CN101228283A - 检测及定量表示多个亚细胞成分的方法 - Google Patents

Abstract

提供了一种用于检测及定量表示来自细胞样本的多个具有唯一性的荧光信号的方法。该方法将免疫组织化学和荧光示踪的原位杂交技术结合起来。该方法可用于识别诸如染色体和蛋白质等特定的亚细胞成分。

Description

检测及定量表示多个亚细胞成分的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2004年9月22日提出的、序号为60/612,067的美国临时专利申请的权益，在与本发明所公开内容不相违背的情况下，通过引用将其全部公开内容并入本文中。

技术领域

本发明涉及一种使用免疫着色和荧光示踪原位杂交技术来检测以及定量表示细胞的多个亚细胞成分的方法。具体地讲，免疫着色与原位杂交的组合允许对细胞中的亚细胞成分的检测，例如对母体血液样本中的胎儿血红蛋白的检测。该方法可用于遗传性疾病的产前和/或胚胎植入前的诊断。

背景技术

存在多种用于对细胞及其成分进行着色和分析的技术。同时应用多种这样的技术的能力非常有益于遗传性疾病诊断中对试样的详细研究，这一能力已引起人们特别的关注。然而，现有技术的组合并不具有任何优于仅采用单一技术的优势。具体地说，例如同时把免疫着色和荧光原位杂交(FISH)分析应用于一个生物试样的能力提供了同时获得例如有关同一细胞的特定蛋白质与核酸成分的定量数据的潜力。然而，传统的或标准的免疫着色和FISH协议互相排斥。成功的FISH分析所需的严酷的条件通常与明显可识别抗原的保持力不相容，或者与用于对细胞成分进行适当检测的基于稳定抗体的信号的持续性不相容。因此，在使用以可视化与定量技术的确定遗传目标的遗传疾病的诊断方面，需要开发更好的技术。

发明内容

提供了一种用于为免疫着色和原位杂交分析准备生物试样的单一连续的方法。

在一个实施例中，提供了一种用于标识细胞中的多个细胞成分的方法，该方法包括：

使细胞样本与至少一种抗体发生反应，其中，每一抗体结合于一种特定的细胞成分，并且生成唯一的荧光信号；

使用一个或多个核酸探针通过原位杂交处置所述细胞样本，其中，把每个核酸探针被构造为与所述细胞中的一个目标核酸序列杂交，并且生成唯一的荧光信号；

生成经过所述反应和处置的细胞样本的一个或多个图像；以及

在所述图像中检测和分析与所述抗体和所述核酸探针相对应的荧光信号。

附图说明

在各附图中，其中相同的标号表示相同的图元：

图1为一个流程图，概要性地描述了本发明的一个实施例的方法；

图2为用于本发明的一个方面的一个实施例的分析系统的方框图；

图3为旨在检测第一信号的阶段I的流程图；

图4A和4B共同为旨在检测第一信号的阶段II的流程图；

图5为检测第二信号的流程图；

图6为使用连续涂片技术、说明本发明的一个实施例的一个装置的一种变体的示意性表示；

图7为用于本发明的一个方面的一个实施例的分析与试剂配制系统的方框图；

图8概要性地描述了本发明的一个实施例，其中使用了多物镜显微镜检查系统；

图9为一种图像“合成”方法；

图10为本发明的一个实施例的校准步骤的流程图；

图11为本发明的一个实施例的预处理步骤的流程图；

图12A和12B为本发明的一个实施例的主处理步骤的流程图；

图13为采用例子1中所描述的、在细胞中通过免疫着色和使用FISH的X与Y染色体识别胎儿血红蛋白的本发明的方法所准备的组合式细胞免疫着色和FISH分析的显微照片。

具体实施方式

在此处所描述的实施例中，提供了一种用于检测和定量表示细胞样本中的细胞的亚细胞成分的方法。可以把该方法应用于包含细胞的多种生物样本，例如血液样本，特别是用于母体血液中遗传性疾病的诊断。

在一个实施例中，所述方法包括产生荧光信号，该荧光信号是通过免疫着色一个或多个抗体生成的，其中对于每一所使用的抗体来说，信号是唯一的，并且持续到用于荧光原位杂交(FISH)分析的细胞样本的接下来的后续处理。在一个实施例中，所述方法包括为所采用的FISH探针选择一个所希望的或唯一的荧光团，从而允许所产生的所有荧光信号的离散的可视化以及定量表示，荧光免疫组织化学信号和FISH信号都是从细胞样本发荧光的。

在一个实施例中，提供了一种操作计算机系统，以检测在样本中是否存在由至少一个目标核酸所定义的遗传条件的方法。该方法涉及对杂交于样本的探针的数字化图像和探针的使用，以及计数对象和对检测遗传条件是否存在的统计期望的分析。例如，所述计数可能涉及对检测出遗传异常的次数进行计数，并且把计数结果与一种特定组织型、细胞类型或样本中的异常的统计期望进行比较。所述计数可能涉及对出现遗传异常的次数进行计数，并且把计数结果与一个细胞类型出现在同一样本中的次数进行比较，或者与一个正常核酸出现在同一样本中的次数进行比较。所述计数可涉及对一个以上不同的遗传异常出现在单个细胞中的次数进行计数。所述计算机系统还可用于标识细胞类型、对细胞进行计数，检查细胞形态等，以及把这一信息与遗传异常的计数结果加以比较或关联。可以进行各种诊断分析。

在一个实施例，提供了一种操作计算机系统，以检测在一个固定样本中是否存在由至少一个目标核酸定义的遗传条件的方法。该方法包括：接收该固定样本的数字化图像，优选的是彩色图像，其中所述固定样本已经受了专门把一个荧光体示踪探针与目标核酸杂交的条件下的荧光原位杂交以及荧光免疫着色，以检测所关注的第一对象；在计算机中处理所述图像，以分隔第一对象，例如一种细胞成分；确定显示与专门预先确定的特征中的目标核酸相关的探针的所关注的第一对象；对具有探针信号的所关注的第一对象进行计数；以及针对检测遗传条件是否存在的统计期望，分析第一对象的计数结果，例如细胞的计数结果。该方法适合于许多遗传条件，包括其中遗传条件为人类三染色体(trisomy)21的情况。除了以上的描述外，还应该认识到，例如，统计期望可以基于组织类型。所述计算机可用于识别所考察细胞的组织类型，但组织类型也可以是已知的。

在某些实施例中，接收的步骤还包括以下步骤：产生一个代表所接收的彩色图像中的相应像素位置处的红、绿以及蓝强度的红、绿和蓝像素的图像文件。在某些实施例中，所述处理的步骤还包括以下步骤：手工选择背景中的多个像素；确定对应于背景的部分的颜色强度值范围；以及将具有所确定的范围内的颜色强度值的图像的区域识别为背景。在某些实施例中，在测量的步骤之前，可以在计算机中进行处理，以过滤彩色图像，从而使彩色图像中的暗像素的颜色强度值变亮，并使彩色图像中的亮像素的颜色强度值变暗。过滤步骤还可以包括：使彩色图像穿过一个孔填充过滤器；使填充的彩色图像穿过一个腐蚀过滤器；对腐蚀过的填充的彩色图像执行分隔操作，以定义各区域周围的轮廓；通过执行逻辑非操作，选择轮廓内的像素；以及在所选择的像素和填充的彩色图像之间执行逻辑与操作。

在某些实施例中，根据目标核酸与第二核酸的比率，进一步定义遗传条件。然后，该方法还包括：识别具有与第二核酸相关的特定的预定特征的第二对象；以及对所识别的第二对象进行计数；其中，分析第一对象的计数结果包括：得到第一对象的计数结果与第二对象的计数结果的比率。在某些实施例中，目标核酸定义了显性特征，第二核酸定义了对应的隐性特征。这些实施例中的方法可以包括：根据所得到的比率将遗传条件指示为具有显性特征、具有隐性特征、或者具有显性特征并携带隐性特征。当目标核酸为第二核酸的重新排列时，所述方法还可以包括：选择所述探针与重新排列和非重新排列的核酸之间的突变区域杂交。最后，该方法可以包括把遗传条件指示为与所得到的比率相关的严重度。

根据本发明的一个实施例，提供了一种计算机软件产品，包括：计算机可读存储媒体，其中安装了一计算机指令序列，该计算机指令序列指示计算机系统对一个已通过特定于目标的荧光体加以示踪的、在包含细胞的样本中的目标物质的出现进行计数，所述指令指示了下列步骤：接收荧光体示踪的样本的数字化的彩色图像；获取荧光体示踪的样本的彩色图像；把所关注的对象与彩色图像中的背景相分隔；测量所关注的对象的参数，以列数具有特定特征的对象；以及针对统计上期望的列数结果，分析对象的列数结果，以确定遗传异常。可以使所述指令实现以上所描述的方法的所有变体。

根据本发明的另一个实施例，提供了一种用于分析已通过特定于目标的荧光体加以示踪的、在包含细胞的样本的图像的装置，该装置包括：计算机系统，在其上执行图像处理软件；以及存储媒体，其中安装了图像处理指令序列，该图像处理指令序列包括：接收荧光体示踪的样本的数字化的彩色图像；获取荧光体示踪的样本的彩色图像；把所关注的对象与彩色图像中的背景相分隔；测量所关注的对象的参数，以列数具有特定特征的对象；以及针对统计上期望的列数结果，分析对象的列数结果，以确定遗传异常。而且，可以改变所述指令，以实现以上所描述的所有变体。

在又一个实施例中，提供了一种处理体液或组织样本图像数据的计算机实现的方法，该方法包括创建代表在第一放大倍数下所取的体液或组织样本的图像的第一图像数据集合的一个子集，所述子集代表一个可以包含稀有细胞的候选斑点；创建代表在第二放大倍数下所取的候选斑点的图像的第二图像数据集合的一个子集，第二数据集合的该子集代表稀有细胞，把第二数据集合的这一子集存储在计算机存储器中，测量所关注的对象的大小和颜色参数，以识别具有与目标核酸相关的特定的预定特征的对象，对在测量步骤中识别的对象进行计数，以及针对统计上期望的计数结果分析对象的计数结果，以检测是否存在遗传异常。

在一个实施例中，提供了一种包括下列步骤的方法：在计算机中进行测量、处理以便过滤彩色图像，使彩色图像中的暗像素的颜色强度值变亮，并使彩色图像中的亮像素的颜色强度值变暗。过滤可以包括下列步骤：使彩色图像穿过一个孔填充过滤器；使填充的彩色图像穿过一个腐蚀过滤器；对腐蚀过的填充的彩色图像执行分隔操作，以定义各区域周围的轮廓；通过执行逻辑非操作，选择轮廓内的像素；以及在所选择的像素和填充的彩色图像之间执行逻辑与操作。

在一个实施例中，可以通过使用计算机化的显微镜图像系统观察来自体液或组织样本的单层细胞的光场，创建第一图像数据集合的一个子集，以检测指示稀有细胞存在与否的信号。在一个实施例中，该方法还可以产生一个代表所接收的彩色图像中各像素位置处的红、绿以及蓝强度的红、绿以及蓝像素的图像文件。根据本发明的某些方面，所述处理还包括手工选择背景中的多个像素；确定对应于背景的部分的颜色强度值范围：以及将图像中具有所确定范围内的颜色强度值的区域识别为背景。在一个实施例中，可以测量所述信号，以判断其是否为一个有效信号电平。可以把第一和/或第二数据子集变换为更适合于由此处描述的计算机加以控制与处理的表示方式，例如，把图像数据从红绿蓝(RGB)信号变换成色调亮度饱和度(HLS)信号。利用过滤器和/或掩模区分那些满足预先选择的准则的细胞，并且消除那些不满足预先选择的准则的细胞，因而可以识别例如稀有细胞。

在本发明的另一个实施例中，提供了一种操作实验室业务的方法，该方法包括下列步骤：接收体液或组织样本，创建体液或组织样本涂片，使用荧光免疫着色剂对涂片中所关注的对象进行免疫着色；使用设计用于与具有诊断意义的核酸序列杂交的荧光探针来处置涂片；操作一个计算机化的显微镜，以使软件程序能够自动地根据免疫着色剂和核酸探针所生成的荧光信号识别具有诊断意义的杂交的核酸序列的关注对象。

在本发明的又一个实施例中，提供了一种计算机软件产品，该计算机软件产品包括计算机可读存储媒体，该计算机可读存储媒体中安装了指令序列，当计算机执行该指令序列时，这一指令序列指示执行检测具有诊断意义的核酸序列的关注对象的步骤。这些步骤包括：创建代表在第一放大倍数下所取的体液或组织样本的图像的第一图像数据集合的一个子集，所述子集代表可以包含所关注的对象的候选斑点，例如，一个细胞或稀有细胞(10000个细胞中少于1个)，创建代表在第二放大倍数下所取的候选斑点的图像的第二图像数据集合的一个子集，第二图像数据集合的所述子集代表了所关注的对象，把第二数据集合的这一子集存储在计算机存储器中，测量与荧光核酸探针相关的荧光，其中所述荧光核酸探针指向与所关注的对象相关的所关注诊断的一个核酸序列，以识别具有与目标核酸相关的预定特征的对象；对在测量步骤中所识别的对象进行计数；以及针对统计上所期望的计数结果分析对象的计数结果，以检测是否出现遗传异常。

根据本发明的一个实施例，提供了一种为诊断过程准备细胞样本的方法。获取细胞的样本，并且在一个基片上将其固定为一个单层，细胞样本包括按每10000个细胞中不多于1个的比率(即不大于0.01％)存在于样本中的稀有细胞。使用指向稀有细胞的荧光免疫着色剂对所述单层进行免疫着色，然后使用指向与某一疾病状态或异常相关的核酸序列的一个荧光体探针对其进行处置。使用计算机化的显微镜图像系统，观察覆盖细胞样本的至少一部分的光场，以发现指示稀有细胞和所关注的核酸序列存在与否的荧光信号。为了诊断过程，检测每一个信号，并且识别检测到信号所在的坐标。显示与某一疾病状态或异常相关的核酸序列的稀有细胞的计数结果可以用于进行诊断。可以由计算机化的显微镜系统自动地进行一个试验性的诊断。在一个实施例中，稀有细胞按不大于细胞的0.001％的比率出现。在其它实施例中，稀有细胞按不大于0.0001％、0.00001％、甚至0.000001％的比率出现。

在本发明的另一个实施例中，待检测和诊断的稀有细胞类型是在来自动物或病人的细胞样本中所发现的癌细胞。所述样本可以为包含细胞的血液或其它体液或者组织切片。作为这一实施例的一个说明，在第5部分中所描述的癌细胞标记物，即infia，例如GM4蛋白质、端粒酶蛋白质或核酸、以及p53蛋白质或核酸，可按一种由本发明的具体应用所确定的方式被用于第一或第二信号的生成。

在本发明的一个实施例中，当稀有细胞类型存在于样本中时，本发明的方法按不小于80％的频度检测稀有细胞类型。在其它实施例中，检测频度不小于85％、90％、95％以及99％。

根据本发明的一个实施例，提供了一种为诊断过程准备血液样本的方法，该方法包括：准备包含自然存在浓度的胎儿细胞的未浓缩母体血液的样本的涂片；利用指向所述胎儿细胞的荧光免疫着色剂来处置所述涂片；利用指向所关注核酸序列的荧光核酸探针来处置所述涂片；使用计算机化的显微镜图像系统观察覆盖涂片的一部分的光场，以寻找指示胎儿细胞是否存在的荧光信号；以及利用来自所述核酸探针的荧光信号，识别具有所关注核酸序列的胎儿细胞。

在一个实施例中，所述信号被进一步处理，以表示稀有细胞的形态学测量结果。在另一个实施例中，利用示踪标签(label)处置细胞，以增强稀有细胞与其它细胞的光学区别。在这一实施例中，例如，信号可以来自有选择地结合于稀有细胞的示踪标签。在另一个实施例中，诊断过程涉及移至所识别的坐标，并且放大光场，直至图像为一个孤立的稀有细胞。

在某些实施例中，令光场跨过基本覆盖所有细胞的一系列细胞部分。例如，可以通过在计算机化的显微镜图像系统的控制下，相对计算机化的显微镜图像系统的透镜移动基片上的细胞，从而实现这一点。在另一个实施例中，识别在其处获得第一信号的坐标，然后，在已经识别出所述坐标之后，专门接触在这些坐标处的稀有细胞。

在某些实施例中，可以使用诊断信号来识别稀有细胞。在其它一些实施例中，可以使用定位信号来识别稀有细胞，并且在细胞被定位后获得诊断信号。

在一个实施例中，稀有细胞按每10000个细胞中不多于一个(即，不大于细胞的0.001％)的比率存在于样本中。在其它实施例中，稀有细胞按不大于0.001％、0.00001％、甚至0.000001％的比率存在。在一个特别重要的实施例中，稀有细胞为来自母体血液的细胞样本中的胎儿细胞。优选地，样本仅包含自然存在浓度的胎儿细胞，其可以不大于0.001％、0.0001％、0.00001％、0.000001％、甚至0.0000001％。

在以上实施例中的任何一个实施例中，例如，可以在一个显微镜载物片上准备细胞，或者基片可以具有一个坐标系，可以针对基片校准该坐标系，以致可以把一个步骤中识别的稀有细胞的坐标接下来返回到另一个步骤。同样，各实施例中的基片具有10倍于宽度的长度，基片沿一个方向明显被拉长。长度甚至可以20倍于宽度。基片可以为一种柔性薄膜。在一个重要的实施例中，是可以承载相当大量的细胞的细长的柔性薄膜，例如，通过相当大量的涂抹的母体血液提供大量细胞。在以上实施例中的任何一个实施例中，可以选择来自免疫着色剂的荧光信号和来自核酸探针的荧光信号，从而当两者均出现时，它们不互相屏蔽。

根据多个实施例，这样的方法可以使用未浓缩的和浓缩的样本，例如包含自然存在的胎儿细胞的母体血液。

当结合附图，阅读以下对本发明和本发明的各示例性实施方式的详细描述时，可以更好地理解本发明。尽管这一详细描述针对胎儿细胞、稀有细胞类型以及作为体液的血液或组织样本对本发明进行解释，但本领域中的技术人员将会清楚地意识到，事实上，本发明适合于并且包含基于任何细胞类型和任何体液或者组织样本的诊断，特别是样本在基片上被沉积为单层细胞的情况。

落入本发明的范围的体液和组织样本包括但不局限于血液、组织切片、脊髓液、脑脊膜液、尿液、肺泡液等。对于那些细胞非自然存在于单层中的组织样本，可以利用本领域技术人员熟知的标准技术分离细胞。这些技术包括但不局限于组织的胰蛋白酶、胶原酶或者分散酶(dispase)处置。

在一个实施例中，本发明用于检测和诊断胎儿细胞。在一个示例性的实施方式中，荧光免疫着色剂可用于指示细胞身份。例如，免疫着色剂可以为针对例如血红蛋白ε-链(即，胎血红蛋白)结合于抗体的荧光染料。另外，也可以使用对每一细胞与有核红细胞的特征形态的相似性的度量来定义细胞身份，其中，可以使用细胞识别算法辨别所述相似性。

可以根据核酸探针信号(或者免疫着色剂信号与核酸探针信号的组合)进行诊断。

在一个示例性的实施方式中，FISH包括把稀有细胞类型例如胎儿细胞的变性测试DNA与变性双氧(DIG)示踪的基因组探针杂交。包含测试DNA的样本被冲洗，并且被允许结合于与某一荧光团耦合的抗DIG抗体。可选地，通过以荧光团配对的抗Fab抗体进行培养，增加第二层荧光团(例如FITC)。在一个实施例中，FISH包括把稀有细胞的变性DNA与一个包括同源于一个或多个直接通过特定荧光团示踪的特定目标DNA区域的DNA序列的荧光示踪的探针相杂交。

可以通过一种在光场中把所关注的对象与其它对象和背景相区别的装置与方法，实现自动化样本分析。我们的1994年10月4日授权的序号为5,352,613的美国专利中公开了自动化系统的一个例子。另外，一旦已经识别出对象，则可以测量和存储颜色，即包括对象的像素的红、绿、蓝分量的组合，或者与对象相关的其它关注的参数。

遗传条件的自动化样本分析与诊断可以按下列方式进行：(i)接收所固定样本的数字化的彩色图像，其中，所固定样本在专门把一个荧光体示踪的探针与目标核酸杂交的条件下，已经历了荧光原位杂交；(ii)在计算机中处理彩色图像，以把所关注的对象与彩色图像中的背景相分离；(iii)测量用于识别具有特定特征的对象的所关注对象的参数；(iv)计数识别出的对象；以及(v)针对统计上预期的计数结果，分析对象的计数结果，以确定遗传条件。该方法可用于诊断与染色体数目和/或排列方面的一个畸变相关的遗传条件。因此，例如，本发明可用于通过使用检测重新排列的染色体段和该段被易位到其中的染色体的示踪探针的组合，来检测染色体的重新排列。更一般地讲，也可以使用体现本发明的这一方面的方法，加上适当选择的荧光探针，来检测包括易位、删除和插入的三染色体、遗传放大以及重新排列。

此处所使用的“遗传异常”指的是相对于从一个健康受检者，即从一个具有正常染色体组的个体所获得的染色体的数目和/或排列而言，一个或多个染色体在相应的数目和/或排列方面的畸变。例如，遗传异常包括通常少则大约15个基对，多则整个的染色体的核苷酸序列所特征化的染色体的增加、删除、放大、易位以及重新排列。遗传异常还包括基因点突变。

所述方法可用于确定固定样本(即附着于固体支架的样本)中的一个或多个遗传异常，其中优选的是已按一种可保持包含在其中的细胞和亚细胞成分的结构的完整性的方式对样本进行了处置。用于把一个包含样本的细胞固定于一个固体支架(例如玻璃载物片)的方法是本领域中的普通技术人员十分熟悉的。

样本可以包含至少一种目标核酸，目标核酸的分布指示了遗传异常。所述“分布”，指的是在已知包括目标核酸的一种或多种核酸(例如染色体)中的目标核酸的存在、不存在、相对数量和/或相对位置。在一个实施例中，目标核酸指示了三染色体21，因此，该方法可用于诊断唐氏综合征。在一个实施例中，从母体周围血液中得到旨在用于唐氏综合征分析的样本。更具体地讲，根据标准的规程，把细胞从周围血液中孤立出来，根据标准的规程(例如，参见“例子”)，把细胞附着于一个固体支架，以准许对目标核酸的检测。

荧光原位杂交指的是一种核酸杂交技术，该技术采用荧光体示踪探针专门与目标核酸杂交，从而有助于该目标核酸的可视化。这样的方法是本领域中的普通技术人员十分熟悉的，而且，例如，序号为5,225,326的美国专利、序号为07/668,751的美国专利申请、PCT WO94/02646中公开了这样的方法，特将这些专利的全部内容以引用的方式并入此处。总体上讲，原位杂交可用于确定在包含核酸的样本中的核酸的分布，例如，其中包含核酸的样本包含在诸如单细胞级的组织中。这样的技术已被用于染色体组型应用，以及用于检测包含在细胞中的特定基因的存在、不存在和/或排列。然而，对于染色体组型，在把细胞附着于固体支架用于执行原位杂交反应之前，通常允许样本中的细胞增殖，直至获得“分裂中期扩散”的分裂中期(metaphase)。

简而言之，荧光原位杂交涉及把样本固定于一个固体支架，并且通过把样本与一个包含至少一种沉淀剂和/或一种交联剂的介质相接触，保持包含在其中的成分的结构完整性。“例子”中描述了用于“固定”样本的示范性的试剂。可选的固定剂是本领域中的普通技术人员十分熟悉的，例如，以上所提到的专利和/或专利出版物中对它们进行了描述。

可以通过对目标核酸进行变性，以致其能够与包含在杂交溶液中的补偿探针杂交，借此进行原位杂交。可以把固定的样本并行地或顺序地与变性剂和杂交溶液相接触。于是，在一个实施例中，把固定的样本与包含变性剂和至少一个寡核苷酸探针的杂交溶液相接触。所述探针具有至少与目标核酸的核苷酸序列基本互补的核苷酸序列。杂交溶液可选地包含混合稳定剂、缓冲剂以及选择性膜造孔剂中的一或多种。用于实现一个具体探针与某一具体目标核酸的杂交的杂交条件的优化是本领域中的普通技术人员十分熟悉的。

当提及探针时，短语“基本互补”指的是足以实现本发明目的的补偿量，即在用于实践本发明的杂交条件下，足以准许探针向核酸目标的特定杂交，而不准许把探针与非目标核酸序列相关联。这样的条件是原位杂交技术领域中的普通技术人员所熟悉的。

可针对其使用本发明的遗传异常包括：相对于从一个具有正常染色体组的个体所获得的染色体而言，在一个或多个染色体的数目和/或排列方面存在畸变的遗传异常。可以由本发明加以检测的示范性的染色体包括：人类X染色体、Y染色体以及染色体13、18和21。例如，目标核酸可以为一个完整的染色体，例如染色体21，其中，染色体的3个拷贝的存在(目标核酸的“分布”)指示了遗传异常、唐氏综合征。专门用于与目标核酸(例如，染色体)杂交的示范性的探针为能够被定位到可诊断遗传异常的一个或多个染色体的探针。例如，参见纽约州，纽约McGraw Hill出版的Wilson等人编著的Harrison’sPrinciples of Internal Medicine，第12版(1991)。

本发明的一个实施例旨在通过检测出现于诸如母体周围血液、胎盘组织、绒毛膜绒毛、羊膜水以及胚胎组织中的胎儿细胞的(以下所讨论的)三染色体21，进行唐氏综合征的产前诊断。然而，本发明的方法并不局限于对胎儿细胞的分析。因此，例如，包含目标核酸的细胞可以为真核细胞(例如，人类细胞，包括从血液、皮肤、肺所获得的细胞，并且包括从正常以及瘤源所获得的细胞)、原核细胞(例如，细菌)以及植物细胞。根据一个实施例，本发明用于区分各种病毒的毒株。根据这一实施例，目标核酸可以处于一个无包被病毒或一个包被病毒(具有一个无包被隔膜，例如一个液体蛋白质隔膜)。例如，参见Asgari supra。可以由本发明加以检测的示范性的病毒包括艾滋病毒、肝炎病毒以及疱疹病毒。

可以根据标准的实践，用荧光体(荧光“标签”或“示踪物”)示踪寡核苷酸探针。可以直接把荧光体附着于探针(即，共价键)或者间接附着于探针(例如，可以把生物素附着于探针，并且可以把荧光体共价地附着于抗生物素蛋白；生物素示踪探针和荧光体示踪抗生物素蛋白可以形成一个能够用作本发明的方法中的荧光体示踪探针的复合体)。

可以根据本发明的方法和装置加以使用的荧光体是本领域中的普通技术人员十分熟悉的。这些荧光体包括4，6-二氨基-2phenylindole(DIPA)、异硫氰酸荧光素(FIFC)以及若丹明。例如，参见“例子”。也可参见1983年2月15日授权的、Gribnau等人的、序号为4,373,932的美国专利，特将其内容以引用的方式并入此处，作为根据本发明的方法可加以使用的一列示范性的荧光体。具有互不相同的激发光谱与放射光谱的荧光体的存在准许同时看到单个固定样本中的一个以上的目标核酸。如以下所讨论的，可以使用荧光体的示范对同时看到同一固定样本中的两个不同的核酸目标。

目标核酸的分布为指示遗传异常的指示信息。例如，参见Asgarisupra。可加以检测的遗传异常包括突变、删除、增加、放大、易位以及重新排列。例如，可以通过检测光场中荧光信号的不存在来识别删除。为了检测一个遗传序列的删除，准备多个探针，这些探针对存在于正常细胞中但不存在于不正常细胞中的目标核酸是互补的。如果探针与固定样本中的核酸杂交，则该序列将被检测出来，并且所述细胞将被指定为相对于该序列是正常的。然而，如果探针不能够与固定样本杂交，则检测不到所述信号，并且所述细胞将被指定为相对于该序列为不正常的。根据本领域中的普通技术人员已知的标准实践，适当的控制被包括在原位杂交反应中。

例如，可以通过检测荧光体示踪探针与染色体(目标核酸)的多核苷酸重复段的结合，识别与目标核酸的增加相关的遗传异常。为了检测遗传序列(例如，三染色体21)的增加，准备多个与目标核酸互补的探针。在“例子”中将讨论示踪探针与包含染色体21的3个拷贝的固定细胞的杂交。

可以通过选择一个可专门结合于正常序列和一个被怀疑对其进行了放大、突变、易位或者重新排列的序列之间的核酸目标中的断点的探针，并且执行以上所描述的过程，借此来识别放大、突变、易位以及重新排列。按照这种方式，可以认为荧光信号是目标核酸所产生的，于是可被用来指示在被测样本中遗传异常的存在或不存在。探针可以具有与在正常个体的DNA中而不是异常个体的DNA中跨越断点的核酸序列互补的序列。用于检测遗传异常的探针对于本领域中的普通技术人员来说是十分熟悉的。

可以利用的计算机控制系统的实施方式的开创性特征是由两个或两个以上具有相同光学特征的物镜组成的阵列。这些透镜按行排列，其中每一个透镜具有自己的Z轴移动机构，以致可以分别对它们进行对焦。这一系统可以配备适当的机构，以致可以交换多个物镜框，以满足与普通的单透镜显微镜可以覆盖的同样多的放大需求。

可以把每一个物镜连接于其自己的CCD照相机。可以把每一个照相机连接于图像采集设备。对于每一个所采集的光场，计算机可以把其物理位置记录在显微镜样本上。这可以通过使用一个计算机控制的x-y机械镜台来实现。对照相机提供的图像进行数字化处理，并且将其存储在主机存储器中。

计算机可以保持对正在使用中的物镜阵列的特性以及电动镜台的位置的追踪。在实际的修补工作中，可以把每一图像的所存储的特征用于使该图像与其正确的位置相吻合，即计算机存储器中“合成的”的图像。

主机系统可以由软件系统加以驱动，所述软件系统通过适当的设备驱动程序控制系统的所有机械部件。所述软件可以包括图像合成算法，该图像合成算法对计算机存储器中的数字化图像进行合成，然后把所合成的图像提交其它算法进行处理。通过图像分解、综合以及图像处理，可以检测具体样本所特有的具体特性。

在一个实施例中，同时检测免疫着色剂信号和探针信号。可以分别地处理这些信号(也分别处理来自针对免疫着色剂和探针的不同荧光团的信号)。在一个实施例中，免疫着色剂信号和探针信号在单一坐标系统中的同时出现，甚至因两个成分的相互作用(例如一个伙伴‘信号’对一个信号的抑制)而产生的单个信号可被用于诊断。

通常，用于生成免疫着色剂信号的材料与技术不应不利地干扰用于生成第二探针的材料与技术(至不可接受地危及诊断的程度)，反之亦然。免疫着色剂或探针不应损坏或改变试图测量的细胞特征达到不可接受地危及诊断的程度。最后，总的来说，任何其它所希望的或所需要的对细胞的处置一般都不应该干扰用于生成第一和第二信号的材料或技术达到不可接受地危及诊断的程度。在这些限制下，可以使用任何合适的第一和第二信号发生器。

在本发明的一个实施例中，当要检测一种稀有细胞类型时，本发明的方法按不小于80％的频度检测这一稀有细胞类型。在其它一些实施例中，检测频度不小于85％、90％、95％以及99％。

尽管对单个等位基因加标签的单一荧光团可以创建能够同时测试的突变的数目的上限，然而也可以把对组合化学的使用用于可同时加标签和检测的等位基因具体突变的数目。落入本发明的范围的染色体异常包括，但不局限于三染色体21、18、13以及诸如XXX、XXY、YYY的性染色体畸变。由于使用了组合化学，可以把本发明的方法用于诊断多种重新排列，包括在遗传性疾病和癌症中所观察到的易位。落入本发明的范围的孟德尔氏遗传疾病包括但不局限于囊肿性纤维化、血色素沉着病、高脂血、马方综合症以及结缔组织的任何其它可遗传疾病、血红蛋白病、家族黑蒙性白痴综合症，或者任何其它已知突变的可遗传疾病。组合化学染色的使用允许同时对多个等位基因加标签和检测，从而可以确立诸如哮喘等常见疾病的易患病体质遗传性和/或专门针对癌症(例如前列腺癌、乳房癌、结肠癌、肺癌、白血病、淋巴瘤等癌症)的几种分子标志的存在。

本发明的用途之一是用于癌症领域。通常，特定类型的癌细胞可以从形态上与非癌症细胞的背景相互区别。癌症细胞的形态因此可被用作第一信号。热激蛋白质也为大多数恶性癌瘤中所显示的标志。可以把专门针对热激蛋白质的示踪抗体(例如加荧光标签的抗体)用于生成第一信号。同样，存在着专门针对特定癌症或针对特定组织的抗原，例如专门针对前列腺的抗原，并且可以使用专门针对癌症或组织抗原(例如专门针对前列腺的抗原)的抗体生成针对这样的癌细胞的第一信号。

于是，可以根据本发明识别和特征化以其它细胞为背景的稀有癌细胞。所述特征化可以包括对癌细胞的存在的确诊、对癌症类型的确定、通过确定与癌风险等相关的遗传改变的标志的出现而对癌风险的确定。

遗传改变的标志可以实现对癌风险的估计。它们提供了有关暴露于致癌物质的信息。它们可以及早地检测出因暴露于致癌物质所导致的改变，并且可以识别出具有癌症发展特高风险的个体。这样的标志包括关于膀胱癌中的染色体9的LOH，以及结肠直肠肿瘤发生过程中所检测到的染色体删除和染色体7、17以及8增损。

肺癌的发展要求多种遗传改变。癌基因的激活包括K-ras和真菌。肿瘤抑制基因的灭活包括Rb、p53以及CDKN2。对经历变更的特定基因的识别可用于早期发现注定会变为恶性的细胞，并且准许针对药物和基于基因的疗法识别潜在目标。

在确定三染色体的过程中，本发明考虑到确定单个细胞中的三染色体的存在和/或确定多个细胞中具有三染色体的单个细胞的频度(可以在不知道哪些细胞为三染色体的，即所计数的细胞的总数目，以及所计数的染色体的总数目的情况下，实现这一点)。然后，可以估计三染色体的存在与否或者与三染色体相关的条件的风险。

重要的是应具有这样的一种识别能力：可以对信号进行计数，然后将它们与其它信息(例如，其它信号计数，关于针对不同组织类型的所预期的信号频度的统计信息等)进行比较，以产生相关的诊断信息。

已结合识别一对信号的情况描述了本发明，这对信号中的一个信号用于识别目标稀有细胞，例如胎儿细胞，另一个信号用于估计诸如具有遗传缺陷的胎儿细胞等细胞的状态。应该意识到，根据某些实施例，仅需检测单个信号。例如，在胎儿细胞携带Y染色体，而且针对Y染色体上的异常进行诊断的情况下，则识别遗传异常的信号可以与识别胎儿细胞的信号相同。又例如，在其中所观察的遗传特征为隐性特征的情况下，可以使用单个信号。也可以使用一对信号检测两个等位基因的存在或者以下条件的存在：根据不同基因中的两上或两个以上突变的存在与否对该条件的存在加以诊断。在这些情况下，所述一对信号(甚至多个信号)既可以识别表现型，也可以识别具有该表现型的细胞。这样的实施例对本领域中的普通技术人员是显而易见的。

示例性的实施方式

例子1

下列过程使用免疫着色技术分析血液样本以发现包含胎儿血红蛋白的细胞存在与否，并且利用荧光示踪的原位杂交技术确定相同细胞中的X和Y染色体的存在。

把细胞沉积在适合于显微镜分析的固体支架上，并且用甲醇加以固定。在风干之后，在磷酸盐缓冲生理盐水中漂洗细胞，并且在磷酸盐缓冲生理盐水中以2％的甲醛进一步加以固定。然而，接下来在磷酸盐缓冲生理盐水冲洗细胞、然后利用包含Tween

20的pH7.6的Tris缓冲生理盐水冲洗细胞。在去除多余的液体之后，添加封堵剂，并且在一个湿润箱中培养载物片。在去除了封堵溶液之后，在封堵剂中添加一种原发抗体的稀释物，并且把细胞在一个湿润箱中培养30～120分钟。然后去除抗体溶液，并且利用包含Tween

20的pH7.6的Tris缓冲生理盐水漂洗细胞。去除多余的液体，并且在封堵剂中添加一种抗引诱二抗的稀释物，接下来，把细胞在一个湿润箱中培养30～120分钟。然后去除抗体溶液，再在包含Tween

20的pH7.6的Tris缓冲生理盐水中漂洗细胞。在去除了多余的流体之后，在碱性磷酸酶缓冲液中添加新鲜的、过滤的HNPP/Fast Red染料溶液，并且把细胞样本培养10分钟。去除着色溶液，并且在包含Tween20的pH7.6的Tris缓冲生理盐水中漂洗细胞，然后在包含Tween

20的pH7.6的Tris缓冲生理盐水中用DAPI溶液漂洗细胞。细胞在包含Tween20的pH7.6的Tris缓冲生理盐水中、然后在标准的生理盐水柠檬酸盐中被漂洗两次，去除多余的液体，并且风干细胞。接下来，在37℃下在预热的0.005％的胃蛋白酶中把细胞培养5分钟。然后在磷酸盐缓冲生理盐水中用50mM MgCl2冲洗细胞5分钟，接下来，两次在磷酸盐缓冲生理盐水中冲洗细胞，去除多余的液体，并且使细胞干燥。然后，在杂交过程中添加荧光示踪的FISH探针的溶液，例如DNA和/或RNA，把一个盖玻片盖在包含细胞的载物片的顶部，接下来在湿润箱中在74℃下把细胞培养2.5分钟，然后在37℃下培养4～16个小时。去除盖玻片，并且在室温下在0.4X标准的生理盐水柠檬酸盐中冲洗细胞2分钟。去除多余的液体，并且风干细胞，然后被装载以进行显微镜观察与分析。

例子2

装置

图2的方框图描述了适合于具体实施本发明的这一方面的一个实施例系统的基本元件。这样的系统的基本元件包括X-Y镜台201、水银光源203、配备有电动物镜转动架(换镜旋座)207的荧光显微镜205、彩色CCD照相机209、个人计算机(PC)系统211以及一或两台监视器213、215。

可以定制制造所述系统的各个元件，也可以作为标准部件现货购买。现在，将更详细地描述每一元件。

X-Y镜台201可以为任何适合于与所选择的显微镜205一起使用的电动位置镜台。优选的做法是令X-Y镜台201可以为一个能够连接于个人计算机并且使用专门编译的软件命令进行电子控制的电动镜台。当使用这样一种电子控制的X-Y镜台201时，一个插入到PC211的扩展总线中的镜台控制电路卡把镜台201连接于PC211。还应该能够手工地驱动镜台201。例如此处描述的电子控制镜台由显微镜制造商制造，例如，这些制造商包括Olympus(日本，东京)，以及其它制造商，例如LUDL(美国，纽约)。

例如，荧光显微镜205可以为任何配备有反射光荧光照明装置203和带有20x和油浸60x或63x物镜的电动物镜转动架207，这些物镜提供最大600x的放大倍数。优选的做法是把电动换镜旋座207连接于PC211，并且使用专门编译的软件命令在连续的放大倍数之间电子地进行转换。当使用这样一种电子控制的电动换镜旋座207时，一个插入到PC211的扩展总线中的换镜旋座控制电路卡把镜台201连接于PC211。把显微镜205和镜台201被设置为包括水银光源203，能够提供一致的和基本均匀的全光场的照射。

显微镜205产生供照相机209拍摄的图像。照相机209可以为任何彩色3芯片CCD照相机或者其它连接用于提供电子输出并提供高灵敏度和分辨率的照相机。将照相机209的输出馈送到安装在PC211中的帧抓取器和图像处理器电路板。所找到的一种合适的照相机是SONY930(日本，SONY)。

可以把各种帧抓取器系统与本发明相结合加以使用。例如，帧抓取器可以为MATROX IM-CLD(彩色图像捕获模块)和MATROXIM-640(彩色处理模块)板集合的一个组合，可从MATROX(加拿大，蒙特利尔)获得。MATROX IM-640模块具有板上硬件支持的图像处理能力。这些能力补充了MATROX图像处理库(MIL)软件程序包的能力。因此，它提供了基于MIL的软件算法的极快的执行。MATROX板支持到专用SVGA监视器的显示。除了通常随PC系统211一起使用的监视器外，还提供了这一专用的监视器。可以使用适合于随MATROX图像处理板一起使用的任何监视SVGA监视器。可以结合本发明一起使用的一种专用的监视器为ViewSonic 4E(加利福尼亚Walnut Creek)SVGA监视器。为了具有充分的可用的处理与存储能力，PC211可以为任何具有至少32MB RAM和至少2GB硬盘驱动器存储空间的、基于INTEL PENTIUM的PC。PC211优选地还包括监视器。除了此处所描述的具体特性外，PC211为传统型的，并且可以包括键盘、打印机或者其它所希望的未描述的外部设备。

PC211可以使用MATROX图像处理库(MIL)执行在MICROSOFT C++下编译的涂片分析软件程序。MIL为一个软件函数库，包括那些控制帧抓取器211的操作的函数以及处理帧抓取器211捕获的图像以随后作为盘文件存储在PC211中的函数。MIL包括多个专门化的图像处理例程，这些图像处理例程特别适用于执行诸如过滤、对象选择以及各种的测量功能的图像处理任务。涂片分析软件程序可以作为WINDOWS95应用程序来运行。在计算机监视器213上显示程序提示和测量结果，同时在专用图像处理监视器215上显示通过图像处理硬件211采集的图像。

为了使用涂片分析程序处理显微镜图像，首先校准所述系统。校准补偿了性能方面每天的变化以及从一个显微镜、照相机等到另一个显微镜、照相机等的变化。在这一阶段期间，观察校准图像，并且设置以下的校准参数：

·系统的色彩响应；

·在包含将为了发现胎儿细胞而进行扫描的涂片的载物片上的区域的维度或边界；

·当使用放大倍数20x和60x(或者63x)时，光场的实际维度；以及

·当使用放大倍数20x和60x(或者63x)时，最小与最大胎儿核区域。

对象识别信号的检测

检测算法可以分两个分阶段运行。第一个阶段可为预扫描阶段I，图2的流程图的实施例中对其进行了说明，其中，使用低放大倍数和高速度识别可能的胎儿细胞位置。例如，可以选择20x的物镜，并且可以开始胎儿细胞的搜寻：

·程序把自动镜台(图2，201)移向预先设置的开始点，例如包含涂片的载物片的一角(步骤301)。

·预先设置的开始点处的镜台的x-y位置被记录(步骤303)光场。

·使用CCD照相机209采集光场(步骤305)，并且将其以RBG(红/绿/蓝)图像的形式传送到PC211。

·把RGB图像变换(步骤307)为HLS(色调/亮度/饱和度)表示。

·色调成分被二进制量化(步骤309)为黑白图像，以致可以把具有190和255之间范围的色调值的像素设置为代表关注区域(斑点)的0(黑)，而把每一其它像素值设置为255(白，背景)。斑点代表可能的胎儿细胞核区域。

·测量二进制量化的图像中的每一斑点的面积。按20x放大倍数，如果在大小方面其超出大约20～200个像素的范围，则把斑点的像素设置为值255(背景)；它们被排除在进一步的处理(步骤311、313、315以及317)之外。

·然后，使用定制的MATROX函数计算(步骤319)每一斑点的重心(CG)的坐标。一个斑点的重心为这样一个点：一个薄的、均匀密度的板材在这一点为平衡的。随当前光场的z-y位置一起，把这些坐标存储在一个数据库中，以致可以在下一个处理阶段，使用更高的放大倍数再次定位斑点。

·类似地处理更多的光场，记录每一相继的光场的x-y位置，直至覆盖了整个载物片(步骤321和323)。

图3A和3B的流程图中所说明的阶段II，包括最终胎儿细胞识别过程：

·选择63x放大倍数(步骤401)；

·程序转向自动化阶段(图2，201)，使得较早发现的CG(可能是胎儿细胞核区域)的第一位置的坐标位于光场的中心(步骤403)。

·使用CCD照相机采集光场(图2，209)，并且将其作为RGB图像传送到计算机(步骤405)。

·把RGB图像变换为HLS模式(步骤407)。

·然后，程序通过计数那些亮度值等于每一种可能的亮度值的像素的数目，生成一个亮度直方图(步骤409)。把计数结果存储为长度为256的一个阵列，所述阵列中包含具有与每一索引相对应的灰度级值的像素的计数结果。

·接下来，所述程序对由存储在阵列中的值所表示的亮度分布曲线进行分析(步骤411)，并且定位最后的峰值。已经发现，该峰值包括代表图像中的等离子区域的像素值。分析亮度分布曲线的函数：计算9个点的移动均值以平滑曲线；计算按10个灰度级值间隔的点所定义的线的正切；按度数计算这些线的斜率；找出其中曲线具有0斜率的连续点，如果它们代表一个最小值(曲线中的谷值)，则把这些点(灰度级)设置为-1，否则如果它们代表最大值(曲线中的峰值)，则把这些点设置为1；然后，通过找出灰度级值的阵列中的1或-1的位置，找出曲线中的峰值或谷值的位置。

·然后，所述程序将位于亮度分布的最后峰值之前所出现的亮度分布的谷值中的像素的灰度级值设置为截止(cut-off)值(步骤413)。

·接下来，使用这一截止值，所述程序产生(步骤415)第二二进制量化图像。这是一个黑白图像，其中，与亮度图像中灰度级值低于截止点的像素相对应的像素被设置为255(白)，与亮度图像中灰度级值高于截止点的像素相对应的像素被设置为0(黑)。这一图像的白斑点被视为细胞，而黑色区域被视为非细胞区域。

·闭合过滤器被应用(步骤417)于第二二进制量化图像；在这一方式下，白色区域中的孔，即黑点被封闭。

·此时，所述程序测量细胞的面积。如果细胞中的任何一个细胞的面积小于200个像素，则排除这些细胞，即把组成这些细胞的像素设置为像素值255(黑)(步骤419)。

·把一个在MIL中发现的孔填充函数应用于剩余斑点(步骤421)。

·在处理之后，得到的二进制量化图像为一个其白色区域只表示细胞的掩模。

·现在，基于HLS图像的饱和度成分，把红血细胞与白血细胞加以区分。掩模被用于使处理仅局限于细胞区域。

·此时，所述程序计数饱和度值为每一种可能的饱和度值的像素的数目。把计数结果存储为长度为256的一个阵列，所述阵列包含具有与每一索引相对应的灰度级值的像素的计数结果(步骤423)。

·所述程序对由存储在所述阵列中的值所代表的饱和度分布曲线进行分析(步骤425)，并且确定第一峰值的位置。这一峰值包括代表包含在白血细胞中的区域的像素值。

·把与峰值后的第一最小值(谷值)一致的灰度级值设置为截止点(步骤427)。

·使用这一截止值，所述程序产生(步骤429)第三二进制量化图像。与饱和度图像中灰度级值高于截止点的像素相对应的像素被设置为255(白)。

它们构成红血细胞区域。与饱和度图像中灰度级值低于截止点的像素相对应的像素被设置为0(黑)。该第三二进制量化图像的白斑点为属于红血细胞的区域的种子。

·将闭合过滤器应用(步骤431)于第三二进制量化图像；在这一方式下，白色区域中的孔，即黑点被封闭。

·把一个在MIL中发现的孔填充函数应用(步骤433)于剩余的斑点。

·在处理之后，得到的二进制量化图像为一个仅包含白血细胞的新掩模。

·把一个在MIL中发现的擦除边界斑点函数应用(步骤435)于剩余斑点。去除那些包含与所述图像区域的边界重合的像素的斑点。不能够把这样的斑点包括在进一步的处理中，因为当其与所述图像区域的边界重合时，不知道丢失了多少细胞。

·将腐蚀过滤器应用于这一掩模6次；从而可以切断(步骤437)任何连接的斑点(白血细胞种子)。

·14次应用(步骤439)“粗”过滤器。“粗”过滤器等效于一个扩张(dilation)过滤器。即，其通过在斑点的周围连续地添加一行像素，增大了斑点的尺寸。如果一个正在增长的斑点遇到了一个正在它旁边增长的相邻斑点，则粗过滤器不连接这两个增长的斑点。从而相邻的斑点可以相互分隔。

·使用一个RECONSTRUCTFROMSEED MIL操作符，把第一二进制量化掩模(包含所有细胞)和第三二进制量化掩模(包含白血细胞的分隔的种子)相组合。于是，这样构造出的第四掩模包含第三掩模允许的、从第一掩模拷贝的斑点(细胞)，因此代表了白血细胞(步骤441)。

·测量第四掩模中的斑点，以得到它们的面积与紧致度：面积(A)为一个斑点中的像素的数目；根据斑点的周长(P)和面积(A)，得到紧致度，其等于p2/4(A)。形状盘旋得越厉害，该值就越大。一个圆圈具有最小紧致度值(1.0)。周长为一个斑点的边缘的总长度，为阶梯效应留出了容差，当对菱形边缘数字化时(把内角计算为1.414，而不是2.0)，会产生阶梯效应。仅当斑点的面积处于1000与8000个像素之间，并且它们具有小于3的紧致度时，才把斑点保留在第四掩模中，从而允许细胞具有相当粗略的轮廓。把接触图像边界的斑点排除在进一步的处理(步骤443)之外。

·按下列方式，把第四掩模应用于色调成分(步骤445、447、449以及451)：

·把像素从色调成分拷贝至一个保留它们的色调值的新图像，只要它们的坐标与“掩模”中的白(255)像素一致即可；把新图像中的所有其它像素设置为0(黑)(步骤445)。

·检查每个连续的非0像素区域中的像素值，以找到190和255之间的值，所谓连续非0像素，即那些与红细胞的图像相对应的斑点。对每一个斑点中的这样的像素的数目进行计数(步骤447)。

·如果存在200个以上的这样的像素，则斑点表示一个有核红血细胞。存储每一个这样的细胞的重心的坐标。对掩模进行二进制量化，从而可以把所有具有非0值的像素设置为255(白)；然后，掩模被存储为单独的标签图像文件格式(TIFF)文件(步骤449)。

·所述程序转向与在前一步骤期间存储的任何坐标都不一致的接下来存储的坐标，以找到可能的胎儿细胞。重复整个过程，直至已经识别了预先设置的数目的有核红血细胞。把包括有核红血细胞坐标和相应掩模文件名称的结果随同血液载物片的各种特征代码一起存储在一个结果文本文件中。坐标被存储的有核红血细胞为所寻找的胎儿细胞(步骤451)。

在识别出所关注的对象例如胎儿细胞后，例如通过原位PCR或PCR原位杂交或FISH生成第二信号，如以上所描述的。

诊断信号的检测

把一个所处置的包括原位PCR或PCR原位杂交的涂片放置在镜台(图2，201)上。如果需要，则执行如上所述的校准步骤。校准准许软件补偿性能上日复一日的变化以及从一个显微镜、照相机等到另一个显微镜、照相机等的变化。可以按图4的流程图中所说明的，在一个实施例方法中执行对诊断信号的检测，具体步骤如下：

·选择放大物镜60x(63x)(步骤501)。

·如上所述，根据因检测到第一信号而编译的结果文件中的数据，把x-y镜台移向第一胎儿细胞位置(步骤503)。

·使用CCD照相机(图2，209)采集光场，并且将其作为RGB图像传送到计算机(图2，211)(步骤505)。

·RGB图像被变换为HLS模式(步骤507)。

·把包含黑白掩模的TIFF文件作为单独的图像来加载(步骤509)。

·不对应于掩模弧集中的白色区域的色调成分的像素被设置为0(黑)(步骤511)。

·搜索代表胎儿细胞的剩余区域，以找到与在PCR后产生的信号相对应的像素值。例如，信号可以是因碱性磷酸酶的存在而产生的颜色，即红色。搜索色调成分的非黑色区域，以找到0～30范围内的像素值(步骤513)。

·把镜台移向下一个未处理的胎儿细胞，并且重复上述过程(步骤515)。

PC211执行被称为SIMPLE的软件程序，SIMPLE控制帧抓取器和图像处理器电路217的操作。SIMPLE还处理由帧抓取器和图像处理器电路217捕获的图像，然后，将图像和处理后的数据作为盘文件存储在PC211中。SIMPLE提供了一种基于图标的环境，具有特别适合于执行诸如过滤、对象选择以及测量的图像处理任务的专用例程。大多数SIMPLE任务由操作人员使用连接于PC211的诸如鼠标器或跟踪球(未在图中加以显示)的定位设备加以引导。

为了使用SIMPLE处理图像，必须首先执行多个图像校准步骤。在一个实施例中，把一个使用原位杂交(FISH)技术中的适当着色的新的载物片放置在荧光显微镜下。将要识别的关注对象(即核或染色体区域)具有特定的色彩特性。可以通过组合荧光检测过程，在一个特定的试样中同时描绘多个目标。即，如果使用按不同的波长发荧光的荧光体示踪不同的目标，则可以令软件程序独立地识别发射不同荧光体的对象，假设在图像中可获得全色信息。可以通过所发射的色彩组合来区分对于不同荧光体具有不同亲和力的目标。每一个目标可以按对应于两种或两种以上荧光体的波长发射，然而，例如，每一荧光体的强度不同。因此，在处理期间，使用了显微镜图像的全部3种颜色成分。

对于插入显微镜之下的每一新的试样，首先执行一个预处理过程。图11的流程图描述了本发明的这一实施例的预处理步骤。预处理可用于准许软件补偿试样之间的变化。

在一个实施例中，把包含经FISH处置的细胞的载物片放置在X-Y镜台201中。把X-Y镜台201移向一个被发现包含稀有细胞的初始观察位置。重复执行处理循环，直至已经测量出预定数目的某一具体类型的稀有细胞。在本实施例所针对的应用中，识别多个染色体DNA的目标，执行这一循环直至处理了20～100个核。可以把代表这些核中的染色体区域的测量的数据收集于ASCII文件中。

可以逐个像素地执行过滤步骤12000，具体如下：在步骤12001中，把一个孔填充过滤器应用于图像。可通过SIMPLE语言得到的这一过滤器，通过搜寻亮对象中的暗区域，判断暗孔何时出现在较亮的荧光染色体中。点亮这些区域。把孔填充过滤器的输出保存在一个临时图像文件12101中，并且将其用作对腐蚀过滤器即步骤12003的输入。腐蚀过滤也可以通过SIMPLE语言获得，它用一个小内核中最暗的像素取代该内核的中心像素。所使用的内核可以为3×3。接下来，执行一个单独的操作，即步骤12005，以增长对象，直至它们相遇，但不合并。这一步骤还创建了定义所有对象的边缘的轮廓。逻辑非操作即步骤12007致使轮廓中的像素而非轮廓被选择。最后，在步骤12009中，把步骤12007的结果与所存储的临时图像文件12101进行逻辑与操作。这将导致仅仅在临时图像文件12101中以及在步骤12007的输出中都被定义的那些像素被保留。

如果使用的是荧光检测过程的组合，则可以每个核检测两个以上的染色体区域。因此，就可以识别与染色体21相关的两个染色体区域、与染色体18相关的另外两个染色体区域、与染色体X相关的一个染色体区域以及与染色体Y相关的一个染色体区域，从而能够通过杂交信号的列数发现所检测的可能的数值畸变。在通过一个使用CLIPPER(COMPUTER ASSSOCIATES，加利福尼亚)编译的位于SIMPLE外部的应用程序完成20100核的测量之后，可以执行杂交信号的列数。这一程序读取测量结果ASCII文件，并且根据它们的RGB颜色组合对所检测的染色体区域进行分类。当按组合形式使用两个或两个以上的不同荧光体时，可以使用RGB颜色值的不同的组合区分不同的目标，其中的某些目标可以由一个以上的荧光体加以示踪。例如，可以使用红和绿荧光体对目标进行着色，但一个目标可以接收发射30％红色和70％绿色的荧光体，另一个目标可以接收发射70％红色和30％绿色的荧光体，而第三个目标可以接收仅发射红色的荧光体。可以根据它们的相对的发射，区分这3个目标。如果对于操作员所选择的统计上有意义的水平，指示相应于诸如染色体21的一个具体的染色体的一个染色体区域的信号的数目大于2，则发布一个报告，该报告指出针对具体样本中的三染色体21的增加的可能性。

尽管已经结合对一个包含细胞的样本中的染色体异常的临床检测，描述了本发明，然而此处所公开的图像处理方法也具有其它的临床应用。例如，可以把所描述的图像处理步骤用于尿分析过程的自动化。当把本申请的技术与1993年10月7日提出的、序号为08/132,804的申请的技术相组合时，能够根据细胞的形态可视化与分析种类繁多的细胞类型。为了诊断那些已针对其把细胞形态与一种生理条件相关联的条件，可以观察细胞形态。这样的条件是本领域中的熟练技术人员所熟悉的。例如，参见Harrison supra。可以根据这些技术，检测各种细胞特征与异常。最后，应该加以注意的是，这一特定的样本源并不是对本发明的一种限制，因为可以从血液样本、血清样本、尿样本或者来自子宫颈的细胞样本得到所述样本。此处所描述的细胞可视化和图像分析技术，可用于能够根据所孤立的细胞的形态或其它特征，通过单个细胞的分析加以检测的任何条件。

可商业性地获得专门针对人类胎儿血红蛋白(新泽西州的Research Diagnostics公司)和针对胚胎小正数血红蛋白链(乔治亚州的Immuno Rx公司)的抗体，并且可将它们用作荧光示踪的抗体，或者可以利用荧光示踪的二抗生成荧光信号。如本领域人们所熟悉的，可以由用于稀有细胞的其它类型的着色剂或示踪标签产生荧光。这一处理步骤所需的荧光着色类型是本领域的技术人员熟悉的，将不对其进行更详细的讨论。

计算机和图像处理技术正在不断地变化。显然，应将那些满足以上所描述的方法与装置的需求而未在此处特别加以描述的更新的技术视为落入本发明的范围。例如，以上提到了某些传统的像素和图像文件格式，但也可以使用其它的像素和图像文件格式。可以使用目前本领域技术人员熟悉的JPEG或GIF技术或尚在加以开发的其它技术来压缩图像文件。可以在RGB颜色描述空间而不是在当前所使用的HLS空间执行处理。也可以使用其它颜色空间，如技术人员所希望的，特别是当通过其可以加强对广受欢迎的特征进行检测时。

已结合本发明的多个具体的实施例对本发明进行了描述。至此，本领域中的熟练技术人员应明显意识到，应把更多的变化视为落入本发明的范围，本发明范围仅由此所附的权利要求及其等效的权利要求加以限制。

在本发明的实施例中，说明了用于检测诸如产前和子宫中胚胎植入前的遗传诊断中或者胚胎或胎儿细胞的性染色体中的染色体异常，对细胞的亚细胞成分进行分析的一个例子。

图13为针对细胞中胎儿血红蛋白的出现和X与Y染色体的识别，对细胞的一个组合的免疫着色与FISH分析的一个显微照片。样本中出现胎儿血红蛋白，由从细胞所检测的橙色荧光信号，以及该图左下限中的细胞的整个细胞质加以显示。在细胞的核中，把X与Y染色体分别描述为绿、浅绿、红色荧光点。

Claims (15)

1.一种用于识别细胞中的多种细胞成分的方法，该方法包括：

使细胞样本与至少一种抗体发生反应，其中，每一抗体结合于一种特定的细胞成分并且生成唯一的荧光信号；

使用一个或多个核酸探针，通过原位杂交处置所述细胞样本，其中，每一核酸探针被构造为与所述细胞中的目标核酸序列杂交并且生成唯一的荧光信号；

生成所述经过反应和处置的细胞样本的一个或多个图像；以及

在所述一个或多个图像中检测和分析与所述抗体和所述核酸探针相对应的荧光信号。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，细胞样本为血液样本。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，血液样本为外周血液样本。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，血液样本来自怀孕妇女。

5.根据权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：和一个控制相对照来定量表示所述荧光信号。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，一个或多个核酸探针被构造为与所述细胞样本中的X和/或Y染色体杂交。

7.一种操作计算机系统以检测由至少一个目标核酸定义的遗传条件是否存在于细胞样本中的方法，该方法包括下列步骤：

对具有杂交的、荧光示踪的、目标为核酸的探针以及指向所关注的细胞的非核酸成分的荧光免疫着色剂的固定样本进行成像，其中，探针与免疫着色剂的荧光示踪标签不同；

检测来自所述样本的荧光；以及

确定显示来自所述免疫着色剂和所述探针的荧光的所关注对象的数目，以及

根据显示来自所述免疫着色剂和所述探针二者的荧光的细胞的所述数目的统计期望，判断所述遗传条件是否存在。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，核酸探针被构造为与所述细胞样本中的X和/或Y染色体杂交。

9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述免疫着色剂结合于胎儿血红蛋白。

10.一种用于准备包含自然存在浓度的胎儿细胞的母体血液样本的方法，该方法包括：

利用指向所关注的细胞的非核酸成分的荧光免疫着色剂来处置所述样本；

利用指向所关注的核酸序列的荧光核酸探针来处置所述样本；

使用计算机化的显微镜图像系统观察覆盖细胞样本的一部分的光场，其中，所述计算机化的显微镜图像系统被配置为检测来自所述荧光免疫着色剂和所述荧光核酸探针的荧光信号；以及

通过所述荧光信号检测，识别具有所关注的核酸序列的所关注的细胞。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所关注的细胞为胎儿细胞。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述胎儿细胞是从母体血液得到的。

13.根据权利要求10所述的方法，其中，所述核酸探针包含X和/或Y染色体DNA序列。

14.根据权利要求10所述的方法，其中，所述计算机化的图像系统使用一个物镜获取来自所述免疫着色剂和所述核酸探针的荧光信号。

15.根据权利要求10所述的方法，还包括以下步骤：根据被识别为具有所关注的核酸序列的所关注的细胞的数目，自动生成试验性的诊断结果。

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