CN112424825A - 染色聚集体中信号的定量 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于检测和估计对应于生物样品中一种或多种生物标记的信号的系统和方法，所述生物样品被染色以检测蛋白质和/或核酸生物标记的存在。

Description

染色聚集体中信号的定量
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年5月15日提交的美国临时专利申请第62/671,825号的申请日的权益，其披露内容通过引用整体并入本文中。
背景技术
数字病理学涉及将整个组织病理学或细胞病理学玻片扫描成可在计算机屏幕上解释的数字图像。这些图像随后将由成像算法处理或由病理学家解释。为了检查组织切片(实际上是透明的)，使用选择性结合细胞成分的有色组织化学染色剂制备组织切片。临床医生或计算机辅助诊断(CAD)算法使用颜色增强或染色的细胞结构来识别疾病的形态学标记，并相应地进行治疗。观察所述测定可以实现多种过程，包括疾病诊断、对治疗反应的评估、以及研发抗击疾病的新药物。
免疫组织化学(IHC)玻片染色可以用于识别组织切片的细胞中的蛋白质，并且因此广泛地用于对诸如生物组织中的癌性细胞和免疫细胞等不同类型的细胞的研究中。因此，可以在研究中使用IHC染色以理解癌组织中免疫细胞(诸如，T细胞或B细胞)的差异表达的生物标记的分布和位置以用于免疫应答研究。例如，肿瘤经常包含免疫细胞的浸润液，该浸润液可以防止肿瘤的发展或有利于肿瘤的向外生长。
原位杂交(ISH)可用于寻找遗传异常或病状的存在，例如在显微镜下观察时在形态学上表现为恶性的细胞中特异性地致癌基因扩增。独特的核酸序列在染色体、细胞和组织中占据精确的位置，并且原位杂交允许在不严重破坏序列的情况下确定这种序列的存在、缺失和/或扩增状态。ISH使用与靶基因序列或转录物反义的标记的DNA或RNA探针分子来检测或定位细胞或组织样品中的靶核酸靶基因。通过将固定在玻片上的细胞或组织样品暴露于标记的核酸探针来进行ISH，所述核酸探针能够与细胞或组织样品中的给定靶基因特异性杂交。通过将细胞或组织样品暴露于已经用多个不同核酸标签标记的多个核酸探针，可以同时分析几个靶基因。通过利用具有不同发射波长的标记，可以在单个步骤中对单个靶细胞或组织样品进行同时多色分析。
发明内容
在过去，组织中蛋白质和核酸的临床评价依赖于原位免疫酶检测方法。例如，检测B细胞克隆性有助于B细胞淋巴瘤的诊断，克隆性评估可以通过评估KAPPA和LAMBDA轻链表达来完成。如图8A所示，可以用银(Ag)(呈黑色)检测对KAPPA mRNA染色的扁桃体组织，用酪胺-磺酰罗丹明(Tyramide-sulforhodamine)(呈紫色)检测LAMBDA mRNA。感兴趣的信号的存在表现为微小的斑点(例如离散的点)，并且这些斑点可以积累以形成更大的聚集信号区域(以下称为“信号聚集斑块”或“斑块(blob)”)，这取决于细胞中mRNA的拷贝数。举例来说，浆细胞每个细胞大约有100,000个mRNA拷贝，因此这些细胞中的信号可能表现为斑块。
定量ISH和IHC分析在临床评价中是有用的；然而，由于现有技术的限制，它没有被广泛地执行。一种用于估计信号聚集斑块中的信号量的自动化技术可以促进染色生物样品的增强的临床解释，并且使得样品能够被更快和更准确地解释。鉴于上述情况，申请人开发了一种图像分析系统和方法，其能够检测和量化染色样品中存在的蛋白质或核酸信号的数量。
在本公开的一个方面，是一种估计生物样品的图像中对应于至少一种生物标记的信号的量的方法，包括：检测第一图像(例如，对应于来自第一生物标记的信号的解混图像通道图像)中的孤立斑点；导出代表性孤立斑点的光密度值(例如，基于来自检测到的孤立斑点的计算信号特征或特性)；以及基于所导出的代表性孤立斑点的光密度值，估计多个子区域中每个子区域内的信号聚集体中的预测斑点的数量。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过组合所检测到的孤立斑点的数量和每个所述子区域中信号聚集体中的预测斑点的估计数量来算出一个子区域中斑点的总数。
在一些实施方案中，通过算出其中一个所述子区域中的所述信号聚集体的总光密度除以所述代表性孤立斑点的导出光密度的商来估计所述多个子区域中每个子区域中的所述信号聚集体中的所述预测斑点的数量。在一些实施方案中，一个所述子区域中的信号聚集体的总光密度是测量值。在一些实施方案中，所述代表性孤立斑点光密度是通过以下步骤导出的：(i)根据所有检测到的孤立斑点的计算描述性信号特征生成直方图；(ii)从所述直方图中提取尺寸和强度参数；(iii)根据所提取的尺寸参数算出面积计量值；以及(iv)将所提取的强度参数乘以所算出的面积计量值。在一些实施方案中，所计算的描述性信号特征是通过表征来自所检测到的孤立斑点的信号特征(例如，均值、标准偏差、半高全宽、或尺寸)而导出的。在一些实施方案中，所计算的描述性信号特征包括斑点强度、斑点模糊度、斑点圆度、和斑点尺寸。在一些实施方案中，使用一维高斯函数拟合方法在具有预定尺寸(例如7x 7像素)的图像块中计算所述描述性信号特征。
在一些实施方案中，所述尺寸参数是来自半高全宽直方图的半径的众数。在一些实施方案中，所述尺寸参数是来自半高全宽直方图的半径的均值。在一些实施方案中，所述强度参数是均匀强度度量。在一些实施方案中，所述强度参数是非均匀强度度量。在一些实施方案中，均匀强度度量是从强度直方图导出的强度值的众数。在一些实施方案中，均匀强度度量是从强度直方图导出的强度值的均值。在一些实施方案中，均匀强度度量是从强度直方图导出的加权平均强度。在一些实施方案中，所述非均匀强度度量是从模糊度直方图中导出的，所述模糊度直方图是根据每个所检测到的孤立斑点的模糊度信号特征计算出来的。
在一些实施方案中，使用第二图像来执行预测斑点数量的估计，所述第二图像基本上没有对应于所检测到的孤立斑点的信号。在一些实施方案中，如本文所述，所述第二图像是残留图像。在一些实施方案中，所述第二图像通过以下步骤导出：(i)基于在所述第一图像中检测到的孤立斑点生成前景分割掩模；以及(ii)用所生成的前景分割掩模过滤所述第一图像。在一些实施方案中，所述第二图像通过以下步骤生成：(i)生成仅包括所检测到的来自所述第一图像的孤立斑点的孤立斑点图像；以及(ii)从所述第一图像中减去所述孤立斑点图像。在一些实施方案中，所述第二区域被分割成多个子区域。
在一些实施方案中，所述多个子区域中的每个子区域具有在生物标记染色强度、生物标记染色存在、和局部生物标记染色纹理中的至少一个方面基本均匀的像素。在一些实施方案中，所述多个子区域中的每一个都是超像素。在一些实施方案中，所述超像素是通过以下步骤来导出的：(i)用局部k均值聚类对像素进行分组；以及(ii)使用连通分量算法将小的孤立区域合并到最近的大的超像素中。在一些实施方案中，使用70x 70像素大小以及约10的正则化参数来生成超像素。在一些实施方案中，对上述第二图像执行分割。在一些实施方案中，通过将采样网格覆盖到所述第二图像上来导出所述子区域，所述采样网格限定了具有预定大小和形状(例如简单的对象形状，例如正方形、圆形等)的非覆盖区域，例如大小为大约70像素乘70像素到大约200像素乘大约200像素的区域。在一些实施方案中，所述方法进一步包括重复至少一些前述步骤来估计对应于第二生物标记的信号。
在一些实施方案中，所述估计对应于第二生物标记的信号的方法包括：检测对应于来自第二生物标记的信号的解混图像通道图像中的孤立斑点；导出代表性孤立斑点的光密度值(例如，基于来自检测到的孤立斑点的计算信号特征)；以及基于所检测到的孤立斑点的所述计算描述性信号特征，估计多个子区域中每个子区域中的信号聚集体中的预测斑点的数量。在一些实施方案中，对应于第二生物标记的预测斑点数量的估计是使用从具有对应于第二生物标记孤立斑点和信号聚集体的解混图像通道图像导出的图像(其中来自检测到的孤立斑点的信号被移除)来进行的。
在一些实施方案中，对生物样品进行染色，以检测一种或多种蛋白质生物标记物的存在，例如HER2蛋白质生物标记物。在一些实施方案中，对生物样品进行染色，以检测一种或多种核酸生物标记的存在。在一些实施方案中，对生物样品进行染色以检测一种或多种mRNA序列(例如一种或多种KAPPA mRNA序列和/或一种或多种LAMBDA mRNA序列)的存在。在一些实施方案中，一个或多个KAPPA mRNA序列中的每一个都使用相同的报告子部分(例如银色原)进行检测。在一些实施方案中，一个或多个LAMBDA mRNA序列中的每一个都使用相同的报告子部分(例如紫色原)进行检测。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在数据库中存储整个全玻片图像的多个生成的子区域中每个子区域内预测斑点的估计数量和检测到的孤立斑点。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使用存储的数据来生成可以叠加在输入图像(例如，全玻片图像或其一部分)上的覆盖层。在一些实施方案中，所述方法进一步包括生成图像覆盖层，独立地可视化每个子区域中所检测到的孤立斑点的数量和所估计的预测斑点的数量。在一些实施方案中，所述方法进一步包括根据每个子区域中估计的预测斑点的数量和检测到的孤立斑点的数量生成可视化所述信号总量的图像覆盖层。在一些实施方案中，可视化包括与多于一种生物标记相关的信息。
在本公开的另一方面，是一种估计生物样品的图像中对应于至少一种生物标记的信号的量的方法，包括：检测输入图像(例如，从多路图像导出的单路图像或解混图像通道图像)中的孤立斑点；根据所检测到的孤立斑点计算描述性信号特征；以及基于所检测到的孤立斑点的所述计算描述性信号特征，估计第二图像中多个子区域中每个子区域中的信号聚集体中的预测斑点的数量。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过组合所检测到的孤立斑点的数量和每个所述子区域中信号聚集体中的预测斑点的估计数量来算出一个子区域中斑点的总数。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在数据库中存储多个生成的子区域中每个子区域内和/或全玻片图像中预测斑点的估计数量和/或检测到的孤立斑点。在一些实施方案中，通过以下步骤来估计所述多个子区域中每个子区域中的所述信号聚集体中的所述预测斑点的数量：(i)导出代表性孤立斑点的光密度，所述代表性孤立斑点的光密度从所述计算描述性信号特征导出；以及(ii)算出所述第二图像的其中一个所述子区域中的所述信号聚集体的总光密度除以所述代表性孤立斑点的导出光密度的商。在一些实施方案中，所述代表性孤立斑点的光密度是通过以下步骤导出的：(i)根据每个所计算的描述性信号特征生成直方图；(ii)从所述直方图中提取尺寸和强度参数；(iii)根据所提取的尺寸参数算出面积计量值；以及(iv)将所提取的强度参数乘以所算出的面积计量值。在一些实施方案中，所计算的描述性信号特征是通过表征来自所检测到的孤立斑点的信号特征(例如，均值、标准偏差、半高全宽、或尺寸)而导出的。在一些实施方案中，强度参数选自均匀强度度量和非均匀强度度量。在一些实施方案中，所述计算的描述性信号特征是尺寸、模糊度、强度、和圆度。
在本公开的另一方面，是一种估计生物样品的图像中对应于至少一种生物标记的信号的量的方法，包括：检测对应于第一图像(例如，对应于来自第一生物标记的信号的解混图像通道图像)中的单个基因拷贝的信号；基于根据对应于第一图像中的单个基因拷贝的所有检测信号计算的信号特征，导出对应于单个基因拷贝的代表性信号的光密度值；以及基于对应于单个基因拷贝的代表性信号的导出光密度值，估计第二图像(例如，其中检测到的孤立斑点基本上不属于信号聚集体内的信号的图像)中多个子区域中每个子区域内信号斑块中的预测信号(对应于多个基因拷贝)的数量。在一些实施方案中，对应于单个基因拷贝的代表性信号的光密度通过以下步骤导出：(i)根据至少两个所计算的描述性信号特征生成直方图；(ii)从所述直方图中提取尺寸和强度参数；(iii)根据所提取的尺寸参数算出面积计量值；以及(iv)将所提取的强度参数乘以所算出的面积计量值。在一些实施方案中，强度参数选自均匀强度度量和非均匀强度度量。在一些实施方案中，所述计算的描述性信号特征是尺寸、模糊度、强度、和圆度。在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于预测斑点的估计数量和/或检测到的孤立斑点生成覆盖层。在一些实施方案中，所述方法进一步包括对另一基因重复至少一些前述步骤(仅作为举例，第一次对KAPPA mRNA执行所述方法，第二次对LAMBDA mRNA执行所述方法)。
在本公开的另一方面，是一种估计生物样品的图像中对应于至少一种生物标记的信号的量的方法，包括：检测第一图像(例如，对应于来自第一生物标记的信号的解混图像通道图像)中的孤立斑点；基于来自所检测到的孤立斑点的计算信号特征，导出代表性孤立斑点的光密度值；生成从所述第一图像导出的基本上没有对应于所检测到的孤立斑点的信号的残留图像；将所述残留图像分割成多个子区域；以及基于代表性孤立斑点的导出光密度，估计多个子区域中每个子区域中的信号聚集体中的预测斑点的数量。在一些实施方案中，所述第一图像被染色以检测至少一种核酸生物标记的存在。在其他实施方案中，所述第一图像被染色以检测至少一种蛋白质生物标记的存在。在一些实施方案中，所计算的描述性信号特征是通过表征来自所检测到的孤立斑点的信号特征(例如，均值、标准偏差、半高全宽、或尺寸)而导出的。在一些实施方案中，所计算的描述性信号特征包括斑点强度、斑点模糊度、斑点圆度、和斑点尺寸。
在本公开的另一方面，是一种用于估计生物样品中一种或多种信号的量的系统，所述一种或多种信号对应于生物样品中的染色靶标(例如蛋白质、核酸等)，所述系统包括：(i)一个或多个处理器、和(ii)联接到所述一个或多个处理器的存储器，所述存储器用于存储计算机可执行指令，当所述指令被所述一个或多个处理器执行时，使得所述系统执行操作，所述操作包括：检测第一图像(例如，对应于来自第一生物标记的信号的解混图像通道图像)中的孤立斑点；基于来自所检测到的孤立斑点的计算信号特征，导出代表性孤立斑点的光密度值；以及基于所导出的代表性孤立斑点的光密度值，估计第二图像(例如，检测到的孤立斑点基本上不属于所述信号聚集体内的信号的图像)中的多个子区域中每个子区域内的信号聚集体中的预测斑点的数量。在一些实施方案中，所述系统进一步包括用于通过组合所检测到的孤立斑点的数量和每个所述子区域中信号聚集体中的预测斑点的估计数量来算出一个子区域中斑点的总数的指令。
在一些实施方案中，通过算出所述第二图像的其中一个所述子区域中的所述信号聚集体的总光密度除以所述代表性孤立斑点的导出光密度的商来估计所述多个子区域中每个子区域中的所述信号聚集体中的所述预测斑点的数量。在一些实施方案中，所述代表性孤立斑点光密度是通过以下步骤导出的：(i)根据每个所计算的描述性信号特征生成直方图；(ii)从所述直方图中提取尺寸和强度参数；(iii)根据所提取的尺寸参数算出面积计量值；以及(iv)将所提取的强度参数乘以所算出的面积计量值。在一些实施方案中，所计算的描述性信号特征是从每个检测到的孤立斑点的信号特征导出的，包括均值、标准偏差、半高全宽或尺寸。在一些实施方案中，所述尺寸参数是来自半高全宽直方图的半径的众数。在一些实施方案中，所述强度参数是均匀强度度量或非均匀强度度量。在一些实施方案中，均匀强度度量是从强度直方图导出的强度值的众数。在一些实施方案中，均匀强度度量是从强度直方图导出的强度值的均值。在一些实施方案中，均匀强度度量是从强度直方图导出的加权平均强度。在一些实施方案中，所述非均匀强度度量是从模糊度直方图中导出的，所述模糊度直方图是根据每个所检测到的孤立斑点的模糊度信号特征计算出来的。
在一些实施方案中，所计算的描述性信号特征包括斑点强度、斑点模糊度、斑点圆度、和斑点尺寸。在一些实施方案中，使用一维高斯函数拟合方法在具有预定尺寸(例如7x7像素)的图像块中计算所述描述性信号特征。
在一些实施方案中，所述第二图像通过以下步骤导出：(i)基于在所述第一图像中检测到的孤立斑点生成前景分割掩模；以及(ii)用所生成的前景分割掩模过滤所述第一图像。在一些实施方案中，所述第二图像通过以下步骤生成：(i)生成仅包括所检测到的来自所述第一图像的孤立斑点的孤立斑点图像；以及(ii)从所述第一图像中减去所述孤立斑点图像。
在一些实施方案中，所述多个子区域中的每个子区域具有在生物标记染色强度、生物标记染色存在、和局部生物标记染色纹理中的至少一个方面基本均匀的像素。在一些实施方案中，所述多个子区域中的每一个都是超像素。在一些实施方案中，所述超像素是通过以下步骤来导出的：(i)用局部k均值聚类对像素进行分组；以及(ii)使用连通分量算法将小的孤立区域合并到最近的大的超像素中。在一些实施方案中，通过将采样网格覆盖到所述第二图像上来导出所述子区域，所述采样网格限定了具有预定大小和形状的非覆盖区域。
在本公开的另一方面，是一种用于估计生物样品中一种或多种信号的量的系统，所述一种或多种信号对应于生物样品中的染色靶标(例如蛋白质、核酸等)，所述系统包括：(i)一个或多个处理器、和(ii)联接到所述一个或多个处理器的存储器，所述存储器用于存储计算机可执行指令，当所述指令被所述一个或多个处理器执行时，使得所述系统执行操作，所述操作包括：检测第一图像(例如，对应于来自第一生物标记的信号的解混图像通道图像)中的孤立斑点；根据所有检测到的孤立斑点计算描述性信号特征；以及基于所计算的描述性信号特征，估计第二图像(例如，检测到的孤立斑点基本上不属于所述信号聚集体内的信号的图像)中的多个子区域中每个子区域中的信号聚集体中的预测斑点的数量。在一些实施方案中，通过以下步骤来估计所述多个子区域中每个子区域中的所述信号聚集体中的所述预测斑点的数量：(i)导出代表性孤立斑点的光密度，所述代表性孤立斑点的光密度从所述计算描述性信号特征导出；以及(ii)算出所述第二图像的其中一个所述子区域中的所述信号聚集体的总光密度除以所述代表性孤立斑点的导出光密度的商。在一些实施方案中，所述代表性孤立斑点的光密度是通过以下步骤导出的：(i)根据每个所计算的描述性信号特征生成直方图；(ii)从所述直方图中提取尺寸和强度参数；(iii)根据所提取的尺寸参数算出面积计量值；以及(iv)将所提取的强度参数乘以所算出的面积计量值。在一些实施方案中，所述强度参数是均匀强度度量或非均匀强度度量。在一些实施方案中，所述尺寸参数是来自半高全宽直方图的半径的众数。在一些实施方案中，所述第一图像是对应于来自第一生物标记的信号的第一解混图像通道图像。在一些实施方案中，所计算的描述性信号特征是从每个检测到的孤立斑点的信号特征导出的，包括均值、标准偏差、半高全宽或尺寸。在一些实施方案中，所计算的描述性信号特征包括斑点强度、斑点模糊度、斑点圆度、和斑点尺寸。在一些实施方案中，使用一维高斯函数拟合方法在具有预定尺寸的图像块中计算所述描述性信号特征。在一些实施方案中，对所述信号聚集体中所述预测斑点的数量的所述估计是使用基本上没有对应于所检测到的孤立斑点的信号的第二图像来执行的。
在本公开的另一方面，是一种存储用于估计染色生物样品中不同信号的量的指令的非暂态计算机可读介质，包括：检测第一图像(例如，对应于来自第一生物标记的信号的解混图像通道图像)中的孤立斑点；基于来自所检测到的孤立斑点的计算信号特征，导出代表性孤立斑点的光密度值；以及基于所导出的代表性孤立斑点的光密度值，估计第二图像(例如，检测到的孤立斑点基本上不对应于所述信号聚集体内的信号的图像)中的多个子区域中每个子区域内的信号聚集体中的预测斑点的数量。在一些实施方案中，所述代表性孤立斑点的光密度是通过以下步骤导出的：(i)根据来自所检测到的孤立斑点的每个所述信号特征生成直方图；(ii)从所述直方图中提取尺寸和强度参数；(iii)根据所提取的尺寸参数算出面积计量值；以及(iv)将所提取的强度参数乘以所算出的面积计量值。在一些实施方案中，使用具有盘状形状的形状检测器来检测所述孤立斑点。在一些实施方案中，所述子区域是超像素。在一些实施方案中，所述超像素是通过以下步骤来导出的：(i)用局部k均值聚类对像素进行分组；以及(ii)使用连通分量算法将小的孤立区域合并到最近的大的超像素中。在一些实施方案中，通过算出其中一个所述子区域中的所述信号聚集体的总光密度除以所述代表性孤立斑点的导出光密度的商来估计所述多个子区域中每个子区域中的所述信号聚集体中的所述预测斑点的数量。在一些实施方案中，所述信号聚集体的总光密度是测量值。在一些实施方案中，所述信号对应于至少两种核酸生物标记。在一些实施方案中，所述信号对应于至少一种蛋白质生物标记。在一些实施方案中，非暂态计算机可读介质进一步包括用于解混输入图像的指令。在一些实施方案中，非暂态计算机可读介质进一步包括用于将输入图像(例如，解混图像通道图像)分割成多个子区域的指令。在一些实施方案中，非暂态计算机可读介质进一步包括用于生成超像素的指令。在一些实施方案中，非暂态计算机可读介质进一步包括用于生成第二图像的指令，所述第二图像基本上不包括来自所检测到的孤立斑点的信号。在一些实施方案中，非暂态计算机可读介质进一步包括用于生成可视化并将所生成的可视化叠加到输入图像上的指令。在一些实施方案中，非暂态计算机可读介质进一步包括以下指令：组合来自至少两个图像分块的生成数据，每个图像分块对应于全玻片图像的一部分，并且组合来自所述至少两个分块的数据。
附图说明
为了全面理解本公开的特征，参考了附图。在附图中，始终使用相同的附图标记来标识相同的要素。
根据一些实施方案，图1示出了包括图像获取装置和计算机系统的代表性数字病理学系统。
图2给出了根据一些实施方案的可以在数字病理学系统中或者在数字病理学工作流程中使用的各种模块。
图3A给出了根据一些实施方案的流程图，该流程图提供了用于估计在全玻片图像或其任何部分中分别对应于一种或多种生物标记的一种或多种信号的量的步骤的概述，并且进一步示出了生成覆盖层或存储计算数据的可选步骤。
图3B给出了根据一些实施方案的流程图，其示出了用于估计在全玻片图像或其任何部分中分别对应于一种或多种生物标记的一种或多种信号的量的步骤，并且进一步示出了生成覆盖层或存储计算数据的可选步骤。
图3C给出了根据一些实施方案的流程图，其示出了用于估计对应于一个或多个蛋白质生物标记的一种或多种信号的量的非限制性方法。
图3D给出了根据一些实施方案的流程图，其示出了用于估计对应于一个或多个核酸生物标记的一种或多种信号的量的非限制性方法。
图3E给出了根据一些实施方案的流程图，其示出了用于估计对应于全玻片图像或其任何部分中的至少两种生物标记的至少两种信号的量的非限制性方法。
图4给出了根据一些实施方案的流程图，其示出了根据检测到的孤立斑点生成数据。
图5给出了根据一些实施方案的流程图，其示出了计算代表性孤立斑点的光密度值的步骤。
图6A提供了在原位杂交测定中用苏木精复染对KAPPA mRNA(银或黑色/报告子，601)进行了染色的全玻片图像的一部分。
图6B提供了解混后的图像通道图像的例子，仅显示对应于KAPPA mRNA的信号(银/黑色/报告子，602)。
图6C提供了解混后的图像通道的例子，示出了苏木精通道(例如，蓝色，603)。
图7A提供了在原位杂交测定中用苏木精复染对LAMBDA mRNA探针(紫色/报告子，701)进行了染色的全玻片图像的一部分。
图7B提供了解混后的图像通道图像的例子，仅显示对应于LAMBDA mRNA的信号(紫色/报告子，702)。
图7C提供了解混后的图像通道的例子，示出了苏木精通道(例如，蓝色，703)。
图8A提供了在原位杂交测定中对KAPPA mRNA(银或黑色/报告子，801)和LAMBDAmRNA探针(紫色/报告子，802)进行了染色的全玻片图像的一部分。
图8B提供了解混后的图像通道图像的例子，仅显示对应于KAPPA mRNA的信号(黑色/报告子，803)。
图8C提供了解混后的图像通道图像的例子，仅显示对应于LAMBDA mRNA的信号(紫色/报告子，804)。
图8D提供了解混后的图像通道的例子，示出了苏木精通道(例如，蓝色，805)。
图9A提供了在原位杂交测定中染色的全玻片图像的一部分的例子。
图9B示出了将图9A分解成单个通道(银/黑通道)的结果。
图9C示出了在图9B的解混图像通道图像上的点检测结果(斑点通道图像)。
图9D示出了斑块通道图像，由此来自图9C的检测到的孤立斑点的信号被基本去除(例如，被减去)。
图9E和9F示出了在图9C的斑点通道图像中检测到的孤立斑点的导出x,y位置。
图9G和9H示出了叠加在图9C的斑点通道图像中的每个检测到的孤立斑点上的导出种子中心。
图9I和9J示出了叠加在图9A的全玻片图像的一部分上的检测到的孤立斑点的覆盖层。
图10A示出了根据本公开的一些实施方案用作输入图像的全玻片图像的一部分，其中对全玻片图像中的生物样品进行染色，以检测蛋白质生物标记(例如HER2)的存在。
图10B和图10C示出了来自图10A的蛋白质生物标记的斑点检测结果。
图11示出了根据本公开的一些实施方案在从围绕斑点信号的图块导出的数据上采用一维高斯拟合函数来提取检测到的孤立斑点的特性之后可以导出的参数。面板(i)示出了在输入图像上裁剪出感兴趣斑点的窗口；面板(ii)示出了以二维显示的来自面板(i)的裁剪窗口的光密度；面板(iii)示出了以三维显示的来自面板(i)的裁剪窗口的光密度；图板(iv)示出了高斯函数的三维图，其中理论上使用高斯拟合方法来确定输入光密度的参数以拟合理想的高斯函数；并且面板(v)示出了一维高斯函数。
图12示出了根据本公开的一些实施方案的斑点检测的结果和从每个检测到的孤立斑点生成的计算参数，其中计算参数被归入几个不同的直方图中。
图13示出了根据本公开的一些实施方案从解混图像通道图像和斑点通道图像生成残留图像，其中根据本公开的一些实施方案，残留图像基本上没有来自斑点通道图像中所示的检测到的孤立斑点的信号。
图14A示出了根据本公开的一些实施方案的对至少一种生物标记染色的全玻片图像的一部分。
图14B示出了根据本公开的一些实施方案的图14A的全玻片图像的一部分的分割结果。
图14C示出了根据本公开的一些实施方案将生成的分割片段叠加到全玻片图像的一部分上的结果。
图15给出了替代流程图，其示出了根据本公开的一些实施方案的估计对应于全玻片图像中的至少一种生物标记的信号的步骤。
图16A和16B示出了根据本公开的一些实施方案将信号聚集体中检测到的孤立斑点和估计的信号量叠加到全玻片图像上的结果。
图17A示出了根据本公开的一些实施方案的细胞核分割的结果。
图17B示出了根据本公开的一些实施方案的每个细胞的细胞核边界。
图18示出了在31个视场上验证的专家观察者和算法结果(R2＝0.99，CCC＝0.99)之间的斑点计数一致性的总散点图。该图显示了斑点计数的良好分布，斜率为0.98，截距为-2.3。由观察者(126,588)和算法(124,040)识别的总斑点计数在附表中示出。
具体实施方式
还应该理解，除非明确指出相反的情况，否则在本文要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于该方法的步骤或动作被叙述的顺序。
如本文所使用的，单数术语“一个”、“一种”、以及“该”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指示。类似地，词语“或”旨在包括“和”，除非上下文中另外明确指示。术语“包括”被定义为包含性的，使得“包括A或B”是指包括A、B或A和B。
如本文在说明书和权利要求书中所使用的，“或”应被理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，在将所列项目分开时，“或”或“和/或”应解释为包容性的，即包括所列元素中的多个元素或至少一个元素，但也包括一个以上元素，以及(可选地)其他未列出的项目。只有明确指示相互矛盾，否则诸如“只有一个”或“恰好一个”或者在权利要求中使用时“由……组成”将指代恰好包括许多元件或元件列表中的一个元件。一般而言，如本文中所使用的术语“或”之后有诸如“两者之一”、“中的一个”、“中的仅一个”或“中的恰好一个”之类的排他性术语时仅应被解释为指示排他性备选方案(即，“一个或另一个但不是两个”)。“基本上由……组成”在权利要求中使用时它的普通意义如同在专利法领域中使用的那样。
术语“包括”、“包含”、“具有”等可互换地使用并且具有相同的含义。类似地，术语“包括”、“包含”、“具有”等可互换地使用并且具有相同的意思。具体而言，每个术语的定义与美国专利法中“包括”的一般定义一致，因此被解释为一个开放式术语，意思是“至少以下”，并且也被解释为不排除附加的特征、限制、方面等。因此，例如，“具有部件a、b和c的装置”意味着该装置至少包括部件a、b和c。类似地，短语“涉及步骤a、b和c的方法”意味着该方法至少包括步骤a、b和c。此外，尽管本文中可以特定顺序概述步骤和过程，但是本领域技术人员将认识到，排序步骤和过程可以变化。
如本说明书和权利要求书中所使用的，关于一个或多个元件的列表，短语“至少一个”应被理解为表示选自元件列表中的任何一个或多个元件的至少一个元件，但不一定包括元件列表中具体列出的每个元件中的至少一个元件，并且不排除元件列表中元件的任何组合。该定义还允许可选地存在除在短语“至少一个”所指代的元件列表内具体表示的元件之外的元件，而无论是与具体表示的那些元件相关还是不相关。因此，作为非限制性示例，“A和B中的至少一者”(或等同地，“A或B中的至少一者”，或等效地“A和/或B中的至少一者”)在一个实施方案中可以指代至少一个A，可选地包括一个以上A，而不存在B(并且可选地包括除B之外的元件)；在另一个实施方案中，指代至少一个B，可选地包括一个以上B，而不存在A(并且可选地包括除A之外的元件)；在又一个实施方案中，指代至少一个A，可选地包括一个以上A和至少一个B，可选地包括一个以上B(和可选地包括其他元件)；等等。
如本文所用，术语“生物样品”、“组织样品”、“样本”等是指从包括病毒在内的任何生物体获取的包括生物分子(如蛋白质、肽、核酸、脂质、碳水化合物或其组合)的任何样品。生物的其他示例包括哺乳动物(诸如人类；兽类，诸如猫、狗、马、牛和猪；以及实验动物，诸如小鼠、大鼠和灵长类动物)、昆虫、环节动物、蛛形纲动物、有袋动物、爬行动物、两栖动物、细菌和真菌。生物样品包括组织样品(例如组织切片和组织的针活检)，细胞样品(例如细胞学涂片，例如巴氏涂片或血液涂片或通过显微切割获取的细胞样品)，或细胞组分、片段或细胞器(例如通过裂解细胞并通过离心或其他方式分离它们的组分获取的)。生物样品的其他示例包括血液、血清、尿液、精液、粪便、脑脊液、间质液、粘液、泪液、汗液、脓、活检组织(例如，通过外科活组织检查或针活组织检查获取的)、乳头抽吸物、耳垢、乳汁、阴道液、唾液、拭子(例如口腔拭子)，或任何包含来自第一生物样品的生物分子的材料。在某些实施方案中，本文使用的术语“生物样品”指从肿瘤制备的样品(例如均质或液化样品)或从受试者获取的肿瘤的一部分。
如这里所使用的，术语“斑块(blob)”指的是数字图像中与周围区域相比在诸如亮度或颜色等属性上不同的区域。例如，斑块可以是一组具有特定强度值范围的相邻像素。
“前景分割掩模”例如是由分割算法创建的图像掩模，该分割算法允许将一个或多个像素斑块(用作“前景像素”)与其他像素(构成“背景”)分开。例如，前景分割掩模可以由核分割算法生成，并且前景分割掩模在描绘组织切片的图像上的应用可以允许识别图像中的核斑块。
如本文所使用的，术语“图像数据”涵盖从生物组织样品获取(诸如借助于光学传感器或传感器阵列)的原始图像数据或经过预处理的图像数据。具体地，图像数据可以包括像素矩阵。
如本文所用，术语“图像”、“图像扫描”或“扫描图像”包括从生物组织样品获取的原始图像数据，例如通过光学传感器或传感器阵列、或预处理图像数据。具体地，图像数据可以包括像素矩阵。
如本文所用，术语“多通道图像”或“多路图像”包括从生物组织样品获取的数字图像，其中不同的生物结构，例如细胞核和组织结构，同时用特定的荧光染料、量子点、发色剂等染色，其每一个都发出荧光或者在不同的光谱带中可检测到，从而构成多通道图像的通道之一。
如本文所用，术语“探针”或“寡核苷酸探针”指用于检测互补核酸靶基因的核酸分子。
如本文所用，术语“玻片”指任何合适尺寸的任何基底(例如，全部或部分由玻璃、石英、塑料、硅等制成的基底)，更具体地涉及“显微镜玻片”,例如标准的3英寸乘1英寸显微镜玻片或标准的75毫米乘25毫米显微镜玻片。可以放置在玻片上的生物样本的例子包括但不限于细胞学涂片、薄组织切片(例如来自活组织检查)和生物样本阵列，例如组织阵列、细胞阵列、DNA阵列、RNA阵列、蛋白质阵列或其任意组合。因此，在一个实施方案中，组织切片、DNA样品、RNA样品和/或蛋白质被放置在玻片上的特定位置。在一些实施方案中，术语玻片可以指SELDI和MALDI芯片，以及硅晶片。
如本文所用，术语“特异性结合实体”指特异性结合对的成员。特异性结合对是分子对，其特征在于它们相互结合，基本上排除了与其他分子的结合(例如，特异性结合对的结合常数至少比生物样品中结合对的两个成员中的任一个与其他分子的结合常数大10”3M-1、10”4M-1或10”5M-1)。特异性结合部分的具体例子包括特异性结合蛋白(例如，抗体、凝集素、抗生物素蛋白如链霉抗生物素蛋白和蛋白A)。特异性结合部分还可以包括被这种特异性结合蛋白特异性结合的分子(或其部分)。
本文使用的术语“染色”、“染色的”等通常指检测和/或区分生物样本中特定分子(如脂质、蛋白质或核酸)或特定结构(如正常或恶性细胞、胞液、细胞核、高尔基体或细胞骨架)的存在、位置和/或数量(如浓度)的生物样本的任何处理。例如，染色可以提供特定分子或特定细胞结构与生物样本周围部分之间的对比，染色的强度可以提供对样本中特定分子的量的度量。染色不仅可以用明场显微镜，也可以用其他观察工具，如相差显微镜、电子显微镜和荧光显微镜，来帮助观察分子、细胞结构和生物体。系统进行的一些染色可用于可视化细胞轮廓。系统进行的其他染色可能依赖于某些细胞成分(如分子或结构)被染色，而不会或几乎不会对其他细胞成分进行染色。由系统执行的染色方法类型的例子包括但不限于组织化学方法、免疫组织化学方法和基于分子间反应(包括非共价结合相互作用)的其他方法，例如核酸分子间的杂交反应。特定的染色方法包括但不限于初级染色方法(例如，H&E染色、巴氏染色等)，酶联免疫组织化学方法，以及原位RNA和DNA杂交方法，如荧光原位杂交(FISH)。
如本文所用，术语“靶”是指已经或能够确定其存在、位置和/或浓度的任何分子。靶分子的例子包括蛋白质、核酸序列、和半抗原(例如共价键合到蛋白质上的半抗原)。靶分子通常使用特异性结合分子和可检测标志的一种或多种缀合物来检测。
概览
本公开提供了用于检测和估计对应于生物样品中一种或多种生物标记的信号的系统和方法，所述生物样品被染色以检测蛋白质和/或核酸生物标记的存在。在一些实施方案中，本公开能够精确估计(即定量)对应于信号聚集斑块(例如，在密集生物标记染色的区域)中的一种或多种生物标记的信号量。
在一些实施方案中，本文所述的系统和方法有助于对来自各个孤立斑点和在原位杂交(ISH)(例如来自高基因拷贝数等)和免疫组织化学(IHC)图像中聚集在一起的信号聚集斑块的斑点信号进行检测和计数。本文公开的系统和方法能够检测和表征孤立斑点信号(例如，代表单个基因拷贝或单个蛋白质靶)，然后应用检测到的孤立斑点的导出特性来检测和估计聚集信号形式(即，在信号聚集斑块中)的斑点的数量。结果，可以报告孤立斑点和聚集斑块两者的斑点总数，并且这种数量可以与基因拷贝数(mRNA拷贝数)或蛋白质靶数量相关联。
据信，本文所述的系统和方法能够在有相当大量的生物标记信号聚集在小区域的情况下(例如当一个细胞中存在大量基因拷贝时)量化信号。虽然此处适用的方法适用于检测和估计与蛋白质和核酸生物标记相关的信号，但是当生物样品的小区域中存在大量基因拷贝时，所述系统和方法特别适用于阐明信号量。
本公开的至少一些实施方案涉及计算机系统和用于分析从生物样品中捕获的数字图像的方法，该生物样品包括用一个或多个原色(例如苏木精和曙红(H&E))以及一个或多个检测探针(例如，包含促进对样品内的靶标进行标记的特定结合实体的探针)染色的组织样品。虽然本文示例可以指特定组织和/或用于检测某些标记(并且因此检测疾病)的特定染色或检测探针的应用，但本领域的技术人员将理解的是可以应用不同的组织和不同的染色/检测探针来检测不同的标记和不同的疾病。例如，尽管某些实施例可能涉及量化对应于两种不同的mRNA探针(或一系列具有不同序列的mRNA探针)的信号量，但本文所述的系统和方法可用于对来自单个核酸探针、单个抗体探针、两种或多种核酸探针的组合、两种或多种抗体探针的组合和/或核酸和抗体探针的任何组合的信号进行检测和估计。
根据一些实施方案，用于成像和分析样本的数字病理学系统200在图1中示出。数字病理学系统200可以包括成像设备12(例如，具有用于扫描承载样本的显微镜玻片的装置的设备)和计算机14，由此成像设备12和计算机可以通信地耦合在一起(例如，直接地或间接地通过网络20)。计算机系统14可以包括台式计算机、膝上型计算机、平板电脑等、数字电子电路、固件、硬件、存储器、计算机存储介质、计算机程序或指令集(例如，其中程序存储在存储器或存储介质中)、一个或多个处理器(包括编程处理器)、以及任何其他硬件、软件或固件模块或其组合。例如，图1中展示的计算系统14可以具有显示装置16和外壳18的计算机。计算机可以以二进制形式存储数字图像(本地地诸如存储在存储器、服务器或另一个网络连接装置中)。还可以将数字图像分成像素矩阵。像素可以包括由位深定义的具有一个或多个位的数字值。技术人员将了解到，可以利用其他计算机装置或系统，并且本文所描述的计算机系统可以通信地耦合到另外的部件，例如样本分析仪、显微镜、其他成像系统、自动玻片制备装备等。本文将进一步描述这些附加部件中的一些以及可以使用的各种计算机、网络等。
通常，成像设备12(或包括存储在存储器中的预扫描图像的其他图像源)可以包括但不限于一个或多个图像捕获装置。图像捕获装置可以包括但不限于相机(例如，模拟相机、数字相机等)、光学器件(例如，一个或多个透镜、传感器聚焦透镜组，显微镜物镜等)、成像传感器(例如，电荷耦合装置(CCD)、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器等)、胶片等。在数字实施方案中，图像捕获装置可以包括协作以证明即时聚焦的多个透镜。图像传感器(例如，CCD传感器)可以捕获样本的数字图像。在一些实施方案中，成像设备12是明场成像系统、多光谱成像(MS I)系统或荧光显微镜系统。数字化的组织数据可以例如由图像扫描系统生成，诸如VENTANA MEDICAL SYSTEMS,Inc.(Tucson,Arizona)的VENTANA DP200扫描仪或VENTANA iSCAN HT扫描仪、或其他适合的成像装备。本文还描述了另外的成像装置和系统。本领域技术人员将理解，由成像设备12获取的数字彩色图像可以传统地由基本彩色像素组成。每个彩色像素可以在三个数字分量上编码，每个数字分量包括相同数量的位，每个分量对应于原色，通常是红色、绿色或蓝色，也由术语“RGB”分量表示。
图2提供了当前公开的数字病理学系统中使用的各种模块的概述。在一些实施方案中，数字病理学系统采用具有一个或多个处理器220和至少一个存储器201的计算机装置200或计算机实施的方法，所述至少一个存储器201存储非暂态计算机可读指令以由所述一个或多个处理器执行从而使所述一个或多个处理器220执行一个或多个模块(例如，模块202至210)中的指令(或存储的数据)。
参照图2和图3A，本公开提供了一种计算机实现的系统和方法，用于估计对应于生物样品图像中的至少一种生物标记的信号的量。在一些实施方案中，所述系统可以包括：(a)成像模块202，其适于生成经染色的生物样品(例如，至少针对一种或多种蛋白质生物标记或一种或多种核酸序列(包括一种或多种mRNA序列)的存在而染色的样品)的图像数据(步骤310)；(b)斑点检测模块204，其适于检测对应于输入图像中生物标记信号的孤立斑点(步骤320)；(c)光密度导出模块205，其被配置为基于所有检测到的孤立斑点的某些特性(例如，强度、尺寸、模糊度、圆度等特性)来导出典型孤立斑点的光密度值(步骤330)；(d)斑点估计模块208，其适于基于计算的斑点特性估计多个子区域中每个子区域中的斑点或信号斑块聚集体内的预测斑点的数量(步骤340)；和(e)数据库或其他存储子系统240，用于在数据库240中存储所述多个子区域的每个子区域内的预测斑点的估计数量和检测斑点的数量(步骤350)。
本领域技术人员还将理解，可以根据需要将附加模块结合到工作流程中。例如，参考图3B，可以可选地运行解混模块203来提供对应于特定染色或生物标记的图像通道图像(例如，当多路图像被用作输入图像时)。这样，在解混之后，接收的输入图像被解混成具有对应于单个生物标记的信号的图像，并且该解混图像通道图像可以用于检测孤立斑点(步骤320)。
在一些实施方案中，该系统包括残留图像生成模块206，其可以运行以计算基本上没有检测到的孤立斑点的图像(步骤370)。这样，可以处理输入图像通道图像，使得来自步骤320的所检测到的孤立斑点被去除，仅留下信号聚集体的斑块。
在其他实施方案中，可以运行分割模块207来将输入图像(例如，来自步骤370的残留图像)分割成一系列子区域(步骤380)。在一些实施方案中，所得到的分割区域在染色存在、染色强度、或纹理中的至少一个方面是基本均匀的。在一些实施方案中，如本文所述，分割区域每个都是超像素。
在其他实施方案中，可以运行覆盖层生成模块209，使得任何信号聚集体中检测到的孤立斑点的视觉表示和预测斑点的估计数量可以叠加在输入图像上(步骤360)。
本领域技术人员还将意识到，该系统可适于利用在原位杂交测定或免疫组织化学测定(或两种测定的组合)中染色的生物样本的接收输入图像。例如，图3C示出了估计单个蛋白质生物标记的量的步骤。当然，可以对第二蛋白质生物标记重复图3C中所示的步骤，并且可以比较第一估计蛋白质生物标记和第二估计蛋白质生物标记的量和/或用于进一步的下游分析。同样，图3D示出了估计单个核酸生物标记的量的步骤。当然，图3D中所示的步骤可以对第二核酸生物标记重复，并且第一估计核酸生物标记和第二估计核酸生物标记的量可以被比较和/或用于进一步的下游分析。
此外，图2中标识的任何模块可以运行不止一次。例如，第一次模块204至208可以运行来量化来自第一生物标记的信号(例如，对应于第一mRNA探针的信号)，第二次模块204至208可以运行来量化来自第二生物标记的信号(例如，对应于第二mRNA探针的信号)。例如，解混模块可用于将具有对应于不同生物标记的至少两种染色的接收图像解混为至少两个相应的图像通道图像(步骤310)。模块204至208可以在第一图像通道图像上第一次运行，以提供多个子区域的每个子区域中的预测斑点(对应于第一生物标记)的估计。然后，模块204至208可以在第二图像通道图像上第二次运行，以再次在多个子区域的每个子区域中提供预测斑点(对应于第二生物标记)的估计。然后可以组合结果，使得可以导出每种生物标记的预测斑点的估计数量，并且可以进行第一生物标记和第二生物标记的数量之间的比较(例如，提供预后或开发治疗方案)。用于比较两种生物标记的量的估计结果的这些和其他步骤在图3E中示出。
本领域技术人员还将理解，图2中未示出的附加模块或数据库可以被并入工作流程中。例如，可以运行图像预处理模块来将某些滤波器应用于所获取的图像，或者标识组织样品内的某些组织和/或形态结构。此外，感兴趣区域选择模块可用于选择图像的特定部分进行分析。
此外，可以运行用于消除输入图像中存在的色差的模块。色差是指光学传感器中由色散引起的效应，其中透镜无法将所有颜色聚焦到同一会聚点。当使用安装的显微镜摄像头获取图像时，可能会出现这种效应。因此，应该校正显微镜图像以减少这种效应，这种效应可能会影响斑点计数。在一些实施方案中，通过简单地移动红色(R)、绿色(G)和蓝色(B)通道的像素来执行校正，并且它可以减少图像中存在的彩虹效应。色差消除可以作为内部模块使用，以校正使用数字扫描仪获取的图像上的这种影响。
图像获取模块
在一些实施方案中，作为初始步骤，并参考图2，数字病理学系统200运行成像模块202来捕获具有一种或多种染色的生物样品的图像或图像数据(例如来自扫描装置12)(步骤310)。在一些实施方案中，接收或获取的图像是RGB图像或多光谱图像(例如，多路明场和/或暗场图像)。在一些实施方案中，捕获的图像被存储在存储器201中。
图像或图像数据(在本文中可互换使用)可以使用扫描装置12获取，例如实时获取。在一些实施方案中，图像是从显微镜或能够捕获承载样本的显微镜玻片的图像数据的其他仪器获取的，如本文所指出的。在一些实施方案中，图像是使用二维扫描仪获取的，例如能够扫描图像块的扫描仪，或者能够以逐行方式扫描图像的行扫描仪，例如VENTANA DP200扫描仪。可替代地，图像可以是先前已经获取(例如，扫描)并且存储在存储器201中(或者就此而言，经由网络20从服务器中检索到)的图像。
在一些实施方案中，作为输入接收的图像是全玻片图像。在其他实施方案中，作为输入接收的图像是全玻片图像的一部分。在一些实施方案中，全玻片图像被分解成几个部分，例如分块，并且每个部分或分块可以被独立地分析(例如，使用图2中给出的模块和至少在图3A和图3B中示出的方法)。在独立地分析多个部分或分块(例如，提供每个分块的每个子区域的信号量的估计)之后，来自每个部分或分块的数据可以独立地存储(步骤350)和/或在全玻片级别进行报告(步骤360)(也参见图15)。
生物样品可以通过应用一种或多种染色剂被染色，并且所得图像或图像数据包括对应于一种或多种染色剂中每一种的信号。在一些实施方案中，输入图像是仅具有单一染色(例如，用3,3’-二氨基联苯胺(DAB)、银(Ag+)染色)的单路图像。在一些实施方案中，可以在多重测定中对生物样品进行两种或多种染色(从而提供多路图像)(例如，对于KAPPAmRNA序列为Ag+，对于LAMBDA mRNA序列为磺酰罗丹明B(SRB))。在一些实施方案中，对生物样品进行至少两种生物标记的染色。在其他实施方案中，生物样品被染色以寻找至少两种生物标记的存在，并且还被初染剂(例如苏木精)染色。
在一些实施方案中，生物样品在免疫组织化学测定中被染色，以确定一种或多种蛋白质生物标记的存在。例如，可以针对人类表皮生长因子受体2蛋白(HER2蛋白)的存在对生物样品进行染色。
在其他实施方案中，生物样品在原位杂交(ISH)测定中被染色，以检测一种或多种核酸(包括mRNA)的存在。美国专利第7,087,379号(其披露内容通过引用整体并入本文中)描述了以ISH探针染色样品从而可以观察和检测代表单一拷贝的各个斑点的方法。在一些实施方案中，通过将细胞或组织样品暴露于已经用多个不同核酸标签标记的多个核酸探针来同时分析几个靶基因。例如，多个核酸探针可以用具有不同发射波长的多个生色和/或荧光化合物标记，从而允许在单个步骤中对单个靶细胞或组织样品进行同时多色分析。
例如，Ventana Medical Systems，Inc.的INFORM HER2双ISH DNA探针混合测定旨在通过计数HER2基因与17号染色体的比率来确定HER2基因状态。HER2和17号染色体探针在福尔马林固定、石蜡包埋的组织样品(如人乳腺癌组织样本或人胃癌组织样本)上使用双色显色原位杂交进行检测。对于HER2双重ISH测定，信号是银信号(“黑信号”)和红信号，分别对应于输入图像中的黑点和红点。对于HER2双重ISH测定，基于细胞的评分包括对选定细胞内的红点和黑点进行计数，其中HER2基因表达通过黑点表达，17号染色体通过红点表达。
作为另一个例子，生物样品可以在ISH测定中用多种mRNA探针染色。检测B细胞克隆性有助于B细胞淋巴瘤的诊断，克隆性评估可以通过评估KAPPA和LAMBDA轻链表达来完成。因此，可以将KAPPA寡聚体和LAMBDA寡聚体的混合物引入样品中，以促进KAPPA和LAMBDAmRNA的多路检测。如本文所述，可以用银(Ag)(表现为黑色)检测KAPPA mRNA，用酪胺SRB(表现为紫色)检测LAMBDA mRNA。通过分析检测到的KAPPA mRNA和检测到的LAMBDA mRNA的量的比率，可以确定样品是非淋巴瘤、淋巴瘤(KAPPA受限)、或淋巴瘤(LAMBDA受限)。美国专利第8,236,502号描述了可以使用的特定KAPPA和LAMBDA mRNA探针及其检测方法，其披露内容通过引用整体并入本文中。
显色染色剂可以包括苏木精、曙红、固红或3,3'-二氨基联苯胺(DAB)。在一些实施方案中，组织样品用初染剂(例如苏木精)染色。在一些实施方案中，组织样品也用次级染色剂(例如曙红)染色。在一些实施方案中，组织样品在特定生物标记的IHC测定中被染色。当然，本领域技术人员将理解，也可以用一种或多种荧光团染色任何生物样品。
典型的生物样品在向样品施加染色剂的自动染色/测定平台上进行加工。市场上有各种适合用作染色/测定平台的商业产品，其中一个示例是Ventana Medical Systems,Inc.(Tucson,AZ)的DiscoveryTM。相机平台还可以包括明视场显微镜，例如VentanaMedical Systems,Inc.的VENTANA iScan HT或VENTANA DP 200扫描仪，或者具有一个或多个物镜和数字成像器的任何显微镜。可以使用用于捕获不同波长的图像的其他技术。适用于对染色生物样本成像的其他相机平台在本领域是已知的，并且可从诸如Zeiss、Canon、Applied Spectral Imaging等公司购得，并且这种平台易于适用于本主题公开的系统、方法和设备。
在一些实施方案中，输入图像被掩码成使得仅组织区域存在于图像中。在一些实施方案中，生成组织区域掩码以由组织区域来掩码非组织区域。在一些实施方案中，可以通过识别组织区域并且自动或半自动地(即，以最少的用户输入)排除背景区域(例如，对应于没有样品的玻璃的全玻片图像的区域，例如仅存在来自成像源的白光的区域)来创建组织区域掩码。如本领域技术人员将理解的，除了由组织区域来掩码非组织区域之外，组织掩码模块还可以根据需要掩码其他兴趣区域，诸如，被识别为属于某一组织类型或属于疑似肿瘤区的组织的一部分。在一些实施方案中，使用分割技术通过在输入图像中由非组织区掩码组织区来生成组织区掩码图像。适当的分割技术是如本领域已知的这种技术(参见《数字图像处理》,第三版,Rafael C.Gonzalez,Richard E.Woods,第10章,第689页和医学成像手册,处理与分析,Isaac N.Bankman Academic Press,2000,第2章)。在一些实施方案中，利用图像分割技术在图像中的数字化组织数据与玻片之间进行区分，该组织与前景相对应并且该玻片与背景相对应。在一些实施方案中，所述部件计算全玻片图像中的兴趣区(AOI)，以便检测在AOI中的所有组织区域同时限制分析的背景非组织区的数量。可以使用各种图像分割技术(例如，基于HSV彩色的图像分割、实验室图像分割、均值平移颜色图像分割、区域生长、水平设置方法、快速行进方法等)来确定例如组织数据和非组织或背景数据的边界。至少部分地基于分割，所述部件还可以生成可以用于识别与组织数据相对应的数字玻片数据的这些部分的组织前景掩码。替代性地，所述部件可以生成用于识别与组织数据不对应的数字化玻片数据的这些部分的背景掩码。
这种识别可以通过诸如边缘检测等图像分析操作来实现。组织区域掩码可用于去除图像中的非组织背景噪声，例如非组织区域。在一些实施方案中，组织区域掩码的生成包括以下操作中的一个或多个(但不限于以下操作)：计算低分辨率分析输入图像的亮度，产生亮度图像，对亮度图像应用标准偏差滤波器，产生滤波后的亮度图像，以及对滤波后的照度图像应用阈值，使得照度高于给定阈值的像素被设置为1，而低于阈值的像素被设置为0，产生组织区域掩码。在标题为“An Image Processing Method and System for Analyzinga Multi-Channel Image Obtained from a Biological Tissue Sample Being Stainedby Multiple Stains(用于分析从由多个染色剂染色的生物组织样品中获得多通道图像的图像处理方法和系统)”的US公开号2017/0154420中披露了与生成组织区域掩码相关的附加信息和例子，其披露内容通过引用以其全文结合在本文。
在一些实施方案中，感兴趣区域识别模块可以用于选择应当对其获取图像数据的生物样品的一部分，例如，具有大浓度淋巴细胞的感兴趣区域或者被怀疑具有大浓度淋巴细胞的区域。美国公开号2017/0154420中描述了确定感兴趣区域的方法，其披露内容通过引用整体并入本文中。一般来说，美国公开号2017/0154420公开了：一种用于分析从被多种染色剂染色的生物组织样品获得的多通道图像的图像处理方法，该方法包括：a.解混多通道图像以为每个通道提供一个解混图像，b.对至少一个解混图像进行空间低通滤波，c.对至少一个经空间低通滤波的解混图像进行局部最大值滤波，d.对经空间低通滤波的解混图像中的至少一个进行阈值处理，以识别至少一组相邻像素，以及e.通过从由所述一组相邻像素给出的图像位置提取多通道图像的图像部分来定义感兴趣区域，所述感兴趣区域具有预定的大小和形状。
解混模块
在一些实施方案中，作为输入接收的图像可以是多路图像，即接收的图像是用多于一种染色剂染色的生物样品的图像(例如，针对KAPPA mRNA和LAMBDA mRNA探针的存在而被染色的图像；或者HER2和17号染色体探针)。在这些实施方案中，并且在进一步处理之前，多个图像首先被解混到其组成通道中，例如利用解混模块203，其中每个解混通道对应于特定的染色剂或信号。
在一些实施方案中，在包括一种或多种染色剂的样品中，可以为一种或多种染色剂的每个通道产生单独的图像。本领域技术人员将理解，从这些通道提取的特征可用于描述组织的任何图像(例如细胞核、膜、细胞质、核酸等)中存在的不同生物结构。例如，在本文所述的KAPPA mRNA和LAMBA mRNA探针的情况下，解混将得到具有银(或黑色)信号的第一解混图像通道图像、具有紫色信号的第二解混图像通道图像和具有苏木精信号的第三解混图像通道。这种解混结果，同样在KAPPA mRNA和LAMBA mRNA探针的情况下，在图6A至图6C、图7A至图7C和图8A至图8D中示出。在一些实施方案中，解混的图像(通常称为“通道图像”或“图像通道图像”)可以用作这里描述的每个模块的输入。在一些实施方案中，首先解混具有最强颜色的通道。例如，银/黑色通道可在紫色通道之前解混。
成像模块202提供的多光谱图像是与各个生物标记和噪声成分相关联的基础光谱信号的加权混合物。在任何特定像素，混合权重与组织中特定位置的基础共定位生物标记的生物标记表达和该位置的背景噪声成比例。因此，混合权重因像素而异。本文公开的光谱解混方法将每个像素处的多通道像素值向量分解成组成生物标记端元或组分的集合，并估计每个生物标记的各个组成染色的比例。
解混是将混合像素的测量光谱分解成一组组成光谱或端元以及一组相应的分数或丰度的过程，这些分数或丰度表示像素中存在的每个端元的比例。具体而言，解混过程可以提取染色剂特异性通道，以使用标准类型的组织和染色剂组合所熟知的参考光谱来确定单个染色剂的局部浓度。解混可以使用从对照图像检索的或者从观察图像估计的参考光谱。解混每个输入像素的分量信号使得能够检索和分析染色特异性通道，例如H&E图像中的苏木精通道和曙红通道，或者IHC图像中的二氨基联苯胺(DAB)通道和复染色(例如苏木精)通道。术语“解混”和“颜色反卷积”(或“反卷积”)等(例如，“反卷积”、“解混”)在本领域中可以互换使用。
在一些实施方案中，使用线性解混，用解混模块205解混多路图像。线性解混描述于例如‘Zimmermann"Spectral Imaging and Linear Unmixing in Light Microscopy"Adv Biochem Engin/Biotechnol(2005)95:245-265'以及C.L.Lawson和R.J.Hanson,"Solving least squares Problems",PrenticeHall,1974,第23章,第161页'，所述文献的披露内容通过引用整体并入本文。在线性染色剂解混中，任何像素处的测量光谱(S(λ))被认为是染色剂光谱成分的线性混合，并且等于在像素处表示的每个单独染色剂的颜色参考(R(λ))的比例或权重(A)的总和
S(λ)＝A1·R1(λ)+A2·R2(λ)+A3·R3(λ).......Airy(λ)
这可以更一般地表示为矩阵形式
S(λ)＝∑Airy(λ)|或|S＝R·A
如果获取了M个信道图像并且存在N种单独的染色剂，则M x N矩阵R的列是如本文导出的最佳颜色系统、N x 1向量A是单独染色剂的未知比例并且M x 1向量S是像素处测量的多通道光谱向量。在这些方程中，每个像素中的信号(S)在获取多路图像和参考光谱期间进行测量，即最佳颜色系统如本文所描述的那样导出。各种染色剂(Ai)的贡献可以通过计算它们对测量光谱中每个点的贡献来确定。在一些实施方案中，使用最小二乘逆拟合方法来获取解决方案，所述方法通过求解以下方程组来最小化测量光谱和计算光谱之间的平方差，
Figure BDA0002889734810000261
在这个等式中，j代表检测通道的数量，i等于染色剂的数量。线性方程解通常包括允许受约束的解混来强制权重(A)求和为1。
在其他实施方案中，使用在2014年5月28日提交的题为“Image AdaptivePhysiologically Plausible Color Separation(图像自适应生理上似然颜色分离)”的WO2014/195193中描述的方法来完成解混，其披露内容通过引用整体并入本文中。一般而言，WO 2014/195193描述了一种通过使用迭代优化的参考向量分离输入图像的分量信号来进行解混的方法。在一些实施方案中，来自测定的图像数据与特定于测定特征的预期或理想结果相关，以确定质量度量。在低质量图像或与理想结果相关性差的情况下，调整矩阵R中的一个或多个参考列向量，并且使用调整后的参考向量迭代地重复解混，直到相关性显示出匹配生理和解剖要求的良好质量图像。解剖、生理和测定信息可用于定义应用于测量图像数据的规则，以确定质量度量。这些信息包括组织是如何染色的，组织内的哪些结构是打算染色的或不打算染色的，以及结构、染色剂和特定于正在处理的测定的标记之间的关系。迭代过程产生特定于染色的向量，该向量可以生成精确标识感兴趣结构和生物学相关信息的图像，没有任何噪声或不想要的光谱，因此适于分析。参考向量被调整到搜索空间内。搜索空间定义了参考向量可以用来表示染色剂的值的范围。搜索空间可以通过扫描包括已知或常见问题在内的各种代表性训练测定，并确定训练测定的高质量参考向量集来确定。
在其他实施方案中，使用在215年2月23日提交的题为“Group Sparsity Modelfor Image Unmixing(用于图像解混的群稀疏模型)”的WO 2015/124772中描述的方法来完成解混，其披露内容通过引用整体并入本文中。总的来说，WO 2015/124772描述了使用组稀疏性框架来解混，其中在“相同的组”内对来自多个共存标记的染色贡献的分数进行建模，并且在不同的组中对来自多个非共存标记的染色贡献的分数进行建模，向建模的组稀疏性框架提供多个共存标记的共同定位信息，使用组套索求解建模的框架以在每个组内产生最小二乘解，其中最小二乘解对应于共存标记的解混，并且在对应于非共存标记的解混的组中产生稀疏解。此外，WO 2015124772描述了一种通过输入从生物组织样品获取的图像数据、从电子存储器读取参考数据、从电子存储器读取共存数据来解混的方法，所述参考数据描述多种染色剂中每一种染色剂的染色剂颜色，所述共存数据描述染色剂的组，每个组包括可以在生物组织样品中并置的染色剂，并且每个组形成用于组套索标准的组，至少一个组具有二或更大的大小，并且使用参考数据作为参考矩阵来计算用于获得解混图像的组套索标准的解。在一些实施方案中，用于解混图像的方法可以包括生成组稀疏模型，其中来自共定位标记的一部分染色贡献被分配在单个组内，来自非共定位标记的一部分染色贡献被分配在单独的组内，并且使用解混算法求解组稀疏模型以在每个组内产生最小二乘解。
斑点和斑块检测模块
在图像获取和/或解混之后，具有单个生物标记通道的图像被提供给斑点检测模块204，使得图像内的孤立斑点可以被检测到(与“斑块”或信号聚集体相对)。在其他实施方案中，解混图像通道图像被用于斑点和斑块检测模块的输入。
在一些实施方案中，执行形态学操作以检测图像内的孤立斑点，即点。基于数学形态学理论，二值形态滤波是一种用于处理具有预定形状(例如圆形)的特定结构元素的图像的技术。形态滤波操作通过检查具有预定形状的对象的几何和拓扑结构来执行图像滤波。其基本思想是用一个简单的预定义形状来探测图像，其中算法根据这个形状如何与图像中的形状匹配或不匹配来得出结论。在一些实施方案中，使用盘形结构元件来执行形态学操作。在一些实施方案中，所述盘形元件的半径范围在大约1到大约2之间。在其他实施方案中，所述盘形元件的半径为1。在一些实施方案中，在检测之前执行高斯滤波/平滑。在一些实施方案中，可以使用缩放参数1。
在美国专利公开第2014/0377753号和第2017/0323148号中描述了检测图像中孤立斑点的其他方法，其披露内容通过引用整体并入本文中。
在一些实施方案中，在检测到输入图像中的每个孤立斑点之后，将检测到的孤立斑点与输入图像中的斑块分离，从而提供“孤立斑点图像通道”和“斑块图像通道”在一些实施方案中，检测到的斑点从斑块图像通道中被“掩蔽”。在一些实施方案中，假设输入图像包含具有较高图像值的对象和具有较低或接近零值的背景。在一些实施方案中，在“掩蔽(masking out)”之前，利用4像素宽度的平滑边界和具有2的盘参数的形态学操作来执行平滑操作。从“孤立斑点图像通道”，可以确定图像中每个检测到的孤立斑点的位置，即为每个检测到的孤立斑点找到笛卡尔坐标。例如，可以通过确定每个检测到的孤立斑点的种子中心来找到x,y坐标。例如，可以通过确定每个检测到的孤立斑点的质心或质量中心来计算种子中心。
在一些实施方案中，可以使用多尺度高斯差分(DoG)方法来检测小对象或模糊点源。一般来说，高斯差分是一种特征增强算法，它包括从原始图像的一个模糊版本中减去另一个不太模糊的版本。在灰度图像的简单情况下，通过将原始灰度图像与具有不同标准偏差的高斯核进行卷积来获得模糊图像。据信使用高斯核模糊图像仅抑制高频空间信息。从另一幅图像中减去一幅图像会保留两个模糊图像中保留的频率范围之间的空间信息。因此，高斯滤波器的不同之处在于它是一种带通滤波器，除了原始灰度图像中存在的少量空间频率之外，它抛弃了所有空间频率。在一些实施方案中，使用DoG过滤器方法检测不同大小的斑点。在一些实施方案中，以升序(从小到大)配置多个斑点尺寸，但是处理是按从大斑点到小斑点的顺序。在每次迭代中，根据给定的内部和外部过滤器大小创建一个DoG过滤器。用这个DoG滤波器对输入或残留图像进行滤波，并且在局部非最大值抑制之后，使用自适应阈值判定来识别阳性检测。各个检测被收集在结果种子/注释对象中。
举例来说，同样在KAPPA mRNA和LAMBDA mRNA检测的情况下，解混后产生的黑色解混通道图像(即具有对应于KAPPA mRNA拷贝的信号)可用作检测孤立的KAPPA mRNA斑点(即单个基因拷贝)的输入图像(参见图9A对应于全玻片图像的一部分，图9B对应于解混图像的部分后)。在这个特定的例子中，通过使用多个预定的盘直径检测斑点的盘状形状来提取孤立斑点信号。如图9C和图9D所示，斑块和斑点通道图像在斑点检测之后被分离。最后，从每个斑点信号的中心种子计算每个检测到的孤立斑点的x,y坐标，如图9E至图9H所示。在一些实施方案中，可以生成覆盖层，并且检测到的孤立斑点叠加在解混之前使用的全玻片图像的部分上(将图9A与图9I和图9J进行比较)。
作为另一个例子，在检测免疫组织化学测定中被染色的图像中HER2蛋白的情况下，图10A示出了针对HER2蛋白的存在而染色的生物样品的全玻片图像的一部分。图10B和图10C示出了从图10A导出的解混图像通道图像中的孤立斑点的检测结果，其中检测到的孤立斑点叠加在全玻片图像的一部分上。
光密度导出模块
在检测图像中的孤立斑点(320)之后，光密度导出模块205用于基于来自每个检测到的孤立斑点的计算的信号特征来确定代表性孤立斑点的光密度(步骤330)，即，考虑输入图像中所有检测到的孤立斑点的特定特征来确定典型检测到的孤立斑点的光密度。
参考图4，在一些实施方案中，光密度导出模块205首先计算图像中每个检测到的孤立斑点的描述性信号特征(步骤400)。在一些实施方案中，信号特征导出模块205实现高斯拟合技术来分析和参数化检测到的孤立斑点的某些特性。
短语“高斯拟合”是指通过确定高斯函数的常数，将构成峰的数据曲线拟合成高斯分布曲线。这里，来自步骤320的每个检测到的孤立斑点的数据被用于生成高斯函数，由此可以导出信号特征，并且因此可以导出每个检测到的孤立斑点的特性。在一些实施方案中，基于光密度和半径的分布是正态分布的假设来执行所述拟合方法。
在一些实施方案中，使用一维高斯函数拟合方法来估计检测到的孤立斑点周围的预定义图块大小内的相关斑点参数。在一些实施方案中，图块大小是5x 5像素。在其他实施方案中，图块大小是7x 7像素。在其他实施方案中，图块大小是11x 11像素。技术人员将能够为任何特定应用确定最合适的图块大小，这将有助于提供最佳直方图结果。
在一些实施方案中，从高斯拟合技术导出的特性包括检测到的孤立点的尺寸、强度、模糊度和圆度，并且使用高斯函数的参数来计算这些特性中的每一个。在一些实施方案中，通过求解线性系统Ax＝b，来自所述拟合方法的估计参数包括均值、标准偏差(SD)和半高全宽，如图11所示。
在一些实施方案中，使用检测到的孤立斑点的中心周围的5个像素半径内的第98百分位来计算检测到的孤立斑点的强度特性。在其他实施方案中，强度直方图中的整个强度范围可用于计算代表性孤立斑点的强度，方法是用其直方图区间数对强度进行加权，并除以强度值的总和(例如，intensityRef＝sum(hIntensity.Values.*(hIntensity.BinEdges))/sum(hIntensity.Values))
在一些实施方案中，代表性孤立斑点的半径通过求解sizeRef＝sum(hSize.Values.*(hSize.BinEdges))/sum(hSize.Values)来计算。
在其他实施方案中，模糊度特性是通过找到高斯函数拟合方法的标准偏差(σ)来导出的。
在其他实施方案中，尺寸特性从半高全宽(FWHM)导出。FWHM是由自变量的两个极值之差给出的函数范围的表达式，因变量等于其最大值的一半。换句话说，它是在y轴上最大振幅的一半的那些点之间测量的光谱曲线的宽度(例如，参见图11)。使用以下等式计算FWHM：
Figure BDA0002889734810000301
在进一步的实施方案中，基于图块内的实际光密度分布和从估计参数计算的理想高斯模型之间的比较来计算圆度特性。一致性相关系数(CCC)(衡量两个变量之间的一致性，例如，评估再现性或评分者之间的可靠性)可用于比较关系(或一致性)，其中CCC＝1表明估计参数与理想高斯模型完全一致；并且其中CCC＝0表明在估计参数和理想高斯模型之间没有一致性。
再次参考图4，一旦确定了每个检测到的孤立斑点的信号特征特性，就可以导出代表性孤立斑点的光密度(步骤401)。
图5提供了一个流程图，示出了计算代表性孤立斑点的光密度的步骤。作为该过程的第一步，所计算的描述性信号特征(来自步骤400)被接收作为输入(501)。接下来，可以为每个计算的信号特征特性生成直方图(步骤502)。例如，如果确定了代表孤立斑点大小的FWHM参数，则可以生成FMHM参数的直方图。在一些实施方案中，所生成的直方图示出了输入图像中具有每个信号特征特性的特定值的孤立斑点的分布，如图12所示。在一些实施方案中，每个直方图的y轴提供归一化的斑点计数，而x轴给出特征量。例如，在图12中，示出了直方图，其示出了黑点信号的强度和具有一系列区间强度值中的每一个的检测到的孤立斑点的数量。同样，图12示出了直方图，其示出了具有特定区间大小的检测到的孤立斑点的分布。
这样，生成的直方图提供了对具有特定值或代表性特性的检测到的孤立细胞的密度的理解。本领域技术人员将会理解，所生成的直方图因此提供了对代表性或典型的检测到的孤立斑点的特性的洞察。例如，通过查看强度直方图(例如，图12)，本领域技术人员将能够确定最经常重复的检测到的孤立斑点的强度值(即，强度值的众数)具有某个值(例如，0.9的值)。然后可以假设代表性或典型的检测到的孤立斑点将具有该特定的确定强度值(例如0.9)。在其他实施方案中，例如，可以使用加权平均值。
给定前述内容，下一步是从生成的直方图中提取尺寸和强度参数(步骤502)，从而可以求解以下等式：
Figure BDA0002889734810000311
其中，面积可以指假定为斑点的形状的圆形(πr2)或矩形(w x h)面积，并且
Figure BDA0002889734810000312
指单个点的预期光密度。
在一些实施方案中，单个点的预期光密度是强度值，其可以是均匀的或不均匀的强度值。在一些实施方案中，单个点的预期光密度可以是强度直方图的众数、所有检测到的孤立斑点的总强度的平均值、或加权强度、或直方图的加权平均强度等等。在一些实施方案中，导出隔离信号特征，然后导出参数(例如尺寸、强度等)被用作描述性统计数据来对当前数据(图像)中的单个点进行建模，以计算聚集信号的估计计数。单个点的模型可以是简单的或更复杂的模型，例如圆形、矩形、球形或三维球形，其信号密度从中心到边界变化(随模糊度变化)。
接下来，从提取的尺寸参数(来自步骤503)计算面积计量值(步骤504)。例如，半径可以从相应直方图中的FWHM值的众数中导出。然后这个半径可以乘以π，得出面积。
作为另一个例子，可以计算以下数据，从而可以导出代表性孤立斑点的光密度：
(i)使用银斑点强度直方图的第10百分位选择背景强度的阈值(例如，TH＝0.45)。
(ii)使用银强度直方图的众数(强度＝0.9)作为孤立点的预期强度。
(iii)使用FWHM＝1.06的大小，使用银斑点尺寸直方图的第10百分位作为代表性孤立斑点的预期大小。
最后，将导出的强度参数乘以面积，以给出代表性孤立斑点的光密度(步骤505)。然后，计算出的代表性斑点的光密度被提供给斑点估计模块208。
分割模块和残留图像生成模块
在一些实施方案中，在估计信号聚集体中的预测斑点的数量之前，使用分割模块207将输入图像分割成多个子区域。在一些实施方案中，由于计算是基于较小的局部区域而不是整个图像，所以认为子区域的生成最小化了计算误差。在一些实施方案中，将输入图像分割成多个子区域对于降低估计聚集信号斑块中的信号的复杂性是有用的。在一些实施方案中，分割提供了多个子区域，其中染色存在(例如，超像素中存在的像素是特定类型的染色)、染色强度(例如，像素具有特定的相对强度值或值的范围)、和/或纹理(例如，像素具有特定的颜色或强度的空间排列)是相似或均匀的。具有基本上均匀的子区域对于几乎完全由聚集信号组成的片段来说尤其重要，子区域上的均匀性在信号估计期间(如本文所述)在该片段内创建了斑点计数的一致近似。分割是在单通道图像上进行的，例如，显示LAMBDAmRNA信号的解混图像中的“紫色”通道，或者显示KAPPA mRNA信号的解混图像中的“黑色”通道。
在一些实施方案中，对不同于用于检测孤立斑点的图像或者用于计算代表性或典型孤立斑点的光密度的图像进行分割。在一些实施方案中，对由残留图像生成模块206生成的残留图像执行分割。在一些实施方案中，通过从另一个图像中减去一个图像来生成残留图像。例如，可以从解混的图像通道图像中减去孤立斑点图像(如本文所述)，以提供仅具有信号聚集斑块的残留图像。在其他实施方案中，可以基于检测到的孤立斑点的位置生成前景分割掩模，并且前景分割掩模可以用于过滤解混图像通道图像，以提供仅具有信号聚集斑块的残留图像。图13中提供了残留图像的示例。
在一些实施方案中，子区域在输入图像的区域中生成捕获信息，该区域具有预定的尺寸或者在图像处理算法(例如，如本文所述的SLIC超像素生成算法的参数)中设定的范围内的尺寸。
在一些实施方案中，输入图像被分割成具有预定形状、大小、面积和/或间距的子区域。例如，子区域可以是椭圆形、圆形、正方形、矩形等。在一些实施方案中，椭圆形、圆形、正方形或矩形子区域可以具有范围在50像素到大约100像素之间的尺寸，或者一些其他尺寸，使得选择的像素组具有相似的属性。在一些实施方案中，子区域是非重叠的，并且可以通过采样网格生成。在一些实施方案中，子区域以捕获相关区域的代表性样品用于分析的方式分布在图像上，例如不规则形状的细胞是主要特征的区域。
在其他实施方案中，通过对图像应用一系列算法来分割输入图像，包括全局阈值滤波器、局部自适应阈值滤波器、形态学运算和分水岭变换。滤波器可以顺序运行或者以本领域普通技术人员认为必要的任何顺序运行。当然，任何滤波器都可以反复应用，直到达到期望的结果。在一些实施方案中，第一滤波器被应用于输入图像以去除不太可能有染色的区域，例如去除那些白色的图像区域。在一些实施方案中，这是通过应用全局阈值滤波器来实现的。在一些实施方案中，全局阈值化基于在第一主成分通道上计算的中值和/或标准偏差，例如类似于灰度通道。然后对图像应用滤波器，以选择性地去除伪影，例如小斑块、小间断、其他小物体和/或填充孔洞。在一些实施方案中，形态算子被应用于去除伪影和/或填充孔洞。在一些实施方案中，基于作为输入引入的二值图像(例如，由先前的滤波步骤产生的二值图像)，应用基于距离的分水岭。
在一些实施方案中，输入图像被分割成超像素。认为超像素算法将图像分割成代表具有感知意义的实体的多个片段(像素组)。每个超像素通过低级分组过程获得，并且具有感知上一致的单位，即包含在超像素中的生物对象中的所有像素在染色存在、染色强度、和纹理方面尽可能一致。图14A至图14C示出了超像素分割的例子(其中图14A示出了全玻片图像的一部分；图14B示出了在没有检测到的孤立斑点的解混图像通道图像上的超像素生成，即残留图像；并且图14C示出了叠加在来自图14A的全玻片图像的一部分上的生成的超像素)。如将在此进一步描述的，超像素分割图像(例如，图14B)可被用作用于估计对应于每个信号聚集斑块中的生物标记的信号量的输入。
超像素是具有相似特性(如颜色、亮度和纹理)的像素的集合。图像可以由一定数量的超像素组成，这些超像素包含像素的多个组合特征，并且可以保留原始图像的边信息。与单个像素相比，超像素包含丰富的特征信息，可以大大降低图像后处理的复杂度，显著提高图像分割的速度。超像素对于估计概率和用小邻域模型做决策也很有用。
超像素算法是将像素分成大小相似的有意义的原子区域的方法。不希望被任何特定的理论所束缚，相信超像素是强大的，因为它们经常落在图像内的重要边界上，并且当它们包含显著的对象特征时倾向于呈现异常或独特的形状。与以中等分辨率分析来获取和存储信息的愿望相一致，超像素位于像素和对象级别之间：它们通过表示具有感知意义的像素组来携带比像素更多的信息，而不是全面地表示图像对象。超像素可以理解为图像分割的一种形式，在短的计算时间内对图像进行过分割。超像素的轮廓已经显示出很好地粘附到自然图像边界，因为图像中的大多数结构都被保留。通过为每个超像素而不是每个像素计算图像特征，随后的处理任务在复杂度和计算时间上得以降低。因此，超像素被认为是有用的预处理步骤，用于对象级分析，如图像分割。
不希望受任何特定理论的约束，认为超像素通过形成在例如颜色或几何形状上具有相似特征的紧凑且均匀的像素组来过度分割图像。过去，已经开发了多种超像素方法。它们可以分为(一)基于图形的方法和(二)基于梯度上升的方法。在基于图的方法中，每个像素被认为是图中的一个节点。在所有节点对之间定义一个与其相似性成比例的边权重。然后，在图上定义的成本函数被公式化并最小化，以便提取超像素片段。在基于梯度上升的方法中，像素被迭代地映射到特征空间，以描绘代表簇的更密集的区域。每次迭代细化每个簇以获得更好的分割，直到收敛。
已经开发了许多超像素算法，包括归一化切割、凝聚聚类、快速移位和Turbopixel算法。归一化切割算法使用轮廓和纹理线索递归地分割图像中所有像素的图形，全局最小化在分割边界的边缘上定义的成本函数。它产生非常规则的、美观的超像素(参见JianboShi和Jitendra Malik.Normalized cuts and image segmentation,IEEE Transactionson Pattern Analysis and Machine Intelligence,(PAMI),22(8):888–905，2000年8月，其披露内容通过引用整体并入本文中)。Alastair Moore、Simon Prince、JonathanWarrell、Umar Mohammed和Graham Jones在Superpixel Lattices.IEEE Computer Visionand Pattern Recognition(CVPR),2008中描述了一种方法，通过寻找最佳路径或接缝，将图像分割成更小的竖直或水平区域，生成符合网格的超像素。最佳路径是使用图切割方法找到的(参见Shai Avidan and Ariel Shamir.Seam carving for content-aware imageresizing.ACM Transactions on Graphics(SIGGRAPH),26(3),2007，其披露内容通过引用并入本文中)。快速移位(见维A.Vedaldi和S.Soatto.Quick shift and kernel methodsfor mode seeking.In European Conference on Computer Vision(ECCV),2008，其披露内容通过引用并入本文中)使用模式搜索分割方案。它使用中心点移位(medoid shift)过程初始化分割。然后，它将特征空间中的每个点移动到最近的邻居，这增加了Parzen密度估计。涡轮像素方法使用基于水平集的几何流逐步扩展一组种子位置(见A.Levinshtein,A.Stere,K.Kutulakos,D.Fleet,S.Dickinson,and K.Siddiqi).Turbopixels:Fastsuperpixels using geometric flows.IEEE Transactions on Pattern Analysis andMachine Intelligence(PAMI),2009，其披露内容通过引用并入本文中)。几何流依赖于局部图像梯度，目的是在图像平面上有规律地分布超像素。与其他方法不同，Turbopixel超像素被限制为具有一致的大小、紧密度和边界粘附性。Radhakrishna Achanta在“SLICSuperpixels Compared to State-of-the-art”，Journal of Latex Class Files,Vol.6,No.1，2011年12月中描述了生成超像素的其他方法，其披露内容通过引用整体并入本文中。
引入了一种称为简单线性迭代聚类(SLIC)的超像素算法，与目前最先进的超像素方法相比，它在边界粘附性和效率方面都是优越的。SLIC具有两个步骤。首先，它通过用局部k-均值聚类(KMC)方法对像素进行分组来生成超像素，其中距离被测量为与数据和空间距离相结合的欧几里德距离。其次，使用连通分量算法(CCA)通过将生成的小孤立区域合并到最近的大超像素中来去除它们。
k均值聚类旨在将n个观测值划分为k个簇，其中每个观测值属于具有最近均值的簇，作为该簇的原型。连通分量标记通过逐像素扫描图像(从上到下，从左到右)来识别连通像素区域，即共享同一组强度值V的相邻像素区域。(对于二值图像V＝{1}；然而，在灰度图像中，V将呈现一系列值，例如：V＝{51,52,53,...,77,78,79,80}。)连通分量标记适用于二值或灰度图像，不同的连通度量是可能的。然而，下面我们假设二进制输入图像和8-连通性。连通分量标记算子通过沿一行移动来扫描图像，直到到达点p(其中p表示在扫描过程的任何阶段要标记的像素)，对于该点，V＝{1}。当这为真时，它检查已经在扫描中遇到的p的四个相邻像素(即，(i)p左边的相邻像素，(ii)p上面的相邻像素，以及(iii和iv)两个上对角线项)。基于该信息，p的标记如下：如果所有四个相邻像素都为0，则为p分配一个新的标记，否则如果只有一个相邻像素的值为V＝{1}，则将其标记分配给p，否则，如果有多个相邻像素的值为V＝{1}，则为p分配一个标记，并记下等价项。
完成扫描后，等效标签对被分类到等效类别中，并为每个类别分配一个唯一的标签。作为最后一步，对图像进行第二次扫描，在此期间，每个标签被分配给其等价类的标签替换。对于显示，标签可以是不同的灰度或颜色。
SLIC是超像素生成的k-均值的一种改编，具有两个重要的区别：(i)通过将搜索空间限制在与超像素大小成比例的区域，优化中的距离计算的数量显著减少(这被认为减少了像素数量的线性复杂度，并且与超像素数量k无关)；以及(ii)加权距离度量结合了颜色和空间邻近性，同时提供对超像素的大小和紧凑性的控制。(参见Achanta等人，“SLICSuperpixels Compared to State-of-the-Art Superpixel Methods”，IEEETransactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence,Vol.34,No.11，2012年11月，其披露内容通过引用整体并入本文中)。
SLIC考虑5D空间中的图像像素，由CIELAB颜色空间的L*a*b值以及它们的x和y坐标定义。5D空间中的像素基于整合了图像平面中的颜色相似性和邻近性的自适应k均值聚类来聚类。聚类是基于距离度量D的，距离度量D度量L*a*b空间中的颜色相似性(dc)和x,y空间中的像素接近度(ds)。后者通过定义图像像素总数的平方根除以超像素数(k)的网格间隔(S)来归一化。超像素的紧密度和规律性由常数m控制。该参数用作空间距离(dc)和谱距离(ds)之间的加权标准。较大的m增加了空间邻近度的权重，这导致更紧凑的超像素，其边界与图像中的谱轮廓粘附较少。
Figure BDA0002889734810000361
SLIC算法可以应用如下。设Np为给定图像(或其感兴趣的部分或区域)中的像素数，k为要生成的超像素数。接下来，SLIC算法的主要步骤如下：
(1)初始化簇中心。将k个初始簇中心设置在间隔开
Figure BDA0002889734810000371
像素的规则网格上，然后将这些簇中心移动到3x 3邻域中梯度最低的位置。不希望受任何特定理论的约束，认为这样做是为了避免将超像素居中在边缘上，并减少用噪声像素播种超像素的机会。
(2)分配像素。通过局部KMC将每个像素指定到局部搜索空间中最近的簇中心。
(3)更新簇中心。将每个簇中心设置为相应簇中所有像素的均值。
(4)重复步骤(2)-(3)，直到簇不变或满足另一个给定标准。
(5)后处理。如果孤立区域的大小小于最小大小Smin，则使用CCA将孤立区域重新分配给附近的超像素。
在SLIC方法的步骤(2)中应用局部KMC，其中每个像素与搜索区域覆盖其位置的最近簇中心相关联。在传统的KMC中，每个簇中心的搜索区域是整个图像，然后计算从每个簇中心到图像中每个像素的距离。然而，在局部KMC中，簇中心的搜索空间被限制在局部2S x2S正方形区域。因此，SLIC仅计算从每个簇中心到其搜索区域内的像素的距离。
在局部KMC，欧几里德距离用于聚类。设zi为第i个簇中心的数据，其空间位置为(xi,yi)。设zj为中心搜索区域内像素的强度。然后，该像素和中心之间的积分距离为：
Figure BDA0002889734810000372
其中df＝|zi-zj|和
Figure BDA0002889734810000373
分别是像素和中心之间的强度和空间距离，m是对df和ds对积分距离DI的相对贡献进行加权的正则化参数。较大的m表示ds比df更重要。直接描述两个距离的贡献的等效积分距离DI可以由下式给出：
Figure BDA0002889734810000374
其中Nf是整个图像的平均强度，w∈[0,1]是正则化参数。在这种情况下，w和(1-w)分别是归一化强度和空间距离DI的比值。
在一些实施方案中，SLIC算法的参数k指定近似相等大小的超像素的数量。在一些实施方案中，紧密度参数m可以被设置为控制超像素的同质性和边界粘附性之间的折衷。不希望受任何特定理论的约束，认为通过改变紧密度参数，规则形状的超像素可以在未纹理化区域中生成，并且高度不规则的超像素可以在纹理化区域中生成。同样，不希望被任何特定的理论所束缚，相信参数m也允许颜色相似性和空间接近性之间的相对重要性的加权。当m较大时，空间邻近性更重要，并且产生的超像素更紧密(即，它们具有较低的面积与周长比)。当m较小时，产生的超像素更紧密地附着在图像边界上，但是具有不太规则的尺寸和形状。
在一些实施方案中，调整像素大小和紧密度参数两者。在一些实施方案中，使用范围在大约40像素到大约70像素之间的像素大小。在其他实施方案中，使用范围在大约60像素到大约100像素之间的像素大小。在另外的实施方案中，使用范围在大约70像素到大约100像素之间的像素大小。在进一步的实施方案中，使用范围在大约80像素到大约100像素之间的像素大小。
斑点估计模块
斑点估计模块208用于量化对应于任何信号聚集体或斑块中的生物标记的染色的量(步骤340)。在一些实施方案中，估计模块208用于确定输入图像中的多个子区域(例如在执行分割模块之后返回的子区域)中每个子区域内每个信号聚集体或斑块中的信号量。
在一些实施方案中，该估计基于单个斑点的光密度总和和聚集信号之间的线性关系，如下所示：
Figure BDA0002889734810000381
其中，N是聚集信号区域内的斑点数量，ODA是聚集信号的光密度，ODS是代表性孤立斑点的计算光密度(来自步骤401)。
在一些实施方案中，点聚集体的光密度是来自输入图像(例如来自残留图像)的斑点聚集体的测量强度。
一旦估计了每个子区域中的预测斑点的数量(步骤340)，就可以将数据存储在数据库或其他存储模块240中(步骤350)。在一些实施方案中，每个信号聚集斑块的预测斑点的数量与斑块的坐标(x,y)(例如斑块的种子中心的x,y坐标)一起被存储。在一些实施方案中，检测到的孤立斑点也与它们的x,y坐标一起存储，如这里所述。在一些实施方案中，存储每个子区域的斑点总数，即实际检测到的孤立斑点和预测斑点的总数。
参照图15，在独立评估全玻片图像的几个部分的实施方案中，可以为全玻片图像的每个部分存储预测斑点的估计数量或斑点的总数(如上所述)(步骤350)。可选地，再次参考图15，在独立评估全玻片图像的几个部分的实施方案中，可以组合全玻片图像的每个部分中的预测斑点的估计数量或斑点的总数(如上所述)，使得可以为全玻片图像存储(步骤350)和/或报告(步骤360)对应于信号量的数据。
在一些实施方案中，每个子区域的斑点总数可以被算出并存储在数据库中。例如，检测到的孤立斑点的总数可以与每个子区域的预测斑点的估计数量组合(即相加)，以提供每个子区域的斑点总数。
在一些实施方案中，可以计算每个细胞的斑点的总数。在一些实施方案中，可以执行细胞核分割以返回总细胞计数。在计算出每个子区域的斑点总数之后(如上所述)，该结果与总细胞计数一起使用：每个细胞的总斑点计数＝总斑点计数/总细胞计数。图17A和图17B示出了种子中心的细胞核分割的例子(图17A)和每个细胞的细胞核边界(图17B)。
覆盖层生成模块
在检测到孤立斑点(步骤320)之后并且在估计预测斑点的数量(步骤340)之后，可以报告数据(例如定量数据)，例如通过将数据叠加到全玻片图像或其一部分上。在一些实施方案中，覆盖层生成模块209用于计算随后可以叠加在输入图像上的覆盖层。图16A和图16B提供了合适的叠加层的例子，其中各个检测到的斑点(红点，1610)和每个子区域的预测斑点的估计数量(整数值)叠加在全玻片图像的一部分上。
在一些实施方案中，每个子区域的斑点总数可以被计算并存储在数据库(例如，存储模块240)中，或者在覆盖层中可视地描绘。例如，检测到的孤立斑点的总数可以与每个子区域的预测斑点的估计数量组合(即相加)，以提供每个子区域的斑点总数。换句话说，总斑点计数＝检测到的孤立斑点计数+估计的聚集信号计数。
作为显示孤立斑点和/或表示每个信号聚集斑块的估计信号量的整数的替代，每个子区域可以被颜色编码以显示检测到的和预测到的斑点信号的总密度。例如，当总斑点数小于5时，该区域可以用蓝色表示；当总斑点数在6到15之间时，该区域可以用黄色表示；并且在总斑点数大于15的情况下，该区域可以用红色表示。
此外，当估计一种以上生物标记的信号量时，例如估计对应于KAPPA和LAMBDAmRNA探针的信号，可以产生覆盖层，其中显示具有特定KAPPA与LAMBDA比率的子区域。例如，可视化可以是(+)或(-)，表示特定比率的阳性或阴性。同样，每个子区域可以根据导出的比率进行颜色编码。
用于实践本公开文本的实施方案的其他部件
本公开文本的计算机系统200可以绑定到可以对组织样本执行一个或多个制备过程的样本处理设备。制备过程可以包括但不限于对样本进行脱蜡、对样本进行调节(例如，细胞调节)、对样本进行染色、执行抗原修复、执行免疫组织化学染色(包括标记)或其他反应和/或执行原位杂交(例如，SISH、FISH等)染色(包括标记)或其他反应、以及用于制备用于显微术、微量分析、质谱法或其他分析方法的样本的其他过程。
处理设备可以将固定剂应用于样本。固定剂可以包括交联剂(诸如醛类(例如甲醛、多聚甲醛和戊二醛)以及非醛类交联剂)、氧化剂(例如，金属离子和复合物，如四氧化锇和铬酸)、蛋白质变性剂(例如，乙酸、甲醇和乙醇)、未知机制的固定剂(例如，氯化汞、丙酮和苦味酸)、组合试剂(例如，卡诺氏固定剂(Carnoy's fixative)、methacarn、波恩氏流体(Bouin's fluid)、B5固定剂、罗斯曼氏流体(Rossman's fluid)、詹德莱氏流体(Gendre'sfluid))、微波和混杂固定剂(例如，排出体积固定和蒸气固定)。
如果样本是嵌入石蜡中的样品，则可以使用(多种)适当的去石蜡流体对样品进行脱石蜡。除去石蜡后，任何数量的物质都可以连续施加到样本上。物质可以用于预处理(例如，用于反转蛋白质交联、暴露核酸等)、变性、杂交、洗涤(例如，严格洗涤)、检测(例如，将视觉或标记分子与探针链接)、扩增(例如，扩增蛋白质、基因等)、复染、盖玻等。
样本处理设备可以向样本施加各种物质。物质包括但不限于染色剂、探针、试剂、冲洗剂和/或调节剂。物质可以是流体(例如，气体、液体或气体/液体混合物)等。流体可以是溶剂(例如，极性溶剂、非极性溶剂等)、溶液(例如，水溶液或其他类型的溶液)等。试剂可以包括但不限于染色剂、润湿剂、抗体(例如，单克隆抗体、多克隆抗体等)、抗原回收流体(例如，基于水性或非水性的抗原修复溶液、抗原回收缓冲液等)等。探针可以是与可检测的标记或报告分子附接的孤立的核酸或孤立的合成寡核苷酸。标记可以包括放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光或荧光剂、半抗原和酶。
样本处理设备可以是自动化设备，例如Ventana Medical Systems,Inc.出售的BENCHMARK XT仪器和SYMPHONY仪器。Ventana Medical Systems,Inc.是许多美国专利的受让人，这些专利公开了用于执行自动分析的系统和方法，包括美国专利第5,650,327号、第5,654,200号、第6,296,809号、第6,352,861号、第6,827,901号和第6,943,029号以及美国公开专利申请第20030211630号和第20040052685号，这些专利申请的披露内容通过引用整体并入本文中。可替代地，可以手动处理样本。
在处理样本之后，用户可以将带有样本的玻片运送到成像设备。在一些实施方案中，成像设备是明场成像器玻片扫描仪。一种明场成像器是Ventana Medical Systems,Inc.出售的iScan超线程和DP200(Griffin)明场扫描仪。在自动化实施方案中，成像设备是如在题为IMAGING SYSTEM AND TECHNIQUES的国际专利申请号：PCT/US2010/002772(专利公开号：WO/2011/049608)中公开的或者在2011年9月9日提交的题为IMAGING SYSTEMS,CASSETTES,AND METHODS OF USING THE SAME的美国专利公开号2014/0178169中公开的数字病理学装置。
成像系统或设备可以是多光谱成像(MSI)系统或荧光显微镜系统。这里使用的成像系统是MSI。MSI通常通过提供对像素级图像的光谱分布的访问用基于计算机化显微镜的成像系统来配备病理样本的分析。虽然存在各种多光谱成像系统，但是所有这些系统共有的操作方面是形成多光谱图像的能力。多光谱图像是捕获特定波长或跨电磁波谱的特定光谱带宽的图像数据的图像。可以通过光学滤波器或通过使用能够选择预定光谱分量的其他仪器来挑选这些波长，所述预定光谱分量包括在可见光范围之外的波长处的电磁辐射，如例如红外(IR)。
MSI系统可以包括光学成像系统，该光学成像系统的一部分包含光谱选择性系统，该光谱选择性系统可调谐以定义预定数量的N个离散光学带。光学系统可以适于对组织样品进行成像、用宽带光源在透射中照射到光学检测器上。在一个实施方案中可以包括放大系统(如例如显微镜)的光学成像系统具有通常在空间上与光学系统的单个光学输出对准的单个光轴。当调整或调谐光谱选择系统(例如用计算机处理器)时，系统形成组织的一系列图像，如以确保在不同的离散光谱带中获取图像。设备可以另外包含显示器，所述显示器中出现来自所获取的图像的序列中的至少一个视觉上可感知的组织图像。光谱选择系统可以包括光学色散元件(如衍射光栅)、光学滤波器(如薄膜干涉滤光器)的集合、或适于响应于用户输入或预编程处理器的命令从光源通过样品朝向检测器透射的光谱中选择特定通带的任何其他系统。
在替代性实施方式中，光谱选择系统定义了对应于N个离散光谱带的若干个光学输出。这种类型的系统从光学系统摄入透射光输出，并且沿着N个空间上不同的光路在空间上重定向这个光输出的至少一部分，其方式为将识别的光谱带中的样品沿着对应于这个识别的光谱带的光路成像到检测器系统上。
在本说明书中描述的主题和操作的实施方案可以在数字电子电路中或在计算机软件、固件、或硬件(包括在本说明书中公开的结构及其结构等同物)、或它们中的一个或多个的组合中实施。可以将本说明书中描述的主题的实施方案实施为一个或多个计算机程序，即在计算机存储介质上编码以用于由数据处理设备来执行或者用于控制数据处理设备的操作的计算机程序指令的一个或多个模块。本文所描述的任何模块可以包括由一个或多个处理器执行的逻辑。如本文所使用的，“逻辑”是指具有可以应用于影响处理器操作的指令信号和/或数据形式的任何信息。软件是逻辑的示例。
计算机存储介质可以是机器可读存储装置、机器可读储存基板、随机或串行存取存储器阵列或装置、或其中的一项或多项的组合。此外，虽然计算机存储介质不是传播信号，但是计算机存储介质可以是以人工生成的传播信号编码的计算机程序指令的来源或目的地。计算机存储介质还可以是或者可以包括在一个或多个单独的物理部件或介质(例如，多个CD、磁盘或其他存储装置)中。可以将本说明书中描述的操作实施为由数据处理设备对存储在一个或多个计算机可读存储装置上或从其他来源接收的数据执行的操作。
术语“编程处理器”包括用于处理数据的所有种类的设备、装置和机器，包括例如可编程微处理器、计算机、芯片上系统或多个芯片上系统、或前述项的组合。设备可以包括专用逻辑电路系统，例如FPGA(现场可编程门阵列)或ASIC(专用集成电路)。除了硬件之外，设备还可包括为所讨论的计算机程序创造执行环境的代码，例如，组成处理器固件、协议栈、数据库管理系统、操作系统、跨平台运行时环境、虚拟机、或其中的一个或多个的组合的代码。设备和执行环境可以实现各种不同的计算模型基础结构，诸如web服务、分布式计算和网格计算基础结构。
计算机程序(也称为程序、软件、软件应用、脚本或代码)可以以任何形式的编程语言书写，包括编译或解释语言、说明性或者过程性语言，并且计算机程序可以以任何形式部署，包括作为独立程序或者作为模块、部件、子例程、对象或适用于计算环境的其他单元。计算机程序可以但不需要对应于文件系统中的文件。可以将程序存储在保持其他程序或数据的文件的一部分(例如，存储在标记语言文档中的一个或多个脚本)中、专用于所讨论的程序的单个文件中、或者多个协调文件(例如，存储一个或多个模块、子程序、或代码的各部分的文件)中。计算机程序可以被部署成在一个计算机上或者在位于一个站点或跨多个站点分布并且通过通信网络互连的多个计算机上执行。
本说明书中描述的过程和逻辑流程可以由一个或多个可编程处理器实行，所述一个或多个可编程处理器执行一个或多个计算机程序以便通过对输入数据进行操作并且生成输出来执行动作。过程和逻辑流程还可以由设备执行，并且设备还可以被实施为专用逻辑电路系统，例如FPGA(现场可编程门阵列)或ASIC(专用集成电路)。
举例来说，适合于执行计算机程序的处理器包括通用和专用微处理器、以及任何类型的数字计算机的任何一个或多个处理器。通常来说，处理器将从只读存储器或随机存取存储器或二者中接收指令和数据。计算机的必不可少的元件是用于根据指令执行动作的处理器和用于存储指令和数据的一个或多个存储器装置。通常，计算机还将包括用于存储数据的一个或多个大容量存储装置(例如，磁盘、磁光盘或光盘)，或者被操作性地耦合以从大容量存储装置接收数据或向大容量存储装置传递数据或两者。然而，计算机不需要有这种装置。此外，计算机可以嵌入另一个装置中，仅举几例，例如移动电话、个人数字助理(PDA)、移动音频或视频播放器、游戏控制台、全球定位系统(GPS)接收器或便携式存储装置(例如，通用串行总线(USB)闪存驱动器)。适用于存储计算机程序指令和数据的装置包括所有形式的非易失性存储器、介质和存储器装置，举例来讲，包括半导体存储器装置(例如，EPROM、EEPROM、以及闪存存储器装置)、磁盘(例如，内置硬盘或可移除盘)、磁光盘、以及CDROM和DVD-ROM盘。处理器和存储器可以由专用逻辑电路补充或结合在其中。
为了提供与用户的交互，本说明书中描述的主题的实施方案可以实施在具有用于向用户显示信息的显示装置(例如，LCD(液晶显示器)、LED(发光二极管)显示器或OLED(有机发光二极管)显示器)以及通过其用户可以向计算机提供输入的键盘和定点装置(例如鼠标或轨迹球)的计算机上。在一些实施方案中，触摸屏可以用于显示信息并接收来自用户的输入。还可以使用其他种类的装置来提供与用户的交互；例如，提供给用户的反馈可以是任何形式的感官反馈，例如，视觉反馈、听觉反馈或触觉反馈；并且可以以任何形式接收来自用户的输入，包括声音、语音或触觉输入。另外，计算机可以通过向用户使用的装置发送文档和从用户使用的装置接收文档(例如，通过响应于从用户的客户端装置上的web浏览器接收的请求将网页发送到web浏览器)来与用户交互。
本说明书中描述的主题的实施方案可以实施在包括以下的计算系统中：后端部件(例如，作为数据服务器)、或中间件部件(例如，应用服务器)、或前端部件(例如，具有图形用户界面或Web浏览器的客户端计算机，用户可以通过所述图形用户界面或所述Web浏览器与本说明书中描述的主题的实施方式交互)、或者一个或多个这种后端、中间件或前端部件的任何组合。系统的部件可以通过数字数据通信的任何形式或介质(例如，通信网络)进行互连。通信网络的示例包括局域网(“LAN”)和广域网(“WAN”)、互联网络(例如，互联网)以及对等网络(例如，自组织对等网络)。例如，图1的网络20可以包括一个或多个局域网。
计算系统可以包括任何数量的客户端和服务器。客户端和服务器通常远离彼此并且通常通过通信网络进行交互。客户端与服务器的关系借助于在相应计算机上运行并且彼此具有客户端-服务器关系的计算机程序产生。在一些实施方案中，服务器将数据(例如，HTML页面)传输到客户端装置(例如，目的是向与客户端装置交互的用户显示数据和从与客户端装置交互的用户接收用户输入)。可以从服务器处的客户端装置接收在客户端装置处生成的数据(例如，用户交互的结果)。
实施例
质量控制是基于图形用户界面(GUI)进行的，其中检测到的孤立斑点覆盖在原件上，观察者可以校正，例如添加、删除、移动斑点。由专家观察者(科学家)在单路银图像上使用31个FOV进行验证。如下所示，一致性曲线图如下所示，R2为0.99，并且CCC＝0.99。校正前后的斑点计数结果的例子在图18中。
本说明书中提到的和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物通过引用整体并入本文。如果需要，可以修改实施方案的方面，以采用各种专利、申请和出版物的概念来提供进一步的实施方案。
尽管已经参考多个说明性实施方案描述了本公开，但是应当理解，本领域技术人员可以设计出在本公开的原理的精神和范围内的许多其他修改和实施方案。更具体地，在不脱离本公开的精神的情况下，在前述公开、附图和所附权利要求的范围内，主题组合布置的组成部分和/或布置中的合理变化和修改是可能的。除了部件和/或布置的变化和修改之外，替代用途对于本领域技术人员也是显而易见的。

Claims (37)

1.一种估计生物样品的图像中对应于至少一种生物标记的信号的量的方法，包括：
(a)检测第一图像中的孤立斑点(320)；
(b)基于来自所检测到的孤立斑点的信号特征导出代表性孤立斑点的光密度值(330)；
(c)基于所导出的代表性孤立斑点的光密度值，估计多个子区域中每个子区域内的信号聚集体中的预测斑点的数量(340)；以及
(d)在数据库中存储所述多个生成的子区域中每个子区域中的所述预测斑点估计数量和所检测到的孤立斑点(350)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中通过算出其中一个所述子区域中的所述信号聚集体的总光密度除以所述代表性孤立斑点的导出光密度的商来估计所述多个子区域中每个子区域中的所述信号聚集体中的所述预测斑点的数量。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述代表性孤立斑点的光密度是通过以下步骤导出的：(i)根据来自所有所检测到的孤立斑点的计算描述性信号特征生成直方图；(ii)从所述直方图中提取尺寸和强度参数；(iii)根据所提取的尺寸参数算出面积计量值；以及(iv)将所提取的强度参数乘以所算出的面积计量值。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述强度参数是均匀强度度量或非均匀强度度量。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述非均匀强度度量是从模糊度直方图中导出的，所述模糊度直方图是根据每个所检测到的孤立斑点的模糊度信号特征计算出来的。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述均匀强度度量选自从强度直方图导出的强度值的众数和从强度直方图导出的加权平均强度。
7.根据权利要求3所述的方法，其中所述尺寸参数是来自半高全宽直方图的半径的众数。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一图像是对应于来自第一生物标记的信号的第一解混图像通道图像。
9.根据权利要求3所述的方法，其中所计算的描述性信号特征包括斑点强度、斑点模糊度、斑点圆度、和斑点尺寸。
10.根据权利要求9所述的方法，其中使用一维高斯函数拟合方法在具有预定尺寸的图像块中计算所述描述性信号特征。
11.根据权利要求1所述的方法，其中对所述信号聚集体中所述预测斑点的数量的所述估计是使用基本上没有对应于所检测到的孤立斑点的信号的第二图像来执行的。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第二图像通过以下步骤导出：(i)基于在所述第一图像中检测到的孤立斑点生成前景分割掩模；以及(ii)用所生成的前景分割掩模过滤所述第一图像。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述第二图像通过以下步骤生成：(i)生成仅包括所检测到的来自所述第一图像的孤立斑点的孤立斑点图像；以及(ii)从所述第一图像中减去所述孤立斑点图像。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个子区域中的每个子区域具有在生物标记染色强度、生物标记染色存在、和局部生物标记染色纹理中的至少一个方面基本均匀的像素。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个子区域中的每一个都是超像素。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述超像素是通过以下步骤来导出的：(i)用局部k均值聚类对像素进行分组；以及(ii)使用连通分量算法将小的孤立区域合并到最近的大的超像素中。
17.根据权利要求1所述的方法，其中通过将采样网格覆盖到所述第二图像上来导出所述子区域，所述采样网格限定了具有预定大小和形状的非覆盖区域。
18.根据权利要求1所述的方法，进一步包括生成图像覆盖层，独立地可视化每个子区域中所检测到的孤立斑点的数量和所估计的预测斑点的数量。
19.根据权利要求1所述的方法，进一步包括根据每个子区域中估计的预测斑点的数量和检测到的孤立斑点的数量生成可视化所述信号总量的图像覆盖层。
20.一种用于估计生物样品中的一种或多种信号的量的系统(200)，所述一种或多种信号对应于所述生物样品中的染色靶标，所述系统包括：(i)一个或多个处理器(220)、和(ii)联接到所述一个或多个处理器的存储器(201)，所述存储器用于存储计算机可执行指令，当所述指令被所述一个或多个处理器执行时，使得所述系统(200)执行操作，所述操作包括：
(a)检测第一图像中的孤立斑点；
(b)根据所有检测到的孤立斑点计算描述性信号特征；
(c)基于所述计算描述性信号特征，估计第二图像中多个子区域中每个子区域中的信号聚集体中的预测斑点的数量；以及
(d)在所述存储器中至少存储所述预测斑点的估计数量。
21.根据权利要求20所述的系统，其中通过以下步骤来估计所述多个子区域中每个子区域中的所述信号聚集体中的所述预测斑点的数量：(i)导出代表性孤立斑点的光密度，所述代表性孤立斑点的光密度从所述计算描述性信号特征导出；以及(ii)算出所述第二图像的其中一个所述子区域中的所述信号聚集体的总光密度除以所述代表性孤立斑点的导出光密度的商。
22.根据权利要求21所述的系统，其中所述代表性孤立斑点的光密度是通过以下步骤导出的：(i)根据每个所计算的描述性信号特征生成直方图；(ii)从所述直方图中提取尺寸和强度参数；(iii)根据所提取的尺寸参数算出面积计量值；以及(iv)将所提取的强度参数乘以所算出的面积计量值。
23.根据权利要求22所述的系统，其中所述强度参数是均匀强度度量或非均匀强度度量。
24.根据权利要求22所述的系统，其中所述尺寸参数是来自半高全宽直方图的半径的众数。
25.根据权利要求20所述的系统，其中所述第一图像是对应于来自第一生物标记的信号的第一解混图像通道图像。
26.根据权利要求20所述的系统，其中所计算的描述性信号特征包括斑点强度、斑点模糊度、斑点圆度、和斑点尺寸。
27.根据权利要求20所述的系统，其中使用一维高斯函数拟合方法在具有预定尺寸的图像块中计算所述描述性信号特征。
28.根据权利要求20所述的系统，其中对所述信号聚集体中所述预测斑点的数量的所述估计是使用基本上没有对应于所检测到的孤立斑点的信号的第二图像来执行的。
29.一种存储用于估计染色生物样品中不同信号的量的指令的非暂态计算机可读介质，包括：
(a)检测第一图像中的孤立斑点；
(b)至少基于来自所检测到的孤立斑点的强度和尺寸信号特征，导出代表性孤立斑点的光密度值；以及
(c)基于所导出的代表性孤立斑点的光密度值，估计第二图像中的多个子区域中每个子区域内的信号聚集体中的预测斑点的数量。
30.根据权利要求29所述的非暂态计算机可读介质，其中所述代表性孤立斑点的光密度是通过以下步骤导出的：(i)根据来自所检测到的孤立斑点的每个所述信号特征生成直方图；(ii)从所述直方图中提取尺寸和强度参数；(iii)根据所提取的尺寸参数算出面积计量值；以及(iv)将所提取的强度参数乘以所算出的面积计量值。
31.根据权利要求29所述的非暂态计算机可读介质，其中使用具有盘状形状的形状检测器来检测所述孤立斑点。
32.根据权利要求29所述的非暂态计算机可读介质，其中所述子区域是超像素。
33.根据权利要求32所述的非暂态计算机可读介质，其中所述超像素是通过以下步骤来导出的：(i)用局部k均值聚类对像素进行分组；以及(ii)使用连通分量算法将小的孤立区域合并到最近的大的超像素中。
34.根据权利要求29所述的非暂态计算机可读介质，其中通过算出其中一个所述子区域中的所述信号聚集体的总光密度除以所述代表性孤立斑点的导出光密度的商来估计所述多个子区域中每个子区域中的所述信号聚集体中的所述预测斑点的数量。
35.根据权利要求34所述的非暂态计算机可读介质，其中所述信号聚集体的总光密度是测量值。
36.根据权利要求29所述的非暂态计算机可读介质，其中所述信号对应于至少两种核酸生物标记。
37.根据权利要求29所述的非暂态计算机可读介质，其中所述信号对应于至少一种蛋白质生物标记。
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