KR100691043B1 - 컴퓨터 제어된 태아 세포 포함 희귀 세포 진단 방법 및 장치 - Google Patents

컴퓨터 제어된 태아 세포 포함 희귀 세포 진단 방법 및 장치 Download PDF

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Abstract

컴퓨터 제어된 희귀세포 탐지 및 진단 방법이 제공되는데, 한 위치에서 희귀세포의 존재를 나타내는 제 1 신호를 발생하도록 조직 샘플을 처리하고, 제 1 신호를 탐지하고, 제 1 신호가 탐지된 위치를 처리하여 진단에 유용한 세포 특성을 나타내는 제 2 신호를 발생시키고, 제 2 신호를 탐지하는 단계를 포함한다. 제 1 신호는 염색전 또는 후 찾고있는 세포에 존재하는 색상 또는 형상일 수 있다. 제 2 신호는 in situ PCR 또는 PCR in situ 교잡에 의해 발생될 수 있다. 한 구체예에서 희귀세포는 산모 혈액 조직 샘플내 태아세포이고, 상기 샘플은 농축안된 산모혈액 표본으로 구성된다. 또다른 구체예에서 본 방법은 혈액 또는 조직 샘플에서 암세포 진단에 사용된다.

Description

컴퓨터 제어된 태아 세포 포함 희귀 세포 진단 방법 및 장치{METHOD AND APPARATUS FOR COMPUTER CONTROLLED RARE CELL, INCLUDING FETAL CELL, BASED DIAGNOSIS}
본 발명은 세포 샘플 획득, 희귀 세포 식별 및 선택된 희귀 세포 특성에 기초한 진단을 위한 컴퓨터 제어된 방법 및 장치에 관계한다. 한 구체예에서 본 발명은 태아 세포 기초 태아 진단용 산모 혈액 샘플 획득에 관계한다.
인간의 유전장애 DNA 기초 태아진단법은 수많은 새로운 진단방법의 개발을 가져왔다. 이러한 진단방법은 유전장애를 갖는 태아에 대해 조기 탐지, 판정 및 중재를 허용한다. 그러나 이들 방법은 수많은 결점이 있다. 새로운 진단방법 각각은 특정 유전 장애 징후에 대해 태아 DNA가 조사 또는 검사되도록 분리된 태아세포 샘플이 획득될 필요가 있다. 이러한 최신 방법의 결점은 주로 태아 세포 샘플 획득 필요성에 기인한다. 현재 태아 세포는 양막천자 또는 융모막 융모 샘플링에 의한 산과 중재를 필요로 하는 공격적 절차에 의해 획득된다. 이러한 특수절차는 태아에 작지만 중요한 위험을 제공한다. 임신 초기에 태아에 대한 위험 수준은 높고 획득된 세포의 수는 적다. 그러므로 임신 18-20주가 될 때까지 이러한 절차의 결과는 종종 수득되지 못한다.
태아 세포를 획득하기 위한 한가지 최신 절차는 태아 세포를 산모 순환계로 누출시키는 것이다. 산호 혈액샘플을 단순히 취함으로써 이론적으로는 DNA 기초방법에 의한 태아진단을 하기에 충분한 양으로 태아 세포 물질을 획득할 수 있다. 산모 혈액 순환계로부터 태아 세포 획득은 태아에 위험을 제공하지 않으므로 임신 10-12주정도 조기에 행할 수 있다.
산모 혈액 순환계에서 획득된 태아 세포는 트로포블라스트, 임파구 및 핵화된 적혈구를 포함한다. 트로포블라스트는 큰 크기 때문에 산모 혈액 순환에서 식별되는 제 1 태아세포이다. 그러나 핵화된 적혈구는 성인 혈액 순환계에서 희귀성, 태아 혈액에서 풍부함 및 제한된 수명 때문에 태아 진단용 유전물질원으로서 가장큰 관심을 받는다. 이들 인자는 태아 세포물질과 산호 세포 물질을 구별할 때 오차를 감소시키도록 조합된다. 산모혈액에서 순환하는 태아 세포는 수주(핵화된 적혈구의 경우)내지 수년(임파구의 경우)의 수명을 가진다.
이들은 산모 혈액 순환계에서 꾸준하게 존재하지만 태아 세포는 매우 희귀하고 매우 제한적인 진단 활용도를 가진다. 산모 혈액 순환계에서 태아 세포의 농도는 105 산모세포내 1개의 태아 세포부터 109 산모세포내 1개의 태아세포까지 다양하다. 따라서 산모혈액 10㎖ 샘플은 보통 10 내지 100개의 태아 세포를 포함한다. 새롭게 취한 산모 혈액 샘플에서 발견된 태아 세포의 농도는 추가 처리 받기전 "자연적으로 존재하는 태아 세포 농도"라 칭한다. "농축되지 않은 산모혈액"은 천연 존재 태아세포 농도를 가지는 산모 혈액 샘플이다.
농축되지 않는 산모 혈액에서 천연 존재 태아세포농도는 매우 낮기 때문에 진단에 의미가 있는 태아 세포 샘플 획득을 위해서 최신 기술은 샘플내 산모 세포로부터 태아 세포를 물리적으로 분리하는 방법을 포함한다. 본질적으로 최신기술은 태아세포를 제거하지 않고 과잉 산모세포를 제거함으로써 샘플내 태아세포 농축방법이다. 이들 방법은 수행하기가 매우 어렵고 신뢰할만한 후속 진단에 적절한 순도의 손상안된 태아세포를 충분한 갯수를 가지는 샘플을 제공하기가 종종 불가능하다.
발명의 요약
조직 샘플내 희귀 세포 타입을 탐지하고 진단하기 위한 컴퓨터 제어된 방법 및 장치가 필요하고 상기 진단은 희귀세포의 특성에 기초한다. 혈액 조성물에서 태아 세포를 탐지하고 태아 세포 기초 진단을 수행하는 컴퓨터 조절된 방법 및 장치 제공도 필요하다.
일반적으로 본 발명은 체액 또는 조직 샘플 영상 데이터 컴퓨터 구현 처리방법을 제공하는데, 이 방법은 제 1 배율에서 취한 체액 또는 조직 샘플의 영상을 나타내는 제 1 영상데이터 부분집합을 생성하는 단계를 포함하며, 이 부분집합은 제 2 배율에서 취한 후보 얼룩의 영상을 나타내는 제 2 영상 데이터 집합의 부분집합을 생성하는 희귀 세포를 포함할 수 있는 후보 얼룩을 나타내며, 제 2 데이터 집합의 부분집합은 희귀세포를 나타내고 컴퓨터 메모리에 제 2 데이터 집합의 부분집합을 저장하는 단계를 포함한다.
일반적으로 제 1 영상 데이터 집합의 부분집합은 희귀세포의 존재를 나타내 는 신호를 탐지하기 위해서 컴퓨터화된 마시적 시각 시스템을 사용하여 체액 또는 조직 샘플에서 나온 세포 단층의 광학적 필드를 관찰함으로써 생성될 수 있다.
본 발명은 또한 제 1 영상 데이터 집합에서 표현되는 각 후보 얼룩에 대응하는 지점에서 체액 또는 조직 샘플을 시약과 접촉시켜 의학적으로 의미있는 신호를 발생시키는 과정을 포함한다. 이 방법은 후보 얼룩을 나타내는 제 1 데이터 집합의 부분집합이 생성되지 않은 체액 또는 조직 샘플을 추가 처리로부터 제거할 수 있는 장점을 제공한다. 신호가 측정될 수 있다. 제 1 및 제 2 영상 데이터 부분집합은 컴퓨터에 의해 제어 및 처리하기에 더욱 적합한 표현으로 변환될 수 있다. 한 구체예에서 영상 데이터는 RGB(적녹청)신호로부터 HLS(색조발광포화)신호로 변환된다. 사전 선택된 기준을 충족시키는 세포를 구분하고 기준에 맞지 않은 것을 제거해서 희귀 세포를 식별하는데 필터 또는 마스크가 활용된다.
또다른 측면에서 체액 또는 조직 샘플을 수령하고, 체액 또는 조직 샘플 얼룩을 생성하고, 컴퓨터화된 현미경을 작동시켜 소프트웨어가 얼룩내 희귀세포를 식별하고, 희귀세포내 의학적으로 의미하는 신호를 탐지하는 단계를 포함한 실험실 서비스 수행방법이 제공된다.
또다른 측면에서 컴퓨터 작동시 희귀세포 타입 탐지 및 진단단계를 직접수행하는 일련의 지령이 저장된 컴퓨터 판독가능한 저장 매체를 포함한 컴퓨터 소프트웨어 제품이 제공된다. 단계는 제 1 배율에서 취한 체액 또는 조직 샘플의 영상을 나타내는 제 1 영상 데이터 집합의 부분 집합을 생성하고, 이 부분집합은 제 2 배율에서 취한 후보 얼룩의 영상을 나타내는 제 2 영상 데이터 집합의 부분집합을 생 성하는 희귀세포를 포함할 수 있는 후보 얼룩을 나타내며, 제 2 데이터 집합의 부분집합은 희귀세포를 나타내며, 컴퓨터 메모리에 제 2 데이터 집합의 부분집합을 저장하는 단계를 포함한다.
일반적으로 제 1 영상 데이터 집합의 부분집합이 위와같이 생성될 수 있다. 단계는 제 1 영상 데이터 집합의 부분집합으로 표현된 각 후보 얼룩에 대응하는 지점에서 체액 또는 조직 샘플을 시약과 접촉시켜 의학적으로 의미있는 신호를 발생시키는 과정을 포함한다. 이것은 후보 얼룩을 나타내는 제 1 영상 데이터 집합의 부분집합이 생성되지 않는 체액 또는 조직 샘플 추가처리를 제거할 수 있는 장점을 제공한다. 신호가 의미있는 수준인지 여부를 판정하도록 신호를 측정하는 보조단계가 있다. 또다른 보조단계는 제 1 및 제 2 영상 데이터 부분집합을 컴퓨터에 의해 제어 및 처리하기에 더욱 적합한 표현으로 변환시키는 과정을 포함한다. 한 구체예에서 영상 데이터는 RGB(적녹청)신호에서 HLS(색조발광포화)신호로 변환된다. 사전 선택된 기준을 충족시키는 세포를 구별하여 그렇지 못한 것은 제거하는데 필터 또는 마스크가 활용된다.
한 측면에서 진단 절차용 세포 샘플 제조방법이 제공된다. 세포 샘플이 획득되고 기질상에 단층으로 고정되며, 세포 샘플은 10,000개 세포당 1개 미만(즉, 0.01%미만)으로 샘플에 존재하는 희귀 세포를 포함한다. 세포 샘플의 적어도 일부를 덮는 광학 필드가 컴퓨터화된 현미경 시각 시스템을 사용하여 관찰되어 희귀 세포 존재를 나타내는 신호를 알아낸다. 신호가 탐지되면 신호가 탐지된 좌표가 진단 절차를 위해 식별된다. 한 구체예에서 희귀 세포는 세포의 0.01%미만, 특히 0.001%미만, 더더욱 0.0001%미만, 심지어 0.000001%미만이다.
한 구체예에서 희귀세포는 산모 혈액에서 나온 세포 샘플내 태아 세포이다. 한 구체예에서 샘플은 0.001%미만, 0.0001%미만, 0.00001%미만, 0.000001%미만, 심지어 0.000000%미만으로 자연적으로 존재하는 태아세포농도를 가진다.
또다른 구체예에서 탐지 및 진단될 희귀 세포 타입은 동물 또는 환자의 세포 또는 조직 샘플에서 발견되는 암세포이다. 샘플은 세포 또는 조직 함유 혈액 또는 기타 체액일 수 있다. 섹션 5에서 발표된 암세포 마커(예, GM4 단백질), 텔로메라제 단백질 또는 핵산, P53단백질 또는 핵산이 제 1 또는 제 2 신호 발생에 사용될 수 있다.
한 구체예에서 희귀 세포가 샘플에 존재할 때 본 발명의 방법은 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상 및 99%이상의 탐지 주파수에서 희귀세포를 탐지한다.
한 구체예에서 다음을 포함한 진단 절차용 혈액 샘플 제조방법이 제공된다: 자연적으로 존재하는 태아 세포를 포함한 농축안된 산모 혈액 샘플 표본을 준비하고; 태아 세포 존재를 나타내는 신호 여부에 대해 컴퓨터화된 현미경 시각 시스템 사용하여 표본 일부를 덮는 광학 필드를 관찰하고; 신호가 탐지된 표본내 좌표들 지단 절차를 위해 식별하는 단계.
한 구체예에서 희귀세포의 형상을 표현하도록 신호가 더욱 처리된다. 또다른 구체예에서 희귀세포와 다른 세포의 광학적 구별을 증진시키도록 세포가 라벨로 처리된다. 이 구체예에서 신호는 희귀세포에 선택적으로 결합된 라벨로부터 나올 수 있다. 또다른 구체예에서 진단 절차를 영상이 분리된 희귀세포에 대한 것이 될 때까지 식별된 좌표로 이동시키고 광학 필드를 확대시키는 과정을 포함한다.
한 구체예에서 모든 세포에 대해 광학 필드가 단계화된다. 이것은 컴퓨터화된 현미경 시각 시스템의 제어하에서 기질상의 세포를 상기 시스템의 렌즈에 대해 이동시킴으로써 달성된다. 또다른 구체예에서 제 1 신호가 획득된 좌표가 식별되고 이후에 이 좌표에 있는 희귀세포가 좌표 식별후 접촉된다.
또다른 측면에서 세포 샘플내 희귀 세포에 대한 진단적 의미를 가지는 세포 샘플 수득방법이 제공된다. 희귀세포는 10,000개의 세포당 1개 미만의 갯수로 샘플에 존재한다. 이 방법은 기질상에 고정된 세포 샘플 단층 제조단계를 포함한다. 희귀세포는 진단 신호를 발생시키는 작용제와 접촉되고 진단 신호는 진단적 의미를 가진다. 컴퓨터화된 현미경 시각 시스템을 사용하여 단층이 관측되어서 진단 신호를 획득한다. 한 구체예에서 진단 신호가 희귀 세포 식별에 사용된다. 다른 구체예에서 위치 신호가 희귀 세포 식별에 사용되고 세포가 위치된후 진단신호가 수득된다.
한 구체예에서 희귀세포는 10,000개의 세포마다 1개미만(즉, 0.01%미만), 0.001%미만, 0.00001%미만 심지어 0.0000001%미만의 갯수로 샘플에 존재한다. 한 구체예에서 희귀세포는 산모 혈액으로부터 취한 세포 샘플내 태아 세포이다. 샘플은 0.001%미만, 0.0001%미만, 0.00001%미만, 0.000001%미만, 심지어 0.000000%미만으로 자연적으로 존재하는 태아 세포를 포함한다.
한 측면에서 자연적으로 존재하는 농도의 태아세포를 함유한 농축안된 산모혈액 샘플로부터 태아 세포에 대한 진단적 의미를 갖는 신호를 획득하는 방법이 제 공된다. 이 방법은 농출안된 산모 혈액 샘플 표본을 준비하고; 컴퓨터화된 현미경 시스템을 사용하여 표본을 관측함으로써 태아 세포의 존재를 나타내는 제 1 신호를 획득하고; 태아 세포를 작용제와 접촉시켜 진단적 의미를 갖는 제 2 신호를 발생시키고; 컴퓨터화된 현미경 시스템에 의해 태아세포를 관측하여 제 2 신호를 수득하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서 표본은 250㎕이상 특히 500㎕이상의 농축안된 산호 혈액을 포함할 수 있다.
제 1 신호는 더욱 처리되어서 희귀세포의 형상을 측정한다. 유사하게 산모세포와 같은 다른 세포로부터 태아 세포의 광학적 구별등을 증진시키기 위해서 세포가 라벨로 처리될 수 있다. 이를 위해서 제 1 신호를 태아세포와 같은 의귀 세포에 선택적으로 결합하는 라벨로부터 나올 수 있다. 관측 단계는 세포 부위 위로 광학 필드를 단계화시키는 과정을 포함하며, 이것은 컴퓨터화된 현미경 시스템의 제어하에서 렌즈에 대해 세포 또는 기질을 이동시킴으로써 달성된다.
세포가 기질상에 준비되고 한 단계에서 식별된 희귀 세포의 좌표가 또다른 단계에서 후자로 복귀될 수 있도록 좌표계가 기질에 대해 보정될 수 있다. 유사하게 기질은 폭의 10배인 길이를 가지며 한 방향으로 길쭉하다. 길이는 폭의 20배일수도 있다. 기질은 신축성 필름일 수 있으며, 한 구체예에서 비교적 많은 부피의 세포를 지탱할 수 있는 기다란 신축성 필름이다.
제 1 및 제 2 신호는 둘다 존재할 때 서로를 차단하지 않도록 선택된다. 유사하게 제 2 신호가 in situ PCR 또는 형광 in situ 교잡(FISH)에 의해 발생될 수 있다.
한 구체예에서 기질은 세포 샘플의 준비되는 복수의 기질이며(복수의 산모 혈액 표본과 같은), 각각은 5㎕이상의 샘플을 포함한다. 희귀 세포 함유 기질(제 1 신호가 획득되는)이 식별된다. 이후에 식별된 희귀세포 함유 기질만이 처리되어서 제 2 신호를 발생한다.
또다른 측면에서 자연 존재 태아 세포 함유 농축안된 산모 혈액 샘플을 사용하여 태아 진단을 수행하는 방법이 제공된다. 이 방법은 250㎕이상의 농축안된 산모 혈액 샘플 표본을 준비하고; 표본 내에서 태아 세포를 식별하고; 태아 세포를 진단 신호 생성 작용제와 접촉시키고; 진단 신호를 관측하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서 식별 단계는 컴퓨터화된 현미경 시스템을 사용하여 표본내 세포를 관측하고, 태아 세포의 존재를 나타내며 관측된 세포에 의해 생성되는 신호를 측정하고, 측정된 신호가 태아 세포의 존재를 나타내는 좌표를 한정하는 과정을 포함한다. 산호 혈액의 부피, 기질 구성등은 위에서 기술된바와 같다.
또다른 측면에서 자연적으로 존재하는 농도의 태아세포를 함유한 농축안된 산모 혈액 샘플로부터 분리된 태아세포의 영상 획득 방법이 제공된다. 이 방법은 250㎕이상의 농축안된 산모 혈액 샘플 표본을 준비하고; 컴퓨터화된 현미경 시스템을 사용하여 표본을 관측하여 태아 세포의 존재를 나타내는 신호를 측정하고; 신호가 관측되는 좌표를 식별하고; 식별된 좌표에 대해 태아 세포 영상을 포함한 광학 필드를 이동시키고; 영상이 분리된 태아세포에 대한 것이 될 때까지 광학 필드를 확대시키는 단계를 포함한다.
또다른 측면에서 자연적으로 존재하는 농도의 태아세포를 함유한 농축안된 산모혈액 샘플내에 포함된 태아 세포를 스크린잉 하는 장치가 제공된다. 신축성 필름상에는 250㎕이상의 산호혈액 표본이 있다. 한 구체예에서 신축성 필름은 500㎕이상의 산모혈액 표본이 있다. 신축성 필름은 길이가 폭의 10배인 기다란 필름일 수 있다.
또다른 측면에서 10000개의 세포단 1개 미만의 희귀세포농도로 세포샘플내 포함된 희귀세포 스크린잉 장치가 제공된다. 이 장치는 그위에 세포 샘플이 고정된 신축성 필름이고, 신축성 필름은 5인치 이상의 길이를 가진다. 한 구체예에서 신축성 필름은 폭의 10배인 길이를 가진다. 신축성 필름이 마킹 좌표를 포함하여서, 컴퓨터화된 현미경 시스템이 필름상의 한점에 대해 한 세포를 위치시키고 필요할 경우 그 세포를 나중에 복귀시킬 수 있게 한다.
또다른 측면에서 슬라이드상의 특정위치에 재료를 분배하는 장치가 제공된다. 이 장치는 세포 샘플내 희귀 세포 존재를 나타내는 신호를 탐지하기 위한 현미경 시스템을 포함한다. 이 장치는 또한 광학 필드에서 희귀세포의 좌표를 식별하는 수단을 포함한다. 이 장치는 일정 부피의 물질을 분배하는 분배기와 희귀세포상에 물질을 분배하도록 분배기를 좌표에 대해 이동시키는 수단을 부착하고 있다.
또다른 측면에서 최소의 시간으로 넓은 영역을 스캐닝할 필요성이 "복합"영상을 제공하는 장치나 시스템을 사용하여 충족된다. 이것은 컴퓨터 제어되는 대물 렌즈 배열을 동시사용하여 이루어지며, 대물렌즈는 지지시스템상에 배열되고 미시적 대상에 초점을 맞출 수 있다. 각 대물렌즈는 전하쌍 디바이스 카메라에(CCD 카 메라)연결되고 호스트 컴퓨터에 설치된 영상 취득 하드웨어에 연결된다. 영상은 컴퓨터 메모리에 저장되고 "복합"영상이 컴퓨터 메모리에서 형성되도록 나란히 조합된다. 이후에 "복합"영상은 문제의 특징을 탐지하는 영상화 절차를 사용하여 단일체로서 처리된다. 상기 시스템의 장점은 수개의 대물렌즈로부터 동시에 영상을 획득할 수 있으므로 사용된 대물렌즈 갯수에 반비례하는 방식으로 넓은 샘플 영역을 처리하는데 필요한 시간이 최소화된다.
"복합"시스템은 투과광 또는 반사광을 사용하여 미시적 대상을 처리할 수 있다. 이것은 스크린 또는 진단용 미시적 생물학적 대상을 처리하기 위해 상당한 시간이 걸리는 수많은 샘플이 처리되는 경우에 특히 유용하다.
도 1 은 본 발명의 방법을 요약하는 순서도이다.
도 2 는 한 구체예에서 사용되는 분석 시스템의 블록선도이다.
도 3 은 제 1 신호를 탐지하는 단계 1의 순서도이다.
도 4a 및 4b 는 제 1 신호를 탐지하는 단계 2의 순서도이다.
도 5 는 제 2 신호 탐지 순서도이다.
도 6 은 연속 표본 기술을 사용하는 본 발명 장치를 보여준다.
도 7 은 분석 및 시약 분배 시스템의 블록선도이다.
도 8 은 복수의 대물 현미경 시스템의 아웃라인이다.
도 9 는 영상 "구성" 방법이다.
본 발명이 희귀세포로서 태아세포, 체액 또는 조직 샘플로서 혈액에 대해 설명하고 있을지라도 본 발명은 기질상에 세포 단층을 생성할 수 있는 모든 체액 또는 조직 샘플과 모든 희귀세포에 기초한 진단을 포함한다.
본 발명의 범위에 속하는 체액 및 조직 샘플은 혈액, 조직, 철수, 뇌수, 소변, 폐액등이다. 세포가 단층으로 존재하지 않는 조직 샘플의 경우에 당해 분야에서 공지된 표준 기술에 의해 세포가 해지될 수 있다. 이러한 기술은 조직의 트립신, 콜라겐아제 또는 디파아제 처리를 포함한다.
한 구체예에서 본 발명은 태아세포 탐지 및 진단에 사용된다. 우리의 목표는 태아 세포 기초 태아 진단을 수행하는 비-공격적 방법을 찾는 것이다. 산모 혈액 샘플내 태아 세포의 농도를 농축시키는 시도를 하기 보다는 우리의 방법은 농축안된 산모 혈액 샘플내 태아 세포를 식별하고 식별된 태아 세포에 대해 진단 절차를 수행하는 단계를 포함한다.
도 1 의 순서도에 도시된 본 방법을 요약하면 다음과 같다:
ㆍ 농출안된 산모 혈액 샘플로부터 하나이상의 혈액 표본 준비(101);
ㆍ 예정된 수의 태아 세포(예, 핵화된 적혈구)가 식별될때까지 하나 이상의 혈액 표본을 스크린잉하고 그 좌표를 한정(103);
ㆍ 태아 세포가 식별된 표본 또는 좌표를 처리하여 태아 세포내 유전 특징의 존재 여부를 진단(105).
이 방법에서 두가지 신호, 제 1 신호와 제 2 신호가 정의된다. "신호"는 탐지 및 식별될 수 있어서 정보를 가지는 것이다. 한가지 유용한 신호는 관심 구조 에 선택적으로 결합된 형광 연료에 의해 방출된 빛이다. 이 신호는 형광 염료 없이는 탐지하기 곤란한 구조의 존재를 나타낸다.
스크린잉(103)은 제 1 신호에 기초한다. 세포를 식별하는 제 1 신호를 헤모글로빈 ε-체인(즉, 태아 헤모글로빈)에 대한 항체에 결합된 형광 염료에 의해 발생될 수 있다. 혹은 세포 인지 알고리즘을 사용하여 식별되고 핵화된 적혈구의 특성 형상에 대한 세포의 유사성이 제 1 신호로서 역할을 할 수 있다. 또한 제 1 신호는 에오신 및 산 헤마톡실린으로 염색시킨후 태아 헤모글로빈의 특성 색상의 존재가 될 수 있다. 태아세포의 존재를 표시하는 모든 표시제가 제 1 신호로서 기능을 할 수 있다.
진단(105)은 제 2 신호에 기초한다. 테스트되는 특정 유전 특성의 존재를 나타내는 제 2 신호는 in situ PCR-증폭 또는 PCR in situ 교잡 또는 FISH에 의해 발생될 수 있다. 두가지 신호를 방출하는 세포가 등급이 매겨진다. 즉 세포는 태아세포이가 유전특성을 포함한다. 탐지된 제 1 및 제 2 신호의 세기 및 갯수가 계속된다.
한 구체예에서 특정 핵산 서열이 FISH에 의해 탐지된다. 한 구체예에서 FISH는 희귀세포(예, 태아세포)의 변성된 DNA를 변성된 디옥시제닌(DIG)-라벨링된 게놈 프로브와 교잡시킨다. 테스트 DNA를 포함한 샘플이 세척되고 형광단에 연결된 안티-DIG 항체에 결합된다. 형광단-공액 안티-Fab 항체와 배양시켜 제 2 형광단층(예 FITC)이 첨가된다. 한 구체예에서 FISH는 희귀세포의 변성된 DNA를 특정 형광단으로 직접 라벨링된 타겟 DNA 영역에 상동인 DNA 서열을 포함한 형광 라벨링 된 프로브와 교잡시키는 단계를 포함한다.
광학 필드에서 다른 물체 및 배경으로부터 관심 대상을 식별하는 방법 및 장치에 의해 자동 샘플 분석이 수행된다. 자동 시스템의 예는 미국특허 5,352,613(1994. 10. 4)에 발표된다. 대상이 식별되면 대상 또는 관심 매개변수를 포함한 픽셀의 색상(즉, 적, 녹, 청 성분의 조합)이 측정되고 저장된다.
자동 샘플 분석 장치 및 방법의 또다른 예는 섹션 5의 6.2.1, 6.2.2 및 6.3 에 제시되며 도 3-5에 도시된다.
한 구체예에서 시스템은 다음을 포함한 미시적 샘플 검사 시스템으로 구성된다:
ㆍ 샘플 저장 및 적재 및 탈적재 모듈
ㆍ 현미경 대물렌즈 배열 아래로 샘플을 이동시키는 자동 스테이지로 샘플 전달 장치
ㆍ CCD 카메라 배열
ㆍ 호스트 컴퓨터가 있는 처리장치, 현미경 시스템의 모든 기계적 부품 제어기
ㆍ CCD 카메라가 연결된 고속 영상 처리장치
컴퓨터 제어 시스템의 혁신적인 특징은 도 8 에 도시된대로 동인학 광학 특성을 갖는 2개 이상의 대물렌즈 배열이다. 렌즈는 한줄로 배열되고 각각은 자체 z-축 운동장치를 가지므로 개별적으로 촛점이 잡힌다(801). 시스템에 적당한 설비가 설치되어서 공통 단일-렌즈 현미경이 취급할 수 있는 다양한 배율에 부합하도록 복수의 대물렌즈 홀더가 교환될 수 있다. 광학 현미경의 배율은 1×내지 100×이다.
각 대물렌즈는 자체 CCD 카메라(803)에 연결된다. 카메라는 렌즈에 의해 제공된 광학 필드의 전체 영역을 습득하도록 하는 특성을 가진다.
각 카메라는 영상 취득 장치(804)에 연결된다. 이것은 호스트 컴퓨터에 설치된다. 습득된 각 광학 필드에 대해서 컴퓨터는 미시적 샘플상의 물리적 위치를 기록한다. 이것은 컴퓨터 제어된 x-y 기계적 스테이비(805)를 사용하여 달성된다. 카메라에 의해 제공된 영상을 디지털화되어서 호스트 컴퓨터 메모리에 저장된다. 각 대물렌즈는 영상을 컴퓨터에 동시에 제공할 수 있으며, 각각은 샘플 영역의 특정 부위를 포함한다. 렌즈는 색수차가 보정되어서 모든 영역을 따라 영상은 안정적인 정성적 특성을 가진다.
영상화된 영역은 서로 물리적 거리가 변한다. 거리는 렌즈가 배열된 거리의 함수이고 렌즈의 물리적 거리에 좌우된다. 또한 습득될 수 있는 광학 필드의 영역에 영향을 주는 배율 및 조리개수와 같은 렌즈 특성에 따라 물리적 거리가 달라진다. 그러므로 가변적 배율/조리개수를 갖는 렌즈의 경우에 습득된 영상의 물리적 위치로 변한다.
컴퓨터는 사용되는 대물렌즈 배열의 특징과 스테이지의 위치를 추적한다. 저장된 각 영상의 특성은 영상을 가장 패치워크내 올바른 위치에 일치시키는데 사용될 수 있다. 즉 "구성된" 영상이 도 9 에 도시된 대로 컴퓨터 메모리에 사용된다.
예컨대 시작하면 호스트 컴퓨터로 샘플 스테이지를 초기 위해(x1,y1)으로 이동시킨다. 이후에 새로운 영상이 수득되어 저장된다. 도 9 에 도시된 대로 단계 1에서 영상 세그멘트 "1"가 포착되고 저장되며, 단계 2에서 세그멘트 "2"가 저장되고, 단계 3에서 세그멘트 "3"이 저장된다. 완전한 영상이 연속적 영상 세그멘트가 습득됨에 따라 컴퓨터 메모리에서 "구성"된다.
호스트 컴퓨터 시스템은 적당한 디바이스 드라이버를 통해 시스템의 모든 기계적 성분을 제어하는 소프트웨어 시스템에 의해 구동된다. 소프트웨어는 컴퓨터 메모리에서 디지털화된 영상을 구성하고 구성된 영상을 또다른 알고리즘에 공급하는 영상 구성 알고리즘을 포함한다. 영상 해체, 합성 및 가공을 통해 샘플에 대한 특징이 탐지된다.
모든 자동화된 샘플 분석에서 제 1 신호 발생이 먼저 측정되어 세포를 식별한다면 필요한 수의 태아세포의 좌표를 알아내기 위해서 하나 이상의 표본이 자동 광학 현미경을 사용하여 관찰된다. 태아 세포를 포함하는 표본만 처리되어서 테스트될 유전특성의 존재를 나타내는 제 2 신호를 발생시킨다. 자동 영상 분석 알고리즘은 태아세포의 예정된 좌표와 비교용 산모세포의 예정된 좌표에서 제 2 신호의 존재를 검색한다. 이 과정은 역정되어서 유전적 비정상 신호가 먼저 관찰되고 이후에 태아세포인지 여부를 판정하기 위해서 신호를 발생하는 세포가 관찰될 수도 있다. 또한 단일 좌표에서 두가지 신호의 동시 존재 또는 두 성분의 교차로 발생하는 단일 신호(유전적 비정상인 파트너 "신호"에 의한 세포 타입에 대한 제 1 신 호의 켄칭)의 경우에 두 신호를 동시 관츨할 수도 있다.
제 1 및 제 2 신호 발생 조건을 비교적 간단하다. 제 1 신호 발생에 사용된 물질 및 기술은 제 2 신호 발생에 사용된 물질 및 기술에 악영향을 미쳐서는 안된다. 진단을 못하게할 정도로 이등이 세포특성을 손상 또는 변경시켜서도 안된다. 마지막으로 필요한 세포 처리가 제 1 및 제 2 신호 발생에 사용된 물질 및 기술에 악영향을 끼쳐서도 안된다. 이러한 한계내에서 제 1 및 제 2 신호 발생 물질 및 기술이 사용될 수 있다.
본 발명은 (ⅰ) 산모 혈액내 태아 세포 농도를 농축시키는 시도를 하기 보다는 농출안된 산모 혈액 샘플내 태아 세포가 식별되고, (ⅱ) in situ PCR 또는 PCR in situ 교잡과 같은 단일 세포 탐지 방법이 수행되어서 이미 염색 및 처리된 표본 또는 좌표에 대해서만 태아 세포가 탐지된 경우에만 유전 특성의 존재여부를 판단함을 특징으로 한다.
산모 혈액이 자연적으로 존재하는 농도의 태아 세포를 포함하지만 본 발명은 태아 세포가 부분 농축된 산모 혈액에도 적용된다. 공지 기술에서는 1000개의 산모 세포당 1개 이상의 태아 세포 농도를 달성하기 위해서 가능한 농도를 높이는 것이 목적이다. 특히 태아 세포를 산모 세포로부터 완전 분리하는 것이 공지 기술의 목적이다. 본 발명에서는 희귀세포가 10,000개 세포당 1개 미만(0.01%미만)의 농도로 존재하는 세포 샘플이 사용된다. 따라서 단순한 분별절차(예, 원심분리 또는 밀도차이)를 사용하여 산모 혈액 샘플내 태아 세포 농도를 부분적으로 높힌다. 희귀세포 함유 세포 샘플이 0.01%미만의 농도로 태아세포를 포함할 경우에 이 절차가 사용된다. 본 발명은 희귀세포농도가 0.001%, 0.0001%, 0.00001%, 0.000001% 심지어 0.0000001%일때도 사용된다. 산모 혈액내 태아 세포의 전형적인 농도는 105 산모 세포당 1개의 태아 세포에서 109산모세포당 1개의 태아세포이다. 따라서 본 발명은 자연 발생 태아세포의 전체 농도 범위에 대해 유용하다.
한 구체예에서 희귀세포가 샘플에 존재할 때 본 발명의 방법은 80%이상, 85%이상, 90%이상, 95%이상 및 99%이상의 빈도로 희귀세포를 탐지한다.
태아의 유전적 비정상 탐지에 추가적으로 본 방법은 희귀사건 탐지가 필요한 모든 상황에 적용될 수 있다. 특히 본 발명은 희귀세포가 10,000개의 다른 세포에 대해 1개 미만의 농도로 존재하는 경우 희귀 세포에서 나온 신호가 탐지될 상황에서 적용될 수 있다. 본 발명은 희귀세포가 다른 세포와 표현형에서 구별될 수 있는 상황에 적용될 수 있으므로, 제 1 신호를 사용하여 희귀세포가 먼저 식별되고 이후에 식별된 세포의 유전적 특성이 제 2 신호를 사용하여 결정된다.
염색체 비정상 또는 멘델 특징이 본 발명의 희귀 세포 기술을 사용하여 진단될 수 있다. 유일한 필요조건은 분자 결합에 대한 지식이다. 각 대립형질을 태깅을 위한 단일 형광단의 사용은 동시에 테스트될 수 있는 돌연변기 갯수에 대한 상한을 생성하지만 조합 화학의 사용은 동시에 태깅 및 탐지될 수 잇는 대립형질 특이성 돌연변이 갯수를 무한히 증가시킨다. 본 발명의 범위에 속하는 염색체 비정상은 Trisomy21, 18, 13 과 성염색체 변이 XXX, XXY, XYY를 포함한다. 본 발명의 범위에 속하는 멘델 장애는 낭포성 섬유증, 혈색증, 과유지혈증, 마르팡 증후군, 및 기타 연결조직의 유전장애, 혈색소병, 테이병 또는 기타 유전장애를 포함한다. 조합 화학 염료의 사용은 다중 대립유전자의 동시 태깅 및 탐지를 허용하므로 천식과 같은 특이체질의 유전 또는 전립선, 가슴, 결장, 폐, 백혈병, 임파종의 존재를 탐지할 수 있게 한다.
특히 중요한 응용분야는 암분야이다. 특정 타입의 암세포가 비-암세포 배경에 대해 형태학상으로 인지될 수 있다. 그러므로 암세포 형상이 제 1 신호로서 사용될 수 있다. 히트 쇼크 단백질 역시 대부분의 악성암에서 발현되는 마키이다. 히트 쇼트 단백질에 대해 특이적인 형광 태깅된 항체와 같은 라벨링된 항체가 제 1 신호발생에 사용될 수 있다. 유사하게 전립선 특이성 항원과 같이 특이한 암 또는 조직에 특이적인 항원과 전립성 특이성 항원과 같은 함 또는 조직 항원에 특이적인 항체가 암세포에 대한 제 1 신호 발생에 사용될 수 있다.
제 1 신호에 의해 암세포가 식별되면 암에 대한 더 많은 정보를 제공하기 위해서 제 2 신호가 발생될 수 있다. 예컨대 BRCA1 또는 BRCA2 형태로 생식된 돌연변이를 갖는 여성에게서 유방함 위험은 80-90%이다. 이들 유전자의 다양한 돌연변이가 보고된다.
전립선암은 병리학자에게 진단기준을 할당하기가 곤란한 조직 배열을 제시한다는 점에서 독특하다. 병리학과 병력을 상관시킬 목적으로 전립선 암에서 발견되는 유전적 변경을 분석 및 기록하는 것이 중요하다. 이러한 유전적 변경은 p53, ras, Rb, 시클린-종속 키나아제, 종양 유전자 및 종양 억제 단백질에서 변경을 포함한다. T-세포 수용체 유전자 재배열이 큰 입자형 임파구 증식이 알려진다. T- 세포 수용체 델타 유전자 재배열이 급성 임파구증 백혈병 및 비-Hodgkin 임파종에서 알려진다.
따라서 다른 세포의 배경에서 희귀 암세포가 식별 및 분석될 수 있다. 분석은 암세포 존재의 진단, 암타입의 결정, 암위험에 관계된 유전 변화 마키를 측정함으로써 암위험 판정을 포함한다. 다음 마키중 일부는 목적에 따라 제 1 및 제 2 신호로서 사용될 수 있다. 마키는 다음을 포함한다.
ㆍ 인간 종양 특이성 항체 GM14(흑색종 및 신경아세포종과 반응하는)
ㆍ 뼈형성 단백질(BMPs)(뼈 전이는 전립선암에서 일반적이며 BMPs의 일부가 전립선암 세포에서 발현된다)
ㆍ 성장 조절 유전자(성장 조절 유전자의 구조 및 발현의 변경은 악성 변환 및 종양 진행의 개시를 초래할 수 있다)
ㆍ 단백질 티로신 키나아제(식도암에서 과다하게 발현되며 증식 조절에 중요한 역할을 한다)
ㆍ 텔로메라제(hTRT)(일부 암조직에서 hTRT의 과도한 발현이 나타난다)
ㆍ p53, C-er3B-2 및 p21ras(난소종양에서 과다 발현되며 잔소암을 암초래 유전자의 작용결과이다)
ㆍ 프로토-종양유전자의 BCL-2 계열(발현이 백혈병 및 임파종을 포함한 인간 암에서 변경되는 아포토시스의 중요한 조절인자이다)
ㆍ eki-ras 및 c-myc(이들 유전자의 돌연변이는 종양 개시 및 직장암 진행에 연루된다)
ㆍ APC, p53 및 DCC(이들은 결장직장 종양 암 발생에 관련된다)
치료 전략은 유전 특징에 기초한 종양의 양태에 대한 지식 조합을 필요로 한다.
유전 변화 마키는 암위험 사전을 가능하게 한다. 이들은 발암제에 노출시 정보를 제공한다. 이들은 발암제에 노출로 초래된 변화를 초기에 탐지하며 암발생위험이 높은 개인을 식별한다. 이러한 마커는 방광암에서 염색체 9의 LOH와 결장직장 종양에서 탐지되는 염색체 7, 17 및 8 수득/손실과 염색체 1p 결실을 포함한다.
폐암 발생은 복수의 유전 변화를 필요로 한다. 종양 유전자 활성물질은 k-ras 및 myc이다. 종양 억제 유전자를 활성제거하는 것은 Rb, p53 및 CDKN2를 포함한다. 변경을 겪는 유전자의 식별은 악성이 될 암을 조기에 탐지하며 약물 및 유전자 기초 치료 타겟의 식별을 가능하게 한다.
망막아종 경로에 있는 유전자 돌연변이는 수많은 종양 발생에 연루된다. 종양 진행에 관계된 두가지 중요한 성분은 p16/CDNK2A와 CDK4이다. 전자의 변경은 흑색종을 포함한 복수의 암에서 보고된다. 후자의 변경은 드물다.
4개의 오일치 수선 유전자(hMSH2, hMLH1, hPMS1 및 hPMS2)중 하나의 돌연변이는 HNPCC의 70%를 초래한다.
염색체 11p15.5는 윌름스 종양, 라도미오사코마(rhabdomyosarcoma), 부신피질암, 폐암, 난소암 및 유방암에서 LOH를 보이는 중요한 종양억제 유전자 영역이다.
고유한 유전자 융합 서열을 통해 백혈병 세포의 식별은 MLL-AF4 및 PML/RAR(급성 전골수세포 백혈병).
T-세포 수용체 유전자 재배열은 큰 입자형 임파구 증식에서 알려진다.
T-세포 수용체 델타 유전자 재배열은 중성 임파아구종 백혈병 및 비-Hodgkin 백혈병에서 알려진다.
FAP는 결장직장 점박의 다테노마를 가져오는 APC유전자의 돌연변이에 의해 초래된다.
본 발명은 세포 "단층"을 관찰하여 설명된다. 단층은 융합을 필요로 하지 않으며 단일 세포 현탁액이 관련될 수 있다. 여기서 모든 세포가 서로 분리될 수 있을지라도 세포는 서로의 상부에 포개지지 않는다. 따라서 단층은 단일 세포 현탁액의 얼룩이거나 얇은 조직층일 수 있다. 고체 또는 박리 세포생물학이 사용된다.
본 발명은 한쌍의 신호 식별과 관련하여 기술되는데, 한 신호는 태아 세포와 같은 목표 희귀세포를 식별하여 또다른 세포는 유전적 결함이 있는 태아 세포와 같은 세포 상태 평가에 유용하다. 한 구체예에서 단일 신호만 탐지될 필요가 있다. 예컨대 태아 세포가 Y염색체를 가지며 Y염색체가 비정상이라는 진단이 나오면 유전적 비정상을 식별하는 신호는 태아세포를 식별하는 신호와 동일하다. 또다른 경우에 관찰된 특징이 퇴행성 특징인 경우에 단일 신호가 사용될 수 있다. 상이한 유전자에서 두 개 이상의 돌연변이가 존재한다고 진단된 경우에 두 대립유전자 탐지에 한쌍의 신호가 사용될 수 있다. 이러한 상황에서 신호쌍(또는 여러개의 신호) 이 표현형과 이 표현형을 갖는 세포를 식별할 수 있다.
6.1 표본 준비
현미경 유리 슬라이트상에 10㎕혈액으로 표본이 준비된다. 인대 혈액 및 산호 순환 혈액으로부터 표본이 준비되고 대기 건조된다.
6.1.1 세포 고정
in situ PCR 또는 PCR in situ 교잡을 위해 세포 투과에 앞서 표본 고정이 3가지 조건에서 행해진다:
(ⅰ) 표본이 10분-16시간 얼음-차가운 메탄올에서 고정된다.
(ⅱ) 표본이 10분-16시간 얼음-차가운 10%완충 포르말린에서 고정된다.
(ⅲ) 표본이 10분-16시간 2% 파라포름알데히드에서 고정된다.
고정후 표본을 인산염 완충 식염수에서 10분간 실온에서 3차례 세척된다. 이후에 표본이 공기 건조된다.
6.1.2 세포 염색
다색 염색: 표본이 Wright 염료로 덮히고 실온에서 1 내지 2분간 배양된다. 증류수(2.5㎖)가 첨가되어 염료를 희석시키고 실온에서 3-6분간 배양된다. 이후에 흐르는 물로 염료를 신속하게 세척하고 1:10 희석비의 Giemsa 염료가 슬라이드에 첨가된다. 5분간 실온에서 배양되고 흐르는 물로 염료를 빠르게 세척한다. 이후에 표본이 공기 건조된다.
항체 염색: 안티-태아 헤모글로빈(헤모글로빈 ε-체인) 모노클론 항체로 표 본을 덮고 1 내지 3시간 실온에서 배양된다. 슬라이드가 5분가 실온에서 인산염 완충 식염수에서 2회 세척된다. 제 2 항체(피코에리트린에 공액결합된 안티-마우스 항체)가 첨가되고 37℃에서 30분간 배양한다. 이후에 인산염 완충 염수에서 5분간 실온에서 두차례 슬라이드가 세척된다.
태아 헤모글로빈 염색: 5 내지 10분간 80% 에탄올에서 표본이 고정되고 수돗물로 헹구고 공기건조한다. 시트르산-인산염 완충액(37.7㎖ 0.1M 시트르산, 12.3㎖ 0.2M Na2HPO4, pH3.3)을 37℃ 수조에 담긴 단지에서 뎁힌다. 고정된 표본을 단지에 첨가하고 5분간 37℃에서 배양한다. 이후에 수돗물로 표본을 세척하고 1분간 0.1% 에오신으로 염색한다. 이후에 표본을 수돗물로 헹구고 공기 건조한다.
세포투과: 프로테인아제 k(1-5㎎/㎖, 인산염 완충 염수에서) 또는 펩신(2-5㎎/㎖, 0.01M 염산에서)에 의해 세포 투과가 이루어진다. 1-30분간 실온에서 배양한다. 투과의 5분간 인산염 완충 염수로 실온에서 표본을 세척하고 이후에 1분간 실온에서 100%에탄올로 세척한다. 표본을 공기건조한다.
PCR in situ 교잡: 50㎕ 증폭 용액으로 표본을 덮는다. 증폭용액은 10mM 트리스-HCl, pH 8.3, 90mM 염화칼륨, 1-5mM 염화 마그네슘, 200㎛ dATP, 200㎛ dCTP, 200㎛ dGTP, 200㎛ dTTP, 1㎛ 전방 프라이머, 1㎛ 역전 프라이머 및 5-10 단위 열안정성 DNA 폴리메라제(수성 밀폐 시약에든)로 구성된다. 커버글라스가 증폭 용액위에 덮히고 슬라이드를 열순환기로 옮긴다. 4분간 94℃에서 초기 변성시킨후 슬라이드는 25-35 증폭 싸이클을 겪으며, 각 싸이클은 1분간 94℃에서 변성, 1분간 55℃에서 어닐링, 1분가 72℃에서 방치로 구성된다. 커버글라스를 제거하고 실온에서 10분간 인산염 완충 염수에서 슬라이드를 배양시키고 슬라이드를 공기 건조시킨다. 교잡완충액(600mM 염화나트륨, 60mM 시트르산나트륨, 5% 텍스트란 술페이트, 50% 포름아미드)에든 플루오레스신 라벨리된 올리고누클레오티드 프로브가 첨가되고 커버글라스로 슬라이드를 덮고 10분간 94℃, 1시간동안 37℃에서 배양한다. 커버글라스를 제거하고 실온에서 10분간 인산염 완충 염수에서 슬라이드를 배양하고 실온에서 인산염 완충 염수로 5분간 2회 세척한다. 이후에 단백질 블록 용액(1% 소의 혈청, 2.5% 염소 혈청, 0.2% Tween-20)으로 표본을 덮고 실온에서 배양한다. 이후에 용액을 제거하고 실온에서 5분간 인산염 완충 염수로 3차례 슬라이드를 세척한다. 이후에 표본이 마우스 안티-플루오레스신 모노클론 항체로 덮히고 실온에서 20분간 배양된다. 이후에 용액을 제거하고 실온에서 5분간 인산염 완충 염수에서 3차례 세척된다. 바이오티닐화 염소 안티-마우스 F(ab)2로 표본을 덮고 20분간 실온에서 배양하고 용액을 제거한 다음 실온에서 5분간 인산염 완충 염수에서 2회 세척한다. 표본이 알카리성 포스파타제 공액 스트렙타비딘으로 덮히고 실온에서 20분간 배양된다. 용액을 제거하고 실온에서 5분간 인산염 완충 염수에서 2회 세척된다. 이후에 알카리성 포스파타아제 기질 용액(50㎎/㎖ BCIP, 75㎎/㎖ NBT)이 표본에 첨가되고 10분내지 2시간 37℃에서 배양된다. 이후에 슬라이드를 5분간 실온에서 증류수로 2회 세척하고 공기건조된다.
in situ PCR: 50㎕ 증폭 용액으로 표본이 덮힌다. 증폭용액은 10mM Tris- HCl, P\pH8.3, 90mM 염화칼륨, 1-5mM 염화마그네슘, 200㎛ dATP, 200㎛ dCTP, 200㎛ dGTP, 0.5㎛[R110]dITP, 1㎛ 전방 프라이머, 1㎛ 역전프라이머 그리고 5-10 단위 열안정적 DNA 폴리메라제(수성 밀폐 시약에든)를 포함한다. 커버글라스를 증폭용액에 덮고 슬라이드를 열 순환기에 옮긴다. 4분간 94℃에서 초기 변성시킨후 25-35싸이클 증폭한다. 각 싸이클은 1분간 94℃에서 변성, 55℃에서 1분간 어닐링 및 72℃에서 1분간 방치로 구성된다. 커버글라스를 제거하고 실온에서 10분간 인산염 완충 염수에서 배양하고 슬라이드를 공기 건조시킨다.
6.2 자동 표본 분석
6.2.1 장치
도 2 의 블록선도는 본 발명 실시에 적합한 시스템을 보여준다. 기본요소는 X-Y 스테이지(201), 수은 광원(203), 형광 현미경(205), 대물렌즈튜렛(207), 칼라 CCD 카메라(209), PC시스템(211) 및 모니터(213,215)를 포함한다.
X-Y 스테이지(201)는 선택된 현미경(205)과 함께 사용하기 적합한 위치 스테이지이다. X-Y 스테이지(201)는 컴파일링된 소프트웨어 명령을 사용하여 제어되며 PC에 연결된 스테이지이다. 이러한 X-Y 스테이지(201)를 사용할 때 PC(211)의 확장 버스에 삽입된 스테이지 제어회로는 스테이지(201)를 PC(211)에 연결된다. 스테이지(201)는 수동으로 구동될 수 있다. 전자 제어 스테이지는 Olympus(Tokyo, Japan) 및 LUDL(NY, USA)와 같은 현미경 제작회사에 의해 생산된다.
현미경(205)는 반사광 형광 반사경(203)과 20x 및 오일 침지 60x 또는 63x 대물렌즈를 갖는 대물 렌즈 튜렛(207)이 설비된 형광 현미경으로서 최대 600배 배 율을 제공한다. 튜렛(207)은 PC(211)에 연결되고 소프트웨어 명령을 사용하여 연속 확대사이에 전자적으로 교환된다. 이러한 튜렛(207)사용시 PC(211)의 확장버스에 삽입된 튜렛 제어회로 카드가 스테이지(201)를 PC(211)에 연결시킨다. 완전 광학 필드의 일정하고 균일한 조명을 제공하는 수은광원(203)을 포함시키도록 현미경(206)과 스테이지(201)가 구성될 수 있다.
현미경(205)은 카메라(209)에 의해 관찰된 영상을 생성한다. 카메라(209)는 전자 출력을 제공하기 위해서 연결된 칼라 3-칩 CCD 카메라로서 고민감도 및 해상도를 제공한다. 카메라(209)의 출력은 PC(211)에 설치된 프레임 파지 및 영상 처리기 회로 보오드에 이송된다. 적합한 카메라는 SONY 930(Sony, Japan)이다.
다양한 프레임 파지 시스템이 사용될 수 있다. 프레임 파지기는 MATROX IM-CLD(칼라 영상 포착 모듈)과 MATROX IM-640(영사처리 모듈)의 조합일 수 있다(MATROX, Montreal, Canda). MATROX IM-640 모듈은 온-보오드 하드웨어 지원 영상 처리 능력을 가진다. 이것은 MATROX 영상화 라이브러리(MIL) 소프트웨어 패키지에 의해 제공된다. 따라서 MIL 기초 소프트웨어 알고리즘의 신속한 실행을 제공한다. MATROX 보오드는 전용 SUSGA 모니터에 대한 디스플레이를 지원한다. PC(211)과 함께 사용되는 모니터에 추가적으로 전용 모니터가 제공된다. MATROX 영상 처리 보오드와 함께 사용하기 적합한 SUGA 모니터가 사용될 수 있다. 유용한 전용 모니터는 View sonic 4E(Walnut Creek, CA) SUGA 모니터이다.
충분한 처리 및 저장 용량을 갖기 위해서 PC(211)는 인텔-펜티엄 기초 PC(32MB 이상의 RAM과 2GB이상의 하드 디스크 드라이브 공간을 갖는)이다. PC(211)는 모니터를 더욱 포함한다. PC(211)는 키보드, 프린터 또는 기타 주변장치를 포함할 수 있다.
6.2.2 방법
PC(211)는 MATROX 영상 라이브러리(MIL)을 사용하여 마이크로소프트 C++로 컴파일링된 표본 분석 소프트웨어 프로그램을 실행한다. MIL은 프레임 파지기(211)의 작동을 제어하며 프레임 파지기(211)에 의해 포착된 영상을 처리하여 디스크 파일로서 저장하는 것을 포함하는 소프트웨어 라이브러리이다. MIL 은 필터링, 대물렌즈 선택 및 다양한 측정기능과 같은 영상 처리업무를 수행하기에 적합한 수많은 특수 영상 처리 루틴을 포함한다. 표본 분석 소프트웨어 프로그램은 윈도우 95로 실행된다. 프로그램 프롬프트 및 측정결과는 모니터(213)상에 나타나며 영상하드웨어(211)를 통해 수득된 영상은 전용 영상 모니터(215)상에 표시된다.
표본 분석 프로그램을 사용하여 현미경 영상을 처리하기 위해서 시스템은 먼저 보정된다. 보정은 현미경, 카메라의 변화와 성능 변화를 보상한다. 이 단계동안 보정 영상이 관찰되고 다음 조어 매개변수가 설정된다:
ㆍ 시스템의 칼라 응답;
ㆍ 태아 세포를 위해 스캐닝될 표본을 함유한 슬라이딩상의 영역 경계나 크기;
ㆍ 배율 20x 및 60x (또는 63x)을 사용할 때 광학 필드의 실제 크기;
ㆍ 배율 20x 및 60x(또는 63x)을 사용할 때 최대 및 최소 태아 핵 영역.
6.2.3. 제 1 (식별) 신호 탐지
태아 세포 탐지 알고리즘은 두 단계로 작동된다. 도 3 의 순서도에 나타난 프리스캔 단계 1에서 가능한 태아 세포 위치가 저배율 및 고속으로 식별된다. 20x 대물렌즈가 선택되고 태아 세포 탐색이 시작된다:
ㆍ 프로그램은 자동 스테이지(201,도 2)를 사전설정된 초기 위치, 예컨대 표본 함유 슬라이드의 구석중 한 곳으로 이동시킨다(단계 301).
ㆍ 사전 설정된 초기 위치에서 스테이지의 x-y 위치가 기록된다(단계 303).
ㆍ CCD 카메라(209)를 써서 광학 필드가 취득되고(단계 305) RGB(적/녹/청)영상으로 PC(211)에 전달된다.
ㆍ RGB 영상이 ILLS(색조/발광/포화)표현으로 변환된다(단계 307)
ㆍ 190 내지 255의 색조 값을 갖는 픽셀은 0(흑색)으로 설정되어서 관심 영역(얼룩)을 나타내며 모든 다른 픽셀값은 255(백색, 배경)으로 설정되도록 색조 성분이 흑백영상으로 2진화된다(단계 309). 얼룩은 가능한 태아세포 핵 영역을 나타낸다.
ㆍ 2진화된 영상에서 각 얼룩의 면적이 측정된다. 20배 배율에서 20 내지 200픽셀범위 밖에 있으면 얼룩의 픽셀은 255(배경)으로 설정되고 추가 처리로부터 배제된다(단계 311, 313, 315, 317).
ㆍ MATROX 함수를 사용 각 얼룩의 중력 중심(CG)의 좌표가 계산된다(단계 319). 얼룩의 중력 중심은 얇고 균일한 얼룩형 재료 쉬이트 절단이 균형이 잡히는 지점이다. 현재 광학 필드의 위치와 함께 좌표가 데이터베이스에 저장되어서 더 높은 배율을써 다음 처리단계에서 얼룩이 위치선정된다.
ㆍ 추가 광학 필드가 유사하게 처리되어서 슬라이드가 완전 해석될때까지 연속하는 광학 필드의 x-y 위치를 기록한다(단계 321, 323).
단계 2(도4a,4b)는 최종 태아세포 인지 과정을 포함한다:
ㆍ 63x 배율이 선택된다(단계 401).
ㆍ 프로그램은 자동 스테이지를(도2, 201)이동시켜서 가능한 태아세포 핵 영역인 CG의 제 1 위치의 좌표가 광학필드의 중심에 있게한다(단계 403).
ㆍ CCD 카메라(도2, 209)를 써서 광학 필드가 수득되고 RGB 영상으로서 컴퓨터에 전달된다(단계 405).
ㆍ RGB 가 HLS 모델로 변환된다(단계 407).
ㆍ 발광값이 가능한 발광값과 동일한 픽셀의 갯수를 세서 발광 히스토그램을 생성한다(단계 409). 각 인덱스에 대응하는 회식-수준값을 갖는 픽셀의 수를 포함한 길이 256의 배열로서 갯수가 배열에 저장된다.
ㆍ 배열에 저장된 값으로 표현된 발광 분포곡선을 프로그램이 분석하고 최종 피크를 위치시킨다(단계 411). 피크는 영상에서 플라즈마 영역을 나타내는 픽셀값을 포함한다. 발광 분포곡선을 분석하는 함수는 곡선을 매끄럽게 하도록 9-포인트 이동 평균을 계산하고; 포인트 10 회색-수준값 거리에 의해 한정된 선분의 접선을 계산하고; 선분의 기울기를 도단위로 계산하고; 곡선의 기울기가 0인 지점을 발견하고 이들이 최소값을 나타내면 이들 지점(회색-수준)을 -1로서 나타내고 이들이 최대값을 나타내면 1로서 나타내고; 회색-수준값 배열에서 1 또는 -1의 위치를 발견함으로써 곡선에서 피크 또는 계곡 위치를 나타낸다.
ㆍ 마지막 피크전에 나타나는 발광 분포의 계곡에 놓이는 픽셀의 회색-수준값은 컷 오프값으로서 설정한다(단계 413).
ㆍ 컷오프값을 사용하여 프로그램을 제 2 이진 영상을 생성한다(단계 415). 이것은 흑백 영상으로서 컷오프점보다 낮은 회색-수준값을 갖는 픽셀은 255(백색)으로 설정되고 컷오프점보다 높은 그레이-레벨값을 갖는 픽셀은 9(흑)으로 설정된다. 이 영상의 백색 얼룩은 세포로서 처리되고 흑색 영역은 비-세포영역으로 처리된다.
ㆍ 제 2 이진 영상에 대해 폐쇄 필터가 적용된다(단계 417). 이러한 방식으로 백색 영역내 구멍, 즉 흑색점이 폐쇄된다.
ㆍ 프로그램은 세포면적을 측정한다. 세포면적이 200픽셀 미만이면 이들 세포는 배제된다. 즉 이들 세포를 구성하는 픽셀은 픽셀값 255(흑)으로서 설정된다(단계 419).
ㆍ MIL 소프트웨어에 포함된 "구멍 충진 함수"(hole filling function)"가 나머지 얼룩에 대해 적용된다(단계 412). 결과의 2진 영상은, 처리후 세포들만을 표시하는 백색 영역들을 가진 마스크이다.
"구멍 충진 함수"(hole filling function)"에 관한 이해를 돕기 위한 추가적 설명은 본 명세서 마지막 단락에서 제시된다.
ㆍ HLS 영상의 포화 성분에 기초하여 적혈구 세포가 백혈구 세포로부터 구별된다. 마스크가 사용되어 세포 영역만으로 처리를 제한한다.
ㆍ 프로그램은 포화값이 가능한 포화값인 픽셀의 갯수를 센다. 각 인덱스에 대응하는 그레이-레벨값을 갖는 갯수의 픽셀을 포함한 길이 256의 배열로서 갯수가 배열에 저장된다(단계 423).
ㆍ 배열에 저장된 값으로 표현되는 포화 분포곡선을 분석하고 제 1 피크를 위치 선정한다(단계 425). 피크는 백혈구 세포에 포함된 영역을 나타내는 픽셀값을 포함한다.
ㆍ 제 1 피크후 제 1 최소값(계곡)과 일치하는 그레이-레벨값이 컷오프 포인트로서 설정된다(단계 427).
ㆍ 컷오프값을 사용하여 프로그램은 제 3 2진 영상을 생성한다(단계 429). 포화 영상에서 컷오프 포인트보다 높은 그레이-레벨값을 갖는 픽셀에 대응하는 픽셀이 255(백)으로 설정된다. 이들은 적혈구 세포영역을 구성한다. 포화영상에서 컷오프 포인트보다 낮은 그레이-레벨값은 낮은 픽셀에 대응하는 픽셀이 0(흑)으로 설정된다. 제 3 2진 영상의 백색 얼룩은 적혈구에 속하는 영역의 시드이다.
ㆍ 제 3 2진 영상에 대해 폐쇄 필터가 적용된다(단계 431). 이러한 방식으로 백색영역내 구멍, 즉 흑점이 폐쇄된다.
ㆍ 나머지 얼룩에 대해 MIL 의 "구멍 충진 함수(hole filling function)"가 적용된다(단계 433). 결과의 2진 영상은 처리후 단지 백혈구세포만을 포함한 새로운 마스크이다.
ㆍ 나머지 얼룩에 대해 MIL의 경계 얼룩 지움 함수가 적용되어 영상영역의 경계와 일치하는 픽셀을 포함하는 얼룩을 제거한다(단계 435). 영상 영역의 경계와 일치할 때 얼마나 이러한 얼룩은 추가처리에서 배제된다.
ㆍ 이 마스크에 에로신 필터(erosion filter)가 6회 적용된다. 따라서 연결된 얼룩(백혈구 세포 시드)가 끊긴다(단계 437).
ㆍ"두꺼운 필터"(thick filter)가 14회 적용된다(단계 439). "두꺼운 필터"는 "확장 필터"(dilation filter)이다. 즉, 이것은 얼룩 주변에 한줄의 픽셀을 연속 첨가함으로써 픽셀의 크기를 증가시킨다. 성장하는 얼룩이 인접하여 성장하는 얼룩과 만나면 "두꺼운 필터"는 두 개의 성장하는 얼룩을 연결시키지 않는다. 따라서 인접한 얼룩은 분리될 수 있다.
참고로, 이해를 돕기 위해, "두꺼운 필터"와 "확장 필터"에 관하여 추가적으로 설명하자면, "두꺼운 필터"는 본 명세서에서 "확장 필터"와 동일한 의미로 규정된다. 이러한 확장 필터는 형태학적 필터로 이미지 획득 및 분석 분야에서 잘 알려져 있는 것으로서, 밝은 물체의 경계부를 확대하고 어두운 물체의 경계부를 축소시킴으로서 물체의 형태를 변화시키는 기능을 한다.
ㆍ 제 1 2진 마스크(모든 세포를 포함한)와 제 3 2진 마스크(분리된 백혈구 세포 시드를 포함한)가 RECONSTRUCT FROM SEED MIL 오퍼레이터와 조합된다. 이렇게 구축된 제 4 마스크는, 제 3 마스크에 의해 허용되어 백혈구 세포를 나타내는, 제 1 마스크로부터 복제된 얼룩(세포)을 포함한다(단계 444).
ㆍ 제 4 마스크에서 얼룩의 면적과 밀집성이 측정된다: 영역(A)는 얼룩에서 픽셀의 갯수이다; 밀집성은 얼룩의 영역(A)와 주변(P)으로부터 유도된다(즉, p214CA)). 형태가 얽힐수록 값이 크다. 원은 최소 밀집성 값(1.0)을 가진다. 주변은 얼룩 가장자리의 총길이이며 대각선 가장자리가 디지털화될때(내부 코너는 2.0보다는 1.414로 계산된다) 생성된 계산효과가 허용된다. 얼룩 면적이 1000내지 8000 픽셀일 경우에만 얼룩이 제 4 마스크에 유지되며 이들은 3미만의 밀집성을 가지므로 거친 윤곽을 갖는 세포가 허용된다. 영상 경계에 접촉하는 얼룩은 추가 처리에서 배제된다(단계 443).
제 4 마스크가 다음 방식으로 색조 성분에 적용된다(단계 445, 447, 449, 451):
ㆍ 좌표가 "마스크"에서 백색(255)픽셀과 일치하면 색조 성분의 픽셀이 색조값을 유지한 새로운 영상으로 복제되고 모든 다른 픽셀은 0(흑)으로 설정된다(단계 445).
ㆍ 접촉한 비-0 픽셀 영역에서 픽셀값, 즉 적색 세포의 영상에 대응하는 얼 룩에 대해 190 내지 255 값이 검사된다. 각 얼룩내 픽셀의 갯수가 계수된다(단계 447).
ㆍ 200개 이상의 픽셀이 있으면 얼룩은 핵화된 적혈구 세포를 나타낸다. 각 세포 중력중심 좌표가 저장된다. 마스크가 2진화되어서 비-0값을 갖는 모든 픽셀이 255(백)으로 설정되고 마스크가 별도의 태깅된 영상 파일 포맷(TIFF)파일로서 저장된다(단계 449).
ㆍ 이전 단계동안 저장된 좌표와 일치하지 않은 가능한 태아 세포에 대해 다음 저장된 좌표로 이동된다. 사전 설정된 수의 핵화된 적혈구 세포가 식별될때까지 전체과정이 반복된다. 혈액 슬라이드에 대한 다양한 특성 코드와 함께 각 마스크 파일의 이름과 핵화된 적혈구 세포 좌표를 포함한 결과가 텍스트 파일에 저장된다. 좌표가 저장된 핵화된 적혈구 세포가 찾고있는 태아 세포이다(단계 451).
태아 세포 식별후 in situ PCR 또는 PCR in situ 교잡 또는 FISH에 의해 제 2 신호가 발생된다.
6.2.4 제 2 신호의 탐지
in situ PCR 또는 PCR in situ 교잡 처리된 세포를 포함한 표본이 스테이지(도2, 201)상에 위치된다. 보정단계가 취해진다. 보정은 현미경, 카메라의 변화와 성능 변화를 소프트웨어가 보상할 수 있게한다. 도 5의 순서도에 도시된 제 2 신호 탐지가 다음과 같이 진행된다:
ㆍ 대물렌즌 배율 60x(63x)이 선택된다(단계 501).
ㆍ 제 1 신호 탐지로부터 컴파일링된 결과의 파일 데이터에 따라서 제 1 태 아세포 위치로 x-y스테이지가 이동된다(단계 503).
ㆍ CCD 카메라(도2, 209)를 사용하여 광학 필드가 취득되고 RGB 영상으로서 컴퓨터(도2, 211)로 전달된다(단계 505).
ㆍ RGB 영상이 HLS 모델로 전환된다(단계 507).
ㆍ 흑백 마스크를 포함한 TIFF 파일이 별도의 영상으로서 적재된다(단계 509).
ㆍ 마스크에서 백색 영역에 대응하지 않는 색조 성분의 픽셀이 0(흑)으로 설전된다(단계 511).
ㆍ 태아 세포를 나타내는 나머지 영역이 PCR 에 따라 생성된 신호에 대응하는 픽셀값을 위해 탐색된다. 예컨대 신호는 알카리성 포스파타아제의 존재로 발생하는 색상(즉, 적색)일 수 있다. 색조 성분의 비 흑색 영역이 0 내지 30의 픽셀값을 위해 탐색된다(단계 513).
ㆍ 스테이지가 다음 비-처리된 태아 세포에 이동되고 과정이 반복된다(단계 515).
6.3 변형
상기 기술된 시스템 및 방법의 여러 가지 변형이 가능하다. 각 농축안된 혈액 샘플이 각 현미경 슬라이드상의 표본 제조에 사용된다. 이 경우 각 슬라이드는 제 1 신호 여부를 탐지할 수 있다. 그러나 제 1 신호가 탐지된 슬라이드만이 제 2 신호를 발생하도록 더욱 처리되며 제 2 신호 탐지를 위해 분석된다. 이러한 처리는 종래의 샘플 및 슬라이드 취급 시설의 사용을 가능하게 한다.
도 6의 변형예에서 농축안된 혈액 샘플(601)이 신축성 기질(603)상의 기다란 단일 표본 제조에 사용된다. 기질(603)의 길이는 폭의 10배 이상이다. 예컨대 한면상에 톱니 구멍을 갖는 셀룰로오스 아세테이트 필름 베이스 스트립이 가질로서 사용될 수 있다. 표본을 갖는 스트립은 도 6에 도시된대로 연속처리시스템에서 처리된다. 제 1 신호탐지에 의해 태아세포 위치가 결정된 이후에 이 위치를 포함한 표본 세그멘트가 제 2 신호 발생 및 탐지를 위해 연속 스트립에서 절단된다.
신축성 기질상의 기다란 단일 표본을 사용한 또다른 처리방법에서 제 1 신호 발생 및 탐지전 스트립이 슬라이드와 유사한 복수의 세그멘트로 분할된다. 처리는 현미경 슬라이드처럼 진행된다.
위의 변형은 제 2 신호발생 및 탐지를 위해 전체 표준이 처리될 필요가 없다는 장점을 가진다. 제 1 신호가 탐지된 슬라이드 또는 세그멘트만이 제 2 신호발생 및 탐지를 위해서 추가 처리를 받을 필요가 있다.
한 측면에서, 희귀세포가 탐지된 표본 부위에만 시약을 분배하는 장치가 제공된다. 도 7에서 본 발명의 장치는 시약 분배기를 포함한다. 시약 분배기는 스테이지상의 정확한 위치에 시약을 분배하도록 위치된다. 이것은 희귀세포 좌표와 같이 제 1 신호에 의해 식별된 좌표에만 시약을 분배하기에 적합하다. 시스템은 하우징내에 위치된 복수의 마이크로피펫의 하우지인 시약 분배기(701)를 포함한다. 시약 분배기는 현미경에 부착되며 현미경에 대해 고정된 관계로 스테이지에 대해 위치선정된다. 시약 분배기(701)의 팁은 스테이지(201)에 인접한다. 시약 분배기(701)의 반대 단부는 시약을 분배기(701)에 전달하는 복수의 튜브를 갖는 하우징인 공급선(703)과 통한다. 공급라인(703)은 시약 분배기(701)로부터 원격지인 제 1 시약용기(705) 및 제 2 시약 용기(707)에 부착된다. 공급라인(703)은 하우징이며, 공급라인(703')은 시약용기(705)와 통하며 공급라인(703")은 시약용기(707)와 통한다. 펌프(709)가 용기(707)로부터 분배기(701)에 시약을 펌프질 하도록 공급라인(703")에 부착되며 시약 분배기(701)의 팁으로부터 스테이지상 필요한 위치에 시약을 분배한다. 또다른 펌프(709')가 시약을 용기(705)에서 분배기(701)에 전달하도록 공급라인(703')에 부착된다. 펌프는 "시약제어"라 표시된 특수 소프트웨어 명령어를 사용하여 PC(211)에 의해 제어된다.
도시된 구체예에서 분배기는 현미경에 부착된다. 그러나 시약 분배기가 현미경에 부착될 필요가 없으며 x-y 스테이지에 대한 프레임에 부착될 수 있다. 시약 분배기 팁을 스테이지사의 슬라이드에 대해 정확한 위치에 선정하기 위해 스테이지가 분배기에 대해 움직인다. 스테이지상의 슬라이드는 다른 위치에 이동될 수 있으며 분배기 자체가 슬라이드내 좌표에 대해 위치선정될 수 있다. 중요한 것은 탐지된 희귀세포의 좌표가 시약 분배기의 분배단부에 대해 위치되어서 희귀세포의 좌표에서 이산 지점에 물질이 전달될 수 있다는 것이다. 시약 분배기가 모터에 의해 조절되며 슬라이드(스테이지상) 또는 스테이지에 대해 이동할 수 있다면 시약 분배기에 위치를 선정하는 센서가 제공된다. 따라서 스테이지상의 슬라이드가 일렬로 처리될 수 있다(단 현미경이 희귀세포의 좌표를 먼저 알아낸다). 이후에 슬라이드가 제 2 처리 영역으로 이동되어서 시약분배가 앞서 식별된 좌표에 위치되며 시약이 전달되어 제 2 신호를 발생한다. 슬라이드가 열싸이클링 지대와 같은 제 3 지대로 이동되고 현미경 관측 필드로 다시 이동할 수 있다.
상이한 세포 타입을 식별하고 상이한 세포특서을 진단할 필요가 있을 때 상이한 표본 처리가 가능하다. 생화학, 형태학상 매개변수 및 색상이 다른 진단 조건을 충족시키도록 변경될 수 있다.
컴퓨터와 영상 처리 기술은 꾸준히 변하고 있다. 위의 방법 및 장치의 조건을 충족시키지만 여기서 발표되지 않은 더 새로운 기술로 본 발명의 범위내에서 고려될 수 있다. 예컨대 종래의 픽셀 및 영상파일 포맷이 위에서 언급되지만 다른 것이 사용될 수 있다. 영상파일은 JPEG 또는 GIF 기술을 사용하여 압축될 수 있다. HLS 공간 대신에 RGB 칼라 공간에서 처리가 수행될 수 있다. 기타 칼라 공간이 사용될 수도 있다.
본 발명이 농축안된 산모혈액 샘플과 관련하여 기술되었을지라도 농축된 또는 부분 농축된 산모 혈액 샘플에서도 본 발명이 실시될 수 있다. 샘플내 태아세포 식별 및 진단을 위해 컴퓨터 제어 현미경 시스템의 사용은 모든 태아세포 농도를 포괄하는 샘플에 적용가능하다. 이러한 시스템의 사용은 농축안된 산모 혈액 샘플과 관련하여 사용될 때 특히 유리하다.
본원 상세한 설명에서 언급한 "구멍 충진 함수(hole filling function)"에 관하여 추가적으로 언급하자면, 이 함수는 MATROX IMAGING LIBRARY(MIL)에서 개발한 당 분야에 잘 알려진 알고리즘으로서, 그 특징적 HLS 좌표에 의해 식별되는 표적 세포들만을 지닌 마스크를 생성하는 기능을 한다. 다시 말해서, 이 방법은 세포 클러스터의 분리를 촉진시키고, 또한, 이러한 클러스터(또는 얼룩)에서 관심 대상인 소정의 세포들을 개별적으로 분석할 수 있게 한다. 이 방법은 상대적으로 어두운 영역이나 밝은 영역을 이진 양자화에 의해 측정할 수 있고, 또한, 혈구 세포, 가령, 적혈구 세포나 백혈구 세포가 차지하는 영역을 결정할 수 있다. 이와 같이 특별하게 프로그래밍된 "구멍 충진 함수"(hole filling function)"는 MIL에서 제공하고 있다. 이 방법을 적용한 후 이진 양자화된 이미지는, 백색 영역들이 세포만을 표시하는 마스크에 해당한다. HLS 이미지의 포화 성분을 추가적으로 처리하면, 백혈구 세포만을 가진 마스크가 나타난다. 최종 단계들은 에로신 필터와 확장 필터를 적용하여, 희귀 세포 표적의 경계부를 깨끗하게 비우게 된다.

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  158. 자동화 마이크로스코픽 비전 시스템으로 체액이나 조직의 샘플을 컴퓨터에 의해 분석하는 방법에 있어서, 상기 방법은,
    i) 형태학적 또는 비색정량법 기준에 의해 세포 이미지를 식별하는 제 1 신호에 대해 캐리어 상에서 체액의 샘플을 디지털 방식으로 스크린하는 단계,
    ii) 식별된 세포 이미지의 위치 좌표들을 디지털 방식으로 레코딩하는 단계,
    iii) 유전적 특성이나 결함을 식별하는 제 2 신호를 수신하는 단계, 그리고
    iv) 세포 이미지의 상기 제 2 신호를 자동적으로 진단하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 체액이나 조직의 샘플을 컴퓨터에 의해 분석하는 방법.
  159. 제 158 항에 있어서,
    a) 적색, 녹색, 청색(RGB) 이미지를 표현하는 값들을 가진 제 1 칼라 이미지 신호를 디지털 방식으로 수신하는 단계,
    b) 상기 RGB 이미지를, 색조(Hue), 휘도(Luminance), 그리고 채도(Saturation)(HLS)를 표현하는 값들을 가진 좌표 신호에 의해 표현되는 처리 칼라 공간(processing color space)으로 자동적으로 변환하는 단계로서, 이에 따라, 한개의 좌표 신호를 분석함으로서 세포 후보가 즉각적으로 식별될 수 있는 단계
    를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 체액이나 조직의 샘플을 컴퓨터에 의해 분석하는 방법.
  160. 제 159 항에 있어서, 식별된 세포 이미지 칼라 신호 특성 값들은 한개 이상의 좌표 신호에서 지배적으로 나타나는 지정 세포 이미지 선택 기준으로 작용하는 것을 특징으로 하는 체액이나 조직의 샘플을 컴퓨터에 의해 분석하는 방법.
  161. 제 159 항에 있어서, 세포 이미지 마스크 신호가 생성되어 컴퓨터 메모리에 저장되고, 이에 따라, 식별된 세포를 형성하지 않은 주변 부분을 이미지 신호로부터 제거하고, 세포 이미지 강도를 추가적으로 개선시키는 것을 특징으로 하는 체액이나 조직의 샘플을 컴퓨터에 의해 분석하는 방법.
  162. 제 158 항에 있어서, 디지털화된 칼라 이미지 신호가, 샘플로부터, 컴퓨터에 의해 정렬된 다수의 마이크로스코프 대물 렌즈를 통해 도출되는 것을 특징으로 하는 체액이나 조직의 샘플을 컴퓨터에 의해 분석하는 방법.
  163. 제 158 항에 있어서, 상기 세포가 0.001%, 0.0001%, 0.00001%, 또는 0.000001%의 농도로 존재할 때 희귀 세포로 간주하는 것을 특징으로 하는 체액이나 조직의 샘플을 컴퓨터에 의해 분석하는 방법.
  164. 제 161 항에 있어서, 세포 이미지 마스크 신호를 생성하는 단계는,
    - 세포 이미지를 표현하는 칼라 이미지 신호의 휘도 값들의 히스토그램을 분석하는 단계,
    - 상기 히스토그램의 최종 피크 바로 앞의 최종 밸리보다 큰 휘도 값을 가진 디지털화된 세포 신호 포인트들을 추가적 처리를 위해 선택하는 단계, 그리고
    - 선택된 신호 포인트들에 대해 폐쇄 필터(closing filter)를 적용하여, 지정 크기 기준을 만족시키지 못하는 영역들을 배제하고, 그리고 "구멍 충진 함수(hole filling function)"를 적용하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 체액이나 조직의 샘플을 컴퓨터에 의해 분석하는 방법.
  165. 제 158 항에 있어서, 상기 단계 ii)는,
    - 세포 이미지 신호에 대해, 지정 크기 범위 내에 놓인 신호 포인트들의 클러스터 중에서, 선택된 세포 신호와 일치하는 신호 포인트들을 선택하는 단계로서, 이때, 신호 포인트들의 클러스터는 지정 색조 값 범위 내에 놓인 색조 값을 가지는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 체액이나 조직의 샘플을 컴퓨터에 의해 분석하는 방법.
  166. 제 165 항에 있어서, 선택된 세포 이미지 신호를 레코딩하는 단계는,
    - 세포 마스크 신호의 채도 값들의 히스토그램을 분석하는 단계,
    - 차후 처리를 위해, 히스토그램의 제 1 피크 다음의 제 1 밸리보다 큰 채도 값을 가지는 신호 포인트들을 선택하는 단계, 그리고
    - 선택된 신호 포인트들에 대해 폐쇄 필터를 적용하고, "구멍 충진 함수(hole filing function)"를 적용하여, 이미지 경계를 포함한 관련없는 영역들을 배제하고, 에로신 필터(erosion filter)와 "확장 필터(dilation filter)"를 적용하고, 선택된 세포 신호를 생성하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 체액이나 조직의 샘플을 컴퓨터에 의해 분석하는 방법.
  167. 제 158 항에 있어서, 상기 체액이 산모의 혈액이고, 상기 세포가 태아 세포로 식별되는 것을 특징으로 하는 체액이나 조직의 샘플을 컴퓨터에 의해 분석하는 방법.
  168. 제 158 항에 있어서, 상기 샘플이 암 세포를 가진 체액이나 조직을 포함하는 것을 특징으로 하는 체액이나 조직의 샘플을 컴퓨터에 의해 분석하는 방법.
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