CN113075174B - 一种斜置上顶式静态贝塞尔光片成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种斜置上顶式静态贝塞尔光片成像系统，属于生物医学显微成像领域，包括：生成及整形单元，生成高斯光束并整形扩束为线聚焦光束；贝塞尔光片产生单元，包括双环掩膜，对线聚焦光束的强度进行调制以得到分段线光源；照明单元，将分段线光源汇聚成低旁瓣贝塞尔光束并倾斜入射至水平放置的样品腔室中，以在样品中激发产生荧光；探测单元，与照明单元正交，且均相对于水平面倾斜，探测荧光；像差矫正单元，对荧光进行矫正；成像单元，生成图像。与水平面倾斜的照明和探测方式形成斜置上顶式成像系统，可以对透明化大样本进行成像，双环掩膜形成的低旁瓣贝塞尔光束解决了旁瓣影响图像对比度和光漂白的问题，实现大视场和高分辨率的成像。

Description

一种斜置上顶式静态贝塞尔光片成像系统

技术领域

本发明属于生物医学显微成像领域，更具体地，涉及一种斜置上顶式静态贝塞尔光片成像系统。

背景技术

光学显微成像系统是一种新兴的生物医学成像系统，其照明光路通常与探测光路垂直。照明光路通常利用光学元件对激光光束进行整形，形成一层片状光束，从侧面激发样本的荧光信号。探测光路通常在垂直于照明光路的方向将样品成像在CCD或sCMOS中。根据光束性质可将成像光片分为高斯光片和贝塞尔光片。高斯光片一般由柱透镜对高斯光束进行一维压缩而形成，高斯光片的厚度越小轴向分辨率越高，但有效成像长度越短，即视野越小。贝塞尔光片在沿光传播方向上具有由第一类零阶贝塞尔函数描述的传输不变强度分布的特征，在较长的一段范围内能保持厚度不变，即兼备高轴向分辨率和大视野的优点，但贝塞尔光片在光片厚度维度的光强分布是由一个高强度的中心峰和高能量的旁瓣组成，这些旁瓣显著影响成像对比度并增加样品的光毒性。

光片荧光显微成像系统的照明光路和探测光路具有正交性，在三维空间中分为水平排列和倒置排列两种形式。水平排列的光片成像系统样本通过设计的夹持件垂直放在照明光路和探测光路的交线上，这种排列方式由于狭窄的样品操作空间，无法实现高通量成像。

发明内容

针对现有技术的缺陷和改进需求，本发明提供了一种斜置上顶式静态贝塞尔光片成像系统，其目的在于利用与水平面倾斜的照明和探测方式形成斜置上顶式成像系统，实现对透明化大样本进行成像，利用双环掩膜形成的低旁瓣贝塞尔光束，解决旁瓣影响图像对比度和光漂白的问题，实现大视场和高分辨率的成像。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种斜置上顶式静态贝塞尔光片成像系统，包括：生成及整形单元，用于生成高斯光束，并将所述高斯光束整形扩束为线聚焦光束；贝塞尔光片产生单元，位于所述生成及整形单元的输出光路上，包括双环掩膜，用于对所述线聚焦光束的强度进行调制以得到分段线光源；照明单元，位于所述贝塞尔光片产生单元的输出光路上，包括照明透镜，用于将所述分段线光源汇聚成低旁瓣贝塞尔光束，并将所述低旁瓣贝塞尔光束倾斜入射至水平放置的样品腔室中；样品腔室，用于承载样品，所述样品在所述低旁瓣贝塞尔光束的激发下产生荧光；探测单元，与所述照明单元正交，且所述照明单元和探测单元均相对于水平面倾斜，所述探测单元用于探测所述荧光；像差矫正单元，位于所述探测单元的输出光路上，用于对所述探测单元探测到的荧光进行像差矫正；成像单元，位于像差矫正单元的输出光路上，用于生成像差矫正后的荧光的图像。

更进一步地，所述双环掩膜包括刻蚀有同心双环空心结构的不透光掩膜板以及填充在所述同心双环空心结构中的两个同心透光环，且放置在样品平面傅里叶面的共轭面上。

更进一步地，所述贝塞尔光片产生单元还包括位于所述双环掩膜下方的可翻转夹持件，所述可翻转夹持件用于将所述双环掩膜从光路中撤离或者将所述双环掩膜投入光路中。

更进一步地，所述贝塞尔光片产生单元还包括位于所述双环掩膜输出光路上的第一反射镜，所述第一反射镜用于将所述分段线光源反射至所述照明单元。

更进一步地，所述生成及整形单元包括激光光源、准直器)、第一柱透镜和球透镜；所述激光光源用于生成所述高斯光束；所述准直器用于对所述高斯光束进行准直；所述第一柱透镜和球透镜用于将准直后的高斯光束整形扩束为所述线聚焦光束。

更进一步地，所述照明单元还包括第一中继透镜组、第二反射镜、第二中继透镜组和第三反射镜，所述照明透镜为柱透镜；所述贝塞尔光片产生单元输出的所述分段线光源依次经所述第一中继透镜组、第二反射镜、第二中继透镜组和第三反射镜传输后到达所述照明透镜；所述照明透镜用于将所述分段线光源汇聚成所述低旁瓣贝塞尔光束并倾斜入射至所述样品腔室中。

更进一步地，所述照明单元和探测单元相对于水平面倾斜的倾斜角度的组合为(30°，60°)、(45°，45°)或(60°，30°)。

更进一步地，所述像差矫正单元为长焦柱透镜，所述长焦柱透镜的角度可调节。

更进一步地，还包括：运动单元和夹持单元，所述夹持单元用于连接所述运动单元和所述样品；所述运动单元用于调节所述样品的三维位置。

更进一步地，所述样品腔室还用于填充折射率匹配液，所述样品位于所述折射率匹配液中。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案，能够取得以下有益效果：

(1)将照明单元和探测单元设置为与水平面倾斜的形式，形成斜置上顶式成像系统，可以兼容孔板、载玻片等生物容器，实现透明化大样本的高通量成像，在探测光路中加入光学矫正元件矫正像差，提高成像质量；针对透明化样本，形成的极薄光片通过样本，激发荧光，通过图像传感器同步曝光并输出图像；此外，利用双环掩膜形成的低旁瓣贝塞尔光束，解决旁瓣影响图像对比度和光漂白的问题，实现大视场和高分辨率的成像；该光学成像系统可实现毫米大视野与数微米的高轴向分辨以及更高的时间通量；

(2)在双环掩膜下方设置可翻转夹持件以将双环掩膜从光路中撤离或投入光路，从而实现贝塞尔光片和高斯光片的切换，适用于不同生物样本检测的成像需求；

(3)像差矫正单元设计为角度可调节的长焦柱透镜，便于调节长焦柱透镜角度，更准确地矫正像差。

附图说明

图1为本发明实施例提供的斜置上顶式静态贝塞尔光片成像系统的结构示意图；

图2A为图1所示系统中双环掩膜的结构示意图；

图2B为双环掩膜形成的静态贝塞尔光片的仿真结果图；

图3为图1所示系统中样品腔室的剖面示意图；

图4为图1所示系统中夹持单元的等轴图；

图5为图1所示系统的三维图。

在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或者结构，其中：

1为生成及整形单元，11为激光光源，12为准直器，13为第一柱透镜，14为球透镜，15为光纤头，2为贝塞尔光片产生单元，21为双环掩膜，22为可翻转夹持件，23为第一反射镜，3为照明单元，31为照明透镜，32第一中继透镜组为，33为第二反射镜，34为第二中继透镜组，35为第三反射镜，4为样品腔室，5为探测单元，51为探测物镜，52为第四反射镜，53为套筒透镜，6为像差矫正单元，7为运动单元，8为夹持单元，9为成像单元，91为滤色片，92为相机。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

在本发明中，本发明及附图中的术语“第一”、“第二”等(如果存在)是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。

图1为本发明实施例提供的斜置上顶式静态贝塞尔光片成像系统的结构示意图。参阅图1，结合图2A-图5，对本实施例中斜置上顶式静态贝塞尔光片成像系统(以下简称为光片成像系统)进行详细说明。

参阅图1中的结构图以及图5中的三维图，光片成像系统沿光路传输方向依次包括生成及整形单元1、贝塞尔光片产生单元2、照明单元3、样品腔室4、探测单元5、像差矫正单元6和成像单元9。生成及整形单元1用于生成高斯光束，并将生成的高斯光束整形扩束为线聚焦光束。贝塞尔光片产生单元2中包括双环掩膜21，双环掩膜21用于对线聚焦光束的强度进行调制以得到分段线光源。照明单元3中包括照明透镜31，照明透镜31用于将分段线光源汇聚成低旁瓣贝塞尔光束，并将该低旁瓣贝塞尔光束倾斜入射至水平放置的样品腔室4中。样品腔室4中承载有样品，样品在低旁瓣贝塞尔光束的激发下产生荧光。探测单元5与照明单元3正交，且照明单元3和探测单元5均相对于水平面倾斜，探测单元5用于探测样品表面的荧光。像差矫正单元6用于对探测单元5探测到的荧光进行像差矫正。成像单元9用于生成像差矫正后的荧光的图像。由此，在倒置排列的光片成像系统中，将照明光路和探测光路保持正交性且与水平面成一定角度，放置在样品下方，不需要为样品设置特定的夹持器，可以对载玻片、孔板中的样本成像，极大提高成像通量，用途广泛；此外，利用像差矫正单元对倾斜角度探测引入的像差进行矫正，保证成像准确度；再者，利用双环掩膜降低贝塞尔光束的旁瓣相应，解决了旁瓣影响图像对比度和光漂白的问题，可以实现大生物样本的高分辨率成像，解决生物医学上的实际问题。

沿光路传输方向生成及整形单元1依次包括激光光源11、光纤头15、准直器12、第一柱透镜13和球透镜14。激光光源11用于生成高斯光束，高斯光束经光纤头15到达准直器12。准直器12用于对高斯光束进行准直。第一柱透镜13和球透镜14用于将准直后的高斯光束整形扩束为线聚焦光束。第一柱透镜13和球透镜14的焦距例如分别为50mm和60mm。

贝塞尔光片产生单元2中双环掩膜21的结构如图2A所示。参阅图2A，双环掩膜21包括刻蚀有同心双环空心结构的不透光掩膜板以及填充在同心双环空心结构中的两个同心透光环，双环掩膜21放置在样品平面傅里叶面的共轭面上。同心透光环为透光区域，用于透射光束；不透光掩膜板为不透光区域，阻断光束传播。两个同心透光环对线光源的强度分布进行调制以得到四部分分段线光源，每两部分之间都会发生干涉，经过多级干涉叠加后在焦点位置处产生具有低旁瓣效应的静态贝塞尔光束，其形成的静态贝塞尔光束如图2B所示。低旁瓣贝塞尔光束是指相对于现有元件形成的贝塞尔光束而言，旁瓣光的强度大大降低。不透光掩膜板1的材料优选为铬。同心透光环的材料优选为玻璃。低旁瓣贝塞尔光束中旁瓣的光强分布由这两个同心透光环的内径以及外径确定。可以通过大量的数据仿真结果获得同心双环图案内环半径参数值、外环半径参数值的最优解来达到相对最低的旁瓣效果。

本实施例中，通过双环掩膜21在不损失信号功率的条件下将高斯光束转化为高强度的贝塞尔光束，双环掩膜21的厚度优选为7.5μm，瑞利范围优选为468μm。双环掩膜21的内环内半径、内环外半径、外环内半径、外环外半径优选为423μm、634μm、846μm、1492μm，其旁瓣抑制比可以达到33.3％。

贝塞尔光片产生单元2还包括位于双环掩膜21下方的可翻转夹持件22。可翻转夹持件22用于将双环掩膜21从光路中撤离或者将双环掩膜21投入光路中。双环掩膜21从光路中撤离后，产生高斯光片；双环掩膜21投入光路中后，产生贝塞尔光片，从而实现贝塞尔光片和高斯光片的切换，适用于不同生物样品检测的成像需求。

贝塞尔光片产生单元2还包括位于双环掩膜21输出光路上的第一反射镜23。第一反射镜23用于将分段线光源反射至照明单元3。

沿光路传输方向照明单元3依次包括第一中继透镜组32、第二反射镜33、第二中继透镜组34、第三反射镜35和照明透镜31，照明透镜31为柱透镜。第一反射镜23将分段线光源反射至第一中继透镜组32，分段线光源依次经第一中继透镜组32中继传输至第二反射镜33、经第二反射镜33反射至第二中继透镜组34、经第二中继透镜组34中继传输至第三反射镜35、经第三反射镜35反射至照明透镜31之后，照明透镜31将分段线光源汇聚成低旁瓣贝塞尔光束并倾斜入射至样品腔室4中。第一中继透镜组32例如由两个焦距均为40mm的中继透镜组成，第二中继透镜组例如由两个焦距均为80mm的中继透镜组成，照明透镜31例如为焦距为45mm的柱透镜。

样品腔室4的结构如图3所示，样品腔室4中填充满折射率匹配液，样品浸没在折射率匹配液中，避免三维扫描成像过程中因虚焦造成成像模糊，丢失成像信息。样品腔室4的尺寸设计综合考虑了照明光路和探测光路的需求，确保以合适的尺寸放置在光路中，且不会干扰照明和探测。

沿光路方向探测单元5依次包括探测物镜51、第四反射镜52和套筒透镜53。探测物镜51为长工作距离的高倍物镜，其焦距例如为20mm、放大倍率例如为10、数值孔径例如为0.3；套筒透镜53的焦距例如为200mm。样品受贝塞尔光束激发产生的荧光经过探测物镜51收集、套筒透镜53的无限远矫正后传输至像差矫正单元6进行像差矫正。像差矫正单元6为长焦柱透镜，长焦柱透镜的角度可调节。例如利用旋转固定装置固定长焦柱透镜，以调节长焦柱透镜的角度，有利于矫正像差，改善成像质量。长焦柱透镜的焦距例如为1000mm。

照明单元3和探测单元5相对于水平面倾斜的倾斜角度的组合为(30°，60°)、(45°，45°)或(60°，30°)。照明单元3和探测单元5相对于水平面倾斜的倾斜角度分别是指照明透镜31和探测物镜51相对于水平面倾斜的倾斜角度。以45°倾斜角度为例，扫描成像后的三维图像堆栈需要经过45°坐标矫正以还原成实际三维图像栈，从而进行后续图像处理与分析。

光片成像系统还包括运动单元7和夹持单元8。夹持单元8用于连接运动单元7和样品，兼容常规的样品承载装置，例如玻片和孔板，孔板例如为九十六孔板，从而有利于实现高通量成像，夹持单元8的结构如图4所示。运动单元7用于调节样品的三维位置，运动单元7包括一维位移台和高速XY显微镜平移台，成像过程中，XY显微镜平移台在电机驱动下实现样品的扫描成像。

成像单元9包括滤色片91和相机92，相机92例如为CCD相机或Scmos相机，以在相机92中得到最终的图像。整个系统由两块350mm*400mm和一块200mm*100mm的面包板构成，系统空间结构紧凑，可以实现对肿瘤球、微器官等样本的三维成像，也可以对载玻片、九十六孔板中的样本成像，具有高通量，高分辨率大视野的优点。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种斜置上顶式静态贝塞尔光片成像系统，其特征在于，包括：

生成及整形单元(1)，用于生成高斯光束，并将所述高斯光束整形扩束为线聚焦光束；

贝塞尔光片产生单元(2)，位于所述生成及整形单元(1)的输出光路上，包括双环掩膜(21)，用于对所述线聚焦光束的强度进行调制以得到分段线光源，其中，所述双环掩膜(21)包括刻蚀有同心双环空心结构的不透光掩膜板以及填充在所述同心双环空心结构中的两个同心透光环，且放置在样品平面傅里叶面的共轭面上；

照明单元(3)，位于所述贝塞尔光片产生单元(2)的输出光路上，包括照明透镜(31)，所述贝塞尔光片产生单元(2)得到的分段线光源每两部分之间发生干涉，经过多级干涉叠加后经所述照明透镜(31)汇聚成低旁瓣静态贝塞尔光束，并将所述低旁瓣静态贝塞尔光束倾斜入射至水平放置的样品腔室(4)中；

样品腔室(4)，用于承载样品，所述样品在所述低旁瓣静态贝塞尔光束的激发下产生荧光；

探测单元(5)，与所述照明单元(3)正交，且所述照明单元(3)和探测单元(5)均相对于水平面倾斜，所述探测单元(5)用于探测所述荧光；

像差矫正单元(6)，位于所述探测单元(5)的输出光路上，用于对所述探测单元(5)探测到的荧光进行像差矫正；

成像单元(9)，位于所述像差矫正单元(6)的输出光路上，用于生成像差矫正后的荧光的图像。

2.如权利要求1所述的斜置上顶式静态贝塞尔光片成像系统，其特征在于，所述贝塞尔光片产生单元(2)还包括位于所述双环掩膜(21)下方的可翻转夹持件(22)，所述可翻转夹持件(22)用于将所述双环掩膜(21)从光路中撤离或者将所述双环掩膜(21)投入光路中。

3.如权利要求1或2所述的斜置上顶式静态贝塞尔光片成像系统，其特征在于，所述贝塞尔光片产生单元(2)还包括位于所述双环掩膜(21)输出光路上的第一反射镜(23)，所述第一反射镜(23)用于将所述分段线光源反射至所述照明单元(3)。

4.如权利要求1所述的斜置上顶式静态贝塞尔光片成像系统，其特征在于，所述生成及整形单元(1)包括激光光源(11)、准直器(12)、第一柱透镜(13)和球透镜(14)；

所述激光光源(11)用于生成所述高斯光束；所述准直器(12)用于对所述高斯光束进行准直；所述第一柱透镜(13)和球透镜(14)用于将准直后的高斯光束整形扩束为所述线聚焦光束。

5.如权利要求1所述的斜置上顶式静态贝塞尔光片成像系统，其特征在于，所述照明单元(3)还包括第一中继透镜组(32)、第二反射镜(33)、第二中继透镜组(34)和第三反射镜(35)，所述照明透镜(31)为柱透镜；

所述贝塞尔光片产生单元(2)输出的所述分段线光源依次经所述第一中继透镜组(32)、第二反射镜(33)、第二中继透镜组(34)和第三反射镜(35)传输后到达所述照明透镜(31)；所述照明透镜(31)用于将所述分段线光源汇聚成所述低旁瓣静态贝塞尔光束并倾斜入射至所述样品腔室(4)中。

6.如权利要求1所述的斜置上顶式静态贝塞尔光片成像系统，其特征在于，所述照明单元(3)和探测单元(5)相对于水平面倾斜的倾斜角度的组合为(30°，60°)、(45°，45°)或(60°，30°)。

7.如权利要求1所述的斜置上顶式静态贝塞尔光片成像系统，其特征在于，所述像差矫正单元(6)为长焦柱透镜，所述长焦柱透镜的角度可调节。

8.如权利要求1所述的斜置上顶式静态贝塞尔光片成像系统，其特征在于，还包括：运动单元(7)和夹持单元(8)，所述夹持单元(8)用于连接所述运动单元(7)和所述样品；所述运动单元(7)用于调节所述样品的三维位置。

9.如权利要求1或8所述的斜置上顶式静态贝塞尔光片成像系统，其特征在于，所述样品腔室(4)还用于填充折射率匹配液，所述样品位于所述折射率匹配液中。

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