JP6553631B2 - 光シート顕微鏡検査のための方法および装置 - Google Patents
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Description
この点に関して、(特許文献1)には照明装置を含む顕微鏡が記載されており、その中では光ストリップが生成され、前記光ストリップが試料を、検出方向に関して90°以外の角度で傾斜する平面内で照明する。検出方向は、検出光が表面検出器へと到達する際に通過する対物レンズにより画定される。
画像生成対象の試料部を、対物レンズの光軸との角度δ≠90°を含む光シートで走査するステップであって、
光シートは、画像生成対象の試料部全体を伝搬方向に通過し、
対物レンズの焦点深度Sobjは、この試料部の光軸の方向への深さTより小さい、走査するステップと、
検出ビーム経路内の焦点深度Sobjをこの試料部の深さT以上である焦点深度Seffへと増大させるステップと、
試料部を焦点深度Seff内に位置付けるステップと、
試料部における光画像信号の発生領域を割り当てつつ、増大させた焦点深度Seffで得られた光画像信号を電子画像信号に変換するステップと、
電子画像信号から走査された試料部の画像を生成するステップと
により達成される。
本発明の意味において、それぞれ使用される対物レンズの設計により決定される公称焦点深度は、焦点深度Sobjと定義される。例えば、高開口数の無収差対物レンズには下式:
対物レンズに関する光シートのx、yおよびz方向への位置、および/または
角度δ、および/または
光軸の周囲での中心または偏心回転により、前記試料部内での光シートのアラインメント
を変化させることができる。
画像生成対象の試料部を、対物レンズの光軸との角度δ≠90°を含む光シート(9)で走査するための手段であって、
光シートは、画像生成対象の試料部全体を伝搬方向に通過し、
対物レンズの焦点深度Sobjは、この試料部の光軸の方向への深さTより小さい、走査するための手段と、
対物レンズの下流に設置され、焦点深度Sobjをこの試料部の深さT以上である焦点深度Seffへと増大させるように具現化された光学装置と、
試料部を焦点深度Seffの領域内に位置付けるための手段と、
光学装置の下流に設置された空間分解光電子エリアセンサと、
エリアセンサにより出力された電子画像信号から試料部の画像を生成するように具現化されたハードウェアおよびソフトウェアと
を含む。
試料部内へと走査される光シートを生成し、ならびに
対物レンズに関する光シートのx、yおよびz方向の位置を変化させ、および/または
角度δを変化させ、および/または
光軸の周囲での中心または偏心回転により、試料部内の光シートのアラインメントを変化させるための光学的手段を備える。
照明光の入射位置と対物レンズの光軸との間の距離を変化させ、
瞳面内の入射位置を、照明光の入射位置の光軸からの距離に対応する半径を有する部分円に沿って移動させ、および
照明光を対物レンズの入射瞳へと入射させる方向を変化させる
ように具現化された装置が存在する。
− 照明光の入射位置23と光軸8との間の距離を変化させ、
− 瞳面内の入射位置23を、入射位置23の光軸8からの距離に対応する半径を有する部分円25に沿って移動させ、および
− 照明光を対物レンズ1の入射瞳24への入射方向を変化させる
ように具現化されている。
照明された試料領域から反射された、散乱した、または励起された光は検出光として対物レンズ1に入る。対物レンズ1は検出ビーム経路12を形成し、図1に示されるように、スプリッタ面6は検出光を透過させる。対物レンズ1にマッチするチューブ光学ユニット13が中間像14を生成するために使用され、これはその後、2つの別のレンズ群15および16aと、アキシコン19とによってエリアセンサ17の受像面18上に結像される。受像面18は、焦点面11と共役である対物レンズ1の像面内に固定して位置付けられる。
図3による例示的な実施形態の図1および図2による前述の例示的な実施形態との違いは、アキシコン19も位相マスク20も設けられず、その代わりに受像面18の上流にマイクロレンズアレイ21が配置されている点である。
図4および図5は、例示的かつ全体的に、試料部10の走査中に光シート9が光軸8および試料台22に関して取り得る2つの位置およびアラインメントを示している。明瞭にするために、対物レンズと、試料台22上に載せられ、光シート9によって走査される試料とは、図4および図5には描かれていない。
図4および図5からわかるように、走査される試料部10に対する光シート9の位置およびアラインメントを、入射位置23を変化させることによって、ここでは例えば角度φを変化させることによって適応させることが可能であるが、光軸8と光シート9との間の角度δが保持される。対物レンズ1の焦点面から離れた試料面に関する光シート9の交差点は、このケースでは円形経路に沿って延びる。
領域L内で、光シート9の光軸8の方向への空間的広がりは例えば10μmの数値を超えず、従って、光シート顕微鏡の原理によって試料部10を検出または測定するのに適している。
2 レーザ光源
3 ビーム拡張光学ユニット
4 走査装置
5 照明ビーム経路
6 スプリッタ面
7 ビームスプリッタ
8 光軸
9 光シート
10 試料部
11 焦点面
12 検出ビーム経路
13 チューブ光学ユニット
14 中間像
15 レンズ群
16 レンズ群
17 エリアセンサ
18 受像面
19 アキシコン
20 位相マスク
21 マイクロレンズアレイ
22 試料台
23 入射位置
24 入射瞳
25 部分円
26 コンピューティングユニット
27 メモリおよび再現ユニット
Claims (12)
- 光シート顕微鏡検査の方法であって、
画像生成対象の試料部(10)を、照明光によって形成され、かつ対物レンズ(1)の光軸(8)に対して角度δ≠90°を有する光シート(9)で走査するステップと、
前記光シート(9)は、前記画像生成対象の試料部(10)全体に伝搬方向において方向付けられ、
前記対物レンズ(1)は、試料部(10)への照明光および試料部(10)からの検出光の両方を方向付けし、
照明光は、前記対物レンズ(1)の光軸と平行に、かつ中心を外して前記対物レンズ(1)の入射瞳に入射され、
前記対物レンズ(1)の焦点深度Sobjは、前記試料部(10)の前記光軸(8)の方向への深さTより小さく、
検出ビーム経路内の前記焦点深度Sobjを前記試料部(10)の前記深さT以上である焦点深度Seffへと増大させて、前記試料部(10)を前記焦点深度Seff内に位置付けるステップと、
前記試料部(10)における光画像信号の発生領域を割り当てつつ、前記増大させた焦点深度Seffで得られた光画像信号を電子画像信号に変換するステップと、
前記電子画像信号から走査された試料部(10)の画像を生成するステップと
を含む、方法。 - 走査は、前記試料部(10)中に投射されるか、または走査式に点もしくは線焦点により生成される光シート(9)で実行される、請求項1に記載の光シート顕微鏡検査の方法。
- 前記走査された試料部(10)の2次元画像または3次元画像は、拡張焦点深度技術またはライトフィールド技術に従って、好ましくは回折光学素子(DOE)を前記検出ビーム経路中に挿入して、生成される、請求項1または2に記載の光シート顕微鏡検査の方法。
- 走査対象の試料部(10)に応じた方法で、
前記対物レンズ(1)に関する前記光シート(9)の位置がx、yまたはz方向に変化され、および/または
角度δが変化され、および/または
前記試料部(10)内での前記光シート(9)の空間的広がりが、前記光軸(8)の周囲での回転により変化される、請求項1乃至3の何れか一項に記載の光シート顕微鏡検査の方法。 - 前記試料部(10)が反射光方式を用いて走査される、請求項1乃至4の何れか一項に記載の光シート顕微鏡検査の方法。
- 光シート顕微鏡検査のための装置であって、
画像生成対象の試料部(10)を、照明光によって形成され、かつ対物レンズ(1)の光軸(8)に対して角度δ≠90°を有する光シート(9)で走査するための手段と、
前記光シート(9)は、前記画像生成対象の試料部(10)全体に伝搬方向において方向付けられ、
前記対物レンズ(1)は、試料部(10)への照明光および試料部(10)からの検出光の両方を方向付けし、
照明光は、前記対物レンズ(1)の光軸と平行に、かつ中心を外して前記対物レンズ(1)の入射瞳に入射され、
前記対物レンズ(1)の焦点深度Sobjは、前記試料部(10)の前記光軸(8)の方向への深さTより小さく、
前記対物レンズ(10)の下流に設置され、前記焦点深度Sobjを前記試料部(10)の前記深さT以上である焦点深度Seffへと増大させるように具現化された光学装置と、
前記試料部(10)を前記焦点深度Seffの領域内に位置付けるための手段と、
前記光学装置の下流に設置された空間分解光電子エリアセンサ(17)と、
前記エリアセンサ(17)により出力された電子画像信号から前記試料部(10)の画像を生成するように具現化されたハードウェアおよびソフトウェアとを含む、装置。 - 前記試料部(10)内へと走査される光シート(9)を生成し、
前記対物レンズ(1)に関する前記光シート(9)のx、yまたはz方向の位置を変化させ、および/または
角度δを変化させ、および/または
前記光軸(8)の周囲での、または前記光軸(8)に平行な軸の周囲での回転により、前記光シート(9)の空間的広がりを変化させるための光学的手段を備える、請求項6に記載の顕微鏡検査のための装置。 - 光シート(9)を前記光軸(8)の周囲または前記光軸(8)に平行な軸の周囲で回転させることにより照明光を前記対物レンズ(1)の前記入射瞳(24)へと入射させる方向を変化させるための装置が設けられている、請求項6または7に記載の装置。
- 前記光学装置は、
アキシコン(19)、または
キューブ位相マスク(20)、または
マイクロレンズアレイ(21)
を含む、請求項6乃至8の何れか一項に記載の光シート顕微鏡検査のための装置。 - 検出ビーム経路(12)に直角に、少なくとも実質的に直角に整列された受像面(18)を有するCCDセンサがエリアセンサ(17)として提供される、請求項6乃至9の何れか一項に記載の光センサ顕微鏡検査のための装置。
- 前記対物レンズ(1)の入射瞳(24)に照明光を前記光軸(8)に関して中心を外して入射させるために、入射位置を変化させる手段を含む、請求項6乃至10の何れか一項に記載の装置。
- PCと、2次元画像または3次元画像の電子的保存および視覚的に認識可能な再現のための手段とがハードウェアとして提供され、かつ
前記ソフトウェアは、信号評価と、前記2次元画像または3次元画像の生成とのための所定のアルゴリズムに対応する、請求項6乃至11の何れか一項に記載の光シート顕微鏡検査のための装置。
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