CN113670877B - 用于高通量数字pcr检测的斜置上顶式高斯光片成像系统 - Google Patents

用于高通量数字pcr检测的斜置上顶式高斯光片成像系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其特征在于，包括斜置上顶式高斯光片成像装置、载样器、以及运动机构；所述载样器用于承载多根PCR管至所述斜置上顶式高斯光片成像装置的斜置上顶式样品腔室中，所述多根PCR管呈阵列排布；所述运动机构与载样器相连，用于带动载样器进行按照非直线运动轨迹运动,使得载样器的多根PCR管依次经过高斯光片成像。本发明提供的用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其通过阵列排布的PCR管载样器，采用二维载样实现载样能力数倍的提升。配合载样器的非直线的运动轨迹，降维为一维，依次完成立体成像。本发明极大的提高了数字PCR检测的通量。

Description

用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统
技术领域
本发明属于生物医学显微成像系统领域，更具体地，涉及用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统。
背景技术
聚合酶链式扩增反应(PCR)技术可以实现对目标核酸扩增与信号放大，是分子诊断的重要手段之一。目前商业化的PCR检测技术有液滴数字PCR(Droplet Digital PCR)检测，该技术能够实现核酸分子的绝对定量，是精准医疗的基础支撑性技术手段。因此，液滴数字聚合酶链式反应(ddPCR)广泛应用于需要对极其微量的核酸进行检测的领域，如对早期微量致病基因的检测——癌症分析，炎症临床诊断；在食品监测，胎儿染色体非整倍体无创产前检测等常规诊断工作中也发挥巨大作用，除此之外，ddPCR还能实现在单细胞测序，生物多样性基因分析等极低拷贝数下的痕量分析。
ddPCR技术首先需要制备ddPCR反应体系，将DNA/RNA样品、引物、荧光探针等反应物体系配制混合，约20ul。再将反应体系加入液滴发生器芯片小孔中，用微流控技术产生约2万个液滴，此时目标核酸与背景核酸随机分布于微滴中。再将微滴转入PCR扩增仪中，各微滴中的核酸经PCR扩增至终点。最后需要对微滴中的荧光信号进行分析，对亮的荧光进行计数，根据亮暗比例并结合泊松分布原理最终得出目标DNA/RNA的浓度。但这反应体系转移以及扩增后液滴检测的过程都会存在污染和损耗，降低了检测的准确性。
北京大学2020年发表在PNAS上的一篇文章提出了一种透明化数字PCR技术(CLEAR-dPCR)，在反应物体系制备阶段通过折射率匹配液即添加一定浓度的甜菜碱溶液使得水相和油相折射率接近相同，通过使用微细管阵列(MiCA)高速离心生成液滴，使用水平放置的光片荧光显微成像系统对单个离心管中的液滴进行三维成像计数定量分析。该技术由于将反应体系的配置，液滴生成过程，PCR扩增过程以及荧光检测过程都在同一个PCR管中完成，因此避免了ddPCR技术中存在的液滴损耗和污染问题，具有更高的检测精度，同时提高了检测速度。然而该系统只能实现对单管中的荧光信号进行检测,效率低下,上样繁琐。此外，由于照明光路和探测光路需要正交，而CLEAR-dPCR技术将照明光路和探测光路布设在XY平面内，由于光源还需要布设在XY平面内运动机构带动形成扫描，整体布局非常局促，PCR管无法批量的通过检测位置，只能检测单管。如果PCR管并排通过检测光路，则对多个PCR管进行光片照明和宽场探测时会存在串扰，即相邻的两个PCR管会被同时照明同时探测。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，为了进一步提高检测通量，对多个核酸样本进行荧光检测，本发明提供了一种用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，采用斜置上顶式的荧光显微成像系统，其利用与水平面倾斜的照明和探测方式形成斜置上顶式高斯光片成像系统，配合载样器的非直线运动轨迹，实现对多个PCR管中的液滴进行成像，无需对单个液滴进行转移信号分析。斜置上顶式的高斯光片成像系统与传统躺式高斯光片成像系统相比，本发明使用的斜置上顶式结构为PCR管高通量扫描成像提供了更开阔更方便的物理操作空间，方便多样本的安装与阵列扫描。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其特征在于，包括斜置上顶式高斯光片成像装置、载样器、以及运动机构；
所述载样器用于承载多根PCR管至所述斜置上顶式高斯光片成像装置的斜置上顶式样品腔室中，所述多根PCR管呈阵列排布；
所述运动机构与载样器相连，用于带动载样器进行按照非直线运动轨迹运动,使得载样器的多根PCR管依次经过高斯光片成像。
优选地，所述用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其所述运动机构包括旋转平台和/或多轴运动平台。
优选地，所述用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其使得单个PCR管经过高斯光片的运动行程中其运动轨迹与所述高斯光片的角度始终保持不变。
优选地，所述用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其直线段运动轨迹上相邻PCR管之间的间距D应该使得同一时刻仅有唯一PCR管处于所述斜置的荧光显微成像装置的焦平面内，且同一时刻所述斜置上顶式的荧光显微成像装置的视野内仅有唯一PCR管；
优选直线段运动轨迹上相邻PCR管之间的间距D满足：
D＝h+d/2
其中，d为液滴在PCR管中近似直径，h为液滴在PCR管中近似高度。
优选地，所述用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其所述载样器包括载样板和中轴，载样板上具有载样孔；中轴的一端与载样板连接而另一端与连接板连接，连接板安装在运动机构上；
所述载样板具有多条直边或具有圆形边缘的平板，其直边上或圆形边缘布设有多个与PCR管配合的载样孔，载样孔所装在的PCR管浸没于注满折射率匹配液的样品腔室中；载样板的几何中心具有中轴；
所述运动机构带动装载于载样孔中的PCR管在XY平面内旋转或平移运动，使得所述多个PCR管依次经过所述斜置的荧光显微成像装置的焦平面；所述载样孔之间具有间距D。
优选地，所述用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其所述载样板为多边形；
所述运动机构可带动载样器在XY平面内移动，使得所述载样器上加载的多个PCR管依次经过所述斜置的荧光显微成像装置的焦平面；
运动机构采用三轴运动平台，XY平面内载样器的运动轨迹为折线；当单个PCR管经过高斯光片的运动行程中其运动轨迹与多个PCR管的排列重合时，载样器运动轨迹呈直线，当单个PCR管经过高斯光片的运动行程中其运动轨迹与多个PCR管的排列成交角时，载样器的运动轨迹为锯齿形。
优选地，所述用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其所述载样板为圆形，其边缘沿圆周设置多个载样孔；
运动机构采用旋转平台，所述旋转平台带动载样器旋转，使得所述圆周边缘上的多个PCR管依次经过所述斜置的荧光显微成像装置的焦平面。
优选地，所述用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其所述载样板为多边形；
运动机构采用旋转平台运动机构包括多轴运动平台和旋转平台，旋转平台安装在多轴运动平台上，旋转平台可在多轴运动平台的带动下移动，所述中轴安装在旋转平台上，在旋转平台的带动下旋转；所述旋转平台和中轴带动载样器旋转，使得其中一条直边处于位移路径上，所述运动机构带动所述载样器在XY平面内水平移动，使得所述直边上的多个PCR管依次经过所述斜置的荧光显微成像装置的焦平面。
优选地，所述用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其斜置上顶式高斯光片成像装置，包括：
高斯光束生成单元，用于生成准直的高斯光束；
高斯光片产生及照明单元，位于所述高斯光束生成单元的输出光路上；用于对高斯光束进行整形和压缩形成静态高斯光片，并将高斯光片倾斜入射至水平放置的样品腔中；
探测单元，与所述高斯光片产生及照明单元正交，且所述照明单元和探测单元均相对于水平面倾斜，所述探测单元用于探测样品发出的荧光；
成像单元，位于探测单元的输出光路上，用于生成像差减小的荧光图像；
样品腔室，为斜置上顶式样品腔室，用于对成像样品提供折射率匹配环境，减小成像像差。
优选地，所述用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其所述样品腔室可设计为上部开放型；优选，所述样品腔室是等腰直角三棱柱和两底均为正方形的长方体构成，三棱柱面积较大的侧面与长方形底面重合，保持多面体外形，腔室厚度1.5-3mm，其余部分中空；三棱柱的两个侧面和一个底面分别开有一个窗口，侧面的方形窗口用来透过光片，圆形窗口用来透过荧光，底面的圆形窗口用来观察实验，三个窗口都通过硅胶将盖玻片固定在窗口上，以形成一个可以从上方加样品及折射率匹配液的样品腔。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有益效果：
本发明提供的用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其通过阵列排布的PCR管载样器，突破一维载样能力限制，采用二维载样实现载样能力数倍的提升。而这种突破性的二维载样设计，必须配合载样器的非直线的运动轨迹，使载样器二维阵列排布的PCR管，降维为一维PCR管排列，依次经过高斯光片，完成立体成像。本发明极大的提高了数字PCR检测的通量，由目前的单独检测提升为高通量检测。
附图说明
图1为本发明的结构布置示意图；
图2A为不添加光阑的探测光路的惠更斯点扩散函数的灰度图。
图2B为缩小光阑光圈后的探测光路的惠更斯点扩散函数的灰度图。
图3为本发明中样品腔室的剖面示意图；
图4a～图4c分别为本发明中连接板、中轴和载样器的示意图；
图5为本发明的三维立体示意图；
图6为多个PCR管在样品腔室内的布置示意图；
图7A为本发明实施例的载样器样品示意图；
图7B为本发明实施例的载样器轨迹示意图；
图8为本发明实施例的载样器样品及轨迹示意图；
图9为本发明实施例的载样器轨迹示意图。
在所有附图中，相同的附图标记用来表示相同的元件或结构，其中：
1-高斯光束生成单元、11为激光光源、、12-光纤头、13-准直器、2-高斯光片产生及照明单元、21-狭缝、22-第一柱透镜、23-非球面透镜、24-第二柱透镜、25-第三柱透镜、3-样品腔室、4-探测单元、41为探测物镜、42为光阑、43为套筒透镜、5-滤色片、6-成像单元、7-运动单元、8-样品夹持单元、9-载样器。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
参照图1，用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统包括：
斜置上顶式高斯光片成像装置，包括：
高斯光束生成单元，用于生成准直的高斯光束；沿光路传输方向，高斯光束产生单元依次包括激光光源，光纤头和准直器。激光光源用于生成高斯光束，高斯光束经光纤头到达准直器，准直器用于对高斯光束进行准直。
高斯光片产生及照明单元，位于所述高斯光束生成单元的输出光路上，包括沿光路方向依次布置的狭缝、第一柱透镜、非球面透镜、第二柱透镜和第三柱透镜，对高斯光束进行整形和压缩形成静态高斯光片，并将高斯光片倾斜入射至水平放置的样品腔中；高斯光片产生及照明单元中光束依次经过狭缝和第一柱透镜，焦距为20mm，非球面透镜，焦距为8mm，第二柱透镜，焦距为19mm，第三柱透镜，焦距为50mm。整个照明端尺寸长度在200mm左右。
探测单元，与所述高斯光片产生及照明单元正交，且所述照明单元和探测单元均相对于水平面倾斜，所述探测单元用于探测样品发出的荧光，探测单元中的光阑用于调节成像质量；沿光路方向，探测单元依次包括探测物镜、光阑和套筒透镜。探测物镜为长工作距离的4倍物镜，其焦距为45mm，数值孔径为0.28，因为光阑光圈大小可调，系统的有效数值孔径由光圈和物镜共同决定。PCR管中的液滴受高斯光片激发产生的荧光经过探测物镜收集，光阑滤除大像差的光线，套筒透镜(焦距为100mm)的无限远矫正后传输至滤色片，最后成像在成像单元的相机图像传感器内。探测光路尺寸在250mm左右，整个系统搭建在一个300mm*450mm的面包板上，系统结构紧凑小巧，实现PCR高通量高精度成像。
成像单元，位于探测单元的输出光路上，用于生成像差减小的荧光图像。
高斯光片产生及照明单元和探测单元相对于水平面倾斜的倾斜角度的组合为(30°，60°)、(45°，45°)或(60°，30°)。照明单元和探测单元相对于水平面倾斜的倾斜角度分别是指第三柱透镜和探测物镜相对于水平面倾斜的倾斜角度。以45°倾斜角度为例，扫描成像后的三维图像堆栈需要经过45°坐标矫正以还原成实际三维图像栈，从而进行后续图像处理与分析。
样品腔室，为斜置上顶式样品腔室，用于对成像样品提供折射率匹配环境，减小成像像差，所述样品为装有荧光液滴的PCR管，样品在生成的高斯光片的激发下产生荧光；样品腔室中充满折射率匹配液，PCR管浸没在折射率匹配液中，避免三维扫描成像过程中因虚焦造成成像模糊，丢失成像信息。样品腔室的尺寸设计综合考虑了探测物镜和需要的成像深度需求，确保以合适的尺寸放置在光路中，实现PCR管的扫描且不会干扰探测。
载样器，用于承载多根PCR管至所述斜置上顶式高斯光片成像装置的斜置上顶式样品腔室中，所述多根PCR管呈阵列排布；
运动机构，与载样器相连，用于带动载样器进行按照非直线运动轨迹运动,使得载样器的多根PCR管依次经过高斯光片成像,优选使得单个PCR管经过高斯光片的运动行程中其运动轨迹与所述高斯光片的角度始终保持不变；所述运动机构包括旋转平台和/或多轴运动平台。载样器的非直线运动轨迹,与成平直的运动轨迹相区别，不是呈一条直线的位移，可为折线或弧线运动轨迹。
高斯光片产生及照明单元的狭缝用于在形成光片的维度控制高斯光束的厚度最终影响高斯光片的厚度和瑞利范围，使其符合对PCR管的成像需求，第一柱透镜和非球面透镜用于在高斯光片产生维度压缩高斯光束厚度，非球面透镜与第二柱透镜用于扩展与上述光片维度方向垂直维度的尺寸，第三柱透镜用于对整形的高斯光束进行聚焦生成高斯光片。高斯光片斜入射到水平放置的样品腔室中。样品腔室中装有折射率匹配液，由于对PCR管中液滴成像，其成像深度的比一般光片显微成像深度多了一个数量级，需要充分考虑探测物镜的工作距离以及物镜尺寸，样品腔室的设计需要准确计算。载样器用于承载PCR管阵列，在运动机构的带动下实现对PCR管的扫描。
探测单元与高斯光片产生及照明单元正交，且均相对于水平面倾斜，探测单元用于探测PCR管中的荧光液滴，探测单元中的光阑调整光圈大小可以减小成像像差，使PCR检测计数结果更加准确。由此，斜置上顶式静态高斯光片系统可以对多个PCR管中的荧光液滴进行成像，成像结果通过电脑定制程序进行计数分析即可得出荧光液滴数量，该检测计数过程不需要将液滴进行转移，避免了污染和损耗，同时极大提高了液滴计数的速度。且阵列PCR管的设计提高了成像通量，解决了生物医学上的实际问题。
参照图4a～图4c，所述载样器包括载样板和中轴，载样板上具有载样孔，其尺寸根据PCR管大小设计。中轴的一端与载样板连接而另一端与连接板连接，优选螺栓或螺纹连接，连接板安装在运动机构上。所述载样板具有多条直边或具有圆形边缘的平板，其直边上或圆形边缘(也可以多层布置)布设有多个与PCR管配合的载样孔，载样孔所装在的PCR管浸没于注满折射率匹配液的样品腔室中；载样板的几何中心具有中轴；所述中轴与运动机构相连，带动装载于载样孔中的PCR管在XY平面(水平面)内旋转或平移运动，使得所述多个PCR管依次经过所述斜置的荧光显微成像装置的焦平面；所述载样孔之间具有间距D，使得同一时刻仅有唯一PCR管处于所述斜置的荧光显微成像装置的焦平面内，且同一时刻所述斜置上顶式的荧光显微成像装置的视野内仅有唯一PCR管。
不同于普通的显微成像样品，PCR管体积远大于普通的显微成像样品，需要通过高斯光片扫描立体呈现；而采用斜上顶的设计，高斯光片与PCR管呈斜交，相对正交的设计，为了防止PCR管之间的串扰，相邻PCR管之间的距离需要增加。然而样品腔室的体积有限，高斯光片与PCR管的斜交设计降低了检测通量。为了提高检测通量，增加载样器可加载的PCR管数量，有别于传统的线性样品排布，我们设计了全新的PCR管阵列排布，突破一维载样能力限制，采用二维载样实现载样能力数倍的提升。而这种突破性的二维载样设计，必须配合载样器的非直线的运动轨迹，使载样器二维阵列排布的PCR管，降维为一维PCR管排列，依次经过高斯光片，依次完成立体成像。进一步的，由于现有的图像对准以及堆叠算法，适用于二维图像维持同一成像角度，为了更好的兼容现有的图像对准以及图像堆叠算法，单个PCR管经过高斯光片的运动行程中其运动轨迹与所述高斯光片的角度始终保持不变，避免单个PCR管经过高斯光片的过程出现弧线、折线轨迹导致三维成像的软件算法部分复杂度增加。
作为本发明的优选方案之一，所述载样板为多边形，优选为正多边形，例如正方形；中轴与运动机构相连，所述运动机构可带动载样器在XY平面内移动，使得所述载样器上加载的多个PCR管依次经过所述斜置的荧光显微成像装置的焦平面。该方案中，XY平面内载样器的运动轨迹为折线，相比于直线运动轨迹，能有效减少样品腔室的体积，提高检测通量(检测的PCR管的数量)。
该方案下，运动机构可采用三轴运动平台，三轴运动平台可带动载样器沿Z轴上下移动来使PCR管更好地适应高斯光片的位置，以及在XY平面内沿X轴、Y轴水平移动，来使高斯光片照射在单个的PCR管上及使PCR管位于荧光显微成像装置的焦平面上。然后通过三轴运动平台带动载样器在XY平面内移动到设定位置后暂停，该设定位置使其中一个的PCR管停留在荧光显微成像装置的焦平面(同时也在高斯光片照射路径上)，完成对此PCR管的照射和成像。重复上述过程，可完成对载样器上的所有的PCR管的检测。当然，如果PCR管在载样器上的高度能适应高斯光片的照射和荧光显微成像装置的成像，如不需要调整PCR管的高度，也可让运动机构采用XY运动平台，使得载样器只在XY面(水平面)内移动。具体而言，该方案中，当单个PCR管经过高斯光片的运动行程中其运动轨迹与多个PCR管的排列重合时，载样器运动轨迹呈直线，当单个PCR管经过高斯光片的运动行程中其运动轨迹与多个PCR管的排列成交角时，载样器的运动轨迹为锯齿形。以3X3的正方形8孔载样器，样品编号如图7A所示，为例，运动轨迹如图7B所示，其中轨迹分段标号为相应样品经过高斯光片的轨迹。
作为本发明的优选方案之一，所述载样板为圆形，其边缘沿圆周设置多个载样孔；中轴与旋转平台相连，所述旋转平台带动载样器旋转，使得所述圆周边缘上的多个PCR管依次经过所述斜置的荧光显微成像装置的焦平面，轨迹如图8所示。该方案中，XY平面内载样器定点旋转，样品腔室体积压缩效果明显，运动控制最为方便简单，然而由于PCR管经过焦平面的路径不是直线，因此不能适用现有的三维图像算法。旋转平台可采用现有的驱动结构，譬如电机、伺服减速器等驱动。旋转平台带动载样器在XY平面内旋转到设定位置后暂停，该设定位置使其中一个的PCR管停留在荧光显微成像装置的焦平面(同时也在高斯光片照射路径上)，完成对此PCR管的照射和成像。重复上述过程，可完成对载样器上的所有的PCR管的检测。
作为本发明的优选方案之一，所述载样板为多边形，优选为正多边形例如正方形；运动机构采用旋转平台运动机构包括多轴运动平台和旋转平台，旋转平台安装在多轴运动平台上，旋转平台可在多轴运动平台的带动下移动，所述中轴安装在旋转平台上，可在旋转平台的带动下旋转。所述旋转平台和中轴带动载样器旋转，使得其中一条直边处于位移路径上，所述运动机构带动所述载样器在XY平面内水平移动，轨迹如图9所示，使得所述直边上的多个PCR管依次经过所述斜置的荧光显微成像装置的焦平面，对PCR管的具体检测过程可参考上文。该方案中，XY平面内的运动轨迹为往返直线，在有效减少样品腔室的体积、提高检测通量、适应现有的成像算法的前提下，同时简化了运动控制。
所述斜置荧光显微成像装置，其焦平面与水平面呈角度α。
参照图6，两个PCR管之间最小间隔20ul液滴在PCR管中近似为直径为d＝5mm，高度为h＝7.5mm的圆柱体。
高斯光片以45°斜入射，实际成像过程中，高斯光片位置保持不动(图6中两虚线之间的实线表示高斯光片)，物镜的焦平面也是高斯光片所在平面，也保持不动。PCR管在运动机构的控制下左右扫描，等效为高斯光片在两虚线位置间扫描，如图6，对于任意相邻的两根PCR管，譬如PCR管A和PCR管B，当上方虚线扫描到PCR管B的最上端时(即实际过程中，PCR管B运动到能够成像的最右端)，PCR管A理论上不能被光片照射到，因此直线段运动轨迹上相邻PCR管A和PCR管B之间的间距D应该满足：D＝h+d/2，其中，d为液滴在PCR管中近似直径，h为液滴在PCR管中近似高度。
所述斜置荧光显微成像装置为斜置上顶式的荧光显微成像装置，中轴与其上方的运动机构相连，如此样品腔室可设计为上部开放型，加载PCR管和灌注折射率匹配液更为方便。参照图3，样品腔室是等腰直角三棱柱和两底均为正方形的长方体构成，三棱柱面积较大的侧面与长方形底面重合，保持多面体外形，腔室厚度1.5-3mm，其余部分中空。三棱柱的两个侧面和一个底面分别开有一个窗口，侧面的方形窗口用来透过光片，圆形窗口用来透过荧光，底面的圆形窗口用来观察实验，三个窗口都通过硅胶将盖玻片固定在窗口上，以形成一个可以从上方加样品及折射率匹配液的样品腔。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其特征在于，包括斜置上顶式高斯光片成像装置、载样器、以及运动机构；
所述载样器用于承载多根PCR管至所述斜置上顶式高斯光片成像装置的斜置上顶式样品腔室中，所述多根PCR管呈阵列排布；
所述运动机构与载样器相连，用于带动载样器进行按照非直线运动轨迹运动,使得载样器的多根PCR管依次经过高斯光片成像。
所述斜置上顶式高斯光片成像装置，包括：
高斯光束生成单元，用于生成准直的高斯光束；
高斯光片产生及照明单元，位于所述高斯光束生成单元的输出光路上；用于对高斯光束进行整形和压缩形成静态高斯光片，并将高斯光片倾斜入射至水平放置的样品腔中；
探测单元，与所述高斯光片产生及照明单元正交，且所述照明单元和探测单元均相对于水平面倾斜，所述探测单元用于探测样品发出的荧光；
成像单元，位于探测单元的输出光路上，用于生成像差减小的荧光图像；
样品腔室，为斜置上顶式样品腔室，用于对成像样品提供折射率匹配环境，减小成像像差。
2.如权利要求1所述的用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其特征在于，所述运动机构包括旋转平台和/或多轴运动平台。
3.如权利要求1所述的用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其特征在于，使得单个PCR管经过高斯光片的运动行程中其运动轨迹与所述高斯光片的角度始终保持不变。
4.如权利要求1所述的用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其特征在于，直线段运动轨迹上相邻PCR管之间的间距D应该使得同一时刻仅有唯一PCR管处于所述斜置的荧光显微成像装置的焦平面内，且同一时刻所述斜置上顶式的荧光显微成像装置的视野内仅有唯一PCR管。
5.如权利要求1所述的用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其特征在于，高斯光片产生及照明单元和探测单元相对于水平面倾斜的倾斜角度的组合为45°以及45°；
直线段运动轨迹上相邻PCR管之间的间距D满足：
D＝h+d/2
其中，d为液滴在PCR管中近似直径，h为液滴在PCR管中近似高度。
6.如权利要求1所述的用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其特征在于，所述载样器包括载样板和中轴，载样板上具有载样孔；中轴的一端与载样板连接而另一端与连接板连接，连接板安装在运动机构上；
所述载样板具有多条直边或具有圆形边缘的平板，其直边上或圆形边缘布设有多个与PCR管配合的载样孔，载样孔所装在的PCR管浸没于注满折射率匹配液的样品腔室中；载样板的几何中心具有中轴；
所述运动机构带动装载于载样孔中的PCR管在XY平面内旋转或平移运动，使得所述多个PCR管依次经过所述斜置的荧光显微成像装置的焦平面；所述载样孔之间具有间距D。
7.如权利要求6所述的用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其特征在于，所述载样板为多边形；
所述运动机构可带动载样器在XY平面内移动，使得所述载样器上加载的多个PCR管依次经过所述斜置的荧光显微成像装置的焦平面；
运动机构采用三轴运动平台，XY平面内载样器的运动轨迹为折线；当单个PCR管经过高斯光片的运动行程中其运动轨迹与多个PCR管的排列重合时，载样器运动轨迹呈直线，当单个PCR管经过高斯光片的运动行程中其运动轨迹与多个PCR管的排列成交角时，载样器的运动轨迹为锯齿形。
8.如权利要求6所述的用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其特征在于，所述载样板为圆形，其边缘沿圆周设置多个载样孔；
运动机构采用旋转平台，所述旋转平台带动载样器旋转，使得所述圆周边缘上的多个PCR管依次经过所述斜置的荧光显微成像装置的焦平面。
9.如权利要求6所述的用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其特征在于，所述载样板为多边形；
运动机构采用旋转平台运动机构包括多轴运动平台和旋转平台，旋转平台安装在多轴运动平台上，旋转平台可在多轴运动平台的带动下移动，所述中轴安装在旋转平台上，在旋转平台的带动下旋转；所述旋转平台和中轴带动载样器旋转，使得其中一条直边处于位移路径上，所述运动机构带动所述载样器在XY平面内水平移动，使得所述直边上的多个PCR管依次经过所述斜置的荧光显微成像装置的焦平面。
10.如权利要求1所述的用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其特征在于，所述样品腔室可设计为上部开放型。
11.如权利要求1所述的用于高通量数字PCR检测的斜置上顶式高斯光片成像系统，其特征在于，所述样品腔室是等腰直角三棱柱和两底均为正方形的长方体构成，三棱柱面积较大的侧面与长方形底面重合，保持多面体外形，腔室厚度1.5-3mm，其余部分中空；三棱柱的两个侧面和一个底面分别开有一个窗口，侧面的方形窗口用来透过光片，圆形窗口用来透过荧光，底面的圆形窗口用来观察实验，三个窗口都通过硅胶将盖玻片固定在窗口上，以形成一个可以从上方加样品及折射率匹配液的样品腔。
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