烈的红色中心具有浅红色晕，如图17D中所示。这些边缘更加弥散的点可以称作具有倾斜的类“高斯”强度分布。对于人眼而言，边缘清晰的平台（plateaus）是吸引人的，并且即使距离非常近的点也清楚地分开。对于图像分析软件，朝向火山中心增加的光强度可以额外地帮助识别这些，因为人为物或颗粒也可以具有清晰的边缘。
图17E-17G示出经由所选的交联剂的点编程效果。图17E示出使用作为交联剂的1g/Lα-CHC、作为报道物的5mM(Fer)4-L150-Flu、0.002%过氧化氢、pH6.8咪唑缓冲液、经5min沉积、用抗-FITC-碱性磷酸酶接着用液体永固红显色的产生的PDQA点。当在焦点下观察时，这些PDQA点显示高程度的环状衍射图样，其在光学上可分辨为环形。
图17F显示使用作为交联剂的0.05g/L DAB、作为报道物的5mM(Sin)3-150-Flu、0.005%过氧化氢、pH7.4咪唑缓冲液5min沉积、用抗-FITC-碱性磷酸酶接着用液体永固红显色的PDQA点。17F中所示的PDQA点的点大小和清晰度与17E的PDQA点很相似。然而，17E的基于α-CHC交联剂的点具有更少的背景染色。
图17G是使用作为交联剂的0.3g/L阿魏酸、作为报道物的5mM(Fer)4-L150-Flu、0.003%过氧化氢、pH6.8咪唑缓冲液、10min沉积、用抗-FITC-碱性磷酸酶接着用液体永固红显色而产生的PDQA点的图像。图17G中PDQA点的形状一般为圆形，然而边缘对比度较不显著，由此产生例如由图17D所示的高斯强度分布。
图18A-18E示出由被编程为显示同心环光学特征的可编程性定量检定所处理的样本的一组图像。
图18A和图18B均示出被编程为显示同心环状扩散图样的PDQA点的图像。图18B是图18A的放大图像，其已被增强以突出灰度环状衍射图样的可分辨性。18A中的PDQA点（在18B中所见被放大和增强）被编程为呈现出由显示淡红色调的环1804同心环绕的淡黄橙色调中心部分1803，该环1804进而由显示淡蓝色调的环1805同心环绕。淡蓝色环1805由扩散的粉红晕环绕。编程以产生呈现出同心环光学特征的点的PDQA实施方式不需要任何产生不同颜色的额外染色步骤。相反，对于被编程为具有预定大小范围、预定色调和预定扩散性的点，观察到颜色。
图18B-18D提供被编程为显示同心环光学特征或不依赖于焦平面的PDQA点的图像的另一视图。
因为PDQA点可以被编程为具有随焦平面变化的在光学上非常不同的衍射图样，因此在一些实施方式中该特征还可用于确定最佳焦平面。在确定了中值点大小后，就可以确定随距离的环状衍射程度。这使得能够执行逆计算，即找到呈现环状衍射的点然后通过知晓中值点大小和环程度来计算焦距，可以计算焦点之上或之下的距离。通过比较点之间的环程度，还可以计算两点之间沿Z-轴的垂直距离。
图18F示出PDQA点1836。取样线1831示出像素的y坐标，对于像素，强度水平叠加为图形，强度值在0～255的范围内。图18G示出相同图像的图示，其中示出R、G和B通道的强度水平的单独图形。
线1830表示“开放”或“未染色”区域的平均强度。线1830的强度为约187红、187绿和187红。因此可以预期存在染色的像素的强度低于（即暗于）未染色组织或玻璃的值。点1840是在点1836的原点处绿色通道强度值图形上的最小点。点1840处的绿色强度值为约75/225。点1842是在点1836的原点处蓝色通道强度值图形上的最小点。点1842的强度值为约100/255。点1838是PDQA点1836的原点的强度水平。因为点已被编程为显示中心红色的衍射图样，因此点1836处的红色水平实际上为255/255，显著高于“背景强度水平，即在R、G和B通道为约187的水平面1832”。图18H和图18I是使用包括红色和绿色荧光团混合物的PDQA点来染色的显微镜片上的乳腺癌细胞系的图像。图18H是PDQA点1850和1852具有圆形形状的明视场图像。图18I是采集荧光图像的相同显微镜片。在荧光中，PDQA点1850和1852显示环形形状。在这种情况下，环形形状不是源自衍射图样特征，而是由于在点1850和1852的中心密集的红色荧光团淬灭较不优势的绿色荧光团的结果。
在HER2细胞系的FFPE切片中产生点。使用二甲苯和乙醇使片子脱蜡，并在微波炉中在pH6柠檬酸盐缓冲液中重获靶标10min。然后将其在自动染色器（Autostainer）上在室温进行以下染色方案：
使用3%过氧化氢的过氧化物酶封闭，5min
洗涤
抗HER2抗体，1microg/mL，10min
洗涤
4pM山羊抗兔-Dex70-(HRP)10，10min
洗涤
作为交联剂的1g/Lα-CHC，作为报道物的5mM(Fer)4-L150-Flu，0.002%过氧化氢，pH6.8咪唑缓冲液，10min.
洗涤
20nM抗-FITC-HRP，10min
洗涤
作为交联剂的1g/Lα-CHC，作为报道物的40mM(Fer)4-L150-Flu和80mM(Fer)2-L150-丽丝胺（Lissamine），0.002%过氧化氢，pH6.8咪唑缓冲液，10min。
洗涤
使用用于荧光成像的具有DAPI的甘油类抗荧光衰减剂（antifade）来封片。
注意，在最终沉积混合物中没有40mM(Fer)4-L150-Flu的对照实验在明视场中产生不易区分的紫色的点，但不产生任何绿色荧光。相反，在最终沉积混合物中省略80mM(Fer)2-L150-丽丝胺在明视场中产生非常微弱的淡黄色点，其产生由荧光光亮填充的球形绿点。
对点编程以产生这样的形状可以用于分辨不同类型的点并对其进行定量。
在明视场和荧光显微镜扫描器下处理的其它多重图像可以提供其它益处。例如，常规的组织染色可以与荧光PDQA点结合，从而当在明视场显微镜下观察时，染色呈现为基本上相同，就如同未产生PDQA点。然而，通过产生PDQA点，可以使用荧光图像分析对点进行自动定量，而不会损害或打断视觉手动解读。
图19示出通过图像分析以对对象进行检测和计数并通过使用统计测度调整点计数来评价图像的方法的实施方式中的操作步骤。所示的实施例是可能的实施方式，但是是许多可能的实施方式中的一个。例如，在一个实施方式中，通过色调设阈来分割图像，以确定可分类为点或点簇的所有红色对象，如图19的步骤1910中所示。单独的点可以通过其圆度、大小、强度或其任意组合而容易地识别。如步骤1912中所示，可以对图像中的所有点计算统计测度例如各个光学特征的中值。然后，可以针对被分类的对象，如步骤1914、1916、1918、1922和1926中所示，比较这些统计测度，并且如步骤1920、1926和1928中所示，可以对点计数作出适当的调整。
图20A示出由可编程性点定量检定所处理的样本的图像2002。图20B-20C示出从使用圆形结构元素2008或2012的图像处理方法的实施方式得到的处理版本的图像2002。中间图像处理结果2004和2010显示，该图像分析方法对于具有适合于结构元素的编程大小和形状的点有效。图像2006和2014显示，可以识别和分类不同大小的点。
图21A示出在变化的预分析处理条件下对靶标点和用于稳健性与质量控制的参考点成像的方法的比率实施方式的操作步骤。例如，在步骤2106中，可以执行预处理步骤，例如对福尔马林固定石蜡包埋的组织样本脱蜡、或对石蜡包埋的组织样本执行热引发的靶标恢复。
然而，在一些实施方式中，尽管预处理可对常规IHC染色有利，但在使用高度灵敏的可编程性点定量检定的一些情况下可跳过预处理，因为即使没有热引发的靶标恢复一些靶标分子也通常可得。例如，针对广泛存在的靶标分子例如细胞角蛋白的室温PDQA染色可与常规H&E染色结合，并在其进入实验室时对所有片子执行。PDQA的可编程性时间和灵敏度可被编程为匹配H&E染色所需的时机，并且可分析结果作为衡量样本的固定程度是否适当的方法。用于产生点的步骤的时间和温度可以变化，但本发明许多实施方式的优点是PDQA的时间和温度要求可与常规IHC非常相似（即，它们都可以在单一温度例如室温并在相对较短的时间例如小于100分钟内执行）。
而且，如图21B和21C中所示，PDQA的实施方式可以用于实施具有靶标点和用于稳健性与质量控制的参考点的图像的分析方法的比率实施方式。使用第一PDQA染色可以产生红色靶标点例如点2102，并且使用第二PDQA染色可以产生蓝色参考点例如点2103。在正常预分析处理条件下，例如，执行正常靶标恢复以检验样本已适当地经福尔马林固定。在图21B中，存在14个红色靶标例如点2102，以及6个蓝色参考点例如点2103，图示于高表达区域2105内。因此，14个靶标点与6个参考点的比率可以表示为分数14/6或小数2.333。图21C示出在预分析处理过程中被过固定或低恢复的相同样本。过固定和低恢复均可以产生如下结果，即一定部分的分子交联，且不被检定抗体结合。因此，当抗体使用可编程性点定量检定而被放大并产生点时，对相同浓度和方案的PDQA，会产生较少数目的点。例如，假定预分析步骤例如固定和/或靶标恢复的效果对靶标分子与对参考分子相同，如果一半的点被抑制，即不产生，则7个红点例如点2107与3个蓝点例如点2016的比率是7/3或2.333。即使效果不同，可以产生校准曲线，其使得能够基于区域内参考点的数目确定对于靶标点的点计数调整。
图22示出由被编程为产生具有与多个靶标对应的多个编程颜色的点的可编程性定量检定所处理的样本的图像的成像分析方法。除产生如图13B的图像中所表现的两个颜色的PDQA点之外，通过执行多个染色步骤可产生多个PDQA点类别，各自具有期望的编程颜色。PDQA被编程为产生如图22的图像2210中所示的棕色点如点2204、红色点如点2202、蓝色点如点2206以及包括黑点、紫点和黄点等。通过使用不同色原可以产生其它颜色的点。
在一些实施方式中，各个编程颜色可与不同靶标分子类型相关。或者，可以使用编程为每次产生具有不同光学特征的点的PDQA染色来对单个靶标分子类型进行多次染色。例如，在使用编程为产生第一颜色的PDQA放大用低浓度的一抗进行染色之后，可以使用高浓度的二抗和第二PDQA染色，以产生具有第二颜色的点等等。这样的实施方式的一个应用可以是产生多色的热图，其示出例如在由低浓度的一抗结合的大量靶标表达区域中产生的红色PDQA点，随后是中等表达区域处的蓝点，等等。
图23示出由被编程为产生具有与多个靶标对应的多个编程大小的点2302的可编程性定量检定所处理的样本的图像的成像分析方法。
图24A-B示出通过红色和绿色定量荧光检定进行染色的样本的图像，其提供可编程性点各自连接到单个靶标分子的证据。在其它实施例和实施方式部分中提供关于这些实验的其它细节。
图25A-25D示出以可编程性定量检定使用降低浓度的第二标记抗体处理四次的样本的图像。在其它实施例和实施方式部分中提供关于这些实验的其它细节。
图26示出使用由可编程性定量检定所处理的样本的图像分析方法的实施方式而产生的点计数和点强度的线性。如图26所示，PDQA点计数2602与处理中使用的标记结合剂的浓度增加成比例地增加。PDQA点计数2602的比例增加在高浓度的标记结合剂下趋平，其是可能在点的数目和密度随标记结合剂的增加浓度而增加时由点重叠引起的效果。可通过对点执行强度加权的计数来平衡该效果，这可以更精确地解释重叠点。因此，强度加权的PDQA点计数2604在更大的标记结合剂浓度范围内显示随增加的标记结合剂浓度而比例增加。在其它实施例和实施方式部分中提供关于该实施方式的其它细节。
图27示出每细胞的预测点数与每细胞的测量点数的比较图。该图表显示预测的点计数2704相应于实际的点计数2702。在其它实施例和实施方式部分中提供关于该实验数据的其它细节。
图28A-28B描绘对样本执行图像分析的实施方式，该样本通过将包括至少一种第一靶标2804和任选至少一种第二靶标2806的液体2802经过多孔基质2808然后使用在以上以及其它实施例和实施方式部分中关于各种样本类型描述的实施方式和方法由可编程性定量检定来处理携载样本的基质而产生。样本2802以及第一靶标分子2804和第二靶标分子2806不需要是生物样本和靶标，甚至不需要是有机样本和靶标。结合剂可结合的任何物质可以用于实施PDQA成像的各种实施方式，只要有效的化合物可以与结合剂结合或者以其他方式与其连接即可。在其它实施例和实施方式部分中可找到本发明这些方面的进一步讨论。
图29描绘由可编程性定量检定使用可检测的标记物处理生化加密印刷的图像分析结果的实施方式。由于PDQA的光学特征包括颜色，因此可以使用PDQA和合适的图像分析技术执行生物缩微印刷（biomicroprinting）或生物微加密（biomicroencryption）。例如，单一类型或不同类型的靶标分子可沉积在基质2900（其可为一张纸或任何固体基质）上。例如通过喷墨打印机使用不同类型的靶标分子溶液代替墨，可以使靶标分子以期望的布置沉积。然后可以通过可编程性点定量检定来处理基质2900，从而产生具有期望光学特征的点例如红点2902、橙点2904、黄点2906、绿点2908和蓝点2910。其它光学特征例如大小、点重叠程度等也可以被编程为适合任何期望的应用。由于点即使在显微镜放大下也可呈现为不可见直到它们经过使用抗体或其它结合剂对靶标分子进行处理，因此仅有知道待使用的适当抗体或结合剂的人能够解密该信息。
其它实施例和实施方式
术语“样品”可意指来自较大整体或集合的代表性部分或单个物项（item）、某个量或部分的可包含待检测靶标的物质或对象，例如，某个部分或量的含有待分析的靶标分子、颗粒、结构的生物材料、化学材料、环境材料，例如，活检样品、食物样品、土壤样品等。样品可显示物质或对象的其余部分是什么或应当是什么。样品可以是，例如，来自生物样本的样品、环境样品，例如，土壤样品或溢出物样品、食物样品以及有机分子文库的一部分。
生物样品可以是包括悬浮细胞和/或细胞碎片的样品，例如，血液样品、克隆细胞的悬浮液、身体组织匀浆等；包括完整或损坏的动物体细胞、体组织、涂片或流体的样品，或肿瘤样品，例如活检样品；新鲜的组织样品或保藏的组织样品，例如福尔马林固定石蜡包埋的组织样品；包括活有机体的样品，例如包括动物、植物、细菌、真菌等的介质的样品；包括病毒颗粒、其碎片、或病毒产物的样品，例如包括病毒核酸、蛋白质、肽等的体涂片；包括细胞器的样品；包括天然或重组生物分子的样品，例如血浆样品、条件细胞培养介质等；以及包括植物细胞或其碎片的样品。
生物样品的上述实施方式是示例性的且仅用于说明的目的。
化学样品的实例可以通过化合物文库（例如，肽文库）的样品来示例说明，但是不限制于这些样品。环境样品的实例可以通过土壤、水或空气样品和食物样品来示例说明，但是不限于这些样品。
与本公开一致的实施方式可涉及包括固定靶标的样品，即涉及在与本公开实施方式一致的检测过程中靶标不能自由移动的样品。例如，经机械或化学手段基本上降低或消除靶标移动的样品，如在样品或靶标附着到某支承物或介质或在某支承物或介质内的情况下。因此，在一个实施方式中包括单个单独单元的目的靶标的样品可以在检测过程之前被固定到片子上，例如，固体体组织样品被固定到玻片上。本发明的包括固定靶标的样品的实例包括但不限于，固定在玻片或塑料片上的体组织样品、或包括固定到膜或ELISA板上的生物分子或化学分子的样品。这些实施方式中的样品靶标可以固定在样品内，例如蛋白质固定在组织样品内，或者可以固定在某些材料的表面上或某些材料内，材料例如固体材料或凝胶如硝化纤维素膜等的一部分。在一个实施方式中，片子可以是三维结构，例如胶原或琼脂块，并且靶标可以固定在该结构内。
靶标的其它实例可以包括例如特定蛋白，包括样品中该特定蛋白质的所有分子；本发明靶标的另一实例可以是特定的分子复合物或结构，包括样品中含有该特定的分子复合物或分子结构的基本上所有对象；本发明靶标的另一个实例可以是病毒颗粒或细菌，其中样品中该病毒颗粒或该细菌的总群是靶标。
与对于特定细胞类型、组织、细胞结构、生理条件等为特征性的特征相关的生物对象（如分子、分子复合物、结构、颗粒或生物体）经常被称作该特定细胞类型、组织、细胞结构或生理条件的“生物标记物”。此类生物标记物的非限定实例包括但不限于特定核苷酸序列、蛋白质或其它生物分子，例如碳水化合物类或脂类、染色体结构或膜结构、病毒、细菌、微生物等。在本发明的一些实施方式中，术语“靶标”与术语“生物标记物”可互换使用，并涉及对于特定细胞类型、组织、生理条件等为特征性的分子、分子复合物、结构或颗粒，其中，测试样品中后面的生物标记物中任一者的总群视为靶标。
在一个实施方式中，靶标可以是蛋白质，例如，细胞膜受体或胞质蛋白，在另一实施方式中，靶标可以是核酸，例如胞质核酸。任何在后提到的靶标的衍生物，例如靶标蛋白或靶标核酸等的片段、前体、突变体在本发明的一些实施方式中也可以是靶标。
因此，在本发明的不同实施方式中，靶标可以是生物学或化学靶标分子，或颗粒，或分子复合物或细胞复合物，或分子结构或细胞结构，或病毒，或微生物，或所述靶标分子、颗粒、复合物、结构、病毒或微生物的片段。化学样品和环境样品中所包含的靶标可以是不同的污染物、毒素、战剂物质（warfare substance）、分子文库成员、工业有毒废弃化合物等。
本发明可涉及可以在样品中通过多个独立的基本上相同的单元代表的靶标，本发明可涉及靶标的单个单独单元。
术语“单元（unit）”可意指在计算时视作整体并且起到执行一项特定功能作用的单个量的靶标。术语“单独的（individual）”可意指一单元与同类的其它单元或环境的其它成分可分开（通过功能的物理特性）并且可以分别地考虑和计数。术语“单独单元”与术语“单个单元”可互换使用。术语“单个”在本文中可意指靶标单元由单独的整体构成，在数目上仅由一个构成，与众多相对或与之成对比地由一个构成。例如，单个/单独单元的靶标蛋白意指该靶标蛋白的单个单独的蛋白分子，即同类多个分子中的一个分子。术语“基本上相同单元”意指多个的单个单元靶标具有使得这些单元被视作靶标的一个或多个特性。术语“独立的”意指单个单元的靶标作为独特实体存在，并且不依赖于样品中同类其它独特实体的存在。
本发明的一些实施方式涉及作为分子的单个部分的单个单元。术语“分子的单个部分”涉及分子的具有特殊性质的部分，所述性质允许将分子的这个部分与相同分子的其它部分分开考虑，例如，靶蛋白的蛋白水解片段、融合蛋白的部分、靶蛋白的特定结构域、核酸的特定结构、表位等。
因此，在一个实施方式中，本发明可涉及作为单个单独靶标分子的单个/单独靶标单元，即，涉及样品中存在的多个的单个单独靶标分子，在另一实施方式中，本发明可涉及作为分子的单个单独部分的单个/单独靶标单元，例如，在样品中多个靶标分子中存在的特定分子结构，例如，表位。在另一实施方式中，本发明可涉及构成样品中存在的病毒颗粒集合的多个的单个单独病毒颗粒。
在不同实施方式中，多个的单个靶标单元可以由单个单独的生物分子或化学分子、单个单独的单个颗粒、单个单独的分子复合物或细胞复合物、单个单独的分子结构或细胞结构、或单个单独的病毒或单个单独的微生物、或所述分子、颗粒、复合物、结构、病毒或微生物的单个单独片段所表示。
在一个实施方式中，靶标是与癌相关的生物标记物，例如激素和生长因子及其受体、细胞黏附分子、信号转导分子、细胞周期调控分子等的核酸和多肽，例如，包括生长因子PDGF、VEGF、TGF、HGF或EGF、它们的受体和通路相关分子的群组的基因、RNA和蛋白、与信号转导通路（例如JAK/STAT通路或Akt1/PKB细胞生存通路或5-FU通路）相关的基因及其产物、雌激素受体ER及其基因（ERS1）等。本发明的方法允许简单快速地对所述生物标记物进行可视化和定量。
本发明的方法允许以宽泛动态范围对样品中存在的单个单独靶标单元进行可视化和定量。可以在一个同样的样品中对极高量和极低量的靶标进行可视化和定量，或者可以在分开的样品中对它们进行评价。两种或更多种不同的靶标可以在一个或相同的样品中可视化，例如蛋白靶标和核酸靶标，或者两种或更多种不同的蛋白靶标，或者两种或更多种不同的核酸靶标等。
在一个实施方式中，单个靶标单元可以基本上均匀地遍及整个样品分布，在其它实施方式中，单个靶标单元可以在样品的一个部分中更丰富，而在其它部分中较不丰富。在全部的后述实施方式中，可以使用本发明的方法在一个同样的样品中对单个靶标单元进行可视化和定量。在一些实施方式中，其中单个靶标单元与另一个目的靶标缔合，例如以特殊的分子缔合体（association）或结构存在，其中所述的特殊缔合体或结构是病理状况的生物标记物，所述的另一个目的靶标也可以通过将样品中的单个靶标单元可视化和定量而进行可视化和定量。
在一个实施方式中，本发明涉及样品中存在的单个靶标单元的部分子群，如存在于样品中的单个单独靶标单元的总数的大部分或小部分。术语“部分子群”在本文中意指单个靶标单元的总群（population）的一部分，其等于或少于99.9%，例如等于或少于样品中单个靶标单元的总量的98%、97%、95%、94%、93%、92%、91%或90%，例如在90%与85%之间，少于85%，例如样品中靶标单元的总量的85%～80%、80%～75%，例如少于75%，例如在样品中单个靶标单元的总量的1%～74%，例如样品中靶标单元的总量的1%～60%、1%～50%、1%～40%、1%～30%或25%，等等。根据本发明，将总群的50%～99.9%所代表的单个靶标单元的部分子群定义为样品中存在的单个靶标单元的多数。根据本发明，将由少于50%的样品中单个靶标单元总群所代表的部分子群定义为样品中存在的单个靶标单元的少数。
在一个实施方式中，单独单个靶标单元的多数可以参与本发明的离散单个靶标部位的形成；在另一实施方式中，单独单个靶标单元的少数可以参与本发明的离散单个靶标部位的形成。在一个实施方式中，基本上所有的单独单个靶标单元可以参与与一种或多种结合剂形成复合物，其中仅所述复合物的部分子群参与本发明的离散单个结合位点的形成。
本发明的方法可包括如下步骤，其中将推测包括靶标的样品与一种或多种结合剂一起孵育。
术语“结合剂”意指能够直接或间接与单个靶标单元例如靶标蛋白的单独分子特异性结合的分子。术语“特异性地”意指结合剂对靶标具有特殊亲合力，例如对靶标分子的亲合力，或对结合至靶标的物质的特殊亲合力，例如对结合至靶标蛋白的一抗的亲合力，对与一抗结合的半抗原的亲合力等等。术语“直接地”意指对单个单独靶标单元具有特异性亲合力的结合剂在相互作用时与此单个单独单元相互作用并形成直接的键，例如，一抗与用作用于产生所述一抗的抗原的单个单独靶标分子直接结合。术语“间接地”在本文中涉及结合剂，其中所述结合剂对单个单独靶标单元没有特异性亲合力，但所述结合剂对能够与该单个单独单元特异性结合的另一种物质（例如一抗）具有特异性亲合力，或者所述结合剂对与所述单个单独单元缔合或连接的物质（例如对半抗原）具有特异性亲合力；所述结合剂与后一种物质直接相互作用并且与所述物质形成键，从而该结合剂变得与单个靶标单元间接结合。
在本文中，能够与单个靶标单元直接特异性结合的结合剂一般由第一结合剂表示。能够与单个靶标单元间接特异性结合的结合剂一般由第二结合剂表示。然而，本发明的检测体系可包括可以与单个靶标单元间接结合的其它结合剂，例如第三、第四和其它结合剂。
通常，第一结合剂，或在一些实施方式中的第二结合剂或第三结合剂，用来与样品接触以识别靶标，与靶标结合并且与其形成复合物。第二结合剂、第三结合剂和其它结合剂可以用于本发明方法的其它步骤中，例如用于在下述靶标部位处识别可检测分子的沉积物。一些实施方式中，第二结合剂、第三结合剂和其它结合剂用来放大与靶标相关的信号。这些结合剂还可用于增加检测体系的灵活性，例如用来改变与靶标相关的原始信号，例如将红色荧光信号改变为绿色等。
本发明的结合剂可以是不同特异性结合对的成员。本领域中已知众多不同的特异性结合对，它们是能够特异性相互结合的成对的两种不同分子。适用于实践本发明的特异性结合对的成员可以是免疫型或非免疫型的。
非免疫特异性结合对包括其中两种组分相互共有天然亲合力但不是抗体的体系。示例的非免疫结合对是生物素-抗生物素蛋白或生物素-链酶亲和素、叶酸-叶酸结合蛋白、互补核酸、受体-配体等。本发明也包括彼此形成共价键的非免疫结合对。示例的共价结合对包括巯基反应基团（如马来酰亚胺）和卤乙酰基衍生物和胺反应基团如异硫氰酸酯、琥珀酰亚胺酯、磺酰卤，以及如3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙（MBTH）和3-(二甲基-氨基)苯甲酸（DMAB）的偶合染料等。
免疫特异性结合对可以例举为抗体-抗体体系或半抗原-抗半抗原体系。在一个实施方式中，本发明的免疫特异性结合对可以是含有彼此具有亲合力的两个或更多个抗体分子的抗体-抗体结合对，例如一抗和二抗对，其中一抗表示第一结合剂且二抗表示第二结合剂；含有3个或4个或更多个抗体成员的抗体体系可以用于另一实施方式中。在本发明的其它实施方式中，免疫结合对可以由半抗原-抗半抗原体系代表。在此类实施方式中，第一结合剂可以由含有对靶和半抗原具有亲合力的分子的结合物（例如与半抗原连接的一抗或核酸序列）代表，并且第二结合剂可以由抗半抗原抗体代表。
术语“半抗原”意指一种小分子，其中可以将所述小分子视作对其可产生抗体的孤立表位，尽管如果注入动物中，半抗原单独不会引起免疫反应，它必须与载体（通常是蛋白质）结合。由于半抗原是小分子，故多个拷贝的半抗原可以连接至大分子，例如聚合物分子，如蛋白质、核苷酸序列、葡聚糖等。在信号放大是必需或有利的情况下，半抗原可以充当检定模式的便利标记物分子。因此，结合的多拷贝半抗原提供了增强的灵敏度，例如增加的信号强度。合适半抗原的非限定实例包括荧光素（FITC）、2,4-二硝基酚（DNP）、myc洋地黄毒苷（DIG）、酪氨酸、硝基酪氨酸生物素和染料，例如四甲基罗丹明、得克萨斯红（Texas Red），丹磺酰（dansyl）、Alexa Fluor488、BODIPY FL、萤光黄和Alexa Fluor405/Cascade Blue荧光团。
如本文中所用的术语“抗体”意指免疫球蛋白或其部分，并且包括含有抗原结合位点的任何多肽，无论其来源、产生方法和其它特征是什么。该术语包括，例如多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体和CDR-移植抗体。抗体部分可以包括仍能结合抗原的任何片段，例如Fab、F(ab’)2、Fv、scFv。抗体的起源由基因组序列限定，无论产生方法是什么。
在本公开的上下文中，一抗是指与靶标特异性结合，尤其与样品的单个靶标单元特异性结合，例如与单个靶标分子结合的抗体结合剂，例如整个抗体分子、所述分子的片段或衍生物，例如含有抗体的结合物或聚合抗体。在一些实施方式中，一抗可以是能够与不同靶标的两个（或更多）单个单独单元结合的二价抗体，例如能够与受体二聚物例如Her2/Her3二聚物结合的抗体。在这个实施方式中，本发明的单个靶标单元可以是单个Her2/Her3二聚物，并且该靶标可以是样品中的Her2/her3二聚物群体，其包括该样品中的全部所述二聚物。一抗可以源自任何温血物种，例如哺乳动物、鸟类。
在本公开的上下文中，二抗是指具有下述抗原结合结构域的抗体结合剂，例如整个抗体分子、所述分子的片段或衍生物，例如含有抗体的结合物或聚合抗体，其中所述抗原结合结构域与一抗、或在靶标部位处沉积的半抗原、或与一抗或另一结合剂直接或间接连接的半抗原特异性结合。
在本发明的上下文中，三抗是指包括下述抗原结合结构域的抗体结合剂，例如整个抗体分子、所述分子的片段或衍生物，例如含有抗体的结合物或聚合抗体，其中所述抗原结合结构域与二抗或连接至二抗的半抗原或连接至聚合物（其与二抗结合）的半抗原或在靶标部位处沉积的半抗原特异性结合。
有时，抗体可以同时充当二抗和三抗。在本发明中使用的抗体，包括一抗、二抗和三抗，可以源自任何哺乳物种，例如大鼠、小鼠、山羊、豚鼠、驴、兔、马、羊驼（lama）、骆驼或任何鸟类物种，例如鸡、鸭。如本文中所用，源自任何哺乳物种或鸟类物种，意指编码源自特定哺乳动物（例如大鼠、小鼠、山羊或兔）或特定鸟（例如鸡、鸭）的基因组序列中的特定抗体的至少部分核酸序列。抗体可以是任意同种型（isotype），例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE或任何亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
在某些实施方式中，一抗包含能够与生物标记物特异性结合、尤其与所述生物标记物的单个单独单元结合的抗原结合区，其中所述生物标记物由生物样品的细胞表达。所述标记物可以表达在细胞表面上或在细胞膜内部，即在细胞内部，例如细胞质内、内质网内等。在一些实施方式中，生物标记物可以从细胞中提取，它因此存在于无细胞的介质中，例如水溶液中，或它是存在于细胞培养介质、血浆、脑脊液等中的可溶性分子。相应样品的实例如上所述。
在某些实施方式中，二抗包含与一抗（例如与一抗的恒定区结合）特异性结合的抗原结合区。在某些实施方式中，二抗可以结合至聚合物。在一些实施方式中，2～20个二抗，如5～15个二抗可以与聚合物结合。在其它实施方式中，聚合物可以与1～10个二抗比如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个二抗结合。
在某些实施方式中，三抗可包含与二抗（例如与二抗的恒定区）、或与连接到二抗的半抗原、或与结合于二抗的聚合物特异性结合的抗原结合区。在某些实施方式中，三抗与聚合物结合。在一些实施方式中，1～20个三抗可以与聚合物结合。在其它实施方式中，1～5个三抗，如1、2、3、4或5个三抗可以与聚合物结合。
一些实施方式可包括包含结合剂的单个结合单元的聚合物，例如与一分子的一抗、二抗或三抗结合的聚合物。
可以用于本发明目的的抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体、工程化抗体（包括嵌合抗体、CDR移植抗体和使用噬菌体展示法或替代技术产生的人工选择抗体）。
可以通过本领域熟知的多种方法中的任一种来制造本发明的抗体结合剂。可以从cDNA文库中分离编码抗体的核酸。可以从噬菌体文库中分离编码抗体的核酸。可以通过已知序列的基因改组而获得编码抗体的核酸。可以通过体内重组而分离编码抗体的核酸。用于本发明方法中的抗体包括人源化的免疫球蛋白。可以以任何可能的方式改变本发明的抗体，假定它们保持它们的结合亲和性，例如它们可以与效应蛋白、毒素、标记物等融合。抗体与不同物质结合的方法在以下本发明的示例性实施方式中描述。
在本发明的一个实施方式中，抗体结合剂由Fab区代表。
在一个实施方式中，抗体结合剂可以是含有两种或多种不同抗体结合剂的组合物，例如是含有第一抗体结合剂和第二抗体结合剂的组合物，其中两种或多种不同的抗体剂是不同的免疫结合对。在一个实施方式中，组合物中的两种或多种不同抗体结合剂中的至少一种是能够与靶标特异性结合的抗体并且至少另一种是含有酶的抗体。
在另一实施方式中，本发明可涉及作为非免疫特异性结合对（如互补性核苷酸序列或核酸类似物分子）的成员的结合剂。
含有核酸或核酸类似物分子（例如DNA分子、RNA分子、PNA分子）的结合剂，可用于对核酸靶标的单个单独单元可视化和定量。
用作本发明目的用结合剂的核酸序列可化学合成或在重组细胞中产生。在一些实施方式中，核酸结合剂可包括肽核酸（PNA）。肽核酸是如下的核酸分子，其中通常存在于DNA和RNA中的脱氧核糖或核糖骨架被肽骨架替换。在其它实施方式中，结合剂可包括锁核酸（LNA）。
在一些实施方式中，核酸结合剂可以包括在特定严格条件下与生物样品中靶标序列的单个单元（例如单个mRNA序列）特异性杂交的至少一个寡核苷酸序列或至少一个多核苷酸序列。术语“在严格条件下杂交”在本文中用来描述杂交条件，在所述杂交条件下，彼此明显互补，如至少70%、至少80%、至少85～90%互补的核苷酸序列仍维持彼此结合。
在一些实施方式中，杂交条件是高等严格条件。高等严格杂交条件的实例是在65～70℃在4X氯化钠/柠檬酸钠（SSC）中杂交或在42～50℃在4X SSC加50%甲酰胺中杂交，然后在65～70℃在1X SSC中洗涤一次或多次。将理解，可以将其它试剂添加至杂交缓冲液和/或洗涤缓冲液中，例如封闭剂（BSA或鲑鱼精DNA）、去垢剂（SDS）、螯合剂（EDTA）、Ficoll（聚蔗糖）、PVP等。
在一些实施方式中，结合剂可以在中等严格条件下与样品中的靶标序列杂交。如本文中所用的，中等严格可包括由本领域普通技术人员基于例如DNA的长度可轻易确定的条件。例举的条件包括使用5XSSC、0.5%SDS、1.0mM EDTA（pH8.0）的预洗涤溶液，杂交条件为50%甲酰胺、6X SSC、42℃（或其它类似的杂交溶液，如Stark's溶液，42℃，在50%甲酰胺中），并且洗涤条件为60℃、0.5X SSC、0.1%SDS。
在一些实施方式中，结合剂在低等严格条件下与样品中的靶标序列杂交。如本文中所用的，低等严格条件可包括由本领域普通技术人员基于例如DNA的长度可轻易确定的条件。低等严格可包括，例如，将DNA在40℃在包含35%甲酰胺、5x SSC、50mM Tris-HCl（pH7.5）、5mM EDTA、0.1%PVP、0.1%Ficoll、1%BSA和500μg/ml变性鲑鱼精DNA的溶液中预处理6小时。杂交在相同的溶液中进行，同时作出如下改变：0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.2%BSA、100μg/ml鲑鱼精DNA、10%（wt/vol）硫酸葡聚糖，并使用5～20x106CPM结合剂。样品在40℃在杂交混合物中孵育18～20小时，然后在55℃于含有2x SSC、25mMTris-HCl（pH7.4）、5mMEDTA和0.1%SDS的溶液中洗涤1.5小时。将洗涤溶液更换为新鲜溶液并且在60℃孵育额外的1.5小时。
在其它实施方式中，本发明可以涉及作为肽序列的结合剂或含有肽序列，其中肽序列源自非抗体蛋白，例如，源自不同蛋白的核酸结合结构域、不同细胞受体和核受体的配体的肽序列及其衍生物。此类结合剂的一些非限定实例可以是补体级联经典途径的c1q蛋白（其可以与抗体恒定区结合）、MHC分子（例如，MHC I类、MHC II类和非常规MHC）、具有特异性结合配偶体的分子（如参与胞内信号转导途径的分子，如具有亮氨酸拉链结构域的分子，例如，fos/jun，myc，GCN4）、具有SH1或SH2结构域的分子（如Src或Grb-2）；免疫球蛋白受体（例如Fc受体）；嵌合蛋白（即，经工程化以组合两种或多种特异性结合配偶体之特性的蛋白，例如，可以将亮氨酸拉链工程化至抗体的Fc区中，可以将SH2结构域工程化以在抗体的Fc区中表达）。在其它实施方式中，可以工程化融合蛋白，其包含带有替换的可变结构域的抗体Fc部分。
结合剂也可以是能与大生物分子的特定结构单元特异性结合的小分子。
在一些实施方式中，结合剂可以包括可检测的标记物，例如，荧光物质、半抗原、酶等。在一个实施方式中，本发明涉及标记的结合剂，即能够与样品中的结合配偶体（例如，靶标单元、其它结合剂、沉积的可检测分子）特异性结合的标记的第一、第二、第三或其它的结合剂。这些结合剂可以用于本发明样品中靶标单元或靶标部位的可视化。在一个实施方式中，本发明涉及包括标记物（其为酶）的结合剂。适合的酶标记物的非限定实例可以是辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）、β-半乳糖苷酶（GAL）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫萤光素酶、葡萄糖氧化酶（GO）。在一个实施方式中，结合剂可以含有HRP作为标记物。在另一实施方式中，结合剂可以含有AP作为标记物。其它的酶实施方式在下文中讨论。
对于形成本发明的靶标部位所必需的结合剂的量可以取决于不同因素而改变，例如样品种类、靶标种类、结合剂种类、结合剂的结合亲合力等。可以针对每个特定的实施方式选择性地确定合适的结合剂和所需的量。在一些实施方式中，可以调节用于形成靶标部位的结合剂的量，从而并非全部存在于样品中的单个靶标单元而是其部分子群参与靶标部位的形成，例如，这些实施方式可涉及如下样品，其中以丰沛量含有靶标或含有以宽泛动态浓度范围存在的靶标。在其它实施方式中可以是，全部的或基本上全部的单个靶标单元参与本发明靶标部位的形成，例如在样品具有靶标或单个靶标单元的极低靶标表达的情况下。在后面的实施方式中，可以以如下的量使用结合剂，其中此量将确保使用样品的基本上大部分的单独单个单元形成结合位点，即，存在的基本上大部分的单个靶标单元将参与靶标部位的形成。
在一个实施方式中，结合剂可以是未标记和标记的相同种类的结合分子的混合物，其对相同的结合配偶体具有亲和性，例如，针对特定靶标蛋白的标记和未标记的一抗的混合物，或针对特定种类的一抗的标记和未标记的二抗的混合物等等。使用后面的结合分子混合物，其中一部分标记的结合分子是预先决定的，靶标部位形成（之后可视化为视觉上明显的点）为具有通过该部分标记的结合剂预先决定的一定部分的单个靶标单元子群。这允许确定样品中单个靶标单元的精确量，并由此确定靶标的量，包括样品中靶标的相对量和总量。
在一些实施方式中，本发明涉及结合剂，例如特异结合对的成员，其对于其特异结合配偶体的结合亲和性是对样品中其结合配偶体的已知结合亲和性。
通常通过解离常数来描述特异结合对的成员之间的亲和性，例如，配体与受体、抗体和抗原等，即，配对中的一个结合配偶体（BP1）有多紧密地与另一结合配偶体（BP2）结合。
可以通过双态过程来描述结合配偶体之间的复合物（BP1:BP2）的形成：
BP1:BP2<=>BP1+BP2；相应的解离常数限定为其中[BP1]、[BP2]和[BP1:BP2]分别表示BP1、BP1以及BP1与BP2的复合物的摩尔浓度。
解离常数具有摩尔单位（M），其对应于BP2上的结合位点被占据一半时的BP1的浓度，即BP2结合为[BP1:BP2]的BP2浓度等于没有配体结合[BP2]的BP2浓度时的BP1的浓度。解离常数越小，BP1结合越紧密，或者BP1与BP2之间的亲和性越高。例如，具有纳摩尔（nM）解离常数的BP1比具有微摩尔（μM）解离常数的BP1更紧密地结合BP2。
用于特定的BP1与BP2相互作用的解离常数可以随着溶液条件（例如，温度、pH和盐浓度）而显著变化。不同溶液条件的作用是有效地改变将特定BP1:BP2复合物保持在一起的任何分子间相互作用的强度。用于本发明目的的与BP1:BP2复合物形成相关的介质条件在以下的其它部分中讨论。
在抗体（Ab）与抗原（Ag）结合的具体情形中，通常使用亲和常数（Ka）。其是解离常数的倒数。即：
Ab+Ag<=>Ab:Ag；
该化学平衡也是结合速率（on-rate，K正向）和解离速率（off-rate，K逆向）常数的比率。两种抗体可以具有相同的亲和性，但是一种可以同时具有较高的结合速率和解离速率常数，而另一种可以同时具有较低的结合速率和解离速率常数。
可以从商业提供者得到具有已知Kd或Ka的结合剂，或可以通过任何本领域技术人员已知的技术预先确定Kd和/或Ka。在下面描述使用本发明的可视化体系对组织学样品中第一和第二结合剂的Kd进行确定的方法，以及使用该确定来对组织学样品中的靶标进行定量。
至少一种结合剂可以包括与靶标的单个单元直接或间接结合且与所述单元形成复合物的酶。
酶可以是具有氧化还原酶活性的酶（在本文中，可互换地被称作“氧化还原酶”或“本发明的酶”）。术语“具有氧化还原酶活性的酶”意指按EC（酶分类编号）分类为EC1的酶，所述酶催化电子从一个分子（还原剂，也称为氢或电子供体）转移至另一分子（氧化剂，也称为氢或电子受体）。在一些实施方式中，本发明涉及分类为E1.10.（酚氧化酶）和E1.11.（过氧化物酶）的氧化还原酶。
本发明的一个实施方式可涉及酚氧化酶，特别涉及含铜氧化酶漆酶（Laccase）（E1.10.3.2）家族。漆酶作用于酚和类似分子，进行单电子氧化。漆酶在木质素的形成中通过促进木质醇（一个天然存在的酚类家族）的氧化偶联发挥作用。
本文中，术语“漆酶”用来指本发明的具有酚氧化酶活性的酶，然而，应当理解，漆酶只是适合于本发明目的的酚氧化酶的许多实施方式中的一种。
在另一实施方式中，本发明可涉及催化以下形式反应的过氧化物酶的酶活性：
ROOR'+电子供体（2e-）+2H+→ROH+R'OH
在本发明的一个实施方式中，具有过氧化物酶活性的酶是辣根过氧化物酶（HRP）。在本发明的另一实施方式中，具有过氧化物酶活性的酶是大豆过氧化物酶（SP）。
对于一些过氧化物酶，最佳底物是过氧化氢，其它过氧化物酶在使用有机的氢过氧化物（如有机过氧化物）时更有活性。电子供体的性质依赖于酶的结构，例如辣根过氧化物酶（HRP）可以使用多种有机化合物既作为电子供体，又作为受体。HRP具有可接触的活性部位，并且许多化合物可以抵达这个反应位点。
酶活性，即氧化还原酶活性，例如酚氧化酶或过氧化物酶活性，可以由与结合剂分子直接或间接连接的酶的全长分子或合并有酶活性的酶片段（例如酶分子的全大小的51%至99.9%，或少于51%，例如40%，30%或更少）代表。
本发明的结合剂可以与一个或更多个酶部分直接或间接结合（本文中的术语“部分（moiety）”意指可具有氧化还原酶活性的部分酶分子，它包括完整或基本上完整的酶分子以及所述分子的可具有氧化还原酶活性的部分）。第一和/或第二结合剂中二者或任一的分子可以与氧化还原酶的一个或几个功能活性部分结合。在一个实施方式中，第一结合剂的至少一个分子可以与可具有氧化还原酶活性的一个或更多个酶促部分结合；在另一实施方式中，第二结合剂的至少一个分子可以与一个或更多个这样的部分结合。第三和其它结合剂的分子也可以与氧化还原酶结合。术语“直接结合”意指酶部分通过化学键连接到结合剂分子上。术语“间接结合”意指酶的部分通过连接分子连接到结合剂分子上，其中该连接分子具有与结合剂结合的一个化学键以及与酶结合的另一化学键。
在一个实施方式中，氧化还原酶的部分是HRP的部分，例如整个HRP分子、其具有HRP酶活性的片段，也可以是含有具有酶活性的HRP部分的重组蛋白等。在另一实施方式中，氧化还原酶的部分可以是大豆过氧化物酶（SP）的部分。在另一实施方式中，氧化还原酶的部分可以是漆酶的部分。
含有具有氧化还原酶活性的酶的结合剂的非限定实例可以是与一个或更多个HRP部分结合的抗体分子或其衍生物，例如Fab，以及与HRP结合的核酸结合剂。此类结合剂可直接或间接与单个靶标单元（例如单个靶标分子）结合并由此形成复合物，其中单个这样的复合物含有单个单独的靶标单元以及一个或更多个结合剂（其中一个或更多个的该结合剂包括具有氧化还原酶活性的酶）。
在一个实施方式中，结合剂是含有一个、或两个或更多个过氧化物酶部分的结合物，其中所述部分直接连接于结合剂，例如直接与一个或更多个HRP部分结合的抗体分子。在另一实施方式中，结合剂可以是含有间接连接于结合剂的具有过氧化物酶活性的两种或更多种酶（例如两个或更多个HRP部分）的结合物，例如，这样的结合物，其中一个或更多个抗体分子与和一个或更多个HRP部分独立地连接于骨架聚合物，即具有过氧化物酶活性的酶间接与结合剂（即与抗体）连接。
每结合剂分子的HRP数目可以变动，从每结合剂1个酶部分至每结合剂20～50个酶部分或甚至更高。一些实施方式可使用这样的结合剂，其中每结合剂的HRP部分数目是至少2个，包括每结合剂2个至20～25个酶部分，例如在3个和20个之间，如4、5、6、7、8、9、10个等。一些实施方式可使用这样的结合剂，其每结合剂含有超过2个的酶部分，包括5个和20个之间，例如从5个到15个酶部分。具有超过4个酶部分的结合剂可以有利于形成这样的靶标部位，其可以可视化为大小基本上相同的点。在一些实施方式中甚至可以是，此类结合分子集合的含有酶的每个结合剂分子含有大约相同数目的酶部分，例如集合中的每结合剂含有4～6个，每结合剂分子5～7、6～8、7～9、8～10个等等的酶部分，例如每抗体分子（例如每个一抗分子或每个二抗分子）5～6个或6～7个HRP部分。含有多个HRP部分的后述结合剂构建体是示例性的。为了实现所提到的效果，结合剂可以含有上文讨论的具有氧化还原酶活性的本发明任何酶的多个部分。结合剂还可以含有不同氧化还原酶的多个部分的组合。
在一些其它实施方式中，可以使用结合剂的相对小的结合物分子，例如，与酶（例如HRP）的一个或两个或更多个部分结合的单个抗体分子或抗体的分离Fab区。此类结合剂是相对紧凑的分子并且这可能有利于检测在靶标或样品中被“隐藏”或掩蔽的单独靶标单元，例如单独的单个靶标分子可能被周围的其它分子掩蔽，单个靶标结构可能隐藏在靶标分子内，或者在含有细胞的复杂生物样品中可能难以接触单个病毒颗粒。
在一些其它实施方式中，可以使用含有结合剂和数十至数百个酶部分的巨大结合物。此类结合剂可能例如在关注于非常快速的靶标检测或期望获得每单独靶标部位巨大沉积物的情况下是有利的。
与包含具有氧化还原酶活性（例如过氧化物酶活性）的酶的结合剂（直接或间接）结合的单个靶标单元可构成本发明的单个靶标部位。
在一个实施方式中，本发明的单个靶标部位含有靶标的单个靶标单元、至少一个一抗或其衍生物以及至少一个二抗或其衍生物，其与一个、两个或更多个具有过氧化物酶活性的酶（例如HRP）结合。
在另一实施方式中，单个靶标部位可以含有单个靶标单元、与半抗原结合的至少一个一抗分子以及与一个、两个或更多个具有过氧化物酶活性的酶（例如HRP）结合的针对所述半抗原的抗体。
在另一实施方式中，靶标部位可以含有单个靶标单元、一个或多个对该靶标特异的第一核酸/核酸类似物结合剂以及一个或多个对第一核酸/核酸类似物结合剂特异的第二核酸/核酸类似物结合剂。
上述实施方式不是限定性的。其它实施方式可以涉及上述讨论的单个任意靶标单元与上述讨论的任意结合剂的任意组合，其形成本发明的靶标部位。
在一个实施方式中，单个靶标部位可以是片子的单个位点，其含有用本发明的酶活性标记、即与具有氧化还原酶活性的酶直接或间接结合的单个靶标单元，或是含有具有氧化还原酶活性的酶的重组融合分子的单个单元。在一个实施方式中，氧化还原酶可以是靶标；相应地，该实施方式中的靶标部位可以仅含有氧化还原酶酶的单个单元，如氧化还原酶的固定部分，例如固定在片子之上或内部的HRP或漆酶。
在与一种或多种结合剂孵育并形成上述的本发明靶标部位之后，含有一个或更多个本发明单个靶标部位的样品可以在水溶液（i）中孵育。本发明的水溶液（i）含有与本发明的单个靶标部位相关联的酶的第一底物，其中所述第一底物是水溶性富电子有机化合物，其（1）能够在与该酶反应时产生稳定的自由基；并且（2）能够在该酶和过氧化物化合物存在的情况下交联所述酶的第二底物分子，从而产生所述第二底物的水不溶性聚合产物。本发明的水溶液（i）还可含有与本发明的单个靶标部位相关联的酶的第二底物，其中所述第二底物是结合物分子，该分子含有能够作为所述酶的底物的至少两种化合物和可检测标记物，其中该可检测标记物选自荧光性、发光性、放射性或显色性物质或特异性结合对的成员。
与本发明的单个靶标部位相关联的酶的第一底物（以下也称为“第一底物”）可以是具有氧化还原酶活性的酶的底物。该底物（1）可以是水溶性富电子有机化合物，（2）可能够在与所述酶反应时产生自由基，并且（3）可能够交联所述酶的第二底物的水溶性分子（在所述酶和过氧化物化合物的存在下），从而产生所述第二底物的水不溶性聚合产物。
术语“水溶性”意指第一底物的分子能够在水中和含水溶液中溶解。术语“富电子化合物”意指含有连接的p-轨道的共轭体系的有机化合物，包括具有交替单键和多键的化合物。孤对电子和自由基可以是该体系的部分。该化合物可以是环状、非环状或二者。“共轭”意指一个p-轨道与另一个穿过居间性σ键重叠（在较大的原子中可能涉及d-轨道）。共轭体系具有桥接居间单键的重叠p-轨道区域。这样允许π电子跨越所有相邻对齐的p-轨道离域，这通常可以降低分子的整体能量并提高稳定性。共轭体系的π电子不属于单键或原子，而属于一组原子。
本发明的具有氧化还原酶活性的一组酶包括可以利用大量底物的多样酶。在这些底物中，本发明的底物是这样的化合物，它们是含有共轭π体系的水溶性有机富电子有机化合物，其能够在与具有氧化还原酶活性的本发明酶反应时产生自由基，包括稳定的自由基。术语“稳定的自由基”在本文中意指在本发明的条件下，例如在水溶液（A）（下述）中，第一底物的自由基具有至少20秒、包括约1分钟至约15分钟，或更长例如2、3、4或5分钟、在5和10分钟之间等的寿命。另外，构成本发明第一底物组的化合物的自由基能够交联本发明的第二底物的水溶性分子，从而将所述水溶性分子转化成水不溶性聚合产物。
特别地，在一个实施方式中，本发明涉及如下的第一底物，其由一组水溶性有机富电子化合物（包括含有一串至少三个（C-C=）重复的化合物或含有芳香环结构的化合物）所代表，其中该水溶性有机富电子化合物具有一组相互连接的碳原子，其中每两个键是双键。
在一个实施方式中，第一底物可以由含有式（I）结构的化合物代表：
其中R1是芳基或乙烯基，R2、R3和R4独立地为H、N-(X)2、O-(X)2，其中X是烷基、乙烯基或芳基或H，其中R2、R3和R4不同时为H，其中，N是氮，H是氢；O是氧。
具有如本发明具有氧化还原酶活性的酶的第一底物那样能力的上式化合物的非限定实例可以是3’3’-二氨基联苯胺、阿魏酸、羟基肉桂酸及其衍生物。
在一个实施方式中，本发明涉及3’3’-二氨基联苯胺（DAB）作为第一底物。
本发明利用DAB形成如下稳定自由基的能力，该稳定自由基可以在具有氧化还原酶活性的酶（即辣根过氧化物酶（HRP））和过氧化物化合物（即过氧化氢）的存在下交联第二底物的分子，并在单个靶标部位处离散地沉积所交联的第二底物分子。
另一实施方式可涉及阿魏酸作为第一底物。
阿魏酸能够在具有氧化还原酶活性的酶（即辣根过氧化物酶（HRP））和过氧化物化合物（即过氧化氢）的存在下交联本发明的第二底物分子，并在本发明的单个靶标部位处离散地沉积所述第二底物。作为第一底物的阿魏酸对在靶标部位处需要第二底物的较大沉积（例如，直径大于2微米的点）的实施方式特别有用。
在一些其它实施方式中，本发明可涉及3’3’-二氨基联苯胺或阿魏酸的衍生物。在本文中，术语“衍生物”意指衍生自3’3’-二氨基联苯胺、阿魏酸的化合物或者如果分子中的一个原子被另一原子或原子团替换时可以设想从3’3’-二氨基联苯胺、阿魏酸产生的化合物。本发明涉及了满足上述所讨论的本发明第一底物条件的3’3’-二氨基联苯胺和阿魏酸的衍生物，例如，作为阿魏酸衍生物的α-氰基-4-羟基-肉桂酸。
在另一实施方式中，本发明涉及作为第一底物的4-羟基-肉桂酸及其衍生物，例如α-氰基-4-羟基肉桂酸。作为第一底物的α-氰基-4-羟基肉桂酸在需要小且紧凑地沉积第二底物（例如，约2微米和更小的点）的实施方式中特别有用。
出于本发明的目的，即为了在本发明的条件下生成直径大于0.4微米的第二底物的沉积，例如约1微米、1.5微米、2微米、3微米或4微米，第一底物在水性介质（A）和/或水性介质（B）中的量可以根据表示第一底物的化合物的结构而从约0.05mM变化到约15mM。
例如，作为第一底物的阿魏酸或其衍生物在水性介质（A）中的量可以在0.5mM至5mM之间变化，例如约0.5mM、约1mM、约1.5mM、约2mM、约2.5mM、约3mM。术语“约”表示所述值的1～25%的偏差。
可以以约1.5mM至约15mM的范围使用作为第一底物的羟基肉桂酸的衍生物例如α-氰基-4-羟基肉桂酸，例如约1.5mM、约1.75mM、约2mM、约2.5mM、约3mM、3mM至4mM、4mM至5mM、5mM至6mM、6mM至7mM、7mM至8mM、8mM至9mM、9mM至10mM、10mM至11mM、11mM至12mM、12mM至13mM、13mM至14mM、14mM至15mM（包括所有所述区间的两个端点以及所有区间内的值）。
当使用DAB作为第一底物时，其在水溶液（A）中的量可少于1mM，包括在0.05mM至1mM的范围内，例如0.05mM至0.08mM，例如约0.07mM，即0.066mM至0.074mM，或0.08mM至0.1mM，例如约0.09mM，或0.1mM至0.3mM，例如约0.15mM、约0.2mM、约0.25mM、或0.3mM至0.6mM，例如约0.35mM、约0.4mM、约0.45mM、约0.5mM、约0.55mM，或0.6mM至1mM，例如约0.7mM、约0.75mM、约0.8mM、0.8mM至1mM。
根据本发明，本发明酶的第二底物（这里也称为“第二底物”）是结合物分子，其含有能够作为所述酶的底物的至少两种化合物和可检测标记物，其中该可检测标记物选自荧光性、发光性、放射性或显色性物质或特异性结合对的成员。
在一些实施方式中，本发明涉及一大群作为第二底物的结合物分子，其共有以下特征：
该结合物分子是水溶性分子，其含有能够作为本发明的酶的底物（包括作为HRP的底物）的两种或更多物质和一种或多种标记物，其中底物和标记物通过水溶性连接体化合物（以下称为“连接体”，linker）连接到一起；
酶底物部分“浓集”在所述分子的一部分中结合物分子内，并且标记物“浓集”在所述分子的另一部分中，其中该标记物与底物相距大约30个或更多个连续互连的原子，即分隔大约2.5nm或更多，包括多于3nm；
酶底物彼此以少于2.5nm的距离分隔，例如在结合物分子内以少于30个或更少的互连碳或杂原子（如碳、氮、硫和/或氧原子）分隔，包括不超过5～20个原子；
连接体是含有至少30个连续互连原子的化合物；
在环境中不存在具有氧化还原酶活性的酶时，结合物不从包含过氧化物化合物和本发明第一底物的水溶液（ii）中沉淀；
在环境中存在具有氧化还原酶活性的酶但不含有所述酶的第一底物时，结合物不从包含过氧化物化合物的水溶液（ii）中沉淀；.
在环境中存在所述酶的情况下，结合物从包含过氧化物化合物和具有氧化还原酶活性的本发明酶的第一底物的水溶液（ii）沉淀。
第二底物的沉积物可以通过视觉手段直接可辨识到，因为在一些实施方式中，它们可以含有显色性、荧光性或发光性标记物。在其它实施方式中，沉淀的第二底物可以在沉积为可见之后的步骤中“染色”。在两种情况下，第二底物的沉积物将向观察者“报道”本发明的单个靶标部位存在于环境中。本发明的第二底物的分子因此在本文中可互换地称为“报道”分子。
适合于本公开目的的第二底物分子的非限定性实施方式可在以下更详细地说明。
在一个实施方式中，本发明涉及第二底物，其是含有以下物质的水溶性结合物分子：一种或多种可检测物质（可互换地称为“标记物”）；能够作为本发明的酶的底物的至少两种物质；以及连接体，其中所述连接体是含有至少一条由至少30个连续相接原子组成的直链的化合物，该直链含有至少两个分支点，其中所述分支点分隔至少30个连续相接原子的分子距离；其中标记物（i）和氧化还原酶底物部分（ii）与连接体在其两个分支点处连接，其中所述分支点分隔至少30个连续相接原子的距离，并且其中任何两个相邻的酶底物彼此分隔少于30个连续互连原子的分子距离。
术语“可检测物质”意指该物质能够释放出待通过视觉手段检测的可检测的显色、荧光、发光或放射信号，或者它可以利用其特异性结合配偶体而被检测到，例如抗体、核酸序列、核酸序列类似物序列、半抗原、抗原、受体、受体配体、酶等。
在一些实施方式中，本发明的水溶性结合物分子可以另外含有可增强其特性的部分，例如改善其作为标记物或酶底物的能力，或提高/降低其水溶解性。
在一个实施方式中，本发明的结合物分子可以选自一组下式的化合物：
(Y)n-L-(Z)m，其中Y是能够作为具有氧化还原酶活性的酶的底物的部分；Z是可检测标记物；L是连接体化合物，其中，n是从2至150的整数，m是从1至150的整数。
在一个实施方式中，Y可以是选自下式（II）的化合物：
其中，R1是-H、-O-X、N(X)2或-S-X；R2是-H、-O-X、-N(X)2或-S-X，R3是-H、-OH、-NH2或-SH；R4是-H、-O-X、-N(X)2或-S-X，R5是-H、-O-X、N(X)2或-S-X，R6是-CON(X)2或CO-X，其中H是氢；O是氧；S是硫；N是氮；且X是H、烷基或芳基。
在一个实施方式中，能够作为具有氧化还原酶活性的酶的底物的化合物中至少之一是式（ii）的化合物。
在一个实施方式中，能够在结合物分子中作为具有氧化还原酶活性的酶的底物的化合物中至少两者是式（ii）的化合物。
在一个实施方式中，能够在结合物分子中作为具有氧化还原酶活性的酶的底物的化合物中至少两者是相同的式（ii）化合物。
在一个实施方式中，能够在结合物分子中作为具有氧化还原酶活性的酶的底物的化合物中至少两者是不同的式（ii）化合物。
在一个实施方式中，能够在结合物分子中作为具有氧化还原酶活性的酶的底物的所有化合物由式（II）定义。在一个实施方式中，这些是相同的化合物，在另一实施方式中，结合物分子含有由式（II）定义的不同化合物的任意组合。
在一个实施方式中，Y可以是肉桂酸的残基；在另一实施方式中，Y可以是阿魏酸的残基。在另一实施方式中，Y可以是咖啡酸的残基；在另一实施方式中，Y可以是氨基肉桂酸的残基。在另一实施方式中，Y可以是芥子酸（sinappinic acid）的残基。在另一实施方式中，Y可以是阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸、氨基肉桂酸或芥子酸的衍生物。
由式（II）定义的残基Y可通过基团R6连接到连接体L。
在一个实施方式中，结合物含有2至4个相同的残基Y。在另一实施方式中，结合物含有2至4个不同残基Y的组合。在一个实施方式中，2至4个残基Y是由式（II）定义的化合物。
在一个实施方式中，结合物可以含有2至4个阿魏酸的残基或其衍生物的残基，在另一实施方式中，结合物可以含有2至4个肉桂酸的残基或其衍生物的残基；在另一实施方式中，结合物可以含有2至4个咖啡酸的残基或其衍生物的残基；在另一实施方式中，结合物可以含有2至4个氨基肉桂酸的残基；在另一实施方式中，结合物可以含有2至4个芥子酸的残基或其衍生物的残基。后面化合物的2至4个衍生物可以是相同的化合物或者可以是不同的化合物。
在一个实施方式中，结合物分子可以含有两个式（II）的Y化合物，或两个其衍生物，例如两个阿魏酸残基，或两个肉桂酸残基，或两个氨基肉桂酸残基，或两个咖啡酸残基，或两个芥子酸残基等，以及一个或多个可检测标记物；在另一实施方式中，结合物可以含有三个式（II）的分子或三个其衍生物，如三个阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸、氨基肉桂酸、芥子酸等，以及一个或更多个可检测标记物；在另一实施方式中，结合物可以含有4个式（II）的化合物或4个其衍生物，例如4个阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸、氨基肉桂酸、芥子酸或后者的4个衍生物，以及一个或多个可检测标记物。
在一些实施方式中，Y化合物的数目可以大于4，例如，如5～10、10～15、15～20、20～50、50～100或100～150个化合物。此类结合物分子的非限定实例在实施例中描述。在一些实施方式中，此类结合物可以含有多于一条的至少30个连续相接原子的直链，例如30～150个原子，其中2至4个Y化合物与每条直链在该链的第一和相同分支点处连接，并且此类直链中的几条通过所述直链的第二（另一个）分支点与另一个水溶性连接体分子（例如葡聚糖）连接。
在一个实施方式中，结合物分子可以含有2个或4个不同的式（II）化合物的组合，或2个或4个其衍生物的组合，例如2个阿魏酸残基和1个肉桂酸残基，2个芥子酸残基和2个咖啡酸残基等。
在一个实施方式中，Y可以是氨基酸酪氨酸的残基或其衍生物的残基。结合物可以含有2至4个或更多个此类残基。
在一个实施方式中，结合物分子可以含有具有氧化还原酶活性的酶的底物的组合，其中所述底物至少之一是酪氨酸。在一个实施方式中，结合物分子含有至少一个酪氨酸残基和至少一个式（II）的化合物，或其衍生物，并且至少另一个是式（II）的化合物或其衍生物，例如一个酪氨酸残基和两个芥子酸残基或其衍生物。
在一些实施方式中可以是，结合物含有4至6个残基Y，其中Y由上述讨论的任意化合物或任意化合物的组合所代表。
Y化合物可位于结合物分子中作为一个组，并且可归组为每组2至4个Y化合物（即含有多于4个Y化合物的结合物可以含有几组2至4个Y化合物，其中所述组在结合物分子中由一组原子分隔，例如，由对应于30个或更多个连接原子的分子距离分隔）。此类组中的2至4个Y化合物可以经间隔化合物连接在一起，该间隔化合物在两个相邻的Y残基之间提供不长于5～15个互连原子的距离，例如5～10、6～12、7～13、8～14、9～15个互连原子等等。例如，2～4个Y化合物可以与构成含有2至4个氨基酸残基（例如赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸残基等）的肽链的氨基酸连接，其中Y化合物与肽的氨基酸残基的反应性基团连接，例如与赖氨酸残基的ε-氨基连接。2至4个化合物Y还可以通过含有多个分支点的其它短聚合物彼此连接，其中这些分支点之间的分子距离对应于不超过3～7个原子（包括3～5个原子）的链，其中Y化合物可以与分支点直接或间接连接。2至4个化合物Y还可以归并在一起与非聚合物分子结合，其中该非聚合物分子具有允许连接任何2至4个Y化合物的2至4个反应基团。Y化合物的这种归组定位在下文中称为结合物分子的“Y-头（Y-head）”。
在一个实施方式中，Y-头含有2至4个经短聚合物（例如短PNA分子或短肽）连接的Y残基，其中肽包括赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸和/或半胱氨酸残基。然而，含有15个或更少原子的任何其它聚合水溶性分子或非聚合水溶性分子可以与至少2个Y残基结合，并且连接体L可以是合适的。
在一个实施方式中，含有2至4个化合物Y的一个Y-头可以与含有2个或多个下式（III）重复的聚合物连接
其中R1和R2选自NH和O，并且R3选自甲基、乙基、丙基、CH2OCH2和(CH2OCH2)2，并且，其中不超过3个连续重复的乙氧基。所得到的结合物还可以与一个（或更多）可检测标记物结合，或者它可以与含有一个或更多个反应基团的另一个水溶性分子结合，该反应基团允许连接一个或几个此类结合物。这种水溶性分子的一个非限定实例可以是葡聚糖聚合物。
在结合物分子中Y化合物的紧密间距对作为本发明第二底物的结合物的功能能力具有影响，即，结合物在环境中不存在具有氧化还原酶活性的酶（如上所述）时仍可溶解于包含过氧化物化合物和此酶的第一底物的水溶液中，但在环境中存在具有氧化还原酶活性的酶时从此类溶液中快速且高效沉淀（与仅含有一个Y化合物或含有几个Y化合物的结合物相比，其中所述几个Y化合物在结合物分子中未以Y-头形式“浓集”，即2个相邻Y残基间的分子间距大于上述讨论的距离。此类化合物不能在本发明的单个靶标部位处有效形成离散的沉积物）。
结合物分子的可检测标记物可以是可视觉检测的任何物质，例如荧光性或发光性物质，或是可通过使用一些检测手段检测的任何物质，例如，放射性标记物、特异性结合对的成员，例如核酸序列、半抗原等。
任何荧光性、发光性、生物发光性或放射性分子可以用作标记物。它们中的许多是商业可得的，例如荧光染色剂Alexa Fluors（Molecular Probes）和DyLight Fluors（Thermo Fisher Scientific）。荧光标记物的其它非限定实例可以是以下分子：5-（和6）-羧基荧光素、5-或6-羧基荧光素、6-(荧光素)-5-（和6）-羧基-酰氨基己酸、异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、Cy2、Cy3、Cy5、AMCA、PerCP，R-藻红蛋白（RPE）、别藻蓝蛋白（allophycoerythrin，APC）、德克萨斯红、普林斯顿红、绿荧光蛋白（GFP）包覆的CdSe纳米微晶、钌衍生物、鲁米诺、异鲁米诺、吖啶酯、1,2-二氧杂环丁烷（dioxetane）和吡啶并哒嗪（pyridopyridazine）、氢、碳、硫、碘、钴、硒、氚或磷的放射性同位素。
在一些实施方式中，可检测标记物可以是酶。适合的酶标记物的非限定实例可以是碱性磷酸酶（AP）、β-半乳糖苷酶（GAL）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫萤光素酶、葡萄糖氧化酶（GO）。
在其它实施方式中，可检测标记物可以是特异性结合对的成员，例如半抗原。作为适合的半抗原的非限定实例，可以提到2,4-二硝基酚（DNP）、洋地黄毒苷、荧光素、德克萨斯红、四甲基罗丹明、硝基酪氨酸、乙酰氨基芴（acetylaminoflurene）、苦味酸汞（mercurytrintrophonol）、雌二醇、溴脱氧尿苷（bromodeoxy uridine）、二甲氨基萘磺酸酯（丹磺酰）、氨基酸酪氨酸、丝氨酸等。作为适合的特异性结合对的实例，也可以提到生物素、链酶亲和素、互补性天然和非天然寡核苷酸序列，锌指结合结构域对等。其它实例在以上叙述。
在一个实施方式中，标记物是半抗原。在另一实施方式中，标记物是荧光物质。在另一实施方式中，标记物是特异性结合对的成员。在其它实施方式中可以是其它标记物。
每结合物分子（如上所述中的任何一种）的可检测标记物的数目可以变动。在一些实施方式中，标记物的数目可以是1至3，例如每结合物分子1、2或3个标记物。在一些其它实施方式中，结合物可以含有每结合物分子4至150个的更多标记物。
在一个实施方式中，结合物（如上所述中的任何一种）含有一个可检测标记物。在一个实施方式中，结合物分子可以含有一个Y-头（如上所讨论的任何一种）和一个标记物。
根据本发明，在结合物分子中，可检测物质（单个标记物或多个）与作为具有氧化还原酶活性的酶的底物的化合物，例如与Y-头相隔超过2.5nm的分子距离，例如被至少30个连续原子，例如30～150个或更多连续原子的链隔开。在其中结合物含有一条相连原子的链作为Y-头和1个（或更多）标记物之间之L连接体的实施方式中，Y-头和标记物与所述链在彼此相隔至少30个原子的分支点处，例如在30个连接原子的链的相对端连接。
在一些实施方式中，当结合物含有超过1个标记物时可以是，标记物成组，从而在标记物之间存在分子距离，其对应至少30个连续相连原子的链（称为“间隔体”），包括60个或更多个连续相连原子的链，例如90个连续互连原子的链。标记物之间的间隔体是亲水化合物。后面的标记物组然后与结合物分子中以上述方式连接所述标记物和酶底物部分的连接体化合物连接，即，该组中位置最靠近Y-头的标记物距离Y-头的任何酶底物至少30个互连原子，即，至少2.5nm距离。多个标记物在结合物分子中的这种排列下文称为“Z-尾”。
在Z-尾的标记物之间的至少30个连续原子的间隔体可以是含有2个或更多个下式（III）重复的聚合化合物
其中R1和R2选自NH和O，R3选自甲基、乙基、丙基、CH2OCH2和(CH2OCH2)2，其中不超过3个连续重复的乙氧基。
与上述间隔体连接并由其分隔的多个标记物可以经任何合适的连接体（例如允许多个连接的水溶性聚合物，如葡聚糖）与一个Y-头或几个Y-头结合。在一些实施方式中，几个Y-头可以经此类聚合物与几个Z-尾结合。
在一个实施方式中，本发明结合物分子的多个标记物可以是相同的可检测物质，在另一实施方式中，标记物可以是不同的可检测物质。
标记物的Z-尾设置具有在以下方面的优势：（1）包含多个疏水标记物的结合物在水溶液中保持良好的溶解性，并且（2）当结合剂用来检测沉积的结合物时，标记物更好地为结合剂接近。
根据本发明，在氧化还原酶的底物和标记物之间（例如Y-头和Z-尾之间）的连接体L是这样的分子，其含有至少30个连续原子，如30～150个原子或更多，例如30、45、60、90、150、300、500个原子或更多的链。在一个实施方式中，L含有150个连续原子。在一些实施方式中，连接体分子含有原子直链，其中每两个相连的碳原子之后接氧或氮原子。
在一个实施方式中，L可以是单个线性聚合物分子；在另一实施方式中，L可以是可含有结合在一起的几个不同聚合物的结合物分子。
在一个实施方式中，L是含有原子链的线性聚合物，其中两个连续的碳原子之后接选自氧或氮的杂原子，例如如下所述的连接体或聚乙二醇等。
在另一实施方式中，连接体是含有两个或更多个下式（III）重复的化合物
其中R1和R2选自NH和O，R3选自甲基、乙基、丙基、CH2OCH2和(CH2OCH2)2，其中不超过3个连续重复的乙氧基。
L可以包括下式的至少两个重复：
其中R1和R2均为NH且R3是CH2OCH2。L可以包括下式（IV）的一个或多个重复，其中n是1～10之间的整数，且（B）是分支点。
术语“分支点”意指聚合物分子中的一个点，在此可以连接分支（例如同一聚合物的侧链）或其它分子。该分支点可以是化合物Y和Z可经其与L直接或间接结合的原子、一组原子或官能团。
存在很多种可以用作连接体L的聚合物分子。实例包括多糖，例如葡聚糖、羧甲基葡聚糖、葡聚糖聚醛、羧甲基葡聚糖内酯、和环糊精；支链淀粉（pullulan）、裂裥菌素（schizophyllan）、硬葡聚糖（scleroglucan）、黄原胶、胶凝糖、邻乙氨基半乳甘露聚糖、壳多糖、和壳聚糖例如6-邻羧甲基壳多糖和N-羧甲基壳聚糖；衍生的纤维素例如羧甲基纤维素、羧甲基羟乙基纤维素、羟乙基纤维素、6-氨基-6-脱氧纤维素和邻乙胺纤维素；羟基化淀粉、羟丙基淀粉、羟乙基淀粉、角叉菜胶、海藻酸盐（酯）、和琼脂糖；合成多糖例如聚蔗糖和羧甲基化聚蔗糖；乙烯基聚合物包括聚(丙烯酸)、聚(丙烯酰胺)、聚(丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸-2-羟乙基酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(马来酸)、聚(马来酸酐)、聚(丙烯酰胺)、乙基-醋酸乙烯共聚物、聚(甲基丙烯酸)、聚(乙烯醇)、乙烯醇-氯乙酸乙烯酯共聚物、胺化的聚(乙烯醇)、和其嵌段共聚物；聚乙二醇（PEG）、或聚丙二醇或氧化乙烯-氧化丙烯共聚物，含有聚合物骨架，包括线性、梳状、或超支化的聚合物和树枝状大分子，包括分支的PAMAM-树枝状大分子；聚氨基酸，包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚氨酯、聚(乙烯亚胺)、pluriol；蛋白，包括白蛋白、免疫球蛋白、和病毒样蛋白（VLP）和聚核苷酸、DNA、PNA、LNA、寡核苷酸和寡核苷酸树枝状聚合物构成物；混合的聚合物，即，包括一个或多个上述聚合物、嵌段共聚物和无规共聚物的实例的聚合物。
可以对所选聚合物的特性改性以使性能最佳化，例如，可以使长度或分支最佳化。此外，可以对聚合物化学改性以携带多种取代基。还可以化学保护和/或活化取代基，使聚合物进一步衍生化。
在一个实施方式中，氧化还原酶底物与标记物之间的连接体化合物是葡聚糖聚合物或包括葡聚糖聚合物的结合物分子。
使聚合物与不同化学物质（例如标记物）结合的方法在领域内熟知，且可以用来制备本发明的结合物。例如，可以用乙烯砜活化聚合物并与使其与可检测标记物和式（II）的分子混合以形成聚合物结合物。在其它实施方式中，可以使用醛来活化聚合物，例如葡聚糖，之后将其与可检测标记物和式（II）的分子混合。制备聚合结合物的又一种方法是使用所谓的化学选择结合方案以将组分结合到一起，例如在与硫醇改性的聚合骨架共价结合之前可以使用硫醇反应性马来酰亚胺基团来将分子衍生化。在一些其它实施方式中，式（I）的分子和可检测标记物可以经由连接体化合物连接到聚合物。该方法的实例包括使用同型双官能连接体化合物例如戊二醛、二异氰酸己酯、二甲基己二亚酰胺化物（dimethylapimidate）、1,5-二氟-2,4-二硝基苯、异型双官能交联剂等例如N-Y-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯、以及零长度交联剂例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。
下面进一步描述包括连接体的示例性结合物，该连接体是包括多个式（III）重复的聚合物，例如包括两个L30重复的聚合物（称为L60），例如包括三个L30重复的聚合物（称为L90），例如包括五个L30重复的聚合物（称为L150）。
第二底物在水性介质（ii）中的量可以在约10-10M至约10-4M的范围内变化，例如，在结合物（上述中的任一个）包括放射性标记物的情况下，可施用的量可以是约10-10M至约10- 6M，并且在结合物包括荧光标记物或作为特异结合对成员的标记物的情况下，可施用的量可以是约10-9M至约10-4M。
在一个实施方式中，根据本发明，在可视化过程中在不同的水性介质（本文中统称为“孵育介质”）中孵育包括单个靶标单元的样品。
在本文中，术语“孵育介质”意指在特定的时间期间（在本文中称为“孵育时间”）保持样品以实现所期望反应结果的水溶液。
将样品保持/孵育在孵育介质中的时间，即孵育时间，可以根据期望在孵育之后达到的技术效果而变化。在不同的实施方式中，孵育可以持续大约3秒至大约3分钟，例如约10秒、20秒、30秒、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟或更长，例如1-2小时、整夜。在一些实施方式中，在样本上产生点（例如，在脱蜡的靶标修复/新鲜的组织上）所需的所有步骤可以在60分钟内完成。在其它实施方式中，点在100分钟内产生。在一个实施方式中，该方法所有步骤的孵育时间可以是相同的持续时间，即，每一孵育可以持续5至10分钟等。另一个样品可以在包括结合剂的水溶液（在下文中称为“结合剂溶液/介质”或“BAM”）中持续1～3分钟，水性介质（i）和/或水溶液（ii）介质中的孵育可以持续10分钟。
根据靶标、结合剂类型等，可以在不同温度下进行孵育。根据本发明的过程基本上不依赖温度且可以在约+4℃至约+40℃的温度下进行。在一些实施方式中，可有利的是在单一温度（例如室温或小于+30℃）下进行所有的点产生步骤。这可以使自动处理方案和仪器简化。然而，如果需要的话，温度可以用于延长或减短孵育的持续时间，例如可以使用较低的温度来延长孵育时间，相反亦然，可以使用较高的温度来缩短孵育时间。
在本发明方法的步骤（a）中，样品与一种或多种结合剂一起孵育（例如上述）。因此，在一个实施方式中，本发明涉及包括结合剂（例如含有具有氧化还原酶活性的酶的结合剂）的水溶液。该介质在本文中称为“结合剂介质”。
根据本发明，因样品在这样的介质中孵育而将要达到的一个期望的技术效果是形成靶标部位。因而，结合剂介质是水性介质，其中所选的结合剂是可溶的且能够与单个靶标单元结合。基本上，结合剂介质是pH在4～9范围内的一种或多种结合剂的缓冲水溶液。在一些实施方式中，结合剂介质可以包括有机或无机盐。无机盐可以选自例如氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸钠或硫酸铵。有机盐可以选自例如醋酸钠、醋酸铵或咪唑盐，例如咪唑盐酸盐等。
盐在结合剂介质中的量可以在大约10-3M至饱和的范围内，例如大约20mM至大约200mM，或大约50mM至大约500mM。在一个实施方式中，介质可以按大约10mM至500mM的量含有盐。在另一个实施方式中，介质可以不含盐。
如所述，通常，结合剂介质的pH值可以从约4变化到约9，例如在pH3.5与pH9.5之间，例如在pH5与pH7之间，在pH5.5与pH6.5之间或在pH6.5与pH7.5之间，或在pH7与pH8之间，或在pH7.5与pH8.5之间，或在pH8与pH9之间。可以使用任何具有合适缓冲能力的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水（PBS）和咪唑缓冲液。介质的pH值对于结合剂与靶标的结合可以是重要的；可以根据结合剂和靶标的性质对其进行优化。
在一些实施方式中，结合剂介质可以包括有机改性剂（术语“有机改性剂”是指任何非水溶剂），例如N-甲基吡咯烷酮（NMP）、二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇和二甘醇、环丁砜、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、聚乙二醇（PEG）、丙二醇等。有机改性剂的量可以在约1%至约20%（v/v或w/v）的范围内变化，或者在一些实施方式中可高于20%。
在一些实施方式中，结合剂介质可以包括洗涤剂，例如聚乙二醇对异辛基苯基醚（NP-40）或表面活性剂（例如，选自基于聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯（吐温）的表面活性剂、或基于嵌段聚合物（pluronic等）的表面活性剂等）。洗涤剂的量可以在约0.001%至约5%（v/v或w/v）的范围内变化。
在一些实施方式中，结合剂介质可以包括结合剂稳定剂，例如牛血清白蛋白或葡聚糖。稳定剂的量可以从0.01%至20%（w/v）变化。
在一些实施方式中，结合剂介质可以包括离子螯合剂（例如乙二胺四乙酸（EDTA）或乙二胺羟基苯乙酸型螯合剂（EDHPA）等）。螯合剂的量可以在约10-9M至约10-6M的范围内变化。
在一些实施方式中，结合剂介质可以包括一种或多种封闭剂以使非特异结合位点即不包括靶标的片子的位点饱和。适用于不同实施方式的封闭剂的一些非限制性实例可以是Denhard溶液、牛血清白蛋白、脱脂奶等。
如上所述，本发明构思许多种类的靶标、结合剂和检定形式，因此，结合剂介质的组成可以变化并应该使用本领域知识来针对每个特定实施方式作出调整。下面描述结合剂介质的其它实例。
结合剂在结合剂介质中的量可以根据结合剂、样品、靶标的种类，介质组成等而变化。例如，在一个实施方式中，当样品包括以较低浓度范围存在的靶标时，可以在结合剂介质中使用较高量的结合剂，该结合剂介质的组成（例如，pH、盐浓度等）和孵育条件（例如，与样品孵育的持续时间、温度）被最佳化以促进结合剂与靶标（或其它结合配偶体）之间的相互作用。特异结合对的配偶体之间的结合的优化是对于用于本发明目的的大部分结合剂而言为常规的操作，使得本领域技术人员能够通过遵循本领域的指南来实施。有时候需要这样的优化，以保证结合剂与样品中最大可能数量的单个靶标单元或与另一结合剂（例如，结合到靶标的结合剂）结合。
在一个实施方式中，可以调整结合剂在结合介质中的量，以结合样品中存在的所有单个靶标单元或其部分子群。在另一个实施方式中，调整结合剂的量，以结合样品中单个靶标单元与另一结合剂的所有复合物或其部分子群。在一个实施方式中，部分子群相应于样品中单个靶标单元的大部分。在另一个实施方式中，部分子群相应于样品中小部分的单个靶标单元。在这样的实施方式中，可以调整结合剂介质的组成例如pH、盐含量等，或孵育条件例如温度、持续时间等，使得结合剂与样品中的其配偶体的亲和性被减弱或增强，因此结合剂会与样品中存在的单个靶标单元的较大或较小部分子群形成结合复合物。在一个实施方式中，能够与其在样品中的配偶体特异结合的结合剂例如第一结合剂、第二结合剂的量，和/或在第一或第二结合剂混合物（参见以下）中的结合分子的量，即使在不利于配偶体结合的条件下对于使样品中所有可得的结合位点饱和而言是相对高的。
本文中的术语“部分子群”是指样品中结合剂配偶体单元的总群的一部分，即等于或小于99.9%，例如等于或小于99%、98%、97%等，例如75～80%，小于75%，小于60%等，例如1%至50%，例如1%至25%等。在一些实施方式中，部分子群可以小于样品中存在的结合剂配偶体单元总量的1%。
在一些实施方式中，样品中结合剂的结合配偶体的可检测的部分子群可以是预定的。这可以通过使用结合剂的结合分子的混合物来完成，其中混合物的结合分子全都是相同种类并对样品中的（对所有的所述结合分子是共同的）结合配偶体基本上具有相同的亲和性（本文中的“基本上”是指亲和性包括+/-10%的差异），并且其中一部分所述结合分子被可检测地标记且一部分所述结合分子未标记，且两个部分都是预定的。术语“标记的结合分子”是指所述结合分子与可检测标记物例如荧光标记物或酶相关联/相连接。在一个实施方式中，标记物是酶；在一个实施方式中，酶是氧化还原酶（例如，如上所述的那些，例如HRP）。未标记的结合分子不包括任何可检测的标记物。
在一个这样的实施方式中，结合剂可以是能够与单个靶标单元结合并与所述单个单元形成复合物的第一结合剂。在另一个这样的实施方式中，结合剂可以是对与样品中单个靶标单元结合的第一结合剂具有亲和性的第二结合剂。在一些实施方式中，结合剂可以是能够与第二结合剂、或者与连接至第二结合剂的标记物、或靶标部位处的报道物沉积结合的第三结合剂。
使用包括预定比例的标记和未标记结合分子的结合剂（上述的任一种），可以通过对使用标记的结合剂而形成的靶标部位（可视化为点）进行定量而准确定量样品中靶标的量。在下面更详细说明使用标记和未标记结合分子的混合物来对组织学样品中的靶标进行定量的方法。
在结合剂介质中孵育之后，在包括具有氧化还原酶活性的酶的第一底物、具有氧化还原酶活性的酶的第二底物和过氧化物化合物的水溶液（A）（在本文中也称为“报道物沉积介质”或“RDM”）中孵育样品。
任选地，在水溶液（A）中孵育之前，可以在水溶液（B）中孵育样品，该水溶液（B）的组成与没有第二底物的水溶液（A）相同。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及的孵育介质是水溶液（A），在另一个实施方式中，本发明涉及的孵育介质是水溶液（B）。
水溶液（A）和水溶液（B）均可以是具有合适缓冲能力的水性缓冲溶液，例如，磷酸盐缓冲盐水（PBS）和咪唑缓冲液。可以调整溶液的pH值以达到孵育的技术效果，即在本发明的离散的单个靶标部位处形成具有氧化还原酶活性的酶的第二底物的离散沉积，例如调整成约4至约9范围内的pH。然而，水溶液（A）和（B）的pH对于孵育的技术效果具有较小的重要性。
水溶液（A）和水溶液（B）两者还可以包括有机盐或无机盐。
无机盐可以选自例如氯化钠、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸钠或硫酸铵等。
有机盐可以选自醋酸钠、醋酸铵或咪唑盐，例如咪唑盐酸盐等。
盐在水溶液（A）和水溶液（B）中的量可以在约10-3M到饱和的范围内，例如约20mM至约200mM，或约50mM至约500mM。在一个实施方式中，介质可以包括量为约10mM至500mM的盐。在另一个实施方式中，介质可以没有盐。
在不同实施方式中，水溶液（A）和水溶液（B）两者还可以包括：有机改性剂，和/或酶增强剂，和/或铁螯合剂，和/或洗涤剂，和/或抗菌剂。
有机改性剂可以以约1%至约20%（v/v或w/v）的量存在于介质中，然而，在一些实施方式中，可能需要更高浓度的有机改性剂。有机改性剂可以例如是聚乙二醇（PEG）。其它实例包括但不限于，选自C1～C4即低级醇、N-甲基吡咯烷酮（NMP）、二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇和二甘醇、环丁砜、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的有机改性剂。在一些实施方式中，可有利的是使用聚乙二醇（PEG）例如PEG2000，或丙二醇。在这些情况下，聚乙二醇在介质中的量可以在约0.1%（v/v）至约20%（v/v）的范围内变化，例如约1%（v/v）至约15%，例如5～10%（v/v）。
术语“酶增强剂”是指增强过氧化物酶的催化活性的任何化合物。这样的酶增强剂可以选自苯基硼酸衍生物和二价金属离子例如镍或钙。酶增强剂的量可以在约10-7至约10-3M的范围内变化。
铁螯合剂可以是乙二胺四乙酸（EDTA）或乙二胺羟基苯乙酸型螯合剂（EDHPA）。铁螯合剂的浓度可以在约10-9至约10-6M的范围内变化。
洗涤剂可以选自聚乙二醇对异辛基苯基醚（NP-40），选自基于聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯（吐温）的表面活性剂、或基于嵌段共聚物（pluronic等）的表面活性剂的表面活性剂。洗涤剂的浓度可以在约0.001%至约5%的范围内变化。
水溶液（A）的基本组分是具有氧化还原酶活性的酶的第一底物、所述酶的第二底物和过氧化物化合物。
在以上详细讨论了第一底物和第二底物的实施方式。
在一个实施方式中，第一底物可以是3,3’-二氨基联苯胺（DAB）或其衍生物。在另一个实施方式中，第一底物可以是阿魏酸或其衍生物。
第一底物在水溶液（A）中的量可以根据选为第一底物的化合物而变化（参见以上的讨论）。例如，在实施方式中，当DAB被选为第一底物时，DAB在水溶液（A）和水溶液（B）中的量小于1.4mM，并且可小于1.2mM，或小于1mM，例如约0.005mM至约0.5mM，例如约0.3mM，或约0.2mM，例如约0.15mM等。在阿魏酸用作第一底物的实施方式中，所述化合物的量小于2.5mM，并且可小于2mM，例如约1.5mM。该上下文中的术语“约”是指+/-0.05～0.5mM。
本发明的其它第一底物在水溶液（A）或（B）中的量在之前的章节中有过讨论。
水溶液（i）可以包括多种量的酶的第二底物，例如约10-10M至约10-4M。例如，在第二底物（上述的任一种）包括放射性标记物的实施方式中，适用的量可以在约10-10M至约10-6M的范围内。在其它实施方式中，例如，当第二底物包括荧光标记物或作为特异结合对成员的标记物时，量可以在约10-9M至约10-4M的范围内。
在一个实施方式中，水溶液（A）可以包括第二底物的相同结合物分子的群体。在另一个实施方式中，水溶液（i）可以包括第二底物的不同结合物分子的群体。
本发明的过氧化物化合物是过氧化氢，然而，其它过氧化物化合物也可以用于不同的实施方式中，例如，在一些实施方式中，其可以为有机过氧化物，例如叔丁基过氧化物、二叔丁基-过氧化物、过醋酸等，或者在一些实施方式中，其可以是过氧化氢的加合物，例如过氧化氢尿素加合物。
过氧化物化合物在水溶液（i）和水溶液（ii）中的量可以不高于5mM，并且可小于5mM，包括在0.1mM至5mM的范围内，例如0.1mM至1mM、1mM至2mM、2mM至3mM、或3mM至4mM，包括在约1mM至约2mM的范围内，例如约1.5mM。术语“约”在该上下文中是指+/-0.05～0.5mM。
包括具有氧化还原酶活性的酶的第一底物、所述酶的第二底物和过氧化物化合物的水溶液（A）在本文中称为“沉积介质”。
水溶液（B）可以以与水溶液（A）中相同的量包括相同的化合物，不同之处在于水溶液（ii）不包括具有氧化还原酶活性的酶的第二底物。
在一些实施方式中，可以初始在水溶液（B）中继而在水性介质（A）中孵育包括单个靶标部位的样品。
在另一个实施方式中，在水溶液（A）中孵育包括单个靶标部位的样品，而不在水溶液（B）中预孵育。
根据本发明，沉积介质是稳定的溶液，即在较长的时间段（例如至少5小时）内不出现溶解化合物的沉淀。为延长介质的保存期限，可有用的是在+20℃之下的温度例如在+4～+10℃下储存介质，并且/或者向介质中添加抗菌化合物。抗菌化合物可以是任何常用于该目的的抗菌化合物，例如，叠氮化钠、ProclinTM或。
在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，包括在步骤（b）之后的一个或多个步骤，包括检测在单个靶标部位处的第二底物的离散单个沉积，例如，可以在包括能够与第二底物的沉积分子的可检测标记物特异结合的结合剂的孵育介质中孵育包括第二底物的离散沉积的样品。
包括能够与第二底物的沉积分子的可检测标记物特异结合的结合剂的孵育介质通常具有与以上讨论的结合剂介质相似或相同的组成。
在一个实施方式中，与沉积的第二底物的可检测标记物结合的结合剂可以包括酶，例如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。可以使用标准的可视化体系来检测这些结合剂，该标准的可视化体系采用酶的显色底物，例如酶底物溶液或显色液。这种介质可以是领域内已知的任何合适介质，其根据可得的可视化手段并遵循关于沉积物的可检测标记物的性质的普通常识而进行选择。
或者，在结合剂包括HRP的情况下，本发明的可视化方法可以包括以下的进一步步骤，即，在上述沉积介质中孵育含有与所述结合剂结合的第二底物的离散沉积的样品。在一些实施方式中，当与沉积的第二底物相关的信号可能较弱，或初始沉积的尺寸较小时，该进一步的步骤可以是有利的。额外的沉积步骤允许与沉积相关的信号进一步放大，并且还可以增加在单个靶标部位处的可识别沉积的尺寸。此外，该步骤还允许对可识别信号的特性进行改变，例如改变信号的光谱特征，例如，通过使用包括用于该额外沉积的绿色标记物的结合物分子来替代包括用于初始沉积的红色标记物的结合物分子（在方法的步骤（b）中），可检测为红色信号的初始标记物可以被取代为可检测为绿色信号的标记物。然而，本发明方法的这种灵活性不对额外的检测步骤中所使用的试剂增加额外的复杂度，因为可以成功地使用本发明步骤（a）和（b）（以上讨论的）的孵育介质的所有实施方式而无需在这些额外步骤中作出重大改变。
在一个实施方式中，本发明涉及洗涤介质，即在孵育的技术效果发生之后用于从样品中去除（孵育介质中）剩余化合物的介质。本发明的方法可以包括一个或多个洗涤步骤，其通常在于上述介质中孵育样品的步骤之后，例如在步骤（a）与（b）之间等。通常，洗涤介质将是与洗涤步骤之前的步骤中孵育样品所使用的相同的介质，而没有孵育介质的基本化合物，即，没有结合剂、酶的底物等。
在一个实施方式中，本发明涉及用于使内源性氧化还原酶的活性淬灭的介质。这类介质可以是通常用于本领域目的的任何此类介质，例如过氧化氢溶液。可以在方法的步骤（a）之前使用该介质。还可以在步骤（b）之后且在沉积的第二底物的额外检测步骤之前使用该介质。该介质在过程的该阶段中的应用可以用于使样品中残余的氧化还原酶活性淬灭。
因此，可见，用于对由可编程性定量检定所处理的样本进行图像分析的方法和体系在图像处理简单性和速度方面具有显著优点。并且在各个实施方式中描述了多种诊断和非诊断应用。与过去染色样本的化学和免疫组化成像相比，光学特征的可编程性以及所产生点的离散且明显的性质提供许多益处。
说明书和权利要求中使用的表示成分的量、反应条件等的所有数目在所有实例下都理解为被术语“约”修饰。因此，除非有相反指示，说明书和所附权利要求中提到的数值参数是近似值，其可以根据通过本发明想要获得的期望特性而变化。至少且不是试图将等同原则的应用限制到权利要求的范围，各个数值参数应根据有效数字的数目和普通舍入方式进行理解。
发现，使用特定条件的沉积介质（其包括具有氧化还原酶活性的酶的第二底物的特定结合物分子以及相对低量的具有氧化还原酶活性的酶的第一底物，过氧化物化合物例如DAB和过氧化氢），可以在本发明的单个靶标部位处形成所述结合物分子的离散沉积，其具有明显的物理特征，即直径大于0.4微米的圆形沉积，其能够使用普通的显微镜而被直接观察到或能够可视化为明显的点。使用相似的放大体系（采用可检测结合物分子的HRP-DAB介导的沉积，可以改善传统的HRP-DAB IHC染色，即靶标染色的均匀彩色图样变得更为明晰（crisp），从而改善细胞结构例如细胞膜、细胞质和细胞核的细胞内分辨率。作为替换，本发明的可视化体系提供靶标染色的点状图，其中一个单一点对应于一个单独的靶标单元例如一个单独的靶标分子，从而允许单独单个靶标单元例如单个靶标分子的细胞内分辨率。
由本发明方法制备的本发明可检测结合物分子的沉积是三维的并具有大致的球形，其在二维视野例如显微视野下被观察为明显的大致圆形的点。因此，术语“圆点”（在本文中与术语“点”和“明显的点”互换使用）在本文中是指，在二维视野中观察为明显的大致圆点的本发明可检测结合物分子的球形沉积。本文中的术语“明显”是指本发明的点对眼睛而言是可区分的或认为是离散的。术语“大致圆形”是指本发明的明显点具有约0.65或小于0.65的偏心度。根据本发明的点具有约0.4微米或大于0.4微米的直径。该上下文中的术语“约”是指+/-0.05～0.5微米。相比之下，通过传统DAB-HRP方法得到的DAB染色沉积的“点”、或通过一些常规方法获得的靶标部位处的单个染色沉积、或通过CARD法得到的生物素基-和荧光基-酪胺（fluorescyl-tyramide）沉积，具有在普通显微镜（例如4×或10×放大明视野或荧光镜）的分辨极限之下的尺寸，例如，小于0.1微米。因此，不能在低倍显微视野（例如4×或10×）下直接观察由在后方法可视化的单独单个靶标单元。本文中描述的方法允许检测单个靶标部位处本发明可识别结合物分子的单个沉积并使其可视化，从而使用低倍镜来观察样品中固定的单个单靶标元。
术语（具有氧化还原酶活性的酶的）“第二底物的一个单一沉积”或（本发明的）“可检测结合物分子的一个单一沉积”涉及第二底物的多个结合物分子的单一积聚。根据本发明，本发明中第二底物的一个明显沉积可以包括约1000至高达1000000个结合物分子或更多。
如上所述，单个靶标部位处沉积的第二底物可以包括视觉上可鉴别的分子，例如包括视觉上可检测的标记物例如荧光标记物的分子。因此，在一个实施方式中，可以直接在形成沉积之后通过使用常规荧光显微镜经显微镜人员检测这些第二底物的沉积点。根据本发明使用至少一个额外检测步骤例如上述的额外步骤（c），来使包括经标准显微镜不能直接观察到的标记物（例如，特异结合对的成员）的报道物分子的沉积可视化。
可以控制点的数目、其大小和视觉外观。例如，在不同的实施方式中，可以产生具有特定大小和特定外观（例如，特定颜色）的点。
在一个实施方式中，通过使用涉及本发明靶标部位形成且包括不同数目的酶部分（例如每一结合剂的HRP数目）的结合剂（本文中的术语“酶部分”或“酶”是指具有氧化还原酶活性的酶），沉积尺寸和点尺寸可以变化。在另一实施方式中，可通过沉积过程的持续时间来控制点尺寸。在另一实施方式中，可通过沉积介质的内容物例如第一和/或第二底物或过氧化物化合物在沉积介质中的量来调节点尺寸。
因此，在一个实施方式中，相对于每一分子用于形成靶标部位的结合剂的酶单元数目可以影响点的尺寸。发现，点尺寸可以与每一包括一种或更多结合剂和一个单一靶标单元的复合物的酶部分数目直接相关。相比于使用相同结合剂但相对于每一分子包括较少酶部分而获得的点，当用于形成靶标部位的结合剂相对于每一分子包括较大数目的酶部分时，观察到更大的点（在其它方面相同的沉积条件下，即相同的孵育时间、相同组成的沉积介质）。
为了在本发明的条件下制备与一个单一沉积对应的可见点，靶标部位包括单个即一个酶部分是足够的，例如涉及靶标部位形成的结合剂包括单个HRP部分；然而，在两个或更多酶部分存在于同一靶标部位的实施方式中，与该靶标部位相关的点大于第一种情况下的点。因此，在一个实施方式中，与一个单一靶标部位相关的结合剂可以包括HRP的一个单一部分，在另一个实施方式中，结合剂可以包括HRP的两个或更多个部分，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在一个实施方式中，相对于每一结合剂的酶部分的数目为至少2个，包括3～10，例如4～8个部分。
令人惊讶地发现，使用涉及本发明靶标部位形成的结合剂（其中相对于每分子结合剂的酶部分的数目为至少2个），可以在其它方面相同的条件下（即，相同条件的可视化过程）产生近似相等尺寸的点。因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中包括固定靶标的样品与一种或多种结合剂孵育，其中至少一种结合剂包括至少两个具有氧化还原酶活性的酶。因此，该实施方式中的靶标的单独单元被可视化为单独的基本上相同的点，即相同大小的点。在一个实施方式中，包括具有氧化还原酶活性的酶的结合剂的分子池可以异质的（heterogeneous），即所述分子相对于每一分子包括不同数目的酶部分，例如2～10个分子，11～20个分子等。在另一个实施方式中，本发明涉及一种方法，其中包括具有氧化还原酶活性的酶的结合剂分子池的每个分子，相对于每一结合剂分子包括基本上相同数目的酶部分，例如相对于每一结合剂分子包括1～3、2～4、3～5、4～6、5～7、6～8、7～9、8～10、9～11、10～12等的酶部分。
在另一个实施方式中，通过第一底物在沉积介质中的量例如通过DAB的量来调节点尺寸。当DAB在沉积介质中的量（可视化过程的其它方面条件相同，即相同的结合剂、相同的报道物、相同量的报道物、相同浓度的过氧化物、相同的孵育时间等）在约0.01mM至约1mM的范围内时，例如0.05mM至0.75mM，例如约0.075mM至约0.5mM，例如约0.1mM，例如0.15mM或，约0.3mM，例如0.28mM等时，可以形成其中（相对于每一点）沉积的报道物的量不少于1000分子的较大的点，即直径等于或大于0.4微米、或等于或大于1微米、或等于或大于2或3微米例如4或5微米的点。当在沉积介质中同时使用较多和较少量的DAB时，可以观察到尺寸更小即小于0.4微米的点。
本发明结合物分子的组成和结构影响所述分子沉积为本发明第二底物（上述）的能力，因而它们影响沉积的尺寸和点的明显尺寸。此外，结合物的标记物可影响点的外观。例如，在结合物分子包括荧光标记物的实施方式中，标记物的荧光基团的性质会影响点的外观，例如在相同的条件下，包括丽丝胺（Lissamine，红色荧光基团）的结合物比包括荧光素（绿色荧光基团）的相似结合物产生更强烈的点。此外，在其它方面相同的条件下，沉积介质中较高量的第二底物可以导致形成较大的沉积。
还可以通过第二底物沉积所使用的时间来调节点的尺寸。在沉积介质中较长的孵育时间允许在单个靶标部位处沉积较大量的结合物分子，从而增加单个沉积的尺寸继而增加单个点的尺寸。在其它方面相同的条件下，即相同的结合剂、相同的介质等，将孵育时间从30秒增加到10分钟可以使得酶产生能被观察为直径约5微米的单个点的沉积。然而，孵育持续时间的进一步增加并不增加单个沉积的尺寸。然而，在沉积介质中较长的孵育时间不减小单个沉积的尺寸，如果需要的话，可以使用较长的孵育时间，例如高达20或30分钟或更长。因此，在不同的实施方式中，方法的沉积步骤的持续时间可以在约30秒至约20分钟的范围内变化，例如1、2、3、4、5、10或15分钟，例如，在一个实施方式中，孵育时间可以是约30秒，在另一个实施方式中，该时间可以是约2分钟。在一个实施方式中，结合物分子可以在5～10分钟的过程中沉积。
过氧化物化合物在沉积介质中的量也可以用作调节报道物沉积尺寸以及点尺寸的因素。为获得直径高达5微米的单个点，过氧化物化合物例如过氧化氢在沉积介质中的量应该少于2mM，在一些实施方式中，其量不可超过1.5mM。较高量的过氧化物化合物导致形成尺寸较小的点。
所有以上讨论的因素在本文中称为“初始因素”，因为它们影响最初即第二底物的初始沉积的形成。如所述的，例如在第二底物的结合物分子包括荧光标记物的情况下，可以在发生沉积之后即刻观察到这样的初始沉积。在其它实施方式中，例如在结合物包括作为特异结合对的成员（例如半抗原）的标记物的情况下，初始沉积不是可直接观察的，然而，它们可以在沉积步骤之后的一个或多个检测步骤（在本文中称为“二次可视化过程”）中被可视化。二次可视化过程的数个因素也可以影响作为点的沉积的视觉尺寸和外观，从而增加本发明可视化体系的灵活性。因此，这些因素被称为“二次因素”。
可以通过执行直接或间接接着沉积步骤的以下检测步骤（c'）和（c''）来使包括标记物（为特异结合对的成员）的报道物分子的沉积可视化：
（c'）将在单个靶标部位处包括第二底物的离散沉积的样品与能够与沉积的第二底物的可检测标记物直接或间接结合的一种或多种结合剂一起孵育，其中至少一种结合剂包括一个或多个选自放射性的、荧光的或发光的物质，特异结合对的成员或酶的可检测标记物，从而形成包括沉积的报道物和所述至少一种结合剂的复合物，
（c''）在样品中检测包括可检测标记物的结合剂，从而使在一个或多个单独靶标部位处的一个或多个报道物沉积可视化，并从而使样品中一个或多个单独靶标单元可视化。
在此上下文中的术语“间接”是指，其可以是步骤（b）与（c'）之间的一个或多个任选步骤，例如洗涤步骤。
通过使用识别包括多个酶部分（其可以利用显色或荧光底物，例如HRP或碱性磷酸酶（AP））的结合剂的报道物（作为可检测标记物），可以对沉积“染色”并产生明显的视觉上可检测的点。在这种情况中，通过产生一定尺寸的明显的视觉上可检测点，可以“增加”或“减小”单个沉积的原始尺寸。在一个实施方式中，使用标记有HRP或另一氧化还原酶的结合剂，以及沉积的最佳条件（如上所讨论），沉积步骤可以重复一次或多次，从而在每个重复之后增加单个靶标部位处的可检测沉积的尺寸。在另一个实施方式中，使用标记有HRP或另一氧化还原酶的结合剂，以及沉积的次佳条件（如上所讨论），可以重复沉积步骤，产出较小尺寸的沉积以及较小尺寸的相应可检测点。在一个实施方式中，可以使用结合物分子作为第二底物来重复沉积步骤，该结合物分子不同于用于初始沉积的结合物分子，例如包括另一标记物，例如丽丝胺标记物而非荧光素标记物。在其它实施方式中，可以使沉积时间或沉积介质条件最佳化，从而在初始单个靶标部位处产生较小或较大的二次沉积。
因此，用于本发明中的可视化体系是灵活且有效的放大体系。双重调节体系提供额外的灵活性，其可能在一些实施方式中特别有利，例如在希望将较大的初始沉积可视化为较小尺寸的点的实施方式中。较小尺寸的点可允许靶标单元更精确地定位在样品中，还可以允许检测较大动态范围的靶标。
在要检测两种或更多种不同靶标的实施方式中或在靶标以较宽的动态浓度范围存在于样品中的实施方式中或在初始沉积提供较弱的可检测信号的实施方式等中，也可能期望上述的双重调节。对以较宽的动态浓度范围存在于样品中的靶标（即样品中存在靶标浓度的梯度）的可视化和定量可能是有挑战的。在该范围的最低端，与靶标部位相关的点的数目可能不足以提供关于靶标在整个样品中的存在情况的统计上有效的信息，而在动态范围的最高端，大量不能在视觉上相互单独区分开的重叠点的存在可能会使单个靶标单元的可视化有挑战性。使用上述的初始和/或二次因素来降低与较大的初始沉积对应的点的明显尺寸可以允许克服这些问题，并对以较大动态范围存在于样品中的靶标进行可视化和定量。
第二底物的初始沉积的检测方法根据样品类型、沉积分子的特征等而可以不同。可以使用本领域中任何合适的方法，例如，在组织学样品中，可以通过使用任何标准IHC染色例如HRP-DAB染色来检测沉积，ELISA可视化或免疫印迹染色可以用于其它实施方式中等。
实验例
实施例1.组织学样品中的靶标定量
为确定样品中单一靶标实体的数目，具体是所述单元例如单一靶标蛋白分子的总数，可进行一些复合平衡实验，采用：
测试材料的一些参考样品，具有相同但是未知水平的固定蛋白分子Pr.（例如，同源Her2参考细胞系的单一区块（block）的连续切片）；
与所述蛋白结合的一抗Ab1（例如高亲和性的单克隆兔抗HER2），具有未知的解离常数Kd1；
与所述一抗结合的酶标记二抗Ab2，具有未知的解离常数Kd2。
根据本发明，样品中固定靶标（例如，蛋白）的水平可以表达为组织样品的每细胞核（例如，在参考细胞系样品中）、或单位面积或单位体积等中的计数的单一分子点（PDQA）；分子的数目可以经由阿伏伽德罗数（Avogadro's Number）转变为所述分子在样品中的浓度。
通常认可的是，抗体蛋白相互作用的理论框架是复合平衡。抗体会与靶标蛋白达到平衡：
Ab1+PrAb1:Pr F1
受抗体的解离常数Kd1影响：
在这样的平衡条件下，总蛋白（PrTotal）和总抗体（Ab1Total）将分布在游离蛋白与复合物以及游离抗体与复合物之间。
PrTotal=Pr+Ab1:Pr F3
Ab1Total=Ab1+Ab1:Pr F4
由F2得出：
将F5代入F3，得出：
然后可以将F6重新整理为如下：
第一个实验挑战在于确定该第一个平衡何时达到。可以通过使用酶标记Ab2的随后的第二个平衡实验以及之后的PDQA可视化来检测并确定[Ab1:Pr]。第一系列的实验Exp1可以用于建立，对具有恒定量固定蛋白的样品相继施用恒定浓度的Ab1将最终导致在使用酶标记Ab2的随后的第二可视化步骤和PDQA检测中检测到恒定量的Ab1:Pr。
基于对具有固定蛋白的样品单次添加Ab1将引起Ab1:Pr复合物形成并由此引起Ab1和Pr浓度均下降的事实，需要使用Ab1的多次相继添加。可以明显地达到第一次平衡，但是须使用对相同参考样品的Ab1相继添加直至检测到恒定水平的Ab1:Pr，来得知反映出Ab1浓度的真实平衡何时达到，即何时进一步的Ab1添加将不再引起检测到的Ab1:Pr的增加。Ab1的单次或几次添加将产生平衡，反映出固定样品中的蛋白总量而非Ab1的浓度。Ab1将由于复合物的形成而耗尽，并且平衡中的有效浓度将显著低于所施用的Ab1的浓度。
如果抗体的多次添加证实不是耗尽或缓慢动力学的情形，则可以忽略反映出降低的游离抗体浓度的影响的式4。
证实以上理论的实验安排可设计如下：将恒定浓度的Ab1相继施用到具有恒定浓度的固定蛋白的样品中。之后，使用酶标记的二抗和PDQA可视化来检测形成的Ab1:Pr复合物。因此，可以建立反映出Ab1浓度而非固定蛋白的量的真实平衡。（在以下实验12.3a中描述证实该理论的实验，实验12.3a示出，在参考样品与Ab1进行4到5次相继的10分钟孵育之后，检测到Ab1:Pr复合物没有进一步增加）。
第二个复合平衡步骤背后的理论与关于第一个的理论（如上讨论）相同。
在酶标记的二抗与固定的一抗蛋白复合物之间建立第二个平衡：
Ab1:Pr+Ab2Ab2:Ab1:Pr F8
受标记二抗的解离常数Kd2影响：
Ab1:PrTotal=Ab1:Pr+Ab2:Ab1:Pr F10
Ab2Total=Ab2+Ab2:Ab1:Pr F11
从F9得出：
将F12代入F10中，得出：
然后可以将F13重新整理为F14：
仅当Ab1:Pr的浓度在第二个平衡实验中保持基本恒定时，即在洗涤步骤和与酶标记二抗的孵育的过程中在蛋白和一抗之间没有显著的解离发生，才能建立该第二个平衡。如果观察到该情形，可以用式14的Ab1:PrTotal替换式7的[Ab1:Pr]。
这给出下一等式（式15）：
式15可以被认为是绝对计数实验（即确定样品中靶标分子的总数的实验）的理论基础，因为其描述了Kd1与Kd2之间的关系（其能在与抗体滴定相关的平衡实验中得以确定）、以及总蛋白浓度与蛋白和抗体的复合物（可视化为点）之间的关系。
这些实验可以如下进行：将恒定浓度的Ab1相继施用到具有恒定浓度的固定蛋白的样品中。之后，使用酶标记的二抗和PDQA可视化来检测形成的Ab1:Pr复合物。同样地，相继地多次施用酶标记的二抗（其恒定量）。证实该理论的实验（在实验12.3b中描述）已示出，在酶标记Ab2与事先用一抗平衡的参考样品进行四到五次相继的10分钟孵育之后，没有检测到Ab2:Ab1:Pr复合物的形成进一步增加，也没有检测到降低（可能因在洗涤步骤和第二平衡建立的过程中显著的蛋白-Ab1解离而引起）。因此，可以建立反映出固定蛋白、[Ab1]和酶标记[Ab2]的浓度的真实平衡，从而证实式15的等式。
出于与针对式4讨论的相同的原因，现在可以忽略式11。如果多次添加游离的酶标记二抗证实耗尽或缓慢动力学不是问题，则可以忽略该抗体的浓度降低的影响。
具有未知的蛋白浓度水平的组织样品可以与一抗常规地孵育，以确定所述未知蛋白浓度。这个步骤之后可以是与酶标记的二抗进行孵育的步骤，之后为可视化的额外步骤。
通常，在常规的IHC染色过程中，仅使用与一抗和二抗的单次孵育，并且物理搅动是惯例，该物理搅动或是不受控的（由于重力、蒸发或芯吸（wicking））或通过在片子上主动搅拌试剂而是受控的。然而，使用混合和/或较高浓度的一抗与二抗，可通过单次试剂施用而达到伪平衡条件，引起可再现的结果（这就是现今熟知的组织学染色体系如何工作的，例如Envision体系）。抗体试剂（一抗或酶标记的二抗）的连续添加产生相对稳定的平衡，因此还能起到针对抗体耗尽的保护作用，并且对比传统IHC染色，允许准确评估IHC样品中的靶标量。
如以下实验中所述，需使用低量的高亲和性一抗是因为所测试的Her2克隆的较低Kd1值以及需要使用低于Kd1的浓度以测量Kd1。针对常规用途，可以使用远高于Kd1的浓度，从而降低对多次添加的需求。在二抗的情况中，因需要降低点重叠而避免使用较高浓度。在较高浓度下，至少在手动进行计数时，重叠点可能妨碍准确的点计数。
当观察到引起形成非重叠PDQA点的染色条件时，PDQA点可以被计数为Pr，且如果PrTotal可以保持恒定（例如，在使用相同参考材料的连续切片的情况下），具有变动的[Ab1]和恒定的[Ab2]的实验将允许确定Kd1；PrTotal和Kd2将仍然保持未知，但是是恒定的。这允许将式15重新整理为式16：
常数（C）反映样品的PrTotal值以及在具有常数[Ab2]的第二平衡反应中检测的Ab1:Pr复合物的分数。其为可以在这些条件下检测的点的绝对数目。F16的等式表明，当[Ab1]高且增加时，点的数目将接近常数水平但不会达到常数水平。当[Ab1]低且降低时，作为[Ab1]的双曲线函数的点的数目将接近[Ab1]的线性函数。
在具有恒定参考材料和常数[Kd2]的实验中，作为[Ab1]函数的点数目是双曲线函数，并且通过拟合实验数据将点与[Ab1]相关联，使用式16来确定Kd1。然而，使用以接近Kd1的浓度的Ab1的相继添加，可再现性地允许经由对式16的优异拟合而准确确定Kd1。
允许确定Kd2的实验安排稍稍更复杂些。挑战是，酶标记的二抗的浓度（不变地接近Kd2）将导致点形成，由于重叠问题，其数目将太多以至于无法计数。使用非常低浓度的一抗和/或使用具有低蛋白浓度的参考材料不是解决方案，因为由于非特异结合的二抗，来自高浓度二抗的背景将给出非常高的背景噪音，从而不能准确地反映蛋白浓度。在非常低的一抗浓度下建立平衡的困难使这进一步复杂。克服这些挑战的方法是，在二抗具有约Kd2的浓度的情况下，以相对高的浓度使用一抗和二抗两者，并通过常规IHC来对结合的二抗进行可视化。常规IHC是指使用酶标记的二抗例如通过使用Envision体系而非PDQA可视化来产生3,3’-二氨基联苯胺（DAB）的棕色沉积。这种常规DAB沉积的强度不是线性的，且不正确地反应样品中靶标分子的量，然而两种沉积的强度可以在视觉上比较并确定为大约是相同强度。实际上，这是当前IHC染色结果如何解读的情况：通过比较测试样品和参考样品中棕色沉积的强度来对它们进行评价并遵循图表或说明性指南来对它们进行解读。
使用相同的参考材料，（F15的）PrTotal可以保持恒定。如果[Ab1]和[Ab2]也恒定，且Ab2:Ab1:Pr通过常规IHC而被可视化为棕色沉积，则染色会具有恒定强度。明显地，强度必须在常规IHC的动态范围内，从而以棕色沉淀的可变强度反映出Ab2:Ab1:Pr的变化。IHC片通常以0（阴性）（完全没有颜色）、1+（弱阳性）、2+（中等阳性）和3+（高度阳性/棕黑色）的等级来进行评分。为准确反映[Ab1:Ab2:Pr]，分数应该在0.5+至2.5+的范围内，从而检测到向上或向下的变化，包括在1+至2+的范围内，在该范围内作为[Ab1:Ab2:Pr]函数的强度变化是最明显的且背景噪音最小。
当在期望的动态范围内（即，在1+至2+的范围内，且[Ab2]为约[Kd2]）建立参考体系后，相对于初始参照实验，使用较低恒定浓度的Ab1、变化的[Ab1]2以及增加浓度的Ab2来进行以下描述的实验12.3d。
通过增加[Ab2]，[Ab2:Ab1:Pr]的浓度在一些点将达到与先前建立的参考水平相同的水平，引起相同强度的棕色沉积。当棕色DAB沉积的强度具有与使用[Ab1]1和[Ab2]1形成的沉积相同的强度时，得出：
[Ab2:Ab1:Pr]1=[Ab2:Ab1:Pr]2
因此，通过两种不同的[Ab1]和[Ab2]的组合以及恒定的PrTotal，达到相同的染色水平。其遵循以下等式：
因为Kd1已知，且根据实验条件已知[Ab1]1和[Ab1]2，等式可以简化成式17（C1和C2是常数）：
除以C1得到：
可以将式18重新整理以允许分离出Kd2：
(Kd2×[Ab2]2)+([Ab2]1×[Ab2]2)=(C3×Kd2×[Ab2]1)+(C3×[Ab2]1×[Ab2]2),
其可以简化成：
其中C3（等于C2/C1，参见以上）限定为：
C3涉及两个双曲线函数，在相互的顶点反映出恒定水平的棕色染色，其源自于两组不同的实验条件：首先，通过达到反映[Ab1]1和[Ab2]1的第一平衡来建立参考水平；之后，通过使用[Ab1]2和[Ab2]2来达到相同的参考水平。Kd1已知，由此可以确定Kd2。
可以使用[Ab1]1和[Ab2]1来产生常规染色强度的参考水平。使用不同浓度的Ab1，[Ab1]2允许[Ab2]的滴定直至通过[Ab2]2达到相同的染色强度水平。这允许根据式19确定Kd2。
返回到原始式15，在已经确定Kd1和Kd2之后，满足在两个步骤中均达到平衡的条件并允许准确的PDQA点计数的任何PDQA染色实验将允许确定所使用的参考样品中的PrTotal。
其中已经通过该方式确定了PrTotal的任何参考样品得到“绝对参考”的状态。
对固定样品中蛋白（或任何其它固定靶标化合物）的绝对数目进行计数并且可以根据固定样品的性质将其表达为绝对项，例如单位面积/体积/细胞的分子等。
实验支持
缩写
MBHA 4-甲基二苯甲胺
NMP N-甲基吡咯烷酮
HATU 2-(1h-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3四甲基脲六氟磷酸
酯；亚甲铵（methenamminium）
DIPEA 二异丙基乙胺
DCM 二氯甲烷
TFA 三氟乙酸
TFMSA 三氟甲基磺酸
Flu 荧光棒
Dex 葡聚糖
HPLC 高效液相色谱
equi. 当量
L30 1,10,16,25-四氮杂-4,7,13,19,22,28-六氧杂-11,15,26,30-四
氧-三十烷
L60、L90、L120、L150 L30的不同聚合物，包括2、3、4或5个L30重复
CIZ 2-氯Z=2氯苄氧羰基
FITC 异硫氰酸荧光素
HRP 辣根过氧化物酶
GaM 山羊抗小鼠抗体
DNP 2,4二硝基-氟代苯（二硝基苯基）
ACim 4-氨基-肉桂酸
LPR 液体永固红（Dako K0540）
Sin 芥子酸（4-羟基-3,5-二甲氧基肉桂酸）
Caf 咖啡酸（3,4-二羟基肉桂酸）
α-CHC α-氰基-4-羟基肉桂酸
PNA-X 肽核酸寡聚体(N-(2-氨乙基)-甘氨酸)，包括与中心氮结合的
不同取代基
A 腺嘌呤-9-乙酸
C 胞嘧啶-1-乙酸
D 2,6-二氨基嘌呤-9-乙酸
G 鸟嘌呤-9-乙酸
Gs 6-硫代鸟嘌呤-9-乙酸
P 2-嘧啶酮-1乙酸
T 胸腺嘧啶-1-乙酸
Us 2-硫脲嘧啶-1-乙酸
Dpr 2,3 二氨基-丙酸
Phe 苯丙氨酸
Tyr 酪氨酸
Trp 色氨酸
Lys 赖氨酸
Cys 半胱氨酸
betaala β丙氨酸、N,N二乙酸
FFPE 甲醛固定石蜡包埋
PDQA 可编程性点定量检定，也称作单一分子检测
交联剂 具有氧化还原酶活性的酶的第一底物
报道物 具有过氧化物酶活性的酶的第二底物
RDM 报道物沉积介质
BAM 结合剂介质
材料和方案
1.第二底物（报道物）
Sin-Lys(Sin)-Lys(Sin)-L150-Lys(Flu)（0328-018/D21047/D21067）
在固相合成携有游离N端氨基和游离赖氨酸侧链氨基的中间体后，进行溶液相合成。使用α-N-Boc-(ε-N-2-Cl-Z)-赖氨酸来引入赖氨酸残基，其在从树脂分裂之后提供游离的ε-N-氨基。溶液相标记基本上是固相技术的延伸，利用的是，相对高分子量的中间体几乎能够与乙醚从TFA或NMP溶液中定量地沉淀出。
在固相上制备Boc-(Lys(2-Cl-Z))3-L150-Lys(Fmoc)。除去Fmoc基团，之后如上所述进行荧光素标记。中间体NH2-((Lys(NH2))3-L150-Lys(Flu)由与树脂开裂而产生。用乙醚使其沉淀，将其溶解在TFA中，沉淀然后溶解在NMP中，并用DIPEA制成碱性。将该溶液与等体积的经HATU和DIPEA活化的0.2M芥子酸（4-羟基-3,5-二甲氧基肉桂酸）在NMP中的溶液混合。10分钟后，完成标记，并通过添加乙二胺至10%浓度持续5分钟，来进一步“擦洗”粗产物。在用乙醚沉淀后，进一步在TFA中溶解产物并用乙醚将其沉淀三次以除去低分子量碎片。在使用乙二胺“擦洗”之前，质谱分析显示出两种加合物（及其组合）：+（176）n，表明额外的阿魏酸（在其它阿魏酸和荧光素上的酚酯），以及+98（N,N’-四甲基脲加合物，同样地在未受保护的酚基上）。通过乙二胺处理完全除去这些物质，并且活性酯和阿魏酸寡聚体同样也被分解。
结合剂：
2.1与结合有HRP的Dex70结合的山羊抗兔抗体（L348.111，10～11部分）
在40℃下，在316微升的缓冲液A（100mM NaCl、25mM NaHCO3，pH9.5）中使11nmol70kDA MW的葡聚糖与484nmol HRP反应3h。之后，将于196微升水中的44nmol山羊抗兔添加到葡聚糖-HRP结合物中并使其在40℃下另外反应1h。通过添加70微升0.165M半胱氨酸30分钟来淬灭反应混合物，并在缓冲液B（100mM NaCl，10mM HEPES pH7.2）中经Sephacryl300（GE Medical）纯化产物。洗脱的产物是包括山羊抗兔（GaR）和HRP的葡聚糖结合物。产物基于结合物大小分为4个部分：含有产物的前两个部分（8～9部分）洗脱为第一个峰，推测含有一些交联的结合物，然后接着是较宽的肩峰，其被分为10～11部分（均质的大结合物）和12～21部分（较小的可变结合物），且最后是在22～42部分的未结合的酶和抗体。对单独产物部分、以及含有未结合抗体和HRP的部分的测量，显示出87%的总结合物回收率。假设引入的HRP与葡聚糖之间成正比，显示出10～11部分相对于每一葡聚糖含有10.9个HRP和0.96个抗体。仅这两个部分被用于实验。
2.2与结合有HRP的Dex70结合的抗HER2抗体（D21100，9～10部分）
在30℃下，在125微升的缓冲液A（100mM NaCl、25mM NaHCO3，pH9.5）中使4.6nmol70kDA MW的葡聚糖与202nmol HRP反应3h。之后，将于489微升水中的18nmol Her2抗体添加到葡聚糖-HRP结合物中并使混合物在30℃下另外反应21h。通过添加70微升0.165M半胱氨酸30分钟来淬灭反应混合物，并在缓冲液B（100mM NaCl，10mMHEPES pH7.2）中经Sephacryl300（GE Medical）纯化产物。洗脱的产物是包括Her2抗体和HRP的葡聚糖结合物。产物基于结合物大小分为4个部分：含有产物的前两个部分（7～8部分）洗脱为第一个峰，推测含有一些交联的结合物，然后接着是较宽的肩峰，其被分为9～10部分（均质的较大结合物）和11～19部分（较小的可变结合物），最后是在20～41部分的未结合的酶和抗体。对单独产物部分、以及含有未结合抗体和HRP的部分的测量，显示出68%的总结合物回收率。假设引入的HRP与葡聚糖之间成正比，显示出9～10部分相对于每一葡聚糖含有9.1个HRP和0.6个抗体。仅这两个部分被用于实验。
2.3与结合有HRP的Dex70结合的抗FITC抗体（AMM353-022，8～11部分）
在40℃下，在316微升的缓冲液A（100mM NaCl、25mM NaHCO3，pH9.5）中使11nmol70kDA MW的葡聚糖与484nmol HRP反应3h。之后，将于196微升水中的66nmol FITC抗体添加到葡聚糖-HRP结合物中并使其在40℃下另外反应1h。通过添加70微升0.165M半胱氨酸30分钟来淬灭反应混合物，并在缓冲液B（100mM NaCl，10mMHEPES pH7.2）中经Sephacryl300（GE Medical）纯化产物。洗脱的产物是包括FITC抗体和HRP的葡聚糖结合物。产物基于结合物大小分为3个部分：含有产物的前面的部分（8～11）洗脱为第一个峰，然后接着是较宽的肩峰（较小的可变结合物，12～27部分），最后是在28～45部分的未结合的酶和抗体。对单独产物部分、以及含有未结合抗体和HRP的部分的测量，显示出90%的总结合物回收率。假设引入的HRP与葡聚糖之间成正比，显示出10～11部分相对于每一葡聚糖含有11.7个HRP和0.80个抗体。仅这两个部分被用于实验。
3.第一底物
在以下条件下，使用DAB、阿魏酸和α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-CHC）作为第一底物：
表1
与DAB相比，使用阿魏酸，当孵育时间加倍时得到相近直径的点；使用α-氰基-4-羟基肉桂酸，孵育时间与DAB相同，然而点更小（与DAB的3～4微米相比，直径为2～3微米）。
4.其它试剂
DAB显色液（Dako K3465）
LPR显色液（Dako K0640）
苏木精复染（Dako S3301）
洗涤缓冲液（Dako S3306）
靶标修复液（Dako S1699）
封片介质Dako Fairmount（S3205）
5.测试材料
作为测试材料，使用福尔马林固定石蜡包埋的表达Her2的细胞系sk45、df45和df23的球粒连续切片（这些细胞系还将被对应地称为0（即阴性）、1+和3+细胞系）。这些细胞系是FDA批准的用于乳腺癌的Dako HercepTest的0、1+和3+对照材料。细胞系的球粒被包埋在单块石蜡中，以提供存在每个细胞系的切片。测试材料的选择反映出材料的可得性（例如，各个单块提供上百个连续切片，各个测试片上三种不同细胞样品的存在允许三种不同测试样品的一个染色过程的结果之间的相关性）。
6.测试材料的预处理
含有三个细胞系的石蜡块的FFPE切片的片子（还被称为“片子”）通过沉浸（emersion）在二甲苯（2×5min）、之后96%乙醇（2×2min）和70%乙醇（2×2min）中而被脱石蜡化。之后，用去离子水洗涤片子并将其转移到靶标修复液中，或是稀释10×的高pH溶液（Dako S2375）（使用细胞角蛋白抗体的实施例1和2）或是低pH溶液（Dako S1700）（参见以下的实施例10.3～10.8）。之后在微波炉中加热片子至沸腾（约5min）并温和地沸腾10分钟。之后，使片子冷却20min并在之后将其转移到稀释10×的洗涤缓冲液（Dako S3006）中。
7.一抗：
将特异的抗细胞角蛋白抗体（Dako M3515，小鼠单克隆）作为浓缩物和稀释溶液进行使用。基于总蛋白浓度（在各个瓶上标示）并考虑抗体的分子量（150kDa/mol）制备抗体稀释液。抗体还被称为“细胞角蛋白抗体”。
抗Her2抗体是兔单克隆抗体（Dako克隆25-11-3）。基于所计算的浓缩液中总蛋白浓度以及抗体的分子量（150kDa/mol）来制备稀释液。该抗体在本文中被称为“HER2抗体”。
8.介质
结合剂介质（BAM）：0.1%的4-氨基安替比林（4-aminoantipurine）、0.2%Procline、2%BSA、0.2%酪蛋白、2%PEG、0.1%吐温20、0.1M NaCl、10mM HEPES，pH7.2（ABCPT缓冲液）
报道物沉积介质（RDM）：50mM咪唑HCl pH7.5、0.1%NonidetP40、0.1%苯扎氯铵、0.005%（1.5mM）过氧化氢。
9.仪器
Dako Autostainer Classic。该仪器是全开放且可自由编程的自动IHC仪，其中可以使用并随意设置试剂和孵育时间。仪器进行四个基本动作：
吸入试剂；
将洗涤缓冲液吹离水平放置的片子；
将试剂分配到片子上（已知为吸（sip）和吐（spit））；
通过用洗涤缓冲液进行冲洗来洗涤片子。
在以下方案1中描述用于单一片子的典型程序。对于所有的PDQA实验，初始的过氧化物酶封闭和点形成步骤保持不变。
10.染色方案1
过氧化物酶封闭，5min，在Dako S2023中
洗涤
靶标部位的形成：
一抗，
洗涤
HRP标记的二抗，
洗涤。
靶标部位处报道物沉积的形成
样品（a）在RDM中与0.28mM DAB和5μM报道物（D21047）孵育10分钟。
洗涤
c）检测单一靶标部位处的报道物沉积
FITC-AP抗体，10min，BAM中20nM D20036
洗涤
LPR，10min，Dako K0640
洗涤
d）苏木精复染
苏木精，5min
用去离子水洗涤
f）封片
可以在自动的方案中引入额外的洗涤。自动化调度器通过将洗涤步骤的持续时间降至最低来将整个方案时间保持在最小量；然而，洗涤步骤的持续时间将取决于仪器的负荷。如果单一片子被编程以染色，则单一洗涤步骤可减至20秒，而48张片子的满负荷显著增加洗涤时间。为保持该时间变化最小，每次运行平均染色10张片子。因此，洗涤步骤持续时间相对于每一步骤保持约2min。报道物沉积以及沉积与FITC-AP抗体孵育之后的多次洗涤保证最小的LPR背景染色。尽管具有大量的放大（据估计源自与靶标结合的单个抗体-葡聚糖-HRP分子的各个红点包括平均1000亿LPR分子），几乎没有背景被检测出。
可能会建议进行额外的洗涤，以达到最高水平的放大和最低的背景染色，但报道物和报道物结合剂以相对高的量进行使用。
11.染色评估
通过目视检查PDQA染色片及其图像，初始手动进行点计数。使用免费软件JMicrovision1.27版本来进行自动图像分析。在示例性实施方式中，对所描述的产生的LPR红点以及苏木精染色的细胞核进行自动计数。通过目视检查和手动计数来检验自动计数。分割（segmentation）和对象提取可以仅基于色调、饱和度、强度、（HSI）色空间中的色调，即强度和饱和度都设置为全0～255范围。点色调设定为188（紫）至255以及0～16（橙），核色调设定为76（绿色）至163（蓝）。通过在装配有DP505.5Mpixel相机和CellD图像采集软件的Olympus BX51显微镜上执行的图像采集的过程中过度曝光红（1.2）、中性绿（1.0）且曝光于蓝（0.56）下，来增强点-核对比度。
12.实验
12.1抗细胞角蛋白抗体的Kd的确定
如上所述对8张具有0、1+和3+细胞系的FFPE切片的片子进行预处理和染色（参见预处理和方案1）。
以表2中所描述的变化浓度施用一抗（细胞角蛋白抗体）20min：
片号 BAM中M3115的浓度
1 40nM
2 33nM
3 25nM
4 20nM
5 13nM
6 10nM
7 5nM
8 2.5nM
表2
之后，片子用水性Faramount来封片。采集各张片子上的各个细胞系球粒的3张图像，在各个图像中对红色点进行手动计数，并将所计数的点数目与样品中理论计算的点数目进行比较。
假设一分子细胞角蛋白抗体（cAb）与一个点相关，可以使用下式计算点的理论数目（Ndot）：
其中[cAb]是抗细胞角蛋白抗体的浓度，且Kd是抗细胞角蛋白抗体即cAb的解离常数，且Ndotmax是常数。
名为Ndotmax的常数是指点的最大数目，并且在本文中是指，当抗体的使用浓度显著高于其Kd值时（即当抗细胞角蛋白抗体以远超过Kd值的浓度使用时），点的数目接近最大值。
该式源于用于一抗和二抗的解离常数的式，条件是蛋白在每个测试样品（即细胞0、1+、和3+的样品，如下表3所示具有不同浓度抗体的各个细胞系的8张片子）中的绝对浓度是恒定的且二抗的浓度在片子间保持不变。
表3示出对于所有三个测试细胞系的每个样品1～8实验所得以及理论计算的点数目：
表3
通过将由上式生成的曲线拟合到由实验数据生成的曲线，可以确定Kd1和Ndotmax的大概值。因此，对于所有三个计算系列，将Kd1设定为7nM，Ndotmax设定为700（0）、1300（1+）和1600（3+）。
7nM的Kd值与所有三个细胞系的实验计数较好地相一致。在1+和3+细胞系的情况中，对于高浓度的抗体，计算值稍稍低于测量值。抗细胞角蛋白抗体M3515具有较宽的特异性，其识别数种不同的细胞角蛋白亚型。理论上说，对于各个细胞角蛋白亚型，抗体可具有稍稍不同的Kd，因为抗原的环境可能不同且其可能影响抗体结合。这解释了双曲线的“非完美契合”。此外，一些非特异结合可能在远高于Kd值的浓度下发生。
所进行的定量可以被认为是精确的，因为可以直接比较使用不同片子和不同细胞系的实验的结果，即点染色图样提供对样品的简单快速的数字化定量评估（即，通过对视觉上明显的点进行计数），例如600个点可以与另一样品中的300个点容易地区分开。
使用的二抗（D20168）的Kd值是未知的，且没有示出在亲和性结合的步骤中达到平衡，然而，对照试验确实示出与一抗的进一步孵育（延长的孵育时间和额外部分的抗体）不引起信号的显著增加。因此，如果恒定部分的一抗在实验过程中被二抗识别，后者对Kd测量没有影响。使用多次施用二抗，可以产生两倍多的点。在这些施用中，每一片子的最大点数（Ndotmax）也加倍，但是这些并不影响Kd的测量。12.2第二结合剂（山羊抗小鼠-葡聚糖-HRP 结合物（D20168））Kd的确定
使用常规的IHC染色（Dako Envision体系）来进行该实验。
如所述对片子进行预处理，并将其进行以下染色方案2：
过氧化物酶封闭，5min
洗涤
细胞角蛋白抗体，在孵育介质1中20min
洗涤
HRP标记的二抗（D20168），在孵育介质1中20min
洗涤
DAB显色液，10min
洗涤
苏木精染色，5min
用水洗涤
洗涤
用去离子水洗涤。
三个细胞系（0、1+和3+）中各个的12个样品被分为两个系列，其中第一系列的六张片子与2.5nM抗细胞角蛋白抗体孵育并进一步与6个不同浓度的D20168（100nM、50nM、25nM、15nM、10nM和5nM）孵育，且第二系列的六张片子与10nM抗细胞角蛋白抗体孵育并进一步与6个不同浓度的D20168（100nM、50nM、25nM、15nM、10nM和5nM）孵育。之后，根据以上方案用DAB（作为显色剂）和苏木精对两个系列的片子进行染色。
对于所有三个细胞系，染色强度随浓度增加而增加，但是稳定在IHC染色的动态范围内（低于2.5+的分数）。
如预期的，使用较高浓度的一抗引起较高的染色强度。将使用2.5nM细胞角蛋白抗体和100nM D20168处理的（各个细胞系的）片子（还称为片子A）的染色与（各个细胞系内）使用10nM细胞角蛋白抗体的片子的染色进行比较。使用两个独立的模拟观测者来估计染色的强度。他们发现，对于所有三个细胞系，片子A的染色强度与使用10nM细胞角蛋白抗体和15nM D20168处理的片子（片子B）的染色强度相同。因为参考材料是恒定的（相同细胞系对照片），且在用不同量的一抗和二抗处理的片子中观察到接近相同的染色强度，因此得出的结论是，片子A和片子B中（在一个细胞系内）存在的细胞角蛋白-细胞角蛋白抗体-D20168复合物的数目是相同的。因此，可以使用以下等式来计算二抗D20168的Kd（即Kd2）：
其中C1、C2和C3；[Ab1]1=2.5nM，[Ab1]2=10nM，[Ab2]1=100nM，[Ab2]2=15nM，且其中由以下等式限定C3：
因此，D20168的Kd2被计算为25nM。
12.3a.对于HER2一抗的平衡条件的建立
由于所测试的HER2抗体克隆的Kd值低（即，高亲和性），通过与实施例1相似的手段来确定Kd值的初始尝试可能给出不是特别契合平衡条件的结果：非常低浓度（100pM）的一抗的单次施用可能引起不完全平衡的形成。因此，为限定并确保HER2抗体的平衡条件，一抗的相继添加被应用于所有三个细胞系的样品。用最低浓度（100pM）的抗体处理的片子（其中抗体耗尽和不完全平衡问题被预期为是最严重的）还用高浓度二抗的两次相继添加进行处理，以补偿一抗步骤中的耗尽。
根据方案1，对一抗和二抗使用特定的浓度、孵育时间和相继添加次数来完成染色，如下所示。
100pM HER2抗体，1～6次相继孵育，每次10分钟：
片号 添加次数
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
6 6
表4
每次添加之后，洗涤一次（在下一次添加之前）；5pM HRP标记的山羊抗兔（L348-111，9～10部分），两次相继孵育，每次10min。
采集各个0和1+细胞系样品的三个图像（10×放大），并对每一细胞核的PDQA点数目进行计数。3+细胞系样品不被考虑，因为染色非常强而不能对点进行准确计数。结果呈现在以下的表5中：
HER2抗体的添加 点/核（0） 点/核（1+）
1 0.158 0.407
2 0.258 0.665
3 0.305 1.031
4 0.42 1.309
5 0.532 1.536
6 0.532 1.513
表5
从实验的结果得出，需要至少5次添加HER2一抗溶液（其中抗体的量是100pM）来避免耗尽并在测试样品中建立真实的平衡条件。12.3b.对于二抗的平衡条件的建立
为限定对于二抗的平衡条件，在过程的第一步骤中使用高浓度的HER2一抗，预期其会提供高水平的一抗与靶标的结合，且在过程的第二步骤中进行低浓度二抗（L348-111，9～10部分）的一系列施用（其中抗体的耗尽被预期为是最严重的）。
根据方案1，对一抗和二抗使用以下描述的特定的浓度、孵育时间和添加次数来完成染色：
500pM HER2抗体，2次相继添加，每次10min；
洗涤
-5pM L348-111，1～5次相继添加，每次10min：
片号 添加次数
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
表6
在每次添加之后，在下一次添加之前，应用一次洗涤。
采集各个0和1+细胞样品的三个图像（10×放大），并对每一细胞核的PDQA点数目进行计数。3+细胞系样品不被考虑，因为染色非常强而不能对点进行准确计数。
结果呈现在表7中：
二抗的添加 点/核（0） 点/核（1+）
1 0.077 0.327
2 0.083 0.609
3 0.195 0.889
4 0.318 1.216
5 0.364 1.31
表7
从实验的结果得出，需要添加至少5次1.5pM L348-1119～10部分来达到平衡。
12.3c HER2抗体的Kd值的确定
从实施例12.3a和12.3b已经知道，需要相继添加6次100pM HER2抗体和随后添加5次5pM L348-111，以达到平衡条件并测量Kd值。因此，根据方案1，对一抗和二抗使用以下描述的特定的浓度、孵育时间和添加次数来进行对三个细胞系样品的12张片子的PDQA染色：
6种浓度的HER2抗体，6次相继添加，每次10分钟：
片号 HER2浓度
1和2 100pM
3和4 200pM
5和6 300pM
7和8 400pM
9和10 500pM
11和12 1nM
表8
在每次添加之后且在下一次添加之前，应用一个洗涤步骤；
5pM L348-111，5次相继添加，每次10min。
采集各个0和1+细胞系样品的三个图像（10×放大），并对每一细胞核的PDQA点数目进行计数。3+不被考虑，因为染色非常强，同样地，用最高浓度一抗（1nM）孵育的片子也不被考虑。
0细胞系样品的实验结果呈现在以下的表9中：
表9
非常低浓度的一抗和二抗（相应地，100～500pM和5pM）的使用并结合多次相继添加，对于达到如实验12.3a和12.3b中示出的平衡条件是必须的。6次添加远在Kd之上（1nM）的浓度的一抗应该会引起一些背景，这是预期到的，然而，从5次在Kd附近的双重确定得出的契合是非常好的。使用调整式1中Kd和Ndotmax的迭代过程是可选的方式：将数据拟合到282pM的Kd值和（假设的）靶标饱和时的最大点计数，0.70点/核。
12.3d.L348-111（山羊抗兔-葡聚糖-HRP结合物）的Kd的确定
使用常规的IHC染色来进行该实验。如所述对片子进行预处理，并将其进行以下染色方案3：
过氧化物酶封闭，5min
洗涤
HER2抗体于孵育介质1中，6次添加，每次10min；
洗涤
L348-111于孵育介质1中，3次添加，每次10min；
洗涤
DAB染色，10min
洗涤
苏木精染色，5min
用水洗涤
洗涤
用去离子水洗涤。
对于三个细胞系中的各个，用100pM HER2抗体和50nML348-111对三个片子进行染色（一式三份）。用500pM HER2抗体和浓度降低的L348-111（相应地，50nM、25nM、17nM、11nM、7.5nM和5nM）对其它六个片子进行染色。对染色结果的两个独立观察发现，对于所有三个细胞系，三份染色（100pM HER2抗体和50nML348-111）的强度与使用500pM HER2抗体和11nML348-111处理的片子相同。因为参考材料是恒定的（相同的细胞系对照片）且观察到恒定的染色强度，可以得出，存在相同数目的HER2-HER2抗体-L348-111复合物。因此，使用下式来计算二抗的Kd：
其中[Ab1]1和[Ab1]2是两个不同的一抗浓度，且[Ab2]1和[Ab2]2是不同的二抗浓度。
根据下式计算C3：
使用以下值，[Ab1]1=100pM、[Ab1]2=500pM、[Ab2]1=50nM、[Ab2]2=11nM，发现L348-111的Kd2等于28nM。
在实施例12.3c的平衡滴定中，将结果拟合到0.70点/核（在用一抗饱和且使用1.5pM浓度的L348-111的条件下）。因此，使用下式，可以计算0细胞中存在的HER2的总量（PrTotal）：
[Ab2:Ab1:Pr]是复合物HER2-HER2抗体-L348-111的浓度，Kd1是HER2抗体的解离常数，且Kd2是L348-111的解离常数，[Ab1]1和[Ab1]2是两个不同的HER2抗体浓度，[Ab2]1和[Ab2]2是两个不同的L348-111浓度。
将[Ab2:Ab1:Pr]设定在0.70PDQA点/核，第一分数设定为1，Kd2设定为28nM，且[Ab2]设定为1.5pM，PrTotal的值被计算为13.000分子/核。
这个值与本领域的数据较好地一致，即0（即阴性）细胞系在这些细胞的表面上表达21,600±6700拷贝的Her2受体。
实施例2.对组织学样品中靶标的定量（方法II）
用于估计细胞中靶标分子的总（绝对）数的方法（II）与方法（I）相比具有很多相似的手段，然而也具有一些不同。
在上述方法中，应该对一抗和标记的二抗两者建立平衡条件。在高靶标浓度的情况下，这可能存在困难，因为在孵育过程中会出现结合剂的耗尽，因此需要与结合剂的多次且延长的孵育。本方法利用的是，使用非常高浓度的结合剂，可以建立“顶峰”水平的结合（这表明，样品中基本上所有的结合位点将被相应的结合剂饱和）而没有耗尽问题。明显地，没有100%，但是可以达到蛋白靶标与高亲和性一抗的90～99%结合，以及一抗与标记的二抗的50～75%的结合。在这些范围内，可以使用具有变化但是较高的浓度的试剂的实验来建立更加精确的结合水平。
此外，使用含有高浓度的未标记二抗和低浓度的标记（同一）二抗的混合物，可以达到平衡条件，而仅小部分的与靶标结合的一抗将会被标记。
本方法还利用由本发明可视化方法提供的可能性，即，标记的二抗可以取决于放大程度而以多种方式可视化。在低量的结合靶标的一抗情况下，标记的二抗（或标记和未标记的二抗的混合物）可以用来产生可计数的点。在高量的靶标结合的一抗的情况下，相同的试剂（或混合物）可以用来产生常规的染色。因此，实验可以包括数个步骤：
使用与高浓度结合剂的孵育来建立平衡条件，引起对较高且已知分数（fraction）的靶标的识别。使用一抗和标记的二抗两者来执行这样的实验。这些条件还将被称为“顶峰水平”条件。
之后，制备识别未知分数的一抗的标记二抗和未标记二抗的混合物，并将其用于具有高靶标表达且已经在顶峰水平条件下经一抗处理过的组织样品的孵育。孵育之后，使用常规的染色来对结合的标记二抗进行可视化。
使用常规染色，在顶峰水平条件下通过标记的二抗对结合靶标的一抗进行滴定。要点在于，不需要在靶标与一抗之间建立平衡条件。足够的是，使用恒定的测试材料（恒定的测试材料是指靶标量恒定的测试材料）识别出可再现量的靶标。在一些低浓度的一抗下，得到与步骤2中观察到的染色水平相同的染色强度。
使用将单一分子可视化为点的方法（如本发明中描述的），相对于由顶峰水平条件的一抗识别出的靶标分数，使用标记和未标记的二抗的混合物来获得与步骤3中相同的低浓度的一抗识别出的靶标分数。
使用如步骤3中的低水平的一抗，以及步骤2中的标记和未标记二抗的混合物，将单一分子染色为点，评估相对于每一细胞核的点数。
从这些实验，可以确定靶标的绝对数目。从步骤1和4的实验，可知多少分数的靶标由低浓度的一抗所识别。从步骤1和3的实验，可以推出多少分数的一抗由实验2中使用的标记和未标记二抗的混合物所识别。我们利用如下事实，即在步骤2和3的实验中得到相同的常规染色水平（这表明，在样品中存在相同数目的结合且标记的二抗）。因此，现在我们知道由低浓度一抗识别的靶标分子分数，以及由步骤5的实验中标记和未标记的二抗的混合物识别的一抗分数。将这两个因子相乘，可以得到被可视化为点的靶标分子的分数（参见以下实验2.1c的描述）。因为我们又已对每一细胞核的点数目进行了计数，我们知道存在于每一细胞核的靶标分子数目。由此，可以进行绝对计数。
实验
用于以下实验中的材料和方法，如果没有具体公开，则如上所述。
已建立Her2一抗的Kd是280pM（参见实验12.3c）。使用平衡条件下（多次添加直至没有观察到信号进一步增加）13.3nM浓度的抗体将引起13.3nM/（13.3nM+0.28nM）的标记，其等于约97.9%的初始靶标分子。
同样地，已建立标记的二抗的Kd是28nM（参见实验12.3d）。使用平衡条件下（多次添加直至没有观察到信号进一步增加）25nM浓度的标记二抗将引起25nM/（25nM+28nM）的标记，其等于约47.1%的结合一抗。
实验2.1a
使用恒定的测试材料，福尔马林固定石蜡包埋的细胞系球粒的连续切片。使用的细胞系是来自Dako HercepTest的3+对照材料。
含有细胞系的石蜡块的FFPE切片的片子（从现在开始称为“片子”）通过沉浸在二甲苯（2×5min）、之后96%乙醇（2×2min）和70%乙醇（2×2min）中而被脱石蜡化。用去离子水洗涤这些片子，并将其转移到低pH靶标修复液（Dako S1700）中。之后，在微波炉中将片子加热至沸腾（约5min），然后温和地沸腾10分钟。在转移到洗涤缓冲液Dako S2343中之前，使片子冷却20分钟。
之后，使用以下方案将片子在Autostainer上染色：
过氧化物酶封闭，Dako S2023，5min
洗涤
13.3nM HER2一抗的相继数次10分钟添加
洗涤
混合有5nM未标记的山羊抗兔的100pM山羊抗兔-葡聚糖-HRP（L348.111）的相继数次10分钟添加
洗涤
DAB（Dako K5007），10分钟
洗涤
苏木精（Dako S3301），5min
用水洗涤
洗涤
结果：
13.3nM HER2抗体的三次10分钟添加足以达到平衡条件。第四次添加不引起染色水平的增加。混合有5nM未标记的山羊抗兔的100pM山羊抗兔-葡聚糖-HRP（L348.111）的两次10分钟添加足以达到平衡条件。第三次添加不引起染色水平的增加。所达到的最大染色水平相应于约1+。（尽管该细胞系被称为3+，混合有高浓度未标记二抗的低浓度标记二抗的使用引起小部分一抗的染色）。
实验2.1b
如实验2.1a对片子进行预处理，并使其进行以下方案（常规DAB染色）：
过氧化物酶封闭，Dako S2023，5min
洗涤
浓度在30～50pM范围内变化的HER2一抗，10分钟
洗涤
25nM山羊抗兔-葡聚糖-HRP（L348.111）的相继两次10分钟添加。对照片子显示第三次添加不引起信号的增加。
洗涤
DAB（Dako K5007），10min
洗涤
苏木精（Dako S3301），5min
用水洗涤
洗涤
结果：
与40pM HER2抗体孵育10分钟引起与实验2.1a中达到的最大染色水平相同的染色强度（1+）。43pM的孵育引起明显更高的染色强度，而37pM的孵育给出明显更低的染色强度。
实验2.1c
如实验2.1a对片子进行预处理，并使其进行以下方案（PDQA染色）：
过氧化物酶封闭，使用Dako S20235min
洗涤
HER2一抗。13.3nM的相继3次10分钟添加（片1）或40pM的一次10分钟添加（片2～5）
洗涤
混合有5nM未标记山羊抗兔的500fM（femtoM，毫微微M）山羊抗兔-葡聚糖-HRP（L348.111）的相继两次10分钟添加（片1～3），或者混合有5nM未标记山羊抗兔的100pM山羊抗兔-葡聚糖-HRP（L348.111）的相继两次10分钟添加（片4～5）
洗涤
FITC-报道物沉积：10min，使用具有0.28mM DAB和10μMD21067的孵育介质2
三次洗涤
FITC-AP抗体：10min孵育，20nM D20036于BAM中
三次洗涤
LPR，使用Dako K0640，10min
洗涤
苏木精（Dako S3301），5min
用水洗涤
洗涤
将片子进行图像分析。使用ScanScope（Aperio）片子扫描器在20×（约300×300nm像素）下采集整个细胞球粒的图像。使用JMicrovision1.27版本软件来分析图像。红点的强度、色调、饱和度色空间被鉴定为（I=0～234、H=187～37、S=52～255），蓝色的细胞核被鉴定为（I=0～201、H=148～221、S=0～190）。尺寸阈值进一步被应用到点，大于30像素的对象被计数为两个点，大于45像素的对象被计数为三个点。较低的100像素的阈值被应用到细胞核以过滤碎片和较小的细胞核片段。
注意，部分重叠的色空间允许将单独的像素识别为红点的一部分和细胞核的一部分，与在细胞核上方点的深紫色外观一致。
结果和结论：
片子PDQA染色和点计算的结果显示在以下的表10中：
片 点 核 点/核
1 56918 12388 4.59
2 151 13817 0.0109
3 177 13925 0.0127
4 52011 13618 3.82
5 61040 12939 4.72
表10
将片1与片2和片3的平均相比，显示出少388倍的结合一抗。因为片1表现出约97.9%的结合靶标分子（该值源自Her2抗体的Kd1），40pM一抗在相同测试材料（片2和片3）上施用10分钟引起1/396的靶标分子与一抗结合（或0.252%）。
然后使用该数据来分析实验2.1a和2.1b的结果。如所提到的，40pM一抗施用10分钟引起0.252%的初始靶标的标记。接着，结合至靶标的一抗与二抗47.1%（该数值源自二抗的Kd）的结合引起0.119%的靶标与二抗（间接）结合。这相应于实验2.1c，即使用40pM一抗10min。这也必然是实验2.1b的情况（因为染色水平相同），其中13.3nM一抗孵育（97.9%的初始结合靶标）之后，与100pM标记二抗和5nM未标记二抗的混合物孵育。因此，可以得出结论，该混合物的使用引起0.119%/0.979=0.121%的一抗与标记二抗的结合；0.252%中0.121%的靶标等于3.06ppm（百万分率）。因此，在片4和5中观察到的每一细胞核4.27个点（平均）计数为每个细胞核1,395,000个靶标分子（这是从以下计算中得出的：4.27/0.00000306=1,395,000）。
可以通过将片2和3与片4～5进行比较而得出该评估的准确性。使用具有100pM标记二抗（片2～3）的混合物比使用具有500fM标记二抗（片4～5）的混合物，观察到多362倍的点（平均）。因为具有100pM的混合物引起0.121%的一抗被标记，具有500fM的混合物必然引起低362倍的靶标与抗体的标记，即0.121%/362=3.34ppm。使用该数字来分析片1，可以计算出在这个片子中的靶标分子的标记水平：3.34ppm的97.9%得出3.27ppm，且每一细胞核观察到4.59个点与每一细胞核1,402,000的靶标分子对应（4.59/0.00000327=1.402.000）。
对本领域技术人员明显的是，可以在不偏离本发明精神和范围的情况下对本发明作出许多修改和变化。本文描述的具体实施方式和实施方式的组合仅以示例的方式提供，并不意指以任何方式进行限制。说明书和实施例意在被认为仅是示例性的，本发明的真实范围和精神由所附权利要求指明。

Claims (74)

1.一种对样本的至少一个目的区域中至少一个靶标分子的表达进行光学定量的方法，包括：
在所述样本的部位处产生光学可识别的点，其中一个点对应于与单一靶标分子结合的单一免疫组化结合剂，
其中所述点的特征在于大小和形状的原位可编程性特征以及至少一个额外的可编程性光学特征，
其中在给定区域内的部位处产生的点的数目代表所述区域内靶标分子总群的部分子群；
对所述样本成像；
在图像内选择至少一个目的区域；
在所述至少一个目的区域内识别至少一个点；以及
在所述至少一个目的区域内对所述点进行定量。
2.如权利要求1所述的方法，还包括评价所述至少一个目的区域内的靶标分子的表达。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个目的区域包括整个样本。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述的识别和定量步骤是通过整个目的区域来进行，而不进行背景分离步骤。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个额外的可编程性光学特征包括荧光、衍射水平、清晰度、色调、强度和饱和度中的至少一者。
6.如权利要求1所述的方法，其中对所述点进行定量包括对所述点计数、测量所述点的总面积、计算单位面积内所述点的密度中的至少一者。
7.如权利要求1所述的方法，其中对所述点进行定量包括：计算所识别的候选点的预定光学特征的统计测度；将候选对象的光学特征与计算出的统计测度进行比较；以及至少部分基于比较步骤的结果来调整点计数。
8.如权利要求1所述的方法，其中形状的所述可编程性特征包括球形度、偏心度、紧密性、伸长率、最小和最大费雷特之比、圆度、同心环中的至少一者。
9.如权利要求1所述的方法，其中大小的所述可编程性特征包括长度、宽度、直径和面积中的至少一者。
10.如权利要求1所述的方法，其中使用酶标记的分子探针检测体系来进行产生光学可识别的点的步骤。
11.如权利要求1所述的方法，其中产生光学可识别的点的步骤包括显色染色。
12.如权利要求1所述的方法，其中产生光学可识别的点的步骤包括荧光染色。
13.如权利要求1所述的方法，其中当在所述样本内的两个不同焦平面深度下成像时，至少选自70％、80％或90％的百分比的点能够以特定的放大倍率被光学识别，并且其中所述两个焦平面深度以如下距离隔开，所述距离是至少选自所述样本的厚度的10％、20％或50％的距离。
14.如权利要求1所述的方法，其中对所述样本成像包括在按微米/像素计的选自0.6～0.9、0.9～1.2、1.2～2.5或2.5～5的范围内的分辨率下产生所述样本的图像，并且至少90％的所产生点在所选分辨率下能被光学识别。
15.如权利要求1所述的方法，其中对所述样本成像包括在小于1微米/像素的分辨率下产生所述样本的图像，并且至少选自70％、80％或90％的百分比的所产生的点在所述分辨率下能被光学识别。
16.如权利要求1所述的方法，其中识别至少一个点包括鉴定至少两个点的原点；并且
对所述至少一个点进行定量包括基于在两个原点之间测量的至少一个距离计算至少一个因子。
17.如权利要求1所述的方法，其中产生所述光学可识别的点的总时间少于100分钟。
18.如权利要求1所述的方法，其中产生所述点在固定的温度下执行。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述固定的温度小于30摄氏度。
20.一种对样本中至少一个目的区域中的至少一个靶标分子的表达进行光学定量的体系，包括：
第一试剂盒，用于检测所述样本中所述至少一个靶标分子的部分子群；
第二试剂盒，用于在所述样本的部位处产生光学可识别的点，其中一个点对应于与单一靶标分子结合的单一免疫组化结合剂，
其中所述点的特征在于大小和形状的原位可编程性特征以及至少一个额外的可编程性光学特征，
其中在给定区域内的部位处产生的点的数目代表所述区域内靶标分子总群的部分子群。
21.如权利要求20所述的体系，还包括：
染色器，适于使用所述第一试剂盒和所述第二试剂盒执行染色方案；
成像器，适于对所述样本成像；以及
处理器，配置成：
在所述至少一个目的区域内识别至少一个点；并且
在所述至少一个目的区域内对所述点进行定量。
22.如权利要求20所述的体系，其中所述第一试剂盒包括第一结合剂，并且所述第一结合剂的预定部分包括标记物；并且
所述第二试剂盒包括包含染色沉淀的基质。
23.如权利要求21所述的体系，其中所述处理器还配置成评价所述至少一个目的区域内的靶标分子的表达。
24.如权利要求21所述的体系，其中所述至少一个目的区域包括整个样本。
25.如权利要求21所述的体系，其中所述处理器还配置成遍及整个目的区域对所述点进行定量，而不进行背景分离步骤。
26.如权利要求20所述的体系，其中所述至少一个额外的可编程性光学特征包括荧光、衍射水平、清晰度、色调、强度和饱和度中的至少一者。
27.如权利要求21所述的体系，其中配置成对所述点进行定量的所述处理器被进一步配置成进行以下中的至少一者：对所述点计数、测量所述点的总面积、计算单位面积内所述点的密度。
28.如权利要求21所述的体系，其中配置成对所述点进行定量的所述处理器被进一步配置成：计算所识别的候选点的预定光学特征的统计测度；将候选对象的光学特征与计算出的统计测度进行比较；并且至少部分基于比较结果来调整点计数。
29.如权利要求20所述的体系，其中形状的所述可编程性特征包括球形度、偏心度、紧密性、伸长率、最小和最大费雷特之比、圆度、同心环中的至少一者。
30.如权利要求20所述的体系，其中大小的所述可编程性特征包括长度、宽度、直径和面积中的至少一者。
31.如权利要求22所述的体系，其中所述第一试剂盒的标记物是酶。
32.如权利要求21所述的体系，其中当在所述样本内的两个不同焦平面深度下成像时，至少选自70％、80％或90％的百分比的点能够以特定的放大倍率被光学识别，并且其中所述两个焦平面深度以如下距离隔开，所述距离是至少选自所述样本的厚度的10％、20％或50％的距离。
33.如权利要求21所述的体系，其中所述成像器适于在按微米/像素计的选自0.6～0.9、0.9～1.2、1.2～2.5或2.5～5的范围内的分辨率下产生所述样本的图像，并且至少90％的所产生点在所选分辨率下能被光学识别。
34.如权利要求21所述的体系，其中所述成像器适于在小于1微米/像素的分辨率下产生所述样本的图像，并且至少选自70％、80％或90％的百分比的所产生点在所述分辨率下能被光学识别。
35.如权利要求21所述的体系，其中所述处理器还配置成
鉴定至少两个点的原点；并且
基于在两个原点之间测量的至少一个距离对至少一个点进行定量。
36.如权利要求20所述的体系，其中所述第一试剂盒和所述第二试剂盒适于检测所述靶标分子并在少于100分钟内产生所述光学可识别的点。
37.如权利要求20所述的体系，其中所述第一试剂盒和所述第二试剂盒适于检测所述靶标分子并在固定的温度下产生所述光学可识别的点。
38.如权利要求37所述的体系，其中所述固定的温度小于30摄氏度。
39.一种对样本中至少一个目的区域中的至少一个靶标分子的表达进行光学定量的方法，包括：
在所述样本的部位处产生光学可识别的点，其中一个点对应于与单一靶标分子结合的单一免疫组化结合剂，
其中所述点的特征在于大小和形状的原位可编程性特征以及至少一个额外的可编程性光学特征，
其中在给定区域内的部位处产生的点的数目代表所述区域内靶标分子总群的部分子群；
其中各个点代表预定统计界限内的预定数目的靶标分子；
对所述样本成像；
在图像内选择所述至少一个目的区域；
在所述至少一个目的区域内识别至少一个点；以及
在所述至少一个目的区域内对所述点进行定量。
40.如权利要求39所述的方法，还包括评价所述至少一个目的区域内的靶标分子的表达。
41.如权利要求39所述的方法，其中产生所述光学可识别的点包括：
使用第一结合剂检测所述样本内基本上所有的靶标分子；
其中各个点所代表的靶标分子的数目通过包括标记物的所述第一结合剂的预定部分来确定。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述标记物是酶。
43.如权利要求41所述的方法，其中包括标记物的第一结合剂的所述部分与由各个点所代表的靶标分子的数目成比例。
44.如权利要求40所述的方法，其中对所述点进行定量包括计算点密度。
45.一种对样本中至少一个目的区域中的至少一个靶标分子的表达进行光学定量的体系，包括：
第一试剂盒，用于检测所述样本中所述至少一个靶标分子的部分子群；以及
第二试剂盒，用于在所述样本的部位处产生光学可识别的点，其中一个点对应于与单一靶标分子结合的单一免疫组化结合剂，
其中所述点的特征在于大小和形状的原位可编程性特征以及至少一个额外的可编程性光学特征，
其中在给定区域内的部位处产生的点的数目代表所述区域内所述至少一个靶标分子的总群的部分子群；并且
其中各个点代表预定统计界限内的预定数目的靶标分子。
46.如权利要求45所述的体系，还包括：
染色器，适于使用所述第一试剂盒和所述第二试剂盒执行染色方案；
成像器，适于对所述样本成像；以及
处理器，配置成：
在所述至少一个目的区域内识别至少一个点；并且
在所述至少一个目的区域内对所述点进行定量。
47.如权利要求46所述的体系，其中所述处理器还配置成评价所述至少一个目的区域内的靶标分子的表达。
48.如权利要求45所述的体系，其中所述第一试剂盒包括第一结合剂，并且所述第一结合剂的预定部分包括标记物；
其中包括标记物的所述第一结合剂的所述预定部分确定各个点所代表的靶标分子的数目；
其中所述第二试剂盒包括包含染色沉淀的基质。
49.如权利要求48所述的体系，其中所述标记物是酶。
50.如权利要求48所述的体系，其中包括标记物的所述第一结合剂的所述部分与由各个点所代表的靶标分子的数目成比例。
51.如权利要求46所述的体系，其中配置成对光学可识别的点进行定量的所述处理器还被配置成计算点密度。
52.一种对样本中至少一个目的区域中的至少一个靶标分子的表达进行光学定量的方法，包括：
使用成像器对所述样本成像；
在图像内选择至少一个目的区域；
在所述至少一个目的区域内所述样本的部位处识别至少一个光学可识别的点，其中所述一个点对应于与单一靶标分子结合的单一免疫组化结合剂；
其中所述点的特征在于大小和形状的原位可编程性特征以及至少一个额外的可编程性光学特征，
其中在给定区域内的部位处识别的点的数目代表所述区域内靶标分子总群的部分子群；
其中各个点代表预定统计界限内的预定数目的靶标分子；以及
基于至少一个识别出的点进行至少一个图像分析步骤。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述至少一个图像分析步骤包括：
在所述至少一个目的区域内对所述点进行定量；以及
评价所述至少一个目的区域内的靶标分子的表达。
54.如权利要求52所述的方法，其中所述至少一个图像分析步骤是在没有使用者监督下通过处理器进行的。
55.如权利要求52所述的方法，其中在使用者监督下通过处理器进行所述至少一个图像分析步骤。
56.如权利要求53所述的方法，其中对所述点进行定量包括对所述点计数。
57.如权利要求53所述的方法，其中对所述点进行定量包括对点簇计数。
58.如权利要求52所述的方法，其中所述至少一个图像分析步骤包括基于所述至少一个识别出的点对所述至少一个目的区域的特征提取。
59.如权利要求52所述的方法，其中所述至少一个图像分析步骤包括基于所述至少一个识别出的点识别所述图像内的几何对象。
60.如权利要求52所述的方法，其中所述至少一个图像分析步骤包括：将识别出的点分类为至少两类对象；以及对分类对象进行定量。
61.一种对样本中至少一个目的区域中的至少一个靶标分子的表达进行光学定量的体系，包括：
成像器，适于对所述样本成像；
至少一个处理器，配置成：
在图像内选择至少一个目的区域；
在所述至少一个目的区域内所述样本的部位处识别至少一个光学可识别的点，其中一个点对应于与单一靶标分子结合的单一免疫组化结合剂；
其中所述点的特征在于大小和形状的原位可编程性特征以及至少一个额外的可编程性光学特征，
其中在给定区域内的部位处识别的点的数目代表所述区域内靶标分子总群的部分子群；
其中各个点代表预定统计界限内的预定数目的靶标分子；以及
基于至少一个识别出的点进行至少一个图像分析步骤。
62.如权利要求61所述的体系，其中所述至少一个图像分析步骤包括：
在所述至少一个目的区域内对所述至少一个点进行定量；以及
评价所述至少一个目的区域内的靶标分子的表达。
63.如权利要求61所述的体系，其中所述至少一个图像分析步骤是在没有使用者监督下通过所述处理器进行的。
64.如权利要求61所述的体系，其中在使用者监督下通过所述处理器进行所述至少一个图像分析步骤。
65.如权利要求62所述的体系，其中对所述点进行定量包括对所述点计数。
66.如权利要求62所述的体系，其中对所述点进行定量包括对点簇计数。
67.如权利要求61所述的体系，其中所述至少一个图像分析步骤包括基于所述至少一个识别出的点对所述至少一个目的区域的特征提取。
68.如权利要求61所述的体系，其中所述至少一个图像分析步骤包括基于所述至少一个识别出的点识别所述图像内的几何对象。
69.如权利要求61所述的体系，其中所述至少一个图像分析步骤包括：将识别出的点分类为至少两类对象；以及
对分类对象进行定量。
70.一种对组织样本中的多重诊断指示物进行光学定量的方法，包括：
在组织样本中至少一个目的区域内产生第一多重诊断指示物；
其中所述第一多重诊断指示物包括所述样本的部位处的第一组光学可识别的点，其中一个点对应于与单一第一靶标分子结合的单一免疫组化结合剂，
其中所述第一组光学可识别的点的特征在于大小和形状的原位可编程性特征以及至少一个额外的可编程性光学特征，
其中在给定区域内的部位处产生的所述第一组光学可识别的点代表所述区域内第一靶标分子总群的部分子群；
在所述至少一个目的区域内产生第二多重诊断指示物；
对所述样本成像；
评价所述第一多重诊断指示物和所述第二多重诊断指示物；其中评价所述第一多重诊断指示物包括：
在所述至少一个目的区域内识别至少一个所述第一组光学可识别的点；和
在所述至少一个目的区域内对所述第一组光学可识别的点进行定量；以及
至少部分基于所述第一多重诊断指示物和所述第二多重诊断指示物的评价来确定所述组织样本的总体诊断评价。
71.如权利要求70所述的方法，
其中所述第二多重诊断指示物包括所述样本的部位处的第二组光学可识别的点，其中至少一个点对应于单一第二靶标分子，
其中所述第二组光学可识别的点的特征在于大小和形状的原位可编程性特征以及至少一个额外的可编程性光学特征，
其中在给定区域内的部位处产生的所述第二组光学可识别的点代表所述区域内第二靶标分子总群的部分子群；并且
评价所述第二多重诊断指示物包括：
在所述至少一个目的区域内识别至少一个所述第二组光学可识别的点；和
在所述至少一个目的区域内对所述第二组光学可识别的点进行定量。
72.如权利要求71所述的方法，
其中所述第一组光学可识别的点是一组靶标点，并且所述第二组光学可识别的点是一组参考点；
其中所述靶标点和所述参考点可通过至少一个可编程性光学特征区分开；并且
所述方法还包括至少部分基于定量的第一组靶标点与定量的第二组参考点的比率评价所述至少一个目的区域内的靶标分子的表达。
73.如权利要求70所述的方法，其中产生所述第二多重诊断指示物包括使用免疫组化染色；苏木精和曙红染色中的至少一种来处理所述样本；并且
评价所述第二多重诊断指示物包括基于所述处理在所述至少一个目的区域中对至少一个特征进行定量。
74.如权利要求70所述的方法，其中产生所述第二多重诊断指示物的评价包括使用免疫组化染色；苏木精和曙红染色中的至少一种来处理所述样本；并且
评价所述第二多重诊断指示物包括基于所述处理识别所述样本内的形态学特征。
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