CN104081412A - 用于检测组织样本中的基因的系统 - Google Patents

Abstract

一种基于计算机的标本分析器（10），被配置为：通过检测表示细胞中的被不同地染色的基因和染色体的斑点来检测细胞样本中的基因的表达水平。对被染色的基因和染色体的色彩进行增强并且滤波，以产生限定作为基因、染色体或非遗传物质的图像中的区的斑点蒙片。针对斑点和/或与斑点对应的在区中的细胞的图像中的像素确定度量。所述度量被馈送到分类器，所述分类器分离基因与染色体。对分类器的结果进行计数，以估计组织样本中的基因的表达水平。

Description

用于检测组织样本中的基因的系统

技术领域

在此公开的技术涉及基于计算机的标本分析器，并且特别是涉及用于检测组织样本中的基因的表达水平的基于计算机的系统。

背景技术

很多疾病与在细胞的核中发生的改变关联。特别是，某些类型的癌症与细胞中的附加遗传物质的存在关联。例如，特定类型的乳腺癌与人类表皮生长因子2（“HER2”）对于细胞中所发现的染色体17的数量的过富余（例如过表达）关联。通过检测组织样本中HER2基因的数量对于染色体17的数量，可以更容易地标识这种特定类型的乳腺癌，并且可以估计治疗选项。

在常规组织分析系统中，病理学家使用显微镜来查看已经利用包括特殊基因标记的“鸡尾酒”混合物而染色的组织样本，所述特殊基因标记将它们自身附接到特定基因、染色体或其部分。标记使得所附接的染色体或基因在已染色的载片（slide）上显现为不同地着色的区域。病理学家可以对有多少物体真实表示所标记的遗传物质对于载片中的额外废物进行计数并且估计，并且然后作出基因是否在特定组织样本中被放大的确定。

发明内容

所公开的技术的至少一些实施例针对构建一种用于自动地对组织标本进行评分的成像系统。所述系统选择用于定量分析的候选核。所述系统自动地对第一原位杂交信号和第二原位杂交信号进行计数。可以确定所述第一信号的计数对于所述第二信号的计数的比例。

在一些实施例中，所述系统包括：计算系统，其自动地对所述第一杂交信号和所述第二杂交信号进行计数。在特定实施例中，所述第一杂交信号和所述第二杂交信号之一或二者是非荧光信号。所述非荧光信号可以是银色原位杂交信号或红色原位杂交信号等。在一些实施例中，一个信号是指示HER2基因的银色原位杂交信号（“SISH”），而另一信号是指示染色体17的红色原位杂交信号。

在一些实施例中，系统估计是否应对图像的特征进行计数。所述系统可以使用至少一个图像特性度量以及至少一个形态度量来确定特征是否与基因、蛋白质、染色体或其它感兴趣解剖结构对应。图像特性度量可以包括例如色彩、色彩平衡或强度等。形态度量可以包括例如特征大小、特征色彩、特征定向、特征形状、各特征（例如相邻特征）之间的关系或距离、或者与另一解剖结构有关的特征的关系或距离等。图像特性度量、形态度量和其它度量可以用于训练分类器。

在一些实施例中，基于计算机的标本分析器被配置为：通过检测表示已染色的感兴趣特征的图像特征来检测用于图像中的感兴趣特征的表达水平。对已染色的特征的色彩进行增强并且滤波，以产生限定图像中的区的蒙片（mask），所述图像中的区是基因、染色体、蛋白质、非遗传物质或其它所标定的标记。度量可以用于估计与所述感兴趣特征对应的图像特征（例如斑点、像素或这两者）。所述度量被馈送到分类器，所述分类器分离不同的细胞结构。

在一些实施例中，用于检测基因的表达水平的系统包括存储器和处理器。所述存储器可以存储程序指令序列。所述处理器可以被编程为：接收组织样本的彩色图像，并且基于所述细胞核的形态来标识在所述彩色图像中被不同地染色的基因和染色体。所述处理器可以估计所标识的基因和染色体的关系，以确定所述基因的表达水平。

所述基因或染色体可以显现为所述标本的图像中的斑点。在一些实施例中，所述处理器被编程为：通过估计斑点尺寸、斑点形状、斑点定向、多个斑点之间的空间关系以及至少一个斑点与另一组织结构之间的空间关系中的至少一个来标识基因和染色体。在特定实施例中，所述处理器被编程为：测量标识为基因的多个斑点的尺寸和相对位置。所述处理器也可以被编程为：测量标识为染色体的多个斑点的尺寸和相对位置。

所述存储器可以存储指令，以估计所述细胞核的形态。所存储的指令可以是形态算法。可以执行所述形态算法，以估计例如组织或其部分的尺寸、位置、形式和结构。在一些实施例中，基因形态算法用于估计与基因对应的信号，并且染色体形态算法用于估计与染色体对应的信号。

所公开的技术的至少一些实施例包括一种基于计算机的系统，被配置为：通过将细胞的图像从RGB色彩空间转换为L*a*b色彩空间来增强标本的彩色图像中的特征的色彩，并且针对每个像素计算将L、a和b值线性组合来计算灰度图像。所述系统可以通过利用多个高斯差分滤波器对增强的彩色图像进行滤波来产生表示可能的感兴趣特征的斑点蒙片。可以选择滤波器以及关联的参数，以给出对图像中在大小和形状方面显现为感兴趣斑点的像素的强响应以及对图像中的所有其它像素的最小响应。所述基于计算机的系统可以被配置为：增强包括基因、基因产物、染色体、标志、标记或蛋白质等的宽范围的感兴趣特征的色彩。

在一些实施例中，一种分析器，包括：存储器，用于存储程序指令序列以及已被染色以使得不同的感兴趣特征在图像中不同地显现的组织样本的图像。所述分析器被配置为：执行指令，以便增强感兴趣特征的外观，对所增强的图像进行滤波以检测可能表示图像中的不同感兴趣特征的区，以及测量用于表示所述感兴趣特征的区的一个或更多个度量。在特定实施例中，所述度量包括图像特性度量或形态度量或这两者。所述度量可以应用于分类器，所述分类器确定所述区是否表示感兴趣特征。所述分析器可以对图像或其部分中的不同的所标识的特征的数量进行计数。

在一些实施例中，计算机系统可以被编程为：自动地确定任何感兴趣区。基于一个或更多个选择准则来选择候选特征，包括基于样本形态（例如细胞成分形态、细胞形态、组织形态、解剖结构形态等）、组织特性（例如密度或成分等）、空间参数（例如组织结构的排布或各组织结构之间的相对位置等）、或图像特性参数等的准则。如果所述候选特征是核，则所述选择准则可以包括但不限制于核形态（例如形状、尺寸、成分等）、空间参数（例如细胞结构中的核的位置、各核之间的相对位置等）、图像特性、或它们的组合等。在选择候选核之后，可以自动地使用算法来执行定量分析，以估计HER2基因/染色体17比例。在一些实施例中，如果想要的话，则用户可以基于图像的视觉检查来手动地改动所述感兴趣区。如果想要的话，则可以在没有人工介入的情况下分析一批载片。可以对感兴趣区进行评分。在一些实施例中，用户可以在逐载片的基础上删除任何感兴趣区。例如，用户可以在视觉上确定自动地选择的视场不适合于评分。用户可以然后从另一处理删除所选择的视场。

附图说明

专利或申请文件包含以彩色来执行的至少一个附图。具有彩色附图的该专利或专利申请公开的副本将在请求和支付必要费用时提供给专利局。相同的参考标号贯穿各个视图提及同样的部分或动作，除非另外指定。

图1示出根据所公开的技术的实施例的用于分析标本的基于计算机的系统；

图2示出根据所公开的技术的实施例的允许用户查看所选择的细胞核以及计算机系统所执行的细胞分析的结果的说明性用户接口（“UI”）屏幕；

图3图解根据所公开的技术的实施例的连同检测到的HER2基因和染色体17以及针对所产生的细胞所计算的统计一起显示细胞的用户接口窗口；

图4示出根据所公开的技术的实施例的用于分析细胞核物质的计算机实现的方法的工作流程图；

图5图解根据所公开的技术的实施例的所选择的细胞的数量、从细胞创建的斑点蒙片图像以及所检测到的遗传物质；

图6是根据所公开的技术的实施例的用于分析标本的方法的流程图；以及

图7示出根据所公开的技术的实施例的用于制备并且分析标本的系统。

具体实施方式

在此公开的技术的至少一些实施例涉及用于分析细胞物质的计算机系统和方法，特别是涉及用于检测细胞中的过表达的基因的系统。虽然在此所描述的示例性实施例检测HER2基因的表达水平（例如过表达或欠表达），但是将领会技术可以用于检测细胞中的其它基因或其部分以及其它感兴趣特征。

图1示出用于分析标本的基于计算机的标本分析器。分析系统10包括成像装置12和计算机系统14。标本承载显微镜载片可以被加载到成像装置12中。成像装置12产生标本的图像。图像或者通过直接连接或者经由网络20而被发送到计算机系统14。计算机系统14将图像显示给用户。用户（例如病理学家、细胞科学家或实验室技术员等）可以选择图像的一个或更多个区以用于估计。计算机系统14可以通过对具有感兴趣特征的区进行评分来协助用户。

成像装置12可以包括但不限制于一个或更多个图像捕获设备。图像捕获设备可以包括但不限制于相机（例如模拟相机、数字相机等）、光学器件（例如一个或更多个透镜、传感器聚焦透镜组、显微镜物镜等）、成像传感器（例如电荷耦合器件（CCD）或互补金属氧化物半导体（CMOS）图像传感器等）、或摄影胶片等。在数字实施例中，图像捕获设备可以包括多个透镜，其协作以证实实时（on-the-fly）聚焦。CCD传感器可以捕获标本的数字图像。产生数字图像的一种方法包括：确定包括显微镜载片的区域的扫描区，所述显微镜载片的区域包括标本的至少一部分。扫描区可以被划分为多个快照。可以通过组合快照来产生图像。在一些实施例中，成像装置12产生整个标本的高分辨率图像。

计算机系统14可以包括台式计算机、膝上计算机或手写板等，并且可以包括数字电子电路、固件、硬件、存储器、计算机存储介质、计算机程序或处理器（包括编程处理器）等。图1的所图解的计算系统14是具有屏幕16和塔柜（tower）18的台式计算机。塔柜18可以以二进制形式来存储数字图像。图像也可以被划分为像素的矩阵。像素可以包括由比特深度定义的一个或更多个比特的数字值。数字值可以表示例如通过图像处理所得到的能量、亮度、色彩、强度、声音、高度（elevation）或分类值。非限制性的示例性数字图像格式包括但不限制于比特映射的联合图像专家组（JPEG）、标签的图像文件格式（TIFF）和图形互换格式（GIF）以及其它数字数据格式。

网络20或直接连接将成像装置12和计算机系统14进行互连。网络20可以包括但不限制于一个或更多个网关、路由器、桥或其组合等。网络20可以包括一个或更多个服务器以及用户可访问的一个或更多个网站，并且可以用于发送并且接收计算机系统14可以利用的信息。服务器可以包括但不限制于用于存储信息（例如数字图像、算法或染色协议等）的一个或更多个关联数据库。网络20可以包括但不限制于使用传输控制协议（TCP）、用户数据报协议（UDP）、互联网协议（IP）以及其它数据协议的数据网络。

标本可以是根据原位杂交（“ISH”）协议所处理的乳腺组织样本。ISH协议可以通过将核苷酸的互补链（例如探针）杂交为感兴趣序列而在冷冻组织切片、固定/石蜡包埋的组织切片或其它细胞制备中提供特定核酸序列（例如DNA、mRNA等）的可视化。ISH协议可以包括但不限制于双SISH和红色ISH协议、单红色ISH协议或单SISH协议等。为了确定HER2/染色体17比例，成像装置12捕获包括银色原位杂交信号或红色原位杂交信号等的图像。基于与HER2基因和染色体17对应的信号来对组织进行评分，以确定HER2/染色体17比例。基于该比例，确定标本的HER2基因是被放大还是未被放大。为了自动地对乳腺组织样本进行评分，可以选择候选核以用于定量分析。计算机系统14自动地对不同的特征（例如HER2基因、染色体17等）进行计数，并且确定特征的数量的比例。可以对附加核进行评分。可以至少部分地基于比例来作出诊断。结果可以显示在屏幕16上。为了估计组织样本（例如乳腺组织）是否是癌，计算机系统14可以通过估计HER2基因信号的数量对于染色体17信号的数量的比例来协助用户通过例如检测基因的放大来获得关于所选择的区域的信息。在此使用的术语“检测”包括定量检测或定性检测或这两者。在特定实施例中，生物样本包括细胞或组织。

分析系统10可以执行关于图2到图7所讨论的方法和技术。分析系统10的组件和特征可以混合并且匹配于图2到图5以及图7的系统的其它组件和特征。

图2图解根据所公开的技术的允许用户与分析细胞的基于计算机的标本分析器进行交互的用户接口（UI）屏幕的部分。可以通过以下步骤来制备组织样本形式的标本：使用鸡尾酒测定（assay）进行染色，将已染色的组织安装在载片上，并且利用可以与计算机系统100关联的或可以是分离组件或系统的高分辨率成像装置来对载片进行成像。组织样本的彩色数字图像存储在本地或远程计算机可读存储介质（硬盘或固态存储器等）中并且显示在显示器110上。

在显示器110上示出计算机系统100所创建的说明性用户接口200。UI 200包括窗口202，其示出组织样本或其部分的图像。用户使用选择工具（鼠标、操纵杆、图标（诸如套索（lasso）工具或一个或更多个击键（key stroke））或其它机构）来选择在图像中显示为视场（“FOV”）的组织的部分。窗口210中示出所选择的视场内的组织的放大视图。用户可以然后利用选择工具来选择单独的细胞/核以用于分析。所图解的用户选择的边界（以绿色图解）通常与核膜对应。可以分析边界内的图像的部分。替换地，计算机系统可以采用细胞/核检测算法以选择多个细胞。检测算法可以基于例如图像特性参数、组织形态、组织特性、空间参数或它们的组合等来确定边界。如本领域技术人员将领会那样，所公开的技术所检测到的遗传物质显现在细胞的核中。因此，为了本公开的目的，术语“细胞”和“核”以及它们的复数形式被看作同义的。通过以可以看见的色彩来对细胞描画轮廓，通过遮蔽细胞的区或其它手段来在窗口210中突出所选择的细胞。

为了分析而选择的单独细胞的彩色图像显示在UI 200的底部处的细胞托盘214中。如果用户手动地标识细胞，则每个这样的所标识的细胞的图像可以放置在细胞托盘214中。如果计算机系统100自动地标识细胞，则可以在细胞托盘214中包括每个这样的自动地标识的细胞的图像。替换地，用户可以手动地确认选择待在细胞托盘214中包括的自动地标识的细胞中的一个或更多个。

用户接口200还包括一个或更多个窗口216，其显示针对细胞托盘214中所包括的细胞核所计算的分析的结果。在一个实施例中，分析确定HER2基因的数量对于针对FOV中所标识的每个这样的细胞所发现的染色体17的数量的比例。如上面所指示的，该比例可以指示特定类型的癌症。作为整体针对每个所标识的细胞和载片所确定的HER2/染色体17比例的结果存储在用于对应载片的记录中。用户可以在无需对HER2基因和染色体17进行可能非常耗时并且乏味并且因此倾向于出错的视觉计数的情况下方便地查看HER2/染色体17比例。自动化评分处理可以减少诊断所耗费的时间，并且因此增加实验室生产量。附加地，自动化处理可以提供一致并且可靠的评分，以增强解释精度。

在一个实施例中，利用条码、机器可读码（例如一维或多维条码或infoglyph、RFID标签、布拉格衍射光栅、磁带或纳米条码）或一些其它类型的电可检测标识符来对每个载片进行标记，以便例如将分析的结果匹配于特定载片。如果载片被重新插入计算机系统的（包括载片查看器的）成像装置中，则所确定的统计可以被从计算机可读存储介质回调并且对于用户而被显示。附加地或替换地，针对载片中的组织所执行的分析的记录可以经过计算机通信链路（例如互联网）传输到远程计算机系统以用于查看、存储或分析。这样的记录可以与其它组织样本的分析组合，以用于各种目的，诸如医疗研究等。计算机也可以产生一个或更多个关于用于患者的记录中的内含物（inclusion）的组织分析的报告。一旦对细胞托盘214中所包括的细胞执行了分析，用户就可以退出分析，或可以选择组织样本的图像中的另一FOV。

图3图解在选择细胞托盘214中的单独细胞时UI所产生的代表性窗口300。窗口300包括所选择的细胞的图像302（连同显示区304一起），显示区304指示细胞中所检测到的HER2基因和染色体17的数量。如果想要的话，则用户可以超控（override）自动地检测到的HER2基因或染色体17的数量。多个控制件306允许用户保存用于细胞的结果或者进行取消。控制件308允许用户翻动遍历细胞托盘中的细胞中的每一个。控制件308包括：倒回按钮，用于返回到细胞托盘中的第一细胞；后退按钮，用于允许用户返回到细胞托盘中的前一细胞；下一细胞按钮，用于允许用户前进到细胞托盘中的下一细胞；以及快进按钮，用于允许用户前进到细胞托盘中的最后细胞。按钮310允许用户从细胞托盘删除所示出的细胞。按钮312允许用户打开并且关闭细胞边界的轮廓以及细胞边界内的分别指示检测到的HER2基因和染色体17的位置的黑色斑点和红色斑点的图像。按钮314允许用户包括已经针对用于载片的报告中的细胞计算的统计。最后，按钮316允许用户超控用于任何特定细胞的计算机所确定的统计，并且输入它们的自身的针对细胞的HER2基因和染色体17的数量的估计。

图4示出根据所公开的技术的用于分析细胞的方法的一个代表性工作流程图。虽然为了便于解释而将所示出的动作描述为按特定顺序执行，但是将领会，在仍获得所描述的功能的同时，可以改变动作的顺序，可以省略动作，或执行附加动作。

在一个实施例中，计算机系统14、100包括一个或更多个处理器，利用非瞬态计算机可读介质上所存储的一系列计算机可执行指令而对一个或更多个处理器编程。当被执行时，所述指令引起计算机系统的一个或更多个处理器从用户接收一个或更多个FOV的指示。在一个实施例中，计算机系统然后执行引起一个或更多个处理器分段或标识所选择的FOV中所包含的细胞核的边界的指令。在一个实施例中，计算机系统100执行指令以自动地标识细胞核的边界。在另一实施例中，计算机系统执行指令以从使用选择工具的用户接收细胞核的指示。在一个实施例中，所标识的每个细胞核的图像被放置到用户接口200内的细胞托盘中。

一旦在细胞托盘中选择了用于分析的想要数量的细胞，计算机系统就执行指令以检测每个所标识的细胞核内的信号（例如，斑点）。在一个实施例中，通过将细胞的彩色图像转换为单色图像来首先标识斑点。在一个实施例中，通过首先将细胞的彩色图像的色彩空间从RGB色彩空间变换到L*a*b色彩空间来创建单色图像。在L*a*b色彩空间中，“L”通道表示像素的亮度，“a”通道反映像素的红色分量和绿色分量，并且“b”通道表示像素的蓝色分量和黄色分量。新的图像然后被创建，其强调通过线性组合在每个像素位置处的“L”、“a”和“b”的值而获得的图像中的红色和黑色的色彩。

通过使得红色和黑色增强的图像运行通过多个滤波器而在增强的图像中检测斑点。在一个实施例中，滤波器是高斯差分（“DOG”）滤波器，其中，基于待检测的斑点的期望大小的斑点/团块（clump）来选择每个滤波器大小。在一个实施例中，DOG滤波器的大小范围从大约0.05微米到大约5微米。组合来自每次通过DOG滤波器的结果以创建用作蒙片的滤波的灰度图像，以表示每个细胞内的已染色的核物质和某种“废物”。

然后基于Otsu方法使用例如自适应赋阈值技术来对所组合的灰度图像进行二值化，以产生斑点蒙片图像，其中，斑点外部的一切具有一个二进制值（例如逻辑0），并且斑点内部的一切具有相反的二进制值（例如逻辑1）。

一旦已经创建斑点蒙片图像，其就与分类器一起使用以去除与废物关联的任何斑点，并且留下表示HER2基因和染色体17的斑点。在一个实施例中，使用线性二进制分类器—虽然其它分类器同样可应用。在使用分类器的第一级中，计算机系统执行指令以基于针对所分析的细胞中的每一个所确定的响应的柱状图来修剪掉具有弱DOG响应的斑点。

在第二级中，通过分析在与斑点蒙片图像中的斑点中的每一个内的区对应的像素位置处的组织的RGB图像的色彩，来使暗红色斑点与浅红色斑点分离，并且使黑色斑点与深蓝色斑点分离。结果是仅红色斑点和黑色斑点的集合。其余的斑点被看作废物并且被去除。然后使用连接分量分析来提取斑点和斑点小块（blob）。

为了确定斑点表示HER2基因还是染色体17，测量并且分析斑点（包括斑点小块）的多个度量。这些度量包括斑点大小、色彩、定向、形状、多个高斯差分滤波器的响应、相邻各斑点之间的关系或距离以及计算机可以测量的多个其它因素。度量然后被输入到分类器中。分类器先前已经在已由受训练的病理学家、细胞科学家或其它个人或包括这些核特征的计算机模型的机器积极地标识为表示HER2基因或染色体17的训练数据集上被训练。

在一个实施例中，分类器已经在包含斑点变化性的范围的训练载片集合上被训练，并且已经针对每个级教导了线性边际二进制分类器模型。由区分超平面所参数化的所得到的模型将特征空间划分为限定HER2基因或染色体17的两个被标定的区域。

一旦已经训练分类器，对于图像中的未知斑点所测量的度量就应用于分类器。分类器可以然后指示表示什么类型的斑点（例如HER2基因或染色体17）。

一旦斑点已经被分类，它们就由计算机系统计数。如果计算机系统确定斑点的大小在标称单个斑点大小的规模上，则然后斑点被计数为如分类器所标定的HER2斑点或染色体17斑点。如果斑点大于标称单个斑点大小，则然后计算机系统确定簇的区，并且将其按标称斑点的区进行划分，以确定斑点簇中可能包括多少斑点。在计数算法中使用分类为HER2和染色体17的斑点的封闭性。

一旦已经对斑点进行分类并且计数，就基于每细胞并且基于每FOV来对结果进行记分（tally）。斑点类型的比例被计算并且作为整体针对每个细胞和载片而被显示。基于比例，可以将表达水平确定为过表达、欠表达等。在一个实施例中，如果组织样本中的HER2基因对于染色体17的比例超过例如2.2，则将组织样本标识为过表达的。这样过表达的HER2基因可以指示癌。

计算机系统14，100可以执行形态算法以估计图像中的一个或更多个特征。基因形态算法可以通过例如以下步骤来估计彩色图像中的信号：测量斑点尺寸中的一个或更多个，估计斑点形状、估计斑点定向，估计多个斑点之间的空间关系，以及估计至少一个斑点与组织样本的另一解剖结构之间的空间关系。输出可以被发送到分类器，分类器确定信号是否表示基因。其它类型的形态算法可以用于标识组织的其它特征。输出可以被发送到分类器。

可以通过包括本说明书中公开的结构及其结构等同物的数字电子电路、或计算机软件、固件或硬件、或者它们中的一个或更多个的组合来实现本说明书中描述的主题内容和操作的实施例。该说明书中所描述的主题内容的实施例可以实现为一个或更多个计算机程序，即在计算机存储介质上所编码的计算机程序指令中的一个或更多个模块，以用于由数据处理装置执行或控制数据处理装置的操作。

计算机存储介质可以是或可以包括于计算机可读存储设备、计算机可读存储衬底、随机或串行存取存储器阵列或设备或它们中的一个或更多个的组合中。此外，虽然计算机存储介质不是所传播的信号，但计算机存储介质可以是在人工地生成的传播信号中所编码的计算机程序指令的源或目的地。计算机存储介质也可以是或可以包括于一个或更多个分离的物理组件或介质（例如多个CD、盘或其它存储设备）中。该说明书中所描述的操作可以实现为数据处理装置对一个或更多个计算机可读存储设备上所存储的或从其它源接收到的数据所执行的操作。

术语“编程处理器”涵盖用于处理数据的所有种类的装置、设备和机器，通过示例的方式包括可编程微处理器、计算机、片上系统或上述中的多个或上述的组合。装置可以包括特定目的的逻辑电路（例如FPGA（现场可编程门阵列）或ASIC（专用集成电路））。除了硬件之外，装置还可以包括创建用于所讨论的计算机程序的执行环境的代码，例如构成处理器固件、协议栈、数据库管理系统、操作系统、跨平台运行时环境、虚拟机或它们中的一个或更多个的组合的代码。装置和执行环境可以实现各种不同的计算模型基础架构，诸如web服务、分布式计算和网格计算基础架构。

可以通过任何形式的编程语言（包括编译或解释语言、说明性或过程性语言）来写计算机程序（也已知为程序、软件、软件应用、脚本或代码），并且可以通过任何形式（包括作为单机程序或作为模块、组件、子例程、对象或适合于在计算环境中使用的其它单元）来部署它。计算机程序可以但无需与文件系统中的文件对应。程序可以存储在保存其它程序或数据（例如标记语言文档中存储的一个或更多个脚本）的文件的部分、专用于所讨论的程序的单个文件、或多个协调的文件（例如存储一个或更多个模块、子程序、或代码的部分的文件）中。计算机程序可以被部署为在位于一个地点或跨多个地点而分布并且通过通信网络而互连的一台计算机或多台计算机上执行。

执行一个或更多个计算机程序的一个或更多个可编程处理器可以执行该说明中所描述的处理和逻辑流程，以通过操作输入数据并且生成输出来执行动作。处理和逻辑流也可以由特定目的的逻辑电路（例如FPGA（现场可编程门阵列）或ASIC（专用集成电路））执行，并且装置也可以实现为特定目的的逻辑电路。

通过示例的方式，适合于执行计算机程序的处理器包括通用和特定目的的微处理器这两者、以及任何种类的数字计算机的任何一个或更多个处理器。通常，处理器将从只读存储器或随机存取存储器或这两者接收指令和数据。计算机的必需组件是用于根据指令执行动作的处理器以及用于存储指令和数据的一个或更多个存储器设备。通常，计算机也将包括用于存储数据的一个或更多个大规模存储设备（例如磁盘、磁光盘或光盘），或可操作地耦接以从大规模存储设备接收数据或将数据传递至大规模存储设备或进行这两者。然而，计算机无需具有这些设备。此外，仅举几个例子来说，计算机可以嵌入另一设备（例如移动电话、个人数字助理（PDA）、移动音频或视频播放器、游戏控制台、全球定位系统（GPS）接收机或便携式存储设备（例如通用串行总线（USB）闪速驱动器））。适合于存储计算机程序指令和数据的设备包括所有形式的非易失性存储器、介质和存储器设备，通过示例的方式包括示例半导体存储器设备（例如EPROM、EEPROM和闪存储器设备）；磁盘（例如内部硬盘或可拆卸盘）；磁光盘；以及CD-ROM和DVD-ROM盘。处理器和存储器可以由特定目的的逻辑电路补充或被合并到其中。

为了提供与用户的交互，本说明书描述的主题内容的实施例可以实现在具有用于将信息显示给用户的显示设备（例如LCD（液晶显示器）、LED（发光二级管）显示器或OLED（有机发光二级管）显示器）以及用户通过其可以将输入提供给计算机的键盘和指点设备（例如鼠标或轨迹球）的计算机上。在一些实现中，触摸屏可以用于显示信息并且从用户接收输入。其它种类的设备同样可以用于提供与用户的交互；例如，提供给用户的反馈可以是任何形式的感觉反馈（例如视觉反馈、听觉反馈、或触觉反馈）；并且可以通过任何形式（包括声学、话音或触觉输入）来接收来自用户的输入。此外，计算机可以通过将文档发送到用户所使用的设备并且从用户所使用的设备接收文档来与用户进行交互，例如，通过响应于从web浏览器接收到的请求而将网页发送到用户的客户机设备上的web浏览器。

可以在包括后端组件（例如，如数据服务器）或包括中间件组件（例如应用服务器）或包括前端组件（例如具有用户通过其可以与本说明书描述的主题内容的实现进行交互的图形用户接口或Web浏览器的客户机计算机）或一个或更多个这样的后端、中间件、或前端组件的任何组合的计算系统中实现本说明书中描述的主题内容的实施例。系统的组件可以通过任何形式的数字数据通信的介质（例如通信网络）而互连。通信网络的示例包括局域网（“LAN”）和广域网（“WAN”）、因特网（例如互联网）以及点对点网络（例如ad hoc点对点网络）。例如，图1的网络20可以包括一个或更多个局域网。

计算系统可以包括任何数量的客户机和服务器。客户机和服务器通常彼此远离，并且典型地通过通信网络而交互。客户机和服务器的关系借助在相应计算机上运行并且具有对彼此的客户机-服务器关系的计算程序而产生。在一些实施例中，服务器将数据（例如HTML页面）传输到客户机设备（例如目的是将数据显示给与客户机设备交互的用户并且从用户接收用户输入）。可以在服务器处从客户机设备接收在客户机设备处所生成的数据（例如用户交互的结果）。

图6是用于分析标本的方法的流程图400。在402，选择组织标本的图像中的候选特征。可以通过计算机系统或用户来选择候选特征。

在410，标识信号。在HER2/染色体17比例分析中，第一原位杂交信号（例如斑点）指示HER2基因，并且第二原位杂交信号（例如斑点）指示染色体17。可以对这些不同的杂交信号进行计数。

在412，估计各信号之间的关系。在特定实施例中，确定所计数的信号的比例。可以估计各信号之间的其它类型的关系。

方法400可以重复任何次数，以估计任何想要的感兴趣区。计算机系统可以基于包括图像特性度量、形态度量或其组合等的度量来确定感兴趣区。针对一个或多个感兴趣区可以确定合计分数、平均分数或其它类型的分数。至少部分地基于分数，病理学家可以作出诊断。

图7示出能够通过评分来执行组织制备的分析系统10。标本处理装置210可以对标本执行一个或更多个制备处理。制备处理可以包括但不限制于：对标本进行脱蜡，调理标本（例如细胞调理）、对标本进行染色，执行抗原修复，执行免疫组化染色（包括标定）或其它反应，和/或执行原位杂交（例如SISH、FISH等）染色（包括标定）或其它反应，以及其它用于制备用于显微镜、微观分析、质谱方法或其它分析方法的处理。

标本可以包括组织样本。组织的样本可以是目标可以出现于其中或出现于其上的任何液体、半固体或固体实物（或物质）。特别是，组织样本可以是从生物组织获得的生物样本或组织样本。组织可以是在有机体内执行相似功能的互连细胞的集合。在一些示例中，从动物物体（诸如人体）获得生物样本。生物样本可以是从任何活的有机体获得、由任何活的有机体排泄或分泌的任何固体或流体样本，活的有机体包括但不限制于单细胞有机体（诸如除了其它以外，还有细菌、酵母、原生动物和阿米巴）、多细胞有机体（诸如植物或动物，包括来自健康或明显健康的人体或受待诊断或调查的状况或疾病（例如癌症）影响的人类患者的样本）。例如，生物样本可以是从例如血液、血浆、血清、尿、胆汁、腹水、唾液、脑脊液、水性或玻璃体液、或任何身体分泌物、漏出液、渗出液获得的生物流体（例如从脓肿或任何其它感染或炎症的位点获得的流体）或从结合部（例如正常结合部或受疾病影响的结合部）获得的流体。生物样本也可以是从任何器官或组织（包括活检或尸检标本，肿瘤肿瘤活检）获得的样本，或可以包括任何细胞、组织或器官所调理的细胞（无论原代细胞还是培养细胞）或介质。在一些示例中，生物样本是核提取物。在特定示例中，样本是质量控制样本，诸如所公开的细胞团（cell pellet）切片样本中的一个。在其它示例中，样本是测试样本。例如，测试样本是从获得自对象的生物样本制备的细胞、组织或细胞团切片。在示例中，对象是处于风险或已经取得特定状况或疾病的对象。在一些实施例中，标本是乳腺组织。

处理装置210可以将固定剂应用到标本。固定剂可以包括交联剂（诸如醛类（例如甲醛、多聚甲醛和戊二醛）以及非醛类交联剂）、氧化剂（例如金属离子和络合物，诸如四氧化锇和铬酸）、蛋白质变性剂（例如醋酸、甲醇和乙醇）、未知机制的固定剂（例如氯化汞、丙酮和苦味酸）、组合试剂（例如Carnoy固定剂、Methacarn氏液、Bouin流体、B5固定剂、Rossman流体和Gendre流体）、微波以及杂类固定剂（例如排除量固定（excluded volume fixation）或蒸汽固定（vapor fixation））。

如果标本是石蜡中所包埋的样本，可以使用适当的（多种）脱蜡流体来对样本进行脱蜡。在废物去除器去除（多种）脱蜡流体之后，任何数量的物质可以连续地应用到标本。物质可以用于预处理（例如蛋白质交联，暴露核酸等）、变性、杂交、清洗（例如转渍膜清洗（stringency wash））、检测（例如将可视或标记分子链接到探针），放大（例如放大蛋白质、基因等）、复染色或盖片等。

标本处理装置210可以将宽范围的物质应用于标本。所述物质包括但不限制于染色剂、探针、试剂、清洗剂和/或调理剂。物质可以是流体（例如气体、液体或气体/液体混合物）等。流体可以是溶剂（例如极性溶剂、非极性溶剂等）或溶液（例如水性溶液或其它类型的溶液）等。试剂可以包括但不限制于染色剂、湿润剂、抗体（例如单克隆抗体、多克隆抗体等）或抗原恢复流体（例如基于水性或非水性的抗原恢复溶液、抗原恢复缓冲液等）等。

探针可以是附接到可检测的标定或报告分子的隔离核酸或隔离合成寡核苷酸。标定可以包括放射性同位素、酶底物、辅因素、配体、化学发光或荧光剂、半抗原和酶。例如，探针可以包括但不限制于半抗原标定的特定结合部分（binding moiety）、DNA探针（例如DNP标定的DNA探针）、硝基芳基染料（nitroaryl）化合物、二硝基苯酚、缺电子芳香化合物、探针杂交溶液或其它类型的ISH探针。ISH可以牵涉标定的互补DNA或RNA链（即探针），以将特定DNA或RNA序列定位在组织（原位）的部分或切片中，或者如果组织足够小，则定位在整个组织中（完全安装ISH）。

在一些实施例中，处理装置210所应用的鸡尾酒测定包括不同的试剂。例如，一个鸡尾酒测定包括ULTRAVIEW SISH检测工具（文塔纳医疗系统（Ventana Medical Systems）公司，物品编号 780-001）、INFORM HER2 DNA探针（文塔纳医疗系统公司，物品编号 780-4332）、Rabbit反DNP抗体（文塔纳医疗系统公司，物品编号 780 -4335）、Rabbit 反HER2（4B5）抗体（文塔纳医疗系统公司，物品编号 800-2996）、ULTRAVIEW通用碱性磷酸酶红色检测工具（文塔纳医疗系统公司，物品编号 760-501）、银清洗（文塔纳医疗系统公司，物品编号 780-002）和/或INFORM染色体17探针（文塔纳医疗系统公司，物品编号 780-4331）。另一鸡尾酒测定是（文塔纳医疗系统公司）所销售的INFORM HER2双ISH DNA探针，其包括INFORM HER2双ISH DNA探针鸡尾酒（文塔纳医疗系统公司，物品编号 800-4422）、HybReady（文塔纳医疗系统公司，物品编号 780-4409）、ultraView SISH DNP检测工具（文塔纳医疗系统公司，物品编号 800-098）、ultraView 红色ISH DIG 检测工具（文塔纳医疗系统公司，物品编号 800-505）、ultraView Siler Wash II（文塔纳医疗系统公司，物品编号 780-003）和/或HER2 双ISH 3合1 Xenograft Slides（文塔纳医疗系统公司，物品编号 783-4332）。可以使用其它鸡尾酒测定。鸡尾酒测定可以用于定量检测经由包括胃-食道连接部的人类乳腺癌和胃癌的福尔马林固定的、石蜡嵌入的组织标本中的两个彩色显色ISH的HER2基因的放大，并且可以协助评估对其来说赫赛汀（曲妥珠单抗）可以是治疗选项的患者。在再一其它协议中，鸡尾酒测定是文塔纳医疗系统公司销售的VENTANA HER2 DNA探针测定，物品编号 800-4422。题为“MULTICOLOR CHROMOGENIC DETECTION OF BIOMAKERS”的美国专利申请No.11/809,024（与美国专利公开No.2008/299555对应）以及题为“METHOD FOR CHROMOGENIC DETECTION OF TWO OR MORE TARGET MOLECULES IN A SINGLE SAMPLE”的美国专利申请No.11/809,024（与美国专利公开No.2011/0136130对应）公开了物质、协议和标本处理技术，并且被通过对其整体进行引用而合并到此。

标本处理装置210可以是自动化装置，诸如文塔纳医疗系统公司销售的BENCHMARK XT设备和SYMPHONY设备。文塔纳医疗系统公司是公开用于执行自动化分析的系统和方法的很多美国专利的受让人，包括美国专利No.5,650,327、5,654,200、6,296,809、6,352,861、6,827,901和6,943,029以及美国公开专利申请No.20030211630和20040052685，其中的每一个被通过对其整体进行引用而合并到此。替换地，可以手动地处理标本。

在处理标本之后，用户可以将标本承载载片运送到成像装置12。门13可以打开，以加载装置12。输入设备17（图解为控制面板）用于操作装置12。成像装置12可以是明视野成像器或其它类型的载片扫描仪。一种明视野成像器是文塔纳医疗系统公司销售的iScan Coreo™明视野扫描仪。在自动化实施例中，成像装置12是如题为“IMAGING SYSTEM AND TECHNIQUES”的国际专利申请No.PCT/US2010/002772（专利公开No.WO/2011/049608）中所公开的或题为“IMAGING SYSTEMS, CASSETTES, AND METHODS OF USING THE SAME”的2011年9月9日提交的美国专利申请No.61/533,114中所公开的数字病理设备。国际专利申请No.PCT/US2010/002772和美国专利申请No.61/533,114被通过对其整体进行引用而合并到此。在其它实施例中，成像装置12包括耦接到显微镜的数字照相机。

用户可以使用图7的计算系统14来控制处理装置210并且从数字化载片图像的数据库选择图像。用户可以选择一个或更多个感兴趣区以用于分析。计算机系统14自动地对每个感兴趣区中的信号进行计数，以确定是否充足数量的SISH信号和红色ISH信号出现，以用于HER2/染色体17比例的足够精确的估计。结果被显示给用户。如果用户决定继续分析任何特定感兴趣区，则用户具有这样的选项：或是选择待包括在估计中的核的集合，或是使用算法来自动地标识候选核。用户可以删除通过使用算法所标识的任何候选核。在一些实施例中，分析标本的整个图像以用于定性分析。可以针对标本确定整体计数。用户可以然后确定是否将分析聚焦在特定标本区上。

针对SISH信号和红色ISH信号检查所选择的核中的每一个。针对每个核估计SISH对于红色ISH的比例。组合所选择的核中所发现的SISH信号和红色ISH信号，以形成用于整个感兴趣区的HER2/染色体17比例。用户可以接受作为用于该样本的官方注释的结果。替换地，用户可以丢弃结果并且基于例如核的不同集合或新的感兴趣区等而重新开始处理。贯穿处理，结果以数字或图像形式显示给用户。基于结果，用户可以介入或继续。除了这种互动的或用户辅助的方法以外，计算机系统14还可以自动地分析每个区而无需任何人员介入。用户可以基于分析来控制标本处理装置210的操作以改进后续标本处理。

本说明书中所提及的和/或申请数据表单中所列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开被通过对其整体进行引用而合并到此。如果需要的话则可以修改实施例的各方面，以采用各个专利、申请和公开的构思来提供再进一步的实施例。

根据前述将领会，虽然为了图解说明的目的而在此已经描述了本发明特定实施例，但在不背离本发明精神和范围的情况下，可以作出各种修改。相应地，除了由所附权利要求来限制之外本发明不受限制。

Claims (19)

1.一种用于检测组织样本中的基因的表达水平的基于计算机的系统，包括：

存储器，用于存储程序指令序列；以及

可编程处理器，其被配置为：执行所述指令，以便：

接收组织样本的彩色图像；

基于细胞核的形态来标识所述彩色图像中被不同地染色的所述细胞核的基因和染色体；以及

确定所标识的所述基因与所述染色体的比例，以确定所述组织样本中的所述基因的表达水平。

2.如权利要求1所述的基于计算机的系统，其中，所述彩色图像包括至少一个斑点，其中，所述处理器被编程为：通过估计斑点尺寸、斑点形状、斑点定向、多个斑点之间的空间关系、以及至少一个斑点与所述组织样本中的另一解剖结构之间的空间关系中的至少一个来标识所述基因和所述染色体。

3.如权利要求1所述的基于计算机的系统，其中，所述处理器被编程为：通过将细胞的图像从RGB色彩空间转换为L*a*b色彩空间来增强所述组织样本的所述彩色图像中的所述基因和所述染色体的色彩，并且针对增强的彩色图像中的每个像素计算L、a、b的线性组合。

4.如权利要求3所述的基于计算机的系统，其中，所述处理器被编程为：通过利用多个高斯差分滤波器来对增强的彩色图像进行滤波而产生可能表示基因和染色体的斑点蒙片。

5.如权利要求4所述的基于计算机的系统，其中，所述处理器被编程为：通过凭借计算斑点和/或所述像素的度量并且将所述度量供给至分类器来分析所述斑点的区内的所述细胞的所述彩色图像中的所述像素而确定所述斑点表示基因还是染色体，所述分类器被训练为基于所确定的度量中的一个或更多个来分离基因与染色体。

6.一种用于检测组织样本中的基因表达的基于计算机的系统，包括：

存储器，用于存储所述组织样本的图像；以及

处理器，其被配置为：执行指令序列以分析所述组织样本的图像，以便确定用于所述组织样本的被染色区域的多个度量并且将所述度量供给至分类器，所述分类器标识所述被染色区域表示细胞中的基因还是染色体；对所检测到的基因和染色体的数量进行计数，并且计算所检测到的基因对染色体对于所检测到的染色体的数量的比例，以确定基因是否为过表达的。

7.一种用于组织标本的自动化评分的方法，包括：

a）从所述组织标本的数字图像选择用于定量分析的所述组织标本中的候选核；

b）借助于计算机自动地对来自所述数字图像的第一原位杂交信号和第二原位杂交信号进行计数；以及

c）估计所述第一信号与所述第二信号的计数的比例，并且报告所述比例。

8.如权利要求7所述的方法，其中，所述第一原位杂交信号包括银色原位杂交信号，并且其中，所述第二原位杂交信号包括红色原位杂交信号。

9.如权利要求7所述的方法，其中，自动地选择所述核。

10.如权利要求7所述的方法，其中，所述组织标本包括乳腺癌标本，并且其中，所述方法还包括步骤：d）放大所述组织标本中出现的HER2基因。

11.如权利要求7所述的方法，其中，对所述数字图像中的第一视场执行步骤a）至c），并且其中，所述方法还包括：针对所述数字图像的第二视场重复步骤a）至c）。

12.一种用于组织标本的自动化评分的方法，包括：

a）将第一原位杂交探针和第二原位杂交探针应用于所述组织标本；

b）随后获得所述组织标本的数字图像；

c）在所述数字图像中选择视场；

d）在所述视场内，选择用于定量分析的候选核；

e）自动地在所述候选核中对来自所述第一原位杂交探针的第一信号以及来自所述第二原位杂交探针的第二信号进行计数；以及

f）估计所述第一信号与所述第二信号的计数的比例。

13.如权利要求12所述的方法，还包括：针对所述数字图像中的第二视场，重复步骤d）、e）和f）。

14.如权利要求12所述的方法，其中，所述组织标本包括乳腺癌标本，并且其中，所述方法还包括步骤：g）报告所述比例。

15.如权利要求12所述的方法，其中，自动地执行步骤c）。

16.如权利要求15所述的方法，其中，自动地执行步骤d）。

17.如权利要求12所述的方法，还包括：g）显示所述视场和所述比例的图像。

18.如权利要求12所述的方法，其中，步骤c）包括：分析来自所述第一原位杂交探针和所述第二原位杂交探针的信号的色彩平衡，并且如果所述色彩平衡满足预定准则，则选择所述视场。

19.一种细胞分析器，包括：

存储器，用于存储程序指令序列以及已经被染色从而基因和染色体在图像中不同地显现的组织样本的所述图像；

一个或更多个处理器，其被配置为：执行所述指令，以便增强所述图像中的被染色的基因和染色体的外观，对所增强的图像进行滤波以检测可能表示所述图像中的基因和染色体的区，测量用于可能表示所述图像中的基因和染色体的所述区的多个度量，并且将所述度量应用于分类器，所述分类器确定所述区表示基因还是染色体；

其中，所述一个或更多个处理器进一步被配置为：对所述图像中的所确定的基因和染色体进行计数，以确定所述组织样本中的基因表达水平。