JP2019518242A - 位相変調素子および像再構成部を用いるｓｃａｐｅ顕微鏡法 - Google Patents

Abstract

スキャニング素子は、光学コンポーネントの第１のセットを介して、斜角で試料に入射する、励起光のシートまたはビームの経路を決定する。試料における励起光の位置は、スキャニング素子の向きに応じて変化する。試料における蛍光体は、蛍光検出光を放射する。光学コンポーネントの第１のセットは、スキャニング素子へと戻る検出光の経路を決定し、スキャニング素子は、光学コンポーネントの第２のセットを介するカメラへの検出光の経路を決定する。光学コンポーネントの第２のセットは位相変調素子を含んでおり、この位相変調素子は、制御された収差をもたらし、それによってカメラにおいて測定された際の、焦平面、焦平面の上方および焦平面の下方の各点の点拡がり関数を均質化する。一部の実施形態においては、点拡がり関数のデコンボリューションを実施することによって収差を補正するために、カメラによって捕捉された像が処理される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、米国仮特許出願第６２／３４３，１１２号（２０１６年５月３０日出願）の利益を主張するものであり、これは参照によりその全体が本願に組み込まれる。

連邦政府資金による研究開発の記載
本発明は、ＮＩＨによって採択された５Ｕ０１ＮＳ０９４２９６−０１、１Ｒ０１ＮＳ０７６６２８、１Ｒ０１ＮＳ０６３２２６およびＲ２１ＮＳ０５３６８４、ＮＳＦによって採択されたＣＢＥＴ−０９５４７９６およびＩＧＥＲＴ０８０１５３０、ＤｏＤによって採択されたＭＵＲＩＷ９１１ＮＦ−１２−１−０５９４に基づいて、米国政府の支援を受けて成された。米国政府は、本発明について一定の権利を有している。

ＳＣＡＰＥ顕微鏡法は、掃引共焦点配置平面励起（ｓｗｅｐｔ ｃｏｎｆｏｃａｌｌｙ ａｌｉｇｎｅｄ ｐｌａｎａｒ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）を利用する高速３Ｄ顕微鏡法に関する技術である。ＳＣＡＰＥ撮像システムの一部の例は、刊行物ＷＯ２０１５／１０９３２３に開示されており、この刊行物は、参照によりその全体が本願に組み込まれる。ＳＣＡＰＥにおいては、斜めの光のシート（例えば、レーザ光）によって試料が掃引され、試料に由来する蛍光がカメラによって捕捉され、像が生成される。ＳＣＡＰＥは、光シート顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、および２光子顕微鏡法などの技術に匹敵する分解能を達成することができるが、より高速に動作することができる。

ＳＣＡＰＥシステムにおいては、励起経路が、光源から試料までの間の複数の光学コンポーネントを含んでおり、また検出経路が、試料からカメラまでの間の複数の光学コンポーネントを含んでいる。ＳＣＡＰＥ顕微鏡法の一部の実施形態は、像回転のために、相互に所定の角度で配置されている、検出アームにおける２つの対物レンズを使用している。しかしながら、この構成では、検出器において捕捉される光の純損失が生じることになり、これは撮像システムの開口数、分解能、および光スループットに悪影響を及ぼす可能性がある。

本発明の１つの態様は、近位端部および遠位端部を有している光学コンポーネントの第１のセットを含んでいる第１の装置に関し、この光学コンポーネントの第１のセットは、光学コンポーネントの第１のセットの遠位端部に配置されている対物レンズを含んでいる。この装置は、近位端部および遠位端部を有している光学コンポーネントの第２のセットも含んでおり、この光学コンポーネントの第２のセットは、位相変調素子を含んでいる。この装置は、光学コンポーネントの第１のセットの近位端部に関して近位側に配置されており、かつ光学コンポーネントの第２のセットの近位端部に関して近位側に配置されている、スキャニング素子も含んでいる。スキャニング素子は、このスキャニング素子に到達する励起光の経路を決定するように構成されており、それによって励起光は、近位から遠位の方向において光学コンポーネントの第１のセットを通過し、また対物レンズを超えて遠位側に位置決めされている試料に投影されることになる。励起光は、斜角で試料に投影され、また励起光は、スキャニング素子の向きに応じて変化する位置において試料に投影される。光学コンポーネントの第１のセットは、遠位から近位の方向においてスキャニング素子へと戻る、試料に由来する検出光の経路を決定するように構成されている。スキャニング素子は、検出光の経路を決定するようにも構成されており、それによって検出光は、近位から遠位の方向において光学コンポーネントの第２のセットを通過することになる。この装置は、光学コンポーネントの第２のセットを通過した検出光によって形成された像を捕捉するように、光学的に位置決めされているカメラも含んでいる。位相変調素子は、制御された収差をもたらし、それによってカメラにおいて測定された際の、焦平面、焦平面の上方および焦平面の下方の各点の点拡がり関数を均質化する。

第１の装置の一部の実施形態においては、位相変調素子には、位相板が含まれる。第１の装置の一部の実施形態においては、位相変調素子には、空間光変調器が含まれる。第１の装置の一部の実施形態においては、位相変調素子には、可変ミラーが含まれる。

第１の装置の一部の実施形態においては、対物レンズが、瞳面を有しており、また位相変調素子が、対物レンズの瞳面に共役である平面に位置決めされている。それらの実施形態の一部は、さらに、（ａ）位相変調素子に隣接して位置決めされており、かつ（ｂ）位相変調素子に関して近位側に位置決めされているアパーチャ絞りを含んでいる。

第１の装置の一部の実施形態においては、検出光が、光学コンポーネントの第２のセットの近位端部と遠位端部との間において、固定の共役像面を形成している。

第１の装置の一部の実施形態においては、光検出器アレイが、２Ｄイメージセンサを含んでおり、またカメラが、光学コンポーネントの第２のセットを通過した検出光によって形成された複数の像を連続的に捕捉し、複数の像の各々が、像データのフレームの各々に対応する。それらの実施形態においては、装置が、さらに、像データのフレームにおける収差を補正するようにプログラミングされているプロセッサを含んでいる。それらの実施形態の一部においては、プロセッサが、点拡がり関数のデコンボリューションを実施することによって、像データのフレームにおける収差を補正する。それらの実施形態の一部においては、点拡がり関数が、測定された点拡がり関数であるか、またはシミュレートされた点拡がり関数である。

第１の装置の一部の実施形態においては、光検出器アレイが、線形イメージセンサを含んでいる。それらの実施形態の一部においては、スキャニング素子が、Ｘ−Ｙガルバノメータを含んでいる。それらの実施形態の一部においては、励起光が、試料における蛍光の励起が複数の光子のほぼ同時の吸収を要求する波長を有している。

第１の装置の一部の実施形態は、さらに、光学コンポーネントの第２のセットの近位端部とスキャニング素子との間に配置されているビームスプリッタと、励起光の光源と、を含んでいる。それらの実施形態においては、励起光がビームスプリッタへと方向付けられるように、励起光の光源の照準が定められており、ビームスプリッタが、スキャニング素子へと向かう励起光の経路を決定するように構成されており、またビームスプリッタが、スキャニング素子から到達する検出光の、光学コンポーネントの第２のセットの近位端部への経路を決定するように構成されている。

第１の装置の一部の実施形態においては、励起光には、励起光のシートが含まれる。励起光のシートを、（ａ）光源に由来する光を励起光のシートに展開するように構成されているシリンドリカルレンズ、（ｂ）光源に由来する光を励起光のシートに展開するように構成されている非球面ミラー、（ｃ）光源に由来する光を励起光のシートに展開するように構成されている空間光変調器、（ｄ）光源に由来する光を励起光のシートに展開するように構成されている第２のスキャニング素子、および（ｅ）光源に由来する光を励起光のシートに展開するように構成されている振動ガルバノメータミラー、のうちの少なくとも１つによって生成することができる。

第１の装置の一部の実施形態は、さらに、光学コンポーネントの第２のセットの近位端部とスキャニング素子との間に配置されているビームスプリッタと、励起光の光源と、を含んでいる。それらの実施形態においては、励起光がビームスプリッタへと方向付けられるように、励起光の光源の照準が定められており、ビームスプリッタが、スキャニング素子へと向かう励起光の経路を決定するように構成されており、ビームスプリッタが、スキャニング素子から到達する検出光の、光学コンポーネントの第２のセットの近位端部への経路を決定するように構成されており、光検出器アレイが、２Ｄイメージセンサを含んでおり、励起光には、励起光のシートが含まれ、カメラが、光学コンポーネントの第２のセットを通過した検出光によって形成された複数の像を連続的に捕捉し、複数の像の各々が、像データのフレームの各々に対応し、また装置が、さらに、像データのフレームにおける収差を補正するようにプログラミングされているプロセッサを含んでいる。それらの実施形態の一部においては、プロセッサが、点拡がり関数のデコンボリューションを実施することによって、像データのフレームにおける収差を補正する。それらの実施形態の一部においては、対物レンズが、瞳面を有しており、また位相変調素子が、対物レンズの瞳面に共役である平面に位置決めされている。それらの実施形態の一部においては、位相変調素子が、
θ（ｘ，ｙ）＝２πα（ｘ^３＋ｙ^３）
の位相プロファイルを有しており、ただし、ｘおよびｙは、正規化された瞳座標であり、αは、｜Ψ／２｜に設定される調整パラメータであり、ただし
Ψ（ｕ_２，ｖ_２；ｄｚ）＝−（１／２λ）×ＮＡ^２×（ｕ_２ ^２＋ｖ_２ ^２）×ｄｚ／ｎ
であり、ただし、λは、位相変調素子を通過する光の波長であり、ＮＡは、対物レンズの開口数であり、ｕおよびｖは、正規化された瞳座標であり、ｎは、対物レンズの下に位置する浸漬媒体の屈折率であり、ｄｚは、結像されるべき深度の範囲の１／２である。

第１の装置の一部の実施形態においては、位相変調素子が、
θ（ｘ，ｙ）＝２πα（ｘ^３＋ｙ^３）
の位相プロファイルを有しており、ただし、ｘおよびｙは、正規化された瞳座標であり、αは、｜Ψ／２｜に設定される調整パラメータであり、ただし
Ψ（ｕ_２，ｖ_２；ｄｚ）＝−（１／２λ）×ＮＡ^２×（ｕ_２ ^２＋ｖ_２ ^２）×ｄｚ／ｎ
であり、ただし、λは、位相変調素子を通過する光の波長であり、ＮＡは、対物レンズの開口数であり、ｕおよびｖは、正規化された瞳座標であり、ｎは、対物レンズの下に位置する浸漬媒体の屈折率であり、ｄｚは、結像されるべき深度の範囲の１／２である。

本発明の別の態様は、対物レンズと、その対物レンズに由来する光を受け取るように構成されている検出経路に配置されている複数の光学素子と、含んでいる第２の装置に関する。検出経路に配置されている複数の光学素子には、スキャニング素子が含まれる。スキャニング素子は、（ａ）対物レンズの前側焦平面にわたる掃引励起ビームを生成するように対物レンズへの励起光の経路を決定する、かつそれと同時に（ｂ）共役像を形成するために検出経路に沿って対物レンズを介して戻ってくる像光の経路を決定する、ように構成されている。装置は、さらに、共役像の像を捕捉するように位置決めされている光検出器アレイと、スキャニング素子と光検出器アレイとの間の検出経路に配置されている位相変調素子と、を含んでいる。位相変調素子は、検出経路における被写界深度を拡大する。

第２の装置の一部の実施形態においては、位相変調素子が、制御された収差をもたらすことによって被写界深度を拡大し、それによって光検出器アレイにおいて測定された際の、焦平面、焦平面の上方および焦平面の下方の各点の点拡がり関数を均質化する。

第２の装置の一部の実施形態においては、収差が、画像処理アルゴリズムによって補正される。第２の装置の一部の実施の形態においては、収差が、測定された点拡がり関数またはシミュレートされた点拡がり関数のデコンボリューションによって補正される。第２の装置の一部の実施形態においては、光検出器アレイが、２Ｄイメージセンサを含んでいる。第２の装置の一部の実施形態においては、光検出器アレイが、線形イメージセンサを含んでいる。

本発明の別の態様は、光源と、光源に由来する光を光のシートに展開するシリンドリカルレンズまたはスキャナと、光のシートの経路に配置されているビームスプリッタと、光のシートの経路に配置されているスキャニング素子と、近位端部および遠位端部を有しており、かつその遠位端部に配置されている対物レンズを備えている第１のテレスコープと、近位端部および遠位端部、ならびに光軸を有している、第２のテレスコープと、を含んでいる、第３の装置に関する。ビームスプリッタは、スキャニング素子へと向かう光のシートの経路を決定する。スキャニング素子は、第１のテレスコープの近位端部への光のシートの経路を決定する。第１のテレスコープは、対物レンズを介する近位から遠位の方向への光のシートの経路を決定し、対物レンズを通過した蛍光を受け取り、かつ遠位から近位の方向においてスキャニング素子へと戻る蛍光の経路を決定する。スキャニング素子は、ビームスプリッタを通過する、第２のテレスコープの近位端部への蛍光の経路を決定する。第２のテレスコープは、蛍光に由来する像を、共役像面において形成する。この装置は、さらに、第２のテレスコープと同一の光軸に位置決めされており、かつ共役像面のぼけが生じた像を捕捉するように構成されているカメラと、第２のテレスコープとカメラとの間に配置されている位相変調素子と、カメラによって捕捉された像のぼけを修正するようにプログラミングされているイメージプロセッサと、を含んでいる。

第３の装置の一部の実施形態においては、光源には、レーザが含まれる。第３の装置の一部の実施形態においては、位相変調素子には、位相板が含まれる。第３の装置の一部の実施形態においては、位相変調素子には、空間光変調器および可変ミラーのうちの少なくとも１つが含まれる。第３の装置の一部の実施形態においては、イメージプロセッサが、デコンボリューションアルゴリズムを使用して、像のぼけを修正するようにプログラミングされている。

本発明の別の態様は、試料を撮像するための第１の方法に関する。この方法は、励起光のシートを試料に投影するステップを含み、この場合、励起光のシートは、斜角で試料に投影され、また励起光のシートは、スキャニング素子の向きに応じて変化する位置において、試料に投影される。この方法は、また、スキャニング素子へと戻る、試料から到達する検出光の経路を決定するステップと、スキャニング素子を使用して、制御された収差をもたらす光学系への検出光の経路を再度決定し、カメラにおいて測定された際の、焦平面、焦平面の上方および焦平面の下方の各点の点拡がり関数を均質化するステップと、を含んでいる。この方法は、また、収差の生じた検出光を使用して、それぞれがスキャニング素子の異なる向きに対応する複数の時点において複数の像を形成するステップと、複数の像を捕捉するステップと、を含んでいる。

第１の方法の一部の実施形態は、さらに、複数の像における収差を補正するステップを含んでいる。

第１の方法の一部の実施形態においては、補正ステップが、点拡がり関数のデコンボリューションを実施することを含んでいる。第１の方法の一部の実施形態においては、点拡がり関数が、測定された点拡がり関数であるか、またはシミュレートされた点拡がり関数である。

第１の方法の一部の実施形態においては、収差が、
θ（ｘ，ｙ）＝２πα（ｘ^３＋ｙ^３）
の位相プロファイルを有している位相変調素子によってもたらされる。
ただし、ｘおよびｙは、正規化された瞳座標であり、αは、｜Ψ／２｜に設定される調整パラメータであり、ただし
Ψ（ｕ_２，ｖ_２；ｄｚ）＝−（１／２λ）×ＮＡ^２×（ｕ_２ ^２＋ｖ_２ ^２）×ｄｚ／ｎ
であり、ただし、λは、位相変調素子を通過する光の波長であり、ＮＡは、対物レンズの開口数であり、ｕおよびｖは、正規化された瞳座標であり、ｎは、対物レンズの下に位置する浸漬媒体の屈折率であり、ｄｚは、結像されるべき深度の範囲の１／２である。

位相変調素子を使用するＳＣＡＰＥ顕微鏡の１つの実施形態を示す。 シートのいずれの位置も同時に照明される光のシートを形成するための設計を示す。 仮想的な光のシートを形成するために、光のペンシルビームで高速なスキャニングを行うための設計を示す。 位相関数を示す。 相応の放射点拡がり関数を示す。 ＳＣＡＰＥ顕微鏡法において使用される斜めの光のシートのセクショニング効果を示す。 ＳＣＡＰＥ顕微鏡法において使用される斜めの光のシートのセクショニング効果を示す。 反射性の位相変調素子を使用するＳＣＡＰＥ顕微鏡の１つの実施形態を示す。 位相変調素子、２自由度を有しているスキャニング素子、および線形センサを使用するＳＣＡＰＥ顕微鏡の１つの実施形態を示す。

以下では、複数の実施形態を添付の図面を参照しながら詳細に説明する。各図において、同様の参照番号は、同様の構成要素を表している。

本願は、像回転のために相互に所定の角度で配置されている、検出アームにおける２つの対物レンズを使用するＳＣＡＰＥの実施形態に関連する問題の大部分を回避する、ＳＣＡＰＥ顕微鏡法を実現するための代替的なアプローチを開示する。この代替的なアプローチは、検出アームの実効被写界深度を拡大するための位相変調素子を基礎としている。

図１には、位相変調素子（ＰＭＥ）１７０を使用する、ＳＣＡＰＥ顕微鏡の第１の実施形態が示されている。しかしながら、この実施形態において使用することができる位相変調素子の例には、（例えば、キューブ型、対数型等の）位相板および空間光変調器（ＳＬＭ）が含まれる。ただし、位相変調素子の例は、これらに限定されるものではない。

関心対象の蛍光体の励起スペクトル内にある波長を有している、光源（例えば、レーザ１００またはＬＥＤ）に由来する光のビームが、シート形成光学系１１０を通過する。シート形成光学系１１０は、ビームを光のシートに変換し、また試料において蛍光を励起することになる光の幾何学的な特性を決定する。

一部の実施形態においては、シート形成光学系１１０が、光源１００からの光を、実際の光のシート（すなわち、光のシートのいずれの位置も同時に照明されるシート）に成形する。これを達成するための１つのアプローチが、図２Ａに示されている。光源（例えば、レーザ１００またはＬＥＤ）は、光（例えば、単色光、コヒーレント光、偏光；またはインコヒーレント光）を放射し、その光は、光源の輪郭を一様に拡大する等方性のビームエキスパンダ２０１、２０２を通過するように方向付けられる。その等方性のビームエキスパンダから、光は、真円状の形状から楕円状の形状にビームを拡大する、異方性のビームエキスパンダを通過する。この異方性のビームエキスパンダを、例えばシリンドリカルレンズ２１１、２１２のペア、および／または整合プリズムのペア、および／またはスリット付きアパーチャ等を使用して、実現することができる。

続いて光は、スライドミラー２２０において反射され、また展開された寸法方向に沿って、第３のシリンドリカルレンズ２３０によって焦点合わせされ、続いて、展開されていない寸法方向に沿って、スリット状アパーチャ２４０によって制限される。このアパーチャ２４０のスリット幅は、（図１において参照番号１４０で示されている）対物レンズ下でのシートの厚さ、さらには顕微鏡の被写界深度を制御するために使用される。本明細書において使用されているように、「対物レンズ」という用語は、その一般的な意味において使用されており、試料１４５の手前に位置している最後の光学コンポーネントを表していることを言及しておく。対物レンズは、例えば、単純なレンズ素子、顕微鏡式の対物レンズ等であってよい。オプションとして、スライドミラー２２０、第３のシリンドリカルレンズ２３０およびアパーチャスリット２４０のすべてを相互に機械的に連結させて、１つのマウント２５０を形成することができる。このマウント２５０は、単一のユニットとして左右に並進移動することができ、またそれによって調整を行うことができる。この調整を、モータ駆動式にまたは手動で行うことができ、また同等の作用を有している種々の調整手段も当業者には明らかであろう。シートのいずれの位置も同時に照明される光のシートを生成するための広範な代替的なアプローチも、当業者には容易に分かるであろう。

代替的な実施形態においては、シート形成光学系１１０が、光のペンシルビームで高速なスキャニングを行うことによって、光源１００に由来する光を成形し、それによって仮想の光のシートが生成される。それらの実施形態においては、シートにおける異なる位置における照明が、異なる時点に行われる。これらの実施形態は、対物レンズを超えて斜めの線を生成し、続いて、この斜めの線で、横方向の視野にわたり前後にスキャニングを行うことによって仮想のシートが形成される。

図２Ｂには、この仮想のシートを実現するための１つのアプローチの実施形態が示されている。光源（例えば、レーザ１００）は、光（例えば、単色光、コヒーレント光、偏光）を放射し、その光は、光源の輪郭を一様に拡大する等方性のビームエキスパンダ２０１、２０２を通過するように方向付けられる。等方性に展開されたビームは、続いて、ガルバノメータミラー２６０に方向付けられ、このガルバノメータミラー２６０は、光を偏向させ、その光でシートのスキャニングを行う。続けて、光のシートは、リレーテレスコープ２７１、２７２およびアパーチャスリット２８０を通過するように方向付けられる。この実施形態におけるリレーテレスコープ２７１、２７２の機能は、必要に応じてさらなる拡大を提供することであり、またガルバノメータミラー２６０を、（図１において参照番号１４０で示されている）対物レンズの後焦点面に共役である平面に結像させる。またアパーチャスリット２８０の機能は、上記において説明した図２Ａの実施形態に類似するものである。オプションとして、ガルバノメータミラー２６０、リレーテレスコープ２７１、２７２およびアパーチャスリット２８０のすべてを相互に機械的に連結させて、１つのマウント２５０を形成することができる。このマウント２５０は、単一のユニットとして左右に並進移動することができ、またそれによって図２Ａの実施形態と同様の調整を行うことができる。仮想の光のシートを生成するためにスキャニングを使用する広範な代替的なアプローチも、当業者には容易に分かるであろう。

再び図１を参照する。シート形成光学系１１０を離れた光は、ダイクロイックビームスプリッタ１２０に入射し、このダイクロイックビームスプリッタ１２０は、蛍光を励起させるために使用されるより短い波長の光を、蛍光分子によって放出されたより長い波長の光から分離させる。この実施形態においては、蛍光がダイクロイックビームスプリッタを介して伝播する長距離経路の構成で顕微鏡が組み立てられているので、ダイクロイックビームスプリッタ１２０が選択されている。ダイクロイックビームスプリッタ１２０は、より短い波長の励起光をスキャニング素子１２５に向けて反射する。

代替的な実施形態（例えば、２光子を使用する実施形態、この場合、励起光は蛍光よりも長い波長を有している）においては、ダイクロイックビームスプリッタ１２０が、より長い波長を反射し、より短い波長を通過させるように構成されることが望ましい。一部の代替的な実施形態においては、顕微鏡が短距離経路の構成で組み立てられている場合に、短距離型のダイクロイックビームスプリッタを使用することも可能である。この場合、試料に由来する、収集された蛍光は、ダイクロイックビームスプリッタ１２０において反射されることになる。

図１の実施形態においては、スキャニング素子１２５を、１自由度を有している平面スキャニングミラーを使用して実現することができる。しかしながら、代替的な実施形態においては、非平面スキャニングミラー、可動プリズム等も含めて、スキャニングを実現するための広範な代替的なアプローチを使用することができる。ただし、代替的なアプローチは、上記の例に限定されるものではない。ダイクロイックビームスプリッタ１２０からスキャニング素子１２５に到達する励起光は、スキャニングを行うためにスキャニング素子１２５によって反射され、その後、光学コンポーネント（例えば、スキャンチューブレンズテレスコープ１３１、１３２および対物レンズ１４０）の第１のセットに向かって伝播し続ける。光学コンポーネントの第１のセットは、近位端部および遠位端部を有しており、またスキャニング素子１２５は、励起光が近位から遠位の方向において光学コンポーネント１３１〜１４０の第１のセットを通過することになるように、励起光の経路を決定する。

対物レンズ１４０は、光学コンポーネントの第１のセットの遠位端部に配置されている。光学コンポーネント１３１〜１４０の第１のセットを通過した後に、励起光は、対物レンズ１４０を超えて遠位側に位置決めされている試料１４５に投影されることになる。励起光は、斜角で試料１４５に投影され、また試料１４５における励起光の位置は、スキャニング素子１２５の向きに応じて変化する。

一部の実施形態においては、励起光が、対物レンズ１４０の背面アパーチャにオフアクシス（ｏｆｆ−ａｘｉｓ）で、すなわち軸外で到達する。Ｂｏｕｃｈａｒｄ等によって（２０１５年に）既に説明されているように、これによって、試料１４５にわたる斜めの光のシート１４２が生成される。それらの実施形態においては、（図２Ａおよび図２Ｂにおいて参照番号２５０で示されている）調整可能なスライドマウントが使用され、また調整可能なスライドマウントの位置によって、試料１４５にわたる斜めの光のシートの角度が決定される。種々異なる対物レンズ１４０の種々の背面アパーチャサイズを適合させるために、調整可能なスライドマウント２５０の位置を調整することも可能である。

斜めの光のシート１４２によって、試料１４５において蛍光が励起されることになる。この試料から収集された蛍光は、同一の対物レンズ１４０によって収集される。対物レンズ１４０および光学コンポーネントの第１のセットのうちの残りの光学コンポーネント１３１、１３２は、遠位から近位の方向においてスキャニング素子１２５へと戻る、試料に由来する検出光の経路を決定する。検出光の共役像は、コンポーネント１３１とコンポーネント１３２との間に形成される。この共役像面の位置は、レーザ光による試料１４５の掃引に並行して変化する。

スキャニング素子１２５に到達した検出光は、スキャニング素子１２５によって経路が再度決定され、それによって検出光は、近位から遠位の方向において、光学コンポーネント１４９〜１７０の第２のセットを通過することになる。図示した実施形態においては、光学コンポーネントの第２のセットが、オプションとしての吸収フィルタ１４９、またそれに続く、テレスコープ１５１、１５５、アパーチャ絞り１６０、およびＰＭＥ１７０を含んでいる。図１における実施形態では、検出光が、光学コンポーネントの第２のセットの最も近位の素子（すなわち、レンズ１５１）に入射する前に、ダイクロイックビームスプリッタ１２０を通過することになることを言及しておく。共役像面は、レンズ１５１とレンズ１５５との間に存在している。特に、スキャニング素子１２５は、到来する検出光のデスキャニングを行う。励起光によって対象物空間における試料１４５の種々異なる区間がスキャニングされるにもかかわらず、デスキャニングが行われることによって、この共役像面は固定されたままである。

共役像面に由来する光は、その後、テレスコープの遠位側のレンズ１５５を介してＰＭＥ１７０へと伝播し続ける。位相変調素子は、ダイクロイックビームスプリッタ１２０に対して遠位の位置で、検出光路に位置決めされている。一部の有利な実施形態においては、ＰＭＥ１７０が、対物レンズ１４０の瞳面に共役に位置決めされている。

従来の顕微鏡においては、カメラの焦点が一次レンズの焦平面に合わせられている場合には、試料の非常にシャープな像が形成される。つまり、この平面における分解能は、その平面の上方および下方の平面の分解能よりも高く、またシステムの点拡がり関数によって特徴付けられている。ＰＭＥ１７０の役割は、制御された収差をシステムにもたらすことであり、それによって、カメラ１９０において測定された際の、焦平面、焦平面の上方および焦平面の下方の各点（すなわち、Ｚ軸に沿った異なる位置）の点拡がり関数が均質化される。この収差は、焦平面における顕微鏡の点拡がり関数を劣化させるが、しかしながらその劣化した点拡がり関数を、広範な深度にわたり保持する。これによって顕微鏡を、事実上、複数の平面（すなわち複数の深度）において、（たとえ低減されていたとしても）同一の面内分解能（ｉｎ−ｐｌａｎｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）でもって結像させることができる。したがって、ＰＭＥ１７０の導入は、システムの分解能を改善し、またシステムの被写界深度を拡大する。一般的な技術は、他の分野において、波面コード化（ｗａｖｅ−ｆｒｏｎｔ ｅｎｃｏｄｉｎｇ）として公知である。しかしながら、ここでは、この技術は共役の斜めの像面を回転させないために使用される。

一部の有利な実施形態においては、ＰＭＥがキューブ型の位相板である。それらの実施形態においては、キューブ型の位相板の位相プロファイルを次式によって表すことができる：
θ（ｘ，ｙ）＝２πα（ｘ^３＋ｙ^３）
ただし、ｘおよびｙは、正規化された瞳座標であり、αは、一般的に｜Ψ／２｜に設定される調整パラメータであり、ただし、
Ψ（ｕ_２，ｖ_２；ｄｚ）＝−（１／２λ）×ＮＡ^２×（ｕ_２ ^２＋ｖ_２ ^２）×ｄｚ／ｎ
であり、ただし、λは、位相板を通過する光の波長であり、ＮＡは、対物レンズ１４０の開口数であり、ｕおよびｖは、正規化された瞳座標であり、ｎは、対物レンズの下に位置する浸漬媒体の屈折率であり、ｄｚは、焦点深度（すなわち、結像されるべき深度の範囲）の１／２である。位相板の特性に関するさらなる情報は、Ｓ．Ｑｕｉｒｉｎ等の「Ｉｎｓｔａｎｔａｎｅｏｕｓ Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｓｅｎｓｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｓｐａｔｉａｌ Ｌｉｇｈｔ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｅｐｔｈ ｏｆ Ｆｉｅｌｄ Ｉｍａｇｉｎｇ」、Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ ２１、１６００７−１６０２１（２０１３）から得ることができる。

キューブ型の位相板の位相関数を、一連のゼルニケ多項式の和として、次式のように表すこともできる：
φ（ｘ，ｙ）＝（πα／２）（２Ｚ_２＋２Ｚ_３＋Ｚ_７＋Ｚ_８＋Ｚ_１０−Ｚ_１１）

１つの例においては、キューブ型の位相板の数学的表現は、ＦＲＥＤ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して作成されており、また２つの薄いレンズ間のものとしてシミュレートされた。それらのレンズのうちの一方の焦平面におけるオンアクシス（ｏｎ−ａｘｉｓ）の、すなわち軸内の点の放射拡がり関数が求められた。３６のα値を用いて計算された位相関数およびその相応の放射点拡がり関数が、図３Ａおよび図３Ｂにそれぞれ示されている。

位相板は、一般的に、厳密な公差（＋／−０．０２λ）で製造されており、また特定の波長範囲にわたり使用されることが意図されている。一部の実施形態においては、この波長範囲は、試料において励起されるものであればどのようなものであってもよい蛍光指示薬の放射スペクトルに相当するものであってよい。それらの波長に関する典型的な範囲は、５００ｎｍ〜７００ｎｍである。一部の実施形態においては、試料１４５において励起される蛍光体の波長に応じて、複数の異なる位相板のうちの１つに交換されるように、システムを構成することができる。

Ｓ． Ｑｕｉｒｉｎ等の「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｎｅｕｒａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｔｈｒｅｅ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ」、Ｆｒｏｎｔ．Ｎｅｕｒａｌ Ｃｉｒｃｕｉｔｓ ８、２９（２０１４）において説明されているように、位相板の実際の高さを、次式を使用して計算することができる：
ｈ（ｘ，ｙ）＝｛（θ（ｘ，ｙ）×π）／２｝｛λ／（ｎ−１）｝
ここで、ｈは、位相板の高さであり、ｎは、位相板を形成している材料の屈折率である。

より密な波長範囲に特化させて位相板を設計することによって、設計波長からの偏差に由来する色収差も低減される。位相板に続くレンズの後方にイメージスプリッタを配置することによって、慣例のやり方で、多色撮像を実施することができる。代替的に、位相プレートの手前において、放射された蛍光のスペクトル分離を実施することも可能である。位相板を標準的なイメージスプリッタに組み込むことによって、各位相板を、より狭いスペクトル範囲に合わせて設計することができる。

代替的な実施形態においては、代替的な方程式を位相板において実現することができる、かつ／または異なるクラスの位相板（例えば対数型の位相板）を、上記において説明したキューブ型の位相板の代わりに使用することができる。一部の実施形態においては、所望の位相プロファイルを、ガラスのような基板に（例えば、リソグラフィを使用して）エッチングすることができる。

一部の実施形態においては、異なるタイプの位相変調素子１７０を、上記において説明した位相板の代わりに使用することができる。そのような代替的な位相変調素子の例には、空間光変調器および可変ミラーが含まれる。それらの代替的な位相変調素子の一部は、プログラミング可能である（例えば、ＳＬＭである）ことを言及しておく。それらのケースにおいては、上記において説明した位相プロファイルのうちのいずれかを、プログラミング可能な位相変調素子に与えることができる。

オプションとして、環状のアパーチャ（アパーチャ絞り１６０）を、ＰＭＥ１７０の前（すなわち、ＰＭＥの近位側）に配置して、顕微鏡の検出側光学系の開口数を調節することができる。オプションとして、長距離経路吸収フィルタ１４９を、光学コンポーネントの第２のセット内の任意の適切な場所（例えば、図１に示したようにダイクロイックビームスプリッタ１２０とレンズ１５１との間、またはレンズ１５５とカメラ１９０との間）に位置決めすることができる。

位相変調素子１７０（例えば、位相板）によって変調された後に、カメラ１９０を使用して光を捕捉することができる。カメラは、光学コンポーネントの第２のセットを通過した検出光によって形成された像を捕捉するように、光学的に位置決めされている。その最も簡潔な形態においては、カメラ１９０が、像光を２Ｄカメラセンサ１９５に収束させる単一のレンズ１９２である。代替的な実施形態においては、システムに可変の倍率を提供するために、図示されている単一のレンズ１９２を、より複雑なズームレンズモジュールに交換することができる。オプションとして、改善されたＳＮＲおよびスペクトル分離それぞれのために、イメージインテンシファイアおよびイメージスプリッタを追加することもできる。

カメラ１９０のセンサ１９５は、異なる時点において試料１４５における平面から発せられた蛍光の２Ｄ像をそれぞれが表している、複数のフレームを捕捉する。

レンズ１５１とレンズ１５５との間に生じる共役像面は、その像がカメラ１９０のセンサ１９５に到達した際に、光学コンポーネントの第２のセットの軸方向の軸線に直交していないので、センサ１９５によって捕捉される像の大部分にはぼけが生じることになる（すなわち、焦点が外れている）。ＰＭＥ１７０は、検出経路における被写界深度を拡大することによって、このぼけが生じた状態を大幅に緩和する。

このぼけが生じた状態を、カメラのセンサ１９５によって捕捉された２Ｄ像を処理することによって、飛躍的に改善することができる。より詳細には、カメラのセンサ１９５によって捕捉された各像が、メモリ（例えば、ＲＡＭ、ハードディスクドライブ、またはＳＳＤ）に記憶され、それらの像を適切にプログラミングされているプロセッサ１９９によって処理することによって、各像における収差を補正することができる。一部の実施形態においては、この処理は、測定された点拡がり関数のデコンボリューションを実施することによって、収差を補正する。別の実施形態においては、この処理は、シミュレートされた点拡がり関数のデコンボリューションを実施することによって、収差を補正する。収差の補正に関する代替的なアプローチを使用することもできる。収差が補正された像は、続いてメモリに記憶される。

カメラのセンサ１９５によって捕捉された各２Ｄ像を処理するための１つの適切なアプローチは以下の通りである：最初に、キューブ型の位相板を備えたシステムの横断方向の点拡がり関数（Ｘ−Ｙ）は、深度に依存することを言及しておく。一部の実施形態においては、各深度において経験的に求められた横断方向の点拡がり関数をルックアップテーブルに記憶し、ウィナーフィルタまたは反復デコンボリューションのいずれかによるデコンボリューションを実施することによって、像回転を実施することができる。デコンボリューションを実現するために広範な技術のうちのいずれかを使用することができ、それらの技術には、線形自己回帰フィルタ、ＡＲＭＡフィルタおよびウィナーフィルタ、ルーシー・リチャードソンデコンボリューション、ベイズ最尤期待値最大化法の解、ランドウェーバーデコンボリューション、ウェーブレットを基礎とするデコンボリューション、および最大エントロピを基礎とするデコンボリューションが含まれる。ただし、技術の例は、これらに限定されるものではない。参照によりそれぞれ本願に組み込まれる、以下に挙げる３つの刊行物に開示されているアプローチも使用することができる：Ｓ．Ｑｕｉｒｉｎ等「Ｃａｌｃｉｕｍ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｗｉｔｈ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｄｅｐｔｈ−ｏｆ−ｆｉｅｌｄ Ｌｉｇｈｔｓｈｅｅｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」、Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．４１、８５５（２０１６）；４．Ｄ．Ｃ．Ａｎｄｒｅｏ等「Ｍａｓｔｅｒ ｉｎ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｆａｓｔ Ｉｍａｇｅ Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｌｉｇｈｔ−Ｓｈｅｅｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｗｉｔｈ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｅｐｔｈ ｏｆ Ｆｉｅｌｄ Ｕｓｉｎｇ ＧＰＵｓ」（２０１５）；Ｏ．Ｏｌａｒｔｅ等「Ｄｅｃｏｕｐｌｅｄ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｌｉｇｈｔ Ｓｈｅｅｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｆｏｒ Ｆａｓｔ Ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ」、Ｏｐｔｉｃａ２、７０２−７０５（２０１５）。

図４Ａおよび図４Ｂには、ＳＣＡＰＥ顕微鏡法において使用される斜めの光のシート１４２のセクショニング効果が示されている。光のシート１４２によって、試料１４５においてはＸ方向に沿って前後にスキャンが行われ、またカメラは、Ｙ−Ｚ’の次元におけるシートの像を捕捉する。ＳＣＡＰＥにおけるシートは、ＳＰＩＭ光シートシステムにおける光シートがＺ次元におけるセクショニングを提供するやり方と同様のやり方で、Ｘ次元に沿ったセクショニングを提供する。横断方向（Ｘ−Ｙ）の点拡がり関数のＸ次元に沿った二次ローブが、Ｚ’軸に投影される。横断方向のプロファイルは深度の範囲わたり僅かに変化するので、カメラフレームによって取得された像は、空間的に変化するＰＳＦを有することになる。しかしながら、ＰＭＥの設計に依存して、像の一部または全体にわたり均一性を推定することができる。完全な均一性を推定した場合には、単一の点拡がり関数を、Ｙ−Ｚ’像の中心において取得／計算することができ、また収差の生じた像を、非ブラインドデコンボリューション技術によって復元することができる。

点拡がり関数が深度（Ｚ’）の範囲にわたり飛躍的に変化する場合には、各深度において点拡がり関数を取得／計算することができ、また空間的に変化するカーネルを用いるより複雑なデコンボリューション技術が使用されることになる。点拡がり関数における変化を処理するための適切な技術の例は、Ｌａｕｅｒ、Ｔｏｄ「Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ Ｓｐａｔｉａｌｌｙ−Ｖａｒｉａｎｔ ＰＳＦ」、Ａｓｔｒｏｎｏｍｉｃａｌ Ｔｅｌｅｓｃｏｐｅｓ ａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｏｐｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ（２００２）から得ることができ、この文献は参照により本願に組み込まれる。当業者には明らかであろう代替的な技術を使用することもできる。

キューブ型の位相板において観測される二次シフトは、より高次の逆対象位相マスクの特性であることを言及しておく。回転対称性の位相マスク、例えば動径４次関数および対数関数は、像アーチファクトをもたらすことはないが、しかしながら、Ｍ．Ｄｅｍｅｎｉｋｏｖ等「Ｉｍａｇｅ Ａｒｔｉｆａｃｔｓ ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ａ Ｃｕｂｉｃ Ｐｈａｓｅ Ｍａｓｋ」、Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ １８、８２０７−８２１２（２０１０）において説明されているように、コントラストと被写界深度との間のより顕著なトレードオフに直面する。それにもかかわらず、ＳＣＡＰＥにおいてそのような位相マスクを実現することによって、類似のプロセスに従うことができ、また像復元のために非ブラインドデコンボリューション技術も使用される。

再び図１を参照する。スキャニング素子１２５の任意の所定の位置に関して、励起光のシート１４２が、相応の位置において試料１４５に投影され、また試料１４５における照明された平面１４２に由来する蛍光の２Ｄ像が、カメラのセンサ１９５によって捕捉される。より詳細には、照明された平面１４２に由来する蛍光が、レンズ１３１とレンズ１３２との間の共役像面に結像され、スキャニング素子１２５によってデスキャニングされ、ダイクロイックビームスプリッタ１２０を通過して、レンズ１５１とレンズ１５５との間の固定の共役像面に結像される。この共役像面は、スキャニング素子１２５によって実施されるデスキャニングに起因して固定である。続いて、この共役像には、上記において説明したように、ＰＭＥ１７０によって収差がもたらされて、カメラ１９０のセンサ１９５に結像される。

各フレームは、続いて、メモリに順次読み込まれ、またプロセッサ１９９によって、経験的に求められたシステム点拡がり関数を用いて、デコンボリューションされ、それによって、斜めの区間の再構成された（すなわち、ぼけが修正された）像が取得される。上記において説明したように、スキャニング素子１２５の移動によって、励起光のシート１４２は、試料における異なる場所に移動する。その結果、２Ｄ像がスキャニング素子１２５の複数の位置の各々の位置に応じて捕捉され、またそれらの像の各々が、上記において説明したように再構成される／ぼけ修正される場合、その結果は、ぼけが修正された２Ｄフレームのスタックであり、これを、試料１４５におけるターゲットボリュームを表す３Ｄボリュームに組み立てることができる。

オプションとして、それらの複数の３Ｄボリュームを、複数の異なる時点（例えば１／１０秒毎）に捕捉して、結像されているボリューム（すなわち試料におけるボリューム）の時間にわたる変化を表すことができる。

図５には、透過性の位相変調素子（すなわち、図１の実施形態におけるＰＭＥ１７０の）の代わりに反射性の位相変調素子３７０が使用されている点を除き、図１の実施形態に類似する代替的な実施形態が示されている。それらの実施形態において使用することができる反射性の位相変調素子３７０の例には、反射性の空間光変調器（ＳＬＭ）および可変ミラー（ＤＭ）が含まれ、それらはそれぞれ、検出された蛍光の位相プロファイルを変調するために使用される。それらの実施形態においては、反射性の位相変調素子３７０が、有利には、一次対物レンズ１４０の瞳面に共役である平面に位置決めされている。他の点に関して、この図５の実施形態は、上記において説明した図１の実施形態と同様に動作する。

図６には、図１の実施形態と多くの類似点を有しているが、しかしながら顕著な相異点も多数有している、別の代替的な実施形態が示されている。より詳細には、図６の実施形態は、２自由度を有しているスキャニング素子６２５（例えば、Ｘ−Ｙガルバノメータスキャナ）を使用して、ペンシル形状のビームによって、試料をスキャニングする。さらに、図６の実施形態は、図１の実施形態と関連させて上記において説明した２Ｄセンサの代わりに、線形センサ６９５（すなわち、１次元センサ）を使用する。

図６の実施形態は、光（例えば、単色光、コヒーレント光、偏光）を放射する光源（例えば、レーザ１００）を含んでおり、またその光を、ビーム成形光学系６１０を通過するように方向付け、それによってペンシル形状のビームの特性が改善される。一部の実施形態においては、ビーム成形光学系６１０が、光源の輪郭を一様に拡大するために、等方性のビームエキスパンダと、そのビームエキスパンダの後段に設けられている、ビームの周縁部を制限する環状のアパーチャと、を含んでいる。このアパーチャの大きさを、対物レンズ１４０下におけるビームの太さ、さらには顕微鏡の被写界深度を制御するために使用することができる。

ビーム成形光学系６１０を離れた光は、ダイクロイックビームスプリッタ１２０に入射し、このダイクロイックビームスプリッタ１２０は、蛍光を励起させるために使用されるより短い波長の光を、蛍光分子によって放出されたより長い波長の光から分離させる。このビームスプリッタ１２０の動作は、図１と関連させて上記において説明した動作に類似するものである。ビームスプリッタ１２０は、励起光をスキャニング素子６２５に向けて方向付ける。

スキャニング素子６２５を、２自由度を有している平面スキャニングミラー、例えばＸ−Ｙガルバノメータを使用して実現することができる。しかしながら、代替的な実施形態においては、非平面スキャニングミラー、可動プリズム等も含めて、２軸スキャニングを実現するための広範な代替的なアプローチを使用することができる。ただし、代替的なアプローチの例は、これらに限定されるものではない。ダイクロイックビームスプリッタ１２０からスキャニング素子６２５に到達する励起光は、スキャニングを行うためにスキャニング素子６２５によって反射され、その後、光学コンポーネント１３１〜１４０の第１のセットを介して伝播し続ける。これらのコンポーネント１３１〜１４０の動作は、図１と関連させて上記において説明した動作に類似するものである。

光学コンポーネント１３１〜１４０の第１のセットを通過した後に、励起光は、対物レンズ１４０を超えて遠位側に位置決めされている試料１４５に投影されることになる。励起光は、斜角で試料１４５に投影され、また試料１４５における励起光の位置は、スキャニング素子６２５の向きに応じて変化する。図６の実施形態の動作は、この点に関して、励起光の実際のシートまたは仮想のシートが試料１４５に斜角で投影される代わりに、図６の実施形態は、励起光のペンシル形状のビーム６４２を斜角で試料１４５に投影するという、大きな１つの例外を除き、上記において説明した図１の実施形態の動作に類似するものである。Ｘ方向およびＹ方向の両方向においてスキャニング素子６２５の位置を制御することで、この図６の実施形態における励起光のペンシル形状のビームによって、図１の実施形態におけるシートによってスキャンされる試料における同一のボリュームにわたりスキャニングを行うことができる。

斜めの光のビーム６４２によって、試料１４５において蛍光が励起されることになる。この試料から収集された蛍光は、同一の対物レンズ１４０によって収集される。対物レンズ１４０および光学コンポーネントの第１のセットのうちの残りの光学コンポーネント１３１、１３２は、遠位から近位の方向においてスキャニング素子６２５へと戻る、試料に由来する検出光の経路を決定する。検出光の共役像は、コンポーネント１３１とコンポーネント１３２との間に形成される。この共役像面の位置は、レーザ光による試料１４５の掃引に並行して変化する。

スキャニング素子に到達した検出光は、スキャニング素子６２５によって経路が再度決定され、それによって検出光は、近位から遠位の方向において、光学コンポーネント１４９〜１７０の第２のセットを通過することになる。図示した実施形態においては、光学コンポーネントの第２のセットが、オプションとしての吸収フィルタ１４９、またそれに続く、テレスコープ１５１、１５５、アパーチャ絞り１６０、およびＰＭＥ１７０を含んでいる。図６における実施形態では、検出光が、光学コンポーネントの第２のセットの最も近位の素子（すなわち、レンズ１５１）に入射する前に、ダイクロイックビームスプリッタ１２０を通過することになることを言及しておく。共役像面は、レンズ１５１とレンズ１５５との間に存在している。特に、スキャニング素子６２５は、到来する検出光のデスキャニングを行う。励起光によって対象物空間における試料１４５の種々異なる区間がスキャニングされるにもかかわらず、デスキャニングが行われることによって、この共役像面は固定されたままである。

共役像面に由来する光は、テレスコープの遠位側のレンズ１５５を介して位相変調素子１７０へと伝播し続ける。位相変調素子は、ダイクロイックビームスプリッタ１２０に対して遠位の位置で、検出光路に位置決めされている。一部の有利な実施形態においては、ＰＭＥ１７０が、対物レンズ１４０の瞳面に共役に位置決めされている。この図６の実施形態におけるＰＭＥ１７０の実現形態は、図１の実施形態と関連させて上記において説明した原理と同一の原理に従う。

オプションとして、図１の実施形態と関連させて上記において説明したように、環状のアパーチャ１６０および／または長距離経路吸収フィルタ１４９を含めることができる。

ＰＭＥ１７０によって変調された後に、カメラ６９０を使用して光が捕捉される。カメラは、光学コンポーネントの第２のセットを通過した検出光によって形成された像を捕捉するように、光学的に位置決めされている。その最も簡潔な形態においては、この実施形態におけるカメラ６９０が、像光を１次元センサ６９５（すなわち、線形アレイ）に収束させる単一のレンズ６９２である。

スキャニング素子６２５の任意の所定の位置において、励起光のビーム６４２が、相応の位置において試料１４５に投影され、また試料１４５において照明された線６４２に由来する蛍光の線形の像が、カメラのセンサ６９５によって捕捉される。より詳細には、照明された線６４２に由来する蛍光が、レンズ１３１とレンズ１３２との間の共役像面に結像され、スキャニング素子６２５によってデスキャニングされ、ダイクロイックビームスプリッタ１２０を通過して、レンズ１５１とレンズ１５５との間の固定の共役像面に結像されることになる。この共役像面は、スキャニング素子６２５によって実施されるデスキャニングに起因して固定である。続いて、この共役像には、上記において説明したように、ＰＭＥ１７０によって収差がもたらされて、カメラ６９０のセンサ６９５にデータのフレームとして結像される。

データのフレームの各々は、異なる時点における、試料１４５における線６４２から発せられる蛍光の単一の線に対応する。この線は、複数の画素から構成されることになる。一部の実施形態においては、線形センサ６９５における各画素の大きさは、５μｍ〜１０μｍである。代替的な実施形態においては、より大きい画素が使用され、その場合には、深度方向における分解能は低くなる。他の代替的な実施形態においては、画素の大きさは同一のまま（すなわち、５μｍ〜１０μｍ）であるが、しかしながら隣接する画素が、相互に（例えば、４つまたは８つのグループに）結合され、たとえ深度方向において分解能が低下していたとしても、向上した感度が提供される。

スキャニング素子６２５の移動によって、励起光のビーム６４２のいずれも試料における異なる場所に移動させられるので、線形の像がスキャニング素子６２５の複数の位置の各々に応じて捕捉される場合には、結果は（爪楊枝の束に類似する）フレームの束であり、これをプロセッサおよび対応付けられたメモリ１９９によって、試料１４５におけるターゲットボリュームを表す３Ｄボリュームに組み立てることができる。

オプションとして、それらの複数の３Ｄボリュームを、複数の異なる時点（例えば１／１０秒毎）に捕捉して、結像されているボリューム（すなわち試料におけるボリューム）の時間にわたる変化を表すことができる。

この図６の実施形態においては、デコンボリューションは不要である。しかしながら一部の実施形態においては、１Ｄの像の各々のぼけを、それらの像が３Ｄボリュームに組み立てられる前に修正するために、１Ｄデコンボリューションを、オプションとして実現することができる。代替的な実施形態においては、線形のフィルタリング技術を、１Ｄデコンボリューションの代わりに使用することができる。

代替的な実施形態においては、図６の実施形態のＰＭＥ１７０を、図１の実施形態におけるＰＭＥ１７０が図３の実施形態における反射性のＰＭＥ３７０に置換されたのと同様に、反射性のＰＭＥに置換することができる。

相互に所定の角度で配置されている、検出アームにおける２つの対物レンズを使用して像回転を実施するＳＣＡＰＥのそれらの実施形態とは異なり、図１、図５および図６の実施形態のカメラ１９０／６９０および検出アームにおける光学コンポーネント１４９〜１７０は、単一の光軸を共有している。その結果として、検出アームにおけるテレスコープ１５１〜１５５を通過するほぼすべての光は、カメラ１９０／６９０に向かって伝播し続けることになる。この構成は、有利には、オフアクシスのカメラを使用する多くの従来技術のＳＣＡＰＥの設計に固有である大きい損失を回避する。この設計を複雑にする１つの要因は、カメラ１９０／６９０および検出アームが単一の光軸を共有する場合には、これが像に収差をもたらすことである。しかしながらこの収差は、上記において説明したように、アルゴリズムによって補正される。

この場合、共役像面は、光軸に関して斜めであるにもかかわらず、（斜角に整列されているのではなく、光軸に沿って整列されている）カメラ１９０／６９０は、その斜めの共役像面を、１次元に圧縮された投影として、自身のセンサ１９５／６９５の表面に結像する。ＰＭＥ１７０は、カメラ１９０／６９０に到達する像の被写界深度の拡大に付加的に、結果として生じる像に収差をもたらす。それらの収差は、例えば上記において説明したような測定された点拡がり関数またはシミュレートされた点拡がり関数のデコンボリューションによって、プロセッサ１９９においてアルゴリズムによって補正される。

上記において説明した図１、図５および図６の実施形態は、有利には、整列を単純化し、分解能を改善し、光スループットを改善し、また（２つの対物レンズの実施形態に関して）実効検出開口数を向上させることができる。それらの改善に起因して、優れた信号対雑音比を達成することができる。この改善されたＳ／Ｎを、種々のやり方で高めることができ、このやり方には、より高いボリュメトリックフレームレートを達成するためのより短い露光時間でのより高速な撮像と、試料にもたらされるダメージおよびフォトブリーチングを低減するより低いレーザ強度での撮像と、が含まれる。この構成は、より低いＮＡ（例えば、ＮＡ〜０．５）を有している顕微鏡型の対物レンズを使用することによって、また総フットプリントを低減することによって、システムのコストを削減することもできる。人体組織での高速な生体内病理学のために、または光量不足でも多光子でＳＣＡＰＥを実現するために、この構成をＳＣＡＰＥの内視鏡での実現形態に適用することができる。それらの実現形態においては、蛍光がＮＩＲ−ＩＲ（７００ｎｍ〜１，６００ｎｍ）のスペクトルのレーザで非常に低い確率で励起される。その結果、収集されるべき蛍光は、（３００ｎｍ〜７００ｎｍのレーザを用いる）単一光子用途に関する蛍光よりも著しく弱いので、図１、図５および図６の実施形態の改善された光収集効率の恩恵を受けると考えられる。

特に、図１、図５および図６の実施形態の開口数、分解能および光スループットは、いずれも単一の一次対物レンズ１４０の特性によって管理される。（例えば、ターレットを使用して）このレンズを変更することによって、大きい視野にわたる高速なボリュメットリックイメージングを提供しつつ、（例えば、複数の標準的な倍率、分解能、および被写界深度を有している）卓上顕微鏡のモジュール性を提供することが可能となる。一部の実施形態においては、これには、対物レンズの切換に並行して行われる、異なるＰＭＥ１７０（例えば、異なる位相板）への切り替え、もしくは変更された対物レンズまたは代替的な修正を占めるための、プログラミング可能な位相変調素子（例えば、可変ミラーまたはＳＬＭ）における位相プロファイルの変更が含まれると考えられる。最後に、Ｏｌａｒｔｅ、ＴｏｍｅｒおよびＱｕｉｒｉｎの、光シート顕微鏡法における分離式照明／検出スキームと比較して、ＳＣＡＰＥシステムには直交ビーム経路が省略されていることで、技術の用途が、齧歯類の皮質のような大きい試料に拡大される。

本発明を、特定の実施形態を参照しながら説明したが、添付の特許請求の範囲に記載されているような本発明の範囲および精神から逸脱することなく、上述の実施形態についての種々の修正形態、代替形態および変更が可能である。したがって、本発明は、上記において説明した実施形態に限定されることは意図されていないが、しかしながら、添付の特許請求の範囲、およびそれと等価のものの言語によって定義されているすべての範囲を有するものである。

Claims (37)

1. 撮像装置において、
   光学コンポーネントの第１のセットと、光学コンポーネントの第２のセットと、スキャニング素子と、カメラと、を含んでおり、
   前記光学コンポーネントの第１のセットは、近位端部および遠位端部を有しており、前記光学コンポーネントの第１のセットの遠位端部に配置されている対物レンズを含んでおり、
   前記光学コンポーネントの第２のセットは、近位端部および遠位端部を有しており、位相変調素子を含んでおり、
   前記スキャニング素子は、前記光学コンポーネントの第１のセットの近位端部に関して近位側に配置されており、前記光学コンポーネントの第２のセットの近位端部に関して近位側に配置されており、
   ただし、前記スキャニング素子は、前記スキャニング素子に到達する励起光の経路を決定するように構成されており、それによって前記励起光は、近位から遠位の方向において前記光学コンポーネントの第１のセットを通過し、前記対物レンズを超えて遠位側に位置決めされている試料に投影され、前記励起光は、斜角で前記試料に投影され、前記励起光は、前記スキャニング素子の向きに応じて変化する位置において前記試料に投影され、
   前記光学コンポーネントの第１のセットは、遠位から近位の方向において前記スキャニング素子へと戻る、前記試料に由来する検出光の経路を決定するように構成されており、
   前記スキャニング素子は、前記検出光の経路を決定するようにも構成されており、それによって前記検出光は、近位から遠位の方向において前記光学コンポーネントの第２のセットを通過し、
   前記カメラは、前記光学コンポーネントの第２のセットを通過した前記検出光によって形成された像を捕捉するように、光学的に位置決めされており、
   前記位相変調素子は、制御された収差をもたらし、それによって前記カメラにおいて測定された際の、焦平面、焦平面の上方および焦平面の下方の各点の点拡がり関数を均質化する、
   撮像装置。
2. 前記位相変調素子には、位相板が含まれる、
   請求項１記載の装置。
3. 前記位相変調素子には、空間光変調器が含まれる、
   請求項１記載の装置。
4. 前記位相変調素子には、可変ミラーが含まれる、
   請求項１記載の装置。
5. 前記対物レンズは、瞳面を有しており、前記位相変調素子は、前記対物レンズの前記瞳面に共役である平面に位置決めされている、
   請求項１記載の装置。
6. 前記装置は、（ａ）前記位相変調素子に隣接して位置決めされており、かつ、（ｂ）前記位相変調素子に関して近位側に位置決めされているアパーチャ絞りをさらに含んでいる、
   請求項５記載の装置。
7. 前記検出光は、前記光学コンポーネントの第２のセットの近位端部と遠位端部との間において、固定の共役像面を形成している、
   請求項１記載の装置。
8. 光検出器アレイが、２Ｄイメージセンサを含んでおり、
   前記カメラは、前記光学コンポーネントの第２のセットを通過した前記検出光によって形成された複数の像を連続的に捕捉し、前記複数の像の各々は、像データのフレームの各々に対応し、
   前記装置は、さらに、前記像データのフレームにおける収差を補正するようにプログラミングされているプロセッサを含んでいる、
   請求項１記載の装置。
9. 前記プロセッサは、点拡がり関数のデコンボリューションを実施することによって、前記像データのフレームにおける収差を補正する、
   請求項８記載の装置。
10. 前記点拡がり関数は、測定された点拡がり関数であるか、またはシミュレートされた点拡がり関数である、
    請求項９記載の装置。
11. 光検出器アレイが、線形イメージセンサを含んでいる、
    請求項１記載の装置。
12. 前記スキャニング素子は、Ｘ−Ｙガルバノメータを含んでいる、
    請求項１１記載の装置。
13. 前記励起光は、前記試料における蛍光の励起が複数の光子のほぼ同時の吸収を要求する波長を有している、
    請求項１１記載の装置。
14. 前記装置は、さらに、
    前記光学コンポーネントの第２のセットの近位端部と前記スキャニング素子との間に配置されているビームスプリッタと、
    前記励起光の光源と、
    を含んでおり、
    前記励起光が前記ビームスプリッタへと方向付けられるように、前記励起光の前記光源の照準が定められており、
    前記ビームスプリッタは、前記スキャニング素子へと向かう前記励起光の経路を決定するように構成されており、
    前記ビームスプリッタは、前記スキャニング素子から到達する検出光の、前記光学コンポーネントの第２のセットの近位端部への経路を決定するように構成されている、
    請求項１記載の装置。
15. 前記励起光には、励起光のシートが含まれる、
    請求項１記載の装置。
16. 前記励起光のシートは、
    （ａ）光源に由来する光を前記励起光のシートに展開するように構成されているシリンドリカルレンズ、
    （ｂ）光源に由来する光を前記励起光のシートに展開するように構成されている非球面ミラー、
    （ｃ）光源に由来する光を前記励起光のシートに展開するように構成されている空間光変調器、
    （ｄ）光源に由来する光を前記励起光のシートに展開するように構成されている第２のスキャニング素子、および
    （ｅ）光源に由来する光を前記励起光のシートに展開するように構成されている振動ガルバノメータミラー、のうちの少なくとも１つによって生成される、
    請求項１５記載の装置。
17. 前記装置は、さらに、
    前記光学コンポーネントの第２のセットの近位端部と前記スキャニング素子との間に配置されているビームスプリッタと、
    前記励起光の光源と、
    を含んでおり、
    前記励起光が前記ビームスプリッタへと方向付けられるように、前記励起光の前記光源の照準が定められており、
    前記ビームスプリッタは、前記スキャニング素子へと向かう前記励起光の経路を決定するように構成されており、
    前記ビームスプリッタは、前記スキャニング素子から到達する検出光の、前記光学コンポーネントの第２のセットの近位端部への経路を決定するように構成されており、
    光検出器アレイが、２Ｄイメージセンサを含んでおり、
    前記励起光には、励起光のシートが含まれ、
    前記カメラは、前記光学コンポーネントの第２のセットを通過した前記検出光によって形成された複数の像を連続的に捕捉し、前記複数の像の各々は、像データのフレームの各々に対応し、
    前記装置は、さらに、前記像データのフレームにおける収差を補正するようにプログラミングされているプロセッサを含んでいる、
    請求項１記載の装置。
18. 前記プロセッサは、点拡がり関数のデコンボリューションを実施することによって、前記像データのフレームにおける収差を補正する、
    請求項１７記載の装置。
19. 前記対物レンズは、瞳面を有しており、前記位相変調素子は、前記対物レンズの前記瞳面に共役である平面に位置決めされている、
    請求項１８記載の装置。
20. 前記位相変調素子は、
    θ（ｘ，ｙ）＝２πα（ｘ^３＋ｙ^３）
    の位相プロファイルを有しており、ただし、ｘおよびｙは、正規化された瞳座標であり、αは、｜Ψ／２｜に設定される調整パラメータであり、ただし
    Ψ（ｕ_２，ｖ_２；ｄｚ）＝−（１／２λ）×ＮＡ^２×（ｕ_２ ^２＋ｖ_２ ^２）×ｄｚ／ｎ
    であり、ただし、λは、前記位相変調素子を通過する光の波長であり、ＮＡは、前記対物レンズの開口数であり、ｕおよびｖは、正規化された瞳座標であり、ｎは、前記対物レンズの下に位置する浸漬媒体の屈折率であり、ｄｚは、結像されるべき深度の範囲の１／２である、
    請求項１８記載の装置。
21. 前記位相変調素子は、
    θ（ｘ，ｙ）＝２πα（ｘ^３＋ｙ^３）
    の位相プロファイルを有しており、ただし、ｘおよびｙは、正規化された瞳座標であり、αは、｜Ψ／２｜に設定される調整パラメータであり、ただし
    Ψ（ｕ_２，ｖ_２；ｄｚ）＝−（１／２λ）×ＮＡ^２×（ｕ_２ ^２＋ｖ_２ ^２）×ｄｚ／ｎ
    であり、ただし、λは、前記位相変調素子を通過する光の波長であり、ＮＡは、前記対物レンズの開口数であり、ｕおよびｖは、正規化された瞳座標であり、ｎは、前記対物レンズの下に位置する浸漬媒体の屈折率であり、ｄｚは、結像されるべき深度の範囲の１／２である、
    請求項１記載の装置。
22. 撮像装置において、
    対物レンズと、複数の光学素子と、光検出器アレイと、位相変調素子と、を含んでおり、
    前記複数の光学素子は、前記対物レンズに由来する光を受け取るように構成されている検出経路に配置されており、前記検出経路に配置されている前記複数の光学素子には、スキャニング素子が含まれ、
    前記スキャニング素子は、（ａ）前記対物レンズの前側焦平面にわたる掃引励起ビームを生成するように前記対物レンズへの励起光の経路を決定する、かつ、それと同時に（ｂ）共役像を形成するために前記検出経路に沿って前記対物レンズを介して戻ってくる像光の経路を決定する、ように構成されており、
    前記光検出器アレイは、前記共役像の像を捕捉するように位置決めされており、
    前記位相変調素子は、前記スキャニング素子と前記光検出器アレイとの間の前記検出経路に配置されており、前記検出経路における被写界深度を拡大する、
    撮像装置。
23. 前記位相変調素子は、制御された収差をもたらすことによって前記被写界深度を拡大し、それによって前記光検出器アレイにおいて測定された際の、焦平面、焦平面の上方および焦平面の下方の各点の点拡がり関数を均質化する、
    請求項２２記載の装置。
24. 前記収差は、画像処理アルゴリズムによって補正される、
    請求項２３記載の装置。
25. 前記収差は、測定された点拡がり関数またはシミュレートされた点拡がり関数のデコンボリューションによって補正される、
    請求項２３記載の装置。
26. 前記光検出器アレイは、２Ｄイメージセンサを含んでいる、
    請求項２５記載の装置。
27. 前記光検出器アレイは、線形イメージセンサを含んでいる、
    請求項２２記載の装置。
28. 撮像装置において、
    光源と、シリンドリカルレンズまたはスキャナと、ビームスプリッタと、スキャニング素子と、第１のテレスコープと、第２のテレスコープと、カメラと、位相変調素子と、イメージプロセッサと、を含んでおり、
    前記シリンドリカルレンズまたはスキャナは、前記光源に由来する光を光のシートに展開し、
    前記ビームスプリッタは、前記光のシートの経路に配置されており、
    前記スキャニング素子は、前記光のシートの経路に配置されており、
    前記第１のテレスコープは、近位端部および遠位端部を有しており、前記第１のテレスコープの前記遠位端部に配置されている対物レンズを備えており、
    前記第２のテレスコープは、近位端部および遠位端部ならびに光軸を有しており、
    前記ビームスプリッタは、前記スキャニング素子へと向かう前記光のシートの経路を決定し、前記スキャニング素子は、前記第１のテレスコープの近位端部への前記光のシートの経路を決定し、前記第１のテレスコープは、前記対物レンズを介する近位から遠位の方向への前記光のシートの経路を決定し、前記対物レンズを通過した蛍光を受け取り、遠位から近位の方向において前記スキャニング素子へと戻る前記蛍光の経路を決定し、前記スキャニング素子は、前記ビームスプリッタを通過する、前記第２のテレスコープの近位端部への前記蛍光の経路を決定し、前記第２のテレスコープは、前記蛍光に由来する像を、共役像面において形成し、
    前記カメラは、前記第２のテレスコープと同一の光軸に位置決めされており、前記共役像面のぼけが生じた像を捕捉するように構成されており、
    前記位相変調素子は、前記第２のテレスコープと前記カメラとの間に配置されており、
    前記イメージプロセッサは、前記カメラによって捕捉された像のぼけを修正するようにプログラミングされている、
    撮像装置。
29. 前記光源には、レーザが含まれる、
    請求項２８記載の装置。
30. 前記位相変調素子には、位相板が含まれる、
    請求項２８記載の装置。
31. 前記位相変調素子には、空間光変調器および可変ミラーのうちの少なくとも１つが含まれる、
    請求項２８記載の装置。
32. 前記イメージプロセッサは、デコンボリューションアルゴリズムを使用して、前記像のぼけを修正するようにプログラミングされている、
    請求項２８記載の装置。
33. 試料を撮像するための方法において、
    励起光のシートを、斜角でかつスキャニング素子の向きに応じて変化する位置において、試料に投影するステップと、
    前記スキャニング素子へと戻る、前記試料から到達する検出光の経路を決定するステップと、
    スキャニング素子を使用して、制御された収差をもたらす光学系への検出光の経路を再度決定し、カメラにおいて測定された際の、焦平面、焦平面の上方および焦平面の下方の各点の点拡がり関数を均質化するステップと、
    収差の生じた検出光を使用して、それぞれが前記スキャニング素子の異なる向きに対応する複数の時点において複数の像を形成するするステップと、
    前記複数の像を捕捉するステップと、
    を含んでいる方法。
34. 前記方法は、さらに、前記複数の像における収差を補正するステップを含んでいる、
    請求項３３記載の方法。
35. 前記補正ステップが、点拡がり関数のデコンボリューションを実施するステップを含んでいる、
    請求項３４記載の方法。
36. 前記点拡がり関数は、測定された点拡がり関数であるか、またはシミュレートされた点拡がり関数である、
    請求項３５記載の方法。
37. 前記収差を、
    θ（ｘ，ｙ）＝２πα（ｘ^３＋ｙ^３）
    の位相プロファイルを有している位相変調素子によってもたらし、
    ただし、ｘおよびｙは、正規化された瞳座標であり、αは、｜Ψ／２｜に設定される調整パラメータであり、ただし
    Ψ（ｕ_２，ｖ_２；ｄｚ）＝−（１／２λ）×ＮＡ^２×（ｕ_２ ^２＋ｖ_２ ^２）×ｄｚ／ｎ
    であり、ただし、λは、前記位相変調素子を通過する光の波長であり、ＮＡは、対物レンズの開口数であり、ｕおよびｖは、正規化された瞳座標であり、ｎは、前記対物レンズの下に位置する浸漬媒体の屈折率であり、ｄｚは、結像されるべき深度の範囲の１／２である、
    請求項３３記載の方法。

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