JP6829527B2 - 試料を結像する装置、及びその方法 - Google Patents

Description

本発明は、物体面内に配置された試料を結像する装置に関する。この装置は、試料のエリアを物体面から中間画像面内に結像する光学中継システムを備えている。物体面及び中間画像面は、中継システムの光軸との間に９０度とは異なる角度を含んでおり、また光学中継システムは、幾つかのレンズから構成されている。また、装置は、対物レンズを有する光学結像システムを備えており、対物レンズの光軸が中間画像面上において垂直に位置すると共に、対物レンズが中間画像面上に合焦されることにより、物体面は歪まない状態で検出器上に結像される。また、装置は、ライトシートによって試料を照明する照明装置も備えている。ここで、照明光は、中間画像面内又は瞳孔面内において中継システムのビーム経路内に結合され、中継システムによって試料上に導波されるか、或いは、別個の照明ビーム経路を介して物体面上に直接的に照射される。ここで、ライトシートは本質的に物体面内に位置し、照明の方向を定義している。物体面の法線（これはライトシートの法線にも対応している）は、検出方向を定義している。

光学中継システムは、幾つかのレンズから構成されている。光学中継システムは、対称的に構築することが可能であり、その場合、光学中継システムによる結像は、１：１のスケールで実行される。しかしながら、これは必須ではなく、結像は拡大又は縮小を伴って実行することもできる。

このような装置は、特に生物学的試料の検査において使用されており、その場合、試料の照明はライトシートによって実行され、ライトシートの面はゼロとは異なる角度で検出の光軸と交差している。通常、ライトシートは検出方向との間に直角を含む。このＳＰＩＭ（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｐｌａｎｅ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）とも呼ばれる技法によれば、厚い試料の３次元記録であっても、相対的に短期間に生成することができる。断面に垂直の方向における相対運動と組み合わせられた光学セクションに基づいて、３次元において拡大された試料の画像表現が可能である。

ＳＰＩＭ技法は、好ましくは蛍光顕微鏡撮影法において使用され、その場合、ＬＳＦＭ（Ｌｉｇｈｔ Ｓｈｅｅｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）とも呼ばれている。共焦点レーザースキャニング顕微鏡法又は２光子顕微鏡法などのその他の確立された方法との比較において、ＬＳＦＭ技法は幾つかの利点を有している。すなわち、検出を広いフィールドにおいて実行可能であることから、相対的に大きな試料エリアを検出することができる。これに加えて、この方法においては、光に対する試料の曝露が最小限であり、試料のブリーチングのリスクが低減される。その理由は、試料は検出方向に対するゼロとは異なる角度において、薄いライトシートによって照明されるのみであるからである。純粋に静的なライトシートに代えて、準静的なライトシートを使用することもできる。これは、試料をライトビームによって迅速にスキャニングすることによって生成される。このライトシートに似た照明は、ライトビームに、観察対象の試料との関係において非常に迅速な運動が適用されると共に、並んだ状態で整列するように、このプロセスが、時間的に連続した状態において反復された際に、生成される。その場合、そのセンサ上において試料が結像されるカメラの蓄積時間は、スキャニングが蓄積時間内において完了するように適切に選択される。

なお、ＳＰＩＭ技法については、例えば、これに基づく特許文献１及び特許文献２などの文献において何度も記述されている。特に、薄いライトシートが構築可能な方法及び構成については、例えば特許文献３に記述されている。

従来のＳＰＩＭ構成においては、照明は、照明されている試料の面内に位置するレンズシステムを介して実行される。したがって、試料が例えば上方から観察される場合には、照明は側部から実行しなければならない。したがって、従来のセットアップ法を使用することはできない。更なる基本的な欠点は、広いエリアから光をキャプチャする大きな開口数を有するレンズを検出用にも使用することができるようにするために、照明対物レンズと観察対物レンズの両方を相互に空間的に近接した状態で配置しなければならないことにある。しかしながら、これと同時に、ライトシートも生成しなければならない。これらの機械的な制限は、開口数の制限、したがって結像システムの分解能の制限をもたらすことになる。

これらの制限を克服するために、ライトシートによる照明と試料から到来する蛍光の検出とのために、同一の対物レンズが使用されるＳＰＩＭ光学システムが開発されている。この場合、試料は対物レンズのエッジエリアを含む対物レンズの部分的エリアを介して、ライトシートによって照明され、照明は対物レンズの光軸との関係において傾斜した角度において実行される。また、対物レンズの反対側のエッジエリアも検出のために使用され、検出も同様に対物レンズの光軸に対するゼロとは異なる角度において中心で実行される。対物レンズの限られた開口数の結果として、この角度は原理的に従来のＳＰＩＭ技法において一般的である９０°を下回っている。

このようなセットアップは、例えば特許文献４において記述されており、結像システムは、２つの結像サブシステムの鏡面対称な結合体から構成された中継システムによって補完されている。２つの結像システムは、それらの光学要素に関して鏡面対称となるように配置されており、鏡面は、画像内の試料の照明されたエリアが、所定の角度において画像面と交差している物体側サブシステムのオリジナルの画像面に結果的に対応している。中継システムの倍率は、中間画像が配置される第２媒質に対する試料が配置される第１媒質の屈折率の比率に対応するように、選択される。

浸漬媒質が使用されない場合には、２つのサブシステムの光学コンポーネントは、同一になるように選択することができる。ただし、それらは鏡面反転された方式で構成され、結像は１：１のスケールで実行される。

２つのサブシステムのうちの１つが浸漬システムとして設計される場合には、試料に最も近接した光学要素は浸漬媒質内に配置されることになり、その結果、特許文献４によれば、物体側媒質と画像側媒質又は浸漬媒質との屈折率の比率に対応した倍率を選択する必要がある。したがって、浸漬媒質の使用を除いて対称な光学中継システムを使用することにより、物体面は中間画像面内の中間画像内に結像される。この場合にも、中間画像面はライトシート面と一致しており、物体面は中間画像面との関係において歪んでおらず、且つ、拡大されてもいない状態で表される。

物体面内において試料の拡大された表現を取得するために、特許文献４は、その光軸が中間画像面上において垂直に位置している対物レンズを有する顕微鏡として設計された光学結像システムを提供している。また、それは中間画像面上に合焦されており、中継システム及び結像システムの焦点面は中間画像の中心において交差している。その結果、試料の歪んでいない結像、すなわち収差を有していない結像を、顕微鏡に依存した倍率を伴って、検出器上に実現することができる。基礎となる原理は特許文献５にも記述されており、これによれば、このようなシステムを使用することによって、コマ収差及び球面収差を伴うことなしに、光軸に対して垂直に位置した画像面内において、特定の容積範囲内の深さにおいて物体を結像することができる。

特許文献４において使用されている、レンズから構成される透過型の中継システムに代えて、部分的に反射屈折型であるシステム、すなわち反射を伴って動作するシステムを使用することもできる。そのようなシステムは、例えば現在はまだ公開されていない特許文献６において記述されており、これによれば、光学要素の全体長及び数を低減することができる。

ライトシートの照明方向及び中継システムの光軸が存在する面内において検出される蛍光ビームの角度分布は、中継システムの下流に位置する光学結像システムの伝播光軸との関係において対称であることが特許文献４からわかる。検出瞳孔内において、励起ビームと検出ビームとの間には、オーバーラップが存在しない。また、中継システムの下流に位置する光学結像システムの開口数も、検出可能な試料の角度スペクトルを制限する。その場合、物体側における中継システムの開口数は、光学結像システムの開口数を上回っている。

類似の構成が特許文献７にも記述されている。そこでは、ライトシートはスキャニング運動によって生成され、したがって、これは準静的なライトシートである。この場合にも、検出ビーム経路の角度スペクトルは、中継システムの下流に位置する光学結像システムの光軸との関係において対称的に構成されており、角度スペクトルの範囲は光学結像システムの開口数によって制限される。

独国特許出願公開第１０２５７４２３Ａ１号 国際特許出願公開第２００４／０５３５５５８Ａ１号 独国特許出願第１０２０１２０１３１６３．１号 米国特許出願公開第２０１１／０２６１４４６Ａ１号 国際特許出願公開第２００８／０７８０８３Ａ１号 独国特許出願第１０２０１３１０５５８６．９号 独国特許出願公開第１０２０１１０００８３５Ａ１号

本発明の目的は、検出の際に実現可能な分解能が単純な手段によって改善されるという趣旨において、冒頭に記述されているタイプの装置を改善することにある。

この目的は、結像システムの対物レンズの光軸の周りに非対称に分布した検出角度範囲を検出し、これを検出器上に結像するように、光学結像システムが形成されることによって実現される。従来技術においては、光学結像システムの対物レンズの光軸の周りの対称な検出角度範囲が検出されるのに対して、本発明による光学結像システムは、相当に大きな検出角度範囲を検出しており、これにより全体的な分解能が増大する。ここで、検出角度範囲とは、実際に検出可能な検出角度スペクトルの範囲である。

従来技術よりも大きな角度範囲を含む非対称な検出角度スペクトルに起因して、顕微鏡装置の分解能を増大させることができる。また、角度スペクトルの検出に利用可能な相対的に大きな範囲に起因して、システムの点広がり関数の半値全幅が低減される。しかしながら、同時に、検出角度スペクトルの非対称性に起因して、非対称性も課されることになる。したがって、装置は、好ましくは、このような非対称な点広がり関数及び／又は境界表面に起因して圧縮される点広がり関数を考慮した結像プロセスのために、検出器及びこれに接続される評価ユニットを備える。特に、キャプチャされた画像を非対称な点広がり関数によって逆畳み込みすることにより、画像内に存在しているぼけを相対的に良好に補正することができる。ただし、画像処理の一部としてのみ実行可能な点広がり関数による逆畳み込みを伴わない場合でも、従来技術よりも良好な分解能を有する画像が得られる。

この場合、物体面及び中間画像面は、好ましくは、中継システムの光軸との間に角度を含み、それらの値は、中継システムのそれぞれ物体側又は中間画像側の検出アパーチャコーンの開口角よりも小さい。また、物体面及び中間画像面は、少なくとも部分的にそれぞれ物体側又は中間画像側の検出アパーチャコーン内に位置している。

その結果、中継システムと光学結像システムとの間の中間画像又は結像されたライトシート面は、中継システムのアパーチャ及びその焦点距離に依存すると共に、検出アパーチャコーンに対応する可能な検出角度スペクトル内に位置する。これにより、伝播方向及び中継システムの光軸又は光学結像システムの光軸が位置している面内、すなわちライトシート面に対して垂直である面内における蛍光の検出可能角度分布の本質的な非対称性がもたらされる。上述の面内における蛍光の検出可能角度スペクトルの最大可能部分エリアは、中継システムの出口側における検出アパーチャコーン内の中間画像面の位置に起因して制限されており、したがって、中継システムの光軸との関係において非対称である。

記述されている装置は、好ましくは、物体面が少なくとも部分的に物体側検出アパーチャコーン内に位置しているという点において、したがって、中継システムの光軸が角度を含み、その値が検出アパーチャコーンの開口角よりも小さいということによって、特徴付けられる。したがって、物体側検出アパーチャコーンは、中継システムによって中間画像の側に透過され、中間画像面は、相応して少なくとも部分的に、中間画像側検出アパーチャコーン内に位置している。中継システムの光軸は中間画像面との間に角度を含み、その値は中継システムの中間画像側検出アパーチャコーンの開口角よりも小さい。したがって、この場合、検出角度スペクトルの一部を遮断する可能性のある破壊的な光学要素を、中継システム内に配置する必要がない。

例えば、放出された蛍光の検出の場合、中継システムの物体側アパーチャの範囲全体が利用可能である。これにより、中継システムの検出アパーチャコーンは、物体側における中継システムの開口数によってのみ制限される。従来技術においては、中継システムの物体側対物レンズの一部は、通常、励起光の結合入力のために利用されているため、対物レンズのこの部分はもはや検出のために利用可能ではない。その理由は、例えば照明光が中継システムのビーム経路内に配置された鏡を介して結合入力されるからである。したがって、その場合においては、中継システムの物体側対物レンズのアパーチャ全体をフルに利用する可能な最大の理論的に利用可能な検出アパーチャコーンを実現することができない。その結果、物体面と、したがって更にはライトシート面も、中間画像側における同一の状況を伴って、実際には可能である検出アパーチャコーン内に配置されず、中間画像面は中継システムの中間画像側アパーチャコーンの外部に位置している。結果として、従来技術においては、角度スペクトルは、光学結像システムの光軸との関係において対称的に形成され、また中間画像を画像面内に結像する光学結像システムのアパーチャによって制限される。

したがって、中間画像面は、透過の場合には部分的に中継システムによって透過されると共に、１：１のスケールで反射された検出アパーチャコーン内に配置される。光学結像システムは、中継システムの下流に位置しており、この中間画像面に対して垂直である自身の光軸にアライメントされている。これは、更なる検出アパーチャコーン内において検出される、すなわち光学結像システムの蛍光又は光を収集する。中間画像面は、透過された検出アパーチャコーン内に位置していることから、光学結像システムは、従来技術において可能なものよりも大きな検出角度範囲を検出することが可能である。この場合、これは不可避に検出角度範囲の非対称な分布をもたらす。検出可能な検出角度範囲が（非対称ではあるものの）増大されることから、これにより、分解能を全体的に増大させることができる。

この場合、分解能を極大化させることを目的として最大可能検出角度範囲を検出するために、光学結像システムの可能な最大の開口数を選択することが有利であり、具体的には、中継システムの開口数よりも大きくなるように、これを選択することが有利である。

これに加えて、装置は、第１光学媒質及び第２光学媒質が、光学中継システムと光学結像システムとの間に配置されるように設計することもできる。この場合、第１光学媒質は光学中継システムと中間画像面との間に配置され、第２光学媒質は中間画像面と光学結像システムとの間に配置される。その結果、中間画像面は、第１光学媒質と第２光学媒質との間の境界表面内に位置し、第２光学媒質は第１光学媒質よりも大きな屈折率を有する。媒質は、例えば浸漬媒質のように液体として、或いは、媒質が光学中継システム又は光学結像システムに直接的に接続される場合に、浸漬媒質の機能を引き受けることもできるゼラチン状又はガラス様の媒質として、形成することができる。境界表面は、事実上、単純な境界表面の場合に可能となるものよりも大きな屈折率のジャンプを実現するために、光学的に微細構造化することもできる。光学結像システムの相応に大きな開口数の、好ましくは光学中継システムのものよりも大きなアパーチャの場合、及び、境界表面としての中間画像面を伴う屈折率のジャンプの場合においては、（スネルの屈折の法則の結果として）、実際に検出可能な角度範囲は、理論的に可能な角度範囲に非常に近接することができるが、常に非対称性が存在している。

境界表面の導入は、点源、すなわち点広がり関数の角度スペクトルの圧縮を伴っており、これはここでは歪として見なされないが、後の評価においては相応して考慮しなければならない。

具体的には、上述の装置は、ライトシートによって物体面内に配置された試料を照明するために使用することが可能である。この場合、ライトシートは本質的に物体面内に位置すると共に照明方向を定義しており、また物体面の法線は検出方向を定義している。光学中継システムによって試料のエリアは物体面から中間画像面内に結像され、この場合には、物体面及び中間画像面は中継システムの光軸との間に９０°とは異なる角度を含む。中間画像面は、その光軸が中間画像面上において垂直に位置すると共に中間画像面上に合焦された対物レンズを有する光学結像システムによって、歪んでいない状態で検出器上に結像される。これはその場で画像として記録され、この場合、光学結像システム（６）は、光軸（７）の周りに非対称に分布した検出角度範囲を検出する。その後、記録された画像は、検出器（８）に接続された評価ユニット内において、非対称な検出角度スペクトル及び／又は圧縮された点広がり関数に基づく非対称な点広がり関数を考慮して処理される。

上述の特徴及び後述する特徴は、本発明の範囲を逸脱することなしに、記述されている組合せにおいてのみならず、その他の組合せにおいて、或いは単独で、使用可能であることを理解されたい。

以下、例として添付図面を参照し、本発明について更に詳細に説明するが、添付図面は、本発明にとって必須の特徴についても開示している。添付図面は以下のとおりである。

試料を結像する装置の構造である。 従来技術による検出光の検出可能角度分布である。 図１による装置の第１実施形態の検出角度スペクトルである。 装置の第２実施形態の検出角度スペクトルである。 装置の第３実施形態の検出角度スペクトルである。

図１を参照して、はじめに、物体面１内に配置された試料２を結像する装置の基本動作モードについて説明する。装置は、試料２のエリアを物体面１から中間画像面４内に結像する光学中継システム３を備えている。物体面１及び中間画像面４は、光学中継システム３の光軸５との間に９０°とは異なる角度を含む。ここでは、光学中継システム３は、幾つかのレンズから構成されている。これは例えば、中継システムの光軸５に対して垂直であるサブシステムの対称な面の間との関係において、対称的に構築することが可能であり、その結果、中継システム３による結像は１：１の画像スケールで実行される。その場合、これは例えば、いわゆる４ｆシステムとして構築することも可能であり、各サブシステムは、対物レンズとチューブレンズとを有する。これは反射屈折方式によって構築することも可能であり、すなわち、１つ又は複数のレンズが少なくとも部分的に反射しており、これにより、レンズの構造的なサイズ及び数を低減することができる。中継システム３は、中間画像面内において相応して拡大された画像を生成するために、非対称に構築することもできる。これは、物体側又は中間画像側において、屈折率の異なる適切な媒質（具体的には、浸漬媒質）の選択肢を通じて、実現することもできる。

また、装置は、対物レンズを有する光学結像システム６も備えている。対物レンズの光軸７が中間画像面４上において垂直に位置すると共に、対物レンズが中間画像面４上に合焦されることにより、物体面１は全体として歪まない状態で検出器８上に結像される。検出器８には、画像処理用の評価ユニット９が接続されている。

最後に、試料２を結像する装置は、ライトシート１１によって試料２を照明する照明装置１０も備えている。図１に示される装置では、照明光は中間画像面４内で中継システム３のビーム経路内に結合され、中継システム３によって試料２上に導波される。中間画像面４内での結合入力に代えて、結合入力のために中継システム３の瞳孔面を使用することもできる。更には、中継システムとは独立的に、試料空間内の照射によって、照明を直接的に実行することも想定可能である。ライトシート１１は、中継システム３によって試料２上に導波され、また本質的に物体面１内に位置しており、これにより、照明方向が定義される。また、物体面１の法線は、検出方向に対応している。したがって、照明は、検出方向に対してゼロとは異なる角度において実行される。ライトシート１１は本質的に物体面１内に位置しており、この場合の「本質的」という用語は、ライトシート１１が、図１に示されるように、ここで示されているｘｚ面内において、ゼロとは異なり且つ焦点からの距離の増大に伴って増大する厚さを有することを意味している。この場合には、ライトシート１１の厚さは、物体面１又は中間画像面４の左及び右の２つのエンベロープによって表されている。図面の面に垂直の状態において、ライトシート１１はかなり大きな広がりを有する。

ここでは、検出方向は、物体面１上又は中間画像面４上において垂直に位置している。光学中継システム３の試料側対物レンズのアパーチャは、合焦との組合せにおいて、放出光（例えば、ライトシートによって励起された蛍光）が検出可能な最大可能角度範囲を制限している。この最大可能角度範囲は、物体側及び中間画像側におけるｘｚ面において、短い破線によって表記されている。また、３次元的に考慮される場合には、アパーチャは、物体側検出アパーチャコーン１２及び中間画像側検出アパーチャコーン１３を定義しており、ここではその断面がｘｚ面において表されている。ここでは、中継システム３は対称的に構築されており、その結果、中間画像側検出アパーチャコーン１３は、反射された物体側検出アパーチャコーン１２に対応している。

従来技術においては、検出角度範囲は、検出軸の周りに対称的に配置された物体側アパーチャコーン１２のセクションによって制限されており、このセクションは、ここでは物体側検出アパーチャコーン１２内のハッチングを有するエリアによって、したって、中間画像側におけるハッチングを有するエリアによって、表されている。従来技術において、この背景にある理由は、ビーム経路の一部分が照明のために予約されており、且つ／又は、検出ビーム経路が光学結像システム内に制限されており、且つ／又は、画像評価の際に非対称な検出角度スペクトルの結果として更なる動作を実行する必要がないからであり、これは評価が相当に簡単であることを意味している。

この場合において、光学結像システム６によって検出可能な関連する検出角度スペクトルは、図２において一点鎖線によって表されている。連続的な線は、中継システム３及び／又は光学結像システム６のアパーチャにのみ依存する最大理論可能角度スペクトルを表している。正規化された振幅が任意単位において示されており、また光学結像システム６の光軸７との関係における相対角度が、ｘ軸上においてラジアンを単位として示されている。ここでは、実際に検出可能な検出角度スペクトルは、光学結像システム６の光軸７との関係において対称的に配置されなければならないという要件に起因して、理論的に可能な検出角度スペクトルと比べた場合に、大幅にトリミングされている。

しかしながら、図１に示される装置においては、状況は、物体側検出アパーチャコーン１２が、実際に可能な中継システム３の最大アパーチャコーンに対応するようなものになっており、その寸法は、中継システム３の物体側対物レンズからの対応したデータによってのみ規定される。また、検出アパーチャコーン１３は、中継システム３の最大可能アパーチャコーンよりもわずかに小さくてもよい。ここで示されている例においては、物体面１は中継システム３の光軸との間に角度を含んでおり、その値は中継システム３の物体側検出アパーチャコーン１２の開口角よりも小さく、また、物体面１（したがってライトシート１１の面も）は、少なくとも部分的に、物体側検出アパーチャコーン１２内に位置している。中間画像側においても状況は類似しており、すなわち、中間画像面４は中継システム３の光軸５との間に角度を含んでおり、その値は中継システム３の中間画像側検出アパーチャコーン１３の開口角よりも小さく、また、中間画像面は、少なくとも部分的に、中間画像側検出アパーチャコーン１３内に位置している。これは、図１において明瞭に観察することができる。

したがって、中間画像面４は、反射された検出アパーチャコーン１３内に配置されている。光学結像システム６は、中間画像面４に対して垂直であるその光軸７にアライメントされ、また結像側検出アパーチャコーン１４内において最大蛍光を収集しており、これは長い破線によって表記されている。光学結像システム６の光軸７との関係において９０°を超える角度で伝播する蛍光又は一般的に放出光は、原理的に検出することができないことから、図１に示されているセットアップによって検出可能なｘｚ面内の検出角度スペクトルの最大理論可能部分的エリアは、頂点Ａ、Ｂ、Ｃを有する三角形によって表記される。中間画像面４又は結像されたライトシート１１の面は、潜在的に可能な中間画像側検出アパーチャコーン１３内に配置されていることから、実際に可能な部分的エリアはトリミングされており、また潜在的に可能な部分的エリアよりも小さい。これに加えて、この三角形ＡＢＣによって定義される理論的に可能な最大部分的エリアは、中継システム３の光軸５との関係において非対称である。

ときには、実際に光学結像システム６によって検出可能な部分的エリアは、理論的に可能な最大部分的エリアよりも更に大きな程度で制限される。これは光学結像システム６のアパーチャに依存する。それぞれの場合において、光学結像システム６によって実際に検出可能であって三角形ＣＤＥにより表記される検出角度範囲は、従来技術による対称的なハッチングを有するコーンよりも、かなり大きな角度範囲をカバーしているが、光学結像システム６の光軸７の周りに非対称に分布している。この従来技術と比べた場合に大きい検出角度範囲は、検出角度スペクトルが光学結像システム６の光軸７の周りに非対称に分布してはいるものの、相対的に大きな分解能を装置にもたらす。

ここで、相対的に大きな光学結像システム６の開口数が選択された場合にも、結像側検出アパーチャコーン１４を更に拡大することができる。したがって、光学結像システム６の開口数は、好ましくは中継システム３の開口数よりも大きい。これに加えて、又はこれに代えて、中間画像面内において、屈折率のジャンプを生成する境界表面を導入することもできる。これを目的として、第１光学媒質が光学中継システム３と中間画像面４との間に配置され、第２光学媒質が中間画像面４と光学結像システム６との間に配置される。中間画像面４は、第１光学媒質と第２光学媒質との間の境界上に、すなわち境界表面内に位置する。第２光学媒質は、第１光学媒質よりも大きな屈折率を有する。それぞれの場合において、光学媒質は、中継システム３又は光学結像システム６までのビーム経路をカバーしており、また、これらは例えば浸漬媒質又はゼラチン状物質であってもよく、ガラスも可能な実施形態である。このようにして、実際に検出可能な部分的エリアは、理論的に可能な部分的エリアに可能な限り近づくことができる。それぞれの場合において、装置全体としては、結像の観点において非対称な又は点対称でない点広がり関数を生成する非対称性が残っている。評価ユニット９は、好ましくは、非対称な検出角度スペクトルに基づく非対称な点広がり関数を考慮した画像処理に適しており、これによって、点広がり関数を画像評価のために使用することが可能となり、点広がり関数は、逆畳み込みの文脈における鋭さの増大に寄与することができる。これに代えて、又はこれに加えて、評価ユニットは、スネルの屈折の法則に起因して中間画像面内の上述の境界表面において発生する、圧縮された点広がり関数を考慮又はオフセットするためにも適している。

図３〜図５には、装置の様々な構成における検出角度スペクトルが示されている。これらの図は、それぞれの場合において、試料によって放出された光、すなわち検出角度スペクトルにおける、振幅部分を通じたｘｚ面における断面を連続的な線によって示している。この場合においては、位相部分が無視されているが、これは蛍光放出を考慮する際には適切である。この場合、検出角度スペクトルの形態はランダムに選択されており、図示のためにのみ機能している。横座標は、光学結像システム６の光軸７との関係における角度を示している。

図３に示される場合においては、光学中継システム３の開口数は１．２であり、光学結像システム６の開口数と同一である。ここでは、唯一つの媒質、すなわち１．３３の屈折率を有する水のみが使用されている。中継システム３は対称的に構築されており、光学結像システム６は、光軸との関係において中継システム３に対して４８°の角度を有する。中継システム３の下流において検出可能であって図１の三角形ＡＢＣに対応する検出角度スペクトルの最大理論可能部分的エリアは、破線として示されている。オリジナルの角度スペクトルとの比較において、この部分的エリアは、中継システム３のアパーチャに起因して、また光学結像システムが垂直方向において検出しなければならない検出アパーチャコーン１３内に中間画像面４が位置しているという事実に起因して、トリミングされている。図３〜図５においては、実際に検出可能であって図１の三角形ＣＤＥに対応する部分的エリアは、点線として示されている。ここでは結果的に、光学結像システム６のアパーチャによって特定の部分的エリアしかカバーすることができず、またシステムの点広がり関数が光学結像システム６の光軸７との関係において非対称であるという事実に起因して、更なるトリミングが存在している。

したがって、従来技術との比較において、実際に検出可能なエリアが既に拡大されているが、分解能を増大させるために、破線として示されている理論的に可能なスペクトルの更に大きな部分の検出を試みてもよい。そのような場合が、図４のシミュレーションに示されている。ここでは、光学結像システム６の開口数は、１．３２９である。しかしながら、これは１．３３の屈折率を有する水が浸漬媒質として使用される際には、実現することができない。その理由は、半分の空間全体を検出しなければならなくなり、三角形の点Ｅが中間画像面内にシフトすることになるからである。

したがって、光学結像システム６の開口数の増大に対する制限が存在しているが、中間画像面４内における屈折率のジャンプを導入することにより、実際に検出可能なエリアの拡大を実現することもできる。図５にはこれが示されており、ここでは、１．３３の屈折率を有する水が第１媒質として中継システム３と中間画像面４との間に使用されており、１．５２の屈折率を有するＢＫ７ガラスが第２媒質として中間画像面４と光学結像システム６との間に使用されている。その結果、光学結像システム６の開口数は１．３２９となり、媒質の選択の結果として実現可能な範囲内に位置している。この結果、理論的に可能なスペクトルが完全に検出され、図５においては、これが点線によって示されている。この理論的に可能なスペクトルは、スネルの屈折の法則に起因して圧縮されてはいるが、歪んではいないことも観察することができる。これによって情報は失われないが、依然として存在している非対称性のような圧縮を画像処理の際に同様に考慮しなければならず、その際には点広がり関数も考慮される。圧縮及び点広がり関数は、逆畳み込みの範囲内において考慮することができる。

非対称で圧縮されている可能性のある検出角度スペクトルと、これと関連する非対称で同様に圧縮されている可能性のある点広がり関数が検出において許容される場合には、システムの分解能を全体として増大させることができる。

１ 物体面
２ 試料
３ 光学中継システム
４ 中間画像面
５ 光軸
６ 光学結像システム
７ 光軸
８ 検出器
９ 評価ユニット
１０ 照明装置
１１ ライトシート
１２ 物体側検出アパーチャコーン
１３ 中間画像側検出アパーチャコーン
１４ 結像側検出アパーチャコーン
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ 三角形の頂点

Claims (7)

1. 物体面（１）内に配置された試料（２）を結像する装置であって、
   − 前記試料（２）のエリアを前記物体面（１）から中間画像面（４）内に結像する光学中継システム（３）であって、前記物体面（１）及び前記中間画像面（４）は、前記中継システム（３）の光軸（５）との間に９０°とは異なる角度を含み、また前記光学中継システム（３）は幾つかのレンズから構成されている、光学中継システム（３）と、
   − 対物レンズを有する光学結像システム（６）であって、前記対物レンズの光軸（７）が前記中間画像面（４）上において垂直に位置すると共に、前記対物レンズが前記中間画像面（４）上に合焦されることによって、前記物体面（１）が歪まない状態で検出器（８）上に結像可能である、光学結像システム（６）と、
   − ライトシート（１１）によって前記試料（２）を照明する照明装置（１０）であって、前記ライトシート（１１）は、本質的に前記物体面（１）内に位置すると共に照明方向を定義しており、また前記物体面（１）の法線は検出方向を定義している、照明装置（１０）と
   を備え、
   − 前記光学結像システム（６）は、前記光学結像システム（６）が前記対物レンズの前記光軸（７）の周りに非対称に分布した検出角度範囲を検出して検出器（８）上に結像できるアパーチャを有しており、
   前記光学結像システム（６）の開口数は、前記中継システム（３）の開口数よりも大きいことを特徴とする、物体面内に配置された試料を結像する装置。
2. 前記物体面（１）及び前記中間画像面（４）は、前記中継システム（３）の前記光軸（５）との間にそれぞれ角度を含み、それらの値は、前記中継システム（３）の物体側検出アパーチャコーン（１２）の開口角又は中間画像側検出アパーチャコーン（１３）の開口角よりも小さく、
   前記物体面（１）及び前記中間画像面（４）は、それぞれ部分的に、前記物体側検出アパーチャコーン（１２）内又は前記中間画像側検出アパーチャコーン（１３）
   内に位置していることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
3. 前記非対称な検出角度スペクトル及び／又は圧縮された点広がり関数に基づく非対称な点広がり関数を考慮した画像処理のための、前記検出器（８）に接続された評価ユニット（９）を備える、請求項１又は２に記載の装置。
4. 第１光学媒質が前記光学中継システム（３）と前記中間画像面（４）との間に配置され、
   第２光学媒質が前記中間画像面（４）と前記光学結像システムとの間に配置され、
   前記中間画像面（４）は、第１光学媒質と第２光学媒質との間の境界表面内に位置しており、且つ、前記第２光学媒質は、前記第１光学媒質よりも大きな屈折率を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の装置。
5. 前記中継システム（３）は、該中継システム（３）の前記光軸（５）に対して垂直であるサブシステムの間の対称な面に関して対称的に構築されていることにより、前記中継システム（３）による前記結像は、１：１の画像スケールで実行され、且つ／又は、前記中継システム（３）は、反射屈折方式によって構築されていることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の装置。
6. 物体面（１）内に配置された試料（２）を結像する方法であって、
   − 前記試料はライトシート（１１）によって照明され、該ライトシート（１１）は本質的に前記物体面（１）内に位置すると共に照明方向を定義しており、また前記物体面（１）の法線は検出方向を定義しており、
   − 前記試料（２）のエリアは、光学中継システム（３）によって前記物体面（１）から中間画像面（４）内に結像され、前記物体面（１）及び前記中間画像面（４）は、前記中継システム（３）の光軸（５）との間に９０°とは異なる角度を含み、
   − 前記中間画像面（４）は、対物レンズを有する光学結像システム（６）によって歪まない状態で検出器（８）上に結像されてその場で画像として記録され、前記対物レンズの光軸は前記中間画像面（４）上において垂直に位置すると共に、前記対物レンズは前記中間画像面（４）上に合焦され、
   前記光学結像システム（６）は、前記光軸（７）の周りに非対称に分布した検出角度範囲の検出を可能にするアパーチャを有し、
   前記光学結像システム（６）の開口数は、前記中継システム（３）の開口数よりも大きく、
   − 前記記録された画像は、前記非対称な検出角度スペクトル及び／又は圧縮された点広がり関数に基づく非対称な点広がり関数を考慮しながら、前記検出器（８）に接続された評価ユニット内において処理される、物体面内に配置された試料を結像する方法。
7. 前記物体面（１）及び前記中間画像面（４）は、それぞれ部分的に、物体側検出アパーチャコーン（１２）内又は中間画像側検出アパーチャコーン（１３）内に位置することを特徴とする、請求項６に記載の方法。

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