CN109416321B - 基于空间光调制器的高光谱共焦显微镜及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

描述了用于共焦成像的系统和方法。在一个实施方式中，共焦成像系统(100)包括：光源(110)，被配置为发射具有一个或多个波长的激发光(10)；样品保持器(180)，被配置为保持样品；二维(2‑D)成像设备(190)，以及光学系统，该光学系统包括：第一空间光调制器(140)和第二空间光调制器(150)；其中，该光学系统被配置为(i)准直激发光(10)；(ii)使用第一空间光调制器(140)将预定的相位调制图案应用于准直的激发光(12)；(iii)使用相位调制的准直的激发光(14)作为激发图案来照射样品，其中激发图案位于相对于样品内的焦平面的傅里叶平面处；(iv)从样品内的焦平面收集发射光(18)；以及(v)经由第二空间光调制器(150)将收集的发射光(20)向成像设备(190)引导，使得样品内的焦平面与由第二空间光调制器(150)的像素形成的针孔图案共轭。

Description

基于空间光调制器的高光谱共焦显微镜及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年5月27日提交的美国临时专利申请No.62/342,256和2017年5月27日提交的美国非临时专利申请No.15/607,455的权益，并且其内容通过引用并入本申请。
技术领域
本公开一般涉及成像领域和显微镜系统以及方法。更具体地，但不限于，所公开的实施例涉及用于通过使用空间光调制器共焦成像的系统和方法。
背景技术
荧光显微镜使用荧光原理而不是光吸收、相位或干涉效应来突出检查结构。例如，它能够应用于生物学和其他学科中以表征样品。在荧光显微镜中，样品中的荧光团或其他光学标记被指向样品的激发光束激发。在激发时，荧光团发射能够被获取为图像的荧光。
当对厚样品成像时，能够采用光学技术来执行光学切片，即，获得轴向上的高分辨率图像。一种这样的技术是共焦显微镜。执行共焦显微镜的最常用方法是使用空间针孔，其拒绝从焦平面外部的平面发射的光。因为离焦荧光明显减少或消除，所以共焦显微镜实现了良好的轴向分辨率。因此，共焦显微镜能够进一步允许根据沿着轴向的一系列焦平面处获得的图像重建样品的三维(Three-Dimensional，3-D)图像(例如，虚拟体积图像)。
在共焦显微镜中，通过使用点照射和检测来实现光学切片。激发光源，经常是激光束被聚焦到一个点，对整个样品进行扫描或在激光点固定的情况下在横向方向上平移样品。从样品收集的荧光然后通过单个针孔以产生样品的光学切片。通过逐点地侧向平移针孔或样品来生成二维(Two-Dimensional，2-D)图像。为了生成虚拟体积图像，将样品或物镜(objective)轴向平移以调节到焦平面，并且横向扫描针孔(或样品)以在该平面中构建图像。这显著地限制了图像采集的速度。
通过使用并行扫描技术能够提高图像采集的速度，诸如使用具有针孔阵列的Nipkow盘的横河电机扫描单元。当Nipkow盘高速旋转时，激光并行穿过盘上的针孔，同时照亮样品上的许多离散点。然而，横河电机扫描单元的激发路径受非常低效率的影响。Nipkow盘典型地拒绝绝大多数激发光，因为相邻针孔之间的间距需要很大以维持合理程度的光学切片或共焦。另外，针孔的尺寸和间距是固定的，并且可以仅针对物镜的一个特定数值孔进行优化。改变光学切片的程度可能需要物理地移除和更换盘，这在大多数系统中可能是麻烦的、昂贵的或甚至是不可能的。
因此，需要用于允许快速图像采集、激发光的有效利用以及针孔的容易调节的共焦成像的方法和系统。
发明内容
本公开的实施例包括通过同时捕获来自样品中的焦平面处的多个位置的光来改善共焦显微镜的吞吐量或时间性的系统和方法。有利地，示例性实施例通过使用诸如微镜设备(Micromirror Device，DMD)或液晶设备(Liquid Crystal Device，LCD)的空间光调制器(Spatial Light Modulator，SLM)来允许激发光的有效利用和容易调节的光学切片程度。
根据本公开的示例性实施例，描述了共焦成像系统。该系统可以包括：光源，被配置为发射具有一个或多个波长的激发光；样品保持器，被配置为保持样品；二维(2-D)成像设备；第一组光学元件；和第二组光学元件。
第一组光学元件可以包括第一空间光调制器(SLM)和至少一个透镜。第一组光学元件可以被配置为准直激发光，将预定的相位调制图案应用于准直的激发光，以及以激发图案照射样品。激发图案可以处于相位调制图案的傅立叶平面处。第二组光学元件可以包括第二SLM和至少一个透镜。第二组光学元件可以被配置为将从样品中的焦平面收集的发射光成像到成像设备。焦平面可以与由第二SLM的像素形成的针孔图案共轭。
根据本公开的另一示例性实施例，描述了一种用于获得共焦图像的方法。该方法包括以下步骤：提供发射具有一个或多个波长的激发光的光源，准直来自光源的激发光，通过第一空间光调制器(SLM)将预定的相位调制图案应用于准直的激发光，以二维激发图案照射样品，以及将从样品中的焦平面收集的发射光成像到成像设备。激发图案可以处于相位调制图案的傅立叶平面处。焦平面可以与由第二SLM的像素形成的针孔图案共轭。
根据本公开的又一示例性实施例，描述了一种用于配置共焦显微镜以获得样品的共焦图像的方法。该方法包括以下步骤：提供发射具有一个或多个波长的激发光的光源，准直来自光源的激发光，通过第一空间光调制器(SLM)将预定的相位调制图案应用于准直的激发光，以二维激发图案照射样品，以及将从样品中的焦平面收集的发射光成像到成像设备。激发图案可以处于相位调制图案的傅立叶平面处。焦平面可以与由第二SLM的像素形成的针孔图案共轭。
所公开的实施例的附加特征和优点将部分地在下面的描述中阐述，并且部分地将从描述中显而易见，或者可以通过实践所公开的实施例来学习。通过所附权利要求中特别指出的元素和组合，将实现和获得所公开实施例的特征和优点。
应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述都只是示例和说明，而不是对要求保护的所公开的实施例的限制。
附图构成本说明书的一部分。附图示出了本公开的若干实施例，并且与说明书一起用于解释所附权利要求中阐述的所公开的实施例的原理。
附图说明
图1是根据本公开的实施例的示例性共焦成像系统的示意图。
图2是根据本公开的实施例的用于执行高光谱共焦成像的示例性方案的图形说明。
图3是根据本公开的实施例的用于获得共焦图像的示例性方法的流程图。
具体实施方式
所公开的实施例涉及用于实现共焦成像的系统和方法，其允许快速图像采集和激发光的有效利用。本公开的实施例可以使用具有一个或多个2-D成像设备(例如CCD或CMOS传感器或相机)的显微镜来实施，诸如荧光显微镜、共焦显微镜、透射显微镜或反射显微镜。可替代地，可以使用合适的光学元件来根据本公开的实施例构建光学成像系统。
不是使用具有预定的针孔和/或微透镜阵列的Nipkow盘，本公开的实施例而是允许使用具有可调节尺寸和间距的可编程人造针孔来获取样品中的焦平面的2-D图像。能够在多个焦平面处获取多个2-D图像并且计算地重建多个2-D图像以获得样品的3-D或虚拟体积图像。另外，本公开的实施例允许获取样品中焦平面的高光谱共焦图像数据集。
根据本公开的一个方面，具有一个或多个波长的激发光可以用于激发样品中的荧光团。激发光可以由单色光源或多色光源发射。在一些实施例中，单色光源可以是脉冲或连续的“单波长”激光器，其发射具有非常窄光谱的光。在其他实施例中，单色光源可以是单色器的输出。
在一些实施例中，多色光源可以具有连续光谱。例如，多色光源可以是宽带光源，诸如某些超连续激光器、白光源(例如，高压汞灯、氙灯、卤素灯或金属卤化物灯)、或一个或多个LED。在其他实施例中，多色光源可以具有离散光谱。例如，多色光源可以是发射具有非常窄光谱的光的脉冲或连续“单波长”激光器的组合。
根据本公开的一个方面，使用第一空间光调制器(SLM)可以将由光源发射的激发光构造成以激发图案照射样品上的区域的子集。为了构造激发光，第一SLM可以通过选择性地调制(例如，致动或切换)其像素来调制激发光的相位或振幅。在调制中像素可以是数字的或模拟的。第一SLM可以从包括数字微镜设备(DMD)、变形镜(Deformable Mirror，DM)、衍射光学元件、液晶设备(LCD)和硅上液晶(Liquid Crystal-on-Silicon，LCOS)设备的一组SLM中选择。
如本文所描述，照射在样品上的激发图案可以包括多个激发光的聚焦点(激发点)。激发图案可以是任意图案或预定的图案，诸如同时入射在样品上的2-D激发点阵列。由激发图案照射的样品中的荧光团或荧光分子可以被激发并随后发射荧光。
在一些实施例中，可以通过调制第一SLM的像素在整个样品或视场上扫描激发图案。在其他实施例中，x-y平移台可以用于通过在横向方向上移动样品或物镜来扫描整个样品或视场上的激发图案。该平台可以是机动平移台、压电平移台、或允许横向线性运动的任何合适的平台。
根据本公开的一个方面，根据本公开的系统和方法允许共焦光学切片。这允许沿着样品的轴向获取多个焦平面的图像。在一些实施例中，可以通过在与焦平面共轭的平面处实施一个或多个光学针孔来获取期望的焦平面的图像。光学针孔可以是由第二SLM的像素形成的可编程人造针孔。第二SLM可以从包括数字微镜设备(DMD)、液晶设备(LCD)和硅基液晶(LCOS)设备的一组SLM中选择。
在一些实施例中，可以通过选择性地调制或切换第二SLM的像素以匹配激发光的激发图案来由第二SLM的像素形成针孔图案。有利地，针孔图案可以允许由激发图案同时照射的样品上的多个区域的共焦成像。与使用顺序逐点扫描的传统共焦显微镜相比，这可以增加在焦平面处获取整个样品上的共焦图像的速度和/或吞吐量。另外，通过改变由第二SLM形成的人造针孔的尺寸和/或间隔，可以根据需要有利地调节光学切片或共焦的程度，允许调节期望的焦平面的深度选择性的程度。
如本文所描述，荧光团在本公开中用作样品中的示例性光学标记。关于荧光团的描述同样适用于与本公开的实施例一致的其他类型的光学标记。例如，从光源发射的激发光还可以激发其他类型的光学标记，其在激发时可以发射具有发射光谱的光。因此，在本公开的描述中使用的荧光和荧光发射光谱也可以用于表示其他光学标记的发射光和发射光谱。
根据本公开的一个方面，根据本公开的系统和方法允许高光谱成像。通过由激发光在样品的给定区域激发的荧光团发射的荧光可以被光谱地色散在给定的横向方向(例如，水平方向或垂直方向)。可以采用至少一种色散元件将荧光光谱地色散成与该给定区域相对应的荧光发射光谱。可以通过2-D成像设备在一次曝光中获取样品上的区域的子集的荧光发射光谱作为2-D图像。
在一些实施例中，可以通过扫描整个样品或视场上的激发图案来获取整个样品或整个视场的所有区域的荧光发射光谱。在激发图案的每个空间位置处，可以获取与激发图案相对应的荧光发射光谱(例如，与激发图案的激发点相对应的每个荧光发射光谱)的2-D图像。有利地，可以根据荧光发射光谱的多个这样的2-D图像计算地重建样品的高光谱图像数据集。另外，通过在扫描期间使用第二SLM形成与激发图案匹配的针孔图案，能够获得样品的高光谱共焦图像数据集。
现在将详细参考本公开的实施例和方面，其示例在附图中示出。在可能的情况下，在所有附图中将使用相同的附图标记来表示相同或相似的部分。
如本文所描述，为了示出不同的波长或频率的光，在附图中使用不同的密度的点状织构(texture)。较高的密度与较长的波长或较低的频率的光相对应。另外，垂直和/或水平方向用作示出横向或轴向方向的示例。
图1是示例性共焦成像系统100的示意图。在一些实施例中，系统100可以是荧光显微镜、透射显微镜、反射显微镜或共焦荧光显微镜。本公开的实施例适用于用于执行共焦成像和/或高光谱成像的其他合适的显微技术。
如图1所显示，系统100可以包括照明系统和检测系统。照明系统可以包括光源110、第一SLM 140和一个或多个透镜，例如透镜120a、120b和120c。照明系统还可以包括半波片130、光束转储器125和/或滤光器200a。检测系统可以包括第二SLM 150、2-D成像设备190和一个或多个透镜，例如透镜120d、120e和120f。检测系统还可以包括色散元件210和/或滤光器200b。取决于其布局、几何形状和/或应用，系统100还可以包括分束器160、物镜170和其中放置待成像的样品的样品保持器180。系统100可以包括其他光学元件，诸如镜子、光束转储器、x-y平移台、z轴平移台或可调液体透镜(未显示)等。
如本文所描述，系统100的光轴可以限定路径，来自样品的激发光和发射的荧光沿着该路径传播通过系统100。
在照明系统中，如图1所显示，光源110发射激发光10，该激发光10被引导到SLM140。可以使用一个或两个透镜(例如，透镜120a或一对透镜120a)对激发光10进行准直和/或扩展。SLM 140可以通过选择性地致动或切换其像素来通过调制激发光12的相位或振幅来构造准直的激发光12。SLM 140可以是透射型或反射型SLM。虽然在图1所显示的示例性实施例中使用反射型SLM 140，但是可以可替代地使用与本公开一致的透射型SLM 140。可以基于SLM 140的类型适当地设计照明系统的几何形状。
如图1所显示，当SLM 140是反射型SLM时，SLM 140的像素的至少一部分反射激发光12并将反射的激发光14沿着系统100的光轴引导。在一些实施例中，激发光14可以由SLM140直接朝向分束器160和/或物镜170引导。在其他实施例中，如图1所显示，在到达分束器160和/或物镜170之前，反射的激发光14可以穿过一个或多个中继透镜，例如透镜120b和120c。然后，物镜170将激发光聚焦到放置在样品保持器180上的样品。
在检测系统中，如图1所显示，由样品中的激发的荧光团发射的荧光18由物镜170收集和/或准直。荧光18可以沿着系统100的光轴穿过分束器160和透镜120d。SLM 150可以放置在沿着光轴与位于样品中期望的深度的焦平面共轭的大约一个平面处。例如，物镜170和透镜120d可以形成成像配置。当SLM 150是反射型SLM时，SLM 150可以反射荧光18的至少一部分并将反射的荧光20沿着系统100的光轴朝向成像设备190引导。在到达成像设备190的2-D传感器之前，反射的荧光20可以通过一对管透镜，例如透镜120e和120f。
如本文所描述，虽然在图1所显示的示例性实施例中使用反射型SLM 150，但是可以可替代地使用与本公开一致的透射型SLM 150。可以基于SLM 150的类型适当地设计检测系统的几何形状。
下面详细描述系统100的各种组件的功能和工作原理。
光源
如上所描述的，光源110可以是单色光源或多色光源。在一些实施例中，由光源110发射的激发光10可以是线性偏振的。附加地或可替代地，激发光10可以由透镜120a准直并且在入射在SLM 140上之前变成准直的激发光12。
在一些实施例中，准直的激发光12可以穿过半波片130。半波片130可以改变线性偏振激发光的偏振方向。例如，当SLM 140是LCD或LCOS设备时，半波片130可以使线性偏振激发光的偏振方向旋转，以与SLM 140中的液晶分子的取向平行地对准。这可以通过SLM140的像素提高激发光的反射和/或调制效率。
在一些实施例中，光源110可以可操作地连接到控制器(未显示)，该控制器具有处理器和存储指令或操作步骤的计算机可读介质。当这些指令或步骤由处理器运行时，这些指令或步骤可以调制光源110的操作状态。例如，处理器可以激活或去激活光源110、调制脉冲光源110的脉冲的持续时间、和/或切换或调谐光源110的发射波长。
用于构造激发光的空间光调制器
如上所描述的，为了构造用于以激发图案照射样品的激发光12，SLM 140可以通过在操作状态之间选择性地调制其像素来调制激发光12的振幅或相位。
调幅
在一些实施例中，激发光12的振幅可以由SLM 140调制。例如，SLM 140可以是反射型LCD或LCOS设备。LCD或LCOS设备可以放置在与样品的平面共轭的平面上。在这样的情况下，透镜120b和120c中只有一个可以放置在SLM 140和物镜170之间。例如，透镜120b可以用作管透镜并与物镜170组合以形成成像配置。SLM 140可以放置在透镜120b之前大约一个焦距处。
SLM 140的像素可以通过操纵入射在像素上的激发光的偏振来产生振幅调制图案。例如，可以通过透镜120b和物镜170将振幅调制图案成像到样品上作为激发图案。取决于透镜120b和物镜170的焦距，激发图案可以是振幅调制图案的放大或去放大图像。
为了产生振幅调制图案，SLM 140的像素可以以逐像素的方式在“开”状态和“关”状态之间电调制。“开”像素可以使线性偏振光的偏振方向旋转大约90°，而“关”像素不执行旋转。在这样的情况下，第一线性偏振器(未显示)可以用于线性偏振激发光12。第二线性偏振器或偏振分束器(PBS)(未显示)可以用于使由“开”像素反射的激发光14通过，并阻挡由“关”像素反射的激发光12。
使用SLM 140调制激发光12的振幅的缺点是在调制期间的光的损失。这是因为SLM140的大多数像素典型地处于“关”状态。因此，大部分激发光12被转向远离光轴并且不会到达样品，而因此丢失。
调相
为了提高利用激发光12的效率，SLM 140可以调制激发光12的相位以生成激发图案。在这样的情况下，透镜120b和120c都可以放置在SLM 140和物镜170之间。例如，SLM 140可以是反射型LCD或LCOS设备。LCD或LCOS设备可以放置在孔平面处，该孔平面可以是与物镜170的后孔共轭的平面或者样品的傅里叶平面。例如，透镜120b和120c可以形成成像配置。透镜120b可以位于SLM 140后面的大约一个焦距处。透镜120c可以位于透镜120b后面的大约两个焦距处。物镜170可以位于透镜120c后面的一个焦距附近。
SLM 140的像素可以形成定制相位调制图案以调制激发光12的波前。在由SLM 140反射激发光12时，可以根据相位调制图案选择性地改变反射的激发光14的波前的不同的位置处的相位。在一些实施例中，SLM 140的像素可以以逐像素的方式在“开”状态和“关”状态之间电调制。如果SLM 140的像素处于“开”状态，则它们可以通过改变在液晶中行进的光的光路长度来改变反射光的相位；如果它们处于“关”状态，则它们可能不会改变反射光的相位。这允许由SLM 140的像素形成的相位调制图案根据需要进行数字定制。在其他实施例中，SLM 140的像素可以具有相位调节的多个状态或级别(例如，0和2π之间的256个级别)，并且可以单独地调制到期望的状态或级别。有利地，增加像素的调节的状态或级别增加了相位调制图案的调节的连续性并因此增加了激发光14的相位的调节，并且还可以减少激发图案中的不期望的衍射级。
相位调制可以使反射的激发光14的小波具有不同的方向和/或相位。当反射的激发光14沿着光轴传播时，物镜170和透镜120b和120c中的每一个可以对反射的激发光14的波前执行傅里叶变换。然后可以在物镜170的焦平面处形成衍射图案。这种衍射图案在本文中被称为对样品照射时的激发图案。
在一些实施例中，光束转储器125可以在透镜120b和120c之间沿着光轴放置，例如，在透镜120b后面的约一个焦距处或者在样品的共轭平面处。这可以允许由反射的激发光14在光束转储器125的位置处形成的衍射图案的低阶衍射点(例如，零级和/或一级衍射点)基本上被吸收和阻挡而不能到达样品。因为激发图案是在光束转储器125的位置处形成的衍射图案的图像，所以照射在样品上的激发图案的低阶衍射点的强度将显着降低。由于低阶衍射点(例如，零级和/或一级衍射点)典型地比其他级的衍射点亮，因此使用光束转储器125可以有利地改善整个视场的激发图案的强度的均匀性。
如上所描述的，相位调制图案处于或接近样品的傅立叶平面。在这样的情况下，其相位已经由SLM 140的相位调制图案调制的反射的激发光14的电场，在其以期望的激发图案照射样品之前，还经受由透镜120b和120c和物镜170进行的傅立叶变换。在一些实施例中，激发图案可以是具有期望的相位分布的变换的激发光的波前的强度分布。可以预先确定期望的相位分布以增加激发光的衍射效率。
在一些实施例中，计算机算法(例如，Gerchberg-Saxton(GS)算法)可以用于生成将引起期望的激发图案的相位调制图案。此外，定制的计算机算法可以用于生成时变相位调制图案，用于在整个视场上扫描或平移期望的激发图案。
有利地，调制激发光12的相位将允许其在SLM 140的近场中以基本上均匀的强度传播，从而减少激发光12的损失。然后，当对远场中的样品照射时，调制的激发光可以形成可定制的或可编程的激发图案。因此，与如上所描述的调制激发光12的振幅相比，调制激发光12的相位以产生期望的激发图案可以通过减少激发光12的损失而显着提高系统100的照射效率。
可替代地，SLM 140可以是沿着光轴实施的传输类型设备。可以适当地设计照明系统的几何形状，使得由设备的像素形成的振幅或相位调制图案可以调制类似于如上所描述的激发光12的振幅或相位。
无论SLM 140调制激发光12的振幅还是相位，通过以逐像素的方式在两个操作状态之间调制SLM 140的像素，能够根据需要对照射在样品上的激发图案进行编程和定制。此外，通过扫描或改变SLM 140的像素的调制，激发图案可以在给定空间方向(诸如水平或垂直方向)上在整个样品或视场上被平移或移位。例如，当SLM 140位于样品的傅立叶平面处以便调制激发光12的相位时，可以通过沿着空间方向改变线性相位斜坡的斜率来扫描激发图案。这有利地允许在系统100的整个视场上扫描激发图案，而不使用x-y平移台移动样品和/或样品保持器180。
在一些实施例中，取决于SLM 140的像素的类型和调制特征，激发光12可以相对于SLM 140的平面以预定的角度朝向SLM 140引导。预定的角度可以取决于SLM 140的类型和/或系统100的几何形状。例如，当SLM 140是反射型SLM时，激发光12可以以使得反射的激发光14沿着系统100的光轴传播的角度朝向SLM 140引导。
在一些实施例中，SLM 140可以可操作地连接到控制器(未显示)，该控制器具有处理器和存储指令或操作步骤的计算机可读介质。当这些指令或步骤由处理器运行时，这些指令或步骤可以调制SLM 140的像素的操作状态以形成期望的激发图案和/或在期望的空间方向上将激发图案在整个视场上平移通过预定的距离。
多个照明源
在一些实施例中，系统100可以被配置为同时和/或顺序地用多个不同的波长的光照射样品保持器180中的样品。这可以包括操作光源110的多个不同的发光元件以发射各自不同的波长的光。附加地或替代地，可以提供多个不同的光源、SLM、中继透镜或其他元件，以便于以多个不同的波长照射样品。
在一些示例中，这可以包括将来自多个不同的光源的照射应用于第一SLM 140。可以选择从光源中的每一个到第一SLM 140的激发光的入射角，使得对于在给定空间周期下将相移的相位光栅图案应用于入射/透射光的第一SLM 140的操作的图案，第一SLM 140在基本上相同的方向上(例如，经由物镜170和/或系统100的其他元件传播到样品保持器180的方向)从各自不同的角度衍射两个不同的波长的入射光。
在一些示例中，系统可以包括附加光源、附加SLM和/或附加的其他光学元件(例如，附加透镜、中继透镜对、光学转储器、半波片或光学滤波器)以提供适当地相移、聚焦或以其他方式指定经由物镜170到样品保持器180的激发光。这可以包括将这样的附加激发光组合到由光源110发射并且由第一SLM 140使用例如分束器、二向色镜或一些其他光学元件修正的激发光10。
共焦光学切片
如上所描述的，系统100允许共焦光学切片，其允许选择样品中焦平面的深度。可以通过在与所选择的焦平面共轭的平面处引入一个或多个光学针孔来选择焦平面的深度。
SLM 150用于实现共焦光学切片。如上所描述的，SLM 150可以放置在沿着光轴、与位于样品中的期望的深度处的焦平面共轭的大约一个平面处。透镜120d可以用作管透镜，并且与物镜170一起可以形成成像配置。例如，如图1所显示，透镜120d可以位于物镜170后面，并且SLM 150可以位于透镜120d后面大约一个焦距处。物镜170的后孔和透镜120d之间的空间是准直空间，其可以根据需要基于诸如系统100的几何形状和最小光束孔的期望的位置的各种因素进行调节。在一些实施例中，透镜120d放置在物镜170后面大约一个焦距处。
在一些实施例中，SLM 150可以是具有多个微镜152的阵列的数字微镜设备(DMD)。这些微镜可以被单独地致动以在两个操作位置“开”位置和“关”位置之间切换。当微镜被配置为处于“开”位置时，来自样品中的焦平面的荧光18被反射以作为反射的荧光20沿着光轴传播，该反射的荧光20被引导到成像设备190。当微镜被配置为处于“关”位置时，荧光18朝向偏离光轴的方向反射并且不被引导到成像设备190。在一些实施例中，由“关”微镜反射的荧光18可以被引导到其他光学元件，诸如镜子或光束转储器(未显示)。
在一些实施例中，微镜是方形形状的，其侧边的长度范围从大约几微米到大约10微米。微镜的其他形状和尺寸也是可能的并且可以适当地使用。DMD典型地能够非常快速地改变或交替微镜的“开”和“关”位置。
在一些实施例中，DMD的单个微镜可以被称为单个像素。在其他实施例中，多个微镜可以被称为单个像素。例如，一组紧邻的微镜可以称为单个像素，并且可以一致地调制或致动。
可以选择性地致动SLM 150的像素或将其切换到“开”或“关”位置，以形成与样品上照射的激发图案匹配(共轭)的针孔图案。针孔图案可以包括在共轭平面处的多个人造光学针孔并且拒绝来自样品的离焦荧光。因此，离焦荧光将不会通过检测系统并且将基本上从由成像设备190的获取的图像中移除或消除。
针孔图案中的人造针孔的尺寸和间隔是可编程的，并且可以基于由物镜170和透镜120d形成的成像配置的激发图案和放大率来定制。例如，针孔图案中的人造针孔可以由“开”像素阵列形成，以匹配激发图案中的激发点的尺寸。
然后，由SLM 150的“开”像素反射的荧光20可以通过透镜120e和120f成像到成像设备190。例如，透镜120e可以位于由透镜120d产生的图像外的一个焦距处(例如，在SLM150后面大约一个焦距的长度)，使得其重新准直反射的荧光20。成像设备190可以位于透镜120f后面的大约一个焦距处或位于SLM 150的共轭平面处。因为荧光在透镜120e和120f之间的空间中准直，所以可以根据期望调节透镜120e和120f之间的距离。在一些实施例中，透镜120f可以在透镜120e后面大约两个焦距处，使得透镜120e和120f之间的中间的平面与系统100的出射光瞳共轭。
通过使用SLM 140数字地改变和/或横向移位激发图案以及相应地使用SLM 150匹配针孔图案，可以扫描整个视场以便获取共焦图像。通过进一步扫描整个样品的视场，能够扫描整个样品以获得样品的完整共焦图像数据集。
在一些实施例中，成像设备190可以适当地倾斜以减少像差，从而改善所获取的图像的质量。这至少是因为SLM 150的“开”像素可以以不垂直于SLM 150的表面平面的角度引导反射的荧光20，使得由透镜120e和120f形成的像平面可以倾斜。由这种倾斜效应引起的像差可以通过合适地倾斜成像设备190来补偿。
为了改变或选择焦平面的深度，在一些实施例中，样品保持器180可以安装在z轴平移台上。可以通过使用z轴平移台沿着光轴移动样品保持器180来选择焦平面的期望的深度。可替代地，物镜170可以安装在z轴平移台上，并且可以通过沿着光轴移动物镜170来选择焦平面的期望的深度。如本文所描述，z轴平移台还可以包括x-y平移能力，以在横向方向上在整个样品上移动系统100的视场。
在一些实施例中，当SLM 140处于用于调制激发光12的相位的傅立叶平面时，可以通过改变由SLM 140的像素形成的相位调制图案来调节聚焦深度。在这样的情况下，由SLM140的像素调制的激发光14可以在反射时包括由相位调制图案确定的稍微发散或会聚光束的叠加。取决于它们的发散程度或会聚程度，这些光束在通过显微镜物镜之后会以增加或减少的深度聚焦。
在其他实施例中，可以通过调谐放置在物镜170后面的可调液体透镜(未显示)的焦点来选择焦平面的期望的深度。如本文所描述，可以由计算机程序来控制z平移台、可调液体透镜和/或SLM 140的相位调制图案以实现自动聚焦。
有利地，可以根据需要通过改变由SLM 150形成的人造针孔的尺寸和/或间隔来调节共焦的程度。例如，通过增加针孔中的像素的数量和/或减小针孔间距来增加针孔的尺寸可以降低共焦的程度并因此降低期望的焦平面的深度选择性的程度。另一方面，通过减少针孔中的像素的数量和/或增加针孔间距来减小针孔的尺寸可以增加共焦的程度并因此增加期望的焦平面的深度选择性的程度。在一些实施例中，深度选择性可以与SLM 150的“关”和“开”像素的数量的比率成比例。因此，SLM 150可以有利地允许通过方便地调节针孔尺寸和/或间隔来根据期望在宽视场成像和共焦成像之间切换。
另外，由SLM 150的像素形成的针孔图案有利地允许由SLM 140生成的激发图案同时照射的样品上的多个区域的共焦成像。与使用顺序逐点扫描的传统共焦显微镜相比，这可以增加在期望的焦平面处获取整个样品的共焦图像数据集的速度和/或吞吐量。
高光谱成像能力
在一些实施例中，可以有利地将高光谱成像能力添加到系统100，以允许在样品中的选择的焦平面处获取高光谱成像数据集。高光谱成像数据集可以以三维(3-D)表示：两个空间方向(水平方向和垂直方向)和一个光谱维度(λ)。高光谱成像数据集的光谱维度中的信息可以反映作为样品中的荧光团的发射波长的范围的函数的荧光强度。
可以通过使用系统100中的色散元件210来实现高光谱成像能力。例如，色散元件210可以位于透镜120e和120f之间的准直空间中。色散元件210可以是衍射光栅或诸如非偏离棱镜(例如，Amici棱镜或双Amici棱镜)的棱镜。色散元件210可以沿着给定的横向方向光谱色散从SLM 150反射的荧光20。然后，光谱地色散的荧光22穿过透镜120f并由成像设备190获取。
图2是根据本公开的实施例的用于执行高光谱共焦成像的示例性方案的图形说明。在一些实施例中，当系统100处于单色成像模式时，成像设备190可以获取由形成在SLM150上的针孔图案反射的荧光20的图像。针孔图案与照射在样品上的激发图案共轭。例如，由成像设备190获取的2-D图像192可以显示与激发图案中的激发点的2-D阵列相对应的荧光点302的2-D阵列300。
在其他实施例中，当系统100处于高光谱成像模式时，由SLM 150反射的荧光20在给定方向(例如，水平方向)上由色散元件210光谱地色散。在这样的情况下，由成像设备190获取的2-D图像192可以显示荧光发射光谱312的2-D阵列310。每个荧光发射光谱312可以在水平方向上色散并且与在样品上的不同的空间位置处的激发图案的激发点相对应。
如上所描述的，激发图案能够横向(例如，在垂直和水平方向上)移位，以扫描整个视场或样品。在激发图案的每个空间位置处，能够在2-D图像192中获取与由激发图案照射的样品上的区域相对应的荧光发射光谱312的阵列310。可以获取荧光发射光谱的多个2-D图像192，其与彼此横向移位的一系列激发图案相对应，然后计算重建以获得高光谱成像数据集。
因此，通过相应地在SLM 150上数字地改变和/或横向移位激发图案和匹配的针孔图案，可以扫描整个视场以便获取焦平面处的样品的高光谱成像数据集。通过进一步扫描整个样品的视场，能够扫描整个样品以获得焦平面处的样品的完整高光谱成像数据集。
激发图案的激发点之间的(水平和/或垂直)空间间隔可以基于各种因素预先确定，诸如激发波长、样品的尺寸、系统100的视场、期望的测量吞吐量、空间分辨率和/或速度、和荧光22的光谱色散量。例如，可以基于水平方向上的荧光发射光谱312的范围预先确定水平方向上的激发点之间的空间间隔，使得在2-D图像192中荧光发射光谱312在水平方向上彼此不重叠。
由色散元件210引起的光谱色散的程度可以基于各种因素预先确定，诸如荧光20的光谱范围、视场或样品的尺寸、成像设备190的尺寸、期望的光谱分辨率、和系统100的应用。
在一些实施例中，由色散元件210引起的光谱色散的程度可以有利地调节。例如，色散元件210可以是沿着系统100的光轴放置的一对双Amici棱镜。该对双Amici棱镜中的至少一个围绕光轴相对于另一个旋转。双Amici棱镜相对于彼此的旋转可以允许连续控制荧光22的光谱色散的量和/或角度取向(例如，色散角)。
透镜和目标
系统100的诸如透镜120a-120f的各种透镜，可以是消色差的，诸如消色差双合透镜或三合透镜，以限制或减小系统的色差和/或球差的影响。此外，系统100的物镜170可以是消色差的。可替代地或另外地，物镜170可以是无限校正物镜，使得物镜170可以形成从其后孔进入的准直的光束的期望的焦点(例如，聚焦点或聚焦图案)。使用消色差透镜和/或消色差或无限校正的物镜可以允许来自样品中的焦平面的不同的波长的荧光在成像设备190处类似地形成聚焦的图像。因此，使用消色差透镜和/或消色差物镜可以改善由系统190获取的共焦图像的质量。
滤光片和分光镜
在一些实施例中，滤光器200a可以沿着光轴添加在照明系统中。滤光器200a可以是基本上透射激发光12的期望的波长并阻挡不想要的波长的清理滤光器。例如，滤光器200a可以具有范围为大约几纳米的窄通带，以阻挡来自光源110的噪声自发发射或者基本上降低背景噪声。
因为激发光12的强度可以比荧光18强几个数量级，所以由样品和/或样品保持器180反射和/或散射的激发光12可以进入检测系统并影响成像设备190检测或获取荧光。因此，如下所描述，本公开的实施例可以减少或阻挡激发光12传播到检测系统中。
在一些实施例中，分束器160可以用于阻挡激发光12向成像设备190传播。分束器160可以是基本上反射激发光12的波长并透射荧光18的至少一部分波长的长通二向色分束器。激发光12的光谱典型地在紫外到可见光谱的范围内，并且荧光18的光谱典型地在可见光到近红外光谱的范围内。因此，长通二向色分束器可以阻挡激发光12的波长并透射荧光18的波长范围。
可替代地或另外地，滤光器200b可以沿着光轴添加在检测系统中。滤光器200b可以是可以基本上反射激发光12的波长或窄光谱带的陷波滤波器，从而阻挡激发光12到达成像设备190。
在其他实施例中，当激发光12被线性偏振时，分束器160可以是偏振分束器(PBS)。可以选择PBS，使得其反射具有与线性偏振激发光的偏振方向相同的偏振方向的光，并且透射具有与偏振激发光的偏振方向垂直的偏振方向的光。因此，由物镜170收集的大部分激发光将从该PBS反射并且将不会到达成像设备190。在一些情况下，样品和物镜170两者都可以将反射或散射的激发光去极化到很小的程度，因此不期望地允许一些激发光透过PBS并进入检测系统。
成像设备
成像设备190可以包括合适的2-D传感器，其位于与样品中的选择的焦平面共轭的图像平面处。传感器可以用CMOS传感器、CCD传感器、硅雪崩光电二极管(SiliconAvalanche Photodiode，APD)的二维阵列或其他合适的类型的2-D传感器来实施。
成像设备190可以可操作地连接到控制器或控制其操作的计算设备(未显示)。例如，控制器(未显示)可以具有处理器和存储指令或操作步骤的一个或多个计算机可读介质。当该指令或操作步骤由处理器运行时，该指令或操作步骤可以操作成像设备190的曝光、获取2-D图像192、和/或将2-D图像192的数据集存储到存储器。计算机可读介质还可以存储当其由处理器运行时可以执行所获取的2-D图像数据集的数据处理和/或根据2-D图像数据集重建共焦图像和/或高光谱成像数据集的指令或操作步骤。
如本文所描述的系统100可以用于共焦和/或高光谱成像的各种方法中。
图3是用于执行共焦成像或用于获取样品的共焦图像的示例性方法400的流程图。方法400使用系统100和上面参考图1和2描述的系统100的实施例的特征。
在步骤402处，提供光源110并且光源110被配置为发射具有一个或多个波长的激发光10。在步骤404处，激发光10被透镜120a准直并变成准直的激发光12。在步骤406处，通过与由SLM 140的像素形成的预定的相位调制图案一起应用来构造或调制准直的激发光12。在步骤408处，将构造的激发光向样品引导并以二维激发图案照射样品。激发图案位于相位调制图案的傅里叶平面。在步骤410处，将从样品中的焦平面收集的发射光成像到成像设备190。焦平面能够与由SLM 150的像素形成的针孔图案的平面共轭或在针孔图案的共轭平面处。
方法400还可以包括附加步骤。例如，方法400可以包括在获取2-D图像192之前校准系统100。系统100中的各种光学组件可以被适当地校准和对准，使得能够获取具有减小的或最小的像差和/或失真的聚焦的2-D图像192。
方法400还可以包括使用色散元件210在横向方向上光谱色散从样品收集的荧光18。可以通过成像设备190在2-D图像192中获取光谱地色散的荧光22。
方法400还可以包括以一系列彼此横向移位的激发图案顺序地照射样品，以及形成与该一系列激发图案匹配的一系列针孔图案。
在一些实施例中，方法400还可以包括获得与一系列激发图案相对应的发射光20的多个2-D图像192，以及重建多个2-D图像192以提供共焦图像。如上所描述的，可以在激发图案的每次横向移位和激发图案的匹配的针孔图案的形成之后获取2-D图像192。每个2-D图像192可以记录与每个横向移位的激发图案相对应的荧光点302的阵列300。
在其他实施例中，方法400还可以包括获得与一系列激发图案相对应的光谱地色散的发射光22的多个2-D图像192，以及重建多个2-D图像192以提供高光谱共焦图像数据集。如上所描述的，可以在激发图案的每次横向移位和激发图案的匹配的针孔图案的形成之后获取光谱地色散的发射光的2-D图像192。每个2-D图像192可以记录与每个横向移位的激发图案相对应的荧光发射光谱312的阵列310。
已经出于说明的目的呈现了前面的描述。它并非是穷举的，并不限于所公开的精确形式或实施例。考虑到所公开实施例的说明书和实践，实施例的修改和调整将是显而易见的。例如，所描述的实施包括硬件和软件，但是与本公开一致的系统和方法能够仅被实施为硬件。另外，虽然某些组件已经被描述为彼此耦合，但是这样的组件可以彼此集成或以任何合适的方式分布。
此外，虽然本文已经描述了说明性实施例，但是范围包括具有基于本公开的等效元素、修改、省略、组合(例如，跨各种实施例的方面的组合)、调整和/或变更的任何和所有实施例。权利要求中的元素将基于权利要求中采用的语言进行广义解释，并且不限于本说明书中或在本申请的审查期间描述的示例，这些示例应被解释为非排他性的。此外，能够以任何方式修改所公开方法的步骤，包括重新排序步骤和/或插入或删除步骤。
由计算机可读介质存储的指令或操作步骤可以是计算机程序、程序模块或代码的形式。如本文所描述，基于本说明书的书面描述的计算机程序、程序模块和代码，诸如由控制器使用的那些，容易在软件开发者的范围内。能够使用各种编程技术来创建计算机程序、程序模块或代码。例如，它们能够借助于Java、C、C++、汇编语言或任何这样的编程语言来设计。能够将一个或多个这样的程序、模块或代码集成到设备系统或现有通信软件中。程序、模块或代码也能够被实施或被复制为固件或电路逻辑。
根据详细说明书，本公开的特征和优点是显而易见的，因此，所附权利要求旨在覆盖落入本公开的真实精神和范围内的所有系统和方法。如本文所使用的，不定冠词“一”和“一个”表示“一个或多个”。类似地，除非在给定的上下文中是明确的，否则复数词的使用不一定表示多个。除非另外特别指出，否则诸如“和”或“或”的词语表示“和/或”。此外，由于从研究本公开中将容易地发生许多修改和变化，因此不期望将本公开限制于所示出和所描述的确切构造和操作，并且因此，所有合适的修改和等同物可以诉诸于、落入本公开的范围。
考虑到本文公开的实施例的说明书和实践，其他实施例将是显而易见的。其旨在本说明书和实施例被认为仅作为示例，所公开的实施例的真实范围和精神由所附权利要求指示。

Claims (19)

1.一种共焦成像系统，包括：
光源，被配置为发射具有一个或多个波长的激发光；
样品保持器，被配置为保持样品；
二维成像设备；和
光学系统，包括：
第一空间光调制器SLM；
第二SLM；和
色散元件；
其中，所述光学系统被配置为(i)准直激发光；(ii)使用所述第一SLM将预定的相位调制图案应用于准直的激发光；(iii)使用相位调制的准直的激发光作为激发图案来照射样品，其中所述激发图案位于相对于样品内的焦平面的傅里叶平面处；(iv)从样品内的焦平面收集发射光；(v)经由所述第二SLM将收集的发射光向所述成像设备引导，使得样品内的焦平面与由所述第二SLM的像素形成的针孔图案的平面共轭；以及(vi)在收集的发射光到达成像设备之前使用色散元件光谱色散收集的发射光；
其中，共焦成像系统被配置为使用成像设备获得光谱色散的发射光的多个图像；以及重建所述多个图像以提供样品的高光谱共焦图像数据集。
2.根据权利要求1所述的系统，还包括物镜，其中所述物镜将已经与所述第一SLM交互的激发光聚焦到样品内的焦平面上，以及准直从样品内的焦平面收集的发射光。
3.根据权利要求2所述的系统，其中所述光学系统还包括一个或多个中继透镜，其中所述一个或多个中继透镜将相位调制图案成像到所述物镜的后孔上。
4.根据权利要求3所述的系统，其中所述光学系统还包括放置在所述一个或多个中继透镜中的两个中继透镜之间的光束转储器，使得所述光束转储器吸收已经与所述第一SLM交互的激发光中的低阶衍射最大值。
5.根据权利要求1所述的系统，其中所述光学系统还包括光学分束器，其中所述光学分束器将已经与所述第一SLM交互的激发光向样品引导，以及将发射光从样品透射到所述第二SLM。
6.根据权利要求1所述的系统，其中所述光学系统还包括半波片，其中所述半波片改变激发光的偏振方向。
7.根据权利要求1所述的系统，其中所述第一SLM包括液晶设备LCD或硅基液晶LCOS设备中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的系统，其中所述第二SLM包括数字微镜设备DMD、液晶设备LCD或硅基液晶LCOS设备中的至少一个。
9.根据权利要求1所述的系统，其中所述光学系统还包括一个或多个管透镜，其中所述一个或多个管透镜将所述第二SLM的针孔图案成像到所述成像设备。
10.根据权利要求9所述的系统，其中所述色散元件被放置在一对管透镜之间。
11.根据权利要求1所述的系统，还包括控制器，其可操作地耦合到所述第一SLM、所述第二SLM、所述光源和所述成像设备，其中所述控制器被配置为调制所述第一SLM和第二SLM的像素、操作所述光源、以及操作所述成像设备。
12.根据权利要求1所述的系统，其中所述激发图案包括多个激发点。
13.一种获得共焦图像的方法，包括：
从光源提供具有一个或多个波长的激发光；
准直来自所述光源的激发光；
由第一空间光调制器SLM将预定的相位调制图案应用于准直的激发光；
使用所述相位调制的准直的激发光作为二维激发图案来照射样品；
从所述样品内的焦平面收集发射光；
经由第二SLM将收集的发射光向成像设备引导，使得所述样品内的焦平面与由所述第二SLM的像素形成的针孔图案的平面共轭；
在收集的发射光到达成像设备之前，使用色散元件光谱色散收集的发射光；
使用成像设备获得光谱色散的发射光的多个图像；以及
重建所述多个图像以提供所述样品的高光谱共焦图像数据集。
14.根据权利要求13所述的方法，还包括使用半波片控制激发光的偏振。
15.根据权利要求13所述的方法，还包括：
使用物镜将已经与所述第一SLM交互的准直的激发光聚焦到所述样品内的焦平面上；以及
使用一个或多个中继透镜将所述相位调制图案成像到所述物镜的后孔上。
16.根据权利要求15所述的方法，还包括：使用放置在所述一个或多个中继透镜中的两个中继透镜之间的光束转储器来吸收已经与所述第一SLM交互的激发光中的低阶衍射最大值。
17.根据权利要求13所述的方法，还包括使用一个或多个管透镜将所述第二SLM的针孔图案成像到所述成像设备。
18.根据权利要求17所述的方法，还包括：
以彼此移位的一系列激发图案顺序地照射样品；以及
用所述第二SLM形成一系列针孔图案，其中所述一系列针孔图案中的每个针孔图案与所述一系列激发图案中的相应的激发图案匹配。
19.根据权利要求18所述的方法，
其中所述多个图像中的每个图像与所述一系列激发图案中的激发图案相对应。
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110044481B (zh) * 2019-04-11 2020-06-16 南昌大学 一种压缩高光谱显微成像的系统及方法
CN110383040A (zh) * 2019-05-17 2019-10-25 香港应用科技研究院有限公司 一种检测目标物体的色差共焦系统和方法
CN110989313B (zh) * 2019-11-18 2021-10-01 中国科学技术大学 全息显微成像装置
CN111208633B (zh) * 2020-01-09 2020-10-23 华中科技大学 一种色散共焦显微镜的特性参量的优化方法
DE102020108117B4 (de) * 2020-03-24 2023-06-15 Evident Technology Center Europe Gmbh Mikroskop und Verfahren zum Betreiben eines Mikroskops
US11543640B2 (en) * 2020-04-21 2023-01-03 Laxco Incorporated Confocal optical system and components thereof
CN111538164B (zh) * 2020-07-09 2020-10-20 之江实验室 一种基于数字微镜器件的空心光斑阵列并行调控装置
CN114088006A (zh) * 2020-08-24 2022-02-25 陈亮嘉 共焦显微系统及其光学照明装置
CN111913294A (zh) * 2020-09-07 2020-11-10 中国工程物理研究院机械制造工艺研究所 一种非机械扫描的结构光显微三维成像装置及成像方法
CN113218926B (zh) * 2021-05-17 2023-06-20 北京京东方技术开发有限公司 一种光调制组件、荧光显微镜及芯片检测系统及方法
CN114137713B (zh) * 2021-11-17 2022-11-25 华中科技大学 无标记厚样本的实时定量相位成像方法和系统
CN114353947B (zh) * 2022-01-05 2024-01-26 南开大学 一种基于光场成像的显微拉曼光谱仪
CN114485937A (zh) * 2022-01-19 2022-05-13 浙江微翰科技有限公司 基于mems的高光谱系统及光谱仪

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103411941A (zh) * 2013-08-21 2013-11-27 北京信息科技大学 基于高级次轴对称偏振光的并行共焦显微成像方法及装置
WO2015178338A1 (ja) * 2014-05-21 2015-11-26 浜松ホトニクス株式会社 顕微鏡装置及び画像取得方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120307247A1 (en) * 2011-05-31 2012-12-06 Nanyang Technological University Fluorescence Microscopy Method And System
CN102354046A (zh) * 2011-07-04 2012-02-15 上海理工大学 一种多路频分复用荧光共焦显微成像技术实现方法
US9599805B2 (en) * 2011-10-19 2017-03-21 National Synchrotron Radiation Research Center Optical imaging system using structured illumination
US10539786B2 (en) * 2016-05-27 2020-01-21 Verily Life Sciences Llc Rotatable prisms for controlling dispersion magnitude and orientation and methods of use

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103411941A (zh) * 2013-08-21 2013-11-27 北京信息科技大学 基于高级次轴对称偏振光的并行共焦显微成像方法及装置
WO2015178338A1 (ja) * 2014-05-21 2015-11-26 浜松ホトニクス株式会社 顕微鏡装置及び画像取得方法

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