CN114269916A - 用于样品分析的装置和方法 - Google Patents

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J·杨
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Abstract

本公开一般涉及用于实施表位电泳的装置和方法。加速电泳可以用来诸如通过对靶分析物例如DNA、RNA和/或其他生物学分子的选择性分离、检测、提取和/或预浓缩来实施样品分析。所述靶分析物可以在加速电泳之后被收集并且用于期望的下游应用和进一步分析。

Description

用于样品分析的装置和方法
技术领域
本公开一般涉及电泳领域，并且更具体地涉及通过用于加速电泳(epitachophoresis)的装置和方法选择性分离、检测、提取和/或(预)浓缩样品(例如，生物学样品)进行的样品分析。
背景技术
电泳方法长期以来一直用于样品的分离和分析，针对多种目的，例如鉴定特定物质或确定溶液中分子的大小和类型。例如，多种分子生物学应用已经采用电泳来分离蛋白质或核酸、确定分子量和/或制备用于进一步分析的样品。在这些和其他应用中，电泳一般涉及带电物质(例如，分子或离子)在电场影响下的运动。这种运动可以促进样品与其他样品或物质的分离。一旦分离，就可以使用光学或其他方法容易地分析样品。
各种基于电泳的方法通常取决于要进行的分析的特定需要而结合不同的应用使用。例如，等速电泳(“ITP”)是一种浓缩和分离技术，它利用具有不同电泳迁移率的电解质将离子分析物聚焦(在某些情况下，并分离)到不同的区域(“聚焦区”)。在ITP中，分析物同时在高有效迁移率前导电解质(“LE”)离子和低有效迁移率尾随电解质(“TE”)离子之间聚焦和分离。在ITP中，区域边界处的电迁移和扩散的平衡通常会导致急剧移动的边界。
传统上，ITP是通过使用具有毛细管或微流体通道设计特征的装置和方法来实施的。这样的装置和方法仅能够处理小体积(μl规模)的用于分析的样品，这会使生物学样品的分析(诸如从血液和/或血浆中提取核酸)变得困难。因此，用于分析可能包括大体积的样品的装置和方法的进一步开发可能是有益的。提供更快速的样品分析的加速电泳法也是有益的。
发明内容
本公开一般涉及从样品中分离和/或纯化一种或多种无细胞核酸的方法，其中所述方法包括a.提供用于实施加速电泳(ETP)的装置；b.提供包含所述一种或多种无细胞核酸的样品；c.通过使用所述装置实施ETP来进行一次或多次加速电泳运行以将所述一种或多种无细胞核酸(“cfNA”)聚焦到一个或多个聚焦区内，例如，作为一个或多个ETP带；以及d.通过收集包含所述一种或多种cfNA的所述一个或多个聚焦区来收集所述一种或多种cfNA；从而获得一种或多种分离和/或纯化的cfNA。在一些实施例中，一种或多种cfNA可包含无细胞DNA和/或无细胞RNA。在一些实施例中，包含所述一种或多种无细胞核酸的所述样品可以包括血液、血浆、尿液、淋巴液和/或血清样品。在一些实施例中，所述样品可以包括母体血液、血浆和/或血清。在一些实施例中，所述一种或多种无细胞核酸可以包含一种或多种循环肿瘤核酸(ctNA)，例如，其中所述一种或多种ctNA包含循环肿瘤DNA和/或循环肿瘤RNA。在一些实施例中，所述一种或多种无细胞核酸可包含一种或多种循环病毒核酸(cvNA)，例如，其中所述一种或多种cvNA包含循环病毒DNA和/或循环病毒RNA。
在一些实施例中，所述一种或多种无细胞核酸的所述基于ETP的分离和/或纯化可使得包含在原始样品中的一种或多种无细胞核酸中的1％或更少、1％或更多、5％或更多、10％或更多、15％或更多、20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多或者99％或更多被分离并收集。在一些实施例中，所述方法可产生1％或更低、1％或更高、5％或更高、10％或更高、15％或更高、20％或更高、25％或更高、30％或更高、35％或更高、40％或更高、45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高或者99％或更高纯度的所述一种或多种靶分析物，例如，如通过分析技术所测量，以确定包含一种或多种靶分析物的ETP分离/纯化的样品的组成。在一些实施例中，可以改变和/或优化一种或多种缓冲液浓度例如LE和/或TE缓冲液浓度、包含在所述ETP装置中的凝胶的百分比和/或基于ETP的分离和收集运行的停止时间，以增强所述一种或多种cfNA与包含在所述样品中的其他材料的分离。在一些实施例中，所述样品可以在实施步骤c.之前被蛋白酶K消化。在一些实施例中，一种或多种cfNA可以是约1000bp或更长、1000bp或更短、900bp或更短、800bp或更短、700bp或更短、600bp或更短、500bp或更短、400bp或更短、300bp或更短、250bp或更短、200bp或更短、150bp或更短的长度。在一些实施例中，分离和/或纯化的cfNA可用于一种或多种下游体外诊断应用。在一些实施例中，所述方法可以进一步包括在所述基于ETP的分离和/或纯化期间和/或之后检测所述一种或多种cfNA，例如，所述检测包括光学检测，在一些情况下，其中所述光学检测包括检测与所述一种或多种cfNA结合或缔合的嵌入染料和/或光学标签。在一些实施例中，所述检测可包括电检测。
在一些实施例中，所述方法可以是自动化方法，其中步骤b.的样品被自动加载到所述装置内，且/或在步骤d.之前或期间，从所述装置自动化地收集一种或多种无细胞NA。在一些实施例中，一种或多种分离和/或纯化的cfNA可以经历一次或多次进一步ETP运行以进一步分离和/或纯化所述一种或多种cfNA。在一些实施例中，所述方法可以进一步包括在步骤d.之后的至少一个基于SPRI珠的清理步骤。在一些实施例中，与不使用基于ETP的分离和/或纯化实施的方法相比，所述方法可产生1.25倍或更多、1.5倍或更多、1.75倍或更多、2.0倍或更多、2.25倍或更多、2.5倍或更多、2.75倍或更多、3倍或更多、4倍或更多、5倍或更多、10倍或更多、100倍或更多或者1000倍或更多cfNA的cfNA产量。在一些实施例中，所述方法可获得约1.00ng或更少、1.0ng或更多、2.0ng或更多、3.0ng或更多、4.0ng或更多、5.0ng或更多、5.5ng或更多、6.0ng或更多、6.5ng或更多、6.8ng或更多、10ng或更多、50ng或更多或者100ng或更多的分离和/或纯化的cfNA。
在一些实施例中，所述方法可以进一步包括在步骤c.期间使用ETP上位标记物。在一些实施例中，所述ETP上位标记物可以比一种或多种cfNA在大小上更大和/或在长度上更长。在一些实施例中，所述ETP上位标记物可以通过质粒的限制性消化产生。在一些实施例中，所述限制性消化可产生约1000bp的ETP上位标记物。在一些实施例中，分离和/或纯化的cfNA可以进一步通过深度测序(CAPP-Seq)进行癌症个性化谱分析。在一些实施例中，分离和/或纯化的cfNA可用于评估胎儿非整倍性的风险。在一些实施例中，可以测定分离的和/或纯化的cfNA的一种或多种生物标志物。在一些实施例中，可以对分离和/或纯化的cfNA分析胎儿cfNA与母体cfNA的比率和/或量。在一些实施例中，分离和/或纯化的cfNA可以进一步经历利用非多态性和多态性检测两者来确定来源贡献和拷贝数变异(CNV)的测定系统。在一些实施例中，可以对分离的和/或纯化的cfNA分析特定多态性，所述多态性用于确定胎儿对母体样品的贡献百分比。在一些实施例中，分离的和/或纯化的cfNA可以在一种或多种用于鉴定CNV和感染源的测定中进一步评估。在一些实施例中，分离和/或纯化的cfNA可以通过一种或多种检测cfNA的定量和定性肿瘤特异性改变(诸如DNA链完整性、突变频率、微卫星异常和基因甲基化)的方法进一步评估。在一些实施例中，可以通过一种或多种方法进一步评估分离的和/或纯化的cfNA以检测例如来自癌症患者的样品中的诊断、预后和监测标志物。在一些实施例中，所述方法可以进一步与CNV检测组合以提供用于辅助患有或被怀疑患有恶性肿瘤的患者的临床诊断、治疗、结果预测和进展监测的方法。在一些实施例中，可以在一个或多个适合监测移植患者器官健康的测定系统中进一步评估分离的和/或纯化的cfNA，例如使用cfDNA检测与一个或多个单基因中的SNP或突变检测的组合。在一些实施例中，分离和/或纯化的cfNA可以进一步经历用于检测样品中遗传特征的方法，所述遗传特征包括拷贝数变异(CNV)、插入、缺失、易位、多态性和突变。在一些实施例中，可以确定一种或多种分离和/或纯化的cfNA中的任何一种或多种的浓度。在一些实施例中，浓度可以通过分子条形码确定。在一些实施例中，分离和/或纯化的cfNA可以进一步经历分析，所述分析包括使用ctDNA检测指数。在一些实施例中，可以进一步对分离和/或纯化的cfNA分析源自肿瘤的SNV。在一些实施例中，可以测量一种或多种分离和/或纯化的cfNA的浓度。在一些实施例中，步骤b.中的所述样品的样品体积可以是0.25mL或更小、0.25mL或更大、0.5mL或更大、0.75mL或更大、1.0mL或更大、2.5mL或更大、5.0mL或更大、7.5mL或更大、10.0mL或更大、12.5mL或更大或者15.0mL或更大。在一些实施例中，cfNA可包含起源于一种或多种癌细胞的cfNA。
此外，本公开一般涉及一种用于检测包含胎儿和母体无细胞DNA的母体样品中的胎儿来源的来源贡献以及一个或多个基因组区域中的胎儿拷贝数变异(CNV)存在或不存在的测定法，所述测定法包括以下步骤：a.通过实施基于ETP的分离和/或纯化从母体样品中分离和/或纯化cfNA，例如，cfDNA，以获得分离和/或纯化的母体样品；b.使(i)第一组两个或更多个固定序列寡核苷酸与(ii)分离和/或纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中第一组固定序列寡核苷酸包含第一和第二固定序列寡核苷酸，所述第一和第二固定序列寡核苷酸与第一基因组区域中的至少48个且小于2000个基因座中每一个基因座内的连续区域互补，其中第一组固定序列寡核苷酸中的至少一个包含通用引物区域并且第一组固定序列寡核苷酸中的第一固定序列寡核苷酸的解链温度(Tm)在两摄氏度的范围内变动；c.使(i)第二组两个或更多个固定序列寡核苷酸与(ii)分离和/或纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中第二组固定序列寡核苷酸包含第一和第二固定序列寡核苷酸，所述第一和第二固定序列寡核苷酸与第二基因组区域中的至少48个且小于2000个基因座中每一个基因座内的连续区域互补，其中第二组固定序列寡核苷酸中的至少一个包含通用引物区域并且第二组固定序列寡核苷酸中的第一固定序列寡核苷酸的Tm在两摄氏度的范围内变动；d.使(i)第三组至少两个固定序列寡核苷酸与(ii)分离和/或纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中第三组至少两个固定序列寡核苷酸与两个或更多个多态性信息基因座的连续、多态性区域互补；e.将杂交的第一组固定序列寡核苷酸连接以生成与第一基因组区域互补的连续连接产物，将杂交的第二组固定序列寡核苷酸连接以生成与第二基因组区域互补的连续连接产物，并且将杂交的第三组固定序列寡核苷酸连接以生成与多态性信息基因座互补的连续连接产物；f.使用通用引物区域扩增连续连接产物以生成扩增产物；g.使用高通量测序，通过平均至少100次测量来自第一基因组区域和第二基因组区域的每一个基因座来检测扩增产物；以及h.确定所测量的来自第一和第二基因组区域的基因座的相对频率，其中所测量的来自第一基因组区域的基因座的相对频率与所测量的来自第二基因组区域的基因座的相对频率不同，指示胎儿拷贝数变异的存在，所述确定不依赖于对第一和第二基因组区域内的多态性的检测，并且在多态性信息基因座处源自胎儿来源与母体来源的序列读段的比例指示来源贡献，其中来自胎儿来源的来源贡献为至少5％且低于25％。
此外，本公开一般涉及一种用于使用单一测定法来检测包含胎儿和母体无细胞DNA的母体样品中的胎儿来源的来源贡献以及胎儿非整倍性存在或不存在的测定法，所述测定法包括以下步骤：a.通过实施基于ETP的分离和/或纯化从母体样品中分离和/或纯化cfNA，例如，cfDNA，以获得分离和/或纯化的母体样品；b.使(i)第一组两个或更多个固定序列寡核苷酸与(ii)分离和/或纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中第一组固定序列寡核苷酸包含第一和第二固定序列寡核苷酸，所述第一和第二固定序列寡核苷酸与对应于第一染色体的至少48个且小于2000个基因座中每一个基因座内的连续区域互补，并且第一组固定序列寡核苷酸中的第一固定序列寡核苷酸的解链温度(Tm)在两摄氏度的范围内变动；c.使(i)第二组两个或更多个固定序列寡核苷酸与(ii)分离和/或纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中第二组固定序列寡核苷酸包含第一和第二固定序列寡核苷酸，所述第一和第二固定序列寡核苷酸与对应于第二染色体的至少48个且小于2000个基因座中每一个基因座内的连续区域互补，并且第二组固定序列寡核苷酸中的第一固定序列寡核苷酸的Tm在两摄氏度的范围内变动；d.使(i)第三组至少两个固定序列寡核苷酸与(ii)分离和/或纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中第三组至少两个固定序列寡核苷酸与两个或更多个多态性信息基因座的连续、多态性区域互补；e.将杂交的第一组固定序列寡核苷酸连接以生成与第一染色体上的基因座互补的连续连接产物，将杂交的第二组固定序列寡核苷酸连接以生成与第二染色体上的基因座互补的连续连接产物，并且将杂交的第三组固定序列寡核苷酸连接以生成与多态性信息基因座互补的连续连接产物；f.扩增连续连接产物以生成扩增产物；g.使用高通量测序，通过平均至少100次测量第一染色体上的每一个基因座、第二染色体上的每一个基因座和每一个信息基因座来检测扩增产物；以及h.确定所测量的来自第一和第二基因组区域的基因座的相对频率，其中所测量的来自第一基因组区域的基因座的相对频率与所测量的来自第二基因组区域的基因座的相对频率不同，指示胎儿拷贝数变异的存在，所述确定不依赖于对第一和第二基因组区域内的多态性的检测，并且在多态性信息基因座处源自胎儿来源与母体来源的序列读段的比例指示来源贡献，其中来自胎儿来源的来源贡献为至少5％且低于25％。
此外，本公开一般涉及一种用于检测包含胎儿和母体无细胞DNA的母体样品内的胎儿来源的来源贡献以及一个或多个基因组区域中的胎儿CNV存在或不存在的测定法，所述测定法包括以下步骤：a.通过实施基于ETP的分离和/或纯化从母体样品中分离和/或纯化cfNA，例如，cfDNA，以获得分离和/或纯化的母体样品；b.使(i)第一组两个或更多个固定序列寡核苷酸与(ii)分离和/或纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中第一组固定序列寡核苷酸包含第一和第二固定序列寡核苷酸，所述第一和第二固定序列寡核苷酸与第一基因组区域中的二十四个或更多个基因座的区域互补，并且第一组固定序列寡核苷酸中的第一固定序列寡核苷酸的解链温度(Tm)在两摄氏度的范围内变动；c.使(i)第二组两个或更多个固定序列寡核苷酸与(ii)分离和/或纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中第二组固定序列寡核苷酸包含第一和第二固定序列寡核苷酸，所述第一和第二固定序列寡核苷酸与第二基因组区域中的二十四个或更多个基因座的区域互补，并且第二组固定序列寡核苷酸中的第一固定序列寡核苷酸的Tm在两摄氏度的范围内变动；d.使(i)第三组至少两个固定序列寡核苷酸与(ii)分离和/或纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中第三组至少两个固定序列寡核苷酸与两个或更多个多态性信息基因座的连续、多态性区域互补；e.使(i)桥接寡核苷酸与(ii)分离和/或纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中桥接寡核苷酸与位于与第一组、第二组和第三组固定序列寡核苷酸互补的区域之间的基因座中的区域互补；f.将第一组固定序列寡核苷酸与桥接寡核苷酸连接以生成与第一基因组区域中的基因座互补的连续连接产物，将第二组固定序列寡核苷酸与桥接寡核苷酸连接以生成与第二基因组区域所缔合的基因座互补的连续连接产物，并且将杂交的第三组固定序列寡核苷酸连接以生成与多态性信息基因座互补的连续连接产物；g.扩增连续连接产物以生成扩增产物；h.使用高通量测序，通过平均至少100次测量第一基因组区域中的每一个基因座和第二基因组区域中的每一个基因座来检测扩增产物；以及i.确定所测量的来自第一和第二基因组区域的基因座的相对频率，其中所测量的来自第一基因组区域的基因座的相对频率与所测量的来自第二基因组区域的基因座的相对频率不同，指示胎儿拷贝数变异的存在，所述确定不依赖于对第一和第二基因组区域内的多态性的检测，并且在多态性信息基因座处源自胎儿来源与母体来源的序列读段的比例指示来源贡献，其中来自胎儿来源的来源贡献为至少5％且低于25％。
此外，本公开一般涉及一种用于提供胎儿拷贝数变异的统计学可能性的测定方法，其包括：提供包含母体和胎儿无细胞DNA的母体血浆或血清样品；通过实施基于ETP的分离和/或纯化来分离和/或纯化所述无细胞DNA；通过使成组的至少两个包含与第一靶基因组区域中的基因座互补的区域的固定序列寡核苷酸杂交来查询至少48个来自第一靶基因组区域的非多态性基因座，其中每一组的固定序列寡核苷酸中的一个包含第一捕获区域、第一标签结合区域和两个限制位点；通过使成组的至少两个包含与第二靶基因组区域中的基因座互补的区域的固定序列寡核苷酸杂交来查询至少48个来自第二靶基因组区域的非多态性基因座，其中每一组的固定序列寡核苷酸中的一个包含第一捕获区域、第二标签结合区域和两个限制位点；将杂交的固定序列寡核苷酸连接；扩增连接的固定序列寡核苷酸以生成扩增子；在限制位点处裂解扩增子以生成裂解的扩增子，其中每一个裂解的扩增子包含第一捕获区域和第一或第二标签结合区域；通过使裂解的扩增子的第一捕获区域杂交至包含与第一捕获区域互补的捕获探针的阵列来检测来自第一和第二靶基因组区域的裂解的扩增子，其中来自第一和第二靶基因组区域的裂解的扩增子竞争性地杂交至与第一捕获区域互补的捕获探针；通过检测第一和第二标签结合区域，将裂解的扩增子的捕获区域定量以确定所查询的来自第一和第二靶基因组区域的非多态性基因座的相对频率；基于所确定的第一和第二标签结合区域的相对频率，估计第一和第二靶基因组区域的相对频率；对于每一个多态性基因座，通过使成组的至少三个固定序列等位基因特异性寡核苷酸杂交来查询至少48个来自不同于第一和第二靶基因组区域的至少一个靶基因组区域的多态性基因座，其中每一组的至少三个等位基因特异性寡核苷酸中的两个包含与多态性基因座处的一个等位基因互补的序列、对于每一个多态性基因座具特异性的捕获区域、针对多态性基因座处的每一个等位基因的不同的标签结合区域、和两个限制位点；将杂交的固定序列等位基因特异性寡核苷酸连接；扩增连接的固定序列等位基因特异性寡核苷酸以生成等位基因特异性扩增子；在限制位点处裂解等位基因特异性扩增子以生成裂解的等位基因特异性扩增子，其中每一个裂解的等位基因特异性扩增子包含多态性基因座特异性捕获区域和等位基因特异性标签结合区域；通过裂解的等位基因特异性扩增子的多态性基因座特异性捕获区域竞争性地杂交至阵列上的捕获区域，来检测来自多态性基因座的裂解的等位基因特异性扩增子；通过针对裂解的等位基因特异性扩增子上的每一个等位基因检测等位基因特异性标签结合区域，将多态性基因座的等位基因定量，以确定样品中胎儿DNA的分数；确定胎儿DNA的分数；以及使用估计的样品中第一和第二靶基因组区域的相对频率和胎儿DNA的分数，计算母体样品中胎儿拷贝数变异的统计学可能性。
此外，本公开一般涉及一种用于确定胎儿非整倍性的可能性的测定方法，其包括以下步骤：提供包含母体和胎儿无细胞DNA的母体血浆或血清样品；通过实施基于ETP的分离和/或纯化来分离和/或纯化所述无细胞DNA，从而获得分离和/或纯化的母体样品；在允许每一个固定序列寡核苷酸的互补区域特异性地杂交至分离和/或纯化的母体样品中第一靶基因组区域中的非多态性基因座的条件下，引入至少五十组第一组两个或更多个与非多态性基因座互补的固定序列寡核苷酸，其中每一组的固定序列寡核苷酸中的至少一个包含通用引物位点、第一捕获区域、第一标签结合区域和两个限制位点；在允许每一个固定序列寡核苷酸的互补区域特异性地杂交至分离和/或纯化的母体样品中第二靶基因组区域中的非多态性基因座的条件下，引入至少五十组第二组两个或更多个与非多态性基因座互补的固定序列寡核苷酸，其中每一组的固定序列寡核苷酸中的至少一个包含通用引物位点、第一捕获区域、第二标签结合区域和两个限制位点；在允许每一个固定序列寡核苷酸的互补区域特异性地杂交至多态性基因座的条件下，引入至少五十组第三组三个或更多个与分离和/或纯化的母体样品中的一组多态性基因座互补的固定序列寡核苷酸，其中每一组的三个固定序列寡核苷酸中的至少两个包含通用引物位点、与多态性基因座处的一个等位基因互补的序列、针对多态性基因座处的每一个等位基因的等位基因特异性标签结合区域、两个限制位点和多态性基因座特异性捕获区域，其中针对每一个多态性基因座的捕获区域不同于针对每一个其他多态性基因座的捕获区域并且不同于第一捕获区域；使第一组、第二组和第三组固定序列寡核苷酸杂交至第一和第二靶基因组区域以及多态性基因座；延长杂交的第一组、第二组和第三组固定序列寡核苷酸中的至少一个以形成相邻杂交的固定序列寡核苷酸；将杂交的第一组、第二组和第三组固定序列寡核苷酸连接以生成连接产物；使用通用引物位点扩增连接产物，以生成对应于多态性基因座的扩增子；在限制位点处裂解扩增子以生成裂解的扩增子，其中每一个裂解的扩增子包含一个捕获区域和一个标签结合区域；将裂解的扩增子施加到阵列，其中阵列包含与来自第一和第二靶基因组区域的裂解的扩增子上的第一捕获区域互补的第一捕获探针，并且其中阵列包含与来自每一个多态性基因座的裂解的扩增子上的捕获区域互补的捕获探针；使来自第一和第二靶基因组区域的裂解的扩增子的第一捕获区域杂交至阵列上的第一捕获探针；使来自多态性基因座的裂解的扩增子的捕获区域杂交至阵列上的捕获探针；检测杂交的裂解的扩增子；通过检测第一和第二标签结合区域，将对应于来自第一靶基因组区域的基因座的裂解的扩增子的相对频率和对应于来自第二靶基因组区域的基因座的裂解的扩增子的相对频率定量；通过检测针对裂解的扩增子上的每一个等位基因的等位基因特异性标签结合区域，将来自多态性基因座的每一个等位基因的相对频率定量，以确定胎儿无细胞DNA的百分比；以及，使用对应于来自第一和第二靶基因组区域的基因座的裂解的扩增子的用以确定胎儿非整倍性的可能性的相对频率以及所确定的胎儿无细胞DNA的百分比，来计算胎儿非整倍性的可能性。
此外，本公开一般涉及一种用于确定胎儿非整倍性的可能性的测定方法，其包括以下步骤：提供包含母体和胎儿无细胞DNA的母体血浆或血清样品；通过实施基于ETP的分离和/或纯化来分离和/或纯化所述无细胞DNA，从而获得分离和/或纯化的母体样品；在允许每一个固定序列寡核苷酸的互补区域特异性地杂交至母体样品中第一靶基因组区域中的一组非多态性基因座的条件下，引入至少五十组第一组两个或更多个与所述一组非多态性基因座互补的固定序列寡核苷酸，其中每一组的固定序列寡核苷酸中的至少一个包含通用引物位点、第一捕获区域、第一标签结合区域和两个限制位点；在允许每一个固定序列寡核苷酸的互补区域特异性地杂交至分离和/或纯化的母体样品中第二靶基因组区域中的一组非多态性基因座的条件下，引入至少五十组第二组两个或更多个与所述一组非多态性基因座互补的固定序列寡核苷酸，其中每一组的固定序列寡核苷酸中的至少一个包含通用引物位点、第一捕获区域、第二标签结合区域和两个限制位点；在允许每一个固定序列寡核苷酸的互补区域特异性地杂交至多态性基因座的条件下，引入两组或更多组第三组三个或更多个与分离和/或纯化的母体样品中的一组多态性基因座互补的固定序列寡核苷酸，其中每一组的三个或更多个固定序列寡核苷酸中的至少两个包含通用引物位点、与多态性基因座处的一个等位基因互补的序列、针对多态性基因座处的每一个等位基因的等位基因特异性标签结合区域、两个限制位点和多态性基因座特异性捕获区域，其中针对每一个多态性基因座的捕获区域不同于针对每一个其他多态性基因座的捕获区域并且不同于第一捕获区域；使第一组、第二组和第三组固定序列寡核苷酸杂交至第一和第二靶基因组区域以及多态性基因座；延长杂交的第一组、第二组和第三组固定序列寡核苷酸中的至少一个以形成对于每一组的相邻杂交的固定序列寡核苷酸；将相邻杂交的来自第一组、第二组和第三组的固定序列寡核苷酸连接以生成连接产物；使用通用引物位点扩增连接产物以生成扩增子；在限制位点处裂解扩增子以生成裂解的扩增子，其中每一个裂解的扩增子包含一个捕获区域和一个标签结合区域；将裂解的扩增子施加到阵列，其中阵列包含与来自第一和第二靶基因组区域的裂解的扩增子上的第一捕获区域互补的第一捕获探针，并且其中阵列包含与来自每一个多态性基因座的裂解的扩增子上的捕获区域互补的捕获探针；使来自第一和第二靶基因组区域的裂解的扩增子的第一捕获区域杂交至阵列上的第一捕获探针；使来自多态性基因座的裂解的扩增子的捕获区域杂交至阵列上的捕获探针；检测杂交的裂解的扩增子；通过检测针对裂解的扩增子上的每一个等位基因的等位基因特异性标签结合区域，将来自多态性基因座的每一个等位基因的相对频率定量，以确定胎儿无细胞DNA的百分比；在母体基因座为纯合的且对应的胎儿基因座为杂合的情况下，通过从定量的等位基因鉴定低频率等位基因，确定胎儿无细胞DNA的百分比；通过检测第一和第二标签结合区域，将对应于来自第一靶基因组区域的基因座的裂解的扩增子的相对频率和对应于来自第二靶基因组区域的基因座的裂解的扩增子的相对频率定量；以及，使用对应于来自第一和第二靶基因组区域的基因座的裂解的扩增子的相对频率以及胎儿无细胞DNA的百分比，来计算胎儿非整倍性的可能性。
此外，本公开一般涉及一种鉴定源自肿瘤的SNV的无创性方法，其包括(a)从患有癌症或被怀疑患有癌症的受试者获得样品；(b)进行基于ETP的分离和/或纯化以分离和/纯化靶核酸，例如，cfNA，例如，cNA，以获得分离和/或纯化的样品；(c)对分离和/或纯化的样品执行测序反应以产生测序信息；(d)将算法应用至测序信息以产生基于来自步骤(c)的测序信息的一系列候选肿瘤等位基因，其中候选肿瘤等位基因包含非优势碱基，所述非优势碱基不是种系SNP；以及(e)基于一系列候选肿瘤等位基因，鉴定源自肿瘤的SNV。在一些实施例中，候选肿瘤等位基因可包含基因组区域，所述基因组区域包含候选SNV。
此外，本公开一般涉及一种用于对患有疾病或病症的受试者进行检测、诊断、预后或疗法选择的方法，其包括：(a)获得源自受试者的无细胞DNA(cfDNA)样品的序列信息，其中cfDNA样品通过实施基于ETP的分离和/或纯化来分离和/或纯化；以及(b)使用源自(a)的序列信息来检测样品中的无细胞非种系DNA(cfNG-DNA)，其中该方法可能够检测cfNG-DNA的百分比，所述百分比可低于总cfDNA的2％或高于总cfDNA的约2％。此外，本公开一般涉及一种鉴定源自病毒的cfNA的无创性方法，其包括(a)从被怀疑具有病毒感染或被怀疑已经暴露于病毒的受试者获得样品；(b)进行基于ETP的分离和/或纯化来分离和/或纯化靶cfNA以获得分离和/或纯化的样品；(c)对分离和/或纯化的样品执行测序反应以产生测序信息；以及(d)基于测序信息，确定受试者是否已经被一种或多种病毒感染。此外，本公开一般涉及用于实施本文所述的任何方法的基于ETP的分离和收集的装置。
附图说明
图1提供了用于实施加速电泳的示例性装置的示意图。
图2A提供了用于实施加速电泳的示例性装置的顶视图的示意图。在图2A中，数字1-8是指以下内容：1.外圆形电极；2.终止电解质池；3.前导电解质，任选地包含在凝胶内或以其他方式与终止电解质以流体动力学方式分离；4.前导电解质电极/收集池；5.中心电极；6.电源；7.前导电解质与终止电解质之间的边界，样品离子聚焦在两者之间；和8.底部支持物；并且符号r和d分别表示前导电解质池的半径和LE/TE边界迁移的距离。
图2B提供了用于实施加速电泳的示例性装置的侧视图的示意图。在图2B中，数字1-8是指以下内容：1.外圆形电极；2.终止电解质池；3.前导电解质，任选地包含在凝胶内或以其他方式与终止电解质以流体动力学方式分离；4.前导电解质电极/收集池；5.中心电极；6.电源；7.前导电解质与终止电解质之间的边界，样品离子聚焦在两者之间；和8.底部支持物；并且符号r和d分别表示前导电解质池的半径和LE/TE边界迁移的距离。
图3提供了用于实施加速电泳的示例性装置的示意图。
图4提供了用于实施加速电泳的示例性装置的示意图。在图4中，数字1-10是指以下内容：1.外圆形电极；2.终止电解质池；3.前导电解质，任选地包含在凝胶内或以其他方式与终止电解质以流体动力学方式分离；4.通向前导电解质/收集池的开口；5.中心电极；6.电源；7.前导电解质与终止电解质之间的边界，样品离子聚焦在两者之间；8.底部支持物；9.连接到前导电解质池的管连接装置；10.前导电解质池。
图5提供了用于实施加速电泳的示例性装置的示意图，其中在加载前导电解质和终止电解质之间加载样品。
图6A提供了用于实施加速电泳的装置的示意图，并且实例2中描述的等式参考该图。
图6B提供了表示当使用恒定电流操作用于加速电泳的示例性装置(图6A)时，以cm为单位的行进距离d相对于在距离d处的相对速度的图。对于图6B中呈现的实例，使用半径值5和起始速度值1。
图6C提供了表示当使用恒定电压操作用于加速电泳的示例性装置(图6A)时，以cm为单位的行进距离d相对于在距离d处的相对速度的图。对于图6C中呈现的实例，使用半径值5和起始速度值1。
图6D提供了表示当使用恒定功率操作用于加速电泳的示例性装置(图6A)时，以cm为单位的行进距离d相对于在距离d处的相对速度的图。对于图6D中呈现的实例，使用半径值5和起始速度值1。
图7提供了根据实例3的用于浓缩样品的加速电泳装置的图像。
图8A提供了根据实例4使用的用于加速电泳的示例性装置的图像。
图8B提供了用于根据实例4的用于将样品聚焦到聚焦区的用于加速电泳的示例性装置的图像。
图8C提供了用于根据实例4的用于将样品聚焦到聚焦区的用于加速电泳的示例性装置的图像。
图9A提供了根据实例5使用的用于加速电泳的示例性装置的图像。
图9B提供了根据实例5使用的用于加速电泳的示例性装置的示意图。在图9B中，数字是指以毫米为单位的尺寸。
图9C提供了用于根据实例5的用于将样品聚焦到聚焦区的用于加速电泳的示例性装置的图像。
图9D提供了用于根据实例5的用于将样品聚焦到聚焦区的用于加速电泳的示例性装置的图像。
图10提供了用于根据实例5的用于将样品聚焦到聚焦区的用于加速电泳的示例性装置的图像。
图11提供了用于根据实例5的用于分离两个不同的样品并且将其聚焦到聚焦区的用于加速电泳的示例性装置的图像。
图12提供了根据实例6的用于加速电泳的示例性装置的图像。
图13A提供了根据实例7的示例性加速电泳装置的图像。
图13B提供了根据实例7的示例性加速电泳装置的示意图。“a”对应于中心收集井，而“b”对应于前导电解质池。
图14A提供了用于根据实例7的加速电泳装置中的示例性电导率测量探针的图像。
图14B提供了显示图14A中所示的电导率测量探针的更近视图的图像。
图15A提供了根据实例7的具有电导率探针的示例性加速电泳装置的图像。
图15B提供了根据实例7的示例性加速电泳装置的运行的电导率轨迹。
图16A提供了根据实例7的具有置于半透膜下方的电导率检测探针的示例性加速电泳装置的图像。
图16B提供了示例性底部基板的图像，该底部基板合并有通过位于中心柱内的专用通道连接的两个电导率检测探针。
图17A提供了示例性加速电泳装置的图像，展示了根据实例7的荧光素标记的DNA阶梯样品的聚焦。
图17B提供了在根据实例7的加速电泳运行之前和之后，原始样品和收集的DNA阶梯样品级分的吸收光谱。
图17C提供了来自在根据实例7的加速电泳运行之前和之后的DNA阶梯样品的基于电泳的分析的数据。
图18提供了根据实例8的ETP装置和附件的图像。a表示ETP装置；b表示ETP装置的矩形盖；c表示ETP装置的圆形盖；并且d表示用于调整ETP装置的可移动中心活塞的位置的聚四氟乙烯棒。
图19提供了根据实例8的ETP实验设置的图像。
图20提供了根据实例9从1mL血浆中分离/纯化cfDNA的延时图像。
图21提供了根据实例10通过基于ETP的分离/纯化和随后基于珠的纯化来分离/纯化的cfDNA浓度的(基于QUBIT的)测量值。还呈现了通过离心柱或基于珠的方法分离/纯化的cfDNA浓度的测量数据。
图22提供了来自根据实例11通过基于ETP的分离/纯化从添加有DNA阶梯的血浆样品中分离/纯化的cfDNA和DNA阶梯的基于大小的分析的数据。
图23提供了来自根据实例12通过基于ETP的分离/纯化从血浆样品中分离/纯化的cfDNA的基于大小的分析的数据。
图24提供了来自根据实例13通过基于ETP的分离/纯化分离/纯化的cfDNA的基于大小的分析的数据。
图25提供了根据实例14通过基于ETP的分离/纯化和随后基于珠的纯化来分离/纯化的ctDNA浓度的测量值。还呈现了通过基于离心柱的方法分离/纯化的ctDNA浓度的测量数据。
图26提供了来自根据实例15通过用三种限制酶消化载体产生的ETP上位标记物的基于电泳的分析的数据。
具体实施方式
定义
如本文所用，除非另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”及“该/所述”包括复数个参考物。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个此类细胞，并且提及“该蛋白质”包括提及本领域技术人员已知的一个或多个蛋白质及其等同物，等等。除非另有明确说明，否则本文所用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。
术语“电场”用于表示由电荷(诸如电子、离子或质子)在围绕它的空间或介质体积中的存在所产生的效应。每个电荷分布在叠加的基础上在一点上对整个场有贡献。放置在空间或周围介质体积中的电荷有一个作用于它的力。电场可以由电压差产生：电压越高，所得到的场越强。相反，当电流流动时可产生磁场：电流越大，磁场越强。即使没有电流流动，也可以存在电场。电场可以以伏特每米(V/m)为单位进行测量。在一些实施例中，为了在本方法和装置中引起带电颗粒的移动，在方便的时间范围内，电场强度可以为约10V至约10kV，电功率范围为约1mW至约100W。在一些实施例中，用于最快分析的最大电功率可取决于样品和电解质溶液的电阻率以及可用于构建本文所述装置的材料的冷却能力。
如本文所用，术语“等速电泳”一般是指通过使用电场在材料之间(例如，在带电颗粒与溶液中的其他材料之间)产生边界或界面来分离带电颗粒。ITP一般使用多种电解质，其中样品离子的电泳迁移率小于前导电解质(LE)的电泳迁移率，而大于放置用于ITP的装置中的尾随电解质(TE)的电泳迁移率。前导电解质(LE)一般包含相对高迁移率的离子，而尾随电解质(TE)一般包含相对低迁移率的离子。选择的TE和LE离子具有分别低于和高于目标靶分析物离子的有效迁移率。也就是说，分析物离子的有效迁移率高于TE但低于LE。这些靶分析物与LE和TE离子(即共离子)具有相同的电荷符号。施加的电场使LE离子移动远离TE离子，而TE离子尾随在后。在相邻和连续的TE和LE区域之间形成移动的界面。这会创建电场梯度区域(通常从LE的低电场到TE的高电场)。TE中的分析物离子会超过TE离子，但不能超过LE离子并在TE和LE之间的界面处积聚(“聚焦”或形成“聚焦区”)。替代地，LE中的靶离子被LE离子取代；并也在界面处积累。通过明智地选择LE和TE化学，ITP相当普遍适用，可以用最初溶解在TE和LE电解质中的一种或两种中的样品来完成，并且可以不需要非常低电导率的背景电解质。
如本文所用，术语“加速电泳”一般是指使用圆形或球体和/或同心装置和/或圆形和/或同心电极布置执行的电泳分离方法，诸如通过使用圆形/同心和/或本文所述的多边形装置。由于在加速电泳期间使用的圆形/同心或另一种多边形排列；与传统的等速电泳装置不同的是，横截面积在离子和区域的迁移期间会发生变化，并且由于横截面积的变化，区域移动的速度在时间上不是恒定的。因此，加速电泳布置并不严格遵循传统的等速电泳原理，其中区域以恒定速度迁移。尽管有如本文所示的这些显著差异，但通过使用电场在可能具有不同电泳迁移率的材料之间(例如，在带电颗粒和溶液中的其他材料之间)创建边界或界面，可以使用加速电泳来有效地分离和聚焦带电颗粒。LE和TE，如与ITP一起使用所描述的，也可用于加速电泳。对于其中可以使用圆形或球体装置结构(例如，包括一个或多个圆形电极的装置)的实施例，在恒定电流、恒定电压和恒定功率下区域移动的描述在下文的实例部分中给出。在示例性实施例中，可以使用恒定电流、恒定电压和/或恒定功率来实施加速电泳。在示例性实施例中，可以使用变化的电流、变化的电压和/或变化的功率来实施加速电泳。在示例性实施例中，可以在装置和/或电极布置的背景下实施加速电泳，该装置和/或电极布置的形状通常可以描述为圆形或球体，从而可以如本文所述实施加速电泳的基本原理。在一些实施例中，可以在装置和/或电极布置的背景下实施加速电泳，该装置和/或电极布置的形状通常可以描述为多边形，从而可以如本文所述实施加速电泳的基本原理。在一些实施例中，加速电泳可以通过任何非线性的、连续的电极布置来实施，例如以圆形形状布置的电极和/或以多边形形状布置的电极来实施。
如本文所用，术语“体外诊断应用(IVD应用)”、“体外诊断方法(IVD方法)”等一般是指可评估用于诊断和/或监测目的的样品的任何应用和/或方法和/或装置，该目的诸如鉴定人类受试者，任选地鉴定人类受试者的疾病。在示例性实施例中，所述样品可以包括来自受试者的血液和/或血浆。在示例性实施例中，所述样品可包含来自受试者的核酸和/或靶核酸，任选地进一步其中所述核酸源自来自受试者的血液和/或血浆。在示例性实施例中，加速电泳装置可用作体外诊断装置。在示例性实施例中，已经通过加速电泳浓缩/富集的靶分析物可用于下游体外诊断测定。在示例性实施例中，体外诊断测定可包括核酸测序，例如DNA测序。在进一步的示例性实施例中，体外诊断方法可以是但不限于以下中的任何一种或多种：染色、免疫组织化学染色、流式细胞术、FACS、荧光活化液滴分选、图像分析、杂交、DASH、分子信标、引物延伸、微阵列、CISH、FISH、纤维FISH、定量FISH、流式FISH、比较基因组杂交、印迹、蛋白质印迹、DNA印迹、Eastern印迹、Far-蛋白质印迹、DNA-蛋白质印迹、RNA-蛋白质印迹和RNA印迹、酶测定、ELISA、配体结合测定、免疫沉淀、ChIP、ChIP-seq、ChIP-ChiP、放射免疫测定、荧光偏振、FRET、表面等离子体共振、过滤结合测定、亲和色谱、免疫细胞化学、基因表达谱分析、DNA谱分析和PCR、DNA微阵列、基因表达序列分析、实时聚合酶链反应、差异显示PCR、RNA-seq、质谱测量、DNA甲基化检测、声能、基于脂质组学的分析、免疫细胞的定量、癌症相关标志物的检测、特定细胞类型的亲和纯化、DNA测序、下一代测序、癌症相关融合蛋白的检测、以及化疗耐药性相关标志物的检测。
如本文所用，术语“前导电解质”和“前导离子”一般是指与目标样品离子和/或在ITP和/或加速电泳期间使用的尾随电解质相比具有更高有效电泳迁移率的离子。在示例性实施例中，用于阳离子加速电泳的前导电解质可以包括但不限于包括氯化物、硫酸根和/或甲酸根，用合适的碱例如组氨酸、TRIS、肌酐等缓冲到所希望的pH。在示例性实施例中，用于阴离子加速电泳的前导电解质可以包括但不限于包括钾、铵和/或钠以及乙酸根或甲酸根。在一些实施例中，对于给定的施加电压，前导电解质浓度的增加可导致样品区的成比例增加和电流(功率)的相应增加。典型的浓度一般可以在10-20mM范围内；然而，也可以使用更高的浓度。
如本文所用，术语“尾随电解质”、“尾随离子”、“终止电解质”和“终止离子”一般是指与目标样品离子和/或在ITP和/或加速电泳期间使用的前导电解质相比具有更低有效电泳迁移率的离子。在示例性实施例中，用于阳离子加速电泳的尾随电解质可包括但不限于包括MES、MOPS、乙酸根、谷氨酸根和其他弱酸阴离子和低迁移率阴离子。在示例性实施例中，用于阴离子加速电泳的尾随电解质可以包括但不限于包括在由任何弱酸在加速电泳期间形成的移动边界处的反应水合氢离子。
如本文所用，术语“聚焦区”一般是指包含由于进行加速电泳而被浓缩(“聚焦”)的组分的溶液体积。可从装置收集或移除聚焦区，并且所述聚焦区可包含富集和/或浓缩量的所希望的样品，例如靶分析物，例如靶核酸。在本文所述的加速电泳方法中，靶分析物一般变为聚焦在装置例如圆形或球体或其他多边形装置的中心。
如本文所用，术语“带”和“ETP带”一般是指在电泳(例如等速电泳或加速电泳)迁移期间与其他离子、分析物或样品分开行进的离子、分析物或样品的区(例如聚焦区)。加速电泳装置内的聚焦区可替代地称为“ETP带”。在一些实施例中，ETP带可包括一种或多种类型的离子、分析物和/或样品。在一些情况下，ETP带可包含单一类型的分析物，希望该分析物与样品中存在的其他材料分离，例如将靶核酸与细胞碎片分离。在一些情况下，ETP带可包含多于一种所希望的分析物，例如序列高度相似的多肽或核酸序列，例如等位基因变体。在一些情况下，ETP带可包含相似大小或电泳迁移率的不同分析物，例如长度为0-500bp的核酸。在此类情况下，可以通过进一步的ETP运行来分离一种以上所希望的分析物，例如，在促进所述多于一种分析物分离的不同条件下，和/或可以通过本领域已知的用于分离分析物的其他技术(例如本文所述的那些)分离所述多于一种分析物。在一些实施例中，在一次或多次基于ETP的分离和收集之后，可以收集ETP带并且任选地进行进一步分析。在一些实施例中，ETP带可包括一种或多种正在经历或已经经历基于ETP的分离/纯化且任选地经历收集的靶分析物，该分离/纯化和收集例如作为ETP运行的一部分。
在整个本公开中，术语“核酸”和“核酸分子”可以互换使用。该术语一般是指核苷酸的聚合物(例如，核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、核苷酸类似物等)并包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、DNA-RNA杂交物、寡核苷酸、多核苷酸、适体、肽核酸(PNA)、PNA-DNA缀合物、PNA-RNA缀合物等，它们包含以线性或分支方式共价连接在一起的核苷酸。核酸通常是单链或双链的，并且一般将会包含磷酸二酯键，但在一些情况下，包括可以具有替代骨架的核酸类似物，包括例如磷酰胺(Beaucage等人(1993)Tetrahedron 49(10)：1925)；硫代磷酸酯(Mag等人(1991)Nucleic Acids Res.19：1437和美国专利号5,644,048)、二硫代磷酸酯(Briu等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111：2321)、O-甲基磷酰胺键(参见Eckstein，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，Oxford University Press(1992))、以及肽核酸骨架和键(参见Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114：1895)。其他类似物核酸包括那些带有正电荷骨架的核酸(Denpcy等人(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92∶6097)；非离子骨架(美国专利号5,386,023、5,637,684、5,602,240、5,216,141和4,469,863)和非核糖骨架，包括美国专利号5,235,033和5,034,506中描述的那些。包含一种或多种碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内(参见Jenkins等人(1995)Chem.Soc.Rev.pp.169-176)，并且类似物也描述于例如Rawls，C 8c ENews Jun.2，1997第35页中。可以对核糖-磷酸酯骨架进行这些修饰，以促进添加额外的部分诸如标签或改变这些分子在生理环境中的稳定性和半衰期。
除了通常在核酸中发现的天然存在的杂环碱基(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)之外，核苷酸类似物还可以包括非天然存在的杂环碱基，诸如描述于以下中的那些：例如，Seela等人(1999)Helv.Chim.Acta82：1640。核苷酸类似物中使用的某些碱基可作为解链温度(Tm)调节剂。例如，其中一些包括7-脱氮嘌呤(例如，7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤等)、吡唑并[3，4-d]嘧啶、丙炔基-dN(例如，丙炔基-dU、丙炔基-dC等)等，参见，例如，美国专利号5,990,303。其他代表性的杂环碱基包括例如次黄嘌呤、肌苷、黄嘌呤；2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤的8-氮杂衍生物；腺嘌呤、鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷和黄嘌呤的7-脱氮杂-8-氮杂衍生物；6-氮杂胞苷；5-氟胞苷；5-氯胞苷；5-碘胞苷；5-溴胞苷；5-甲基胞苷；5-丙炔基胞苷；5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶等。
术语核酸和核酸分子一般还可以是指寡核苷酸、oligo、多核苷酸、基因组DNA、线粒体DNA(mtDNA)、互补DNA(cDNA)、细菌DNA、病毒DNA、病毒RNA、RNA、信使RNA(mRNA)、转运RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、siRNA、催化性RNA、克隆物、质粒、M13、PI、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、扩增的核酸、扩增子、PCR产物和其他类型的扩增的核酸、RNA/DNA杂交物和PNA，所有这些都可以是单链或双链形式，并且除非另有限制，否则将涵盖可以以相似方式起作用的天然核苷酸的已知类似物作为天然存在的核苷酸及它们的组合和/或混合物。因此，术语“核苷酸”是指天然存在的和经修饰的/非天然存在的核苷酸，包括存在于多核酸或寡核苷酸内的核苷三磷酸、核苷二磷酸和核苷单磷酸以及单磷酸单体。核苷酸也可以是核糖；2′-脱氧；2′，3′-脱氧以及本领域众所周知的大量的其他核苷酸模拟物。模拟物包括链终止核苷酸，诸如3′-O-甲基、卤代碱基或糖取代；替代性糖结构，包括非糖、烷基环结构；替代性碱基，包括肌苷；脱氮杂修饰的；chi和psi，经连接基修饰；经大量标记修饰的；磷酸二酯修饰或替代，包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硼烷磷酸酯、酰胺、酯、醚；以及基本或完全的核苷酸间替代，包括诸如可光解的硝基苯基部分的裂解键。
“核苷”是指包含与糖部分(核糖或脱氧核糖)、糖部分的衍生物或糖部分的功能等价物(例如碳环)共价连接的碱基或碱性基团(包括至少一个同素环的环、至少一个杂环的环、至少一个芳基基团和/或类似者)的核酸组分。例如，当核苷包括糖部分时，碱基通常连接到该糖部分的1′-位。如上所述，碱基可以是天然存在的碱基或非天然存在的碱基。示例性的核苷包括核糖核苷、脱氧核糖核苷、双脱氧核糖核苷和碳环核苷。
“嘌呤核苷酸”是指包含嘌呤碱基的核苷酸，而“嘧啶核苷酸”是指包含嘧啶碱基的核苷酸。
“修饰的核苷酸”是指稀有或次要的核酸碱基、核苷酸、以及常规碱基或核苷酸的修饰、衍生物或类似物，并且包括具有修饰的碱基部分和/或修饰的糖部分的合成核苷酸(参见Protocols for Oligonucleotide Conjugates，Methods in Molecular Biology，Vol.26(Suhier Agrawal，Ed.，Humana Press，Totowa，N.J.，(1994))；和Oligonucleotidesand Analogues，A Practical Approach(Fritz Eckstein，Ed.，IRL Press，OxfordUniversity Press，Oxford))。
如本文所用，“寡核苷酸”是指通过磷酸二酯键或其类似物连接的天然或经修饰的核苷单体的线性寡聚物。寡核苷酸包括能够与靶核酸特异性结合的脱氧核糖核苷、核糖核苷、其端基异构体形式、PNA等。通常，单体通过磷酸二酯键或其类似物连接以形成寡核苷酸，其大小范围从几个单体单元，例如3-4个，到几十个单体单元，例如40-60个。每当寡核苷酸由字母序列表示时，诸如“ATGCCTG”，应理解的是核苷酸从左至右为5′-3′顺序，并且除非另有说明，否则“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示脱氧胸苷，以及“U”表示核糖核苷尿苷。通常，寡核苷酸包含四个天然的脱氧核苷酸；然而，它们也可以包含核糖核苷或非天然的核苷酸类似物。当酶对活性具有特定的寡核苷酸或多核苷酸底物要求时，例如单链DNA、RNA/DNA双链体等，那么为该寡核苷酸或多核苷酸底物选择合适的组合物是本领域普通技术人员所熟知的。
如本文所用，“寡核苷酸引物”或简称为“引物”是指与靶核酸模板上的序列杂交并可以促进寡核苷酸探针的检测或扩增的多核苷酸序列。在扩增过程中，寡核苷酸引物用作核酸合成的起始点。在非扩增过程中，寡核苷酸引物可用于产生能够被裂解剂裂解的结构。引物可以具有各种长度，并且通常长度小于50个核苷酸，例如长度为12-25个核苷酸。可以基于本领域技术人员已知的原理来设计用于PCR的引物的长度和序列。
如本文所用，术语“寡核苷酸探针”是指能够与目标靶核酸杂交或退火并允许靶核酸进行特异性检测的多核苷酸序列。
当额外的核苷酸被掺入核酸时，例如通过核苷酸掺入生物催化剂掺入在核酸的3′末端时，核酸被“延伸”或“伸长”。
如本文所用，术语“杂交”和“退火”等可互换使用，是指一种多核苷酸与另一种多核苷酸(通常是反平行多核苷酸)的碱基配对相互作用，导致形成双链体或其他更高阶结构，通常称为杂交复合物。反平行多核苷酸分子之间的主要相互作用通常是碱基特异性的，例如A/T和G/C，通过Watson/Crick和/或Hoogsteen型氢键进行。实现杂交并不要求两个多核苷酸在其全长上具有100％的互补性。在一些方面，杂交复合物可以由分子间相互作用形成，或者替代性地，可以由分子内相互作用形成。
术语“互补”意为一个核酸与另一个核酸分子相同或选择性杂交。当发生比完全缺乏特异性更具选择性的杂交时，就存在杂交选择性。一般而言，当在至少14-25个核苷酸的一段中具有至少约55％，优选至少65％，更优选至少75％，最优选至少90％的同一性时，将发生选择性杂交。优选地，一个核酸与另一个核酸特异性杂交。参见M.Kanehisa，NucleicAcids Res.12：203(1984)。
“完美互补”的引物具有在整个引物长度上完全互补的序列并且没有错配。引物通常与靶序列和/或靶核酸的一部分(子序列)完美互补。“错配”是指引物中的核苷酸与其所比对的靶核酸中的核苷酸不互补的位点。当关于引物而使用时，术语“基本互补”是指引物与其靶序列不完美互补；相反，引物的互补程度仅足以在所希望的引物结合位点与其各自的链选择性杂交。
如本文所用，术语“靶核酸”旨在表示其存在将被检测、测量、扩增和/或经历进一步测定和分析的任何核酸。靶核酸可以包括任何单链和/或双链核酸。靶核酸可以作为分离的核酸片段或者是更大核酸片段的一部分存在。靶核酸可以源自或分离自基本上任何来源，例如培养的微生物、未培养的微生物、复杂的生物学混合物、生物学样品、组织、血清、古老或保存的组织或样品、环境分离物等。此外，靶核酸包括或源自cDNA、RNA、基因组DNA、克隆的基因组DNA、基因组DNA文库、酶促片段化的DNA或RNA、化学片段化的DNA或RNA、物理片段化的DNA或RNA等。在示例性实施例中，靶核酸可包含全基因组。在示例性实施例中，靶核酸可包含样品和/或生物学样品的全部核酸含量。在示例性实施例中，靶核酸可包含循环或无细胞DNA，例如存在于患有癌症的个体中的循环肿瘤DNA(“ctDNA”)或存在于孕妇的血浆或血清中的循环胎儿或循环母体DNA(“cfDNA”)片段。靶核酸可以以多种不同形式出现，包括例如简单或复杂的混合物，或以基本上纯化的形式出现。例如，靶核酸可以是含有其他成分的样品的一部分，也可以是样品的唯一或主要成分。靶核酸也可以具有已知或未知的序列。
术语“扩增反应”是指用于扩增核酸靶序列的拷贝的任何体外方式。
术语“扩增(amplification)”和“扩增(amplifying)”等一般是指导致分子或相关分子组的拷贝数增加的任何过程。扩增反应的成分可包括但不限于例如引物、多核苷酸模板、核酸聚合酶、核苷酸、dNTP等。术语“扩增”通常是指靶核酸中的“指数”增加。然而，如本文所用，“扩增”还可以指核酸的选定靶序列的数目的线性增加。扩增通常从少量的靶核酸(例如靶核酸的单拷贝)开始，其中扩增的材料通常是可检测的。靶核酸的扩增包括多种化学和酶促过程。可以通过聚合酶链反应(PCR)、热启动PCR、链置换扩增(SDA)反应、转录介导的扩增(TMA)反应、基于核酸序列的扩增(NASBA)反应或连接酶链反应(LCR)来实施从靶核酸的一个或几个拷贝产生多个DNA拷贝。扩增不限于起始靶核酸的严格复制。例如，使用RT-PCR从样品中有限数量的病毒RNA生成多个cDNA分子是一种扩增形式。此外，在转录过程期间从单个DNA分子产生多个RNA分子也是一种扩增形式。扩增之后可以任选地有附加步骤，例如但不限于标记、测序、纯化、分离、杂交、大小拆分、表达、检测和/或克隆。
如本文所用，术语“靶微生物”旨在表示在血液、血浆、其他体液、样品诸如生物学样品和/或组织中发现的任何单细胞或多细胞微生物，例如与感染性病症或疾病相关的微生物。其示例包括细菌、古细菌、真核生物、病毒、酵母菌、真菌、原生动物、变形虫和/或寄生虫。微生物引起的疾病和可能引起此类疾病的微生物的其他示例可在下表1中找到。因此，术语“微生物”一般是指可能引起疾病的微生物，无论是指疾病还是指致病微生物。
表1
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如本文所用，术语“生物标志物”或“目标生物标志物”是指在血液、血浆、其他体液和/或组织中发现的生物学分子，其作为正常或异常过程或病症或疾病(例如癌症)的标志。生物标志物可用于观察身体对疾病或病症的治疗的应答。在癌症的情况下，生物标志物是指指示体内癌症存在的生物物质。生物标志物可以是由肿瘤分泌的分子或身体对癌症存在的特异性反应。遗传、表观遗传学、蛋白质组学、糖类和影像学生物标志物可用于癌症的诊断、预后和流行病学。可以在无创性收集的生物流体(例如血液或血清)中测定此类生物标志物。几种基于基因和蛋白质的生物标志物已用于患者护理中，包括但不限于AFP(肝癌)、BCR-ABL(慢性粒细胞白血病)、BRCA1/BRCA2(乳腺癌/卵巢癌)、BRAF V600E(黑素瘤/结直肠癌)、CA-125(卵巢癌)、CA19.9(胰腺癌)、CEA(结直肠癌)、EGFR(非小细胞肺癌)、HER-2(乳腺癌)、KIT(胃肠道间质瘤)、PSA(前列腺特异性抗原)(前列腺癌)、S100(黑素瘤)等。生物标志物可用作诊断(鉴定早期癌症)和/或预后(预想癌症的侵袭性和/或预测受试者对特定治疗的应答程度和/或癌症复发的可能性)。目标生物标志物包括但不限于肿瘤生物标志物，诸如AKAP4、ALK、APC、AR、BRAF、BRCA1、BRCA2、CCND1、CCND2、CCND3、CD274、CDK4、CDK6、CFB、CFH、CFI、DKK1、DPYD、EDNRB、EGFR、ERBB2、EPSTI1、ESR1、FCRL5、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FLT3、FN14、HER2、HER4、HERC5、IDH1、IDH2、IDO1、KIF5B、KIT、KRAS、LGR5、LIV1、LY6E、LYPD3、MACC1、MET、MRD、MSI、MSLN、MUC16、MYC、NaPi3b、NRAS、PDGFRA、PDCD1LG2、RAF1、RNF43、NTRK1、NTSR1、OX40、PIK3CA、RET、ROS1、Septin 9、TERT、TFRC、TROP2、TP53、TWEAK和UGT1A1。
其他示例性的目标生物标志物可以包括Her2、bRaf、ERBB2扩增、P13KCA突变、FGFR2扩增、p53突变、BRCA突变、CCND1扩增、MAP2K4突变、ATR突变或其表达与特定癌症相关的任何其他生物标志物；AFP、ALK、BCR-ABL、BRCA1/BRCA2、BRAF、V600E、Ca-125、CA19.9、EGFR、Her-2、KIT、PSA、S100、KRAS、ER/Pr、UGT1A1、CD30、CD20、F1P1L1-PDGRFα、PDGFR、TMPT和TMPRSS2中的至少一者；或选自以下项的至少一种生物标志物：ABCB5、AFP-L3、甲胎蛋白、α-甲基乙酰辅酶A消旋酶、BRCA1、BRCA2、CA15-3、CA 242、Ca27-29、CA-125、CA15-3、CA19-9、降钙素、癌胚抗原、癌胚抗原肽-1、脱-γ-羧基凝血酶原、早期前列腺癌抗原-2、雌激素受体、纤维蛋白降解产物、葡萄糖-6-磷酸酯异构酶、HPV抗原(诸如vE6、E7、L1、L2或p16INK4a)、人绒毛膜促性腺激素、IL-6、角蛋白19、乳酸脱氢酶、亮氨酰氨肽酶、促脂解素、变肾上腺素类物质、脑啡肽酶、NMP22、去甲变肾上腺素、PCA3、前列腺特异性抗原、前列腺酸性磷酸酶、突触素、甲状腺球蛋白、TNF、选自ERG、ETV1(ER81)、FLI1、ETS1、ETS2、ELK1、ETV6(TEL1)、ETV7(TEL2)、GABPα、ELF1、ETV4(E1AF；PEA3)、ETV5(ERM)、ERF、PEA3/E1AF、PU.1、ESE1/ESX、SAP1(ELK4)、ETV3(METS)、EWS/FLl1、ESE1、ESE2(ELF5)、ESE3、PDEF、NET(ELK3；SAP2)、NERF(ELF2)或FEV的转录因子。XXX，肿瘤相关糖蛋白72、c-kit、SCF、pAKT、pc-kit和波形蛋白。替代性地或此外，目标生物标志物可以是免疫检查点抑制剂，诸如但不限于CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TIM3、GAL9、GITR、LAG3、VISTA、KIR、2B4、TRPO2、CD160、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR、TL1A和B-7家族配体或其组合，或者是选自由以下所组成的组中的检查点蛋白的配体：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7家族配体，或其组合。其他示例性生物标志物可包括但不限于包括，与以下项相关的任何一种或多种生物标志物：急性成淋巴细胞性白血病(etv6、am11、亲环蛋白b)、B细胞淋巴瘤(Ig-独特型)、神经胶质瘤(E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白、γ-连环蛋白、p120ctn)、膀胱癌(p21ras)、胆道癌(p21ras)、乳腺癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、宫颈癌(p53、p21ras)、结肠癌(p21ras、HER2/neu、c-erbB-2、MUC家族)、结直肠癌(结直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、APC)、绒毛膜癌(CEA)、上皮细胞癌(亲环蛋白b)、胃癌(HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白)、肝细胞癌(甲胎蛋白)、霍奇金淋巴瘤(Imp-1、EBNA-1)、肺癌(CEA、MAGE-3、NY-ESO-1)、淋巴样细胞源性白血病(亲环蛋白b)、黑色素瘤(p5蛋白、gp75、癌胎抗原、GM2和GD2神经节苷脂、Melan-A/MART-1、cdc27、MAGE-3、p21ras、gp100.sup.Pmel117)、骨髓瘤(MUC家族、p21ras)、非小细胞肺癌(HER2/neu、c-erbB-2)、鼻咽癌(Imp-1、EBNA-1)、卵巢癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、前列腺癌症(前列腺特异性抗原(PSA)及其抗原表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、PSMA、HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白)、肾癌(HER2/neu、c-erbB-2)、宫颈和食道鳞状细胞癌(病毒产物，诸如人乳头瘤病毒蛋白)、睾丸癌(NY-ESO-1)和/或T细胞白血病(HTLV-1表位)。
如本文所用，术语“样品”包括包含核酸和/或靶核酸的标本或培养物(例如微生物学培养物)。术语“样品”还意为包括生物、环境和化学样品，以及希望对其进行分析的任何样品。样品可包括合成来源的标本。样品可以包括来自可以衍生一种或多种微生物的任何来源的一种或多种微生物。“生物学样品”可以包括但不限于全血、血清、血浆、脐带血、绒毛膜绒毛、羊水、脑脊髓液、脊髓液、灌洗液(例如，支气管肺泡、胃、腹膜、导管、耳朵、关节镜)、活检样品、尿液、粪便、痰、唾液、鼻粘液、前列腺液、精液、淋巴液、胆汁、眼泪、汗液、母乳、乳房液、胚胎细胞和胎儿细胞。生物学样品可以是血液，也可以是血浆。如本文所用，术语“血液”涵盖全血或血液的任何级分，诸如常规定义的血清和血浆。血浆是指对用抗凝血剂处理过的血液进行离心产生的全血级分。血清是指血液样品凝结后残留的流体的水状部分。环境样品包括环境材料，诸如表面物质、土壤、水和工业样品，以及从食品和奶制品加工仪器、设备、装备、器皿、一次性和非一次性物品中获得的样品。
“代表性”样品可包括样品的不同亚群，例如，包含肿瘤内所包含的癌细胞的样品。替代性地，“代表性”样品可包括正常和/或对照样品中的不同亚群，例如正常或对照细胞，或可分别包括测试和正常/对照样品的混合样品，例如肿瘤细胞和正常细胞。更有利地，这些代表性样品可用于多种测定方法中，而不损害该标本用于传统诊断测定中的能力。在示例性实施例中，代表性样品可以通过使用本文所述的装置和方法分析样品(例如包含肿瘤细胞的样品)来产生。在一些实施例中，代表性样品可以通过本文所述的装置和方法进行分析。此外，通过使用本文所述的装置和方法分析样品而产生的代表性样品可同时用于几种不同的测定格式，以检测样品中甚至较小的样品亚群的存在，例如肿瘤或淋巴结。
如本文所用，术语“靶分析物”旨在表示其存在将被检测、测量、分离、浓缩和/或经历进一步测定和分析的任何分析物。在示例性实施例中，所述分析物可以是但不限于任何离子、分子、核酸、生物标志物、细胞或细胞群，例如希望的细胞等，希望对其进行检测、测量、分离、浓缩和/或用于进一步的分析。在示例性实施例中，靶分析物可源自本文所述的任何样品。
术语“分析”一般是指涉及物理、化学、生化或生物分析的过程或步骤，包括表征、测试、测量、优化、分离、合成、添加、过滤、溶解或混合。
术语“化学品”是指物质、化合物、混合物、溶液、乳液、分散体、分子、离子、二聚物、大分子诸如聚合物或蛋白质、生物学分子、沉淀物、晶体、化学部分或基团、颗粒、纳米颗粒、试剂、反应产物、溶剂或流体，其任何一者都可以以固态、液态或气态存在，并且通常是分析的对象。
术语“蛋白质”一般是指一组通常以特定序列连接在一起的氨基酸。蛋白质可以是天然存在的，也可以是人造的。如本文所用，术语“蛋白质”包括已被修饰以含有以下项的氨基酸序列：部分或基团诸如糖、聚合物、金属有机基团、荧光或发光基团；增强或参与过程诸如分子内或分子间电子转移的部分或基团；促进或诱导蛋白质呈现特定构象或一系列构象的部分或基团；阻碍或抑制蛋白质呈现特定构象或一系列构象的部分或基团；诱导、增强或抑制蛋白质折叠的部分或基团；或掺入氨基酸序列并旨在修饰序列的化学、生化或生物学性质的其他部分或基团。如本文所用，蛋白质包括但不限于酶、结构元件、抗体、激素、电子载体和其他参与过程例诸如细胞过程或活动的大分子。蛋白质通常具有多达四个结构级别，包括一级、二级、三级和四级结构。
出于本公开的目的，应当理解，当给定部件诸如层、区域、液体或基底在本文中被称为设置或形成在另一组件“上”、“中”或“处”时，该给定部件可以直接位于另一部件上，或者替代性地，也可以存在中间部件(例如，一个或多个缓冲层、夹层、电极或触点)。还应理解，术语“设置在”和“形成在”可互换使用以描述给定部件如何相对于另一部件定位或定点。因此，术语“设置在”和“形成在”并非旨在引入与材料传输、设置或制造的特定方法相关的任何限制。
术语“连通”在本文中用于表示两个或多个部件或元件之间的结构、功能、机械、电、光、热或流体关系，或其任何组合。因此，一个部件被称为与第二部件连通的事实并不旨在排除附加部件可能存在于第一和第二部件之间和/或可操作地关联或接合第一和第二部件的可能性。
如本文所用，“受试者”是指待治疗和/或从其获得生物学样品的哺乳动物受试者(诸如人、啮齿动物、非人灵长类动物、犬科动物、牛科动物、羊亚科动物、马科动物、猫科动物等)。
术语“肿瘤”是指团块或赘生物，其本身被定义为细胞的异常新生长，这种细胞通常比正常细胞生长更快，并且如果不治疗将会继续生长，有时会导致对邻近结构的损害。肿瘤大小可能相差很大。肿瘤可以是实体的或液体填充的。肿瘤可以指良性(非癌性，一般无害)、恶变前(癌前)或恶性(癌性)生长。癌性、癌前病变和癌性生长之间的分界线并不总是很清楚(有时确定哪个是哪个可能是任意的，特别是如果肿瘤处于频谱的中间)，但每种类型的生长都有一般特性。良性肿瘤是非恶性/非癌性肿瘤。良性肿瘤通常是局部的，不会扩散(转移)到身体的其他部位。大多数良性肿瘤对治疗应答良好。然而，如果不及时治疗，一些良性肿瘤会长大并且因为它们的大小而导致严重的疾病。通过这种方式，良性肿瘤可以模拟恶性肿瘤，并因此有时会进行治疗。恶变前或癌前肿瘤还不是恶性的，但它已准备好变成恶性。恶性肿瘤是癌性生长。它们通常对治疗有抵抗力，可能会扩散到身体的其他部位，有时在移除后会复发。“癌症”是恶性生长(恶性肿瘤或赘生物)的另一个术语。
不同肿瘤的毒力不同。某些癌症相对容易治疗和/或治愈，而其他癌症更具侵袭性。肿瘤毒力可以至少部分地通过差异基因表达来确定。在癌细胞(包含恶变前和/或恶性肿瘤的细胞)中，允许细胞活化或沉默基因的机制被破坏。因此，通常会存在其他组织和/或其他发育阶段的特异性基因的异常活化。例如，在肺癌中，表达对于游动精子的产生具有特异性的基因(该基因应该是沉默的)的肿瘤细胞具有极强的毒力(一种高风险的癌症，其表现出增强的增殖能力，并且可以躲避身体的免疫系统)。还表明，在几乎所有癌症中，生殖系和胎盘中的数十个特异性基因被异常活化。参见，例如，Rousseaux等人，EctopicActivation of Germline and Placental Genes Identifies Aggressive Metastasis-Prone Lung Cancers.Science Translational Medicine(2013)5(186)：186。因此，由于基因的上调或下调可能与特定癌症的毒力形式有关，因此有可能在诊断阶段预测哪些癌症具有高复发风险和致命预后，即使在其中在肿瘤发展的早期阶段得到充分治疗的情况下。
“电阻率”，也称为“电阻系数”、“比电阻”或“体积电阻率”，如本领域常规理解的那样使用，并且一般是指材料的定量该材料抵抗电流流动的强度的性质。低电阻率通常表示可以容易地允许电流流动的材料。电阻率通常用希腊字母ρ(rho)表示。电阻率的SI单位是欧姆-米(Ω·m)。
“电导率”，也称为“电导系数”或“比电导率”，一般是指电阻系数的倒数，并且通常衡量材料传导电流的能力。它通常由希腊字母σ(sigma)表示，但偶尔也会使用κ(kappa)(特别是在电气工程中)或γ(gamma)。它的SI单位是西门子每米(S/m)。
在加速电泳装置、系统或机器的上下文中，“检测”样品可以包括在整个装置中的一个、几个或许多点处检测其位置。检测一般可以通过不干扰希望的装置、系统或机器功能以及使用所述装置、系统或机器进行的方法的任何一种或多种方式发生。在一些实施例中，检测包括任何电检测手段，例如通过检测电导率、电阻率、电压、电流等。此外，在一些实施例中，检测可包括以下任何一种或多种：电检测、热检测、光学检测、光谱检测、光化学检测、生化检测、免疫化学检测和/或化学检测。在一些实施例中，在基于ETP的分离/纯化和任选地收集一种或多种靶分析物期间可以检测所述一种或多种靶分析物，例如cfNA。在一些实施例中，在基于ETP的分析期间可以检测任何一种或多种分析物。
“机器人液体处理器”或“液体处理器”是一种机器人系统，用于化学或生化实验室的自动化，将选定数量的试剂、样品或其他液体分配到指定的容器中。一些版本可以从电动移液器或注射器中分配指定体积的液体；一些系统还可以操纵分配器和容器的位置(通常是笛卡尔坐标机器人)和/或集成额外的实验室装置或附件，诸如酶标仪、热封机、加热器/振荡器、条形码阅读器、分光光度或分离装置和仪器、存储装置、废物容器和培养箱。除了电动移液器或注射器之外，机器人液体处理器还可以具有用于样品井的托盘或用于固定样品小瓶的托盘、匹配移液器的移液器吸头托盘以及溶剂容器。在一些实施例中，与本装置、系统和方法一起使用的生物学样品可以在样品井、小瓶或一般用于当前或将来开发的机器人液体处理器上的任何其他样品容器中。本文描述的方法、装置和系统可以采用机器人液体处理器，该机器人液体处理器能够在笛卡尔3轴运动上操纵移液器吸头的位置，通常通过臂机构实施，并且具有多通道移液能力。为了进一步减少人为交互，还希望将分光光度或分离仪器与处理程序集成在一起。示例性机器人液体处理器包括来自
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公司的
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STARTM、STARlet、STARplus、VANTAGE Liquid Handling
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或
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来自
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的Bravo自动液体处理平台；来自
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的
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来自Beckman
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的
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4000、i5、i7、NX或FX；来自GilsonTM的
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系统或
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系统；来自
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的
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Freedom
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或D300e数字分配器；来自CTC Analytics的
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系统；或来自
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的MPS。在一些实施例中，用于本发明的方法或系统中的自动化液体处理器是能够被修改以进行移液的那些。液体处理器还可以与多种其他体外诊断方法和装置集成，包括例如测序、纯化和分离-质谱仪。可以使用和/或修改任何市售机器人液体处理器以与本文所述的用于样品分析的装置、方法和系统协同工作，例如用于实施ETP的那些装置、方法和系统，例如用于一种或多种靶分析物的基于ETP分离/纯化的装置、方法和系统。
术语“移液器吸头”是一个专业术语，指的是具有在此称为“毂”的较大端和在此称为“输送尖头”的较窄端的锥形管，它经过精密设计以用于液体的精确采样和输送。毂通常通过摩擦配合安装在移液器或机器人液体处理器的筒体上。吸头毂的内径必须略大于移液器的筒体，并且吸头的内锥度也必须与移液器筒体的锥度相匹配。大多数手持移液器和机器人液体处理器系统的制造商都生产使用通用吸头的移液器。毂位于移液器吸头的近端，而输送尖头位于远端。移液器吸头以气密方式安装在微量移液器的筒体上，使得当移液器的柱塞被按压和释放时，就会施加真空，并将流体吸入移液器吸头内。通过再次压下柱塞，可以根据需要将流体输送到任何容器。一些移液器吸头通过使用垫圈而不是移液器吸头的锥度密封到移液器的筒体上。一些机器人移液器吸头不是摩擦配合的，而是使用可扩展的O形图来实施液体移液所需的气密密封。因此，移液器吸头有多种大小可供选择，以配合不同的移液器。优选地，移液器吸头在靠近毂的外表面上具有一个或多个脊，使得脊允许吸头存放在具有孔阵列的平台上，脊防止锥形吸头下沉太远进入孔内和被卡住的风险。这种脊在移液器吸头上很常见。常见的脊样式包括完全环绕移液器吸头的环形脊和多个垂直翅片，它们提供强度，将吸头支撑在孔上，并且还使材料和重量最小化。组合也很常见。在一些实施例中，脊用于将移液器吸头存放在外壳的颈部上。在一些实施例中，本领域已知的任何一种或多种类型的移液器吸头可与本文所述的装置、方法和系统协同使用以产生希望的结果。
术语“机器人移液器吸头”是指其在毂中的内锥度适合机器人液体处理器的移液器吸头。在大多数情况下，机器人移液器吸头和手持移液器的移液器吸头之间没有差异，但在某些情况下可能存在大小差异。“宽口径移液器吸头”是一种移液器吸头，其输送尖端的孔口比标准传统或类似体积大小的机器人移液器吸头更宽。一般而言，远端孔口比标准吸头大得多。大口径移液器吸头可具有能够配合标准移液器或机器人液体处理器的毂。术语“过滤式移液器吸头”是指标准或机器人移液器吸头，其已被修改为在靠近窄开口的远(底)端处具有过滤器、筛网或筛板。过滤式移液器吸头可任选地包括基材、吸附剂、屏障或其组合，并且任选地包括垫圈。术语“吸头套吸头”是指“顶部”移液器吸头配合在第二个“底部”移液器吸头内的配置。顶部移液器吸头通常是标准或大口径移液器吸头，底部移液器吸头是过滤式移液器吸头，具有可选的基材、吸附剂、屏障或其组合。顶部移液器吸头不必是大口径，但大口径允许混合含有固体颗粒物质的和/或粘性的样品溶液。在一些实施例中，本领域已知的任何一种或多种类型的机器人移液器吸头可与本文所述的装置、方法和系统协同使用以产生希望的结果。
如本文所用，术语“自动化”是指无需“通过手工”(即手动)执行程序或方法的任何一个或多个步骤(例如样品收集)的情况，但其中所述所希望的步骤或程序(例如样品收集)可以通过一个或多个合适的装置或系统诸如一个或多个机器人、液体处理机器人和/或其他(例如声学)液体转移装置进行，该装置或系统在进行一个或多个步骤之前被编程，使得相应的步骤和模式(特别是收集步骤)根据已编程的内容以自动化方式进行。在一些实施例中，存储收集的样品或立即将收集的样品转移到另一个系统或装置以用于进一步纯化、处理、分析或其他IVD方法也是自动化的(例如通过使用机器人)。
如本文所用，术语“部分”包括用于在本文所述的系统、装置或方法中进行分析的任何合适的样品。这种样品可以包括任何生物学样品、环境样品、工业样品、物质、液体、固体、气体、悬浮液、胶体、化学品、混合物、缓冲液、溶剂、分析物、电解质、溶液、核酸、多肽、金属、流体、反应物、试剂、可检测标签、染料、无机离子、有机离子、盐、聚合物、肽、多糖、细胞、细菌和/或病毒。
在样品分析装置或系统中，术语“样品收集体积”是指在分析期间或之后预期用于收集的样品体积，例如由机器人液体处理器收集。在用于实施加速电泳的装置或包括这种装置的系统中，样品收集体积是预期用于在加速电泳期间或之后包括样品的收集体积。在一些实施例中，样品收集体积可位于本文所述的装置或系统的中心井中。在一些实施例中，样品收集体积可位于允许收集所希望的样品的任何地方。在一些实施例中，样品收集体积可以在样品加载区域和前导电解质电极/收集池之间的任何位置。样品收集体积可由装置或系统的任何合适的区域、容器、井或空间构成。在一些实施例中，样品收集体积由井、膜、区室、小瓶、移液器等构成。在一些实施例中，样品收集体积可以由装置或系统的部件内或部件之间的空间形成，例如，两个凝胶之间的空间或凝胶中的孔。
如本文所用，术语“无细胞核酸”(“cfNA”)一般是指可在生物体的血流中发现的非封装核酸。在一些情况下，cfNA可以从血液、血浆和/或血清样品等中分离。在一些情况下，无细胞核酸可以是无细胞DNA(cfDNA)。在一些情况下，无细胞核酸可以是无细胞RNA(cfRNA)。在一些情况下，无细胞核酸可以是无细胞DNA(cfDNA)和无细胞RNA(cfRNA)的混合物。在一些情况下，cfNA可包含胎儿DNA和/或母体DNA。在一些情况下，来自孕妇的血液样品和/或血浆样品可包含cfNA。在一些情况下，cfNA可包含循环肿瘤核酸(ctNA)。在一些情况下，cfNA可包含长度为约1000bp或更长、1000bp或更短、900bp或更短、800bp或更短、700bp或更短、600bp或更短、500bp或更短、400bp或更短、300bp或更短、250bp或更短、200bp或更短、150bp或更短，例如，约180bp或更短的DNA和/或RNA片段。在一些情况下，可以使用本文所述的基于ETP的装置和方法分离/纯化和任选地收集cfNA。在一些实施例中，在基于ETP的分离/纯化之后，分离/纯化的cfNA可以被收集并且可以经历本文描述的任何一种或多种进一步分析技术，例如测序，例如在标题为“与本文所述的装置和方法关联使用的其他方法”的部分中描述的那些。
如本文所用，术语“循环肿瘤核酸NA”(ctNA)是指源自癌性细胞例如肿瘤细胞的cfNA。在一些情况下，ctDNA可能会在癌性细胞凋亡或坏死期间进入血流。在一些情况下，肿瘤核酸可以是循环肿瘤RNA(ctRNA)。在一些情况下，循环肿瘤核酸可以是循环肿瘤DNA(ctDNA)。ctNA可以是ctDNA和ctRNA的混合物。在一些实施例中，ctNA可以使用本文所述的基于ETP的装置和方法来分离/纯化和任选地收集。在一些实施例中，在基于ETP的分离/纯化之后，分离/纯化的ctNA可以被收集并且可以经历本文描述的任何一种或多种进一步分析技术，例如测序，例如在标题为“与本文所述的装置和方法关联使用的其他方法”的部分中描述的那些。在一些情况下，ctNA可包含长度为约1000bp或更长、1000bp或更短、900bp或更短、800bp或更短、700bp或更短、600bp或更短、500bp或更短、400bp或更短、300bp或更短、250bp或更短、200bp或更短、150bp或更短，例如，长度为约150bp或更短的DNA片段和/或RNA片段。
如本文所用，术语“ETP上位标记物”一般是指与靶核酸相比大小更大和/或长度更长的化合物或分子，使得在基于ETP的靶分析物分离/纯化和随后的收集期间，ETP上位标记物表示可以停止收集靶分析物的截止点。例如，荧光标记的或以其他方式可检测地标记的ETP上位标记物可以产生为大小大于在基于ETP的分离/纯化期间待分离/纯化和收集的靶DNA。通过在整个ETP运行过程中监控标记物，使用者或自动化机器能够在标记物落入收集管之前停止运行，从而允许捕获小于标记物的DNA，同时由于较大的污染DNA定位在上位标记物后面而将其留在管外。此外，不收集ETP上位标记物本身，因此该上位标记物可以大量使用并与各种可检测标签一起使用，因为它不会干扰下游测定，例如，在标题为“与本文所述的装置和方法关联使用的其他方法”的部分中描述的那些。在一些情况下，ETP上位标记物可用于基于ETP的分离/纯化方法，因为它有助于从一种或多种靶分析物的分离/纯化和收集的样品中排除基因组DNA。
如本文所用，术语“ETP装置”、“用于实施ETP的装置”、“用于ETP的装置”等可互换使用以指代可进行或可在其上进行ETP和/或包括ETP的方法的装置。
如本文所用，术语“基于ETP的分离/纯化”一般是指包含ETP的装置和方法，例如可以在其上实施ETP的装置，例如包括实施ETP的方法，其中ETP将一种或多种靶分析物聚焦在一个或多个聚焦区(例如，一个或多个ETP带)内，从而将一种或多种靶分析物与初始样品包含的其他材料分离/纯化，例如将cfNA与基因组DNA分离/纯化。注意，术语“分离”和“纯化”可互换使用。此外，基于ETP的分离/纯化一般允许包含所述一种或多种靶分析物的一个或多个聚焦区(一个或多个ETP带)的后续收集。通过一次或多次基于ETP的分离/纯化实施的一种或多种靶分析物的分离/纯化程度可以是一种或多种靶分析物的与其他材料分离/纯化的任何程度或量。在一些实施例中，基于ETP的从样品中分离/纯化靶分析物法可产生1％或更低、1％或更高、5％或更高、10％或更高、15％或更高、20％或更高、25％或更高、30％或更高、35％或更高、40％或更高、45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高或者99％或更高纯度的所述靶分析物，例如，如通过分析技术所测量，以确定包含一种或多种靶分析物的ETP分离/纯化的样品的组成。在一些实施例中，基于ETP的从样品中分离/纯化靶分析物法可使得从原始样品回收1％或更少、1％或更多、5％或更多、10％或更多、15％或更多、20％或更多、25％或更多、30％或更多、35％或更多、40％或更多、45％或更多、50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、85％或更多、90％或更多、95％或更多或者99％或更多的靶分析物。在一些实施例中，可以进行一次或多次基于ETP的分离/纯化以分离/纯化一种或多种靶分析物。例如，在一些情况下，可以对包含一种或多种靶分析物的样品进行基于ETP的分离/纯化，以将一种或多种靶分析物聚焦到一个聚焦区(ETP带)中，这基本上将一种或多种靶分析物与原始样品中包含的其他材料分离。样品可以在ETP分离/纯化之后收集，并且分离/收集的样品可以进一步经历另一次基于ETP的分离/纯化。任选地，第二次基于ETP的分离-纯化可以在一定条件下进行，以便在多于一种靶分析物的情况下，将一种或多种靶分析物中的每一种分离到单独的聚焦区中，每个聚焦区可以任选地单独收集，从而(如果希望)将靶分析物彼此分离。
如本文所用，术语“混合样品”一般是指包含来自一种以上来源的材料的样品，例如包含胎儿和母体cfNA两者的血液样品，例如包含源自宿主和感染源两者的cfDNA的血液样品。
装置和方法
本公开一般描述用于样品分析的装置和方法，其中所述装置和方法包括实施加速电泳。在示例性实施例中，与通常可用于传统的等速电泳的毛细管或微流体通道设计相反，所述装置和方法包括使用同心或多边形盘(例如，圆形的)设计来实施加速电泳。如本文所讨论的，本公开的装置和方法赋予许多有利的性质和特征。例如，用于加速电泳的装置架构能够分析大样品体积，例如15mL或更多样品和/或生物学样品，而传统的毛细管或微流体技术一般仅配备为处理微升规模的体积。此外，本装置和方法允许从样品和/或生物学样品中提取全基因组和/或全核酸含量，而当使用传统的基于毛细管或微流体的装置和方法，特别是基于ITP的毛细管或微流体装置和方法时，这种提取将会是难以进行的。此外，通过使用本文所述的装置和方法获得的靶核酸的高效提取有助于下游体外诊断(IVD)方法，在该方法中，靶核酸(例如DNA和/或RNA)的量与可在所述下游IVD测定中实现的灵敏度直接相关。有时，传统上可以使用在其表面上结合核酸的旋转柱或磁性玻璃颗粒来实施核酸的提取。与这些传统方法相比，本文所述的装置和方法可赋予以下任何一个或多个优点：与基于柱或珠的提取方法相比更高的提取产率(损失可能更少)；与MagNA Pure或其他台式仪器的较大占地面积相比，装置设置更简单；与应用于类似用途的其他装置相比，样品周转可能更快并且具有高并行性；易于与其他用于提取的核酸的下游处理的基于微流体的系统集成。此外，扁平通道一般可用于本文所述的装置和方法中，并且与一般可用于毛细管和/或微流体装置中的窄通道相比，所述通道架构一般可具有有利的传热能力。因此，使用所述扁平通道可以防止样品和/或聚焦样品的过热或沸腾。此外，本文所述的装置和方法通常允许进行温和的样品收集，这在进行全基因组提取、微生物提取、其中希望保留细胞功能的所希望的靶细胞(诸如干细胞、肿瘤细胞例如循环肿瘤细胞、或其他稀有细胞)提取时通常可能是重要特征，或者允许用于其他不稳定的分析物。一般而言，传统的全基因组提取可能以使用移液器为特征，这可能会剪切基因组DNA。在一些实施例中，本文描述的装置和方法允许在不需要潜在地破坏性移液的情况下获得样品，在一些示例性实施例中，其中通过移液对样品的破坏可能是一个问题。在进一步的实施例中，本文所述的装置和方法可以允许进行全基因组提取，其中由于使用所述装置和方法，全基因组的任何部分的剪切和/或破坏可能不会发生或最小。
此外，本公开一般涉及用于样品分析的装置和方法。如本文所述，用于样品分析的装置和方法一般涉及使用所述装置或方法实施加速电泳。用于实施加速电泳的装置一般包括足以实施所述加速电泳的一个或多个电极的布置。在示例性实施例中，所述装置包括多边形或圆形几何形状。在使用这种示例性装置对样品进行基于加速电泳的分析期间，装置的加速电泳区可以从多边形或圆形的边缘向多边形或圆形的中心移动。所述多边形可以选自三角形、四边形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形、十边形，且/或所述多边形可以具有3、4、5、6、7、8、9、10-20、20-50或50-100或更多条边。此外，在示例性实施例中，用于实施加速电泳的装置可包括便于分析所希望的样品体积的任何装置尺寸，例如直径，例如深度。在示例性实施例中，装置的大小可以随着所使用的体积而缩放。在一些实施例中，装置可包括在约1mm或更大至约20mm或更大范围内的直径。
在示例性实施例中，可以通过一个或多个高压连接和系统中心的接地连接在所述装置中施加电流。在进一步的示例性实施例中，如本文所述的用于样品分析的装置可包括玻璃、陶瓷和/或塑料。在一些情况下，塑料可包括诸如聚丙烯、聚四氟乙烯(可作为
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商购)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(“PMMA”)和/或聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)之类的塑料。特别是当使用玻璃和/或陶瓷时，这些材料可能使得传热性能提高，这在装置操作期间可能是有益的。例如，由于圆形或同心ITP装置(即ETP装置)的扁平通道与窄通道相比具有良好的传热能力，因此可以防止聚焦材料的过热(或沸腾)。此外，在进一步的实施例中，电流/电压编程也可适合于调整装置的焦耳热。
在示例性实施例中，用于样品分析的装置可包括一个或多个电极的二维布置，其中所述布置足以实施加速电泳。在进一步的示例性实施例中，所述一个或多个电极可以包括一个或多个环形(圆形)电极，且/或所述一个或多个电极可以布置成多边形。所述多边形可以选自三角形、四边形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形、十边形，且/或所述多边形可以具有3、4、5、6、7、8、9、10-20、20-50或50-100或更多条边。在示例性实施例中，所述装置的所述一个或多个电极可被布置成使得所述布置包括在约1mm至约20mm范围内的直径或宽度。在进一步的示例性实施例中，所述装置的一个或多个电极的布置可以包括在所述装置的中心处的电极。在一些实施例中，所述装置的所述一个或多个电极可以包括镀铂和/或镀金不锈钢环；一个或多个不锈钢电极；和/或一个或多个石墨电极。此外，在一些实施例中，所述一个或多个电极可包括线电极。在示例性实施例中，一个或多个电极的所述布置可以包括一个以上的规则间隔的电极的布置。在一些实施例中，一个或多个电极的所述布置可以包括一个以上的电极的非线性、连续布置。在一些实施例中，一个或多个电极的所述布置可以包括形成为所希望的形状例如圆形的单线电极。在一些实施例中，一个或多个电极的所述布置可以包括线电极阵列。在示例性实施例中，用于样品分析的装置可以是一次性装置。所述一次性装置可包括不锈钢和/或石墨电极。在其他示例性实施例中，用于样品分析的装置可用作台式仪器，即，该装置可包括工作站和/或可重复使用。
此外，在进一步的示例性实施例中，如本文所述的用于样品分析的装置可包括容纳1μl或更小、1μl或更大、10μl或更大、100μl或更大、1mL或更大、4mL或更大、5mL或更大、10mL或更大或者15mL或更大的样品体积。在示例性实施例中，所述体积可以是约15mL。在示例性实施例中，所述样品可以通过所述装置顶部的开口注入所述装置中。在进一步的实施例中，使用所述装置可以产生收集在装置的中心的聚焦的样品，并且此外，在一些实施例中，所述样品可以从所述装置的中心收集。在一些实施例中，可通过冲出位于装置中心处的可包含聚焦的样品的凝胶来收集样品。在一些实施例中，样品可以收集在位于装置中心处的管中。在一些实施例中，一旦聚焦的样品到达装置的中心，就可以通过移液出该样品来收集样品。在示例性实施例中，所述样品可包含靶分析物。在进一步的实施例中，向所述装置施加电可以将样品所包含的靶分析物聚焦到聚焦区中，并且此外可以在加速电泳之后从所述装置收集所述靶分析物。在进一步的示例性实施例中，使用本文所述的加速电泳的任何装置或方法进行分析的样品可以包括生物学样品，诸如血液和/或血浆。所述血液和/或血浆可以包含靶分析物，例如靶核酸。在一些实施例中，所述血液和/或所述血浆的体积可以是约4mL。所述血液和/或血浆可以源自受试者。在示例性实施例中，使用本文所述的加速电泳的任何装置或方法进行分析的样品可包含一种或多种生物标志物，所述生物标志物可从所述装置分离和/或聚焦和/或收集。
此外，在示例性实施例中，所述用于样品分析的装置可进一步包含前导电解质和尾随电解质。在示例性实施例中，当前导离子具有高于一种或多种目标样品离子的有效电泳迁移率时，本领域技术人员已知的用于等速电泳的所有常用电解质均可与本装置一起使用。相应地，对于所选择的终止离子，一般情况下可能相反。在示例性实施例中，所述装置可用于阳离子分离/加速电泳(正离子模式)或用于阴离子分离/加速电泳(负离子模式)。在进一步的示例性实施例中，用于使用加速电泳进行阴离子分离的常用前导电解质可以包括，例如，氯化物、硫酸根或甲酸根，用合适的碱例如组氨酸、TRIS、肌酸酐等缓冲至所希望的pH。在一些情况下，氯化物可用作阴离子等速电泳中的前导离子，因为它具有非常高的电泳迁移率并且存在于大多数生物学样品中。用于进行阴离子分离的加速电泳的所述前导电解质的浓度相对于前导离子可以在5mM-1M的范围内。相应地，所述终止离子则通常可以包括MES、TAPS、MOPS、HEPES、乙酸根、谷氨酸根等弱酸阴离子和低迁移率阴离子。用于正离子模式下加速电泳的所述终止电解质的浓度范围为：相对于终止离子，5mM-10M。在一些实施例中，因为该装置可以在正离子模式(阳离子物质的分离/浓缩)或负离子模式(阴离子物质的分离/浓缩)下操作，用于样品分析的所述装置可用于广泛范围的分析物，例如，从小的无机和有机离子到大的生物聚合物(包括肽、蛋白质、多糖和DNA)或甚至包括细菌和病毒的颗粒。
在一些实施例中，对于阳离子分离，用于加速电泳的常见前导离子一般可以包括，例如：钾、铵或钠，其中乙酸根或甲酸根是最常见的缓冲配对离子。反应水合氢离子移动边界则充当由任何弱酸形成的通用终止电解质。
在一些实施例中，在正离子模式和负离子模式中，前导离子浓度的增加可导致样品区的成比例增加，对于给定的施加电压，以增加的电流(功率)为代价。典型的浓度一般在10-20mM范围内；然而，也可以使用更高的浓度。
在进一步的示例性实施例中，用于样品分析的装置可包括通过凝胶、粘性添加剂稳定和/或以其他方式与终止电解质流体动力学分离的前导电解质。所述凝胶或流体动力分离可防止前导电解质和终止电解质在装置操作期间混合。此外，所述凝胶可包括不带电荷的材料或形成凝胶的任何其他材料，例如琼脂糖、聚丙烯酰胺、支链淀粉等。特别是这包括所有类型的水凝胶。在一些实施例中，凝胶可以抵抗pH的变化，例如酸或碱稳定的凝胶。在进一步的实施例中，所述装置可包括前导电解质，例如，通过凝胶、粘性添加剂稳定的和/或以其他方式与终止电解质流体动力学分离的前导电解质，其直径范围为约10μm至约20mm的厚度(高度)。在一些实施例中，最大厚度一般可以是可以在整个所述厚度上产生均匀电场的厚度。在其中厚度可能使得电场不均匀的实施例中，电场可能不是线性变化的，然而，加速电泳的基本原理可能仍然适用，并且靶分析物的分离、浓缩、聚焦和/或收集仍可如希望的发生。在一些实施例中，可以使用大于20mm的厚度，并且可以使用弯曲的装置架构来获得线性行为。在一些实施例中，前导和/或尾随电解质可包括具有所希望的缓冲能力的电解质。例如，前导电解质可以包括这样一种电解质，其缓冲能力最小化和/或抵消可能由于实施加速电泳而发生的任何pH变化，使得所有加速电泳区的pH几乎相同或者相同。例如，HCl-组氨酸可用作具有所希望的缓冲能力的前导电解质。此外，在一些实施例中，可以使用pH稳定的凝胶。
在一些实施例中，所述装置可包括在通过管与浓缩器连接的前导电解质池中的电极。所述管可以通过半透膜直接连接或在一端封闭。此外，所述浓缩器可以在线连接到其他装置，例如毛细管分析仪、色谱、PCR装置、酶反应器等。此外，在没有包含所述前导电解质的凝胶的布置中，所述管可用于供应前导电解质的逆流流动。
在示例性实施例中，用于样品分析的装置可包括凝胶或可用于稳定前导电解质的其他材料。在进一步的实施例中，用于样品分析的装置可以包括凝胶，并且所述凝胶可以帮助避免不想要的样品污染。例如，用于样品分析的装置可用来提取ctDNA，并且所述凝胶可用来帮助避免ctDNA被基因组DNA污染。为了避免所述不想要的污染，凝胶可以具有一定的组成以允许ctDNA而不是基因组DNA迁移通过所述凝胶。这种原理可以应用于其他样品分析，其中避免目标样品/靶分析物的污染可能是有益的。在进一步的实施例中，网状聚合物和/或多孔材料可以以与用于样品分析的装置中的凝胶类似的方式使用，例如滤纸或水凝胶。所述网状聚合物和/或多孔材料的选择可以是有助于实施希望的分离/浓缩和/或防止不希望的样品污染的材料。例如，可以选择不允许蛋白质通过/迁移但可以允许靶核酸通过/迁移的材料。在进一步的示例性实施例中，用于样品分析的装置可以不以凝胶为特征但仍然可以实施用于样品分析的加速电泳，其特征可以在于聚焦和/或浓缩和/或收集靶分析物和/或希望的样品。
在示例性实施例中，用于样品分析的装置可包括至少一个电解质池、至少两个电解质池或至少三个电解质池。在一些实施例中，样品可以与前导电解质混合，然后加载到所述装置中。在一些实施例中，样品可以与尾随电解质混合，然后加载到所述装置中。在进一步的实施例中，样品可以与导电溶液混合并加载到所述装置中。此外，在一些实施例中，样品可以包含用于加速电泳的合适的终止离子并且可以加载到所述装置中。使用这种样品可以消除终止电解质区。在一些实施例中，样品可以通过装置中的开口，例如装置顶部的开口，例如装置侧面的开口加载。在一些实施例中，样品可以加载在凝胶和ETP装置的圆形电极之间的空间中。
在进一步的示例性实施例中，所述装置可用于浓缩靶分析物，例如，约2倍或更多至约1000倍或更多。在一些实施例中，所述靶分析物可包括靶核酸。在进一步的实施例中，所述靶分析物可包括小的无机和有机离子、肽、蛋白质、多糖、DNA或微生物诸如细菌和/或病毒。
此外，在进一步的示例性实施例中，可以使用恒定电流、恒定电压或恒定功率来操作如本文所述的用于样品分析的装置。当使用圆形架构并进一步使用恒定电流操作装置(例如，包括一个或多个圆形电极的装置)时，用于计算距起点距离为d且半径为r处的速度v的加速电泳边界速度方程由下式给出：v(d)＝uLI/2π(r-d)hκL＝常数/(r-d)。当使用圆形架构并使用恒定电压操作装置(例如，包括一个或多个圆形电极的装置)时，用于计算距起点距离为d且半径为r处的速度v的加速电泳边界速度方程由下式给出：υL＝uLUκT/[(r-d)κT+κLd。当使用圆形架构并使用恒定功率操作装置(例如，包括一个或多个圆形电极的装置)时，用于计算距起点距离为d且半径为r处的速度v的加速电泳边界速度方程由下式给出：
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在进一步的实施例中，可用于在所述装置中实施加速电泳的电压或电流或功率可以以离散阶段变化。例如，可以以第一值施加电流或电压或功率以允许在装置内和/或在实施本文所述的任何方法期间进行电解质和/或带电物质的分离和分组，并且在所述分离和分组发生之后，可以以第二值施加电流或电压或功率以增加或减少加速电泳的速率，如对于给定样品的分析可能希望的那样。在其中使用非圆形多边形架构的实施例中，电场可以不像圆形或球形架构的情况那样线性变化。此外，在其中可以使用电极的非连续布置的实施例中，电场可以以产生电解质和/或样品的星形布置的方式变化。例如，如果在用于样品分析的装置中使用形成圆形形状的基于点的电极阵列，则由此产生的电解质和/或样品等的区域可能形成星形而不是由基于点电极阵列产生的电场所形成的圆形。
在进一步的示例性实施例中，用于样品分析的装置可用于从样品例如生物学样品中提取核酸。所述样品可以包括全血或血浆。所述样品可以包括可以自其收获靶分析物(诸如全基因组)的细胞培养物。所述核酸可包含一种或多种靶核酸，例如肿瘤DNA和/或ctDNA。在示例性实施例中，用于样品分析的装置可用于聚焦和收集肿瘤DNA和/或循环肿瘤DNA(ctDNA)和/或循环cfDNA，例如存在于孕妇血液或血浆中的那些，和/或表达在特定条件下过表达或低表达的蛋白质的循环DNA，然后可以任选地进行进一步的下游分析，诸如核酸测序和/或其他体外诊断应用。此类下游体外应用包括例如疾病检测诸如癌症诊断和/或癌症预后和/或癌症分期、感染病症的检测、亲子分析、胎儿染色体异常诸如非整倍性的检测、胎儿遗传特征的检测、妊娠相关疾病的检测、自身免疫或炎症的检测、以及无数其他潜在用途。
在示例性实施例中，用于样品分析的装置可用于聚焦和收集靶核酸，并且所述靶核酸可以具有任何希望的大小。例如，所述靶核酸可以是5nt或更小、10nt或更小、20nt或更小、30nt或更小、50nt或更小、100nt或更小、1000nt或更小、10,000nt或更小、100,000nt或更小、1,000,000nt或更小或者1,000,000nt或更大。在一些实施例中，所述装置可用于从无细胞DNA中提取靶核酸。此外，在示例性实施例中，所述装置可用于从样品中浓缩和收集靶分析物。所述样品可以包括生物学样品。在进一步的实施例中，所述靶分析物可用于一种或多种下游体外诊断应用。此外，在示例性实施例中，用于样品分析的装置可以在线连接到其他装置，例如毛细管分析仪、色谱、PCR装置、酶反应器等，和/或可以用于实施进一步的样品分析的任何其他装置，例如与IVD应用相关的装置。在进一步的示例性实施例中，用于样品分析的装置可用于具有核酸测序文库制备的工作流程中。此外，在进一步的实施例中，用于样品分析的装置可以与液体处理机器人一起使用，该液体处理机器人可以任选地用于对可能已经从所述装置聚焦和/或收集的样品实施下游分析。
在另外的示例性实施例中，所述装置的使用可导致以下任何一项或多项：与基于柱或珠的提取方法相比更高的提取产率(可能无损失)；与MagNA Pure或其他台式仪器的较大占地面积相比，装置设置更简单；与应用于类似用途的其他装置相比，样品周转可能更快并且具有高并行性；易于与其他用于提取的核酸的下游处理的基于微流体的系统集成。
此外，本公开一般涉及一种样品分析方法，该方法包括实施用于分析所述样品的加速电泳。所述方法可以通过使用本文所述的用于样品分析的任何装置来实施。在示例性实施例中，所述方法进一步包括：a.提供用于实施加速电泳的装置，例如本文所述的那些装置；b.在所述装置上提供样品，其中所述样品包含一种或多种靶分析物；c.在所述装置上提供前导电解质和尾随电解质；d.使用所述装置进行加速电泳；和e.收集所述一种或多种靶分析物。在示例性实施例中，所述用于样品分析的装置可以包括多边形或圆形几何形状。在进一步的示例性实施例中，装置的加速电泳区在加速电泳期间可以从多边形或圆形的边缘朝向多边形或圆形的中心移动。所述多边形可以选自三角形、四边形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形、十边形，且/或所述多边形可以具有3、4、5、6、7、8、9、10-20、20-50或50-100或更多条边。此外，在示例性实施例中，所述装置可包括便于分析所希望的样品体积的任何装置尺寸，例如直径，例如深度。在示例性实施例中，所述装置的大小可以随着所使用的体积而缩放。在示例性实施例中，所述装置可包括在约1mm或更大至约20mm或更大范围内的直径。
在示例性实施例中，所述样品分析方法可以包括使用加速电泳，该加速电泳可以通过使用一个或多个电极的二维布置来实施。在一些实施例中，所述方法可以包括通过使用一个或多个环形(圆形)电极和/或通过使用以多边形形状布置的一个或多个电极来实施加速电泳。所述多边形可以选自三角形、四边形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形、十边形，且/或所述多边形可以具有3、4、5、6、7、8、9、10-20、20-50或50-100或更多条边。在示例性实施例中，所述电极布置的直径或宽度可以在大约10mm到大约20mm的范围内。此外，在所述样品分析方法的一些实施例中，所述方法可以进一步包括在用于实施加速电泳的装置的中心处使用电极。在所述方法的示例性实施例中，可用于实施加速电泳的一个或多个电极可包括一个或多个镀铂和/或镀金的不锈钢环；一个或多个不锈钢电极；和/或一个或多个石墨电极。在所述方法的一些实施例中，可以使用一个或多个线电极来实施加速电泳。在所述方法的示例性实施例中，可以使用一个以上的规则间隔的电极的布置来实施加速电泳。在进一步的实施例中，在如本文所述的样品分析方法期间，可以通过一个或多个高压连接和系统中心的接地连接施加电流。在一些实施例中，一个或多个电极的所述布置可以包括一个以上的电极的非线性、连续布置。在一些实施例中，一个或多个电极的所述布置可以包括形成为所希望的形状例如圆形的单线电极。在一些实施例中，一个或多个电极的所述布置可以包括线电极阵列。在所述方法的示例性实施例中，用于实施所述样品分析方法的装置可以是一次性装置。所述一次性装置可包括不锈钢和/或石墨电极。在所述方法的其他示例性实施例中，用于根据本文所述方法进行样品分析的装置可用作台式仪器，即，该装置可包括工作站和/或可重复使用
此外，在进一步的示例性实施方式中，所述方法可以使用1μl或更小、1μl或更大、10μl或更大、100μl或更大、1mL或更大、4mL或更大、5mL或更大、10mL或更大或者15mL或更大的样品体积。在一些实施例中，所述体积可以是约15mL。在示例性实施例中，当实践本文所述的方法时，可以通过顶部中的开口将样品注入装置中。在所述方法的进一步示例性实施例中，样品可以被聚焦并且所述样品可以收集在装置的中心。在所述方法的一些实施例中，可通过冲出位于用于样品分析的装置中心处的可包含聚焦的样品的凝胶来收集样品。在所述方法的一些实施例中，样品可以收集在位于用于样品分析的装置的中心处的管中。在所述方法的一些实施例中，一旦聚焦的样品到达用于样品分析的装置的中心，就可以通过移液出该样品来收集样品。在示例性实施例中，聚焦的样品可以包括靶分析物。在所述方法的进一步示例性实施例中，可以在加速电泳之后从装置的中心收集样品。在进一步的实施例中，施加电以实施所述方法将样品包含的靶分析物聚焦到聚焦区中。然后可以在加速电泳后收集所述靶分析物。在本文所述方法的进一步示例性实施例中，使用本文所述的加速电泳的任何装置或方法进行分析的样品可以包括生物学样品，诸如血液和/或血浆。所述血液和/或血浆可以包含靶分析物，例如靶核酸。在一些实施例中，所述血液和/或所述血浆的体积可以是约4mL。所述血液和/或血浆可以源自受试者。在示例性实施例中，使用本文所述的加速电泳的任何方法进行分析的样品可包含一种或多种生物标志物，所述生物标志物可被分离和/或聚焦和/或收集。
在进一步的实施例中，所述方法可进一步包括使用前导电解质和尾随电解质。此外，在一些实施例中，所述加速电泳可用于阳离子分离/加速电泳(正离子模式)和/或阴离子分离/加速电泳(负离子模式)。在进一步的示例性实施例中，用于使用加速电泳进行阴离子分离的常用前导电解质可以包括，例如，氯化物、硫酸根或甲酸根，用合适的碱例如组氨酸、TRIS、肌酸酐等缓冲至所希望的pH。此外，用于进行阴离子分离的加速电泳的所述前导电解质的浓度相对于前导离子可以在5mM-1M的范围内。相应地，所述终止离子则通常可以包括MES、MOPS、HEPES、乙酸根、谷氨酸根等弱酸阴离子和低迁移率阴离子。用于正离子模式下加速电泳的所述终止电解质的浓度范围为：相对于终止离子，5mM-10M。在一些实施例中，因为该装置可以在正离子模式(阳离子物质的分离/浓缩)或负离子模式(阴离子物质的分离/浓缩)下操作，用于样品分析的所述方法可用于广泛范围的分析物，例如，从小的无机和有机离子到大的生物聚合物(包括肽、蛋白质、多糖和DNA)或甚至包括细菌和病毒的颗粒。
在一些实施例中，对于阳离子分离，用于加速电泳的常见前导离子一般可以包括，例如：钾、铵或钠，其中乙酸根或甲酸根是最常见的缓冲配对离子。反应水合氢离子移动边界则充当由任何弱酸形成的通用终止电解质。
在一些实施例中，在正离子模式和负离子模式中，前导离子浓度的增加可导致样品区的成比例增加，对于给定的施加电压，以增加的电流(功率)为代价。典型的浓度一般在10-20mM范围内；然而，也可以使用更高的浓度。
在一些实施例中，所述方法可包括使用通过凝胶、粘性添加剂稳定或以其他方式与终止电解质流体动力学分离的前导电解质。所述凝胶或流体动力分离可防止前导电解质和终止电解质在装置操作期间混合。此外，所述凝胶可包括不带电荷的材料，例如琼脂糖、聚丙烯酰胺、支链淀粉等。在一些实施例中，所述方法可包括使用其直径范围为约10μm至约20mm的厚度(高度)的前导电解质。在一些实施例中，最大厚度一般可以是可以在整个所述厚度上产生均匀电场的厚度。在其中厚度可能使得电场不均匀的实施例中，电场可能不是线性变化的，然而，加速电泳的基本原理可能仍然适用，并且靶分析物的分离、浓缩、聚焦和/或收集应仍如希望的发生。在一些实施例中，可以使用大于20mm的厚度，并且可以使用弯曲或球形的装置架构来获得线性行为。
在本文所述的用于样品分析的方法的示例性实施例中，用于样品分析的方法可包括使用与加速电泳法协同使用的凝胶，该凝胶可用于根据所述方法稳定用于样品分析的装置中的前导电解质。在所述方法的进一步实施例中，方法可以包括使用凝胶，并且所述凝胶可以帮助避免不想要的样品污染。例如，用于样品分析的方法可用来提取ctDNA，并且所述凝胶可用来帮助避免ctDNA被基因组DNA污染。为了避免所述不想要的污染，凝胶可以具有一定的组成以允许ctDNA而不是基因组DNA迁移通过所述凝胶。这种原理可以应用于其他样品分析，其中避免目标样品/靶分析物的污染可能是有益的。在进一步的实施例中，网状聚合物和/或多孔材料可以以与用于样品分析的方法中的凝胶类似的方式使用，例如滤纸或水凝胶。所述网状聚合物和/或多孔材料的选择可以是有助于实施希望的分离/浓缩和/或防止不希望的样品污染的材料。例如，可以选择不允许蛋白质通过/迁移但将会允许靶核酸通过/迁移的材料。在进一步的示例性实施例中，用于样品分析的方法可以不以凝胶为特征但仍然可以实施用于样品分析的加速电泳，其特征可以在于聚焦和/或浓缩和/或收集靶分析物和/或希望的样品。
在样品分析方法的进一步实施例中，在实施所述加速电泳后，毛细管分析仪、色谱、PCR装置、酶反应器等可用于进一步评估由所述方法产生的浓缩样品。在所述方法的一些实施例中，可首先将前导电解质加载到用于实施圆形或同心等速电泳的装置中，然后可以加载与终止电解质混合的样品。在所述方法的进一步实施例中，样品可以与前导电解质混合并加载到用于实施加速电泳的装置中，然后可以加载终止电解质。在所述方法的进一步实施例中，样品可以与导电溶液混合，然后加载到用于实施加速电泳的装置中。在所述方法的示例性实施例中，可以将包含用于加速电泳的合适终止离子的样品加载到用于实施加速电泳的装置中，并且所述样品的使用可以消除终止电解质区。
在示例性实施例中，所述方法可以浓缩靶分析物，例如，约2倍或更多到约1000倍或更多。在示例性实施例中，所述靶分析物可以包括靶核酸。在进一步的示例性实施例中，所述靶分析物可以包括小的无机和有机离子、肽、蛋白质、多糖、DNA、细菌和/或病毒。
在进一步的实施例中，所述样品分析方法可以通过使用恒定电流、恒定电压或恒定功率来实施。当使用恒定电流和包括使用用于样品分析的装置(该装置进一步包括圆形架构，例如包括一个或多个圆形电极的装置)的方法时，用于计算距起点距离为d且半径为r处的速度v的加速电泳边界速度方程由下式给出：v(d)＝uLI/2π(r-d)hκL＝常数/(r-d)。当使用恒定电压和包括使用用于样品分析的装置(该装置进一步包括圆形架构，例如包括一个或多个圆形电极的装置)的方法时，用于计算距起点距离为d且半径为r处的速度v的加速电泳边界速度方程由下式给出：vL＝uLUκT/[(r-d)κT+κLd。当使用恒定功率和包括使用用于样品分析的装置(该装置进一步包括圆形架构，例如包括一个或多个圆形电极的装置)的方法时，用于计算距起点距离为d且半径为r处的速度v的加速电泳边界速度方程由下式给出：
Figure BDA0003468533170000571
在进一步的实施例中，可用于实施加速电泳的电压或电流或功率可以以离散阶段变化。例如，可以以第一值施加电流或电压或功率以允许在装置内和/或在实施本文所述的任何方法期间进行电解质和/或电荷物质的分离和分组，并且在所述分离和分组发生之后，可以以第二值施加电流或电压或功率以增加或减少加速电泳的速率，如对于给定样品的分析可能希望的那样。在其中使用非圆形多边形架构的实施例中，电场可以不像圆形架构的情况那样线性变化。此外，在其中可以使用电极的非连续布置的实施例中，电场可以以产生电解质和/或样品的星形布置的方式变化。例如，如果在用于样品分析的方法中使用形成圆形形状的基于点的电极阵列，则由此产生的电解质和/或样品等的区域可能形成星形而不是由基于点电极阵列产生的电场所形成的圆形。
在进一步的实施例中，样品分析方法可以包括从样品例如生物学样品中提取核酸。所述样品可以包括全血或血浆。所述样品可以包括可以自其收获靶分析物(诸如全基因组)的细胞培养物。所述核酸可包含一种或多种靶核酸，例如肿瘤DNA和/或ctDNA和/或cfDNA。在示例性实施例中，用于样品分析的方法可包括聚焦和收集肿瘤DNA和/或循环肿瘤DNA(ctDNA)和/或循环无细胞DNA，例如无细胞胎儿DNA(cfDNA)，然后可任选地进行进一步的下游分析，例如测序和/或其他体外诊断应用。在示例性实施例中，用于样品分析的方法可以包括聚焦和收集靶核酸，并且所述靶核酸可以具有任何希望的大小。例如，所述靶核酸可以是5nt或更小、10nt或更小、20nt或更小、30nt或更小、50nt或更小、100nt或更小、1000nt或更小、10,000nt或更小、100,000nt或更小、1,000,000nt或更小或者1,000,000nt或更大。在进一步的实施例中，所述方法可用于从无细胞DNA中提取靶核酸。此外，在一些实施例中，所述方法可用于从样品中浓缩和收集靶分析物。在一些实施例中，所述样品可包括生物学样品。在进一步的实施例中，所述靶分析物可用于一种或多种下游体外诊断应用。此外，在示例性实施例中，用于样品分析的方法可包括根据本文所述的方法使用用于样品分析的装置，并且进一步其中所述装置可在线连接至其他装置，例如毛细管分析仪、色谱、PCR装置、酶反应器等，和/或可用于实施进一步样品分析的任何其他装置，例如与IVD应用相关的装置。在进一步的示例性实施例中，用于样品分析的方法可用于具有核酸测序文库制备的工作流程中。此外，在进一步的实施例中，用于样品分析的方法可以与液体处理机器人一起使用，该液体处理机器人可以任选地用于实施样品的下游分析，该样品可能已经从根据所述方法使用的用于样品分析的装置聚焦和/或收集。
在示例性实施例中，所述方法可导致以下任何一项或多项：与基于柱或珠的提取方法相比更高的提取产率(可能无损失)；与MagNA Pure或其他台式仪器的较大占地面积相比，装置设置更简单；与应用于类似用途的其他装置相比，样品周转可能更快并且具有高并行性；易于与其他用于提取的核酸的下游处理的基于微流体的系统集成。
在进一步的实施例中，用于加速电泳的装置和/或方法可以聚焦并允许在允许发生希望的聚焦和收集的任何希望的时间量内收集靶分析物。在一些实施例中，实施如本文所述的聚焦和收集的时间可以是约1分钟至约30分钟。在一些实施例中，实施如本文所述的方法的时间可以是约15min。
在一些实施例中，通过改变缓冲液浓度、凝胶的百分比和/或ETP运行的停止时间，可以通过所述一种或多种靶分析物的基于ETP的分离/纯化来实施一种或多种靶分析物与原始样品中包含的其他材料的增强分离/纯化。此外，缓冲液浓度、凝胶的百分比和/或ETP运行的停止时间的此类变化可使得一种以上靶分析物中的每一种与彼此的分离/纯化增强，例如，将一种以上靶分析物中的每一种聚焦到一个单独的聚焦区(ETP带)内。
此外，本公开一般涉及用于样品分析的装置、方法和系统，其中所述装置、方法和系统包括实施加速电泳和样品检测。本文描述的系统、装置和方法特别适用于使用机器人液体处理器的自动化。本文讨论的系统、装置和方法与如上所述的加速电泳的恒定电压、恒定电流和恒定功率模式以及本文讨论的任何一种或多种装置、系统和方法以及任何下游应用(例如，IVD应用，诸如讨论的那些)兼容。
检测的类型
样品检测可以根据任何已知的样品检测方法实施。检测可以通过多种已知方法中的任一种进行，包括电检测；分光光度或光学跟踪，例如放射性或荧光标记物的分光光度或光学跟踪；或基于大小、电荷或亲和力来跟踪分子的其他方法。在优选实施例中，一种或多种样品是通过电检测来检测的。电检测可以包括电导率、电阻率、电流、电压和/或其他电学性质的检测。在一些实施例中，该样品检测可通过电导率或电阻率检测器实施。在一些实施例中，检测可包括通过光谱、光化学、生化、免疫化学、电学、光学、热学或化学手段的检测。样品收集体积的时间依赖性传输性质可以通过任何合适的技术来测量。传输性质可以是用于传输靶分析物的介质、液体中的溶质(例如，离子)、靶分析物本身(例如，单体的化学结构)或靶分析物上的标签的功能。示例性的传输性质包括电流、电导、电阻、电容、电荷、浓度、光学性质(例如，UV、荧光和拉曼散射)和化学结构。在一些实施例中，传输性质是导电性。
检测器的类型
系统、装置和方法可以包括一个或多个检测器或传感器，诸如光学检测器、反射传感器、红外(IR)检测器、电检测器、热传感器、流量传感器和压力传感器，包括在本公开中进一步描述的检测器。光学检测器可以包括但不限于三轴点检测器、互补金属氧化物半导体(CMOS)检测器、电荷耦合装置(CCD)检测器、光电二极管光传感器、光敏电阻、光电倍增管和光电晶体管。电检测器可以包括能够检测电压、电压差、电流、电荷、电导率、电阻率或其他电学性质的电极或其他检测器。电检测器可用于检测经提取或纯化的核酸的聚焦区的通过，例如通过检测尾随电解质和前导电解质之间界面处的电导率变化进行检测。热传感器可以包括红外(IR)传感器、探针温度传感器、热敏电阻、负温度系数(NTC)热敏电阻、电阻温度检测器(RTD)、热电偶、基于半导体的传感器等。
该系统、装置和方法可以包括一个或多个电学或电子测量装置，包括电流计(安培计)、电容计、曲线示踪器、功率因数(cosφ)计、失真度测试仪、电表、ESR计、频率计数器、漏电测试仪、LCR表、微波功率计、万用表、网络分析仪、欧姆表、示波器、噪声计、Q表、信号分析仪、信号发生器、频谱分析仪、扫描仪发生器、晶体管测试仪、电子管测试仪、瓦特计、矢量示波器、视频信号发生器、电压表和VU表。
一个或多个检测器或传感器可以同时或独立地操作和控制。在一些情况下，单个位置可以具有专用传感器，例如电导率或电压传感器，其独立于专用于系统或装置上的其他点的其他传感器而运行。来自独立传感器的反馈可用于独立地控制系统或装置上的一个或多个电场。例如，传感器可以检测收集井内电压随时间的变化并且来自该传感器的反馈可以用于控制系统或装置内的电流。第二传感器可以以类似但独立的方式作用于第二位置。在一些情况下，传感器可以检测井内电学性质(例如电导率或电流)随时间的变化，并且来自该传感器的反馈可以用于控制系统或装置内的电压或功率。在一些情况下，系统、装置和方法可以包括一个以上的传感器，任选地包括一种以上类型的传感器，例如电传感器和热传感器，前提是系统、装置和方法仍然可以实施所希望的样品分析。
可根据已知的电导率检测原理设计用于本发明的系统、装置和方法中的电导率检测器。电导率探针可以通过安培法、电势法、电感法或环形法进行测量。等效地，与系统、装置和方法相关联的检测器可以测量与电导率相关的其他特征，诸如电阻率(电导率的倒数)或总溶解固体(TDS，与电导率相关的系数取决于溶液)。电导率测量可覆盖从纯水(通常小于1x10-7S/cm)到大于1S/cm的浓缩溶液的各种溶液电导率值。因为电导率和电阻率是倒数，所以描述为测量这些性质之一的系统、装置和方法将被理解为也测量另一性质。
一般而言，如果将两个电极插入溶液中(或跨过包含溶液的凝胶顶部应用)并且跨电极施加电势，则包含样品、电解质和/或分析物的溶液将传导电流。溶液传导的电流越大，其电导率就越高。欧姆定律适用，因此：
V＝IR
其中V是施加的电势(伏特)，I是电流(安培)，并且R是电阻(欧姆)。溶液的电阻可以由几个因素决定，包括溶液中离子物质的浓度和类型，以及温度。溶液的电导G(以用符号S表示的西门子为单位)由电阻的倒数给出：
Figure BDA0003468533170000601
电导也可以以欧姆的倒数(mhos)为单位提供。以欧姆-厘米为单位的电阻率(ρ)由下式给出：
Figure BDA0003468533170000611
其中A是插入溶液中的电极的横截面积(cm2)，而L(cm)是它们之间的距离。电阻率的倒数是电导率κ，单位为S/cm，也称为比电导。
Figure BDA0003468533170000612
如上式所示，通过已知的方程和关系，对溶液、样品或分析物的一种电学性质的测量可以等效于对其他电学性质的测量。因此，本方法、装置和系统包括与样品加速电泳结合使用的任何形式的电检测。
电导率检测器可以是本领域已知的任何一种。这种检测器一般按照以下原理工作：在电势梯度的影响下，溶液中的离子/分析物可以携带电荷，因此如果在位于溶液中的两个电极之间施加电压，电流将在两个电极之间流动，并且溶液被称为导电。这种方法可用于检测靶分析物。在一些实施例中，在电导率检测器中，一般实际监测溶液的电阻，并且提供检测器的输出的是流动相电阻在溶质存在下的变化。因此，通常在电阻测量方面考虑检测器的运作。在一些实施例中，电导率检测器单元包括两个电极，AC电势施加在两个电极之间。可以通过确保电极的表面积小来最小化电池的电容量。一般而言，会优化电极和电势的选择，以增加信噪比而不干扰检测功能。在一些实施例中，电势差为1-2V。在一些实施例中，电势差小于1V、约1V、1-2V或大于2V。电极尺寸一般将会小于1min。在一些实施例中，电极表面积小于1μm、小于10μm、小于50μm、小于100μm、小于500μm、小于1mm或大于1mm。电极可以由本领域已知的任何合适的物质例如铂(Pt)、碳、石墨等形成。在其他实施例中，检测器可以不直接接触待测量的溶液、样品或分析物，例如，电容耦合非接触式电导率检测器(C4D)。电导率检测器的电极可以放置在整个用于实施加速电泳的设备中的任何合适的位置。在一些实施例中，特别选择检测器的位置以发出靶分析物收集的信号，例如在洗脱池附近。
在一些实施例中，用于测量ETP带的位置的方法是测量系统或装置中任意两点之间(诸如驱动电极和接地电极之间)的电压或电阻。在具有两个以上电极的系统中，可以在任何一对电极之间进行该测量。该测量可以容易地进行，因为电压驱动电泳/加速电泳也可以是恒功率模式下的测量电压。在整个加速电泳过程中，电压可以随着尾随离子填充系统或装置而增加。然而，洗脱池可以具有大的横截面，因此对总电阻的贡献可以很小。因此，该区域中缓冲液电导率的变化可以不强烈影响整体通道电阻，并且当ETP区域进入洗脱池时，电压可以停止上升。这可以用作停止施加电流并结束运行的信号。
在一些实施例中，为了评估该电压变化，可以计算电压的导数。在一些实施例中，可以使用Lanzcos微分法来抑制高频噪声。可以为该导数设置阈值，当导数超过阈值时，可以进行触发。在一些情况下，引入额外的触发器可以提高控制的鲁棒性。在一些情况下，这些触发器中仅一些用于改变驱动电流，而其他触发器可以用于标记运行中的时间点，这可以改善最终触发器的时间设置。
在一些实施例中，用于检测ETP带的位置的方法是对电导率进行局部测量。这可以使用电容耦合非接触式电导率检测器(C4D)来完成。该方法可以利用高频交流电流穿过样品收集井壁并与电解质耦合。该局部测量可以在洗脱池本身处进行。该技术可以减少或消除与在整个通道上进行的测量相关的模糊性。在该技术中，一旦在洗脱池电导率检测器上看到电导率发生变化，就可以选择结束运行触发器。C4D检测可以使用放置在洗脱体积以下的电极进行。
在一些实施例中，最大化电极面积可以降低必要的驱动频率。例如，驱动频率可以使用从约100kHz到约10MHz，电极接触垫在约0.2mm2到大约50mm2之间。C4D传感器可以使用包括电阻器、电容器、二极管桥和高频运算放大器在内的电子部件以及高频信号源诸如来自直接数字合成器的高频信号源来实施。
在一些实施例中，用于检测ETP带的位置的方法是对洗脱池附近的温度进行局部测量。该测量可以用温度传感器进行，包括热电偶或红外温度传感器。传感器可以放置在靠近洗脱池的通道下方，并且可以随时间监测温度。当较低迁移率的尾随离子替代较高迁移率的前导离子(例如ETP区的LE-TE界面)时，通道中的电场可以增加，并且温度可以升高。在等速电泳和加速电泳期间，较低迁移率的尾随电解质离子和较高迁移率的前导电解质离子可以在ITP或ETP界面处相遇。ETP界面可以包括浓缩在前导电解质离子和尾随电解质离子之间的样品分析物，例如核酸。温度升高可以检测到较高迁移率的前导离子和较低迁移率的尾随离子之间ETP界面的存在，因此也表明它们之间存在样品。该温升可以是1-10℃。
然而，替代性地，在一些实施例中，本文描述的本发明的系统、装置或方法的特征在于在加速电泳运行的进程中没有或只有最小的温度波动。
检测器位置
系统、装置或方法的一个或多个样品检测器组件可定位在样品分析区域中的任何地方，例如，从装置的样品装载到样品收集区室的任何地方。在一些实施例中，样品检测发生在系统或装置的样品收集区室附近或内部。在一些实施例中，检测发生在样品收集体积内。在一些实施例中，检测发生在样品收集体积以下。在一些实施例中，检测发生在样品收集体积下方的LE池内。
在一些实施例中，一个或多个检测器可以与用于实施加速电泳的装置集成。例如，在一些实施例中，一个或多个检测器是底板或底部基板的一部分，该地板或底部基板可以连接到顶板或顶部基板以实施加速电泳。在一些实施例中，一个或多个检测器可以是与底板或基板集成以实施加速电泳的顶板或基板的一部分。在一些实施例中，一个或多个检测器探针可以并入底部基板中，且检测发生在底部基板的中心柱附近或内部。在一些实施例中，一个或多个检测器探针可以并入顶部基板中，且检测发生在顶部基板的中心柱附近或内部。在一些实施例中，该检测可发生在样品收集体积或包含样品收集体积的容器(例如半透膜、区室、管、孔等)的下方、上方、附近或与之接触。
在检测器和用于实施加速电泳的装置是互连部件的实施例中，这些部件可以通过任何合适的方式连接。在一些实施例中，部件可以通过物理或化学方式连接。在一些实施例中，部件通过磁体连接。在一些实施例中，可以使用O形环、间隔物、绝缘体或其他这样的部件来防止检测部件和加速电泳部件之间的泄漏。
在一些实施例中，可以存在一种或多种用于与本系统、装置或方法合用的样品检测部件。在一些实施例中，存在单个检测器。在一些实施例中，存在一个或多个检测器。在一些实施例中，存在两个或更多个检测器。在一些实施例中，可以在整个系统或装置中的几个或更多个离散位置处进行样品检测。在一些实施例中，可以存在许多样品检测位置。在一些实施例中，在整个系统或装置中的任何两个位置之间可以存在连续的样品检测。在一些实施例中，一个或多个检测器可并入装置和/或系统本身。在一些实施例中，一个或多个检测器可以接触装置和/或系统。在一些实施例中，一个或多个检测器可以并入装置和/或系统本身并且一个或多个检测器可以接触装置和/或系统。
自动化、机器人、液体处理
本发明还涉及高通量样品分析装置，该装置包括许多实施加速电泳以及样品检测的单独部件。在一些实施例中，在加速电泳期间或之后，本发明的系统、装置或方法可包括自动样品收集。自动样品收集可以通过检测样品收集体积附近或内部的靶分析物来触发。靶分析物的检测可以是直接的或间接的，例如，靶分析物可以基于其物理、生化、光学、机械或其他性质被检测，或者靶分析物可以被间接检测。间接检测可以包括通过例如电检测来检测前导电解质和尾随电解质之间的过渡。更一般而言，包括检测样品的聚焦区或者LE和TE区之间的过渡的任何检测方法都可以用于检测样品。然后可以使用这种检测来触发自动液体处理。在一些实施例中，该系统、装置或方法可以包括被配置为在x-y方向、x-y-z方向或旋转方向中的至少一个方向上移动并且可以包括自动液体处理器的机器人组件。自动液体处理器可在系统内的两个或多个容器之间吸入和分配一定体积的液体，以在系统内的两个或多个站或物理位置之间输送液体。本文所述的系统、装置和方法可与任何市售的液体处理机器人兼容，例如
Figure BDA0003468533170000641
液体处理机器人或
Figure BDA0003468533170000642
液体处理机器人，例如Tecan
Figure BDA0003468533170000643
Tecan Freedom
Figure BDA0003468533170000644
或Tecan D300e数字分配器机器人。
在一些实施例中，该方法是一种其中使用自动液体处理器的方法，其中自动液体处理器包括与微量滴定板兼容的24孔、48孔、96孔或384孔歧管液体处理头，以将溶液从一个位置转移到另一个位置。
在一些实施例中，可以结合本文所述的系统和方法采用自动样品铺板或划线。存在适用于以实验室标准培养皿格式划线或铺板的市售自动铺板装置。以下基于划线的装置可以包含在本文所述的系统中：
Figure BDA0003468533170000651
Isola(BioMerieux)、PetriPlaterTM(Scirobotics)和InoqulATM(BD Biosciences)。还存在依赖于自动生成的连续稀释液和铺板的选择，例如easySpiral
Figure BDA0003468533170000652
(Interscience)。
在一些实施例中，液体处理系统可以包括一个或多个液体处理机器，并且可以与一个或多个处理装置连通。在一些实施例中，液体处理机器可以是适用于分配和/或抽取流体的任何可编程机器、机器人或系统或者可编程机器、机器人或系统的组合。在一些实施例中，液体处理机器包括多个分配喷嘴和用于支撑多个板或其他存储装置的平台空间。自动液体处理系统在本领域中一般是众所周知的。一个示例是
Figure BDA0003468533170000653
Freedom
Figure BDA0003468533170000654
机器人工作站。该装置可在独立仪器中或与分析系统自动连接中实施自动液体处理。从WO 2007/061943已知一种用于裂解和/或纯化生物学样品的便携式装置。核酸的处理是在盒腔内使用布置在两侧的电极进行，从而通过电解、电穿孔、电渗透、电动或电阻加热来处理生物材料。盒还包括筛分基质或膜。通过使用足够的缓冲液和其他试剂，结合电极的应用，可以在腔室内进行各种反应，并且可以将所希望的产物引导至例如收集膜。盒本身可以放置在一个集成系统中，该系统包括所需的控制元件和能源。在一些实施例中，本发明包括能够实施加速电泳将所希望的产物引导至此类收集膜以供液体处理机器人进一步处理的装置。
在一些实施例中，液体处理机器被配置用于准确地移液和/或移除小体积的流体，例如20mL或更大、20mL或更小、10mL或更小、5mL或更小、1mL或更小、500μL或更小、250μL或更小、100μL或更小、50μL或更小、10μL或更小或者1μL或更小。在一些实施例中，液体处理机器可包括流体分配系统、抽吸系统和通信系统。在一些实施例中，流体分配系统可进一步包括与一个或多个流体源连通的一个或多个流体导管和喷嘴。在一些实施例中，抽吸系统可包括一个或多个与真空系统连通并且任选地与废物处理系统连通的流体导管。在一些实施例中，通信系统可包括一个或多个显示器和用于向机器输入数据的输入端。在一些实施例中，通信系统还可以包括用于通过通信网络进行通信的一个或多个部件，该通信网络例如但不限于因特网、内联网、局域网、无线局域网、广域网或其他通信网络以及网络的组合。
在一些实施例中，与液体处理系统或其他机器人结合使用的处理装置可以是个人计算机、工作站、服务器、移动装置、移动电话、处理器和/或其他处理装置。在一些实施例中，装置可以包括一个或多个处理软件或其他机器可读指令的处理器并且可以包括用于存储软件或其他机器可读指令和数据的存储器。存储器可以包括易失性和/或非易失性存储器。在一些实施例中，该装置可进一步包括一个或多个数据结构和/或数据库或至少与一个或多个数据结构和/或数据库通信。
此外，在一些实施例中，该装置还可以包括通信系统以通过有线和/或无线通信进行通信，诸如通过因特网、内联网和以太网、有线网络、无线网络和/或其他通信网络进行通信。在一些实施例中，处理装置可进一步包括用于查看数据的显示器(未示出)诸如计算机监视器，以及输入装置(未示出)诸如键盘或定点装置(例如，鼠标、轨迹球、笔、触摸板或其他装置)用于输入数据和通过数据进行操纵，该数据包括检查、图像、文档、结构化数据、非结构化数据、HTML页面、其他网页和其他数据。
样品
本发明的装置、方法和系统可用于分析和检测任何合适的一种或多种样品，例如本文所述的那些。本发明的装置、方法和系统可用于分析、分离和/或收集并检测任何合适的一种或多种样品，诸如本文所述的那些，和/或分析、分离和/或分离并检测包含在任何一种或多种样品中的任何一种或多种靶分析物。在一些实施例中，样品为生物学样品。在一些实施例中，生物学样品是血浆、尿液、血液、唾液、组织提取物或活检提取物，或任何两种或更多种生物学样品的组合。包含靶分析物的样品，例如核酸，可以通过任何数量的方式从受试者获得，包括通过采集体液、采集组织或通过收集细胞/生物体获得。样品可以包括或获自血液、尿液、血清、淋巴、唾液、肛门和阴道分泌物、汗液、精液、脑脊液、精液、痰液、粪便和组织。根据本公开，任何组织或体液标本都可以用作用于分析的样品。核酸分子也可以从培养的细胞诸如原代细胞培养物或细胞系中分离。自其获得核酸的细胞或组织可以被病毒或其他细胞内病原体感染。样品也可以是从生物标本、cDNA文库、病毒或基因组DNA中提取的总RNA。样品也可以是来自非细胞来源的分离的DNA，例如，从冷冻器扩增/分离的DNA。获得的样品可以由单一类型的细胞/生物体组成，或者可以由多种类型的细胞/生物体组成。可以从受试者的样品中提取和制备DNA。例如，可以使用已知的裂解缓冲液、超声处理技术、电穿孔等处理样品以裂解包含多核苷酸的细胞。通过使用醇提取、铯梯度和/或柱层析，可以进一步纯化靶DNA以去除污染物，诸如蛋白质。替代性地，在通过加速电泳进行分析之前，样品可以被最小程度地改变或不改变。
在示例性实施例中，本发明的方法可以包括从样品例如生物学样品中检测、提取、浓缩和/或收集靶分析物。在进一步的示例性实施例中，所述方法可以包括从样品中提取ctDNA，且/或所述方法可以包括从样品例如孕妇的血液或血浆中提取cfDNA。在进一步的示例性实施例中，所述方法可以包括从样品例如生物学样品中提取、浓缩和/或收集靶分析物，并且所述靶分析物可以用于一种或多种下游体外诊断应用。
使用加速电泳进行自动化样品分析和检测的益处
在包括实施加速电泳的装置的系统或方法中进行的样品检测可具有以下一个或多个优点：易于自动化、易于高通量设计、无标签样品检测、多倍样品浓缩、最少样品操作、样品与其他成分的方便且快速的分离、样品损失更少、样品产量更高、获得基本纯样品的步骤更少、低浓度样品的数量更多、下游样品分析的实用性和准确性更高、样品污染更少。
在一些实施例中，该系统特别有利于允许无标签、无染料的样品分析、浓缩、纯化和/或收集。这样的系统可以允许对样品进行快速分析，而无需昂贵或耗时的制备步骤。在一些实施例中，分析样品的靶分析物与其他组分的加速电泳分离对于下游处理例如核酸测序特别有利。
在本文的示例性实施例中，用于样品分析的系统和装置包括基于适合大样品体积(例如，高达20mL)聚焦的ETP设计和制造的系统和装置。该系统和装置提供高回收率并将DNA浓缩在易于回收的微升体积的收集杯中，以便于进一步使用。例如，与现有的固相DNA提取方法相比，这种基于ETP的分离简单快速，产生高浓度因子，而没有广泛的表面相互作用。在一些实施例中，在非筛分性分离介质中，小的和短的DNA片段可以聚焦在一个区域中。在一些实施例中，使用用于仅聚焦特定范围的电泳速度的筛分介质和缓冲液组合物的组合，可以仅将选定的尺寸聚焦或与其他样品组分分离。一般而言，样品的电检测允许无染料、无标签的样品检测并且不需要额外的样品清理步骤，诸如关于本文所述的用于样品分析的装置、方法和系统所描述的电检测。
收集和/或分离
本发明还涉及能够基于电泳迁移率分离两种或更多种不同样品或靶分析物的系统。在一些实施例中，许多靶分析物可浓缩在同一聚焦区域中并可收集在一起。在一些实施例中，不同的分析物可以基于电泳迁移率被分离并且与样品收集体积分开收集。在一些实施例中，多种靶分析物可以聚焦在一个区域中，而其他物质可以聚焦在一个或多个不同于第一区域的区域中。例如，在一个示例性的非限制性实施例中，可以设想1到500bp之间的DNA片段可以聚焦在一个区域中，500到3000bp之间的DNA片段可以聚焦在另一个区域中，而较大的DNA片段(例如基因组DNA)可以聚焦在第三区域中。在一些实施例中，本发明的方法包括加速电泳，然后是额外的样品纯化步骤以将靶分析物与其他材料分离。
在一些实施例中，聚焦区可以非常窄(约100μm)，并且记录LE和TE之间的过渡以指示一种或多种靶分析物的位置可以是有利的。在一些实施例中，检测可分别指示一个或多个聚焦区的位置。
在一些实施例中，样品收集杯(或用于样品收集的任何其他合适的容器，例如小瓶、托盘、井、移液器等)体积可以是5mL或更大、5mL或更小、1mL或更小、500μL或更小、200μL或更小、100μL或更小、50μL或更小、10μL或更小、5μL或更小或者1μL或更小。优选地，样品收集体积被选择为足够小以允许靶分析物浓度的希望的增加。在一些实施例中，样品浓度可以增加2倍或更多、5倍或更多、10倍或更多、15倍或更多、20倍或更多、25倍或更多、30倍或更多、35倍或更多、40倍或更多、45倍或更多、50倍或更多、100倍或更多、150倍或更多、200倍或更多、500倍或更多、1000倍或更多、2000倍或更多、2500倍或更多、5000倍或更多或者10,000倍或更多。
样品收集的反馈控制
根据本方法，诸如使用本系统和装置的方法，可以进行基于加速电泳的样品收集和/或纯化。在一些实施例中，如本文所述的使用样品检测的反馈控制和过程时间设置(例如触发)可用于控制加速电泳过程和/或使加速电泳过程自动化。在一些实施例中，装置上的传感器(例如，电传感器)可用于检测样品，例如基于电导率(或例如，荧光、UV、光学、热学、电学等检测)。在一些实施例中，可检测电导率变化，其可用于指示结束ETP运行的时间设置，例如，当靶分析物(例如，核酸)达到样品收集体积(或洗脱点或其他固定点)时。在一些实施例中，本文所述的其他检测方法，诸如温度或驱动电压，也可用于确定运行时间设置的结束或其他触发。例如，可以使用电导率或光学或温度或电压传感器来控制施加到装置内的通道的电场，以便使ETP过程自动化。例如，可以向通道施加电场以开始ETP样品分析和/或纯化。在一些实施例中，所测量的量的传感变化可用于触发多种事件，例如ETP的开始、在一个或多个固定位置处的其他传感的开始、或ETP的结束。在一些实施例中，装置内的所测量的性质可以随着包含一种或多种受限样品的一个或多个ETP聚焦区移动而变化。指示ETP区经过特定特征的变化可以由一个或多个样品检测仪器传感，并且反馈可以用于例如通过减少或终止运行来改变电场。在一些实施例中，当ETP区经过位于或靠近洗脱池的电导率传感器时，可检测到电导率的变化，并且来自该传感器的反馈可用于控制电场，例如通过移除电场以结束ETP运行.在一些情况下，装置可以终止ETP运行，例如基于触发信号来终止。在一些实施例中，当ETP运行终止时，靶分析物或所希望的样品(例如，核酸)可被定位或分离在收集体积或洗脱池或区域中。
在一些实施例中，ETP运行结束的基于检测的触发还可触发其他事件，诸如可有助于维持用于移液的洗脱体积的那些事件。在一些实施例中，该装置可关闭或阻塞多个通道或特征，其可以固定洗脱体积以维持洗脱的恒定体积(例如，通过在将洗脱体积移液期间阻止或防止流入LE池或出口池)。固定洗脱体积有助于简化使用，并有助于报告洗脱样品材料的浓度。
在一些实施例中，当靶ETP带位于洗脱位置(例如，样品收集体积、中心井、LE电解质池)时，可以停止施加的电流。本公开提供用于评估靶ETP带位置的技术，该技术可用于触发样品分析运行(例如样品纯化运行)的结束。这些技术可以包括驱动电压的测量、电导率的测量和温度的测量以及其他类型的测量。
在一些实施例中，本发明的系统能够(1)实施加速电泳；(2)通过电检测来测量样品体积附近或内部的LE和TE之间的过渡；(3)基于对步骤(2)的过渡的检测，终止加速电泳运行并使用自动液体处理器启动样品体积的自动收集。
在一些实施例中，本发明的系统能够(1)实施加速电泳；(2)通过电检测来测量样品体积附近或内部的两个或更多个ETP带之间的一个或多个过渡；(3)基于对步骤(2)的一个或多个过渡的检测，终止加速电泳运行并使用自动液体处理器启动样品体积的自动收集。步骤(2)中的一个或多个过渡可以是LE与靶分析物，靶分析物与TE、LE和TE之间的过渡。
额外的应用
本文公开的发明的应用和/或用途可包括但不限于以下：1.测定相对或绝对基因表达水平，如mRNA、rRNA和tRNA所示。这包括天然的、突变的和致病的核酸和多核苷酸。2.等位基因表达的测定。3.染色体内多个SNP的单倍型测定和定相。4.DNA甲基化状态的测定。5.mRNA交替剪接和剪接变体水平的测定。6.RNA转运的测定。7.mRNA、rRNA和DNA中的蛋白质-核酸复合物的测定。8.通过DNA、rRNA或mRNA测定食品和环境样品中微生物或病毒含量的存在。9.通过DNA、rRNA或mRNA鉴定食品和环境样品中的微生物或病毒含量。10.通过DNA、rRNA或mRNA鉴定植物、人类、微生物和动物的病理。11.医学诊断中的核酸测定。12.定量核流失测定。13.在DNA和RNA水平上测定基因重排，包括但不限于在免疫应答中发现的那些。14.微生物、病毒和线粒体中基因转移的测定。15.基因进化测定。16.法医学测定。
装置和方法的应用
在进一步的示例性实施例中，本文公开的装置和方法可用于根据本公开的以下应用和/或与根据本公开的以下应用一起使用。
在示例性实施例中，本文描述的装置和方法可以与代表性样品的IHC分析协同使用。例如，对来自淋巴结组织(例如，从手术切除的淋巴结制备)的代表性样品的IHC分析可以通过上皮标志物结合增殖标志物染色(例如细胞角蛋白8/18双IHC与Ki67)、使用在原发肿瘤中呈阳性的标志物、使用转移细胞的其他标志物或其他诊断标志物来检测极小的肿瘤微转移灶。本文所述的装置和方法可用于分析预染色的细胞和/或可用于选择性地染色细胞和/或可用于分离、聚焦和收集所希望的细胞，如通过所希望的标志物的存在/在一些实施例中与IHC分析技术协同使用的染色所鉴定的。此外，还可以在核酸处检测转移性肿瘤细胞，诸如通过使用下一代测序图谱来鉴定癌症相关突变，包括原发肿瘤中存在的突变。如本文所述，在示例性实施例中，本文公开的装置和方法可用于分离、聚焦/浓缩和收集此类核酸。此外，在示例性实施例中，可以分离、聚焦/浓缩和/或收集从来自原发肿瘤和淋巴结的代表性采样纯化的DNA以及来自任何远处转移细胞的循环肿瘤DNA的DNA。
基于此，通过本文所述的本发明方法和装置的示例性实施例获得的代表性样品可以促进并实质性提高检测、诊断和/或分期不同类型肿瘤(即不同实体瘤)的准确度，而不管肿瘤组织类型、位置、大小或体积。而且，在一些实施例中，本方法和装置潜在地可用于从假定的正常组织样品或推定的癌前组织产生代表性样品(例如，从由于遗传风险或既往癌症而具有较高的患癌症风险的受试者获得)，以便鉴定甚至在疾病的任何迹象已经显现之前就可能存在于其中的罕见细胞类型，诸如癌症干细胞系。
一方面，本文所述的装置和方法可提供用于产生生物学样品的方法和装置，该生物学样品适用于评估肿瘤或淋巴结内细胞的异质性和/或评估受试者中特定癌性病症的预后和/或确定患有癌性病症的受试者的适当治疗方案，包括(i)获得包含组织的空间不同区域或包含整个肿瘤或其主要部分的组织(诸如肿瘤样品或淋巴结)，和(ii)制备用于分析的样品，和(iii)使用所述装置和方法分析包含所述样品的细胞，例如分离、聚焦/浓缩和/或收集所希望的细胞。
另一方面，本文所述的装置和方法可提供用于产生生物学样品的装置和方法，该生物学样品适用于评估样品(诸如肿瘤样品或淋巴结)内细胞的异质性和/或评估受试者中的特定癌性病症的预后，包括(i)从实体瘤或淋巴结获得一个或多个完整的活检样品，优选地其中每个活检样品包含至少约100-200、200-1000、1000-5000、10,000-100,000、100,000-1,000,000个或更多个细胞，(ii)制备用于分析的样品，和(iii)使用所述装置和方法分析包含所述样品的细胞，例如分离、聚焦/浓缩和/或收集所希望的细胞。
另一方面，本文所述的装置和方法可提供用于产生生物学样品的装置和方法，该生物学样品适用于评估受试者是否包含特定癌症的毒力形式和/或患有癌症的受试者是否包含该特定癌症的毒力形式，包括(i)从实体瘤或淋巴结获得一个或多个完整的活检样品，优选地其中每个活检样品包含至少约100-200、200-1000、1000-5000、10,000-100,000、100,000-1,000,000个或更多个细胞，并且任选地固定或保存(诸如福尔马林、石蜡或乙醇固定或保存的样品)，和(ii)制备用于分析的样品，和(iii)使用所述装置和方法分析包含所述样品的细胞，例如，分离、聚焦/浓缩和/或收集所希望的需细胞，并且任选地分离或检测至少一种生物标志物的表达。生物标志物的上调(诸如表达增加)或下调(诸如表达减少)与特定癌症的毒力形式相关。
又一方面，本文所述的装置和方法可提供用于表征异质肿瘤内的景观和/或检测异质肿瘤内的遗传上不同的亚克隆和/或鉴定肿瘤内的低发生率事件和/或确定肿瘤内的靶的普遍性，包括(i)获得包含肿瘤的空间不同区域的一个或多个肿瘤样品，(ii)准备用于分析的样品，和(iii)使用所述装置和方法分析包含所述样品的细胞，例如，分离、聚焦/浓缩和/或收集靶分析物，例如所希望的细胞，任选地产生代表异质肿瘤的景观并且适用于表征肿瘤的景观和/或检测异质性肿瘤内的遗传上不同的亚克隆和/或鉴定肿瘤内的低发生率事件和/或确定肿瘤内的靶的普遍性的样品。
又一方面，本文所述的装置和方法可提供用于检测患者(例如，由于基因突变或既往癌症而有患癌风险的患者)的假定的正常组织或推定的癌前组织中的癌前细胞或癌性细胞的装置和方法，包括(i)获得假定的正常组织或推定的癌前组织的一个或多个样品，这些样品包含患者的假定的正常组织或推定的癌前组织的空间不同区域，(ii)制备用于分析的样品，和(iii)使用所述装置和方法分析包含所述样品的细胞，例如分离、聚焦/浓缩和/或收集所希望的细胞，其中通过该装置和/或方法产生的所希望的细胞样品适用于检测罕见的癌细胞或癌症干细胞，例如，甚至在患者出现任何疾病迹象之前。
另一方面，本文所述的装置和方法可以提供以不同测定形式使用通过任何前述方法产生的代表性样品及其部分的装置和方法，其中这些测定可以以高通量同时或在不同时间或不同地点进行，和/或通过自动化(全自动或半自动化)进行。
另一方面，通过任何前述装置和方法产生的代表性样品或其部分被储存以备将来使用，例如被冷冻。
另一方面，本文所述的装置和方法可用于产生代表性样品，其中所述代表性样品或其部分可用于衍生对患者样品中的特定癌细胞或细胞类型具有特异性的抗体或抗原，该抗体或抗原可以用于个性化医疗，即用于生产治疗性或预防性癌症疫苗。
在示例性实施例中，本文所述的任何装置和方法可用于检测样品中至少一种生物标志物例如至少一种脂质、蛋白质或核酸生物标志物的表达。此外，在进一步的实施例中，所述装置和方法可进一步包括检测表达特定生物标志物或生物标志物组合的样品或其部分或级分中肿瘤细胞的百分比。任选地，在一些实施例中，可以检测和/或分离样品或其部分或级分中肿瘤干细胞和/或肿瘤亚克隆的相对频率或百分比。此外，在进一步的实施例中，本文所述的装置和方法还可用于检测遗传靶(诸如点突变、缺失、添加、易位、遗传融合或基因扩增)。
在一些实施例中，本文所述的任何上述装置和方法也可用于检测、分离和/或定量特定免疫细胞(诸如B淋巴细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞、单核细胞或其组合)。
与主题装置和方法协同使用的样品通常源自一种或多种实体瘤。然而，这些装置和方法也可能适用于非实体肿瘤，例如血癌。在一些实施例中，在所公开的装置和方法中使用的此类肿瘤或其他组织的一种或多种样品可以例如源自乳房、结肠、肺、胰腺、胆囊、皮肤、骨、肌肉、肝、肾、子宫颈、卵巢、前列腺、食道、胃或其他器官，例如乳腺癌肿瘤、肺癌肿瘤、肝肿瘤、前列腺癌肿瘤、结肠癌肿瘤、膀胱癌肿瘤或肾癌肿瘤。在一些实施例中，所使用的肿瘤样品可以是人类来源的。
此外，在一些实施例中，任何上述装置和方法可以进一步包括从样品或其部分或级分中纯化核酸(诸如DNA或mRNA)。纯化的核酸可以经历RNA印迹、DNA测序、PCR、RT-PCR、微阵列谱分析、差异展示或原位杂交。而且，纯化的核酸可以与纳米颗粒(诸如量子点、顺磁性纳米颗粒、超顺磁性纳米颗粒和金属纳米颗粒，优选合金化的量子点，包括例如但不限于，举例而言，CdSe、ZnSSe、ZnSeTe、ZnSTe、CdSSe、CdSeTe、ScSTe、HgSSe、HgSeTe、HgSTe、ZnCdS、ZnCdSe、ZnCdTe、ZnHgS、ZnHgSe、ZnHgTe、CdHgS、CdHgSe、CdHgTe、ZnCdSSe、ZnHgSSe、ZnCdSeTe、ZnHgSeTe、CdHgSSe、CdHgSeTe、InGaAs、GaAlAs和InGaN)缀合。
还预期任何上述装置和方法可进一步用于从样品或其部分或级分中纯化脂质。纯化的脂质可以经历质谱或组织化学。
此外，在一些实施例中，还预期任何上述装置和方法可进一步包括从样品或其部分或级分中纯化蛋白质。纯化的蛋白质可以经历蛋白质印迹、ELISA、免疫沉淀、色谱、质谱、微阵列谱分析、干涉测定、电泳染色或免疫组织化学染色。替代性地，或除上述之外，纯化的蛋白质可用于产生对肿瘤具有特异性的抗血清。
此外，预期任何上述装置和方法可进一步包括对样品或其部分或级分进行基因组学、转录组学、蛋白质组学和/或代谢组学分析。
此外，预期任何上述装置和方法可进一步包括从样品或其部分或级分中亲和纯化特定细胞类型。特定细胞类型可以包含目标生物标志物。示例性的目标生物标志物可以包括Her2、bRaf、ERBB2扩增、Pl3KCA突变、FGFR2扩增、p53突变、BRCA突变、CCND1扩增、MAP2K4突变、ATR突变或其表达与特定癌症相关的任何其他生物标志物；AFP、ALK、BCR-ABL、BRCA1/BRCA2、BRAF、V600E、Ca-125、CA19.9、EGFR、Her-2、KIT、PSA、S100、KRAS、ER/Pr、UGT1A1、CD30、CD20、F1P1L1-PDGRFα、PDGFR、TMPT和TMPRSS2中的至少一者；或选自以下项的至少一种生物标志物：ABCB5、AFP-L3、甲胎蛋白、α-甲基乙酰辅酶A消旋酶、BRCA1、BRCA2、CA 15-3、CA 242、Ca 27-29、CA-125、CA15-3、CA19-9、降钙素、癌胚抗原、癌胚抗原肽-1、脱-γ-羧基凝血酶原、早期前列腺癌抗原-2、雌激素受体、纤维蛋白降解产物、葡萄糖-6-磷酸酯异构酶、HPV抗原(诸如vE6、E7、L1、L2或p16INK4a)、人绒毛膜促性腺激素、IL-6、角蛋白19、乳酸脱氢酶、亮氨酰氨肽酶、促脂解素、变肾上腺素类物质、脑啡肽酶、NMP22、去甲变肾上腺素、PCA3、前列腺特异性抗原、前列腺酸性磷酸酶、突触素、甲状腺球蛋白、TNF、选自ERG、ETV1(ER81)、FLI1、ETS1、ETS2、ELK1、ETV6(TEL1)、ETV7(TEL2)、GABPα、ELF1、ETV4(E1AF；PEA3)、ETV5(ERM)、ERF、PEA3/E1AF、PU.1、ESE1/ESX、SAP1(ELK4)、ETV3(METS)、EWS/FLI1、ESE1、ESE2(ELF5)、ESE3、PDEF、NET(ELK3；SAP2)、NERF(ELF2)或FEV的转录因子。XXX，肿瘤相关糖蛋白72、c-kit、SCF、pAKT、pc-kit和波形蛋白。
替代性地或此外，目标生物标志物可以是免疫检查点抑制剂，诸如但不限于CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TIM3、GAL9、GITR、LAG3、VISTA、KIR、2B4、TRPO2、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、TL1A和B-7家族配体或其组合，或者是选自由以下所组成的组中的检查点蛋白的配体：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7家族配体，或其组合。
本文所述的装置和方法可进一步用于检测至少一种与以下项相关的生物标志物：急性成淋巴细胞性白血病(etv6、am11、亲环蛋白b)、B细胞淋巴瘤(Ig-独特型)、神经胶质瘤(E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白、γ-连环蛋白、p120 cm)、膀胱癌(p21ras)、胆道癌(p21ras)、乳腺癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、宫颈癌(p53、p21ras)、结肠癌(p21ras、HER2/neu、c-erbB-2、MUC家族)、结直肠癌(结直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、APC)、绒毛膜癌(CEA)、上皮细胞癌(亲环蛋白b)、胃癌(HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白)、肝细胞癌(甲胎蛋白)、霍奇金淋巴瘤(Imp-1、EBNA-1)、肺癌(CEA、MAGE-3、NY-ESO-1)、淋巴样细胞源性白血病(亲环蛋白b)、黑色素瘤(p5蛋白、gp75、癌胎抗原、GM2和GD2神经节苷脂、Melan-A/MART-1、cdc27、MAGE-3、p21ras、gp100.sup.Pmel117)、骨髓瘤(MUC家族、p21ras)、非小细胞肺癌(HER2/neu、c-erbB-2)、鼻咽癌(Imp-1、EBNA-1)、卵巢癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、前列腺癌症(前列腺特异性抗原(PSA)及其抗原表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、PSMA、HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白)、肾癌(HER2/neu、c-erbB-2)、宫颈和食道鳞状细胞癌(病毒产物，诸如人乳头瘤病毒蛋白)、睾丸癌(NY-ESO-1)和/或T细胞白血病(HTLV-1表位)。
在一些实施例中，本文所述的装置和方法还可包括使用选自以下项的至少一个可检测标签：荧光分子或荧光染料(诸如由Invitrogen出售的，例如，参见The Handbook--AGuide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies，Invitrogen DetectionTechnologies，Molecular Probes，Eugene，Oreg，或在授予Nazarenko等人的美国专利号5,866,366号中公开的)，诸如4-乙酰氨基-4′-异硫氰酸根合二苯乙烯-2，2′二磺酸、吖啶及衍生物诸如吖啶和吖啶异硫氰酸酯、5-(2′-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)、4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘二甲酰亚胺-3，5-二磺酸酯(荧光黄VS)、N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺、邻氨基恩甲酰胺、亮黄、香豆素及衍生物诸如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；花青素；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5′，5″-二溴邻苯三酚-磺酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙氨基-3-(4′-异硫氰酸根合苯基)-4-甲基香豆素；二乙三胺五乙酸盐；4，4′-二异硫氰酸根合二氢-二苯乙烯-2，2′-二磺酸；4，4′-二异硫氰酸根合二苯乙烯-2,2′-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-(4′-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4′-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红及衍生物诸如曙红和曙红异硫氰酸酯；赤藓红及衍生物诸如赤藓红B和赤藓红异硫氰酸酯；乙锭；荧光素和衍生物诸如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2′7′-二甲氧基-4′5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)和QFITC(XRITC)；2′，7′-二氟荧光素(OREGON
Figure BDA0003468533170000761
)；荧光胺；IR144；IR1446；孔雀石绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副玫瑰苯胺；酚红；B-藻红蛋白；邻苯二甲醛；芘及衍生物诸如芘、芘丁酸酯和琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯；活性红4(
Figure BDA0003468533170000762
亮红3B-A)；罗丹明及衍生物诸如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、罗丹明绿、磺基罗丹明B、磺基罗丹明101和磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)；N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；玫红酸和铽螯合物衍生物；发射波长约为617nm的硫醇反应性铕螯合物(Heyduk和Heyduk，Analyt.Biochem.248∶216-27，1997；J.Biol.Chem.274∶3315-22，1999)、以及GFP、LissamineTM、二乙基氨基香豆素、氯三嗪基荧光素、萘基荧光素、4，7-二氯罗丹明和氧杂蒽(如授予Lee等人的美国专利号5,800,996中所述)及其衍生物。也可以使用本领域技术人员已知的其他荧光团，例如可从Invitrogen Detection Technologies，MolecularProbes(Eugene，Oreg.)获得的那些，并且包括ALEXA FLUORTM系列染料(例如，如美国专利号5,696,157、6,130,101和6,716,979中所述)、BODIPY系列染料(二吡咯亚甲基二氟化硼染料，例如，如美国专利号4,774,339、5,187,288、5,248,782、5,274,113、5,338,854、5,451,663和5,433,896中所述)、瀑布蓝(美国专利号5,132,432中所述的磺化芘的胺反应性衍生物)和海蓝(美国专利号5,830,912)，荧光纳米颗粒诸如半导体纳米晶体，例如QUANTUMDOTTM(例如从QuantumDot Corp，Invitrogen Nanocrystal Technologies，Eugene，Oreg.；另见美国专利号6,815,064、6,682,596和6,649,138获得的)。半导体纳米晶体，其描述于例如美国专利号6,602,671、Bruchez等人(1998)Science 281：2013-6、Chan等人(1998)Science 281：2016-8和美国专利号6,274,323、6,927,069、6,914,256、6,855,202、6,709,929、6,689,338、6,500,622、6,306,736、6,225,198、6,207,392、6,114,038、6,048,616、5,990,479、5,690,807、5,571,018、5,505,928、5,262,357和美国专利公开号2003/0165951以及PCT公开号99/26299(1999年5月27日公开)中；放射性同位素(诸如3H)；金属螯合物，诸如放射性或顺磁性金属离子如Gd3+的DOTA和DPTA螯合物；和脂质体；酶，例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶或β-内酰胺酶，酶与产生可检测信号的生色团、荧光或发光化合物组合，例如，由InvitrogenCorporation，Eugene Oreg.销售的那些)。显色化合物的特定示例包括：二氨基联苯胺(DAB)、4-硝基苯基磷酸盐(pNPP)、固红、溴氯吲哚磷酸盐(BCIP)、硝基蓝四唑(NBT)、BCIP/NBT、固红、AP橙、AP蓝、四甲基联苯胺(TMB)、2，2’-联氮-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐](ABTS)、邻联茴香胺、4-氯萘酚(4-CN)、硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、邻苯二胺(OPD)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷(X-Gal)、甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷(MU-Gal)、对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(PNP)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gluc)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、洋红、碘硝基四唑(INT)、四唑蓝和四唑紫等。
本公开一般还包括由本文所述的任何装置和方法产生的组合物。
此外，在一些实施例中，通过使用前述装置和方法(诸如罕见的遗传和/或表观遗传事件、罕见细胞等的检测)获得的结果或通过任何前述装置和方法产生的组合物可以用在对用于治疗受试者的适当治疗方案的选择中。治疗方案可包括化学疗法、免疫调节剂施用、放射、细胞因子施用、手术中的任一种或其组合。此外，所公开的装置和方法可用于选择适合在受试者中使用的至少一种治疗剂(诸如拮抗、抑制或阻断至少一种检测到的生物标志物的表达或功能活性的抗体、核酸、小分子或多肽)，其中该受试者的肿瘤是通过所述装置和/或方法所分析的代表性样品的来源。
此外，通过所述装置和/或方法所分析的样品，例如使用所述装置和/或方法获得的靶核酸，可以适用于额外的诊断测试，诸如全基因组测序，这对未来药理学和诊断发现以及个性化医疗可能很重要。所述分析的样品可用于多种诊断方案，以便鉴定罕见的肿瘤亚克隆并进而改进临床诊断和个性化癌症治疗。而且，所得分析的样品可用于衍生可用于开发治疗性或预防性肿瘤疫苗的抗体或抗原。
与本文所述的用于样品分析的装置和方法协同使用的检测程序还可以包括细胞化学染色程序，该程序呈现细胞或细胞区室的显色或荧光染色。这样的染色程序是本领域技术人员已知的，并且可以例如包括例如对细胞学标本中的亚细胞区域(例如细胞核、线粒体、高尔基体、细胞质等)、特定分子(染色体、脂质、糖蛋白、多糖等)的嗜酸性或嗜碱性结构进行染色。可以采用荧光染料，诸如DAPI、喹吖因(Quinacrin)、色霉素等。此外，可以应用显色染料，诸如Azan、吖啶橙、苏木精、曙红、苏丹红、噻嗪染料(甲苯胺蓝、硫堇)。在其他实施例中，可以使用染色程序诸如巴氏染色、吉姆萨染色、苏木精-曙红染色、van-Gieson染色、希夫染色(使用希夫试剂)、使用金属沉淀(例如在采用硝酸盐的染色程序中的银的沉淀)的染色程序或不溶性染色诸如滕氏蓝(或其他不溶性金属氰化物)等。必须理解，指定的染料和染色方法应该是适用方法的示例，并且本领域已知的任何其他方法可以与本文所述的用于样品分析的装置和方法协同应用。
染色程序可以会产生用于光学显微镜检查的显色染色或用于在荧光显微镜条件下检查的荧光染色。在另一个实施例中，辐射发射程序，即采用损害辐射或其他造影剂传输的物质对样品中的细胞学状况进行成像的程序(例如，通过诸如(显微)放射自显影或(显微)射线图片生成的手段生成光学印模)可以与本文所述的用于样品分析的装置和方法协同使用。
任何染色和成像程序不仅可以用于显微程序中的分析，还可以用于自动分析程序中的分析，诸如流式细胞术、自动显微(计算机化或计算机辅助)分析或用于分析染色的细胞学标本的任何其他方法。“自动化”或“自动”是指基本上由计算机或机器驱动且基本上无需人工干预的活动。
此外，本公开一般涉及装置和方法，其包括一种或多种靶分析物(例如一种或多种靶核酸，可以包括无细胞核酸(cfNA)，例如cfDNA)的基于ETP的分离/纯化，通过下述进行：提供用于实施ETP的装置；提供包含所述一种或多种无细胞核酸的样品；通过使用所述装置实施ETP来进行一次或多次ETP运行，其中所述ETP运行将所述一种或多种cfNA聚焦到一个或多个聚焦区中，例如作为一个或多个ETP带；以及收集所述一种或多种cfNA，从而获得一种或多种分离/纯化的cfNA。在一些情况下，可以通过使用本文所述的基于ETP的装置和方法从血浆样品中分离/纯化cfNA，例如cfDNA。在一些情况下，所述血浆样品可以在一种或多种靶分析物例如一种或多种cfNA的基于ETP的分离/纯化之前被蛋白酶K消化。在一些情况下，一种或多种cfNA(例如一种或多种cfDNA)的基于ETP的分离/纯化可包括使用包含100mMHCl-组氨酸pH6.25的LE和/或包含100mMTAPS-Tris pH 8.30的TE。在一些情况下，待通过基于ETP的装置和方法分离/纯化的cfNA可以是约1000bp或更长、1000bp或更短、900bp或更短、800bp或更短、700bp或更短、600bp或更短、500bp或更短、400bp或更短、300bp或更短、250bp或更短、200bp或更短、150bp或更短的长度。在一些实施例中，在基于ETP的分离/纯化之后，一种或多种cfNA，例如cfDNA和/或cfRNA，可以作为所述一种或多种cfNA的分离/纯化的样品被收集，并且所述分离/纯化的样品可以进一步经历本文描述的任何一种或多种分析技术，例如测序，例如在标题为“与本文所述的装置和方法关联使用的其他方法”的部分中描述的那些。在一些情况下，在基于ETP的分离/纯化之后，一种或多种靶分析物，例如一种或多种靶核酸，诸如一种或多种cfDNA可以被收集，并且可以进一步经历一种或多种基于珠的清理步骤，例如，收集后的基于KAPA纯珠的清理步骤。在一些情况下，在一种或多种靶核酸(例如一种或多种cfDNA)的基于ETP的分离/纯化期间，可以使用嵌入染料(例如，SYBR金染料)来辅助DNA的可视化。在一些情况下，在所述一种或多种靶核酸的基于ETP的分离/纯化期间，可以不使用嵌入染料来帮助一种或多种靶核酸例如一种或多种cfDNA的可视化。在一些情况下，源自怀孕母亲的血浆样品的一种或多种cfNA(例如一种或多种cfDNA)的基于ETP的分离/纯化可以是从基因组DNA及其片段中分离/纯化存在于所述原始血浆样品中的所述一种或多种cfNA。在一些情况下，与不使用基于ETP的分离/纯化实施的方法相比，一种或多种cfNA的基于ETP的分离/纯化可产生1.25倍或更多、1.5倍或更多、1.75倍或更多、2.0倍或更多、2.25倍或更多、2.5倍或更多、2.75倍或更多、3倍或更多、4倍或更多、5倍或更多、10倍或更多、100倍或更多或者1000倍或更多的一种或多种cfNA。在一些情况下，靶分析物(例如cfNA，例如cfDNA)从样品中的基于ETP的分离/纯化可以使得存在于原始样品中的靶分析物(例如cfNA)的约1％或更少、1％或更多、5％或更多、10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、99％或更多或者100％被分离/纯化，并且任选地收集。在一些情况下，一种或多种靶分析物(例如一种或多种cfNA，例如一种或多种cfDNA)的基于ETP的分离/纯化可获得约1.0ng或更少、1.0ng或更多、2.0ng或更多、3.0ng或更多、4.0ng或更多、5.0ng或更多、5.5ng或更多、6.0ng或更多、6.5ng或更多、6.8ng或更多、10ng或更多、50ng或更多或者100ng或更多的所述一种或多种靶分析物(例如一种或多种cfNA，例如一种或多种cfDNA)，其中任选地收集分离/纯化的靶分析物。在一些实施例中，基于ETP的从样品中分离/纯化靶分析物法可产生1％或更低、1％或更高、5％或更高、10％或更高、15％或更高、20％或更高、25％或更高、30％或更高、35％或更高、40％或更高、45％或更高、50％或更高、55％或更高、60％或更高、65％或更高、70％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高或者99％或更高纯度的所述靶分析物，例如，如通过分析技术所测量，以确定包含一种或多种靶分析物的ETP分离/纯化的样品的组成。在一些实施例中，可以进行一次或多次基于ETP的分离/纯化以分离/纯化一种或多种靶分析物。例如，在一些情况下，可以对包含一种或多种靶分析物的样品进行基于ETP的分离/纯化，以将一种或多种靶分析物聚焦到一个聚焦区(ETP带)中，这基本上将一种或多种靶分析物与原始样品中包含的其他材料分离。样品可以在ETP分离/纯化之后收集，并且分离/收集的样品可以进一步经历另一次基于ETP的分离/纯化。任选地，第二次基于ETP的分离-纯化可以在一定条件下进行，以便在多于一种靶分析物的情况下，将一种或多种靶分析物中的每一种分离到单独的聚焦区中，每个聚焦区可以任选地单独收集，从而(如果希望)将靶分析物彼此分离。
在一些实施例中，通过基于ETP的方法和装置分离/纯化的cfNA，例如，cfDNA，可以进一步经历利用非多态性和多态性检测来确定混合样品中的来自单一来源的来源贡献和拷贝数变异(CNV)的测定系统，诸如在通过引用全文并入本文的美国专利申请公开号2012/0034685中描述的。确定样品中主要和/或次要来源的贡献可以提供关于是否存在来自两个来源的足够遗传物质的信息，以允许充分鉴定基因组区域以测定混合样品中的CNV。此外，测定系统可以利用来自个体的混合样品中的选定基因座的扩增和检测来计算来源贡献并鉴定一个或多个基因组区域的拷贝数，并且这种测定系统具有确定混合样品中的来自主要和/或次要来源的核酸贡献的能力，以及混合样品中的来自单一来源的一个或多个基因组区域处存在或不存在CNV。这样的测定系统可以特异性地检测混合样品中的两个或多个来源中存在的基因组区域的拷贝数。为了确定贡献，可以将混合样品中的来自一个来源的选定基因座与至少一个其他来源的选定基因座区分开来。为了确定基因组区域的拷贝数变异，可以但不需要区分选定基因座的来源贡献，因为拷贝数变异可以通过比较混合样品中的两个或多个基因组区域的水平来检测。在一些情况下，当与通过基于ETP的装置和方法分离/纯化的cfNA(例如cfDNA和/或cfRNA)一起使用时，这种测定系统可以提供：1)使用来自两个或更多信息基因座的频率数据，确定混合样品中的主要来源和/或次要来源的贡献；2)确定主要和次要来源中的一个或多个基因组区域的频率；和3)鉴定混合样品中的主要和/或次要来源中存在或不存在染色体异常。此外，这种测定系统可以与通过基于ETP的方法和装置分离/纯化的cfNA一起使用，以鉴定母体样品中的胎儿贡献百分比和染色体异常。测定系统可以包括以下步骤：对母体样品例如母体血液和/或血浆样品进行基于ETP的cfNA的分离/纯化以获得分离/纯化的母体样品；在允许固定的寡核苷酸特异性地杂交至对应于第一染色体的两个或更多个基因座上的互补区域的条件下，将第一组固定序列寡核苷酸引入到分离并收集的样品中；在允许固定的寡核苷酸特异性地杂交至对应于第二染色体的两个或更多个基因座上的互补区域的条件下，将第二组固定序列寡核苷酸引入到分离并收集的样品中；在允许固定寡核苷酸特异性地杂交至两个或更多个信息基因座上的互补区域的条件下，将第三组固定序列寡核苷酸引入分离/纯化的样品中；连接杂交的寡核苷酸以产生与核酸互补的连续连接产物；扩增连续的连接产物以产生扩增产物；以及检测扩增产物。扩增产物的检测可用于计算母体样品中的胎儿贡献以及鉴定胎儿核酸中的染色体异常。
此外，本公开一般涉及通过基于ETP的装置和方法分离/纯化一种或多种cfNA，例如一种或多种cfDNA和/或一种或多种cfRNA，其中所述分离/纯化的一种或多种cfNA被进一步分析以检测胎儿非整倍性。例如，这种检测胎儿非整倍性的测定法一般描述于通过引用全文并入本文的美国专利申请公开号2012/0034685中，并且特别描述于实例7中。例如，一种或多种cfNA，例如一种或多种cfDNA，可通过使用本文所述的基于ETP的装置和方法来分离/纯化，并且来自母体样品的分离/纯化的一种或多种cfNA可用作模板用于杂交、连接和扩增每个母体样品中的来自21号染色体和18号染色体两者的多个选定基因座。现在描述包含cfDNA的示例。三个寡核苷酸可以杂交至每个选定的基因座以产生用于扩增和检测的连接产物。左侧(或第一)固定序列寡核苷酸可包含与选定基因座互补的区域和第一通用引物区域。右侧(或第二)固定序列寡核苷酸可包含与选定基因座互补的第二区域和第二通用引物区域。可设计用于诸如测定的桥接寡核苷酸，使得其各自杂交至用于非整倍性检测测定中的两个或更多个选定基因座的桥接区域。当固定序列寡核苷酸和桥接寡核苷酸杂交至cfDNA上的互补区域时，它们的末端可以会形成两个切口。在将杂交的寡核苷酸连接到cfDNA后，可以为每个选定的基因座产生连接产物，包括可以用作一组扩增引物的模板。然后可以使用分别包含与第一和第二通用引物区域互补的区域的两个扩增引物来扩增连接产物。该扩增产物可包含选定基因座的序列。右侧扩增引物还可包含样品索引以鉴定在多重测定中从其获得基因座的特定样品。例如，使用96种不同的右侧扩增引物进行扩增可以在单个泳道上汇集和同时测序96种不同的扩增产物。这种扩增可以发生在96孔板中。例如，来自单个96孔板的扩增产物可以等体积汇集，汇集的扩增产物可以根据制造商的说明用SPRI珠(Beckman-Coulter，Danvers，Mass.)和/或KAPA纯珠进行纯化。然后，根据制造商的方案，每个纯化的汇集文库可用作在NGS平台上进行簇扩增的模板。然后可以使用已知方法(例如美国专利申请公开号2012/0034685中描述的那些)计算每个靶染色体的比例度量。
除了检测非整倍性之外，还可以使用特定的多态性来确定胎儿对母体样品的贡献百分比，其中通过本文所述的基于ETP的装置和方法分离/纯化的cfNA(例如cfDNA)用于此类确定。用于确定这些胎儿贡献百分比的一般方法在全文以引用方式并入的2011年7月19日提交的美国序列号61/509,188中有所描述。简而言之，对具有可检测的多态性的某些基因座进行测序可以将这些基因座鉴定为信息基因座。然后，具有不同于母体多态性区域的胎儿多态性区域的经鉴定的基因座的计数可用于计算母体样品的近似胎儿贡献。用于计算胎儿对母体样品的贡献百分比的每个基因座可具有最少约256个计数。用于该计算的示例性SNP数据集在下文在美国专利申请公开号2012/0034685的实例7中的表2和表3中说明。然后，对应于从这些集合中鉴定的信息基因座的数据可以用于计算贡献百分比。在美国专利申请公开号2012/0034685的实例7的表2和表3中的每个表中以粗体显示了信息基因座。
此外，通过本文讨论的基于ETP的方法和装置分离/纯化的cfNA(例如cfDNA)的使用可以进一步经历CNV分析，诸如上述分析，这可以允许鉴定混合样品的CNV和感染源。这对于监测临床结果可能因感染源的存在而受到损害的患者特别有帮助。例如，已经接受移植手术的患者可能会服用免疫抑制剂药物，因此一般更容易感染。同样，孕妇的免疫系统发生变化并因此可能更容易感染病原体，这些病原体可能对母亲和/或胎儿产生不利影响。此外，某些类型的癌症与感染源有关(例如，与乙型和丙型肝炎感染相关的肝癌，与人乳头瘤病毒感染相关的宫颈癌)，并且感染源的鉴定可能有助于预测临床结果或确定患者首选的医疗进程。因此，在某些方面，用于计算来源贡献、检测基因组区域的CNV存在或不存在以及使用单一测定法检测混合样品中存在或不存在感染源的测定系统可以包括以下步骤：提供通过基于ETP的装置和/或方法分离/纯化的靶核酸，例如，使用基于ETP的装置实施ETP以将靶核酸聚焦到聚焦区中，并且任选地随后收集所述聚焦区；在允许固定的寡核苷酸特异性地杂交至基因组区域中的或与基因组区域相关的一个或多个基因座上的互补区域的条件下，将第一组固定序列寡核苷酸引入混合样品中；在允许固定的寡核苷酸特异性地杂交至至少一个信息基因座上的互补区域的条件下，将第二组固定序列寡核苷酸引入混合样品中；在允许固定序列寡核苷酸特异性地杂交至指示感染源的基因座上的互补区域的条件下，将第三组固定序列寡核苷酸引入混合样品中；连接杂交的寡核苷酸以产生与基因座互补的连续连接产物；扩增连续的连接产物以产生扩增产物；以及检测扩增产物。扩增产物的检测与混合样品中的基因组区域的拷贝数和存在或不存在感染源相关。
此外，通过基于ETP的装置和方法(诸如本文所述的那些)分离/纯化的cfNA，例如cfDNA，可以进一步经历cfNA的肿瘤特异性改变的定量和定性检测(诸如cfDNA链完整性、频率突变、微卫星异常和基因的甲基化)，作为癌症患者的诊断、预后和监测标志物，并任选地与CNV检测相结合以提供一种对患有或怀疑患有恶性肿瘤的患者进行辅助临床诊断、治疗、结果预测和进展监测的方法。对于进一步讨论，参见美国专利申请公开号2012/0034685。
此外，通过基于ETP的装置和方法(诸如本文所述的那些)分离/纯化的cfNA(例如cfDNA)可以进一步经历可用于使用cfDNA检测与SNP检测的组合或者一个或多个单基因中的突变来监测移植患者的器官健康的测定系统(对于进一步讨论，参见美国专利申请公开号2012/0034685)。移植器官的基因组与受体患者的基因组不同，并且可以使用这样的测定系统检测器官健康状况。例如，已显示心脏移植受者的急性细胞排斥与来自供体基因组中的无细胞DNA水平的显著增加有关。
在一些情况下，通过基于ETP的装置和方法分离和收集的靶分析物，例如cfNA，可以经历美国专利申请公开号2012/0034685的任何一种或多种方法和/或测定，例如，除了上述方法和测定之外，在标题为“测定方法”、“检测拷贝数变异”、“与疾病或倾向相关的多态性”、“选定的扩增”、“通用扩增”、“样品内和样品之间的变异最小化”、“使用测定系统检测来自癌症患者的混合样品”、“使用测定系统检测移植患者的混合样品”、“使用测定系统检测母体样品”和“混合样品中次要来源DNA含量的测定”的部分中描述的那些方法和测定。
此外，本公开一般涉及一种用于检测包含胎儿和母体无细胞DNA的母体样品中的胎儿来源的来源贡献以及一个或多个基因组区域中的胎儿拷贝数变异(CNV)存在或不存在的测定法，所述测定法包括以下步骤：a.使用一种或多种基于ETP的装置和/或一种或多种基于ETP的方法，例如本文所述的那些，从母体样品中分离/纯化cfNA，例如，cfDNA，以获得分离/纯化的母体样品；b.使(i)第一组两个或更多个固定序列寡核苷酸与(ii)分离/纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中第一组固定序列寡核苷酸包含第一和第二固定序列寡核苷酸，所述第一和第二固定序列寡核苷酸与第一基因组区域中的至少48个且小于2000个基因座中每一个基因座内的连续区域互补，其中第一组固定序列寡核苷酸中的至少一个包含通用引物区域并且第一组固定序列寡核苷酸中的第一固定序列寡核苷酸的解链温度(Tm)在两摄氏度的范围内变动；c.使(i)第二组两个或更多个固定序列寡核苷酸与(ii)分离/纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中第二组固定序列寡核苷酸包含第一和第二固定序列寡核苷酸，所述第一和第二固定序列寡核苷酸与第二基因组区域中的至少48个且小于2000个基因座中每一个基因座内的连续区域互补，其中第二组固定序列寡核苷酸中的至少一个包含通用引物区域并且第二组固定序列寡核苷酸中的第一固定序列寡核苷酸的Tm在两摄氏度的范围内变动；d.使(i)第三组至少两个固定序列寡核苷酸与(ii)分离/纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中第三组至少两个固定序列寡核苷酸与两个或更多个多态性信息基因座的连续、多态性区域互补；e.将杂交的第一组固定序列寡核苷酸连接以生成与第一基因组区域互补的连续连接产物，将杂交的第二组固定序列寡核苷酸连接以生成与第二基因组区域互补的连续连接产物，并且将杂交的第三组固定序列寡核苷酸连接以生成与多态性信息基因座互补的连续连接产物；f.使用通用引物区域扩增连续连接产物以生成扩增产物；g.使用高通量测序，通过平均至少100次测量来自第一基因组区域和第二基因组区域的每一个基因座来检测扩增产物；以及h.确定所测量的来自第一和第二基因组区域的基因座的相对频率，其中所测量的来自第一基因组区域的基因座的相对频率与所测量的来自第二基因组区域的基因座的相对频率不同，指示胎儿拷贝数变异的存在，所述确定不依赖于对第一和第二基因组区域内的多态性的检测，并且在多态性信息基因座处源自胎儿来源与母体来源的序列读段的比例指示来源贡献，其中来自胎儿来源的来源贡献为至少5％且低于25％。此外，本公开一般涵盖一种用于使用单一测定法来检测包含胎儿和母体无细胞DNA的母体样品中的胎儿来源的来源贡献以及胎儿非整倍性存在或不存在的测定法，所述测定法包括以下步骤：a.使用一种或多种基于ETP的装置和/或一种或多种如本文所述的基于ETP的方法从母体样品中分离/纯化cfNA，例如，cfDNA，以获得分离/纯化的母体样品；b.使(i)第一组两个或更多个固定序列寡核苷酸与(ii)分离/纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中第一组固定序列寡核苷酸包含第一和第二固定序列寡核苷酸，所述第一和第二固定序列寡核苷酸与对应于第一染色体的至少48个且小于2000个基因座中每一个基因座内的连续区域互补，并且第一组固定序列寡核苷酸中的第一固定序列寡核苷酸的解链温度(Tm)在两摄氏度的范围内变动；c.使(i)第二组两个或更多个固定序列寡核苷酸与(ii)分离/纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中第二组固定序列寡核苷酸包含第一和第二固定序列寡核苷酸，所述第一和第二固定序列寡核苷酸与对应于第二染色体的至少48个且小于2000个基因座中每一个基因座内的连续区域互补，并且第二组固定序列寡核苷酸中的第一固定序列寡核苷酸的Tm在两摄氏度的范围内变动；d.使(i)第三组至少两个固定序列寡核苷酸与(ii)分离/纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中第三组至少两个固定序列寡核苷酸与两个或更多个多态性信息基因座的连续、多态性区域互补；e.将杂交的第一组固定序列寡核苷酸连接以生成与第一染色体上的基因座互补的连续连接产物，将杂交的第二组固定序列寡核苷酸连接以生成与第二染色体上的基因座互补的连续连接产物，并且将杂交的第三组固定序列寡核苷酸连接以生成与多态性信息基因座互补的连续连接产物；f.扩增连续连接产物以生成扩增产物；g.使用高通量测序，通过平均至少100次测量第一染色体上的每一个基因座、第二染色体上的每一个基因座和每一个信息基因座来检测扩增产物；以及h.确定所测量的来自第一和第二基因组区域的基因座的相对频率，其中所测量的来自第一基因组区域的基因座的相对频率与所测量的来自第二基因组区域的基因座的相对频率不同，指示胎儿拷贝数变异的存在，所述确定不依赖于对第一和第二基因组区域内的多态性的检测，并且在多态性信息基因座处源自胎儿来源与母体来源的序列读段的比例指示来源贡献，其中来自胎儿来源的来源贡献为至少5％且低于25％。此外，本公开一般涵盖一种用于检测包含胎儿和母体无细胞DNA的母体样品内的胎儿来源的来源贡献以及一个或多个基因组区域中的胎儿CNV存在或不存在的测定法，所述测定法包括以下步骤：a.使用一种或多种基于ETP的装置和/或一种或多种的基于ETP的方法，诸如本文所述的那些，从母体样品中分离/纯化cfNA，例如，cfDNA，以获得分离和/或纯化的母体样品；b.使(i)第一组两个或更多个固定序列寡核苷酸与(ii)分离/纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中第一组固定序列寡核苷酸包含第一和第二固定序列寡核苷酸，所述第一和第二固定序列寡核苷酸与第一基因组区域中的二十四个或更多个基因座的区域互补，并且第一组固定序列寡核苷酸中的第一固定序列寡核苷酸的解链温度(Tm)在两摄氏度的范围内变动；c.使(i)第二组两个或更多个固定序列寡核苷酸与(ii)分离/纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中第二组固定序列寡核苷酸包含第一和第二固定序列寡核苷酸，所述第一和第二固定序列寡核苷酸与第二基因组区域中的二十四个或更多个基因座的区域互补，并且第二组固定序列寡核苷酸中的第一固定序列寡核苷酸的Tm在两摄氏度的范围内变动；d.使(i)第三组至少两个固定序列寡核苷酸与(ii)分离/纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中第三组至少两个固定序列寡核苷酸与两个或更多个多态性信息基因座的连续、多态性区域互补；e.使(i)桥接寡核苷酸与(ii)分离/纯化的母体样品中的无细胞DNA杂交，其中桥接寡核苷酸与位于与第一组、第二组和第三组固定序列寡核苷酸互补的区域之间的基因座中的区域互补；f.将第一组固定序列寡核苷酸与桥接寡核苷酸连接以生成与第一基因组区域中的基因座互补的连续连接产物，将第二组固定序列寡核苷酸与桥接寡核苷酸连接以生成与第二基因组区域所缔合的基因座互补的连续连接产物，并且将杂交的第三组固定序列寡核苷酸连接以生成与多态性信息基因座互补的连续连接产物；g.扩增连续连接产物以生成扩增产物；h.使用高通量测序，通过平均至少100次测量第一基因组区域中的每一个基因座和第二基因组区域中的每一个基因座来检测扩增产物；以及i.确定所测量的来自第一和第二基因组区域的基因座的相对频率，其中所测量的来自第一基因组区域的基因座的相对频率与所测量的来自第二基因组区域的基因座的相对频率不同，指示胎儿拷贝数变异的存在，所述确定不依赖于对第一和第二基因组区域内的多态性的检测，并且在多态性信息基因座处源自胎儿来源与母体来源的序列读段的比例指示来源贡献，其中来自胎儿来源的来源贡献为至少5％且低于25％。
此外，一种或多种靶分析物，例如一种或多种靶核酸，例如(cf)DNA和/或(cf)RNA，可以通过基于ETP的装置和/或方法(诸如本文描述的那些装置和/或方法)来分离/纯化，并且可以进一步经历用于检测样品中的遗传特征的方法，该遗传特征包括拷贝数变异(CNV)、插入、缺失、易位、多态性和突变，诸如在全文通过引用并入本文的美国专利号9,567,639中描述的那些。例如，这样的方法可采用以下技术：对每个所查询的基因座使用至少两个固定序列寡核苷酸来查询来自两个或更多个靶基因组区域的基因座，并通过连接直接或间接地连接固定序列寡核苷酸。来自选定基因组区域中的不同基因座的连接产物包含设计为包括与固体支持物上的一种或多种捕获探针互补的区域的核酸捕获区域。捕获区域包含一种或多种可检测标签，其将连接产物鉴定为源自特定靶基因组区域。通过将连接产物的捕获区域结合至固体支持物上的互补捕获探针，可以鉴定来自不同靶基因组区域的连接产物。在一些情况下，此类方法可用于检测胎儿非整倍性，例如用于提供胎儿非整倍性的统计学可能性的测定方法包括：对母体样品进行基于ETP的分离/纯化以分离/纯化母体和胎儿的无细胞DNA，从而获得分离/纯化的母体样品，然后，随后使用包含捕获区域的序列特异性寡核苷酸查询来自第一靶基因组区域的一个或多个基因座，使用包含捕获区域的序列特异性寡核苷酸查询来自第二靶基因组区域的一个或多个基因座，通过杂交至阵列检测来自第一和第二靶基因组区域的分离的选定基因座，将分离的基因座的总计数定量以确定第一和第二靶基因组区域的相对频率，使用序列特异性寡核苷酸查询来自不同于第一和第二靶基因组区域的至少一个靶基因组区域的选定多态性基因座，检测分离的选定多态性基因座，将分离的选定多态性基因座的总计数定量以计算分离/纯化的母体样品中的胎儿无细胞DNA的百分比，计算分离/纯化的母体样品中的胎儿非整倍性的统计学可能性，其中来自第一靶基因组区域的基因座的相对频率、来自第二靶基因组区域的基因座的相对频率以及来自分离的选定多态性基因座的定量计数提供存在胎儿非整倍性的统计学可能性。在一些情况下，这种用于检测胎儿非整倍性的方法可提供用于从分离的选定多态性基因座中鉴定低频等位基因，其中母体DNA是纯合的并且非母体DNA是杂合的；计算来自分离的选定多态性基因座的低频等位基因的总和；以及使用来自分离的选定多态性基因座的低频等位基因的总和计算分离并收集的母体样品中胎儿非整倍性的统计学可能性，以针对第一和第二靶基因组区域计算靶基因组区域频率的统计学显著差异，并且其中染色体频率的统计学显著差异提供了胎儿非整倍性存在的统计学可能性。在使用经历基于ETP的分离/纯化的样品来检测胎儿非整倍性的方法的一些情况下，“阈值”水平可用于基于观察到的混合样品中的第一和第二染色体的相对频率的偏差来确定胎儿非整倍性的存在或不存在。该阈值可以例如使用诸如在以下文献中公开的那些技术来确定：美国公开申请号2012/0149583、2013/0324420、2013/0029852；和美国专利号8,532,936，每一文献都通过引用全文并入本文。在某些方面，使用从代表性样品群体确定的阈值水平来确定与预期计数的偏差，并且优选地，代表性群体包括来自具有相似特征(诸如既往风险概况、母亲年龄和/或孕龄)的患者的样品。在一些情况下，通过基于ETP的装置和方法分离/纯化的靶分析物可以经历美国专利号9,567,639的任何一种或多种方法和/或测定，例如，除了上述方法和测定之外，在标题为“检测拷贝数变异”、“串联连接测定”、“检测多态性”、“附加实施例”、“通用扩增”、“估计母体样品中胎儿DNA的比例”、“数据分析”和“本发明过程的计算机实施”的部分中描述的那些方法和测定。
此外，本公开一般涉及一种用于提供胎儿拷贝数变异的统计学可能性的测定方法，其包括：提供包含母体和胎儿无细胞DNA的母体血浆或血清样品；通过使用一种或多种如本文所述的基于ETP的装置和/或方法来分离/纯化所述无细胞DNA；通过使成组的至少两个包含与第一靶基因组区域中的基因座互补的区域的固定序列寡核苷酸杂交来查询至少48个来自第一靶基因组区域的非多态性基因座，其中每一组的固定序列寡核苷酸中的一个包含第一捕获区域、第一标签结合区域和两个限制位点；通过使成组的至少两个包含与第二靶基因组区域中的基因座互补的区域的固定序列寡核苷酸杂交来查询至少48个来自第二靶基因组区域的非多态性基因座，其中每一组的固定序列寡核苷酸中的一个包含第一捕获区域、第二标签结合区域和两个限制位点；将杂交的固定序列寡核苷酸连接；扩增连接的固定序列寡核苷酸以生成扩增子；在限制位点处裂解扩增子以生成裂解的扩增子，其中每一个裂解的扩增子包含第一捕获区域和第一或第二标签结合区域；通过使裂解的扩增子的第一捕获区域杂交至包含与第一捕获区域互补的捕获探针的阵列来检测来自第一和第二靶基因组区域的裂解的扩增子，其中来自第一和第二靶基因组区域的裂解的扩增子竞争性地杂交至与第一捕获区域互补的捕获探针；通过检测第一和第二标签结合区域，将裂解的扩增子的捕获区域定量以确定所查询的来自第一和第二靶基因组区域的非多态性基因座的相对频率；基于所确定的第一和第二标签结合区域的相对频率，估计第一和第二靶基因组区域的相对频率；对于每一个多态性基因座，通过使成组的至少三个固定序列等位基因特异性寡核苷酸杂交来查询至少48个来自不同于第一和第二靶基因组区域的至少一个靶基因组区域的多态性基因座，其中每一组的至少三个等位基因特异性寡核苷酸中的两个包含与多态性基因座处的一个等位基因互补的序列、对于每一个多态性基因座具特异性的捕获区域、针对多态性基因座处的每一个等位基因的不同的标签结合区域、和两个限制位点；将杂交的固定序列等位基因特异性寡核苷酸连接；扩增连接的固定序列等位基因特异性寡核苷酸以生成等位基因特异性扩增子；在限制位点处裂解等位基因特异性扩增子以生成裂解的等位基因特异性扩增子，其中每一个裂解的等位基因特异性扩增子包含多态性基因座特异性捕获区域和等位基因特异性标签结合区域；通过裂解的等位基因特异性扩增子的多态性基因座特异性捕获区域竞争性地杂交至阵列上的捕获区域，来检测来自多态性基因座的裂解的等位基因特异性扩增子；通过针对裂解的等位基因特异性扩增子上的每一个等位基因检测等位基因特异性标签结合区域，将多态性基因座的等位基因定量，以确定样品中胎儿DNA的分数；确定胎儿DNA的分数；以及使用估计的样品中第一和第二靶基因组区域的相对频率和胎儿DNA的分数，计算母体样品中胎儿拷贝数变异的统计学可能性。
此外，本公开一般涵盖一种用于确定胎儿非整倍性的可能性的测定方法，其包括以下步骤：提供包含母体和胎儿无细胞DNA的母体血浆或血清样品；通过使用如本文所述的一种或多种基于ETP的装置和/或方法来分离/纯化所述无细胞DNA，从而获得分离/纯化的母体样品；在允许每一个固定序列寡核苷酸的互补区域特异性地杂交至分离并收集的母体样品中第一靶基因组区域中的非多态性基因座的条件下，引入至少五十组第一组两个或更多个与非多态性基因座互补的固定序列寡核苷酸，其中每一组的固定序列寡核苷酸中的至少一个包含通用引物位点、第一捕获区域、第一标签结合区域和两个限制位点；在允许每一个固定序列寡核苷酸的互补区域特异性地杂交至母体样品中第二靶基因组区域中的非多态性基因座的条件下，引入至少五十组第二组两个或更多个与非多态性基因座互补的固定序列寡核苷酸，其中每一组的固定序列寡核苷酸中的至少一个包含通用引物位点、第一捕获区域、第二标签结合区域和两个限制位点；在允许每一个固定序列寡核苷酸的互补区域特异性地杂交至多态性基因座的条件下，引入至少五十组第三组三个或更多个与分离/纯化的母体样品中的一组多态性基因座互补的固定序列寡核苷酸，其中每一组的三个固定序列寡核苷酸中的至少两个包含通用引物位点、与多态性基因座处的一个等位基因互补的序列、针对多态性基因座处的每一个等位基因的等位基因特异性标签结合区域、两个限制位点和多态性基因座特异性捕获区域，其中针对每一个多态性基因座的捕获区域不同于针对每一个其他多态性基因座的捕获区域并且不同于第一捕获区域；使第一组、第二组和第三组固定序列寡核苷酸杂交至第一和第二靶基因组区域以及多态性基因座；延长杂交的第一组、第二组和第三组固定序列寡核苷酸中的至少一个以形成相邻杂交的固定序列寡核苷酸；将杂交的第一组、第二组和第三组固定序列寡核苷酸连接以生成连接产物；使用通用引物位点扩增连接产物，以生成对应于多态性基因座的扩增子；在限制位点处裂解扩增子以生成裂解的扩增子，其中每一个裂解的扩增子包含一个捕获区域和一个标签结合区域；将裂解的扩增子施加到阵列，其中阵列包含与来自第一和第二靶基因组区域的裂解的扩增子上的第一捕获区域互补的第一捕获探针，并且其中阵列包含与来自每一个多态性基因座的裂解的扩增子上的捕获区域互补的捕获探针；使来自第一和第二靶基因组区域的裂解的扩增子的第一捕获区域杂交至阵列上的第一捕获探针；使来自多态性基因座的裂解的扩增子的捕获区域杂交至阵列上的捕获探针；检测杂交的裂解的扩增子；通过检测第一和第二标签结合区域，将对应于来自第一靶基因组区域的基因座的裂解的扩增子的相对频率和对应于来自第二靶基因组区域的基因座的裂解的扩增子的相对频率定量；通过检测针对裂解的扩增子上的每一个等位基因的等位基因特异性标签结合区域，将来自多态性基因座的每一个等位基因的相对频率定量，以确定胎儿无细胞DNA的百分比；以及，使用对应于来自第一和第二靶基因组区域的基因座的裂解的扩增子的用以确定胎儿非整倍性的可能性的相对频率以及所确定的胎儿无细胞DNA的百分比，来计算胎儿非整倍性的可能性。
此外，本公开一般属于一种用于确定胎儿非整倍性的可能性的测定方法，其包括以下步骤：提供包含母体和胎儿无细胞DNA的母体血浆或血清样品；通过使用如本文所述的一种或多种基于ETP的装置和/或方法来分离/纯化所述无细胞DNA，从而获得分离/纯化的母体样品；在允许每一个固定序列寡核苷酸的互补区域特异性地杂交至母体样品中第一靶基因组区域中的一组非多态性基因座的条件下，引入至少五十组第一组两个或更多个与所述一组非多态性基因座互补的固定序列寡核苷酸，其中每一组的固定序列寡核苷酸中的至少一个包含通用引物位点、第一捕获区域、第一标签结合区域和两个限制位点；在允许每一个固定序列寡核苷酸的互补区域特异性地杂交至分离/纯化的母体样品中第二靶基因组区域中的一组非多态性基因座的条件下，引入至少五十组第二组两个或更多个与所述一组非多态性基因座互补的固定序列寡核苷酸，其中每一组的固定序列寡核苷酸中的至少一个包含通用引物位点、第一捕获区域、第二标签结合区域和两个限制位点；在允许每一个固定序列寡核苷酸的互补区域特异性地杂交至多态性基因座的条件下，引入两组或更多组第三组三个或更多个与母体样品中的一组多态性基因座互补的固定序列寡核苷酸，其中每一组的三个或更多个固定序列寡核苷酸中的至少两个包含通用引物位点、与多态性基因座处的一个等位基因互补的序列、针对多态性基因座处的每一个等位基因的等位基因特异性标签结合区域、两个限制位点和多态性基因座特异性捕获区域，其中针对每一个多态性基因座的捕获区域不同于针对每一个其他多态性基因座的捕获区域并且不同于第一捕获区域；使第一组、第二组和第三组固定序列寡核苷酸杂交至第一和第二靶基因组区域以及多态性基因座；延长杂交的第一组、第二组和第三组固定序列寡核苷酸中的至少一个以形成对于每一组的相邻杂交的固定序列寡核苷酸；将相邻杂交的来自第一组、第二组和第三组的固定序列寡核苷酸连接以生成连接产物；使用通用引物位点扩增连接产物以生成扩增子；在限制位点处裂解扩增子以生成裂解的扩增子，其中每一个裂解的扩增子包含一个捕获区域和一个标签结合区域；将裂解的扩增子施加到阵列，其中阵列包含与来自第一和第二靶基因组区域的裂解的扩增子上的第一捕获区域互补的第一捕获探针，并且其中阵列包含与来自每一个多态性基因座的裂解的扩增子上的捕获区域互补的捕获探针；使来自第一和第二靶基因组区域的裂解的扩增子的第一捕获区域杂交至阵列上的第一捕获探针；使来自多态性基因座的裂解的扩增子的捕获区域杂交至阵列上的捕获探针；检测杂交的裂解的扩增子；通过检测针对裂解的扩增子上的每一个等位基因的等位基因特异性标签结合区域，将来自多态性基因座的每一个等位基因的相对频率定量，以确定胎儿无细胞DNA的百分比；在母体基因座为纯合的且对应的胎儿基因座为杂合的情况下，通过从定量的等位基因鉴定低频率等位基因，确定胎儿无细胞DNA的百分比；通过检测第一和第二标签结合区域，将对应于来自第一靶基因组区域的基因座的裂解的扩增子的相对频率和对应于来自第二靶基因组区域的基因座的裂解的扩增子的相对频率定量；以及，使用对应于来自第一和第二靶基因组区域的基因座的裂解的扩增子的相对频率以及胎儿无细胞DNA的百分比，来计算胎儿非整倍性的可能性。
本公开一般进一步涵盖一种分离/纯化一种或多种靶分析物(例如一种或多种靶核酸)的方法，该方法包括所述一种或多种靶分析物的基于ETP的分离/纯化，其进一步包括使用ETP上位标记物。在一些实施例中，所述ETP上位标记物可以包含与靶分析物相比尺寸更大和/或长度更长的化合物或分子，使得在基于ETP的靶分析物分离/纯化期间，ETP上位标记物表示可以停止收集靶分析物的截止点。例如，荧光标记的或以其他方式可检测地标记的ETP上位标记物可以产生为大小大于在基于ETP的分离/纯化期间待收集的靶DNA。通过在整个ETP运行过程中监控标记物，使用者或自动化机器能够在标记物落入收集管之前停止运行，从而允许捕获小于标记物的DNA，同时由于较大的污染DNA定位在ETP上位标记物后面而将其留在管外。此外，不收集标记物本身，因此该标记物可以大量使用并与各种可检测标签一起使用，因为它不会干扰下游测定，例如，在标题为“与本文所述的装置和方法关联使用的其他方法”的部分中描述的那些。在一些情况下，ETP上位标记物可用于基于ETP的分离/纯化方法，因为它有助于排除不想要的材料，例如，从分离/纯化的cfDNA中排除基因组DNA。在一些实施例中，ETP上位标记物可以是约1000bp或更长的长度。
此外，本公开一般涵盖ctNA(例如ctDNA)的基于ETP的分离/纯化，其中所述ctNA可以进一步经历包括通过深度测序进行的癌症个性化谱分析(CAPP-Seq)的方法，诸如其全部内容通过引用并入本文的美国专利申请公开号20160032396描述的。此类方法一般可以包括将优化的文库制备方法与多阶段生物信息学方法相组合以设计DNA寡核苷酸的“选择子”群的方法，该选择子对应于目标癌症中的反复突变区域。DNA寡核苷酸的选择子群，可以称为选择子组，包含针对多个基因组区域的探针，并且被设计为使得多个基因组区域中的至少一个突变存在于患有特定癌症的受试者中的大多数中；并且在一些实施例中，在患有特定癌症的所有受试者中的大多数中存在多种突变。此外，此类CAPP-Seq方法可包括数据分析步骤，其可作为可由计算机执行的指令程序来提供并通过加载到计算机中的软件部件进行。此类方法包括为目标癌症设计鉴定选择子组。提供了其他生物信息学方法，用于在可检测到高于背景的循环肿瘤DNA时，例如使用将信息内容和突变类别整合到检测指标中的方法进行确定和定量。此外，用于通过检测体细胞突变来确定来自个体的无细胞核酸(cfNA)样品中肿瘤核酸(tNA)的存在的方法可以包括：(a)通过实施基于ETP的分离/纯化从样品中分离/纯化cfNA；(b)为对应于目标癌症中的多个突变区域的序列选择cfNA；(c)对选定的cfNA进行测序；(d)确定体细胞突变的存在，其中体细胞突变的存在可以指示个体中存在肿瘤细胞；以及(e)为个体提供对肿瘤细胞存在的评估。
在一些情况下，通过基于ETP的装置和/或方法分离/纯化的cfNA的浓度可以通过cfDNA的分子条形码来确定。cfDNA的分子条形码可包括将衔接子(adaptor)连接到cfDNA的一个或多个末端。衔接子可包含多个寡核苷酸。衔接子可包含一种或多种脱氧核糖核苷酸。衔接子可包含核糖核苷酸。衔接子可以是单链的。衔接子可以是双链的。衔接子可以包括双链和单链部分。例如，衔接子可以是Y形衔接子。衔接子可以是线性衔接子。衔接子可以是环状衔接子。衔接子可包括分子条形码、样品索引、引物序列、衔接子序列或其组合。分子条形码可以与样品索引相邻。分子条形码可以与引物序列相邻。样品索引可以与引物序列相邻。连接基序列可以将分子条形码联接到样品索引。连接基序列可以将分子条形码联接到引物序列。连接基序列可以将样品索引联接到引物序列。
衔接子可以包括分子条形码。分子条形码可包含随机序列。分子条形码可包含预定序列。两个或更多个衔接子可以包含两个或更多个不同的分子条形码。可以优化分子条形码以最小化二聚作用。可以优化分子条形码，以即使在扩增或测序错误时也能进行鉴定。例如，第一分子条形码的扩增可以引入单碱基错误。第一分子条形码可包含与其他分子条形码的大于单个碱基差异。因此，具有单碱基错误的第一分子条形码仍可被鉴定为第一分子条形码。分子条形码可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸。分子条形码可包含至少3个核苷酸。分子条形码可包含至少4个核苷酸。分子条形码可包含少于20、19、18、17、16或15个核苷酸。分子条形码可包含少于10个核苷酸。分子条形码可包含少于8个核苷酸。分子条形码可包含少于6个核苷酸。分子条形码可包含2至15个核苷酸。分子条形码可包含2至12个核苷酸。分子条形码可包含3至10个核苷酸。分子条形码可包含3至8个核苷酸。分子条形码可包含4至8个核苷酸。分子条形码可包含4至6个核苷酸。
衔接子可以包括样品索引。样品索引可以包括随机序列。样品索引可以包括预定序列。两组或更多组衔接子可以包括两个或更多个不同的样品索引。一组衔接子中的连接基可以包括相同的样品索引。可以优化样品索引以最小化二聚作用。可以优化样品索引，以即使在扩增或测序错误时也能进行鉴定。例如，第一样品索引的扩增可以引入单个碱基误差。第一样品索引可包含与其他样品索引的大于单个碱基差异。因此，具有单碱基错误的第一样品索引仍然可以被鉴定为第一分子条形码。样品索引可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个核苷酸。样品索引可包含至少3个核苷酸。样品索引可包含至少4个核苷酸。样品索引可包含少于20、19、18、17、16或15个核苷酸。样品索引可以包含少于10个核苷酸。样品索引可以包含少于8个核苷酸。样品索引可以包含少于6个核苷酸。样品索引可包含2至15个核苷酸。样品索引可包含2至12个核苷酸。样品索引可包含3至10个核苷酸。样品索引可包含3至8个核苷酸。样品索引可包含4至8个核苷酸。样品索引可包含4至6个核苷酸。
在一些情况下，通过基于ETP的装置和方法(诸如本文所述的那些)分离/纯化的ctNA，例如ctDNA，可以进一步经历包含ctDNA检测指数或其用途的方法、试剂盒和系统。一般而言，ctDNA检测指数基于来自受试者的样品中存在的一种或多种类型的突变的p值。ctDNA检测指数可以包括跨多个突变和体细胞突变类别的信息内容的整合。ctDNA检测指数可以类似于假阳性率。ctDNA检测指数可以基于决策树，其中融合断点因其不存在的背景而优先和/或其中可以整合来自多个类别的突变的p值。突变的类别可包括但不限于SNV、插入缺失、拷贝数变体和重排。ctDNA检测指数可用于评估包含具有多个类别的突变的基因组区域的选择子组的统计学显著性。例如，ctDNA检测指数可用于评估包含具有SNV和插入缺失的基因组区域的选择子组的统计学显著性。在另一个示例中，ctDNA检测指数可用于评估包含具有SNV和重排的基因组区域的选择子组的统计学显著性。在另一个示例中，ctDNA检测指数可用于评估包含具有重排和插入缺失的基因组区域的选择子组的统计学显著性。在另一个示例中，ctDNA检测指数可用于评估包含具有SNV、插入缺失、拷贝数变体和重排的基因组区域的选择子组的统计学显著性。ctDNA检测指数的计算可以基于在受试者中检测到的选择子组的基因组区域中的突变类型(例如，类别)。例如，选择子组可以包含具有SNV、插入缺失、拷贝数变体和重排的基因组区域，然而，在受试者中检测到的选择子的突变类型可以是SNV和插入缺失。ctDNA检测指数可以通过将SNV的p值与插入缺失的p值组合来确定。任何适用于组合独立、部分测试的方法均可用于组合SNV与插入缺失的p值。组合SNV与插入缺失的p值可以基于Fisher方法。
此外，通过基于ETP的装置和方法分离/纯化的靶核酸，例如cfDNA，可以进一步经历鉴定重排的方法。重排可以是基因组融合事件和/或断点。该方法可用于对通过基于ETP的方法和装置(诸如本文所述的那些)分离/纯化的cfDNA样品进行从头分析。替代性地，该方法可用于分析通过基于ETP的装置和方法(诸如本文所述的那些)分离/纯化的已知肿瘤/种系DNA样品。该方法可以包括启发式方法。一般而言，该方法可以包括(a)获得配对末端读数、外显子坐标、参考基因组或其组合的比对文件；以及(b)将算法应用于来自比对文件的信息以鉴定一个或多个重排。该算法可以应用于属于一个或多个基因组区域的信息。该算法可应用于与一个或多个基因组区域重叠的信息。
该方法可以称为FACTERA(FACile易位枚举和恢复算法)。作为输入，FACTERA可以使用配对末端读数、外显子坐标和参考基因组的比对文件。此外，可以任选地将分析限制在与特定基因组区域重叠的读数。FACTERA可以在三个连续阶段处理输入：不一致读数的鉴定、碱基对分辨率的断点检测以及候选融合物的计算机验证。
此外，通过基于ETP的装置和方法分离/纯化的一种或多种靶核酸，例如ctNA，可以进一步经历源自肿瘤的SNV的鉴定。无需事先了解在对应的肿瘤活检样品中鉴定的体细胞变异体，即可鉴定源自肿瘤的SNV。在本发明的一些实施例中，在不与来自患者的已知肿瘤DNA样品进行比较的情况下分析cfDNA。在此类实施例中，ctDNA的存在针对(i)配对的种系DNA中的背景噪声、(ii)跨整个选择子组的cfDNA中碱基对分辨率背景频率和(iii)cfDNA中的测序错误的迭代模型。这些方法可以利用以下可以通过数据点进行迭代以自动调用源自肿瘤的SNV的步骤：从已经经历基于ETP的分离/纯化的单个cfDNA样品中获取等位基因频率并选择高质量数据；测试给定的输入cfDNA等位基因是否与对应的配对种系等位基因显著不同；组装cfDNA背景等位基因频率数据库；测试给定的输入等位基因是否与同一位置处的cfDNA背景显著不同，并选择具有预定阈值(例如5％或更高、2.5％或更高等)的平均背景频率的那些；通过异常值分析将源自肿瘤的SNV与剩余的背景噪声区分开来。
因此，鉴定源自肿瘤的SNV的无创性方法可包括(a)从患有癌症或被怀疑患有癌症的受试者获得样品；(b)进行基于ETP的分离/纯化以分离/纯化靶核酸，例如，cfNA，例如，cNA；(c)对样品执行测序反应以产生测序信息；(d)将算法应用至测序信息以产生基于来自步骤(c)的测序信息的一系列候选肿瘤等位基因，其中候选肿瘤等位基因包含非优势碱基，所述非优势碱基不是种系SNP；以及(e)基于一系列候选肿瘤等位基因，鉴定源自肿瘤的SNV。候选肿瘤等位基因可以指包含候选SNV的基因组区域。
本文进一步公开了用于对患有疾病或病症的受试者进行检测、诊断、预后或疗法选择的方法。该方法可包括：(a)获得源自受试者的无细胞DNA(cfDNA)样品的序列信息，其中通过基于ETP的方法和装置(诸如本文所述的那些)分离/纯化cfDNA样品；(b)使用源自(a)的序列信息来检测样品中的无细胞非种系DNA(cfNG-DNA)，其中该方法可能够检测cfNG-DNA的百分比，所述百分比可低于总cfDNA的2％或高于总cfDNA的约2％。
与本文所述的装置和方法关联使用的其他方法
其他诊断方法可应用于用于分析的样品和/或通过本文所述的装置和方法所分析的样品以及包含用于分析的样品和/或被分析样品的组合物，包括但不限于，基于ELISA的蛋白质检测、特定细胞类型的亲和纯化等。为了进一步说明本公开的众多诊断性和治疗性应用，申请人在下文中提供了可以用样品和子样品或从其分离的组分(例如，细胞、核酸、蛋白质、脂质等)实施的各种技术的附加概述，所述样品和子样品或从其分离的组分用于或已经使用本文所述的装置和方法进行分析。
用于分析的样品和/或通过本文所述的装置和/或方法所分析的样品可以经历进一步的处理步骤。这些包括但不限于进一步的分析技术，诸如本公开中详述的那些，包括适用的进一步诊断性测定。以下方法可与用于分析的样品和/或通过本文所述的装置和方法所分析的样品协同使用，这可产生关于样品的身份和生物学性质的信息，例如，含有异质肿瘤细胞群的细胞。通过本文所述的装置和方法以及下文所述的技术提供的组合分析可以允许鉴定、检测或表征样品(例如，肿瘤)内的甚至较小的亚克隆群。在一些实施例中，这些结果可以为诊断、治疗方法的选择和患者管理提供信息。
在示例性实施例中，用于分析的样品和/或通过本文所述的装置和方法所分析的样品可以经历以下方法或步骤中的一种或多种：染色、免疫组织化学染色、流式细胞术、FACS、荧光活化液滴分选、图像分析、杂交、DASH、分子信标、引物延伸、微阵列、CISH、FISH、纤维FISH、定量FISH、流式FISH、比较基因组杂交、印迹、蛋白质印迹、DNA印迹、Eastern印迹、Far-蛋白质印迹、DNA-蛋白质印迹、RNA-蛋白质印迹和RNA印迹、酶测定、ELISA、配体结合测定、免疫沉淀、ChIP、ChIP-seq、ChIP-ChiP、放射免疫测定、荧光偏振、FRET、表面等离子体共振、过滤结合测定、亲和色谱、免疫细胞化学、电泳测定、核酸电泳、聚丙烯酰氨凝胶电泳、非变性凝胶法、自由流动电泳、等电聚焦、免疫电泳、电泳迁移率变动测定、限制性片段长度多态性分析、酶谱法、基因表达谱分析、DNA谱分析和PCR、DNA微阵列、基因表达序列分析、实时聚合酶链反应、差异显示PCR、RNA-seq、质谱测量、DNA甲基化检测、声能、基于脂质组学的分析、免疫细胞的定量、癌症相关标志物的检测、特定细胞类型的亲和纯化、DNA测序、下一代测序、癌症相关融合蛋白的检测、以及化疗耐药性相关标志物的检测。下面描述了这些方法的示例性实施例，旨在说明这些技术。然而，应当理解，可以利用这些方法以及其他方法的变种和替代方法。
染色技术
流体可以应用于预处理(例如蛋白质交联、暴露核酸等)、变性、杂交、洗涤(如严格洗涤)、检测(如将显示或标记物分子与探针连接)、扩增(如扩增蛋白质、基因等)、复染等。在多种实施例中，物质包括但不限于染色剂(例如苏木精溶液、曙红溶液等)、润湿剂、探针、抗体(例如单克隆抗体、多克隆抗体等)、抗原回收液(例如、水基或非水基抗原修复溶液、抗原回收缓冲液等)、溶剂(例如醇、柠檬烯等)等。染色剂包括但不限于染料、苏木精染色剂、曙红染色剂、抗体或核酸与可检测标签诸如半抗原、酶或荧光部分的缀合物，或用于赋予颜色和/或用于增强对比度的其他类型的物质。参见WO2015197742和WO2015150278，其各自全文以引用方式并入本文。
染色技术可以采用系统和方法来接收多个测定信息以及对一个或多个目标特征的查询，并将来自解剖学测定的解剖信息投影到染色测定(例如免疫组织化学(IHC)测定，通常在解剖测定中配准)的图像上，以定位或确定适合分析的特征。解剖信息可用于生成一个掩膜，该掩膜被投射到一种或多种通常配准的染色或IHC测定上。IHC测定中目标特征的位置可以与掩膜提供的解剖学背景相关联，其中匹配解剖掩膜的任何目标特征被选择或指示为适合于分析。此外，解剖掩膜可以划分为多个区域，并且来自多种IHC测定的多个目标特征可以分别与这些区域中的每一个相关联。因此，所公开的装置和方法为综合多测定分析提供了系统的、定量的和直观的方法，从而优于了现有技术中限制性的临时或主观视觉分析步骤。参见WO2015052128，其全文以引用方式并入本文。
通常，通过将细胞固定在显微载玻片上并使用各种染色方法(例如，形态学或细胞遗传学染色)对其进行染色来对癌症样品进行病理检查。然后评估染色的标本存在或不存在异常或癌性细胞以及细胞形态。尽管仅提供一般信息，但组织学染色方法是目前用于检测生物学样品中癌性细胞的最常用方法。其他常用于癌症检测的染色方法包括免疫组织化学和活性染色。这些方法基于癌性细胞中特定抗原或酶活性的存在或不存在。参见WO2012152747，其全文以引用方式并入本文。
公开了用于处理含有混淆色素的样品的方法、试剂盒和系统。该方法包括将澄清试剂施加至样品，从而使样品中的混淆色素脱色。使混淆色素脱色增强了病理学家检查样品的能力。在说明性实施例中，公开了一种处理封固在基板上的样品以减轻与样品内的色素相关的染色混淆的自动化方法。该方法包括将其上封固有样品的基板放置在自动化仪器上并施加澄清试剂，使得澄清试剂接触样品并且样品内的色素被脱色。该方法进一步包括施加漂洗试剂使得澄清试剂从样品中基本上去除，以及施加显色试剂使得样品被特异性地染色。样品内的色素被澄清试剂脱色，使得合格的读板器可以解读被特异性地染色的样品。在其他说明性实施例中，公开了用于使样品中的混淆色素脱色的试剂盒。该试剂盒包括试剂瓶和存放在试剂瓶中的澄清试剂。澄清试剂包括过氧化氢水溶液，并且试剂瓶被配置为可操作地连接到自动载玻片染色装置，使得自动载玻片染色装置控制澄清试剂的施加，使得澄清试剂接触样品。在进一步的说明性实施例中，公开了一种用于减轻含有色素的组织病理学样品的特异性信号混淆的系统。该系统包括自动化仪器、澄清试剂和显色试剂。自动化仪器被配置为接收粘附到基板上的组织病理学样品，将澄清试剂和显色试剂输送至样品，并且为输送至样品的澄清试剂和显色试剂提供加热和混合。澄清试剂被配置为接触组织病理学样品并使混淆色素脱色。显色试剂被配置为接触组织病理学样品并沉积特异性信号。参见WO2014056812，其全文以引用方式并入本文。
免疫染色和原位DNA分析可以是组织学诊断的有用工具。免疫染色可以依赖于抗体与样品中的表位的特异性结合亲和力，以及与有时仅存在于某些类型的患病细胞中的独特表位特异性结合的抗体的可用性增加。免疫染色可以包括对封固在载玻片上的样品进行的一系列处理步骤，以选择性地突出疾病状态的某些形态学指标。在一些情况下，处理步骤可以包括样品预处理以减少非特异性结合、抗体处理和孵育、酶标记的二抗处理和孵育、底物与酶反应和复染。结果可以产生具有与抗体结合的表位的样品的荧光或显色突出区域。在一些情况下，原位DNA分析依赖于探针与细胞或样品中的核苷酸序列的特异性结合亲和力。免疫组织化学(IHC)或免疫细胞化学(ICC)可以包括通过检测特异性的抗体-抗原相互作用来原位显示细胞成分，其中抗体已使用可见标记物进行标记。IHC有时被称为检测组织中的抗原，而ICC有时被称为检测培养的细胞内或细胞上的抗原(JAVOIS，Methods inMolecular Medicine，V.115：Immunocytochemical Methods and Protocols，2ndedition，(1999)Humana Press，Totowa，New Jersey，全文通过引用并入本文)，然而，描述为IHC或ICC的方法可能同样适用。可见标记物可以是荧光染料、胶体金属、半抗原、放射性标记物或酶。无论采用何种制备方法，可能都希望具有最小背景或非特异性染色的最大信号强度来给出最佳的抗原可视化。参见WO2013139555，其全文以引用方式并入本文。
根据早期研究，miRNA在哺乳动物的发育调节和细胞分化以及心脏发生和淋巴细胞发育中发挥作用。此外，miRNA还参与其他生物学过程，诸如缺氧、细胞凋亡、干细胞分化、增殖、炎症和对感染的应答。miRNA可用于同时靶向参与细胞分化、增殖和存活(肿瘤发生的关键特征)的通路的多个效应子。几种miRNA与癌症有关。因此，miRNA的原位分析可用于癌症诊断和治疗，因为miRNA似乎充当致癌基因或肿瘤抑制因子。例如，与正常组织相比，许多肿瘤细胞具有不同的miRNA表达模式。使用基因改造的小鼠产生过量c-Myc(一种与多种癌症有关的突变形式的蛋白质)的研究证实，miRNA影响癌症的发展。用于检测miRNA以及由miRNA翻译或以其他方式调节的蛋白质的方法是非常需要的，特别是在用于高效和快速检测的自动化方法中。用于检测miRNA的先前方法不能检测同一样品中的miRNA及其蛋白质表达靶(可能受miRNA调节)两者。示例性方法通常需要使用基于蛋白酶的细胞调理来消化细胞成分以暴露核酸靶。此外，示例性方法使用RNA印迹和蛋白质印迹将miRNA的水平与蛋白质水平相关联。此外，可以利用“研磨和结合”样品的分子方法。先前已经证明了基于组织的方法。这些方法一般常包括酶促步骤。参见WO2013079606，其全文以引用方式并入本文。
公开的实施例可以利用特别适合于多重检测miRNA和蛋白质的自动化方法。在说明性实施例中，一种或多种蛋白质的表达可以由miRNA调节。在另一个实施例中，该方法能够鉴定miRNA和蛋白质之间的细胞背景。该方法可以包括，例如，使用自动化系统将(a)适用于检测miRNA靶的试剂、(b)适用于检测蛋白质靶的试剂、和(c)适用于染色miRNA靶和蛋白质靶的试剂施加至样品。本实施例的一方面涉及使用非酶促细胞调节，即避免基于蛋白酶的细胞调节，以保存蛋白质靶。细胞调节步骤可以包括用细胞调节溶液(诸如具有弱碱性pH的缓冲液，包括具有约7.7至约9的pH的基于Tris的缓冲液)在高于环境的温度(诸如约80℃至约95℃)下处理样品。自动化方法可以同时或依次检测miRNA靶和蛋白质靶，但通过首先检测并染色miRNA然后检测并染色蛋白质靶通常获得更好的染色结果。更具体的公开实施例首先包括对样品进行非酶促细胞调节。然后将样品与为特定miRNA靶选择的核酸特异性结合部分接触，然后检测miRNA特异性结合部分。然后将样品与为蛋白质靶选择的蛋白质特异性结合部分接触，随后检测蛋白质特异性结合部分。在某些实施例中，核酸特异性结合部分是与可检测部分诸如酶、荧光团、发光团、半抗原、荧光纳米颗粒或其组合缀合的锁核酸(LNA)探针。某些合适的半抗原是本领域常见的，诸如地高辛、二硝基苯基、生物素、荧光素、罗丹明、溴脱氧尿苷、小鼠免疫球蛋白或其组合。其他合适的半抗原由Ventana MedicalSystems，Inc.特别开发，包括选自噁唑类、吡唑类、噻唑类、苯并呋咱类、三萜烯类、脲类、硫脲类、类胡萝卜素类、香豆素类、环木脂素类、杂联芳基类、偶氮芳基类、苯二氮
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类及其组合的半抗原。可以使用抗半抗原抗体检测半抗原。在某些公开的实施例中，通过抗物种抗体-酶缀合物检测抗半抗原抗体，其中酶是任何合适的酶，诸如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。参见WO2013079606，其全文以引用方式并入本文。
复染是在样品已经用试剂染色以检测一种或多种靶后对样品进行后处理，使得可以在显微镜下更容易地观察它们的结构的方法。例如，在盖玻片之前可任选地使用复染剂，以使免疫组织化学染色更明显。复染剂的颜色不同于初染剂。许多复染剂是众所周知的，诸如苏木精、曙红、甲基绿、亚甲蓝、吉姆萨、阿尔新蓝、DAPI和核固红。在一些实例中，可将一种以上的染色剂混合在一起以得到复染剂。这提供了灵活性和选择染色剂的能力。例如，可针对具有特定属性但不具有其他所希望属性的混合物选择第一染色剂。可以将第二染色剂添加至混合物中，其显示缺少的所需属性。例如，可将甲苯胺蓝、DAPI和滂胺天蓝混合在一起以形成复染剂。参见WO2012116949，其全文以引用方式并入本文。
苏木精是一种天然存在的化合物，存在于苏木属树木的红色心材中。苏木精本身在水溶液中是无色的，并且不是染色组织成分的活性成分。相反，苏木精的氧化产物氧化苏木精成为苏木精染料溶液的活性染色成分，特别是在与媒染剂络合时。氧化苏木精是通过暴露在空气和阳光下自然产生的。自然过程称为“熟成”，可能需要3个月或更长时间才能提供适合细胞染色的溶液。自动染色程序和系统使用机械系统将染色溶液输送到生物学样品。标准的氧化苏木精染色程序利用含有苏木精/氧化苏木精和媒染剂两者的预混原液。参见WO2012096842，其全文以引用方式并入本文。
免疫染色通常利用封固在载玻片上的样品上进行的一系列处理步骤，通过选择性地染色疾病状态的某些形态学指标来突出显示。典型的步骤包括样品预处理以减少非特异性结合、抗体处理和孵育、酶标记的二抗处理和孵育、底物与酶反应以产生样品的具有与抗体结合的表位的荧光团或发色团突出显示区域、复染等。这些步骤中的每一步都由多个冲洗步骤分开，以去除前一步骤中未反应的残留试剂。孵育在升高的温度下执行，通常在40℃左右，并且通常会持续保护样品免于脱水。原位DNA分析使用探针与样品中独特的核苷酸序列的特异性结合亲和力，并且类似地涉及一系列处理步骤，具有各种试剂和处理温度要求。参见WO2011139976，其全文以引用方式并入本文。
免疫组织化学(IHC)染色
样品的免疫组织化学或IHC染色(或免疫细胞化学，即细胞的染色)可能是最常用的免疫染色技术。虽然IHC染色的第一个案例使用了荧光染料(参见免疫荧光)，但现在使用其他使用酶诸如过氧化物酶(参见免疫过氧化物酶染色)和碱性磷酸酶的非荧光方法。这些酶能够催化反应，该反应产生易于通过光学显微镜检测的有色产物。替代性地，可以使用放射性元素作为标签，并且可以通过放射自显影观察免疫反应。制备或固定可能有助于细胞形态和结构的保存。不适当或长期的固定可能显著降低抗体结合能力。许多抗原可以在福尔马林固定的样品中成功证明。许多抗原的检测可以通过抗原修复方法得到改善，该方法通过断裂一些由固定形成的蛋白质交联来揭示隐藏的抗原位点。这可以通过加热不同时间长度(热诱导表位修复或HIER)或使用酶消化(蛋白水解诱导表位修复或PIER)来实施。
“免疫组织化学(IHC)”是指通过检测抗原与特异性结合剂(诸如抗体)的相互作用来确定抗原(诸如蛋白质)在样品(诸如胰腺癌样品)中的存在或分布的方法。在允许抗体-抗原结合的条件下，将包括抗原(诸如，靶抗原)的样品与抗体一起孵育。可以借助于与抗体缀合的可检测标签(直接检测)或与针对一抗产生的二抗缀合的可检测标签(例如，间接检测)来检测抗体-抗原结合。可用于IHC的示例性可检测标签包括但不限于放射性同位素、荧光染料(诸如荧光素、异硫氰酸荧光素和罗丹明)、半抗原、酶(诸如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)和生色团(呼入3，3′-二氨基联苯胺或固红)。在一些实例中，IHC用于检测样品例如胰腺癌样品中一种或多种蛋白质的存在或确定其量。参见WO2013019945，其全文以引用方式并入本文。
免疫组织化学或IHC是指将抗原(诸如蛋白质)定位在样品细胞中并使用抗原促进抗体与特定抗原的特异性结合的过程。这种检测技术的优点是能够准确地显示给定蛋白质在样品中的位置。这也是一种检查样品本身的有效的方法。使用小分子诸如半抗原检测抗原和核酸已成为IHC领域的主要方法。半抗原与抗半抗原抗体相结合，可用于检测特定的分子靶标。例如，可以用一种或多种半抗原分子标记特异性结合部分诸如一抗和核酸探针，并且一旦这些特异性结合部分与它们的分子靶标结合，即可使用抗半抗原抗体缀合物对其进行检测，该抗半抗原抗体缀合物包括作为基于发色团的检测系统的一部分的酶或可检测标记物诸如荧光标记。可检测的抗半抗原抗体缀合物与样品的结合表明样品中存在靶标。地高辛仅作为次生代谢物存在于洋地黄类植物中，是已用于多种分子测定中的半抗原的一个示例。美国专利号4,469,797公开了使用免疫测定法基于抗地高辛抗体与测试样品中药物的特异性结合来确定血液样品中的地高辛浓度。美国专利号5，198,537描述了许多额外的地高辛衍生物，它们已用于免疫学测试诸如免疫测定中。对于样品的原位测定诸如免疫组织化学(IHC)测定和原位杂交(ISH)测定，尤其是此类样品的多重测定，非常希望鉴定和开发提供理想结果而没有背景干扰的方法。其中一种方法涉及使用酪胺信号放大(TSA)，它基于获得专利的催化报告基因沉积(CARD)。美国专利号6,593,100(其全文以引用方式并入本文)公开了通过使标记的苯酚缀合物与酶反应来增强酶在CARD或酪酰胺信号放大(TSA)方法中的催化作用，其中反应在增强试剂的存在下进行。参见WO2012003476，其全文以引用方式并入本文，前述出版物也是如此。
可以利用使用半抗原缀合物的方法的实施例。一般而言，该方法可以包括以下步骤：a)将过氧化物酶固定在样品中的靶上，其中过氧化物酶能够与过氧化物酶可活化的芳基部分例如酪胺或酪胺衍生物反应，b)使样品与包含半抗原缀合物的溶液接触，其中半抗原缀合物包含与如上所述的过氧化物酶可活化的芳基部分结合的半抗原，以及c)使样品与包含过氧化物的溶液接触，由此半抗原缀合物与过氧化物酶和过氧化物反应，与固定化的过氧化物酶形成共价键或靠近固定化的过氧化物酶；以及d)通过检测半抗原定位样品中的靶。参见WO2012003476，其全文以引用方式并入本文。
流式细胞术
流式细胞术是一种基于激光的生物理技术，用于细胞计数、细胞分选、生物标志物检测和蛋白质工程，通过将细胞悬浮在流体流中并使其通过电子检测装置来进行。它允许对每秒多达数千个颗粒的物理和化学特征进行同时多参数分析。流式细胞术通常用于诊断健康障碍，尤其是血癌，但在基础研究、临床实践和临床试验中还有许多其他应用。一种常见的变化是根据颗粒的性质对颗粒进行物理分类，以纯化目标群体。
荧光活化细胞分选(FACS)
荧光活化细胞分选(FACS)是一种特殊类型的流式细胞术。它提供了一种基于每个细胞的特定光散射和荧光特征将细胞的异质混合物分选到两个或多个容器中的方法，一次一个细胞。它是一种有用的科学仪器，因为它提供对来自单个细胞的荧光信号的快速、客观和定量记录，以及对特定的目标细胞的物理分离。细胞悬浮液被夹带在狭窄的、快速流动的液体流的中心。液流的布置使得细胞之间相对于它们的直径有很大的距离。振动机制导致细胞流破碎成单个液滴。系统经过调整，使得每个液滴超过一个细胞的可能性很低。就在液流破碎成液滴之前，液流经过荧光测量站，在那里测量每个细胞的目标荧光特征。充电环放置在液流分解成液滴的位置。基于之前的荧光强度测量结果在环上放置电荷，而相反的电荷在液滴从流中破碎时被捕获在液滴上。然后带电的液滴降落通过静电偏转系统，该系统基于液滴的电荷将液滴转移到容器中。在一些系统中，电荷直接施加到流上，而脱落的液滴保留与流相同符号的电荷。然后，在液滴破碎后，流返回到中性。
单细胞的荧光活化液滴分选
液滴中单个细胞的区室化能够分析细胞释放或分泌的蛋白质，从而克服传统流式细胞术和荧光活化细胞分选的主要限制之一。这种方法的一个示例是用于检测单个小鼠杂交瘤细胞分泌的抗体的结合测定。通过将单个小鼠杂交瘤细胞、荧光探针和涂有的抗小鼠IgG抗体的单珠在50pl液滴共区室化，仅15分钟后即可检测到分泌的抗体。珠捕获分泌的抗体，并且当捕获的抗体与探针结合时，荧光变为定位在珠上，产生清晰可辨的荧光信号，从而能够在～200Hz下进行液滴分选以及细胞富集。所描述的微流控系统很容易适用于筛选其他细胞内、细胞表面或分泌的蛋白质以及用于定量催化或调节活动。为了筛选约100万个细胞，微流控操作可以在2-6小时内完成；整个过程，包括微流控装置和哺乳动物细胞的制备，可以在5-7d内完成。参见Mazutis等人(2013).“Single-cell analysis and sortingusing droplet-based microfluidics”.Nat.Protoc.8：870-891，其全文以引用方式并入本文)。
图像分析
可以通过系统和计算机实施的自动免疫细胞检测方法对样品进行分析，这有助于临床免疫谱研究。自动免疫细胞检测方法涉及从多通道图像(诸如RGB图像或具有生物学意义的未混合图像)中检索多个图像通道。参见WO2015177268，其全文以引用方式并入本文。
可以利用图像分析算法和/或系统从多重IHC载玻片和/或荧光染色载玻片的一组图像自动计算免疫评分。图像分析算法涉及计算机实施的用于对已经用多重测定染色的单个样品中的多种类型的细胞进行计数的方法，包括：对已经用多重测定染色的包括淋巴细胞标记物CD3、CD8、CD20、FoxP3和肿瘤检测标志物的样品进行成像；针对多重测定的每个标志物，将已经用多重测定染色的单个样品的图像分离到单独的图像通道中；基于每个通道中的强度信息，鉴定每个图像通道中的目标区域，其中每个通道中的低强度区域被去除，而高强度区域代表细胞信号；生成单个替代图像，其中替代图像是所有淋巴细胞标志物的图像通道信息的组合；应用细胞检测算法，其中细胞检测算法为寻膜算法或寻核算法；鉴定每个图像通道或组合通道的图像、或转换图像(诸如灰度或吸光度图像)或替代图像中的淋巴细胞和淋巴细胞的组合的特征；基于已知淋巴细胞和淋巴细胞组合的特征训练分类算法；将训练后的算法应用于每个图像通道中或组合通道的每个图像中、或转换图像(诸如灰度或吸光度图像)中或替代图像中的淋巴细胞和淋巴细胞组合的特征，这些特征被鉴定以将检测到的细胞归类为以下项中的至少一项：假阳性细胞、仅CD3 T细胞、CD3和CD8 T细胞、FP3 T细胞和CD20 B细胞；计数分类的每种不同类型细胞的数量；生成样品的评分，其中该评分是基于所计数的每种类型细胞的数量。参见WO2015124737，其全文以引用方式并入本文。
示例性实施例可以包括利用包括两步分类方法的系统和方法。本文公开的操作包括将WS图像划分为多个图块，并且首先使用“软”分类(诸如SVM)对每个图块进行分类，并且为每个图块生成置信度评分和标签。每个图块的位置、其特征、作为分类结果获得的类型及其置信度分数可以存储在数据库中。第二个分类步骤包括将数据库中的低置信度图块与高置信度图块进行比较，并使用相似的图块来增加数据库中图块的空间一致性。换句话说，对于每个低置信度图块，相邻的高置信度图块对细化每个图块的标签做出了更大的贡献，从而提高了低置信度图块的分割精度。与现有的用于生长训练数据库的自适应/主动学习技术相比，所公开的操作不太关注生长单个训练数据库，而是专注于独立地处理每个测试图像，同时基于针对正在分析的图像的标记置信度信息自适应地提高分类准确度。换句话说，为每个图像生成一个置信标签图块数据库，并在图像内进行相似性检索操作以细化低置信图块的分类结果。参见WO2015113895，其全文以引用方式并入本文。
示例性实施例可以包括利用检测和评分间皮素(MSLN)表达诸如MSLN蛋白表达的方法。在特定实例中，该方法包括使包括肿瘤细胞的样品与MSLN蛋白质特异性结合剂(诸如抗体)接触。表达MSLN的示例性肿瘤包括但不限于卵巢癌、肺癌(例如，非小细胞肺癌NSCLC)、胰腺癌和间皮瘤。例如，使用显微术和免疫组织化学(IHC)来检测或测量肿瘤细胞中MSLN蛋白的表达。对于MSLN蛋白表达，样品按0到3+的等级评分。例如，确定样品中是否有至少10％的肿瘤细胞(诸如至少约10％的肿瘤细胞)被蛋白质特异性结合剂染色(例如，具有可检测的MSLN蛋白质表达)。如果小于10％(诸如小于约10％)的肿瘤细胞被特异性结合剂染色，则样品被赋予的MSLN蛋白表达评分为零。如果样品中至少10％的肿瘤细胞(诸如至少约10％的肿瘤细胞)被蛋白质特异性结合剂(例如，具有可检测的MSLN蛋白表达)，但小于10％＞(诸如小于约10％)的肿瘤细胞被特异性结合剂以2+或更高的强度染色，则样品被赋予的MSLN蛋白表达评分为1+。如果样品中至少10％的肿瘤细胞(诸如至少约10％的肿瘤细胞)被蛋白质特异性结合剂(例如，具有可检测到的MSLN蛋白表达)以2+或更高的强度染色并且大多数被染色的肿瘤细胞以2+强度染色，则样品被赋予的MSLN蛋白表达评分为2+。如果样品中至少10％的肿瘤细胞(诸如至少约10％的肿瘤细胞)被蛋白质特异性结合剂(例如，具有可检测的MSLN蛋白表达)以2+或更高的强度染色并且大多数被染色的肿瘤细胞以3+强度染色，并且样品中至少10％的肿瘤细胞(诸如至少约10％的肿瘤细胞)被蛋白质特异性结合剂(例如，具有可检测的MSLN蛋白质表达)以3+强度染色，则样品被赋予的MSLN蛋白表达评分为3+。参见WO2015032695，其全文以引用方式并入本文。
杂交
原位杂交(ISH)涉及将含有在中期或间期染色体制备背景下的靶核酸(例如基因组靶核酸)的样品(诸如封固在载玻片上的样品)与可特异性杂交的或对于靶核酸具特异性的标记的探针(例如，本文公开的一种或多种探针)接触。载玻片任选地进行预处理，例如，以去除会干扰均匀杂交的物质。染色体样品和探针都经过处理，例如通过加热使双链核酸变性。探针(在合适的杂交缓冲液中配制)和样品在允许杂交发生的条件和足够的时间(通常足够达到平衡)下组合。洗涤染色体制备物以去除过量的探针，并使用标准技术检测靶的特异性标记。参见WO2015124702，其全文以引用方式并入本文。
检测癌性细胞的其他方法利用癌细胞中染色体畸变的存在。特别地，全染色体或染色体区段的拷贝的缺失或增加，以及基因组特定区域的更高水平的扩增，在癌症中很常见。染色体畸变通常使用细胞遗传学方法检测，例如吉姆萨染色染色体(G显带)或荧光原位杂交(FISH)。参见WO2012152747，其全文以引用方式并入本文。
当前公开的技术提供了用于提高分析癌症分子机制的特异性的改进方法。因此，在某些实施例中，该技术涉及多变量癌症诊断方法，其中所述方法在细胞水平上确定分子标记物和表型形态计量标记物两者在单个细胞或包含细胞的单个样品中的存在，所述方法包括：
a.从包含单个细胞或多个细胞的受试者的单个样品中获得分子标记物数据；
b.从与步骤(a)中所用相同的单个细胞或多个细胞获得定量细胞形态数据以提供所述单个样品的多变量分析，多变量数据集包括来自步骤(b)的定量细胞形态数据和来自步骤(a)的分子标记物数据两者；以及
c.将在步骤(b)中获得的多变量分析数据集与参考多变量分析数据集进行比较，该参考多变量分析数据集是通过从具有已知临床结果的个体中获取的癌症和非癌细胞样品获得分子标记物数据和定量细胞形态数据而创建的。
步骤(c)的比较结果提供了对由与癌症进展、发生、转移或参考多变量分析数据集中看到的临床结果的其他特征统计学相关的特征和标记物的特定组合定义的受试者的临床结果的预测。参见WO2012152747，其全文以引用方式并入本文。
示例性实施例可以包括利用技术提供信息，通过使用分子标记物的荧光标记与涉及光谱分辨检测和数据预处理的专门成像方法协同作用来确定癌症的病理预后状态。该技术提供了一种成像方法，可以在单个数据采集周期内采集和分析样品的核形态，该样品是针对检测样品上的分子特异性探针而制备的。这种成像方法采用了标记、采集、预处理和分析技术的组合。收集和分析多维图像以通过发射波长分离并区分不同的目标分析物通道。随后的分析物通道代表定量细胞形态和遗传重排、遗传表达和/或蛋白质表达的数据的不同方面。参见WO2012152747，其全文以引用方式并入本文。
示例性实施例可以包括利用系统、方法和试剂盒来使核可视化。样品可以用蛋白酶预处理以透化细胞核，然后与纳米颗粒/DNA结合部分缀合物一起孵育。DNA结合部分包括至少一种DNA结合分子。缀合物与细胞核内的DNA结合，纳米颗粒被可视化，从而使细胞核可视化。计算机和图像分析技术用于评估核特征，诸如染色体分布、倍性、形状、大小、纹理特征和/或背景特征。该方法可以与对样品的其他多重测试组合使用，包括荧光原位杂交。参见WO2012116949，其全文以引用方式并入本文。
荧光原位杂交(FISH)是一种可用于检测和定位染色体上特定DNA序列存在或不存在的技术。FISH使用的荧光探针仅与染色体的显示与荧光探针的高度序列相似性的部分结合。FISH还可用于检测样品内的特定mRNA序列。参见WO2012116949，其全文以引用方式并入本文。
FISH、CISH和SISH的多种程序是本领域已知的。例如，美国专利号5,447,841、5,472,842和5,427,932中描述了进行FISH的程序；CISH在美国专利号6,942,970中有所描述，而额外的检测方法提供在美国专利号6,280,929中，这些专利的公开内容通过引用全文并入本文。许多试剂和检测方案可以与FISH、CISH和SISH程序协同使用，以提高灵敏度、分辨率或其他所希望的性质。如上所述，在进行FISH时，可以直接光学地检测用荧光团(包括荧光染料和量子点)标记的探针。替代性地，探针可以用非荧光分子诸如半抗原(诸如以下非限制性示例：生物素、地高辛、DNP和各种噁唑类、吡唑类、噻唑类、硝基芳基类、苯并呋咱类、三萜烯类、脲类、硫脲类、鱼藤酮类、香豆素类、基于香豆素的化合物、鬼臼毒素、基于鬼臼毒素的化合物及其组合)、配体或其他可间接检测的部分标记。然后可以通过使样品(例如，与探针结合的细胞样品)与标记的检测试剂诸如对所选半抗原或配体具有特异性的抗体(或受体，或其他特异性结合配偶体)接触，用非荧光分子(和它们所结合的靶核酸序列)来标记探针。检测试剂可以用荧光团(例如，量子点)或另一种可间接检测的部分标记；或者可以与一种或多种额外的特异性结合剂(例如，二抗或特异性抗体)接触，而该特异性结合剂又可以用荧光团标记。任选地，可检测标签直接连接至抗体、受体(或其他特异性结合剂)。替代性地，可检测标签通过连接基(诸如酰肼硫醇连接基、聚乙二醇连接基或具有可比反应性的任何其他柔性连接部分)连接至结合剂。例如，特异性结合剂，诸如抗体、受体(或其他抗配体)、抗生物素蛋白等可以通过异双功能聚亚烷基二醇连接基(诸如异双功能聚乙二醇(PEG)连接基)用荧光团(或其他标签)共价地修饰。异双功能连接基组合了选自例如羰基反应性基团、胺反应性基团、硫醇反应性基团和光反应性基团的两个不同的反应性基团，其中第一个连接到标签上，而第二个连接到特异性结合剂上。在其他实例中，探针或特异性结合剂(诸如抗体，例如一抗、受体或其他结合剂)用能够将荧光或显色组合物转化为可检测的荧光、有色的或其他可检测信号(例如，在SISH中可检测的金属颗粒的沉积)的酶标记。如上所述，酶可以通过连接基直接或间接连接到相关探针或检测试剂。合适的试剂(例如，结合试剂)和化学物质[(例如，连接基和连接化学物质)的示例描述于美国专利申请公开号2006/0246524、2006/0246523和2007/0117153中，其公开内容通过引用全文并入本文。参见WO2015124702，其全文以引用方式并入本文。
所述方法可以允许检测一种以上(例如，2、3、4种等)不同的靶。在一些实施例中，不同的可检测标签和/或检测系统可以用于每个靶，使得每一个可以在单个样品中单独检测。可以使用任何合适的可检测标签和/或检测系统。更具体地，设想了用于明场原位杂交的系统。在一些实施例中，该系统包括探针组，该探针组包含对靶RNA具有特异性的X个独特的2′-O-甲基RNA探针，其中X＞2(例如，X＝2、X＝3、X＝4、X＝5等)，探针靶向靶RNA内的X个不同部分。每个2′-O-甲基RNA探针可以与至少一个可检测部分缀合。可检测部分可适于结合用于信号放大的反应性生色团缀合物系统(例如酪酰胺生色团缀合物系统)。在一些实施例中，2′-O-甲基RNA探针各自包含介于15至30个核苷酸之间、介于20至50个核苷酸之间、介于40至80个核苷酸之间、介于20至100个核苷酸之间或介于20至200个核苷酸之间的长度。参见WO2015124738，其全文以引用方式并入本文。
标本可以是根据原位杂交(ISH)方案处理的乳腺细胞样品。ISH方案可以通过将核苷酸的互补链(例如探针)与目标序列杂交来提供细胞制剂中特定核酸序列(例如DNA、mRNA等)的可视化。ISH方案可以包括但不限于双SISH和Red ISH方案、单Red ISH方案、单SISH方案等。参见WO2013113707，其全文以引用方式并入本文。
动态等位基因特异性杂交(DASH)
动态等位基因特异性杂交(DASH)基因分型利用由错配碱基对的不稳定性导致的DNA解链温度的差异。该过程可以高度自动化，并涵盖一些简单的原则。在第一步中，基因组区段被扩增并通过与生物素化引物的PCR反应附着到珠上。在第二步中，将扩增产物附着到链霉亲和素柱上并用NaOH洗涤以去除未生物素化的链。然后在存在与双链DNA结合时发出荧光的分子的情况下添加等位基因特异性寡核苷酸。然后随着温度的升高测量强度，直到可以确定解链温度(Tm)。SNP将会导致低于预期的Tm。由于DASH基因分型测量的是Tm的可定量变化，因此它能够测量所有类型的突变，而不仅仅是SNP。DASH的其他优点包括它能够与无标签探针一起工作以及其简单的设计和性能条件。
分子信标
分子信标利用具体工程化的单链寡核苷酸探针。寡核苷酸被设计成在每个末端有互补区域并且探针序列位于它们之间。这种设计允许探针在其自然、孤立的状态下呈现发夹或茎环结构。探针的一端连接有荧光团，另一端连接有荧光猝灭剂。由于探针的茎环结构，荧光团靠近猝灭剂，从而防止分子发出任何荧光。该分子还经过工程化，使得只有探针序列与将用于测定的基因组DNA互补(Abravaya等人(2003年4月).″Molecular beacons asdiagnostic tools：technology and applications″.Clin.Chem.Lab.Med.41(4)：468-74)。如果分子信标的探针序列在测定期间遇到其靶基因组DNA，它将退火并杂交。由于探针序列的长度，探针的发夹段将被变性，有利于形成更长、更稳定的探针-靶杂交体。由于发夹缔合，这种构象变化允许荧光团和猝灭剂摆脱它们的紧密接近，从而允许分子发出荧光。另一方面，探针序列遇到只有一个非互补核苷酸的靶序列，分子信标将优先保持在其天然发夹状态，并且不会观察到荧光，因为荧光团保持猝灭。
引物延伸
引物延伸是一个两步过程，首先涉及将探针与SNP核苷酸上游紧邻SNP的碱基杂交，然后进行“微型测序”反应，其中DNA聚合酶通过添加与SNP核苷酸互补的碱基来延伸杂交的引物。检测该并入的碱基并确定SNP等位基因(Syvanen，Nat Rev Genet.2001Dec；2(12)：930-42)。由于引物延伸基于高度准确的DNA聚合酶，因此该方法一般非常可靠。引物延伸能够在非常相似的反应条件下对大多数SNP进行基因分型，因此也非常灵活。引物延伸方法用于多种测定格式。这些格式使用广泛的检测技术，包括MALDI-TOF质谱法(参见Sequenom)和ELISA样方法。一般而言，有两种主要方法使用荧光标记的双脱氧核苷酸(ddNTP)或荧光标记的脱氧核苷酸(dNTP)的并入。使用ddNTP，探针与SNP核苷酸上游紧邻SNP的靶DNA直接杂交，并将与SNP等位基因互补的单个ddNTP添加到探针的3′末端(双脱氧核苷酸中缺失的3′-羟基阻止添加更多核苷酸)。每个ddNTP都用不同的荧光信号标记，允许在同一反应中检测所有四个等位基因。使用dNTP，等位基因特异性探针具有3′碱基，这些碱基与每个被查询的SNP等位基因互补。如果靶DNA包含与探针3′碱基互补的等位基因，则靶DNA将与探针完全杂交，使DNA聚合酶从探针的3′末端延伸。这是通过将荧光标记的dNTP并入到探针末端上而检测的。如果靶DNA不包含与探针3′碱基互补的等位基因，则靶DNA将在探针的3′末端产生错配，并且DNA聚合酶将无法从探针的3′末端延伸。第二种方法的好处是几个标记的dNTP可以被并入正在生长的链中，从而增加信号。
微阵列
微阵列背后的核心原理是两条DNA链之间的杂交，互补核酸序列的通过在互补核苷酸碱基对之间形成氢键来与彼此特异性配对的性质。核苷酸序列中的大量互补碱基对导致两条链之间更紧密的非共价键合。洗掉非特异性结合序列后，只有强配对的链会保持杂交。与探针序列结合的荧光标记靶序列生成取决于杂交条件(诸如温度)和杂交后洗涤的信号。来自一个点(特征)的信号的总强度取决于与该点上存在的探针结合的靶样品的量。微阵列使用相对定量，其中将特征的强度与不同条件下相同特征的强度进行比较，并且特征的身份通过其位置已知。
核酸阵列(也称为寡核苷酸阵列、DNA微阵列、DNA芯片、基因芯片或生物芯片)已成为强大的分析工具。核酸阵列本质上是寡核苷酸在表面上的系统分布，例如，以行和列分布。寡核苷酸可以物理地或共价地连接到表面。将寡核苷酸物理地连接到表面的一种方法包括在寡核苷酸溶液接触表面时对其进行干燥。干燥或以其他方式固定后，寡核苷酸被限制在表面上的“点”中。干燥方法始于生产称为“斑点印迹”的极低密度阵列。斑点印迹可以通过在固体表面上手动沉积寡核苷酸滴并干燥来制作。大多数斑点印迹涉及少于约20个按行和列布置的不同寡核苷酸点。改进过去的斑斑点印迹，微量点样(micro-spotting)方法使用机械或机器人系统来创建多个微观的点。小尺寸的点可以实施更高的点密度。例如，使用微量点样在显微镜载玻片上沉积数万个点。根据不同的方法，寡核苷酸是在基板或支持物上直接合成的。无掩模光刻和数字光学化学技术是直接在支持物上合成核酸的技术；这些方法已被用于生成非常高密度的阵列(例如，美国专利号7,785,863，其全文以引用方式并入本文)。类似地，无掩模光刻已被用于制造肽阵列(参见例如Singh-Gasson等人Maskless fabrication of light-directed oligonucleotide microarrays using adigital micromirror array.Nat Biotechnol1999,17：974-978，其全文以引用方式并入本文)。数字光学化学已被用于创建具有数百万个离散区域的阵列，每个区域都包含一个独特的寡核苷酸群体。核酸和肽阵列包括基板表面上的区域(本文称为“点”)的阵列，每个区域指定用于特定寡核苷酸或肽。“阵列密度”本质上是分布在给定区域中的点的行数和列数。高密度阵列在给定区域中具有更多的行和列。随着核酸和肽阵列行业的发展，高密度阵列的可用性也有所增加。随着给定区域中点数的增加，每个点的大小会减小。例如，具有分布在显微镜载玻片区域上的数百万种独特寡核苷酸或肽的阵列中的一个点大约为100pm2。这种点的小尺寸在阅读和理解使用阵列的结果方面带来了技术挑战。例如，虽然可以单独地目视观察100pm2点，但人类无法在不放大的情况下目视分辨两个或更多的100pm2点。因此，高密度阵列的制造和使用已经发展到用户无法再目视读取阵列的阶段。由于阵列在一个小区域中包含大量(数百万)紧密排列的点，因此使用复杂的成像装置检测来自阵列的信号，并使用软件来解释数据。此外，可以使用高度灵敏的检测方法。荧光成像是一种高度灵敏的技术，已成为检测杂交事件的标准方法。这些阵列的荧光成像一般使用配备有滤光片和照相机的显微镜。如果没有这些装置的帮助，荧光一般无法在视觉上分辨。高度复杂的荧光图像使用软件进行处理，因为数据量大且其呈现方式无法辨识。例如，授予Fiekowsky等人的美国专利号6,090，555描述了一个复杂的过程，涉及从核酸阵列获得的荧光图像的计算机辅助比对和去卷积。虽然进行大规模平行基因组学或蛋白质组学研究的能力具有重要价值，但核酸和肽阵列由于难以检测和破译结合事件而在适用性方面受到限制。此外，由于荧光信号随时间降解以及随附荧光检测硬件的复杂性，荧光的使用对阵列的普遍适用性造成了许多障碍。本公开涉及一种装置和使用该装置检测靶分子的方法，该装置包括寡核苷酸或肽阵列。该装置包括多个结合到基板表面的结合分子。结合分子被设计成与靶分子结合。靶和结合分子的结合可以通过该装置的检查来识别。在一些实施例中，该装置能够检测靶核酸与固定化寡核苷酸之间的杂交事件。在其他实施例中，该装置能够检测靶多肽与固定肽之间的结合事件。在说明性实施例中，装置包括具有至少一个基板表面的基板和结合到基板表面的多个固定化寡核苷酸或肽，其中多个固定化寡核苷酸或肽在基板表面上图案化以形成至少一个光学可破译的图案。参见WO2013110574，其全文以引用方式并入本文。
示例性实施例可包括利用用于检测一种或多种靶化合物的装置。一类特定的目标靶化合物是靶核酸或靶寡核苷酸。另一类特定的目标靶化合物是靶多肽。对于包括固定化寡核苷酸的实施例，靶核酸通常将会被理解为靶分子类型。然而，本领域普通技术人员理解，固定化寡核苷酸为能够检测多种其他靶化合物的寡核苷酸结合部分缀合物提供结合配偶体。例如，使用固定化寡核苷酸，可以将抗体-寡核苷酸缀合物固定在装置上，以将装置转化为抗体微阵列。抗体微阵列可用于检测目标蛋白质靶。类似地，包括固定化肽的实施例，靶分子类型可以包括抗体、蛋白质或酶。然而，也可以通过使用肽结合部分和分子靶向部分的缀合物来修饰底层肽。此外，虽然本公开具体公开了固定化的寡核苷酸和肽，但那些仅仅是示例性的固定化检测部分。在不背离本文公开的概念的情况下，存在许多其他有用的固定化检测部分，它们可以结合到如本文所述的装置中。例如，检测部分可以包括适体、配体、螯合剂、碳水化合物及其人造等价物。参见WO2013110574，其全文以引用方式并入本文。
分离CTC的方法可以包括使用对EpCAM、ERG、PSMA或其组合具特异性的抗体。将分离的CTC施加到载玻片或其他基板上并固定(例如使用本领域已知的方法)。使用前列腺特异性抗体的扩散方法也可用于分离CTC，并在固定前将它们施加到基板，例如载玻片。然后将安装和固定的CTC与一种或多种对ERG、PTEN和CEN-10具特异性的核酸探针接触，例如在足以使核酸探针与CTC中的互补序列杂交的条件下。例如用一个或多个量子点标记核酸探针。例如，一种或多种对ERG、PTEN和CEN-10具特异性的核酸探针可以各自用不同的量子点标记，以允许将探针彼此区分开。在使核酸探针与ERG、PTEN和CEN-10杂交后，例如通过使用光谱成像来检测来自一种或多种核酸探针上的一个或多个量子点的信号。然后分析信号，以确定在分离的CTC中，一个或多个ERG是否重排、一个或多个PTEN基因是否缺失、以及是否检测到CEN-10。基于一个或多个ERG是否重排、一个或多个PTEN基因是否缺失以及是否检测到CEN-10，表征前列腺癌。参见WO2013101989，其全文以引用方式并入本文。
显色原位杂交(CISH)
显色原位杂交(CISH)是一种将免疫组织化学(IHC)技术的显色信号检测方法与原位杂交组合的细胞遗传学技术。它是在2000年左右开发的，作为荧光原位杂交(FISH)的替代方法，用于检测HER-2/neu致癌基因扩增。CISH与FISH的相似之处在于，它们都是用于检测DNA的特定区域存在或不存在的原位杂交技术。然而，CISH在诊断实验室中更实用，因为它使用明场显微镜，而不是FISH中使用的更昂贵和更复杂的荧光显微镜。
CISH的探针设计可以与FISH的探针设计非常相似，只是标记和检测有所不同。FISH探针通常用各种不同的荧光标签标记并且只能在荧光显微镜下检测，而CISH探针用生物素或地高辛标记并且可以在应用其他处理步骤后使用明场显微镜检测。CISH探针的长度为约20个核苷酸，专为DNA靶而设计。它们与所靶向的序列互补，并在变性和杂交步骤后与其结合。只有少数CISH探针在商业上可用，因此对于大多数应用，它们必须从细菌人工染色体(BAC)中提取、扩增、测序、标记并进行图谱分析。BAC是在人类基因组计划期间开发的，因为需要分离和扩增人类DNA的短片段以进行测序。如今，可以使用公共数据库(诸如UCSCGenome Browser)选择BAC并将其定位在人类基因组上。这确保了最佳的互补性和序列特异性。从BAC克隆物中提取DNA，并使用基于聚合酶的技术进行扩增，诸如简并寡核苷酸引物(DOP)-PCR。接下来，对克隆物进行测序并验证它们在基因组上的位置。探针标记可以通过使用随机引发或切口平移以并入生物素或地高辛来进行。
样品制备、探针杂交和检测：样品可以包括处于间期或中期的染色体。样品牢固地附着在表面例如载玻片上。样品可以进行胃蛋白酶消化以确保靶是可及的。加入10-20μL探针，用橡胶接合剂密封盖玻片盖住样品，将载玻片加热至97℃，加热5-10分钟使DNA变性。然后将载玻片放置在37℃的烤箱中过夜，使得探针可以杂交。第二天，洗涤样品并施加非特异性蛋白质结合位点的封闭剂。如果要使用辣根过氧化物酶(HRP)，样品必须在过氧化氢中孵育以抑制内源性过氧化物酶活性。如果使用地高辛作为探针标签，则使用抗地高辛荧光素一抗，然后使用HRP缀合的抗荧光素二抗。如果使用生物素作为探针标签，则必须首先使用牛血清白蛋白(BSA)封闭非特异性结合位点。然后，使用HRP缀合的链霉亲和素进行检测。然后，HRP将二氨基联苯胺(DAB)转化为不溶性棕色产物，该产物可在40至60倍放大倍数下在明场显微镜中检测到。可以使用复染剂诸如苏木精和曙红，使产品更显眼。
分子细胞遗传学技术，诸如显色原位杂交(CISH)，将染色体的视觉评估(核型分析)与分子技术组合。分子细胞遗传学方法基于核酸探针与细胞内的其互补核酸的杂交。特定染色体区域的探针将会识别中期染色体上或间期核内(例如在样品中)的互补序列并与其杂交。已经开发出用于多种诊断和研究目的的探针。序列探针与特定染色体区域或基因中的单拷贝DNA序列杂交。这些是用于鉴定与目标综合征或病症相关的染色体关键区域或基因的探针。在中期染色体上，这种探针与每个染色单体杂交，通常每个染色体给出两个小的、离散的信号。序列探针(诸如重复耗尽探针或独特序列探针)的杂交使得检测与多种疾病和综合征相关的染色体异常成为可能，包括组成性遗传异常诸如微缺失综合征、染色体易位、基因扩增和非整倍体综合征、肿瘤疾病以及病原体感染。最常见地，这些技术应用于显微镜载玻片上的标准细胞遗传学制备。此外，这些程序可用于固定细胞或其他核分离物的载玻片上。例如，这些技术经常用于表征肿瘤细胞以用于癌症的诊断和预后。许多染色体异常与癌症的发展有关(例如，与某些骨髓疾病相关的非整倍体，诸如三体型8；易位，诸如慢性粒细胞白血病中的BCR/ABL重排；以及与肿瘤转化相关的特异性核酸序列的扩增)。分子技术可以在此类获得性染色体异常的检测和表征中增强标准细胞遗传学检测。已引入用于双色CISH的系统。这些系统包括Dako DuoCISHTM系统和Zyto Vision
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2C系统。这两种系统都使用单独的酶(碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶)进行两个颜色检测步骤。
在一些实施例中，设想了用于显色原位杂交(CISH)的系统和过程，特别是在单个测定中防止两个或多个颜色检测系统之间的干扰的方法，并且进一步涉及利用分裂的探针对测定进行评分的过程。参见WO2011133625，其全文并入本文。
荧光原位杂交(FISH)
荧光原位杂交(FISH)是一种细胞遗传学技术，它使用仅与染色体的那些具有高度序列互补性的部分结合的荧光探针。它由生物医学研究人员在1980年代早期开发，用于检测和定位染色体上特异性DNA序列的存在或不存在。荧光显微镜可用于找出荧光探针与染色体的结合位置。FISH通常用于寻找DNA中的特定特征，以用于遗传咨询、医学和物种鉴定。FISH还可用于检测和定位细胞、循环肿瘤细胞和样品中的特定RNA靶(例如mRNA、lncRNA和miRNA)。在这种情况下，它可以帮助定义细胞内基因表达的时空模式。
探针：RNA和DNA：可以针对任何基因或基因内的任何序列来设计RNA探针，以将细胞中的mRNA、lncRNA和miRNA可视化。FISH用于检查细胞繁殖周期，特别是任何染色体异常的细胞核间期。该技术[FISH]通过创建一个带有人工染色体基础的将会吸引类似染色体的探针，可以更容易地分析大量档案案例，从而鉴定精确定位的染色体。检测每个探针在核酸异常时的杂交信号。每个用于检测mRNA和lncRNA的探针由20个寡核苷酸对组成，每对覆盖40-50bp的空间。对于miRNA检测，探针使用专有化学来特异性地检测miRNA并覆盖整个miRNA序列。探针通常源自被分离、纯化和扩增以用于人类基因组计划的DNA片段。与可以直接测序的长度相比，人类基因组的大小是如此之大，以至于有必要将基因组分成多个片段。(在最终的分析中，通过下述将这些片段排序：使用序列特异性核酸内切酶将每个片段的拷贝消化成更小的片段，使用体积排阻色谱测量每个小片段的大小，并使用该信息确定大的片段在哪里彼此重叠。)为了保存带有各自DNA序列的片段，将这些片段添加到一个不断复制细菌种群的系统中。细菌的克隆种群，每个种群都保持着一条人工染色体，储存在世界各地的不同实验室中。人工染色体(BAC)可以在任何实验室中生长、提取和标记。这些片段有大约10万个的碱基对，是大多数FISH探针的基础。
制备和杂交过程-RNA：细胞可以被透化以允许靶可及性。FISH也已在未固定的细胞上成功完成。由20个寡核苷酸对组成的靶特异性探针与一个或多个靶RNA杂交。独立但兼容的信号放大系统支持多重测定(每个测定至多两个靶)。信号放大是通过一系列顺序杂交步骤实现的。在测定结束时，在荧光显微镜下观察样品。
制备和杂交过程-DNA：首先，构建探针。探针必须达到足以与其靶特异性地杂交，但不能大到妨碍杂交过程。探针直接用荧光团、用抗体的靶或用生物素进行标记。标记可以通过多种方式完成，诸如切口平移或使用标记核苷酸的PCR。然后，产生间期或中期染色体制剂。染色体牢固地附着在基板(通常是玻璃)上。重复的DNA序列必须通过向样品中添加短的DNA片段来封闭。然后将探针施加至染色体DNA并在杂交的同时孵育大约12小时。几个洗涤步骤去除所有未杂交或部分杂交的探针。然后使用能够激发染料和记录图像的显微镜对结果进行可视化和定量。如果荧光信号弱，则可能需要放大信号以超过显微镜的检测阈值。荧光信号强度取决于许多因素，诸如探针标记效率、探针类型和染料类型。荧光标记的抗体或链霉亲和素与染料分子结合。选择这些次级成分以使其具有强信号。
纤维FISH
在间期或中期准备的替代技术即纤维FISH中，间期染色体以这样的方式附着在载玻片上，使得它们以直线方式伸展而不是像在传统FISH中那样紧密盘绕，或采用如在间期FISH中那样的染色体区域构象。这是通过沿载玻片的长度对已固定在载玻片上然后裂解的细胞或对纯化的DNA溶液施加机械剪切来实施的。一种称为染色体梳理的技术越来越多地用于此目的。染色体的扩展构象允许显著更高的分辨率——甚至低至几千个碱基。
定量FISH(Q-FISH)
定量荧光原位杂交(Q-FISH)是一种基于传统FISH方法的细胞遗传学技术。在Q-FISH中，该技术使用称为肽核酸(PNA)寡核苷酸的标记的(Cy3或FITC)合成DNA模拟物，使用荧光显微镜和分析软件定量染色体DNA中的靶序列。
流式FISH
流式FISH是一种细胞遗传学技术，通过将流式细胞术与细胞遗传学荧光原位杂交染色方案组合，定量整个细胞群的基因组DNA中特定重复元素的拷贝数。流式FISH由Rufer等人于1998年首次发表，作为另一种用于分析端粒长度的技术即Q-FISH的改进，流式FISH使用以荧光素荧光团标记的3′-CCCTAACCCTAACCCTAA-5′序列的肽核酸探针，对细胞的制备中期扩散物上的端粒重复序列进行染色，该细胞已用秋水仙素、低渗休克和通过甲醇/乙酸处理固定到载玻片上(方案可在线获取)。然后可以通过专门的计算机程序(可从Flintbox网络获得的方法和软件)分析所得荧光点的图像，以产生定量荧光值，该定量荧光值然后可用于估计实际端粒长度。通过探针染色产生的荧光被认为是定量的，因为PNA在低离子盐浓度和甲酰胺存在下优先与DNA结合，因此DNA双链体在已经解链并退火到PNA探针后可能不会重新形成，从而允许探针使其靶重复序列饱和(因为它不会被互补链上的竞争性反义DNA从靶DNA中置换出来)，从而在洗去未结合的探针之后，产生可靠的且可定量的PNA探针靶在给定染色体位点处的频率的读数。
比较基因组杂交
比较基因组杂交是一种分子细胞遗传学方法，用于分析与参考样品相比测试样品DNA倍性水平的拷贝数变异(CNV)，无需培养细胞。该技术的目的是快速有效地比较来自通常最密切相关的两个来源的两个基因组DNA样品，因为怀疑它们在整个染色体或亚染色体区域(整个染色体的一部分)的获得或损失方面存在差异。该技术最初是为了评估实体瘤和正常组织样品的染色体互补物之间的差异而开发的，并且与受限于所用显微镜分辨率的更传统的吉姆萨显带和荧光原位杂交(FISH)等细胞遗传学分析技术相比，分辨率提高到了5-10兆碱基。
印迹
可以使用的示例性印迹技术包括蛋白质印迹、DNA印迹、Eastern印迹、Far-蛋白质印迹、DNA-蛋白质印迹、RNA-蛋白质印迹和RNA印迹，如以下部分中进一步描述的和本领域已知的。
蛋白质印迹
蛋白质印迹(有时称为蛋白质免疫印迹)是一种广泛使用的分析技术，用于检测样品或提取物中的特定蛋白质。它使用凝胶电泳通过3-D结构分离天然蛋白质或通过多肽长度分离变性蛋白质。然后将蛋白质转移到膜(通常是硝化纤维或PVDF)上，在那里它们被靶蛋白质的特异性抗体染色。凝胶电泳步骤包含在蛋白质印迹分析中，以解决抗体交叉反应性的问题。
DNA印迹
DNA印迹将电泳分离的DNA片段转移到滤膜上，然后通过探针杂交进行片段检测。探针与滤膜上特异性DNA片段的杂交表明该片段包含与探针互补的DNA序列。将DNA从电泳凝胶转移到膜上的步骤允许标记的杂交探针与大小分级分离的DNA轻松结合。它还允许固定靶-探针杂交体，可用于通过放射自显影或其他检测方法进行分析。用限制酶消化的基因组DNA进行的DNA印迹可用于确定基因组中序列(例如，基因拷贝)的数量。仅与未被限制酶切割的单个DNA片段杂交的探针将在DNA印迹上产生单带，而当探针与几个高度相似的序列(例如，可能是序列复制的结果的那些)杂交时，将可能观察到多个带。杂交条件的修改(例如，增加杂交温度或降低盐浓度)可用于增加特异性并减少探针与小于100％相似度的序列的杂交。
Eastern印迹
Eastern印迹是一种生化技术，用于分析蛋白质翻译后修饰(PTM)，诸如脂质、磷酸部分和糖缀合物。它最常用于检测碳水化合物表位。因此，Eastern印迹可以被认为是蛋白质印迹生化技术的延伸。Eastern印迹一词描述了多种技术，大多数使用从SDS-PAGE凝胶印迹到PVDF或硝酸纤维素膜上的蛋白质。使用可以检测脂质、碳水化合物、磷酸化或任何其他蛋白质修饰的探针对转移的蛋白质分析翻译后修饰。Eastern印迹应该用于指通过PTM和探针的特异性相互作用来检测其靶的方法，将它们与标准Far-蛋白质印迹区分开来。原则上，eastern印迹类似于凝集素印迹(即检测蛋白质或脂质上的碳水化合物表位)。
Far-蛋白质印迹
Far-蛋白质印迹采用非抗体蛋白来探测印迹上的一种或多种目标蛋白质。以此方式，可以鉴定探针(或印迹的)蛋白质的结合配偶体。探针蛋白通常使用表达克隆载体在大肠杆菌中产生。含有猎物蛋白质的细胞裂解物中的蛋白质首先通过SDS或天然PAGE分离，然后转移到膜上，如在标准WB中那样。然后将膜中的蛋白质变性和复性。然后用一种或多种纯化的诱饵蛋白对膜进行封闭和探测。如果诱饵蛋白和猎物蛋白一起形成复合物，则在猎物蛋白所在的膜点上检测到诱饵蛋白。然后可以通过通常的方法将探针蛋白可视化——它可以被放射性标记；它可以荷有特异性亲和标签，如存在针对其的抗体的His或FLAG；或者可能有蛋白质特异性抗体(针对探针蛋白)。
DNA-蛋白质印迹
DNA-蛋白质印迹基于DNA印迹(由Edwin Southern创建)并由B.Bowen、J.Steinberg及其同事于1980年首次描述，是一种实验室技术，涉及通过DNA结合蛋白(与DNA结合的蛋白质)与特异性寡核苷酸探针结合的能力来鉴定和表征DNA结合蛋白。蛋白质通过凝胶电泳分离，随后类似于其他类型的印迹转移到硝酸纤维素膜上。“DNA-蛋白印迹图谱分析”用于快速表征DNA结合蛋白及其在基因组DNA上的特异性位点。蛋白质在含有十二烷基硫酸钠(SDS)的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)上分离，在尿素存在下通过去除SDS进行复性，并通过扩散印迹到硝酸纤维素上。目标基因组DNA区域被选定的限制酶消化，以产生适当但不同大小的片段，随后对这些片段进行末端标记并使其与分离的蛋白质结合。从每个单独的蛋白质-DNA复合物中洗脱特异性结合的DNA，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。已经呈现了可以通过这种技术检测特异性DNA结合蛋白的证据。此外，它们的序列特异性结合允许纯化相应的选择性结合的DNA片段，并可以改善蛋白质介导的DNA调控序列克隆。
RNA-蛋白质印迹
运行RNA-蛋白质印迹涉及通过凝胶电泳分离RNA结合蛋白，凝胶电泳将根据RNA结合蛋白的大小和电荷进行分离。可以将单个样品加载到琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶(通常是SDS-PAGE)中，以便同时分析多个样品。一旦凝胶电泳完成，就将凝胶和相连的RNA结合蛋白转移到硝酸纤维素转移纸上。然后将新转移的印迹浸泡在封闭溶液中；脱脂牛奶和牛血清白蛋白是常见的封闭缓冲液。这种封闭溶液有助于防止一抗和/或二抗与硝酸纤维素膜的非特异性结合。一旦封闭溶液与印迹有足够的接触时间，就施加特异性竞争者RNA，并间在室温下孵育给定时间。在此期间，竞争者RNA与印迹上的样品中的RNA结合蛋白结合。在该过程期间，孵育时间可以因所施加的竞争者RNA的浓度而异；但孵育时间通常为一小时。孵育完成后，印迹通常至少洗涤3次，每次洗涤5分钟，以便稀释溶液中的RNA。常见的洗涤缓冲液包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)或10％Tween 20溶液。洗涤不当或不充分将会影响印迹显影的清晰度。一旦洗涤完成，通常随后通过X射线或类似的放射自显影方法使印迹显影。
RNA印迹
一般的RNA印迹程序始于从样品(例如细胞)中提取总RNA。然后可以通过使用寡聚(dT)纤维素层析来分离真核mRNA，以仅分离那些带有聚(A)尾的RNA。然后通过凝胶电泳分离RNA样品。由于凝胶易碎且探针无法进入基质，将现在按大小分开的RNA样品通过毛细管或真空印迹系统转移到尼龙膜上。带正电荷的尼龙膜最适合用于RNA印迹，因为带负电荷的核酸对它们具有高亲和力。用于印迹的转移缓冲液通常含有甲酰胺，因为它降低了探针-RNA相互作用的退火温度，从而消除了对可能导致RNA降解的高温的需要。一旦RNA被转移到膜上，就通过紫外线或热的共价键将其固定在膜上。探针被标记后，与膜上的RNA杂交。可影响杂交效率和特异性的实验条件包括离子强度、粘度、双链体长度、错配碱基对和碱基组成。洗涤膜以确保探针已经特异性地结合并防止产生背景信号。然后通过X射线胶片检测杂交信号，并可以通过光密度测定法进行定量。在通过微阵列或RT-PCR确定后，可以使用不显示目标基因产物的RNA印迹样品创建用于比较的对照。
酶促
描述了一种可能使用自动染色平台的近端检测(proximity detection)方法，该方法利用酶促生物素化来检测样品中的靶。一个公开的实施例包括使样品与包含生物素连接酶和与第一靶近端结合的第一特异性结合部分的第一缀合物接触；使样品与包含生物素连接酶底物和与第二靶近端结合的第二特异性结合部分的第二缀合物接触；当第一靶和第二靶具有近端布置时，使样品经历允许生物素连接酶底物通过生物素连接酶进行生物素化的条件；以及检测生物素连接酶底物的生物素化。允许底物生物素化的条件包括添加生物素和ATP。该方法还可包括使样品与链霉亲和素-酶缀合物接触。也可以使用信号放大。参见WO2014139980，其全文以引用方式并入本文。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
进行ELISA涉及至少一种对特定抗原具有特异性的抗体。将具有未知量抗原的样品要么非特异性地(通过吸附到表面)要么特异性地(通过对同一抗原具有特异性的另一种抗体捕获，在“夹心”ELISA中)固定在固体支持物(通常是聚苯乙烯微量滴定板)上。将抗原固定后，添加检测抗体，与抗原形成复合物。检测抗体可以与酶共价连接，或者其自身可以通过经由生物偶联与酶连接的二抗检测。在每个步骤之间，通常用温和的洗涤剂溶液清洗板，以去除任何非特异性结合的蛋白质或抗体。在最后的洗涤步骤之后，通过添加酶促底物将板显色以产生可见信号，该信号指示样品中的抗原量。
配体结合测定
分析已知或怀疑含有循环CTC的样品的方法可以包括成像步骤。在一个示例中，成像包括对CTC鉴定试剂的免疫荧光成像(例如通过检测与所用的每种抗体缔合的标签)。在另一个示例中，成像包括使用多光谱带通滤波器。免疫荧光可以从用荧光团直接或间接标记的抗体发出，或者免疫荧光可以通过用光谱过滤的可见光激发荧光团而产生。在一个实施例中，经光谱过滤的可见光包括激发第一荧光团的第一选定范围和激发第二荧光团的第二选定范围，其中第一选定范围不显著激发第二荧光团，并且第二选定范围不显著激发第一荧光团。对样品成像可以包括获取由第一选定范围激发的样品的第一免疫荧光图像和获取由第二选定范围激发的样品的第二免疫荧光图像(如果使用两种以上CTC鉴定试剂，则为每个标签获取额外的免疫荧光图像)，以及通过定位或可视化CTC鉴定试剂来定位或识别CTC，这可以包括比较或叠加第一免疫荧光图像和第二免疫荧光图像(以及，如果如此获得了，额外的图像)。例如，对第一免疫荧光图像成像可以鉴定CK+细胞，并且第二免疫荧光图像可以鉴定CD45+细胞，其中比较或叠加包括鉴定作为CK+和CD45-的细胞。在另一个实施例中，通过定位CTC鉴定试剂来定位CTC包括使用计算机在算法上分析第一免疫荧光图像和第二免疫荧光图像(以及，如果获得了，附加的免疫荧光图像)。在一个实施例中，在算法上分析包括数字地查询图像以测量细胞大小、标志物的细胞区室定位和/或标志物表达的强度。参见WO2013101989，其全文以引用方式并入本文。
免疫沉淀(IP)
免疫沉淀(IP)的液相配体结合测定是一种使用来自复杂混合物的抗体纯化或富集特异性蛋白质或一组蛋白质的方法。破碎的细胞或样品的提取物可以与针对目标抗原的抗体混合，从而产生抗原-抗体复合物。当抗原浓度低时，抗原-抗体复合物沉淀可能需要数小时或甚至数天，并且难以分离所形成的少量沉淀。酶联免疫吸附测定(ELISA)或蛋白质印迹是两种不同的方法，可以获得和分析纯化的抗原(或多种抗原)。该方法包括借助附着在固体(珠状)支持物(诸如琼脂糖树脂)上的抗体来纯化抗原。固定化蛋白质复合物可以一步完成，也可以依次完成。IP还可与生物合成放射性同位素标记协同使用。使用该技术组合，可以确定特异性抗原是否由样品合成或由细胞合成。
染色质免疫沉淀(ChIP)
染色质免疫沉淀(ChIp)是一种免疫沉淀实验技术，用于探索细胞中蛋白质与DNA之间的相互作用。它旨在确定特异性蛋白质是否与特异性基因组区域(诸如启动子或其他DNA结合位点上的转录因子)相关，并且是否可能定义顺反组(cistrome)。ChIP还旨在确定与各种组蛋白修饰相关的基因组中的特定位置，指示组蛋白修饰剂的靶。
染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)
ChIP测序，也称为ChIP-seq，是一种用于分析蛋白质与DNA相互作用的方法。ChIP-seq将染色质免疫沉淀(ChIP)与大规模平行DNA测序组合，以鉴定DNA相关蛋白的结合位点。它可用于为任何目标蛋白质精确绘制全局结合位点。ChIP-seq主要用于确定转录因子和其他染色质相关蛋白如何影响表型影响机制。确定蛋白质如何与DNA相互作用以调节基因表达对于充分理解许多生物过程和疾病状态至关重要。这种表观遗传信息是对基因型和表达分析的补充。ChIP-seq技术目前主要被视为可以利用杂交阵列的ChIP-chip的替代品。这必然会引入一些偏差，因为阵列仅限于固定数量的探针。相比之下，测序被认为具有较小的偏差，尽管尚未完全裂解不同测序技术的测序偏差。可以通过染色质免疫沉淀来分离与转录因子和其他蛋白质进行直接物理相互作用的特异性DNA位点。ChIP产生与体内目标蛋白质结合的靶DNA位点文库。将大规模并行序列分析与全基因组序列数据库协同使用，以分析任何蛋白质与DNA的相互作用模式，或任何表观遗传染色质修饰的模式。这可以应用于一组可进行ChIP的蛋白质和修饰，诸如转录因子、聚合酶和转录机制、结构蛋白、蛋白质修饰和DNA修饰。作为依赖于特异性抗体的替代方法，已经开发了不同的方法来寻找基因组中所有核小体耗尽或核小体破坏的活性调节区的超集，如DNase-Seq和FAIRE-Seq。
ChIP-on-chip(ChP-ChIP)
ChIP-on-chip(也称为ChIP-chip)是一种将染色质免疫沉淀(“ChIP”)与DNA微阵列(“芯片”)组合的技术。与常规ChIP一样，ChIP-on-chip用于研究体内蛋白质和DNA之间的相互作用。具体而言，它允许在全基因组的基础上鉴定DNA结合蛋白的顺反组，即结合位点的总和。可以进行全基因组分析以确定几乎任何目标蛋白质的结合位点的位置。正如该技术的名称所暗示的那样，此类蛋白质通常是在染色质环境中操作的蛋白质。这一类最突出的代表是转录因子、复制相关蛋白如起源识别复合蛋白(ORC)、组蛋白、它们的变体和组蛋白修饰。ChIP-on-chip的目标是定位可能有助于鉴定基因组中功能元件的蛋白质结合位点。例如，在转录因子作为目标蛋白质的情况下，可以确定在整个基因组中的其转录因子结合位点。其他蛋白质允许鉴定启动子区域、增强子、抑制因子和沉默元件、绝缘子、边界元件和控制DNA复制的序列。如果组蛋白是目标主题，则相信修饰的分布及其定位可能提供对调节机制的新见解。ChIP-on-chip的长期目标之一是建立一个(选定的)生物体目录，列出各种生理条件下的所有蛋白质-DNA相互作用。这些知识最终将有助于理解基因调控、细胞增殖和疾病进展背后的机制。因此，ChIP-on-chip不仅提供了巨大的潜力来补充我们关于核苷酸水平上基因组编排的知识，而且还提供了更高水平的信息和调节，因为它是通过表观遗传学研究传播的。
放射免疫测定
放射免疫测定(RIA)是一种非常灵敏的体外测定技术，用于通过使用抗体测量抗原浓度(例如，血液中的激素水平)。因此，它可以被看作是放射性结合测定的逆过程，后者通过使用相应的抗原来定量抗体。传统上，为了进行放射免疫测定，使已知数量的抗原具有放射性，通常是通过用与酪氨酸连接的碘的γ放射性同位素(诸如125-I)标记该抗原。然后将该放射性标记的抗原与已知量的针对该抗原的抗体混合，结果，两者特异性结合。然后，添加来自患者的血清样品，该血清样品包含未知数量的相同抗原。这导致来自血清的未标记(或“冷”)抗原与放射性标记(“热”)抗原竞争抗体结合位点。随着“冷”抗原浓度的增加，更多的它与抗体结合，置换放射性标记变体，并降低抗体结合的放射性标记抗原与游离放射性标记抗原的比率。然后将结合的抗原与未结合的抗原分离，并使用γ计数器测量残留在上清液中的结合抗原的放射性。
该方法原则上可以用于任何生物学分子并且不限于血清抗原，也不需要使用间接测量游离抗原的方法代替直接测量捕获的抗原。例如，如果不希望或不可能对目标抗原或靶分子进行放射性标记，如果有两种不同的识别该靶的抗体可用，并且靶足够大(例如，一个蛋白质)以向抗体呈递多个表位，则可以进行RIA。一种抗体将会按上述方式进行放射性标记，而另一种将会保持未修饰。RIA将会适于允许“冷”的未标记抗体与溶液中的靶分子相互作用并结合。优选地，该未标记抗体以某种方式被固定，诸如偶联至琼脂糖珠、包被至表面等。接下来，允许“热”放射性标记抗体与第一抗体-靶分子复合物相互作用。大量洗涤后，测量结合的放射性抗体的直接量，并通过将其与同时测定的参考量进行比较来定量靶分子的量。该方法在原理上类似于非放射性夹心ELISA方法。
荧光偏振
荧光偏振与荧光各向异性同义。该方法测量荧光标记配体在与受体结合后的旋转速度的变化。使用偏振光来激发配体，并测量发射的光量。发射的光的去偏振取决于当前配体的大小。如果使用小配体，它将具有很大的去极化，这将快速旋转光。如果使用的配体尺寸较大，则产生的去极化将减少。这种方法的一个优点是它可以只包括一个标记步骤。然而，如果在低纳摩尔浓度下使用这种方法，结果可以是精确的。
福斯特共振能量转移(FRET)
福斯特共振能量转移(也称为荧光共振能量转移)利用供体和受体分子之间的能量转移，这些分子非常接近，例如，供体荧光团和受体荧光团、或荧光团和猝灭剂。FRET使用荧光标记的配体，如FP。FRET内的能量转移始于激发供体。供体和受体分子之间的偶极-偶极相互作用将能量从供体转移到受体分子。可以通过检测与进入转移相关的荧光光谱或不存在进入转移来监测供体和受体所针对的两个或更多个分子之间的相互作用。例如，如果配体与受体-抗体复合物结合，则受体将发射光。能量转移取决于供体和受体之间的距离，因此转移的存在或不存在指示分子距离。一般而言，小于10nm的距离允许受体和供体之间的有效能量转移，但可以根据所涉及的特定分子使用更大或更小的距离。
表面等离子体共振(SPR)
表面等离子体共振(SPR)不需要标记配体。相反，它通过测量偏振光从表面反射的角度(折射率)的变化来工作。该角度与质量或层厚度的变化有关，诸如配体的固定化改变共振角，这增加了反射光。衍生SPR的装置包括传感器芯片、流动槽、光源、棱镜和固定角度位置检测器。
过滤器结合测定
过滤器测定是固相配体结合测定，使用过滤器来测量两个分子之间的亲和力。在过滤器结合测定中，过滤器用于通过将培养基抽吸通过该过滤器来截留细胞膜。这种快速方法以快速的速度进行，其中可以对所发现的级分实现过滤和回收。用缓冲液洗涤过滤器去除残留的未结合配体和存在的能够从结合位点洗掉的任何其他配体。洗涤过滤器时存在的受体-配体复合物不会显著解离，因为它们将完全被过滤器截留。过滤器的特征对于正在完成的每项工作都很重要。较厚的过滤器有用于更彻底地回收小膜片，但可能需要更长的洗涤时间。建议对过滤器进行预处理，以帮助截留带负电荷的膜片。将过滤器浸泡在将会使过滤器表面带正电荷的溶液中，将会吸引带负电荷的膜碎片。
亲和色谱
亲和层析是一种基于高度特异性相互作用(诸如抗原与抗体、酶与底物或受体与配体之间的相互作用)分离生化混合物的方法。固定相通常是凝胶基质，通常是琼脂糖；源自藻类的线性糖分子。通常，起始点是溶液中未定义的异质分子组，诸如细胞裂解物、生长培养基或血清。目标分子将具有众所周知的且明确的性质，并且可以在亲和纯化过程期间加以利用。该过程本身可以被认为是一种截留，其中靶分子被截留在固体或固定相或介质上。流动相中的其他分子将不会被截留，因为它们不具备这种性质。然后可以从混合物中去除固定相，洗涤并在称为洗脱的过程中从截留物中释放靶分子。亲和色谱最常见的用途是用于纯化重组蛋白。
免疫亲和性：该程序的另一个用途是从血清中亲和纯化抗体。如果已知血清含有针对特异性抗原的抗体(例如，如果血清来自针对相关抗原免疫的生物体)，则可将其用于该抗原的亲和纯化。这也称为免疫亲和色谱法。例如，如果针对GST融合蛋白对生物体进行免疫，该生物体将产生针对融合蛋白的抗体，并且可能还会产生针对GST标签的抗体。然后可以将蛋白质共价偶联到固体支持物诸如琼脂糖上，并用作从免疫血清中纯化抗体的亲和配体。为了彻底纯化，GST蛋白和GST融合蛋白可以各自单独偶联。血清最初被允许与GST亲和基质结合。这将去除针对融合蛋白的GST部分的抗体。然后将血清与固体支持物分离并使其与GST融合蛋白基质结合。这允许识别抗原的任何抗体被捕获在固体支持物上。目标抗体的洗脱最常使用低pH缓冲液(诸如甘氨酸pH 2.8)实现。将洗脱液收集到中性tris或磷酸盐缓冲液中，以中和低pH洗脱缓冲液并阻止抗体活性的任何退化。这是一个很好的示例，因为亲和纯化用于纯化初始GST融合蛋白、从血清中去除不希望的抗GST抗体并纯化靶抗体。通常采用简化的策略来纯化针对肽抗原生成的抗体。当合成产生肽抗原时，会在肽的N端或C端添加末端半胱氨酸残基。该半胱氨酸残基包含一个巯基官能团，使肽能够轻松地与载体蛋白(例如钥孔戚血蓝蛋白(KLH))缀合。同样的含有半胱氨酸的肽也通过半胱氨酸残基固定在琼脂糖树脂上，然后用于纯化抗体。大多数单克隆抗体已使用基于源自细菌的免疫球蛋白特异性蛋白A或蛋白G的亲和层析纯化。
免疫细胞化学(ICC)
免疫细胞化学(ICC)是一种常见的实验室技术，用于通过使用与细胞中特异性蛋白质或抗原结合的特异性一抗将该蛋白质或抗原的定位在解剖学上可视化。当一抗被具有缀合荧光团的二抗结合时，一抗允许在荧光显微镜下观察蛋白质。ICC允许研究人员评估特定样品中的细胞是否表达所讨论的抗原。在发现免疫阳性信号的情况下，ICC还允许研究人员确定哪些亚细胞区室正在表达该抗原。有许多方法可以对样品进行免疫检测，包括直接与一抗或抗血清相关的方法。直接方法包括将可检测标签(例如荧光分子、金颗粒等)直接用于抗体，然后使其与细胞中的抗原(例如蛋白质)结合。替代性地，有许多间接方法。在一种这样的方法中，抗原被一抗结合，然后通过使用与一抗结合的二抗进行扩增。接下来，施加含有酶部分的三级试剂并与二级抗体结合。当施加四级试剂或底物时，三级试剂的酶促末端将底物转化为颜料反应产物，从而在原始一抗识别该兴趣的抗原的相同位置产生颜色(可能有多种颜色；棕色、黑色、红色等)。所用底物(也称为生色团)的一些示例是AEC(3-氨基-9-乙基咔唑)或DAB(3，3′-二氨基联苯胺)。在暴露于必要的酶(例如，与抗体试剂缀合的辣根过氧化物酶)后使用这些试剂中的一种产生了阳性免疫反应产物。当特异性较低的染色如H&E(苏木精和曙红)不能用于待进行的诊断或提供有关治疗的额外预测信息时(例如，在某些癌症中)，可以使用目标特异性抗原的免疫细胞化学可视化。替代性地，二抗可以共价连接到在荧光或共聚焦显微镜中检测的荧光团(FITC和罗丹明是最常见的)。荧光的位置将根据靶分子，针对膜蛋白在外部和针对细胞质蛋白在内部而变化。这样，当与共聚焦显微镜组合用于研究蛋白质的位置和动态过程(胞吐作用、内吞作用等)时，免疫荧光是一种强大的技术。
基因表达谱分析
可以利用的示例性基因表达谱分析技术包括用PCR、DNA微阵列、SAGE、实时PCR、差异显示PCR和RNA-seq进行的DNA谱分析，如以下部分中进一步描述的和本领域已知的。
使用PCR进行DNA谱分析
聚合酶链反应(PCR)过程模拟DNA复制的生物学过程，但将其限制在目标特异性DNA序列中。随着PCR技术的发明，DNA谱分析在区分能力和从非常小的(或退化的)起始样品中恢复信息的能力方面都取得了巨大的进步。PCR极大地放大了DNA的特异性区域的数量。在PCR过程中，通过加热将DNA样品变性成单独的多核苷酸链。使用两个寡核苷酸DNA引物与相对DNA链上两个相应的邻近位点杂交，以这种方式，每个引物的活性末端(即3′末端)的正常酶促延伸会朝着另一个引物前进。PCR使用耐高温的复制酶，诸如热稳定的Taq聚合酶。以这种方式，生成了目标序列的两个新拷贝。以这种方式重复变性、杂交和延伸，产生呈指数增长的目标DNA拷贝数。进行热循环的仪器现在很容易从商业来源获得。该过程可以在2小时或更短的时间内产生所希望区域的百万倍或更多的扩增。
DNA微阵列
微阵列背后的核心原理是两条DNA链之间的杂交，互补核酸序列的通过在互补核苷酸碱基对之间形成氢键来与彼此特异性配对的性质。核苷酸序列中的大量互补碱基对意味着两条链之间更紧密的非共价键合。洗掉非特异性结合序列后，只有强配对的链会保持杂交。与探针序列结合的荧光标记靶序列生成取决于杂交条件(诸如温度)和杂交后洗涤的信号。来自一个点(特征)的信号的总强度取决于与该点上存在的探针结合的靶样品的量。微阵列使用相对定量，其中将特征的强度与不同条件下相同特征的强度进行比较，并且特征的身份通过其位置已知。
基因表达系列分析(SAGE)
基因表达系列分析(SAGE)是分子生物学家使用的一种技术，以对应于那些转录物片段的小标签形式生成目标样品中信使RNA群体的快照。简而言之，SAGE实验如下进行：
分离输入样品(例如肿瘤)的mRNA，并使用逆转录酶和生物素化的引物从mRNA合成cDNA。
cDNA通过与连接在引物上的生物素相互作用而与链霉亲和素珠结合，然后使用称为锚定酶(AE)的限制性内切核酸酶进行裂解。对于每个单独的cDNA(mRNA)，裂解位点的位置经有所不同，因此与珠结合的剩余cDNA的长度将有所不同。
然后丢弃裂解位点下游的切割的cDNA，将裂解位点上游剩余的固定cDNA片段分成两半并暴露于两个衔接子寡核苷酸中的一者(A或B)，该寡核苷酸包含位于连接位点上游的以下顺序的几种成分：1)带有AE切割位点的粘性末端，以允许连接到切割的cDNA；2)称为标记酶(TE)的限制性内切核酸酶的识别位点，该酶切割在其识别位点下游(原始cDNA/mRNA序列内)的约15个核苷酸；3)连接基A或B所独有的短引物序列，稍后将用于通过PCR进一步扩增。
衔接子连接后，使用TE裂解cDNA以将它们从珠上去除，只留下原始cDNA的约11个核苷酸的短“标签”(15个核苷酸减去对应于AE识别位点的4个核苷酸)。
然后用DNA聚合酶修复裂解的cDNA标签以产生平末端cDNA片段。
这些cDNA标签片段(带有衔接子引物以及连接的AE和TE识别位点)被连接起来，将两个标签序列夹在一起，并在任一端具有侧翼衔接子A和B。然后使用锚定A和B特异性引物对这些称为双标签的新构建体进行PCR扩增。
然后使用原始AE裂解双标签，并允许与其他双标签连接在一起，这些双标签将被连接以创建cDNA串联体，其中每个双标签通过AE识别位点分隔。
然后将这些串联体转化到细菌内，通过细菌复制进行扩增。
然后可以使用现代高通量DNA测序仪将cDNA串联体分离和测序，并且可以使用计算机程序分析这些序列，该程序可以定量单个标签的重复出现。
实时聚合酶链反应
实时聚合酶链反应是一种基于聚合酶链反应(PCR)的分子生物学实验室技术。它在PCR期间即实时监控所靶向的DNA分子的扩增，而不是像传统PCR那样在其结束时监控。实时PCR可用于定量(定量实时PCR)；半定量，即高于/低于一定量的DNA分子(半定量实时PCR)或定性(定性实时PCR)。在实时PCR中检测PCR产物的两种常用方法是：(1)插入有任何双链DNA的非特异性荧光染料，以及(2)序列特异性DNA探针，由用荧光报告基因标记的寡核苷酸组成，只有在探针与其互补序列杂交后才能对该荧光报告基因进行检测。实时PCR在热循环仪中进行，该循环仪能够用至少一个特定波长的光束照射每个样品，并检测激发的荧光团发出的荧光。热循环仪还能够快速加热和冷却样品，从而利用核酸和DNA聚合酶的物理化学性质。PCR过程通常由一系列重复25至50次的温度变化组成。正常情况下，这些循环由三个阶段组成：第一阶段，在95℃左右，允许双链分离；第二阶段，在50-60℃左右的温度下，允许引物与DNA模板结合；第三阶段，在68至72℃之间，促进通过DNA聚合酶进行的聚合。由于片段的小尺寸，在这种类型的PCR中通常省略最后一步，因为酶能够在比对阶段和变性阶段之间的变化期间增加它们的数量。此外，在四步PCR中，在每个循环中仅持续几秒钟的短温度相期间测量荧光，其中温度例如为80℃，以便减少当使用非特异性染料时由引物二聚体的存在引起的信号。每个循环使用的温度和时间取决于多种参数，诸如：用于合成DNA的酶、反应中二价离子和脱氧核糖核苷酸(dNTP)的浓度以及引物的结合温度。
差异显示PCR
差异显示(也称为DDRT-PCR或DD-PCR)是一种技术，研究人员可以在其中比较和鉴定任何一对真核细胞样品之间在mRNA水平上的基因表达变化。如果需要，该测定可以扩展到一对以上。配对的样品将具有形态、遗传或其他实验差异，研究人员希望针对该差异研究基因表达模式，希望阐明特定差异或受实验影响的特异性基因的根本原因。差异显示的概念是使用数量有限的任意短引物与锚定的oligo-dT引物组合，从而系统地放大和可视化细胞中的大部分mRNA。在1990年代早期发明后，差异显示成为在mRNA水平上鉴定差异表达的基因的常用技术。已经提出了不同的改进型DD-PCR方案，包括荧光DD过程以及放射性标记，可提供高精度和读数。
RNA测序(RNA-seq)
RNA测序(RNA-seq)，也称为全转录组鸟枪法测序(WTSS)，是一种使用下一代测序的能力在给定时间点揭示基因组中RNA存在和数量的快照的技术。
RNA′Poly(A)′文库RNA-seq：在高通量测序中，序列库的创建可以因平台而异，每个平台都有几种试剂盒，该试剂盒被设计成构建不同类型的文库，并使所得序列适应其仪器的特定要求。但是，由于所分析的模板的属性，每种技术都存在共性。一般而言，在mRNA分析中，3′多聚腺苷酸化(poly(A))尾部被靶向，以便确保编码RNA与非编码RNA分离。这可以简单地通过共价连接到给定底物的poly(T)寡核苷酸来实施。目前，许多研究利用磁珠进行该步骤。包括poly(A)RNA外的转录组部分的研究表明，当使用poly(T)磁珠时，流通的RNA(non-poly(A)RNA)可以产生重要的非编码RNA基因发现，否则这些基因就会消失而没有被注意到。而且，由于核糖体RNA占给定细胞内RNA的超过90％，研究表明，通过探针杂交去除核糖体RNA增加了从转录组剩余部分检索数据的能力。下一步是逆转录。由于随机引物逆转录的5′偏向以及影响引物结合位点的二级结构，在逆转录前将RNA水解为200-300个核苷酸可同时减少这两个问题。然而，这种方法存在一些权衡，尽管转录物的整体有效地转化为DNA，但5′和3′末端的转化率较低。根据研究目的，研究人员可以选择应用或忽略此步骤。
小RNA/非编码RNA测序：对mRNA以外的RNA进行测序时，修改了文库制备。基于所希望的大小范围选择细胞RNA。对于小RNA靶，诸如miRNA，通过大小选择来分离RNA。这可以使用体积排阻凝胶、通过体积选择磁珠或使用商业开发的试剂盒进行。一旦分离，就将连接基添加到3′和5′末端，然后纯化。最后一步是通过逆转录生成cDNA。
直接RNA测序：由于使用逆转录酶将RNA转化为cDNA已被证明引入可能干扰转录物的适当表征和定量的偏差和伪影，因此Helicos(现已破产)正在开发单分子直接RNA测序(DRSTM)技术。DRSTM直接以大规模平行的方式对RNA分子进行测序，无需将RNA转化为cDNA或其他有偏差的样品操作，诸如连接和扩增。一旦合成cDNA，就可以将其进一步片段化以达到测序系统所希望的片段长度。
(蛋白质)质谱
蛋白质质谱是指将质谱应用于蛋白质的研究。质谱是用于表征蛋白质的一种重要的新兴方法。用于电离全蛋白的两种主要方法是电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸/电离(MALDI)。为了与可用质谱仪的性能和质量范围保持一致，使用两种方法来表征蛋白质。首先，完整蛋白质通过上述两种技术中的任何一种进行电离，然后引入质量分析仪。这种方法被称为蛋白质分析的“自上而下”策略。在第二种情况下，使用蛋白酶(诸如胰蛋白酶)将蛋白质酶促消化成较小的肽。随后将这些肽引入质谱仪并通过肽质量指纹图谱或串联质谱法进行鉴定。因此，后一种方法(也称为“自下而上”蛋白质组学)使用肽水平上的鉴定来推断蛋白质的存在。全蛋白质量分析主要使用飞行时间(TOF)MS或傅里叶变换离子回旋共振(FT-ICR)执行。这两种类型的仪器在这里是优选的，因为它们的质量范围宽，在FT-ICR的情况下，它的质量精度高。蛋白水解肽的质量分析是一种更流行的蛋白质表征方法，因为可以使用更便宜的仪器设计进行表征。此外，一旦整个蛋白质被消化成更小的肽片段，样品制备就会更容易。最广泛使用的肽质量分析仪器是MALDI飞行时间仪器，因为它们允许高速采集肽质量指纹(PMF)(1PMF可在大约10秒内分析)。多级四极杆飞行时间和四极杆离子阱也可用于该应用。
质谱CMS已越来越多地用于生物分析学分析。质谱法非常适合多路复用，因为质量区分允许多个同时检测通道。然而，复杂的生物学分子，诸如DNA，具有复杂的质谱，由于相对较差的灵敏度，可能难以在基质中检测到。MS是一种测量带电物质的质荷比的分析技术。它可用于确定样品或分子的化学组成。通过质谱分析的样品被电离以生成带电分子或原子，根据其质荷比进行分离并进行检测。根据多种应用，该技术被定性和定量地使用。电感耦合等离子体(OCP)是一种类型的等离子体源，其中能量由通过电磁感应即通过时变磁场产生的电流提供。ICP可用作质谱分析的电离源。电感耦合等离子体和质谱的组合称为ICP-MS。质谱成像(MSI)是质谱的一种应用，它涉及使用空间信息分析化学信息，使得可以将化学信息可视化为化学图像或图谱。通过生成化学图谱，可以阐明样品表面的组成差异。激光烧蚀是通过用激光束照射固体表面从该固体表面去除材料的过程。激光烧蚀已被用作质谱分析(特别是质谱成像)的对材料进行采样的手段。根据一个实施例，一种用于样品质谱成像的系统包括激光烧蚀采样器、电感耦合等离子体电离器、质谱仪和计算机。说明性地，激光烧蚀采样器包括激光器、激光烧蚀室和样品平台，该样品平台被配置为使得激光可以照射定位在样品平台上的样品以形成烧蚀的样品，其中激光器和样品平台通过计算机协调。激光烧蚀采样器与电感耦合等离子体电离器可操作连接，使得可以将烧蚀的样品从激光烧蚀采样器转移到电感耦合等离子体电离器中，从而使烧蚀的样品蒸发、汽化、雾化和电离，以形成具有质荷比分布的原子离子群。质谱仪可操作地连接到电感耦合等离子体电离器，使得可以将离子群从电感耦合等离子体电离器转移到质谱仪，其中质谱仪根据质荷比分布来分离离子群，从而生成质荷比数据。计算机被配置为接收位置输入并与激光烧蚀采样器通信以根据位置输入烧蚀样品，并且其被配置为根据位置输入将质荷比数据与样品上的位置相关联。在进一步的说明性实施例中，该系统进一步包括配准系统，该配准系统被配置为确定样品的位置，从而实施位置输入与样品上的位置的自动关联，其中激光被配置为照射该位置。在说明性实施例中，用于多重样品LA-ICP-MS测定的组合物包括质量标签和与质量标签缀合的特异性结合部分。质量标签包括第一类原子群，该第一类原子群与样品的内源元素可检测地不同。在一个实施例中，第一类原子群是元素的非内源性稳定同位素。在另一个实施例中，原子群被配置为胶体颗粒。参见WO2014079802，其全文以引用方式并入本文。
用于检测样品中的靶的方法涉及使样品与经选择以识别该靶的酶特异性结合部分缀合物接触。然后使样品与质量标签前体缀合物接触，该缀合物包含质量标签前体和酶底物、酪胺部分或酪胺衍生物、以及任选的连接基。质量标签前体缀合物与酶或酶促反应的产物发生反应以产生沉淀的质量标签、共价结合的质量标签或非共价结合的质量标签。样品暴露于提供足够能量的能源中，以从质量标签产生质量代码。电离后，可以使用检测方法诸如质谱来检测质量代码。在一些实施例中，将样品暴露于包含酶特异性结合部分缀合物的第一溶液和包含质量标签前体缀合物的第二溶液。酶特异性结合部分的酶部分可以选自氧化还原酶(例如过氧化物酶)、磷酸酶(例如碱性磷酸酶)、内酰胺酶(例如β-内酰胺酶)和半乳糖苷酶(例如β-D-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶)。特异性结合部分可以选自蛋白质、多肽、寡肽、肽、核酸、DNA、RNA、寡糖、多糖及其单体。特定的公开实施例涉及使用碱性磷酸酶-抗体缀合物和辣根过氧化物酶-抗体缀合物。在一些公开的实施例中，特异性结合部分识别靶。在其他公开的实施例中，特异性结合部分识别与靶结合的一抗。在一些实施例中，沉积质量标签包括将酶固定在靶处，并使样品与酶底物部分和质量标签前体接触。酶底物部分与酶和质量标签前体反应以在靶上产生和沉积质量标签。当样品中存在两个或多个靶时，质量标签按上述顺序沉积在每个靶上。在沉积质量标签之后，在随后的靶处沉积随后的质量标签之前，使对应的酶失活。在其他公开的实施例中，酶与质量标签前体-酪胺缀合物或质量标签前体-酪胺衍生物缀合物反应，以将质量标签通常共价地沉积在接近靶处。在一些实施例中，将酶固定在靶标处包括使样品与包含特异性结合部分和酶的缀合物接触。在某些实施例中，特异性结合部分是抗体。特异性结合部分能够识别并直接结合至靶或先前与靶结合的另一个特异性结合部分。在特定实施例中，第一酶、第二酶和任何另外的酶是相同的。参见WO2012003478，其全文以引用方式并入本文。
DNA甲基化检测
近年来，已经提出了通过测量DNA甲基化来诊断癌症的方法。DNA甲基化主要发生在特异性基因启动子区域中的CpG岛的胞嘧啶上，以干扰转录因子的结合，从而使基因表达沉默。因此，检测肿瘤抑制基因启动子中的CpG岛的甲基化对癌症研究有很大帮助。近年来，已积极尝试通过诸如甲基化特异性PCR(以下称为MSP)或自动DNA测序等方法来确定启动子甲基化，用于癌症的诊断和筛查。参见WO2009069984A2，其全文以引用方式并入本文。
声能
至少一些实施例涉及用于分析标本的方法和系统。可以根据标本的性质对其进行分析。这些性质包括在加工期间可以是静态或动态的声学性质、机械性质、光学性质等。在一些实施例中，在处理期间连续或定期地监测标本的性质以评估标本的状态和状况。基于获得的信息，可以控制处理以增强处理一致性、减少处理时间、提高处理质量等。声学可用于分析软物体，诸如样品。当声学信号与样品相互作用时，传输的信号取决于样品的几种机械性质，诸如弹性和坚固性。随着已放入固定剂(例如福尔马林)中的样品的交联程度变得更高，传输速度将根据样品的性质而变。在一些实施例中，可以基于声波的飞行时间来监测生物学样品的状态。状态可以是密度状态、固定状态、染色状态等。监测可以包括但不限于测量样品密度、交联、脱钙、染色等的变化。生物学样品可以是非流体样品，诸如骨骼，或其他类型的样品。在一些实施例中，方法和系统涉及使用声能来监测标本。基于反射模式和/或传输模式中的声能之间的相互作用，可以获得关于标本的信息。可以进行声学测量。测量的示例包括样品中的声信号幅度、衰减、散射、吸收、飞行时间(TOF)、声波的相移或其组合。在一些实施例中，标本的性质在处理期间改变。在一些实施例中，将固定剂施加到标本。随着标本变得更加固定，机械性质(例如弹性、刚度等)由于分子交联而发生变化。可以通过TOF使用声速测量来监测这些变化。基于测量结果，可以确定标本的固定状态或其他组织学状态。为了避免固定不足或固定过度，可以监测样品的静态特征、样品的动态特征或两者。样品的特征包括透射特征、反射特征、吸收特征、衰减特征等。在某些实施例中，用于评估样品的方法包括在样品处理之前、期间和/或之后分析声波速度。这是通过首先通过将声波从发射器输送到取自受试者的样品来为新鲜的、未固定的样品建立基线测量而实施的。使用接收器检测基线TOF声波。在处理样品之后或期间，第二个声波从发射器输送到样品。在第二个声波穿过样品后，使用接收器检测第二个TOF声波。基于第一个TOF和第二个TOF比较样品中的声速以确定速度的变化。这些测量对于所分析的每个样品而言可能是唯一的，并因此用于为每个样品建立基线。附加的TOF测量可用于确定可归因于介质、测量通道等的TOF贡献。在一些实施例中，当不存在标本时测量介质的TOF以确定介质的基线TOF。参见WO2011109769，其全文以引用方式并入本文。
脂质组学
脂质组学研究涉及数千种细胞脂质分子物质及其与其他脂质、蛋白质和其他代谢物的相互作用的鉴定和定量。在脂质组学中，研究人员检查细胞脂质的结构、功能、相互作用和动力学以及系统扰动期间发生的变化。脂质组学分析技术可以包括质谱(MS)、核磁共振(NMR)光谱、荧光光谱、双偏振干涉测量和计算方法。在脂质组学研究中，定量地描述不同脂质分子物质的含量和组成的时空变化的数据是在细胞受到扰动后通过其生理或病理状态的变化产生的。从这些研究中获得的信息有助于深入了解细胞功能的变化。
免疫细胞的定量
通过使用基于表观遗传的定量实时PCR辅助细胞计数(qPACC)，可以对样品中的免疫细胞进行定量。活跃表达或沉默的基因的染色质结构的甲基化状态是基于表观遗传的细胞鉴定和定量技术的基础。从二核苷酸胞嘧啶磷酸鸟嘌呤中胞嘧啶碱基的5′-碳中特异性地去除甲基(去甲基化)的细胞类型的发现，允许仅从少量人类血液或组织样品中精确且稳健地定量免疫细胞。这些位于基因组DNA上的表观遗传生物标志物与目标细胞稳定地相关。Kleen和Yuan(2015年11月).“Quantitative real-time PCR assisted cell counting(qPACC)for epigenetic-based immune cell quantification in blood and tissue”.J.Immunother.Cancer 46(3).
癌症相关标志物的检测
使用诸如但不限于RNA、DNA或蛋白质测序的技术检测“肿瘤标志物”，包括但不限于与癌症的存在相关的蛋白质、抗原、酶、激素、DNA突变和碳水化合物，对于正确诊断癌症类型和选择适当的治疗方法具有重要意义。此类标志物包括但不限于：甲胎蛋白(通常与生殖细胞肿瘤和肝细胞癌相关，但不限于此)、CA 15-3(通常与乳腺癌相关，但不限于此)、CA27-29(通常与乳腺癌相关，但不限于此)、CA19-9(通常与前列腺癌、结直肠癌和其他类型的胃肠道癌相关，但不限于此)、CA-125(通常与卵巢癌、子宫内膜癌、输卵管癌、肺癌、乳腺癌和胃肠道癌相关，但不限于此)、降钙素(通常与甲状腺髓样癌相关，但不限于此)、钙结合蛋白(通常与间皮瘤、性腺-性腺间质瘤、肾上腺皮质癌、滑膜肉瘤相关，但不限于此)、癌胚抗原(通常与胃肠道癌、宫颈癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、泌尿道癌相关，但不限于此)、CD34(通常与血管外皮细胞瘤/孤立性纤维性肿瘤、多形性脂肪瘤、胃肠道间质瘤、隆凸性皮肤纤维肉瘤相关，但不限于此)、CD99MIC 2(通常与Ewing肉瘤、原始神经外胚层肿瘤、血管外皮细胞瘤/孤立性纤维瘤、滑膜肉瘤、淋巴瘤、白血病、性腺-性腺间质瘤相关，但不限于此)、CD117(通常与胃肠道间质瘤、肥大细胞增多症、精原细胞瘤相关，但不限于此)、嗜铬粒蛋白(通常与神经内分泌瘤相关，但不限于此)、染色体3、7、17和9p21(通常与膀胱癌相关，但不限于此)、多种类型的细胞角蛋白(通常与很多类型的癌和一些类型的肉瘤相关，但不限于此)、肌间线蛋白(通常与平滑肌肉瘤、骨骼肌肉瘤和子宫内膜间质肉瘤相关，但不限于此)、上皮膜抗原(通常与多种类型的癌、脑膜瘤和一些类型的肉瘤相关，但不限于此)、因子VIII/CD31FL1(通常与血管肉瘤相关，但不限于此)、胶质原纤维酸性蛋白(通常与神经胶质瘤(星形细胞瘤、室管膜瘤)相关，但不限于此)、巨囊性病液体蛋白(通常与乳腺癌、卵巢癌和唾液腺癌相关，但不限于此)、HMB-45(通常与黑色素瘤、PEComa(例如血管平滑肌脂肪瘤)、透明细胞癌、肾上腺皮质癌相关，但不限于此)、人绒毛膜促性腺激素(通常与妊娠滋养细胞疾病、生殖细胞肿瘤和绒毛膜癌相关，但不限于此)、免疫球蛋白(通常与淋巴瘤、白血病相关，但不限于此)、抑制素(通常与性腺间质瘤、肾上腺皮质癌、成血管细胞瘤相关，但不限于此)、多种类型的角蛋白(通常与癌、一些类型的肉瘤相关，但不限于此)、多种类型的淋巴细胞标志物(通常与淋巴瘤、白血病相关，但不限于此)、MART-1(Melan-A)(通常与黑色素瘤、产类固醇性肿瘤(肾上腺皮质癌、性腺肿瘤)相关，但不限于此)、Myo D1(通常与横纹肌肉瘤、小的、圆的、蓝色细胞肿瘤相关，但不限于此)、肌肉特异性肌动蛋白(MSA)(通常与肌肉瘤(平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤)相关，但不限于此)、神经丝(通常与神经内分泌瘤、肺的小细胞癌相关，但不限于此)、神经元特异性烯醇化酶(通常与神经内分泌瘤、肺的小细胞癌、乳腺癌相关，但不限于此)、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)(通常与精原细胞瘤、无性细胞瘤、胚胎癌相关，但不限于此)、前列腺特异性抗原(通常与前列腺癌相关，但不限于此)、PTPRC(CD45)(通常与淋巴瘤、白血病、组织细胞肿瘤相关，但不限于此)、S100蛋白(通常与黑色素瘤、肉瘤(神经肉瘤、脂肪瘤、软骨肉瘤)、星形细胞瘤、胃肠道间质瘤、唾液腺癌、一些类型的腺癌、组织细胞肿瘤(树突细胞、巨噬细胞)相关，但不限于此)、平滑肌肌动蛋白(SMA)(通常与胃肠道间质瘤、平滑肌肉瘤、PEComa相关，但不限于此)、突触素(通常与神经内分泌瘤相关，但不限于此)、甲状腺球蛋白(通常与甲状腺癌的术后标志物相关，但不限于此)、甲状腺转录因子-1(通常与所有类型的甲状腺癌、肺癌相关，但不限于此)、肿瘤M2-PK(通常与结直肠癌、乳腺癌、肾细胞癌、肺癌、胰腺癌、食道癌、胃癌、宫颈癌、卵巢癌相关，但不限于此)、波形蛋白(通常与肉瘤、肾细胞癌、子宫内膜癌、肺癌、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤相关，但不限于此)、ALK基因重排(通常与非小细胞肺癌和间变性大细胞淋巴瘤相关，但不限于此)、β-2-微球蛋白(B2M)(通常与多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病和一些淋巴瘤相关，但不限于此)、β-人绒毛膜促性腺激素(Beta-hCG)(通常与绒毛膜癌和生殖细胞肿瘤相关，但不限于此)、BRCA1和BRCA2基因突变(通常与卵巢癌相关，但不限于此)、BCR-ABL融合基因(费城染色体)(通常与慢性粒细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病和急性骨髓性白血病相关，但不限于此)、BRAF V600突变(通常与皮肤黑色素瘤和结直肠癌相关，但不限于此)、CD20(通常与非霍奇金淋巴瘤相关，但不限于此)、嗜铬粒蛋白A(CgA)(通常与神经内分泌瘤相关，但不限于此)、上皮起源的循环肿瘤细胞
Figure BDA0003468533170001411
(通常与转移性乳腺、前列腺和结直肠癌相关，但不限于此)、细胞角蛋白片段21-1(通常与肺癌相关，但不限于此)、EGFR基因突变分析(通常与非小细胞肺癌相关，但不限于此)、雌激素受体(ER)/孕激素受体(PR)(通常与乳腺癌相关，但不限于此)、HE4(通常与卵巢癌相关，但不限于此)、KRAS基因突变分析(通常与结直肠癌和非小细胞肺癌相关，但不限于此)、乳酸脱氢酶(通常与生殖细胞中流、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤和成神经细胞瘤相关，但不限于此)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)(通常与小细胞肺癌和成神经细胞瘤相关，但限于此)、核基质蛋白22(通常与膀胱癌相关，但不限于此)、程序性死亡配体1(PD-L1)(通常与非小细胞肺癌相关，但不限于此)、尿激酶纤溶酶原活化因子(uPA)和纤溶酶原活化抑制因子(PAT-1)(通常与乳腺癌相关，但不限于此)、5-蛋白签名
Figure BDA0003468533170001421
(通常与卵巢癌相关，但不限于此)、21-基因签名(Oncotype
Figure BDA0003468533170001422
)(通常与乳腺癌相关)、70-基因签名
Figure BDA0003468533170001423
(通常与乳腺癌相关，但不限于此)和HER2/neu基因扩增或过表达(通常与乳腺癌、卵巢癌、食管-胃结合部腺癌、胃癌、非小细胞肺癌和子宫癌相关，但不限于此)。与肿瘤相关的额外的生物标志物可以包括但不限于：Pl3KCA突变、FGFR2扩增、p53突变、BRCA突变、CCND1扩增、MAP2K4突变、ATR突变或其表达与特定癌症相关的任何其他生物标志物；AFP、ALK、BCR-ABL、BRCA1/BRCA2、BRAF、V600E、Ca-125、CA19.9、EGFR、Her-2、KIT、PSA、S100、KRAS、ER/Pr、UGT1A1、CD30、CD20、F1P1L1-PDGRFα、PDGFR、TMPT和TMPRSS2中的至少一者；或选自以下项的至少一种生物标志物：ABCB5、AFP-L3、甲胎蛋白、α-甲基乙酰辅酶A消旋酶、BRCA1、BRCA2、CA 15-3、CA 242、Ca27-29、CA-125、CA15-3、CA19-9、降钙素、癌胚抗原、癌胚抗原肽-1、脱-γ-羧基凝血酶原、早期前列腺癌抗原-2、雌激素受体、纤维蛋白降解产物、葡萄糖-6-磷酸酯异构酶、HPV抗原(诸如vE6、E7、L1、L2或p16INK4a)、人绒毛膜促性腺激素、IL-6、角蛋白19、乳酸脱氢酶、亮氨酰氨肽酶、促脂解素、变肾上腺素类物质、脑啡肽酶、NMP22、去甲变肾上腺素、PCA3、前列腺特异性抗原、前列腺酸性磷酸酶、突触素、甲状腺球蛋白、TNF、选自ERG、ETV1(ER81)、FLI1、ETS1、ETS2、ELK1、ETV6(TEL1)、ETV7(TEL2)、GABPα、ELF1、ETV4(E1AF；PEA3)、ETV5(ERM)、ERF、PEA3/E1AF、PU.1、ESE1/ESX、SAP1(ELK4)、ETV3(METS)、EWS/FLI1、ESE1、ESE2(ELF5)、ESE3、PDEF、NET(ELK3；SAP2)、NERF(ELF2)或FEV的转录因子。XXX，肿瘤相关糖蛋白72、c-kit、SCF、pAKT、pc-kit和波形蛋白。替代性地或此外，目标生物标志物可以是免疫检查点抑制剂，诸如但不限于CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、KIR、TIM3、GAL9、GITR、LAG3、VISTA、KIR、2B4、TRPO2、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、TL1A和B-7家族配体或其组合，或者是选自由以下所组成的组中的检查点蛋白的配体：CTLA-4、PDL1、PDL2、PD1、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD160、CGEN-15049、CHK1、CHK2、A2aR、B-7家族配体，或其组合。额外的标志物可以包括但不限于检测至少一种与以下项相关的生物标志物：急性成淋巴细胞性白血病(etv6、am11、亲环蛋白b)、B细胞淋巴瘤(Ig-独特型)、神经胶质瘤(E-钙粘蛋白、α-连环蛋白、β-连环蛋白、γ-连环蛋白、p120cm)、膀胱癌(p21ras)、胆道癌(p21ras)、乳腺癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、宫颈癌(p53、p21ras)、结肠癌(p21ras、HER2/neu、c-erbB-2、MUC家族)、结直肠癌(结直肠相关抗原(CRC)-C017-1A/GA733、APC)、绒毛膜癌(CEA)、上皮细胞癌(亲环蛋白b)、胃癌(HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白)、肝细胞癌(甲胎蛋白)、霍奇金淋巴瘤(Imp-1、EBNA-1)、肺癌(CEA、MAGE-3、NY-ESO-1)、淋巴样细胞源性白血病(亲环蛋白b)、黑色素瘤(p5蛋白、gp75、癌胎抗原、GM2和GD2神经节苷脂、Melan-A/MART-1、cdc27、MAGE-3、p21ras、gp100.sup.Pmel1l7)、骨髓瘤(MUC家族、p21ras)、非小细胞肺癌(HER2/neu、c-erbB-2)、鼻咽癌(Imp-1、EBNA-1)、卵巢癌(MUC家族、HER2/neu、c-erbB-2)、前列腺癌症(前列腺特异性抗原(PSA)及其抗原表位PSA-1、PSA-2和PSA-3、PSMA、HER2/neu、c-erbB-2、ga733糖蛋白)、肾癌(HER2/neu、c-erbB-2)、宫颈和食道鳞状细胞癌(病毒产物，诸如人乳头瘤病毒蛋白)、睾丸癌(NY-ESO-1)和/或T细胞白血病(HTLV-1表位)。
现在已知精确靶向激酶级联的特定方面向疾病治疗提供以前无法实施的突破。由于激酶活性失调引起的众多疾病状态强调了蛋白激酶家族的重要性。许多这些蛋白质和脂质激酶造成的异常细胞信号传导可导致疾病，诸如癌症。已知几种蛋白质丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸激酶在癌细胞中被活化并驱动肿瘤生长和进展。本文所述的技术提供了利用一种或多种激酶捕获剂富集(或分离)激酶例如ATP依赖性激酶的方法。激酶捕获剂的示例包括但不限于，相对非选择性的蛋白激酶抑制剂、底物或假底物。例如，这些方法可用于通过串联质谱法对激酶组进行谱分析。尽管如上文所述，先前已经鉴定了许多高度选择性和有效的小分子激酶抑制剂，但也鉴定了大量相对非选择性的小分子激酶抑制剂。对于本文所述的方法，使用相对非选择性的小分子激酶抑制剂减少了为单个激酶定制纯化程序的需要，并放大了通过富集正常情况下仅以催化浓度存在于细胞、组织和体液中的酶而获得的分析信号。然而，将认识到选择性小分子激酶抑制剂也可用于这些激酶分析方法。此外，非选择性和选择性小分子激酶抑制剂的组合可用于这些方法。此外，一种激酶捕获剂(或一种以上激酶捕获剂)也可以与磷酸酶捕获剂组合以同时富集(或分离)激酶和磷酸酶。本文所述的方法还可以应用于通过串联质谱法对来自单个或多个标靶的蛋白激酶和/或磷酸酶进行多重分析。本文描述的技术提供了一种用于分析激酶群例诸如激酶组的方法。该方法包括使用一种或多种激酶捕获剂从样品中分离激酶，将蛋白质样品蛋白水解消化成组成肽(例如用蛋白酶，诸如胰蛋白酶)，用与包含易裂天冬氨酸-脯氨酸(DP)键的特定蛋白激酶肽序列相关的合理设计的校准肽补充所获得的肽，并通过串联质谱法定量源自激酶群的天然肽。参见WO2007131191，其全文以引用方式并入本文。
特定细胞类型的亲和纯化
现在已经在包括AML、CML、多发性骨髓瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、黑色素瘤和前列腺癌、结肠癌和胃癌在内的多种人类肿瘤中报道了推定的循环肿瘤细胞。原则上，循环肿瘤细胞可以通过几种实验策略来鉴定。许多循环肿瘤细胞似乎表达细胞表面标志物，该细胞表面标志物鉴定其正常对应物。这种观察结果提供了一种相对简单的富集程序，利用基于流式细胞术的细胞分选或基于微珠的细胞亲和纯化进行富集。参见Schawb，M.Encyclopediaof Cancer，第3版，Springer-Verlag Berlin Heidelberg，2011。
DNA测序
在进一步的示例性实施例中，可以对样品或其一个或多个细胞进行DNA测序。DNA测序可以靶向例如特定基因、区域、调控序列、内含子、外显子、SNP、潜在融合等，例如以检测与癌症相关或与其诊断有关的序列。也可以对整个基因组或其重要部分执行DNA测序。可以利用的示例性测序方法包括但不限于：桑格测序和染料终止剂测序，以及下一代测序(NGS)技术，诸如焦磷酸测序、纳米孔测序、基于微孔的测序、纳米球测序、MPSS、SOLID、Solexa、Ion Torrent、Starlite、SMRT、tSMS、合成法测序、连接法测序、质谱测序、聚合酶测序、RNA聚合酶(RNAP)测序、基于显微镜的测序、微流控桑格测序、基于显微镜的测序、RNAP测序、隧道电流DNA测序和体外病毒测序。参见WO2014144478、WO2015058093、WO2014106076和WO2013068528，它们各自通过引用全文并入本文。
DNA测序技术呈指数级发展。最近，高通量测序(或下一代测序)技术将测序过程并行化，一次产生数千或数百万个序列。在超高通量测序中，可以并行运行多达500，000次合成法测序操作。与行业标准染料终止剂方法相比，下一代测序降低了成本并大大提高了速度。
焦磷酸测序在油溶液中扩增水滴内的DNA(乳液PCR)，其中每个液滴都含有一个DNA模板，该模板附着在单个包被有引物的珠上，然后形成克隆集落。测序机器包含许多皮升体积的孔，每个孔都包含单个珠和测序酶。焦磷酸测序使用荧光素酶生成光来检测添加到新生DNA中的单个核苷酸，并使用组合数据生成序列读数。见Margulies，M等人2005，Nature，437，376-380，其全文以引用方式并入本文。焦磷酸测序是一种合成法测序技术，它也利用焦磷酸测序。DNA的焦磷酸测序包括两个步骤。在第一步中，将DNA剪切成大约300-800个碱基对的片段，并将片段平端化。然后将寡核苷酸衔接子连接到片段的末端。衔接子用作对片段进行扩增和测序的引物。可以使用例如包含5′-生物素标签的衔接子B将片段连接到DNA捕获珠例如链霉亲和素包被的珠。附着在珠的片段在油水乳液的液滴内进行PCR扩增。结果是每个珠上都有克隆扩增的DNA片段的多个拷贝。在第二步中，珠被捕获在孔中(皮升大小)。对每个DNA片段并行进行焦磷酸测序。添加一个或多个核苷酸生成光信号，该信号由测序仪器中的CCD相机记录。信号强度与并入的核苷酸数量成正比。焦磷酸测序利用在添加核苷酸时释放的焦磷酸酯(PPi)。在腺苷5′磷硫酸酯存在下，PPi被ATP硫酸化酶转化为ATP。荧光素酶使用ATP将荧光素转化为氧化荧光素，该反应生成的光可被检测和分析。在另一个实施例中，焦磷酸测序用于测量基因表达。RNA焦磷酸测序的应用类似于DNA焦磷酸测序，它是通过将部分rRNA基因测序应用程序附加到微珠上，然后将附着体放入单个孔中来实施的。然后扩增附着的部分rRNA序列以确定基因表达谱。Sharon Marsh，
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Protocols in Methods in Molecular Biology，Vol.373，15-23(2007)。
可以使用的测序技术的另一个示例是纳米孔测序(Soni G V和Meller，A ClinChem53∶1996-2001，2007，其全文以引用方式并入本文)。纳米孔是一个小孔，直径约为1纳米数量级。纳米孔浸入导电流体中并在所述各处纳米孔上施加电势，由通过纳米孔的离子的传导产生少量电流。流动的电流量对纳米孔的大小敏感。当DNA分子穿过纳米孔时，DNA分子上的每个核苷酸都不同程度地阻塞纳米孔。因此，当DNA分子穿过纳米孔时，穿过纳米孔的电流的变化代表了对DNA序列的读取。参见Bayley，Clin Chem.2015Jan；61(1)：25-31，其全文以引用方式并入本文。
可以使用的DNA和RNA检测技术的另一个示例是SOLiDTM技术(AppliedBiosystems)。SOLiDTM技术系统是一种基于连接的测序技术，可用于对DNA和RNA进行大规模并行的下一代测序。在DNA SOLiDTM测序中，基因组DNA被剪切成片段，并将衔接子连接到片段的5′和3′端以生成片段文库。替代性地，可以通过将衔接子连接到片段的5′和3′末端，将片段环化，消化环化的片段以生成内部衔接子，并将衔接子连接到所得片段的5′和3′末端以生成配偶配对文库。接下来，在包含珠、引物、模板和PCR部件的微反应器中制备克隆珠群。PCR之后，模板被变性，珠被富集以分离带有扩展的模板的珠。选定的珠上的模板经过3′修饰，允许与载玻片键合。序列可以通过部分随机寡核苷酸与由特异性荧光团鉴定的中心确定碱基(或碱基对)的顺序杂交和连接来确定。记录颜色后，将连接的寡核苷酸裂解并去除，然后重复该过程。
在其他实施例中，SOLiDTM基因表达系列分析(SAGE)用于测量基因表达。基因表达系列分析(SAGE)是一种允许同时对大量基因转录物进行定量分析的方法，无需为每个转录物提供单独的杂交探针。首先，生成一个短序列标签(约10-14bp)，其包含足够的信息来唯一地鉴定转录物，前提是该标签是从每个转录物中的唯一位置获得的。然后，许多转录物连接在一起形成长序列分子，可以对其进行测序，同时揭示多个标签的身份。可以通过确定单个标签的丰度并鉴定对应于每个标签的基因来定量评估任何转录物群体的表达模式。关于更多细节，参见例如Velculescu等人，Science 270：484 487(1995)；和Velculescu等人，Cell 88：243 51(1997年，每个文献的内容通过引用全文并入本文)。
可以使用的另一种测序技术包括，例如，Helicos True Single MoleculeSequencing(tSMS)(Harris T.D.等人(2008)Science 320：106-109)。在tSMS技术中，DNA样品被裂解成大约100到200个核苷酸的链，并在每条DNA链的3′末端添加一个polyA序列。每条链都通过添加荧光标记的腺苷核苷酸进行标记。然后将DNA链与流动槽杂交，该流动槽包含数百万个固定在流动槽表面的oligo-T捕获位点。模板可以具有大约1亿个模板/cm的密度。然后将流动槽加载到仪器例如HeliScope测序仪中，并且激光照射流动槽表面，显示每个模板的位置。CCD相机可以映射模板在流动槽表面上的位置。然后将模板荧光标记裂解并洗掉。测序反应开始于引入DNA聚合酶和荧光标记的核苷酸。oligo-T核酸用作引物。聚合酶以模板导向的方式将标记的核苷酸并入引物中。去除聚合酶和未并入的核苷酸。通过对流动槽表面成像来检测已定向并入荧光标记的核苷酸的模板。成像后，裂解步骤去除荧光标签，并用其他荧光标记的核苷酸重复该过程，直到达到所需的读取长度。每个核苷酸添加步骤都收集序列信息。例如，在以下文献中显示了对tSMS的进一步描述：Lapidus等人(美国专利号7,169,560)、Lapidus等人(美国专利申请号2009/0191565)、Quake等人(美国专利号6,818,395)、Harris(美国专利号7,282,337)、Quake等人(美国专利申请号2002/0164629)和Braslavsky等人，PNAS(USA)，100：3960-3964(2003)，其各自通过引用全文并入本文。
可以使用的测序技术的另一个示例包括Pacific Biosciences的单分子实时(SMRT)技术来对DNA和RNA进行测序。在SMRT中，四种DNA碱基中的每一种都连接到四种不同的荧光染料之一。这些染料是磷连接的。单个DNA聚合酶用单个的模板单链DNA分子固定在零模波导(ZMW)底部。ZMW是一种限制结构，它能够在荧光核苷酸的背景下观察通过DNA聚合酶进行的单个核苷酸的并入，荧光核苷酸快速地扩散进出ZMW(以微秒为单位)。将一个核苷酸并入不断增长的链中需要几毫秒的时间。在此期间，荧光标签被激发并产生荧光信号，并且荧光标记被裂解掉。染料对应荧光的检测指示并入了哪种碱基。重复该过程。为了对RNA进行测序，在ZMW中将DNA聚合酶替换为逆转录酶，并相应地遵循该过程。
可包括的测序技术的另一个示例使用化学敏感场效应晶体管(chemFET)阵列对DNA进行测序(例如，如美国专利申请公开号20090026082中所述)。在该技术的一个示例中，可以将DNA分子置于反应室中，并且可以将模板分子与结合至聚合酶的测序引物杂交。将一种或多种三磷酸酯并入测序引物的3′末端处的新核酸链中的过程可通过电流的改变通过chemFET来检测。一个阵列可以有多个chemFET传感器。在另一个示例中，单个核酸可以附着到珠上，并且可以在珠上扩增核酸，并且可以将单独的珠转移到chemFET阵列上的单独反应室，其中每个室具有chemFET传感器，并且可以对核酸进行测序。
可以使用的测序技术的另一个示例包括使用电子显微镜(Moudrianakis E.N.和Beer M.Proc Natl Acad Sci USA.1965March；53：564-71)。在该技术的一个示例中，使用电子显微镜可区分的金属标签来标记单个DNA分子。然后将这些分子在平面上拉伸并使用电子显微镜成像以测量序列。
DNA纳米球测序是一种类型的高通量测序技术，用于确定生物体的整个基因组序列。该方法使用滚环复制将基因组DNA的小片段扩增成DNA纳米球。然后使用通过连接进行的非链式测序来确定核苷酸序列。这种DNA测序方法允许每次运行对大量DNA纳米球进行测序。参见WO2014122548和Drmanac等人，Science.2010Jan 1；327(5961)：78-81；Porreca，Nat Biotechnol.2010Jan；28(1)：43-4，其各自通过引用全文并入本文。
大规模并行签名测序(MPSS)是较早的下一代测序技术之一。MPSS使用复杂的衔接子连接方法，然后进行衔接子解码，以四个核苷酸为增量读取序列。
Polony测序将体外配对标签文库与乳液PCR、自动显微镜和基于连接的测序化学组合，对大肠杆菌基因组进行测序。该技术也被整合到Applied Biosystems SOLiD平台中。
在Solexa测序中，首先将DNA分子和引物附着在载玻片上并用聚合酶进行扩增，从而形成最初称为“DNA集落”的局部克隆集落。为了确定序列，添加了四种类型的可逆终止子碱基(RT-碱基)并洗掉未并入的核苷酸。与焦磷酸测序不同，DNA链一次延伸一个核苷酸，图像采集可以在延迟的时刻进行，从而允许通过从单个相机拍摄的连续图像捕获大量的DNA集落。
SOLiD技术采用连接法测序。在这里，根据测序的位置标记了所有可能的固定长度寡核苷酸的集合。
将寡核苷酸退火并连接；通过DNA连接酶进行匹配序列的优先连接在该位置处产生核苷酸的信号信息。在测序之前，通过乳液PCR扩增DNA。所得的珠沉积在玻璃载玻片上，其中每个珠都含有相同DNA分子的单个拷贝。结果是数量和长度与Solexa测序相当的序列。
在Ion TorrentTM测序中，将DNA剪切成大约300-800个碱基对的片段，并将片段平端化。然后将寡核苷酸衔接子连接到片段的末端。衔接子用作对片段进行扩增和测序的引物。片段可以附着在表面上，并以一定的分辨率附着，使得片段可以单独解析。添加一个或多个核苷酸释放了质子(H+)，该信号在测序仪器中被检测和记录。信号强度与并入的核苷酸数量成正比。Ion Torrent数据也可以作为FASTQ文件输出。见美国公布号2009/0026082、2009/0127589、2010/0035252、2010/0137143、2010/0188073、2010/0197507、2010/0282617、2010/0300559、2010/0300895、2010/0301398和2010/0304982，其各自的全部内容以引用方式并入本文。
检测癌症相关融合蛋白
融合基因可以促进肿瘤的形成，因为融合基因可以比非融合基因产生活跃得多的异常蛋白质。通常，融合基因是引起癌症的致癌基因；这些包括BCR-ABL、TEL-AML1(具有t(12；21)的ALL)、AML1-ETO(具有t(8；21)的M2 AML)和TMPRSS2-ERG(在21号染色体上有间质缺失，通常在前列腺癌中出现)。在TMPRSS2-ERG的情况下，通过破坏雄激素受体(AR)信号传导并通过致癌ETS转录因子抑制AR表达，融合产物调节前列腺癌。大多数融合基因见于血液学癌症、肉瘤和前列腺癌。致癌融合基因可能导致基因产物具有新的或与两个融合配偶体不同的功能。替代性地，原癌基因与强启动子融合，因此致癌功能被设置为通过由上游融合配偶体的强启动子引起的上调发挥作用。后者常见于淋巴瘤中，其中致癌基因与免疫球蛋白基因的启动子并列。致癌融合转录物也可能由反式剪接或通读事件引起。某些染色体畸变及其产生的融合基因的存在通常用于癌症诊断中，以进行精确的诊断。染色体显带分析、荧光原位杂交(FISH)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)是诊断实验室用于鉴定癌症相关融合蛋白的常用方法。
检测化疗耐药标志物
耐药性是恶性肿瘤化疗失败的原因，耐药性要么是预先存在的(内在耐药性)，要么是由药物引起的(获得性耐药性)。耐药标志物的检测基于但不限于：通过免疫组织化学和流式细胞术鉴定癌相关成纤维细胞；使用免疫组织化学染色鉴定醛脱氢酶1、裂解的半胱天冬酶3、环氧合酶2、磷酸化的Akt、Ki-67和H2AX蛋白；通过全基因组阵列比较基因组杂交鉴定的P-糖蛋白表达，透明质酸(细胞外基质的主要糖胺聚糖成分)，3q26.2的增益以及6q11.2-12、9p22.3、9p22.2-22.1、9p22.1-21.3、Xp22.2-22.12、Xp22.11-11.3和Xp11.23-11.1的损失；通过免疫染色鉴定的LRP过表达；使用RNA测序鉴定的HGF和c-MET，它们是与microRNA MiR-193a-5p相关的基因产物；通过细胞分选鉴定的CD44过表达；以及鉴定曲古抑菌素A，一种有效的组蛋白脱乙酰酶抑制剂。化疗耐药性标志物通常可以采取蛋白质过表达的形式，使用诸如但不限于DNA测序、RNA测序和蛋白质测序的技术在任一/或DNA、RNA或蛋白质水平上鉴定这种过度表达。一些化疗耐药性标志物采取表观遗传变化的形式，通过DNA焦磷酸测序鉴定这些改变特别可用于鉴定化疗耐药性标志物。此外，基因突变可以直接影响基因产物的表达，可能导致癌细胞的形成，并且通过DNA测序鉴定基因突变具有很高的实用性。目前，耐药性通常是在长期给药后在治疗期间诊断出来的。目前存在快速评估耐药性的方法。通常使用三类测试程序：新鲜肿瘤细胞培养物测试、癌症生物标志物测试和正电子发射断层扫描(PET)测试。耐药性可以在体外治疗前通过新鲜肿瘤细胞培养物测试进行诊断，在体内治疗一段时间后通过PET测试进行诊断。参见Lippert，T.等人(2011).“Current status of methods to assess cancer drug resistance”.Int.J.Med.Sci.8(3)：245-253。
使用代表性样品生产肿瘤特异性抗原或肿瘤特异性抗体和抗肿瘤疫苗
如上所述，受试样品的另一个应用是用于分离肿瘤细胞和源自其的抗原，该抗原可用于生产肿瘤特异性抗体或用于制造癌症或肿瘤疫苗。
癌症疫苗接种的一种方法是从癌细胞中分离蛋白质，并针对这些蛋白质对癌症患者进行免疫，以期刺激将会杀死癌细胞的免疫反应。正在开发用于治疗乳腺癌、肺癌、结肠癌、皮肤癌、肾癌、前列腺癌和其他癌症的治疗性癌症疫苗。事实上，Dendreon Corporation开发的一种用于治疗前列腺癌的这种疫苗于2010年4月29日获得美国食品和药物管理局(FDA)的批准，可用于治疗晚期前列腺癌患者。这种疫苗
Figure BDA0003468533170001511
的批准刺激人们对这种疗法重新燃起兴趣。
例如，肿瘤细胞或源自已鉴定的肿瘤细胞的蛋白水解裂解的细胞表面抗原可用于开发有效的治疗性或预防性肿瘤疫苗。这些抗原可以是裸露的或多聚化的或缀合到其他部分例如其他蛋白质、佐剂，或加载到细胞例如树突细胞上。已经表明，活癌细胞的蛋白水解治疗可以释放抗原靶，这些抗原靶足以在体外诱导超过未经治疗的癌细胞的抗癌免疫反应。(Lokhov等人，J Cancer 20101：230-241)。
具体而言，包含一种源自从特定患者样品分离的肿瘤细胞的不同抗原或其混合液的肿瘤疫苗被考虑在内，本质上是“个性化癌症疫苗”的生产，使得患者可以用对其特定肿瘤类型聚特异性的免疫刺激部分进行治疗。一般而言，这些疫苗将包含有效量的此类抗原以生成有效的免疫应答，例如针对表达特定抗原的肿瘤细胞的抗原特异性CTL应答。如上所述，在一些情况下，这些抗原可以加载到其他部分例如树突细胞。一般而言，此类疫苗还将包含其他免疫佐剂，例如细胞因子、TLR激动剂、TNF/R激动剂或拮抗剂、调节检查点抑制剂的药剂等。
而且，在一些实施例中，本公开进一步考虑使用此类抗原生产抗血清和单克隆抗体。这些抗体可用于诊断目的，即用于检测样品中的肿瘤细胞或抗原。替代性地，此类抗体，特别是对此类肿瘤抗原具特异性的人或人源化抗体，可治疗性地用于治疗表达这些抗原的癌症。制备可能用于疗法中的抗体的方法是本领域公知的。
实例
实例1：用于加速电泳的装置
用于加速电泳的装置一般使用同心或多边形盘架构，例如，如图1至图4所示。玻璃或陶瓷用于制造系统(即用于同心圆盘或多边形圆盘的材料)，因为这些材料使得传热性能提高，这在装置操作期间是有益的。例如，由于与窄通道相比，加速电泳装置的扁平通道具有良好的传热能力，因此一般可以防止聚焦材料的过热(或沸腾)。电流/电压编程也适用于调节装置的焦耳热。塑料材料也用于装置制造，例如聚丙烯、聚四氟乙烯(可作为
Figure BDA0003468533170001521
商购)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(“PMMA”)和/或聚二甲基硅氧烷(“PDMS”)等.一般而言，装置被制造成容纳所需样品体积的尺寸，例如毫升级样品体积，例如高达15mL。
参考图1至图3，两个同心盘由分隔物隔开，从而形成用于加速电泳样品处理的平坦通道。电流通过多个高压连接(HV连接)和系统中心的接地连接施加(例如，参见图1和图3)。在一些情况下，样品通过装置中的开口注入装置中，该开口例如在顶部或侧面(参见例如图3)。电的施加将样品的靶分析物聚焦为一个同心环，该环迁移到盘的中心(下文进一步讨论)，然后通过位于装置底部的注射器收集靶分析物(例如参见图3)。如图2A(顶视图)和图2B所示，优选的装置设置由外部圆形电极(1)、终止电解质(2)和前导电解质(3)组成。一般而言，外部圆形电极(1)的直径为约10-200mm，前导电解质的直径范围为约10μm至约20mm的厚度(高度)。前导电解质通过凝胶、粘性添加剂稳定，或以其他方式例如通过膜与终止电解质流体动力学分离。凝胶或流体动力分离可防止前导电解质与终止电解质在装置运行期间混合。而且，在一些装置中，通过使用非常薄(＜100um)的电解质层来防止混合，如下面的实例2中进一步讨论的。
参考图2A至图2B，在前导电解质的中心是带有电极(5)的电极池(4)。电极(1，5)和电解质(2，3)的组件放置在平坦的电绝缘支撑物(8)上。电解质池(4)用于在分离过程之后移除浓缩的样品溶液，诸如通过将样品重该池移液来移除。
在替代性布置中(参见图4)，中心电极(5)被移动到通过管(9)与浓缩器连接的前导电解质池(10)。管(9)通过半透膜(未示出)直接连接或在一端封闭。这种布置通过根据所用膜的性质阻止大分子的迁移来促进收集。这种布置简化了样品收集并提供了将浓缩器在线连接到其他装置的手段，该其他装置例如毛细管分析仪、色谱、PCR装置、酶促反应器等。管(9)还可以用于在没有包含前导电解质的凝胶的布置中供应前导电解质的逆流流动。
一般而言，用于前导电解质稳定的凝胶由任何不带电荷的材料例如琼脂糖、聚丙烯酰胺、支链淀粉等形成。在一些装置中，顶面是敞开的，或者在一些装置中，顶面是封闭的，这取决于要进行的分离的特性。如果闭合，则用于覆盖装置的材料优选地是导热绝缘材料，以防止在加速电泳装置操作期间的蒸发。
一般而言，环(圆形)电极最好是镀金或镀铂的不锈钢环，因为这可以实现最大的耐化学性和电场均匀性。替代性地，不锈钢和石墨电极可用于一些装置，特别是一次性装置。而且，环(圆形)电极可以用提供类似功能的其他部分代替，例如，线电极阵列。此外，规则间隔的电极的2维阵列可以附加地或替代性地用于加速电泳装置中。圆形定向的规则间隔电极阵列也可用于加速电泳装置中。此外，也可以使用其他电极配置来基于所希望的样品分离(例如，用于引导聚焦区)来实施不同的电场形状。此类配置被描述为电极的多边形布置。当分成电分离的段时，会产生一个开关电场，用于驱动电场的时间依赖性形状。在一些装置中，这种布置有利于样品收集。
实例2：加速电泳装置操作
加速电泳装置，例如具有图1至图4中呈现的设计的哪些，要么以两电解质池布置操作，其中前导电解质后面跟随着终止电解质混合的样品，或者与前导电解质混合的样品后跟随着终止电解质，要么以三电解质池布置操作，如图5所示。在这种布置中，样品可以与任何导电溶液混合。替代性地，当样品包含合适的终止离子时，终止电解质区可以被消除。参考图2A至图2B，在用样品与合适的终止电解质的混合物填充终止电解质池(2)并打开电源(6)后，离子开始朝着中心电极(5)移动并在前导电解质和终止电解质之间的边界处形成多个区(7)。迁移期间，样品区的浓度根据一般等速电泳原理进行调整[Foret，F.，Krivankova，L.，Bocek，P.，Capillary Zone Electrophoresis.ElectrophoresisLibrary，(Editor Radola，B.J.)VCH，Verlagsgessellschaft，Weinheim，1993.]。因此，低浓度的样品离子被浓缩，而高浓度的样品离子被稀释。一旦样品区进入电解质池(4)，分离过程就会停止，并且聚焦的物质被收集在装置的中心。实际上，迁移区的最终浓度与前导离子的浓度相当。通常，使用加速电泳法实现了2到1000或甚至更大的浓缩系数。
在三电解质池布置中，将样品施加在前导电解质和终止电解质之间(参见，例如，图5)，与两电解质池布置相比，这种布置使得样品浓缩和分离稍快。
为了避免混合，前导电解质和尾随电解质通过中性(不带电)粘性介质稳定，例如琼脂糖凝胶(参见例如图2A至图2B、3，其代表前导电解质任选地包含在凝胶内或与终止电解质流体动力学地分离)。
当前导离子具有比一种或多种目标样品离子更高的有效电泳迁移率时，本领域技术人员已知的用于等速电泳的所有常用电解质均可与本加速电泳装置一起使用。对于选定的终止离子，情况正好相反。
该装置以正离子模式(阳离子物质的分离/浓缩)或负离子模式(阴离子物质的分离/浓缩)操作。用于使用加速电泳进行阴离子分离的最常用前导电解质包括，例如，氯化物、硫酸根或甲酸根，用合适的碱例如组氨酸、TRIS、肌酸酐等缓冲至所希望的pH。用于进行阴离子分离的加速电泳的前导电解质的浓度相对于前导离子在5mM-1M的范围内。终止离子则通常包括MES、MOPS、HEPES、TAPS、乙酸根、谷氨酸根等弱酸阴离子和低迁移率阴离子。用于正离子模式下加速电泳的终止电解质的浓度范围为：相对于终止离子，5mM-10M。
对于阳离子分离，用于加速电泳的常见前导离子包括，例如：钾、铵或钠，其中乙酸根或甲酸根是最常见的缓冲配对离子。反应水合氢离子移动边界则充当由任何弱酸形成的通用终止电解质。
在正离子模式和负离子模式中，前导离子浓度的增加导致样品区的成比例增加，对于给定的施加电压，以增加的电流(功率)为代价。典型的浓度在10-100mM范围内；然而，更高的浓度也是可能的。
此外，在只有区域电泳分离就足够的情况下，该装置可以仅使用一种背景电解质进行操作。
电流和/或电压编程适用于调整样品的迁移速度。应注意，采用这种同心布置，横截面积在迁移期间发生变化，并且区域运动的速度在时间上不是恒定的。因此，这种布置并不严格遵循等速电泳原理，其中区域以恒定速度迁移。根据电源(6)的操作模式，可以区分三种基本情况：1.以恒定电流进行的分离；2.以恒定电压进行的分离恒压分离；和3.以恒定功率进行的分离。
用于下述方程的变量如下：d＝迁移距离(d＜0；r＞)；E＝电场强度；H＝电解质(凝胶)高度；I＝电流；J＝电流密度；κ＝电解质电导率；r＝半径；S＝横截面积；u＝电泳迁移率；v＝速度；X＝从中心电极到加速电泳边界的长度。
在使用由高压电源(HVPS)提供的恒定电流的常见操作模式中，迁移区会随着由于电流密度的增加而向中心移动而加速。在以恒定电流进行并使用包含圆形架构的装置(例如包含一个或多个圆形电极的装置)的示例性分离中，在距离d处的相对速度仅取决于前导电解质的迁移率(电导率)，如在与起始半径r的距离d处的加速电泳边界速度v的推导证明，如下所示：
一般方程：
U＝IR或E＝J/κ(欧姆定律)
E＝U/X(电场强度)
Figure BDA0003468533170001551
R＝X/κS
v＝uE
5＝2πXH
与半径为r的起点距离为d处的加速电泳边界速度v：
v(d)＝uLI/2π(r-d)hκL＝常数/(r-d)
对于在恒定电流下行进的距离(d)与在距离d处的相对速度的关系图，参见图6B。
关于以恒定电压进行并使用包含圆形架构的装置(例如包含一个或多个圆形电极的装置)的分离中，在距离d处的相对速度取决于LE和TE两者的迁移率(电导率)，如在与起始半径r的距离d处的加速电泳边界速度v的推导证明，如下所示：
一般方程：
U＝IR或E＝J/κ(欧姆定律)
E＝U/X(电场强度)
Figure BDA0003468533170001561
R＝X/κS
边界速度的计算：
UL＝U-UT＝U-IRT
UL＝U-Id/SκT
UL＝U-ULκLd/(r-d)κT
UL＝U(r-d)κT/((r-d)κT+κLd]
EL＝UL/(r-d)
EL＝UκT/[(r-d)κT+κLd]
υL＝uLEL
vL＝uLUκT/[(r-d)κT+κLd
对于在恒定电压下行进的距离(d)与在距离d处的相对速度的关系图，参见图6C。
关于以恒定功率进行并使用包含圆形架构的装置(例如包含一个或多个圆形电极的装置)的分离中，在距离d处的相对速度取决于LE和TE两者的迁移率(电导率)，如在与起始半径r的距离d处的加速电泳边界速度v的推导证明，如下所示：
一般方程：
P＝UI＝I2R(电功率)
U＝IR或E＝J/κ(欧姆定律)
E＝U/X(电场强度)
Figure BDA0003468533170001562
R＝X/κS
边界速度的计算：
P＝PL+PT
P＝I2(RL+RT)
Figure BDA0003468533170001571
Figure BDA0003468533170001572
UL＝IRL＝I(r-d)/κLS
Figure BDA0003468533170001573
Figure BDA0003468533170001574
κ是一个小的数字，因此：
Figure BDA0003468533170001575
对于在恒定功率下行进的距离(d)与在距离d处的相对速度的关系图，参见图6D。
实例3：使用示例性装置的加速电泳
使用如图7所示的加速电泳装置进行将磺胺酸染料(SPADNS)聚焦在同心环内的加速电泳分离。施加1W恒定功率以在加速电泳装置中实施加速电泳。
参考图7，SPADNS被聚焦在一个同心环状的聚焦区内，可以看成是图7中的红色区域。红色圆圈的上半部分显示该区域的高度约为5mm。随着加速电泳区从边缘向装置中心移动，最终SPADNS的聚焦区进入装置中心并在装置中心被收集，从而证明使用加速电泳对所希望的样品的聚焦和回收。
实例4：使用示例性装置的加速电泳
使用加速电泳装置(图8A)进行加速电泳以聚焦磺胺酸染料(SPADNS)。图8A的装置具有圆形架构和直径为10.2cm的圆形金电极。10mM HCl-组氨酸(pH 6.25)用作前导电解质并包含在10mL的0.3％琼脂糖凝胶中，该凝胶的直径为5.8cm。15mL的10mM MES Tris(pH8.00)用作尾随电解质。该装置的注射器池含有浓度为100mM的前导电解质HCl His(pH6.25)。在尾随电解质中制备300μl浓度为0.137mM的SPADNS，并将其加载到凝胶和装置圆形电极之间的空间中。为了实施加速电泳，使用了1W的恒定功率。
参考图8B，SPADNS被聚焦在一个同心环状的聚焦区内，可以看成是图8B中的红色区域。随着加速电泳区从边缘向装置中心移动，最终SPADNS的聚焦区进入装置中心并在装置中心被收集，从而证明使用加速电泳对所希望的样品的聚焦和回收。
此外，图8A的加速电泳装置用于执行加速电泳以聚焦30nt寡聚体(ROX-oligo)。图8A的装置具有圆形架构和直径为10.2cm的圆形金电极。10mM HCl-组氨酸(pH6.25)用作前导电解质，包含在10mL的0.3％琼脂糖凝胶中，该凝胶的直径为5.8cm。15mL的10mM MESTris(pH 8.00)用作尾随电解质。该装置的注射器池含有浓度为100mM的前导电解质HClHis(pH 6.25)。在尾随电解质中制备75μl浓度为100μM的ROX-oligo并加载到装置中。为了实施加速电泳，使用了1W的恒定功率。
参考图8C，ROX-oligo被聚焦在一个同心环状的聚焦区内，可以看成是图8C中的蓝色区域。随着加速电泳区从边缘向装置中心移动，最终ROX-oligo的聚焦区进入装置中心并在装置中心被收集，从而证明使用加速电泳对所希望的样品的聚焦和回收。
实例5：使用示例性装置的加速电泳
使用加速电泳装置(图9A至图9B)进行加速电泳以聚焦磺胺酸染料(SPADNS)，随后从所述装置收集该染料(图9C至图9D)。图9A至图9B的装置具有圆形架构和直径为11.0cm的圆形不锈钢线电极。参考图9B，示意图的数字代表以毫米为单位的尺寸。20mM HCl-组氨酸(pH6.20)用作前导电解质。要么5mL的10mM MES Tris(pH8.00)用作尾随电解质，且在LE中具有0.3％琼脂糖凝胶，其中凝胶的直径为8.9cm(图9C)并在引入TE之前形成；要么15mL的10mM MES Tris(pH8.00)用作尾随电解质，且在LE中具有0.3％凝胶，其中凝胶具有5.8cm的直径(图9D)并且在引入TE之前形成。该装置的电极池含有浓度为100mM的前导电解质HClHis(pH 6.25)。
参考图9C，在15mL尾随电解质中制备150μl浓度为0.137mM的SPADNS并加载到装置中。为了实施加速电泳，使用了2W的恒定功率。SPADNS被聚焦在一个同心环状的聚焦区内，可以看成是图9C中的红色区域。随着加速电泳区从边缘向装置中心移动，最终SPADNS的聚焦区进入装置中心并在装置中心被收集，从而证明使用加速电泳对所希望的样品的聚焦和回收。与初始15mL的含SPADNS样品的吸光度相比，回收的SPADNS的吸光度增加了40倍。
参考图9D，在15mL尾随电解质中制备150μl浓度为0.137mM的SPADNS并加载到装置中。为了实施加速电泳，使用了2W的恒定功率。SPADNS被聚焦在一个同心环状的聚焦区内，可以看成是图9D中的红色区域。随着加速电泳区从边缘向装置中心移动，最终SPADNS的聚焦区进入装置中心并在装置中心被收集，从而证明使用加速电泳对所希望的样品的聚焦和回收。与初始15mL的含SPADNS样品的吸光度相比，回收的SPADNS的吸光度增加了40倍。
图9A至图9B的加速电泳装置还用于在不使用凝胶的装置中进行加速电泳以从生理盐水溶液中聚焦SPADNS。20mM HCl-组氨酸(pH 6.20)用作前导电解质。13mL的10mM MESTris(pH 8.00)用作尾随电解质，其进一步与3mL 0.9％NaCl混合。该装置的电极池含有浓度为100mM的前导电解质HCl组氨酸(pH 6.25)。
参考图10，在与3mL的0.9％NaCl混合的13mL尾随电解质中制备150μl浓度为0.137mM的SPADNS并加载到装置中。为了实施加速电泳，使用了2W的恒定功率。SPADNS被聚焦在一个同心环状的聚焦区内，可以看成是图10中的红色区域。随着加速电泳区从边缘向装置中心移动，最终SPADNS的聚焦区进入装置中心并在装置中心被收集，从而证明使用加速电泳对所希望的样品的聚焦和回收。
图9A至图9B的加速电泳装置还用于进行加速电泳以分离和聚焦SPADNS和专利蓝染料，其中乙酸作为间隔物。20mM HCl-组氨酸(pH 6.20)用作前导电解质。5mL的10mM MESTris(pH 8.00)用作尾随电解质，其进一步与150μl的10mm乙酸、150μl的0.1mM专利蓝染料和150μl的0.137mM SPADNS混合。SPADNS、乙酸和专利蓝染料的有效迁移率值(10-9m2/Vs)分别为55、42、7和32。该装置的电极池含有浓度为100mM的前导电解质HCl His(pH 6.25)。对于该实验，该装置的通道中没有使用凝胶，但是凝胶存在于装置平台的顶部。
参考图11，尾随电解质、SPADNs、乙酸和专利蓝染料的混合物被加载到装置中。为了实施加速电泳，使用了2W的恒定功率。SPADNS被聚焦到同心环状的聚焦区内，其可以看成是图11的红色区/内区，并且专利蓝染料也被聚焦到同心环状的聚焦区内，其可以看作是图11的蓝区/外区。随着加速电泳区从边缘向装置中心移动，最终SPADNS和专利蓝染料的聚焦区依次进入装置中心并可以在装置中心被独立地收集，从而证明使用加速电泳对所希望的样品的分离、聚焦和回收。
实例6：用于加速电泳的装置
加速电泳装置被设计为用于实施加速电泳(图12)。图12的装置具有圆形架构和直径为5.8cm的圆形铜条电极。
实例7：用于通过基于电导率的样品检测实施加速电泳的示例性系统
装置构建
根据前面的实例，具有大样品体积容量的加速电泳装置加工为具有圆形分离通道。图13A和图13B示出了装置结构的两个视图。线环电极(直径为1mm的不锈钢线；半径为55mm)连接在圆形分离室的边缘上。样品体积由环形电极和琼脂糖稳定的前导电解质盘(半径为35mm)之间的空间限定。因此，适用的样品体积为每毫米高度5.7毫升。第二电极放置在装置侧面的前导电解质池中。环形电极连接到图13A所示的上部香蕉型连接器。底部香蕉连接器连接到定位在前导电极池中的3cm长、0.4mm直径的铂丝电极(图13B所示方案中的“b”)。为了防止来自电解产物的可能干扰，从前导电解质池向中心收集井(图13B所示方案中的“a”)迁移，在装置内部钻出总长度为20cm的9mm ID内部通道。装置钻孔后的侧开口被硅隔片堵塞。直径为9mm的中心收集井钻透装置，并通过由橡胶o形圈密封的移动
Figure BDA0003468533170001601
杆从底部封闭。
对于每次分析，在用前导电解质填充中心收集井一直到前导电极池中之后，将带有半透膜的塑料小瓶(Slide-A-LyzerTM MINI Dialysis Units2000 Da MWCO，ThermoFisher Scientific，USA)插入中心收集井中。为了尽量减少体积，用刀片将Slide-A-Lyser切成两半，形成一个体积小于200微升的收集杯。接下来，在前导电解质中制备具有中心8mm孔的0.3％琼脂糖凝胶盘(直径70mm，厚4mm)，定位在装置的中心，并由同样具有中心8mm孔的75xlmm圆形玻璃板覆盖以避免气泡堆积。尽管可以应用多种电泳分离模式(例如，区带电泳、等电聚焦或排代电泳)，但我们已经使用加速电泳和包括前导(LE)和终止(TE)电解质的电解质系统。用注射器将处于终止电解质中的样品溶液注入凝胶盘和环形电极之间的空间内。选择电流联接的极性，使得阴离子样品组分从环形电极向装置中心的收集井迁移。聚焦的样品区进入收集杯后，关闭电流，并移液出样品待用。空的收集杯被移动杆提起并丢弃。
电驱动分离条件
在负离子模式下进行分离，其中Cl-离子作为前导离子(有效迁移率79.1×10-9详V-1s-1)。前导电解质(LE)含有pH6.2的100mM HCl-组氨酸缓冲液，而终止电解质(TE)含有10mM TAPS，经TRIS滴定至pH8.30。琼脂糖稳定的前导电解质盘在20mM前导电解质(HCl-组氨酸；pH6.25)中制备。所有缓冲液均在去离子水中制备。电源由PowerPac3000(BioRad)提供，它在恒定功率模式下以2W运行(这对应于分析开始时的大约16mA和120V)。分析耗时约1小时(分析结束时约为10mA和200V)。
样品检测
为了检测样品，构建了表面电阻率检测槽并将其联接到商用ITP仪器(VillaLabeco，Sp.N.Ves，Slovakia)的电导率检测器。检测槽的制备如下：将两根铂(Pt)线(300μmx2cm长)连接到与ITP仪器匹配的连接器上。Pt线的两端插入1mL移液器吸头内，然后用快速固化环氧树脂填充。最后，用刀片切割1mm的内嵌有环氧树脂线的移液器吸头，露出带有两个圆形Pt电极的平坦环氧树脂表面。参见图14A和图14B。检测槽安装在实验室支架上，轻轻接触靠近收集瓶的琼脂糖凝胶盘的表面，如图15A所示。采用该用于检测的系统来生成图15B的电导率曲线。
还构建了另一个示例性系统，用于加速电泳期间的样品检测。在该系统中，由直径为500μm的两根铂(Pt)线组成的表面电阻率检测探针整合在加速电泳装置的底部基板(即底板)中，如图16A和图16B中所示。导线的尖端通过底部基板上的中心柱内的专用通道从底部靠近半透膜。导线的相反末端联接到商用ITP仪器(Villa Labeco，Sp.N.Ves，Slovakia)的电导率检测器。用作加速电泳装置的顶板使用磁体与底部基板组装在一起，而o形环(参见图16B)能够实施两个基板之间的完全密封以防止任何泄漏。
化学品
缓冲液组分：L-组氨酸单盐酸盐一水合物(99％)、L-组氨酸(99％)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS；99.5％)和三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS；99.8％)购自Sigma-Aldrich(USA)。具有低电内渗的琼脂糖NEEO超品质
Figure BDA0003468533170001621
garose购自Carl Roth(Germany)。乙酸和阴离子染料专利蓝V钠盐来自Sigma-Aldrich；红色阴离子染料SPADNS(1，8-二羟基-2-(4-磺基苯基偶氮)萘-3,6-二磺酸三钠盐)来自Lachema，Bmo，CzechRepublic。
SPADNS和专利蓝的聚焦
为了测试上述包括加速电泳和电样品检测的示例性装置，该装置用于聚焦和检测测试分析物：SPADNS和专利蓝。前导电解质(LE)：缓冲至pH6.2的HCl-HIS。尾随电解质(TE)：缓冲至pH 8.3的TAPS-TRIS。凝胶由20ml的6％聚丙烯酰胺凝胶在20mM LE中形成。将100mMLE添加到电极池中。样品溶液：15ml的10mM TE+150μL的0.1mM SPADNS+150μL的0.1mM专利蓝。用注射器将处于终止电解质中的样品溶液注入凝胶盘和环形电极之间的空间内。该装置在恒定功率模式下运行，P＝2W。图15A提供了SPADNS和专利蓝的聚焦图像，显示样品收集井附近的电导率样品检测。图15B提供了该样品聚焦的电导率轨迹，并显示了由于LE和TE之间的过渡造成的电导率/电阻率的显著变化，包括样品的聚焦区(SPADNS和专利蓝)。
DNA分析
用荧光素标记的低分子量dsDNA阶梯(从75个碱基对(bp)到1622bp的十个片段)来自Bio-Rad，USA。通过使用高灵敏度dsDNA Qubit定量测定试剂盒，使用Qubit荧光计(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)评估收集的级分中的DNA浓度。样品中靶分子的浓度由仅在与DNA结合时发射的荧光染料报告。使用芯片CGE-LIF仪器Agilent 2100生物分析仪(Agilent，Santa Clara，CA，United States)进一步分析收集的级分。该分析使用高灵敏度DNA试剂盒(Agilent，United States)提供了收集的样品中DNA片段的大小信息。
DNA聚焦
游离溶液中50bp以上的DNA片段的电泳迁移率为大约37x10-9m2/Vs，而短片段(约20-50bp)的偏差可能仅为约10％。基于这些迁移率，我们设计了一种不连续电解质系统，适用于将所有样品DNA片段聚焦到单个聚焦区。对于实验测试，我们选择了片段大小在75到1632bp范围的经荧光素标记的低分子范围DNA阶梯。每个DNA片段只有一个荧光团的样品的荧光被2cm半径的激光束照射(图17A)。表面电阻率检测用于指示靠近收集井的LE/TE边界的过渡。从LE到TE的电阻率的整体变化被用作样品位置的标志。基于这种变化，关闭电压并停止分离。通过UV光谱法(吸光度测量)(图17B)和基于生物分析仪的分析(图17C)分析收集的级分。图17C中的前后标志物(根据制造商的说明以相同的量添加到初始样品和最终样品中)的较低信号强度是由于收集的级分中的DNA浓度较高。在这两种情况下，收集的级分中的约30x浓度增加对应于样品体积从起始15mL减少到该示例性实施例中的280μL样品收集体积。进入收集杯之前迁移DNA区的体积要小得多(约3μL)，并且最终级分浓度主要取决于所选收集瓶的体积。
实例8：通过ETP分离/纯化无细胞核酸
使用加速电泳装置和实验设置(参见图18-20)进行ETP以实施包含无细胞DNA的无细胞核酸的分离(纯化)。该装置具有圆形架构和圆形电极(参见图18和20)。
在设置和进行ETP以分离/纯化cfDNA之前，制备了ETP缓冲液、ETP装置的琼脂糖凝胶、缩短的透析单元和一个或多个经蛋白酶K消化的血浆样品。制备了包含HCl-组氨酸pH6.25的前导电解质(LE)缓冲液，并制备了包含TAPS-Tris pH8.30的尾随电解质(TE)缓冲液。与ETP装置一起使用的琼脂糖凝胶是通过在锥形瓶中将适合所希望的琼脂糖百分比凝胶的一定量的琼脂糖与LE缓冲液混合来制备的。
经蛋白酶K消化的血浆是通过下述制备的：首先在室温下解冻血浆样品，然后混合样品，取出所希望的体积并分配到无核酸酶管中。接下来，加入蛋白酶K，将溶液充分混合，然后在37-70℃孵育，具体取决于样品。
cfDNA的基于ETP的分离/纯化一般按下述进行。ETP系统是通过下述制备的：首先使用特氟龙棒(参见图18)或一对镊子将可移动的中心活塞(参见图18)移动到较低的位置。用LE缓冲液(25mL LE+1.25μLSYBR金(如果用于DNA带的可视化))经由ETP平台的角落开口填充中心电极通道，并且在中心开口完全填充时停止填充。透析单元通过O形环固定在中心开口中(参见图18)。然后用LE缓冲液(和SYBR金溶液，如果希望的话)填充透析单元。将如上所述制备的琼脂糖凝胶小心地从模具转移到ETP装置并固定。然后将圆形覆盖物置于凝胶上。
制备样品混合物，一般包含15mL TE缓冲液+1μL SYBR金(如果用于DNA带的可视化)+50bp DNA阶梯(如果用作标记物)+PK预处理的血浆样品，并用移液器移入凝胶和ETP装置的圆形电极之间的间隙内。最后，将第二个盖子放在装置的顶部。
然后通过将ETP装置插入电源来准备电源。电源设置在1到8W之间的恒定功率(取决于所用的血浆样品量)，并且ETP实施大约1-2小时。通过打开电源，ETP将一种或多种靶分析物聚焦到一个或多个聚焦区(一个或多个ETP带)内。
在一些情况下，如下监测和收集样品。如果在ETP运行中包含SYBR金，则使用蓝色光源和适当的滤光器来监测DNA聚焦区(ETP带)的移动。一旦在透析单元中收集到DNA，就关闭电源。如果希望选择DNA/分析物的大小，则仅收集一个或多个目标DNA聚焦区(一个或多个ETP带)，如下文进一步所述。一旦关闭电源，就将LE缓冲液从ETP装置的角落开口去除，然后从装置中去除TE缓冲液和凝胶。接下来，收集包含在透析单元中的样品。然后将移动中心活塞移动到上部位置。在一些情况下，收集的DNA溶液随后通过使用KAPA纯珠的混合物进行清洗，并在30-50μL的TRIS.HCl溶液中洗脱。
在一些情况下，通过使用高灵敏度dsDNA Qubit定量测定试剂盒，使用Qubit荧光计(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)对收集的cfDNA进行分析。样品中靶分子的浓度由仅在与DNA结合时发射的荧光染料报告。在一些情况下，通过使用芯片CGE-LIF仪器Agilent2100生物分析仪(Agilent，Santa Clara，CA，United States)对收集的cfDNA进行分析。该分析使用高灵敏度DNA试剂盒(Agilent，United States)提供了收集的样品中DNA片段的大小信息。
实例9：基于ETP的cfDNA分离/纯化
在本实例中，cfDNA通过基于ETP的分离/纯化进行分离/纯化，如实例8中一般描述的，具有以下修改。将DNA阶梯添加到血浆样品中，并使用SYBR金来可视化DNA区域。样品包含1mL血浆，其包含cfDNA和200ng DNA阶梯。
现在参考图20，对基于ETP的从1 mL血浆样品中分离/纯化DNA的过程拍摄延时照片，该过程分离/纯化了cfDNA和DNA阶梯。SYBR金用于DNA区的可视化(参见图20)。
实例10：基于ETP的cfDNA分离/纯化
在本实例中，如实例8中一般描述的并做以下修改，通过基于ETP的分离/纯化从1mL血浆样品中分离并收集cfDNA。没有使用SYBR金。在cfDNA的基于ETP的纯化和随后的收集之后，执行单个基于KAPA纯珠的清理步骤(1X SPRI珠)或两个基于KAPA纯珠的清理步骤(2X SPRI珠)。还通过使用AVENIO试剂盒的旋转柱方法从血浆样品(1mL)中分离/纯化cfDNA，然后进行单个基于KAPA纯珠的清理步骤；并使用“UNA方法”，该方法包括使用两次基于微珠的清理(即两个净化步骤，每个清理步骤使用相同类型的微珠)去除基因组DNA污染，然后进行使用AVENIO试剂盒的旋转柱方法。在使用上述方法分离/纯化和清理cfDNA之后，使用基于QUBIT的分析测量cfDNA的浓度，并以ng为单位记录cfDNA的浓度。
现在参考图21，结果证明了通过使用基于ETP的分离和收集来提取cfDNA，包括一个或两个珠清理步骤。与本实例中使用的其他方法相比，通过基于ETP的分离和收集来分离和收集cfDNA所产生的cfDNA量约为2.5倍。值得注意的是，与包括两个基于珠的清理步骤的基于ETP的cfDNA分离和收集相比，执行cfDNA的基于ETP的分离和收集然后进行一个基于珠的清理步骤包含更高的量的cfDNA。
实例11：基于ETP的cfDNA分离/纯化
在本实例中，如实例8中一般描述的并做以下修改，通过基于ETP的分离/纯化从1mL血浆中分离/纯化包含cfDNA和DNA阶梯的DNA。向1mL血浆中加入60ng DNA阶梯。在分离/纯化和随后收集cfDNA和DNA阶梯之后，使用如实例8中一般描述的生物分析仪运行对分离/纯化并收集的DNA样品进行基于大小的分析。
现在参考图22，结果表明在分离/纯化并收集的样品中存在cfDNA，如通过荧光信号和不对应于DNA阶梯的带所证明的，因为cfDNA表现为长度为约150至约200bp的带(参见图22)。
实例12：基于ETP的cfDNA分离/纯化
在本实例中，如实例8中一般描述的并做以下修改，通过基于ETP的分离/纯化从1mL血浆样品中分离/纯化cfDNA。在本实例中，没有使用SYBR金或DNA阶梯。在分离/纯化和随后收集cfDNA之后，使用如实例8中一般描述的生物分析仪运行对分离/纯化并收集的DNA样品进行基于大小的分析。
现在参考图23，结果表明在分离/纯化并收集的样品中存在cfDNA，如通过荧光信号和长度为约150至约200bp的带所证明的(参见图23)。值得注意的是，25bp和10,300bp的标记物被用作标准。
实例13：基于ETP的cfDNA分离/纯化
在本实例中，如实例8中一般描述的并做以下修改，通过基于ETP的分离/纯化从1mL血浆样品中分离/纯化cfDNA。在本实例中，通过改变缓冲液浓度、凝胶百分比和ETP运行的停止时间，从1mL血浆样品中分离/纯化并随后收集cfDNA，从而分离/纯化出各种不同大小范围的DNA并随后收集，这允许增强从片段化的基因组DNA中分离/纯化cfDNA。
现在参考图24，呈现了使用不同的缓冲液浓度、凝胶百分比和停止时间进行的基于ETP的分离/纯化和后续收集的结果。ETP运行结果的基于电泳的分析表明，通过基于ETP的分离/纯化和随后的收集实现了各种DNA大小截断值(参见图24)。
实例14：循环肿瘤DNA的基于ETP的分离/纯化
在本实例中，如实例8中一般描述的并做以下修改，通过基于ETP的分离/纯化从1mL血浆样品中分离/纯化并随后收集循环肿瘤DNA。除了基于ETP的分离/纯化之外，使用AVENIO试剂盒的基于旋转柱的方法也用于在单独的测定中从4mL血浆样品中分离ctDNA。此外，在ctDNA的基于ETP的分离/纯化和随后的收集之后，进行了基于KAPA纯珠的清理步骤。此外，对分离/纯化并随后收集的ctDNA进行了基于QUBIT的分析，如实例8中一般所述。
现在参考图25，呈现了ctDNA从0.5mL血浆中的基于ETP的分离/纯化和随后收集的结果。值得注意的是，基于离心柱的方法的结果是从4mL样品反算到0.5mL。对每个样品取五次读数。呈现于图26中的结果表明，通过基于ETP的方法分离/纯化并随后收集的ctDNA的产量超过了基于离心柱的方法的产量。通过基于ETP的方法得到的ctDNA产量平均为约5.7ng，最高产量为6.8ng，范围为约5.1ng至约6.8ng。
实例15：使用ETP上位标记物的基于ETP的分离/纯化
在本实例中，生成了在基于ETP的分离/纯化期间使用的ETP上位标记物。
一种用于产生在ETP期间使用的标记的上位标记物的方法是在一个限制性位点消化质粒，然后，随后使用适当的引物产生所希望大小的扩增子，例如1003bp扩增子，以产生大小为1003bp的扩增子。任选地，扩增子可以被荧光标记。
替代性地，如下所述产生标记的上位标记物。使用三种不同的限制酶在三个不同的限制性位点切割载体以产生744bp、875bp和1067bp的片段。消化后，清除消化产物，随后分别荧光地标记三种载体。清理后，使用安捷伦生物分析仪分析ETP上位标记物(见图26)，证实产生了具有744bp、875bp和1067bp三个碎片的上位标记物。
这种ETP上位标记物可以在基于ETP的方法实施期间使用并与基于ETP的装置一起使用，以指示可以停止收集靶分析物(例如DNA)的截止点。例如，荧光标记的或以其他方式可检测地标记的ETP上位标记物可以产生为大小大于在基于ETP的方法实施期间待收集的靶分析物。通过在整个ETP运行过程中监控标记物，使用者或自动化机器能够在标记物落入收集管之前停止运行，从而允许捕获小于标记物的靶分析物，同时由于较大的污染分析物定位在上位标记物后面而将其留在管外。此外，ETP上位标记物本身不会被收集并因此可以大量使用并与各种可检测标记一起使用，因为它不会干扰下游检测。特别地，ETP上位标记物可用于cfDNA分离/纯化方法，因为它有助于排除基因组DNA。例如，在某些情况下，ETP上位标记物可以是大约1000bp。

Claims (19)

1.一种从样品中分离和/或纯化一种或多种无细胞核酸的方法，其中所述方法包括：
a.提供用于实施加速电泳(ETP)的装置；
b.提供包含所述一种或多种无细胞核酸的样品；
c.通过使用所述装置实施ETP来进行一次或多次加速电泳运行以将所述一种或多种无细胞核酸(“cfNA”)聚焦到一个或多个聚焦区内，例如，作为一个或多个ETP带；以及
d.通过收集包含所述一种或多种cfNA的所述一个或多个聚焦区来收集所述一种或多种cfNA；
从而获得一种或多种分离和/或纯化的cfNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括光学检测，所述光学检测包括对与所述一种或多种cfNA结合和/或缔合的嵌入染料和/或光学标签的检测。
3.根据权利要求1中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括电检测。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法为自动化方法，其中步骤b.的所述样品被自动加载到所述装置内，且/或在步骤d.之前或期间，从所述装置自动化地收集一种或多种无细胞NA。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一种或多种分离和/或纯化的cfNA经历一次或多次进一步ETP运行以进一步分离和/或纯化所述一种或多种cfNA。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括在步骤d.之后的至少一个基于SPRI珠的清理步骤。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在步骤c.期间使用ETP上位标记物。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b.的所述样品的样品体积为0.25mL或更小、0.25mL或更大、0.5mL或更大、0.75mL或更大、1.0mL或更大、2.5mL或更大、5.0mL或更大、7.5mL或更大、10.0mL或更大、12.5mL或更大或者15.0mL或更大。
9.一种用于检测包含胎儿和母体无细胞DNA的母体样品中的胎儿来源的来源贡献以及一个或多个基因组区域中的胎儿拷贝数变异(CNV)存在或不存在的测定法，所述测定法包括以下步骤：a.通过实施基于ETP的分离和/或纯化从母体样品中分离和/或纯化cfNA，例如，cfDNA，以获得分离和/或纯化的母体样品；b.使(i)第一组两个或更多个固定序列寡核苷酸与(ii)所述分离和/或纯化的母体样品中的所述无细胞DNA杂交，其中所述第一组固定序列寡核苷酸包含第一和第二固定序列寡核苷酸，所述第一和第二固定序列寡核苷酸与第一基因组区域内的至少48个且小于2000个基因座中每一个基因座内的连续区域互补，其中所述第一组固定序列寡核苷酸中的至少一个包含通用引物区域并且所述第一组固定序列寡核苷酸中的所述第一固定序列寡核苷酸的解链温度(Tm)在两摄氏度的范围内变动；c.使(i)第二组两个或更多个固定序列寡核苷酸与(ii)所述分离和/或纯化的母体样品中的所述无细胞DNA杂交，其中所述第二组固定序列寡核苷酸包含第一和第二固定序列寡核苷酸，所述第一和第二固定序列寡核苷酸与第二基因组区域内的至少48个且小于2000个基因座中每一个基因座内的连续区域互补，其中所述第二组固定序列寡核苷酸中的至少一个包含通用引物区域并且所述第二组固定序列寡核苷酸中的所述第一固定序列寡核苷酸的所述Tm在两摄氏度的范围内变动；d.使(i)第三组至少两个固定序列寡核苷酸与(ii)所述分离和/或纯化的母体样品中的所述无细胞DNA杂交，其中所述第三组至少两个固定序列寡核苷酸与两个或更多个多态性信息基因座的连续、多态性区域互补；e.将杂交的第一组固定序列寡核苷酸连接以生成与所述第一基因组区域互补的连续连接产物，将杂交的第二组固定序列寡核苷酸连接以生成与所述第二基因组区域互补的连续连接产物，并且将杂交的第三组固定序列寡核苷酸连接以生成与所述多态性信息基因座互补的连续连接产物；f.使用所述通用引物区域扩增所述连续连接产物以生成扩增产物；g.使用高通量测序，通过平均至少100次测量来自所述第一基因组区域和所述第二基因组区域的每一个基因座来检测所述扩增产物；以及h.确定所测量的来自所述第一和第二基因组区域的所述基因座的相对频率，其中所测量的来自所述第一基因组区域的所述基因座的所述相对频率与所测量的来自所述第二基因组区域的所述基因座的所述相对频率不同，指示胎儿拷贝数变异的存在，所述确定不依赖于对所述第一和第二基因组区域内的多态性的检测，并且在所述多态性信息基因座处源自所述胎儿来源与母体来源的序列读段的比例指示所述来源贡献，其中来自所述胎儿来源的所述来源贡献为至少5％且低于25％。
10.一种用于使用单一测定法来检测包含胎儿和母体无细胞DNA的母体样品中的胎儿来源的来源贡献以及胎儿非整倍性存在或不存在的测定法，所述测定法包括以下步骤：a.通过实施基于ETP的分离和/或纯化从母体样品中分离和/或纯化cfNA，例如，cfDNA，以获得分离和/或纯化的母体样品；b.使(i)第一组两个或更多个固定序列寡核苷酸与(ii)所述分离和/或纯化的母体样品中的所述无细胞DNA杂交，其中所述第一组固定序列寡核苷酸包含第一和第二固定序列寡核苷酸，所述第一和第二固定序列寡核苷酸与对应于第一染色体的至少48个且小于2000个基因座中每一个基因座内的连续区域互补，并且所述第一组固定序列寡核苷酸中的所述第一固定序列寡核苷酸的解链温度(Tm)在两摄氏度的范围内变动；c.使(i)第二组两个或更多个固定序列寡核苷酸与(ii)所述分离和/或纯化的母体样品中的所述无细胞DNA杂交，其中所述第二组固定序列寡核苷酸包含第一和第二固定序列寡核苷酸，所述第一和第二固定序列寡核苷酸与对应于第二染色体的至少48个且小于2000个基因座中每一个基因座内的连续区域互补，并且所述第二组固定序列寡核苷酸中的所述第一固定序列寡核苷酸的所述Tm在两摄氏度的范围内变动；d.使(i)第三组至少两个固定序列寡核苷酸与(ii)所述分离和/或纯化的母体样品中的所述无细胞DNA杂交，其中所述第三组至少两个固定序列寡核苷酸与两个或更多个多态性信息基因座的连续、多态性区域互补；e.将杂交的第一组固定序列寡核苷酸连接以生成与所述第一染色体上的所述基因座互补的连续连接产物，将杂交的第二组固定序列寡核苷酸连接以生成与所述第二染色体上的所述基因座互补的连续连接产物，并且将杂交的第三组固定序列寡核苷酸连接以生成与所述多态性信息基因座互补的连续连接产物；f.扩增所述连续连接产物以生成扩增产物；g.使用高通量测序，通过平均至少100次测量所述第一染色体上的每一个基因座、所述第二染色体上的每一个基因座和每一个信息基因座来检测所述扩增产物；以及h.确定所测量的来自所述第一和第二基因组区域的所述基因座的相对频率，其中所测量的来自所述第一基因组区域的所述基因座的所述相对频率与所测量的来自所述第二基因组区域的所述基因座的所述相对频率不同，指示胎儿拷贝数变异的存在，所述确定不依赖于对所述第一和第二基因组区域内的多态性的检测，并且在所述多态性信息基因座处源自所述胎儿来源与母体来源的序列读段的比例指示所述来源贡献，其中来自所述胎儿来源的所述来源贡献为至少5％且低于25％。
11.一种用于检测包含胎儿和母体无细胞DNA的母体样品内的胎儿来源的来源贡献以及一个或多个基因组区域中的胎儿CNV存在或不存在的测定法，所述测定法包括以下步骤：a.通过实施基于ETP的分离和/或纯化从母体样品中分离和/或纯化cfNA，例如，cfDNA，以获得分离和/或纯化的母体样品；b.使(i)第一组两个或更多个固定序列寡核苷酸与(ii)所述分离和/或纯化的母体样品中的所述无细胞DNA杂交，其中所述第一组固定序列寡核苷酸包含第一和第二固定序列寡核苷酸，所述第一和第二固定序列寡核苷酸与第一基因组区域内的二十四个或更多个基因座的区域互补，并且所述第一组固定序列寡核苷酸中的所述第一固定序列寡核苷酸的解链温度(Tm)在两摄氏度的范围内变动；c.使(i)第二组两个或更多个固定序列寡核苷酸与(ii)所述分离和/或纯化的母体样品中的所述无细胞DNA杂交，其中所述第二组固定序列寡核苷酸包含第一和第二固定序列寡核苷酸，所述第一和第二固定序列寡核苷酸与第二基因组区域内的二十四个或更多个基因座的区域互补，并且所述第二组固定序列寡核苷酸中的所述第一固定序列寡核苷酸的所述Tm在两摄氏度的范围内变动；d.使(i)第三组至少两个固定序列寡核苷酸与(ii)所述分离和/或纯化的母体样品中的所述无细胞DNA杂交，其中所述第三组至少两个固定序列寡核苷酸与两个或更多个多态性信息基因座的连续、多态性区域互补；e.使(i)桥接寡核苷酸与(ii)所述分离和/或纯化的母体样品中的所述无细胞DNA杂交，其中所述桥接寡核苷酸与位于与所述第一组、第二组和第三组固定序列寡核苷酸互补的区域之间的所述基因座中的区域互补；f.将所述第一组固定序列寡核苷酸与所述桥接寡核苷酸连接以生成与所述第一基因组区域中的所述基因座互补的连续连接产物，将所述第二组固定序列寡核苷酸与所述桥接寡核苷酸连接以生成与所述第二基因组区域所缔合的基因座互补的连续连接产物，并且将杂交的第三组固定序列寡核苷酸连接以生成与所述多态性信息基因座互补的连续连接产物；g.扩增所述连续连接产物以生成扩增产物；h.使用高通量测序，通过平均至少100次测量所述第一基因组区域中的每一个基因座和所述第二基因组区域中的每一个基因座来检测所述扩增产物；以及i.确定所测量的来自所述第一和第二基因组区域的所述基因座的相对频率，其中所测量的来自所述第一基因组区域的所述基因座的所述相对频率与所测量的来自所述第二基因组区域的所述基因座的所述相对频率不同，指示胎儿拷贝数变异的存在，所述确定不依赖于对所述第一和第二基因组区域内的多态性的检测，并且在所述多态性信息基因座处源自所述胎儿来源与母体来源的序列读段的比例指示所述来源贡献，其中来自所述胎儿来源的所述来源贡献为至少5％且低于25％。
12.一种用于提供胎儿拷贝数变异的统计学可能性的测定方法，其包括：提供包含母体和胎儿无细胞DNA的母体血浆或血清样品；通过实施基于ETP的分离和/或纯化来分离和/或纯化所述无细胞DNA；通过使成组的至少两个包含与第一靶基因组区域中的基因座互补的区域的固定序列寡核苷酸杂交来查询至少48个来自所述第一靶基因组区域的非多态性基因座，其中每一组的所述固定序列寡核苷酸中的一个包含第一捕获区域、第一标签结合区域和两个限制位点；通过使成组的至少两个包含与第二靶基因组区域中的基因座互补的区域的固定序列寡核苷酸杂交来查询至少48个来自所述第二靶基因组区域的非多态性基因座，其中每一组的所述固定序列寡核苷酸中的一个包含第一捕获区域、第二标签结合区域和两个限制位点；将杂交的固定序列寡核苷酸连接；扩增连接的固定序列寡核苷酸以生成扩增子；在所述限制位点处裂解所述扩增子以生成裂解的扩增子，其中每一个裂解的扩增子包含所述第一捕获区域和所述第一或第二标签结合区域；通过使所述裂解的扩增子的所述第一捕获区域杂交至包含与所述第一捕获区域互补的捕获探针的阵列来检测来自所述第一和第二靶基因组区域的所述裂解的扩增子，其中来自所述第一和第二靶基因组区域的所述裂解的扩增子竞争性地杂交至与所述第一捕获区域互补的所述捕获探针；通过检测所述第一和第二标签结合区域，将所述裂解的扩增子的所述捕获区域定量以确定所查询的来自所述第一和第二靶基因组区域的非多态性基因座的相对频率；基于所述第一和第二标签结合区域的所确定的相对频率，估计所述第一和第二靶基因组区域的所述相对频率；对于每一个多态性基因座，通过使成组的至少三个固定序列等位基因特异性寡核苷酸杂交来查询至少48个来自不同于所述第一和第二靶基因组区域的至少一个靶基因组区域的多态性基因座，其中每一组的所述至少三个等位基因特异性寡核苷酸中的两个包含与多态性基因座处的一个等位基因互补的序列、对于每一个多态性基因座具特异性的捕获区域、针对所述多态性基因座处的每一个等位基因的不同的标签结合区域、和两个限制位点；将杂交的固定序列等位基因特异性寡核苷酸连接；扩增连接的固定序列等位基因特异性寡核苷酸以生成等位基因特异性扩增子；在所述限制位点处裂解所述等位基因特异性扩增子以生成裂解的等位基因特异性扩增子，其中每一个裂解的等位基因特异性扩增子包含多态性基因座特异性捕获区域和等位基因特异性标签结合区域；通过所述裂解的等位基因特异性扩增子的所述多态性基因座特异性捕获区域竞争性地杂交至所述阵列上的捕获区域，来检测来自所述多态性基因座的所述裂解的等位基因特异性扩增子；通过针对所述裂解的等位基因特异性扩增子上的每一个等位基因检测所述等位基因特异性标签结合区域，将所述多态性基因座的所述等位基因定量，以确定所述样品中胎儿DNA的分数；确定所述胎儿DNA的分数；以及使用所述样品中所述第一和第二靶基因组区域的估计的相对频率和所述胎儿DNA的分数，计算所述母体样品中胎儿拷贝数变异的统计学可能性。
13.一种用于确定胎儿非整倍性的可能性的测定方法，其包括以下步骤：提供包含母体和胎儿无细胞DNA的母体血浆或血清样品；通过实施基于ETP的分离和/或纯化来分离和/或纯化所述无细胞DNA，从而获得分离和/或纯化的母体样品；在允许每一个固定序列寡核苷酸的互补区域特异性地杂交至所述分离和/或纯化的母体样品中第一靶基因组区域内的非多态性基因座的条件下，引入至少五十组第一组两个或更多个与所述非多态性基因座互补的固定序列寡核苷酸，其中每一组的所述固定序列寡核苷酸中的至少一个包含通用引物位点、第一捕获区域、第一标签结合区域和两个限制位点；在允许每一个固定序列寡核苷酸的互补区域特异性地杂交至所述分离和/或纯化的母体样品中第二靶基因组区域内的非多态性基因座的条件下，引入至少五十组第二组两个或更多个与所述非多态性基因座互补的固定序列寡核苷酸，其中每一组的所述固定序列寡核苷酸中的至少一个包含通用引物位点、第一捕获区域、第二标签结合区域和两个限制位点；在允许每一个固定序列寡核苷酸的互补区域特异性地杂交至多态性基因座的条件下，引入至少五十组第三组三个或更多个与所述分离和/或纯化的母体样品中的一组多态性基因座互补的固定序列寡核苷酸，其中每一组的所述三个固定序列寡核苷酸中的至少两个包含通用引物位点、与多态性基因座处的一个等位基因互补的序列、针对所述多态性基因座处的每一个等位基因的等位基因特异性标签结合区域、两个限制位点和多态性基因座特异性捕获区域，其中针对每一个多态性基因座的所述捕获区域不同于针对每一个其他多态性基因座的所述捕获区域并且不同于所述第一捕获区域；使所述第一组、第二组和第三组固定序列寡核苷酸杂交至所述第一和第二靶基因组区域以及所述多态性基因座；延长杂交的所述第一组、第二组和第三组固定序列寡核苷酸中的至少一个以形成相邻杂交的固定序列寡核苷酸；将杂交的所述第一组、第二组和第三组固定序列寡核苷酸连接以生成连接产物；使用所述通用引物位点扩增所述连接产物，以生成对应于所述多态性基因座的扩增子；在所述限制位点处裂解所述扩增子以生成裂解的扩增子，其中每一个裂解的扩增子包含一个捕获区域和一个标签结合区域；将所述裂解的扩增子施加到阵列，其中所述阵列包含与来自所述第一和第二靶基因组区域的所述裂解的扩增子上的所述第一捕获区域互补的第一捕获探针，并且其中所述阵列包含与来自每一个多态性基因座的所述裂解的扩增子上的所述捕获区域互补的捕获探针；使来自所述第一和第二靶基因组区域的所述裂解的扩增子的所述第一捕获区域杂交至阵列上的第一捕获探针；使来自所述多态性基因座的所述裂解的扩增子的所述捕获区域杂交至所述阵列上的捕获探针；检测杂交的裂解的扩增子；通过检测所述第一和第二标签结合区域，将对应于来自所述第一靶基因组区域的基因座的所述裂解的扩增子的相对频率和对应于来自所述第二靶基因组区域的基因座的所述裂解的扩增子的相对频率定量；通过检测针对所述裂解的扩增子上的每一个等位基因的所述等位基因特异性标签结合区域，将来自所述多态性基因座的每一个等位基因的相对频率定量，以确定胎儿无细胞DNA的百分比；以及，使用对应于来自所述第一和第二靶基因组区域的基因座的所述裂解的扩增子的用以确定胎儿非整倍性的可能性的所述相对频率以及所确定的胎儿无细胞DNA的百分比，来计算所述胎儿非整倍性的可能性。
14.一种用于确定胎儿非整倍性的可能性的测定方法，其包括以下步骤：提供包含母体和胎儿无细胞DNA的母体血浆或血清样品；通过实施基于ETP的分离和/或纯化来分离和/或纯化所述无细胞DNA，从而获得分离和/或纯化的母体样品；在允许每一个固定序列寡核苷酸的互补区域特异性地杂交至所述母体样品中第一靶基因组区域内的一组非多态性基因座的条件下，引入至少五十组第一组两个或更多个与所述一组非多态性基因座互补的固定序列寡核苷酸，其中每一组的所述固定序列寡核苷酸中的至少一个包含通用引物位点、第一捕获区域、第一标签结合区域和两个限制位点；在允许每一个固定序列寡核苷酸的互补区域特异性地杂交至所述分离和/或纯化的母体样品中第二靶基因组区域内的一组非多态性基因座的条件下，引入至少五十组第二组两个或更多个与所述一组非多态性基因座互补的固定序列寡核苷酸，其中每一组的所述固定序列寡核苷酸中的至少一个包含通用引物位点、第一捕获区域、第二标签结合区域和两个限制位点；在允许每一个固定序列寡核苷酸的互补区域特异性地杂交至多态性基因座的条件下，引入两组或更多组第三组三个或更多个与所述分离和/或纯化的母体样品中的一组多态性基因座互补的固定序列寡核苷酸，其中每一组的所述三个或更多个固定序列寡核苷酸中的至少两个包含通用引物位点、与所述多态性基因座处的一个等位基因互补的序列、针对所述多态性基因座处的每一个等位基因的等位基因特异性标签结合区域、两个限制位点和多态性基因座特异性捕获区域，其中针对每一个多态性基因座的所述捕获区域不同于针对每一个其他多态性基因座的所述捕获区域并且不同于所述第一捕获区域；使所述第一组、第二组和第三组固定序列寡核苷酸杂交至所述第一和第二靶基因组区域以及多态性基因座；延长杂交的所述第一组、第二组和第三组固定序列寡核苷酸中的至少一个以形成对于每一组的相邻杂交的固定序列寡核苷酸；将相邻杂交的来自所述第一组、第二组和第三组的固定序列寡核苷酸连接以生成连接产物；使用所述通用引物位点扩增所述连接产物以生成扩增子；在所述限制位点处裂解所述扩增子以生成裂解的扩增子，其中每一个裂解的扩增子包含一个捕获区域和一个标签结合区域；将所述裂解的扩增子施加到阵列，其中所述阵列包含与来自所述第一和第二靶基因组区域的所述裂解的扩增子上的所述第一捕获区域互补的第一捕获探针，并且其中所述阵列包含与来自每一个多态性基因座的所述裂解的扩增子上的所述捕获区域互补的捕获探针；使来自所述第一和第二靶基因组区域的所述裂解的扩增子的所述第一捕获区域杂交至阵列上的第一捕获探针；使来自所述多态性基因座的所述裂解的扩增子的所述捕获区域杂交至所述阵列上的捕获探针；检测杂交的裂解的扩增子；通过检测针对所述裂解的扩增子上的每一个等位基因的所述等位基因特异性标签结合区域，将来自所述多态性基因座的每一个等位基因的相对频率定量，以确定胎儿无细胞DNA的百分比；在母体基因座为纯合的且对应的胎儿基因座为杂合的情况下，通过从定量的等位基因鉴定低频率等位基因，确定所述胎儿无细胞DNA的百分比；通过检测所述第一和第二标签结合区域，将对应于来自所述第一靶基因组区域的基因座的裂解的扩增子的相对频率和对应于来自所述第二靶基因组区域的基因座的裂解的扩增子的相对频率定量；以及，使用对应于来自所述第一和第二靶基因组区域的基因座的裂解的扩增子的所述相对频率以及所述胎儿无细胞DNA的百分比，来计算胎儿非整倍性的可能性。
15.一种鉴定源自肿瘤的SNV的无创性方法，其包括(a)从患有癌症或被怀疑患有癌症的受试者获得样品；(b)进行基于ETP的分离和/或纯化以分离和/纯化靶核酸，例如，cfNA，例如，cNA，以获得分离和/或纯化的样品；(c)对所述分离和/或纯化的样品执行测序反应以产生测序信息；(d)将算法应用至所述测序信息以产生基于来自步骤(c)的所述测序信息的候选肿瘤等位基因的列表，其中候选肿瘤等位基因包含非优势碱基，所述非优势碱基不是种系SNP；以及(e)基于所述候选肿瘤等位基因的列表，鉴定源自肿瘤的SNV。
16.根据权利要求54所述的方法，其中所述候选肿瘤等位基因包含基因组区域，所述基因组区域包含候选SNV。
17.一种用于对患有疾病或病症的受试者进行检测、诊断、预后或疗法选择的方法，其包括：(a)获得源自所述受试者的无细胞DNA(cfDNA)样品的序列信息，其中所述cfDNA样品通过实施基于ETP的分离和/或纯化来分离和/或纯化；以及(b)使用源自(a)的序列信息来检测所述样品中的无细胞非种系DNA(cfNG-DNA)，其中所述方法可能够检测cfNG-DNA的百分比，所述百分比可低于总cfDNA的2％或高于总cfDNA的约2％。
18.一种鉴定源自病毒的cfNA的无创性方法，其包括(a)从被怀疑具有病毒感染或被怀疑已经暴露于病毒的受试者获得样品；(b)进行基于ETP的分离和/或纯化来分离和/或纯化靶cfNA以获得分离和/或纯化的样品；(c)对所述分离和/或纯化的样品执行测序反应以产生测序信息；以及(d)基于所述测序信息，确定所述受试者是否已经被一种或多种病毒感染。
19.一种装置，其用于实施根据前述权利要求中任一项所述的基于ETP的分离和收集。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115144519A (zh) * 2022-06-30 2022-10-04 上海交通大学 基于无机纳米颗粒的单细胞样品指纹图谱检测方法和应用
CN116045835A (zh) * 2023-03-31 2023-05-02 成都太科光电技术有限责任公司 一种超大口径平面或球面光学干涉测试装置

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11542541B2 (en) * 2019-11-26 2023-01-03 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method and system for sampling material from cells
CN116113500A (zh) * 2020-07-13 2023-05-12 巴克曼实验室国际公司 荧光计校准装置和方法
US20240301394A1 (en) 2021-03-03 2024-09-12 Roche Sequencing Solutions, Inc. Devices and methods for electrophoretic extraction of nucleic acids from biological samples
WO2023004066A1 (en) * 2021-07-23 2023-01-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and devices for nucleic acid extraction using epitachophoresis
CN114067315B (zh) * 2021-10-23 2022-11-29 广州市艾贝泰生物科技有限公司 细胞计数方法、装置、计算机设备和存储介质

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120034685A1 (en) * 2010-08-06 2012-02-09 Tandem Diagnostics, Inc. Assay systems for determination of source contribution in a sample
US20140349859A1 (en) * 2010-08-06 2014-11-27 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization

Family Cites Families (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4469797A (en) 1982-09-23 1984-09-04 Miles Laboratories, Inc. Digoxigenin immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
DE3529478A1 (de) 1985-08-16 1987-02-19 Boehringer Mannheim Gmbh 7-desaza-2'desoxyguanosin-nukleotide, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung zur nukleinsaeure-sequenzierung
US6280929B1 (en) 1986-01-16 2001-08-28 The Regents Of The University Of California Method of detecting genetic translocations identified with chromosomal abnormalities
US5447841A (en) 1986-01-16 1995-09-05 The Regents Of The Univ. Of California Methods for chromosome-specific staining
US4774339A (en) 1987-08-10 1988-09-27 Molecular Probes, Inc. Chemically reactive dipyrrometheneboron difluoride dyes
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
DE3836656A1 (de) 1988-10-27 1990-05-03 Boehringer Mannheim Gmbh Neue digoxigenin-derivate und ihre verwendung
US5132432A (en) 1989-09-22 1992-07-21 Molecular Probes, Inc. Chemically reactive pyrenyloxy sulfonic acid dyes
US5274113A (en) 1991-11-01 1993-12-28 Molecular Probes, Inc. Long wavelength chemically reactive dipyrrometheneboron difluoride dyes and conjugates
US5433896A (en) 1994-05-20 1995-07-18 Molecular Probes, Inc. Dibenzopyrrometheneboron difluoride dyes
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5248782A (en) 1990-12-18 1993-09-28 Molecular Probes, Inc. Long wavelength heteroaryl-substituted dipyrrometheneboron difluoride dyes
US5338854A (en) 1991-02-13 1994-08-16 Molecular Probes, Inc. Fluorescent fatty acids derived from dipyrrometheneboron difluoride dyes
US5427932A (en) 1991-04-09 1995-06-27 Reagents Of The University Of California Repeat sequence chromosome specific nucleic acid probes and methods of preparing and using
US5187288A (en) 1991-05-22 1993-02-16 Molecular Probes, Inc. Ethenyl-substituted dipyrrometheneboron difluoride dyes and their synthesis
US5505928A (en) 1991-11-22 1996-04-09 The Regents Of University Of California Preparation of III-V semiconductor nanocrystals
US5262357A (en) 1991-11-22 1993-11-16 The Regents Of The University Of California Low temperature thin films formed from nanocrystal precursors
US5644048A (en) 1992-01-10 1997-07-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing phosphorothioate oligonucleotides
US6048616A (en) 1993-04-21 2000-04-11 Philips Electronics N.A. Corp. Encapsulated quantum sized doped semiconductor particles and method of manufacturing same
US5472842A (en) 1993-10-06 1995-12-05 The Regents Of The University Of California Detection of amplified or deleted chromosomal regions
US6090555A (en) 1997-12-11 2000-07-18 Affymetrix, Inc. Scanned image alignment systems and methods
US5637684A (en) 1994-02-23 1997-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphoramidate and phosphorothioamidate oligomeric compounds
US5571018A (en) 1994-11-23 1996-11-05 Motorola, Inc. Arrangement for simulating indirect fire in combat training
US5690807A (en) 1995-08-03 1997-11-25 Massachusetts Institute Of Technology Method for producing semiconductor particles
US5800996A (en) 1996-05-03 1998-09-01 The Perkin Elmer Corporation Energy transfer dyes with enchanced fluorescence
US5696157A (en) 1996-11-15 1997-12-09 Molecular Probes, Inc. Sulfonated derivatives of 7-aminocoumarin
US5830912A (en) 1996-11-15 1998-11-03 Molecular Probes, Inc. Derivatives of 6,8-difluoro-7-hydroxycoumarin
US5866366A (en) 1997-07-01 1999-02-02 Smithkline Beecham Corporation gidB
US6130101A (en) 1997-09-23 2000-10-10 Molecular Probes, Inc. Sulfonated xanthene derivatives
US6322901B1 (en) 1997-11-13 2001-11-27 Massachusetts Institute Of Technology Highly luminescent color-selective nano-crystalline materials
US5990479A (en) 1997-11-25 1999-11-23 Regents Of The University Of California Organo Luminescent semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
US6207392B1 (en) 1997-11-25 2001-03-27 The Regents Of The University Of California Semiconductor nanocrystal probes for biological applications and process for making and using such probes
AU4333799A (en) 1998-06-04 1999-12-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Digital optical chemistry micromirror imager
US6617583B1 (en) 1998-09-18 2003-09-09 Massachusetts Institute Of Technology Inventory control
US6372937B1 (en) 1998-11-09 2002-04-16 Mark Norman Bobrow Enhanced catalyzed reporter deposition
US6114038A (en) 1998-11-10 2000-09-05 Biocrystal Ltd. Functionalized nanocrystals and their use in detection systems
US6855202B2 (en) 2001-11-30 2005-02-15 The Regents Of The University Of California Shaped nanocrystal particles and methods for making the same
EP1179185B1 (en) 1999-05-07 2009-08-12 Life Technologies Corporation A method of detecting an analyte using semiconductor nanocrystals
US6818395B1 (en) 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US6225198B1 (en) 2000-02-04 2001-05-01 The Regents Of The University Of California Process for forming shaped group II-VI semiconductor nanocrystals, and product formed using process
US6306736B1 (en) 2000-02-04 2001-10-23 The Regents Of The University Of California Process for forming shaped group III-V semiconductor nanocrystals, and product formed using process
EP2365096A1 (en) 2000-03-22 2011-09-14 Life Technologies Corporation Methods of using semiconductor nanocrystals in bead-based nucleic acid assays
US6689338B2 (en) 2000-06-01 2004-02-10 The Board Of Regents For Oklahoma State University Bioconjugates of nanoparticles as radiopharmaceuticals
AU7918501A (en) 2000-08-04 2002-02-18 Molecular Probes Inc Derivatives of 1,2-dihydro-7-hydroxyquinolines containing fused rings
US6942970B2 (en) 2000-09-14 2005-09-13 Zymed Laboratories, Inc. Identifying subjects suitable for topoisomerase II inhibitor treatment
US6649138B2 (en) 2000-10-13 2003-11-18 Quantum Dot Corporation Surface-modified semiconductive and metallic nanoparticles having enhanced dispersibility in aqueous media
US20020083888A1 (en) 2000-12-28 2002-07-04 Zehnder Donald A. Flow synthesis of quantum dot nanocrystals
CA2440754A1 (en) 2001-03-12 2002-09-19 Stephen Quake Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences by asynchronous base extension
US6709929B2 (en) 2001-06-25 2004-03-23 North Carolina State University Methods of forming nano-scale electronic and optoelectronic devices using non-photolithographically defined nano-channel templates
WO2003092043A2 (en) 2001-07-20 2003-11-06 Quantum Dot Corporation Luminescent nanoparticles and methods for their preparation
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
WO2006116742A2 (en) 2005-04-28 2006-11-02 Ventana Medical Systems, Inc. Fluorescent nanoparticles conjugated to antibodies via a peg linker
JP5628476B2 (ja) 2005-04-28 2014-11-19 ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド 抗体コンジュゲート
US20090233291A1 (en) * 2005-06-06 2009-09-17 454 Life Sciences Corporation Paired end sequencing
CN101365781A (zh) 2005-11-21 2009-02-11 阿普尔拉公司 用于核酸处理的便携式制备、分析和检测设备
JP5199880B2 (ja) 2005-11-23 2013-05-15 ベンタナ・メデイカル・システムズ・インコーポレーテツド 分子コンジュゲート
US7282337B1 (en) 2006-04-14 2007-10-16 Helicos Biosciences Corporation Methods for increasing accuracy of nucleic acid sequencing
WO2007131191A2 (en) 2006-05-05 2007-11-15 Perkinelmer Life And Analytical Sciences Mass spectrometry methods for multiplexed quantification of protein kinases and phosphatases
US8349167B2 (en) 2006-12-14 2013-01-08 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for detecting molecular interactions using FET arrays
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
EP2639578B1 (en) 2006-12-14 2016-09-14 Life Technologies Corporation Apparatus for measuring analytes using large scale fet arrays
WO2009069984A2 (en) 2007-11-30 2009-06-04 Genomictree, Inc. Diagnosis kit and chip for bladder cancer using bladder cancer specific methylation marker gene
US20100035252A1 (en) 2008-08-08 2010-02-11 Ion Torrent Systems Incorporated Methods for sequencing individual nucleic acids under tension
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US20100301398A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US8546128B2 (en) 2008-10-22 2013-10-01 Life Technologies Corporation Fluidics system for sequential delivery of reagents
US8574835B2 (en) 2009-05-29 2013-11-05 Life Technologies Corporation Scaffolded nucleic acid polymer particles and methods of making and using
US8673627B2 (en) 2009-05-29 2014-03-18 Life Technologies Corporation Apparatus and methods for performing electrochemical reactions
US20120100548A1 (en) 2010-10-26 2012-04-26 Verinata Health, Inc. Method for determining copy number variations
US9260745B2 (en) 2010-01-19 2016-02-16 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
WO2011109769A1 (en) 2010-03-04 2011-09-09 Ventana Medical Systems, Inc. Processing system for processing specimens using acoustic energy
WO2011133625A1 (en) 2010-04-20 2011-10-27 Ventana Medical Systems, Inc. Two-color chromogenic in situ hybridization
WO2011139976A1 (en) 2010-05-04 2011-11-10 Ventana Medical Systems, Inc. Cell staining with air quenched steam heating
AU2011274369A1 (en) 2010-07-02 2012-12-06 Ventana Medical Systems, Inc. Hapten conjugates for target detection
ES2676183T3 (es) 2010-07-02 2018-07-17 Ventana Medical Systems, Inc. Detección de dianas usando marcas de masa y espectrometría de masas
JP2014505248A (ja) 2011-01-10 2014-02-27 ヴェンタナ メディカル システムズ， インク． ヘマトキシリン染色法
US9448231B2 (en) 2011-02-28 2016-09-20 Ventana Medical Systems, Inc. Application of quantum dots for nuclear staining
GB2484764B (en) 2011-04-14 2012-09-05 Verinata Health Inc Normalizing chromosomes for the determination and verification of common and rare chromosomal aneuploidies
DK2707505T3 (en) 2011-05-09 2016-07-25 Ventana Med Syst Inc SPECTRAL IMAGE FOR MEASUREMENT OF NUCLEAR PATHOLOGICAL FEATURES IN CANCER CELLS PREPARED FOR IN SITU ANALYSIS
US20130115628A1 (en) 2011-08-02 2013-05-09 Ventana Medical Systems, Inc. Method for selection of chemotherapeutic agents for adenocarcinoma cancer
GB2497510A (en) 2011-11-10 2013-06-19 Harry Cuppens Methods for determining mononucleotide sequence repeats
WO2013079606A1 (en) 2011-12-01 2013-06-06 Ventana Medical Systems, Inc. Automated dual stain of mirna and protein targets
EP2798355B1 (en) 2011-12-30 2018-09-12 Ventana Medical Systems, Inc. Automated analysis of circulating tumor cells
EP2807272A1 (en) 2012-01-27 2014-12-03 Ventana Medical Systems, Inc. Devices and methods for detecting bio-analytes using optically decipherable patterns
KR20140120321A (ko) 2012-02-01 2014-10-13 벤타나 메디컬 시스템즈, 인코포레이티드 조직 샘플들에 있어서의 유전자들을 검출하는 시스템
US20130252240A1 (en) 2012-03-21 2013-09-26 Ventana Medical Systems, Inc. Cryoembedded cell concentrates, methods for making, and methods for using
JP6253657B2 (ja) 2012-10-08 2017-12-27 ヴェンタナ メディカル システムズ， インク． 有色素サンプルを明確化するための方法、キット、及びシステム
WO2014079802A2 (en) 2012-11-20 2014-05-30 Ventana Medical Systems, Inc. Laser ablation inductively-coupled plasma mass spectral tissue diagnostics
WO2014106076A2 (en) 2012-12-28 2014-07-03 Quest Diagnostics Investments Incorporated Universal sanger sequencing from next-gen sequencing amplicons
US20150369772A1 (en) 2013-02-07 2015-12-24 Koninklijke Philips N.V. Processing of nucleotide sequences
CA2901513C (en) 2013-03-12 2020-12-29 Ventana Medical Systems, Inc. Proximity assay for in situ detection of targets
CN113337604A (zh) 2013-03-15 2021-09-03 莱兰斯坦福初级大学评议会 循环核酸肿瘤标志物的鉴别和用途
US20140278461A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center System and method for integrating a medical sequencing apparatus and laboratory system into a medical facility
WO2015032695A1 (en) 2013-09-09 2015-03-12 Ventana Medical Systems, Inc. Scoring method for mesothelin protein expression
AU2014333927A1 (en) 2013-10-07 2016-03-03 Ventana Medical Systems, Inc. Systems and methods for comprehensive multi-assay tissue analysis
KR20160062763A (ko) 2013-10-18 2016-06-02 세븐 브릿지스 지노믹스 인크. 유전자 샘플을 유전자형 결정하기 위한 방법 및 시스템
JP6588444B2 (ja) 2014-01-28 2019-10-09 ベンタナ メディカル システムズ， インコーポレイテッド 全スライド組織セグメント化のための適応分類
JP6982392B2 (ja) 2014-02-21 2021-12-17 ヴェンタナ メディカル システムズ， インク． 染色体又は遺伝子コピーの計数のための一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ
ES2701092T5 (es) 2014-02-24 2022-05-12 Ventana Med Syst Inc Procedimientos, kits y sistemas para puntuar la respuesta inmunitaria al cáncer por detección simultánea de CD3, CD8, CD20 y FOXP3
CA2940118C (en) 2014-02-24 2023-05-23 Ventana Medical Systems, Inc. Automated rna detection using labeled 2'-o-methyl rna oligonucleotide probes and signal amplification systems
EP3126847B1 (en) 2014-03-31 2021-07-28 Ventana Medical Systems, Inc. Automated specimen processing systems and multistep processing of microscope slides
AU2015261891A1 (en) 2014-05-23 2016-10-13 Ventana Medical Systems, Inc. Systems and methods for detection of biological structures and/or patterns in images
EP3161448A1 (en) 2014-06-27 2017-05-03 Ventana Medical Systems, Inc. Automated specimen processing systems and methods of detecting specimen-bearing microscope slides
ES2940620T3 (es) * 2016-11-02 2023-05-09 Archerdx Llc Métodos de preparación de muestras de ácido nucleico para la secuenciación del repertorio inmunitario
KR20190095410A (ko) * 2016-12-22 2019-08-14 가던트 헬쓰, 인크. 핵산 분자를 분석하기 위한 방법 및 시스템
US11691141B2 (en) * 2017-11-13 2023-07-04 Roche Sequencing Solutions, Inc. Devices for sample analysis using epitachophoresis
CN111757934A (zh) * 2017-12-21 2020-10-09 豪夫迈·罗氏有限公司 通过单向双重探针引物延伸的靶标富集
US20210382002A1 (en) * 2018-10-12 2021-12-09 Roche Sequencing Solutions, Inc. Detection methods for epitachophoresis workflow automation

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120034685A1 (en) * 2010-08-06 2012-02-09 Tandem Diagnostics, Inc. Assay systems for determination of source contribution in a sample
US20140349859A1 (en) * 2010-08-06 2014-11-27 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BECKMAN: "SPRI 磁珠技术概述", Retrieved from the Internet <URL:https://www.mybeckman.cn/resources/technologies/spri-beads> *
FRANTISEK FORET: ""Macrofluidic Device for Preparative Concentration Based onEpitachophoresis"", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》, pages 7047 - 7053 *
曹际娟: "《食品微生物学与现代检测技术》", 30 April 2006, 辽宁师范大学出版社, pages: 539 - 540 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115144519A (zh) * 2022-06-30 2022-10-04 上海交通大学 基于无机纳米颗粒的单细胞样品指纹图谱检测方法和应用
CN116045835A (zh) * 2023-03-31 2023-05-02 成都太科光电技术有限责任公司 一种超大口径平面或球面光学干涉测试装置
CN116045835B (zh) * 2023-03-31 2023-06-02 成都太科光电技术有限责任公司 一种超大口径平面或球面光学干涉测试装置

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JP2024012501A (ja) 2024-01-30
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