CN111378562A - 数字pcr检测定量系统 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种数字PCR检测定量系统，包括快速生成大量微液滴的液滴生成装置、微泵装置、微管道、液滴温度循环装置、光学成像与检测装置和控制器。液滴温度循环装置对位于液滴生成装置内的微液滴或位于管道内非预设位置处的微液滴进行温度循环以完成PCR扩增，然后利用微泵装置将完成PCR扩增的微液滴抽回到管道预设位置处，以利用安装至管道预设位置处的光学成像与检测装置对该位置处的微液滴进行荧光信号采集并绘制相应散点图以计算原菌液样本的模板数量；控制器控制流体运动的流动速度和流动方向、液滴温度循环装置的温度升降和光学成像与检测装置的工作状态。本申请实现了数字PCR的便携化，制备了光机电一体化、且全自动化工作流程的数字PCR系统。

Description

数字PCR检测定量系统

技术领域

本申请涉及数字聚合酶链式反应技术领域，特别是涉及一种数字PCR检测定量系统。

背景技术

PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)为一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，通过模拟天然DNA分子的复制过程可将微量的DNA在生物体外大幅增加；从而可将原来低于检测线目标基因扩增到可以分析的级别以进行定性分析，该技术操作简单，灵敏度高，被广泛应用于多种病原微生物及寄生虫的检测。

数字PCR为当今最先进、检测灵敏度最高的核酸定量方法，相关技术中的数字PCR方法，在液滴制备、液滴PCR与液滴分析这3个关键单元操作依赖多个体积庞大的设备，整个系统不仅体积庞大、重量重，而且能耗高，无法实现数字PCR的便携化，远达不到世界卫生组织定义的“理想型PCR诊断”标准。以商品化的Bio-Rad QX200数字PCR仪举例，其系统由液滴生成器、温度循环扩增仪与荧光检测器3个单元仪器构成，该系统的总长度、宽度与高度分别达到1.34m，1.27m与0.62m。

鉴于此，如何实现数字PCR的便携化，制备体积小、重量轻、易于携带的数字PCR系统，是所属技术领域人员需要解决的技术问题。

发明内容

本申请提供了一种数字PCR检测定量系统，实现了数字PCR的便携化，有利于制备体积小、重量轻、易于携带的数字PCR系统。

为解决上述技术问题，本发明实施例提供以下技术方案：

本发明实施例提供了一种数字PCR检测定量系统，包括液滴生成装置、微泵装置、微管道、液滴温度循环装置、光学成像与检测装置和控制器；

其中，所述液滴生成装置用于将原菌液样本在预设时间内生成数量不低于预设数量阈值的微液滴；

所述微泵装置用于将所有微液滴泵入所述微管道内，并将完成PCR扩增的微液滴抽回到管道的预设位置处；

所述液滴温度循环装置用于对位于所述液滴生成装置内的微液滴或者是位于所述微管道非所述预设位置处的微液滴进行温度循环以完成所述原菌液样本的PCR扩增；

所述光学成像与检测装置安装在所述微管道的预设位置处，用于对所述预设位置处的微液滴进行荧光信号采集并绘制相应散点图以计算得到所述原菌液样本的模板数量；

所述控制器用于控制所述微泵装置驱动流体运动的流动速度和流动方向、所述液滴温度循环装置的温度升降和所述光学成像与检测装置的工作状态。

可选的，所述液滴生成装置为微流控微液滴芯片或离心管模组；

所述离心管模组包括置于集液瓶的离心管、与所述微泵装置输出端相连并用于注射水性试剂的注射器、与所述注射器的注射头连通的导流管、所述导流管的末端伸入到所述离心管内，且所述导流管的末端与所述离心管的底端保持用于生成预设尺寸液滴的预设距离；

所述离心管预先设置容量不高于预设容量阈值的油性试剂，以形成由油性试剂所覆盖于液滴上表面的分层结构；所述水性试剂为所述原菌液样本和PCR试剂的混合试剂。

可选的，所述离心管还包括第一孔和插入所述第一孔的第一管道，所述第一管道的另一端与连续相存储装置相连，以用于在PCR扩增过程中通过所述微泵装置将所述连续相存储装置中的连续相试剂以不高于预设流速阈值的流速冲入至所述离心管内；所述预设流速阈值根据所述连续相试剂的挥发速度确定。

可选的，所述离心管模组还包括调节机构和步进电机垂直架；

所述调节机构用于夹持所述导流管并调节其末端高度；所述步进电机垂直架用于夹持所述离心管并推到所述离心管在液滴流出过程中向上移动；相应的，

所述控制器还用于控制所述调节机构和所述步进电机垂直架的工作状态和运动参数。

可选的，所述微管道为由多个子管道通过相应微阀门串联而成，且包括用于容纳液滴以进行PCR扩增的PCR扩增子管道和荧光检测子管道；

所述PCR扩增子管道设置在所述液滴温度循环装置上，且所述PCR扩增子管道的深度与液滴直径相匹配，以使泵入所述PCR扩增子管道的液滴在管道内平铺排列；

所述荧光检测子管道的管道外安装所述光学成像与检测装置，所述荧光检测子管道的管道内径与液滴直径相匹配，以使泵入所述荧光检测子管道的所有液滴在进行荧光检测过程中依次单独通过管道。

可选的，还包括位于所述PCR扩增子管道和所述荧光检测子管道之间的多荧光数据同步采集装置；

所述多荧光数据同步采集装置包括多个光电二极管、光源装置、光纤束、设置有截止滤光片的镜头组；所述光纤束包括多根光纤，每根光纤对应一个光电二极管和一个镜头，所述镜头组内不同镜头设置有不同波段截止滤光片；

各光电二极管用于采集从所述PCR扩增子管道输出的微液滴的荧光信号并将采集的荧光信号通过相应光纤传输至对应镜头，以使各微液滴的荧光信号在通过相应截止滤光片后聚焦至所述述荧光检测子管道的不同位置，以利用所述光学成像与检测装置实现多荧光数据同步采集。

可选的，所述液滴生成装置为所述离心管模组，且所述原菌液样本的PCR扩增在所述离心管内进行，所述液滴温度循环装置包括恒温热源、金属浴孔板槽、机械移动装置及导入金属块；

所述离心管插入所述金属浴孔板槽内，且在所述离心管四周的插孔内设置导入金属块；所述恒温热源设置在所述机械移动装置上，以在所述机械移动装置的驱动下到达所述离心管需要加热的位置；相应的，所述控制器还用于控制所述机械移动装置的工作状态和移动轨迹。

可选的，所述液滴生成装置为所述离心管模组，所述离心管模组中还包括设置在所述离心管中的高通量点阵基片，以使所述原菌液样本和PCR试剂的混合试剂通过在所述微泵装置作用下顺着所述导流管通过所述高通量基片后在所述油性试剂之中分散成微液滴；

所述液滴生成装置为所述微流控微液滴芯片，所述微流控微液滴芯片中还包括高通量点阵基片，所述高通量点阵基片设置在具有中空结构或空腔结构、且与所述高通量点阵基片尺寸相匹配的芯片夹层之中，以构建多个微液滴平行生成通道。

可选的，所述光学成像与检测装置还包括人机交互模块和阈值线生成模块；

所述光学成像与检测装置将所有微液滴的荧光亮度散点图及各微液滴在所述荧光亮度散点图中的位置通过所述人机交互模块展示给用户，以使用户通过所述人机交互模块输入各微液滴为阴性还是阳性的属性信息；

所述阈值线生成模块用于根据用户输入的各微液滴的属性信息在所述荧光亮度散点图中生成阴性液滴与阳性液滴的阈值线。

可选的，所述光学成像与检测装置还包括液滴荧光亮度统计模块和液滴属性分类模块；

所述液滴荧光亮度统计模块用于对每个微液滴在温度循环过程中的每一圈的荧光亮度进行统计分析，得到每个微液滴的每一圈的荧光亮度值；

所述液滴属性分类模块用于将第一圈激光亮度值和最后一圈荧光亮度值的差值大于预设亮度阈值的微液滴设置为阳性微液滴；将第一圈激光亮度值和最后一圈荧光亮度值的差值不大于所述预设亮度阈值的微液滴设置为阴性微液滴。

本申请提供的技术方案的优点在于，将光学成像与检测装置安装至微管道上，利用微泵装置驱动微液滴的运动速度和运动方向将其抽入至微管道设置光学成像与检测装置的位置处，从而实现对PCR扩增户的原菌液样本进行荧光检测，构建出光机电一体化的数字PCR检测定量系统，从而解决了传统数字PCR系统需要依赖多个仪器的弊端，同时依靠控制器控制微泵装置、液滴温度循环装置和光学成像与检测装置实现直接从样本放入样本池到检测结果输出的全自动化工作流程，解决传统技术需要多次手动转移样本避免样本污染的弊端，最终实现体积小，能耗低，重量轻且可实时在线检测的数字PCR系统，满足原位快速检测需求。

应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性的，并不能限制本公开。

附图说明

为了更清楚的说明本发明实施例或相关技术的技术方案，下面将对实施例或相关技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的数字PCR检测定量系统的一种具体实施方式结构框架图；

图2为本发明实施例提供的添加矿物油的离心管一种具体实施方式结构框架图；

图3为本发明实施例提供离心管内生成微液滴的示意图；

图4为本发明实施例提供的数字PCR检测定量系统的另一种具体实施方式结构图；

图5为本发明实施例提供的图4的A区域的局部区域放大示意图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”、“第三”“第四”等是用于区别不同的对象，而不是用于描述特定的顺序。此外术语“包括”和“具有”以及他们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备没有限定于已列出的步骤或单元，而是可包括没有列出的步骤或单元。

本申请的发明人经过调研发现，以目前在整个国际市场占有垄断地位的美国伯乐公司qx200系列数字PCR仪器以及赛默飞公司的abI系列数字PCR设备为代表的国内外相关数字PCR设备，基本都面临以下共性缺点：

第1个缺点是对于高通量微液滴的产生基本都需要价格非常昂贵的微流控微液滴芯片，且每一个芯片的价格从100元到几百元不等。

第2个缺点是整个数字PCr仪器往往是由多个单独的设备构成，从而分别完成液滴生成、液滴温度循环以及还有液滴荧光检测几个单元操作，无法实现整个数字PCR工作流程机电一体化仪器构建。

第3个缺点是在整个工作流程之中往往涉及到手动的样本转移、不能实现全自动化，也间接造成了潜在的样本被污染的可能性。

第4个缺点是整套仪器在能耗体积与重量方面都存在较大的弊端，不能满足现场原位POCT(point-of-care testing)快速检测的需求。

第5个缺点是每一个样本所生成的有效液滴数量往往不足2万，限制分析样本的可测量程只有4个数量级，这远低于传统的实时荧光定量PCR技术要求的不低于10个数量级；而解决这一弊端的唯一方法，就是能在短时间之内生成更高通量的微液滴，例如如果每一个样本的有效液滴数量可以达到2000万那么就可以提高4个数量级从而大大拓展样本的可测量程。

第6个缺点是对于每一款数字PCR系统都需要有其专门对应的检测试剂盒，也就是说PCR系统的检测试剂盒普适性较差。而这些试剂盒在不同的仪器之间基本不兼容，一旦换成其他的试剂盒，就会造成检测的失败。

第7个缺点是所有传统的数字PCR设备的升降温速度较慢，往往局限于4-7°/S之间因此难以实现样本的快速分析。

鉴于此，针对于目前主流数字PCR系统的上述缺点，本申请将提出一种光机电一体化的数字PCR检测定量系统解决传统数字PCR系统需要依赖多个仪器的弊端，同时提出全自动化的工作流程从而实现直接从样本放入样本池到检测结果输出的全自动化工作流程、解决传统技术需要多次手动转移样本的弊端，同时实现一种免微流控芯片的液滴生成扩增与检测以解决传统技术对昂贵微流控芯片的依赖，最终实现体积小，能耗低，重量轻的POCT数字PCR系统，满足原位快速检测需求以及多通量样本平行检测需求。

在介绍了本发明实施例的技术方案后，下面详细的说明本申请的各种非限制性实施方式。

首先参见图1，图1为本发明实施例提供的数字PCR检测定量系统在一种实施方式下的结构示意图，本发明实施例可包括以下内容：

一种数字PCR检测定量系统可包括液滴生成装置1、微泵装置2、微管道3、液滴温度循环装置4、光学成像与检测装置5和控制器6。

其中，液滴生成装置1用于将原菌液样本在预设时间内生成数量不低于预设数量阈值的微液滴。液滴生成装置1可为微流控微液滴芯片，也可不是微流控微液滴芯片，这均不影响本申请的实现。预设时间和预设数据阈值可基于实际应用场景进行确定，若数量阈值较大、或是预设时间段较短，则可同时设置多个液滴生成装置1同时生成多组微液滴。

本发明实施例中，微泵装置2可用于将所有微液滴泵入微管道3内，并将完成PCR扩增的微液滴抽回到管道的预设位置处。微泵装置2可为注射泵、恒压泵或者旋转泵等任何一种单泵或是多个单泵组合成多泵装置，本申请对此均不做任何限定。预设位置可为微管道3的入口位置处，也可为出口位置处，或者是其他任何一段微管道，这均不影响本申请的实现。微管道3可用于作为微液滴温度循环的PCR扩增管道，也可仅作为检测管道，本申请对此不做任何限定。

本申请中的液滴温度循环装置4用于对位于液滴生成装置1内的微液滴或者是位于微管道非预设位置处的微液滴进行温度循环以完成原菌液样本的PCR扩增。其中，液滴温度循环装置4可为基于半导体制冷器升降温进行温度调节控制的装置，也可为其他任何一种可实现温度循环控制的装置，本申请对此不做任何限定。

在本发明实施例中，光学成像与检测装置5可安装在微管道3的预设位置处，用于对预设位置处的微液滴进行荧光信号采集并绘制相应散点图以计算得到原菌液样本的模板数量。光学成像与检测装置5可为任何一种可进行荧光检测的小型化光学设备，例如可为光电倍增管/光电二极管/雪崩二极管/CMOS传感器等。

本申请的控制器6用于控制微泵装置2驱动流体运动的流动速度和流动方向、液滴温度循环装置4的温度升降和光学成像与检测装置5的工作状态。工作状态是指光学成像与检测装置5的开启、关闭、信号采集、信号分析和信号分析结果输出。控制器6可为智能终端的内嵌计算机程序或者是嵌入式单片机自动化软件，从而可保证整个工作流程的全自动化，控制器6中用于控制微泵装置2驱动流体运动的流动速度和流动方向、例如正转反转；液滴温度循环装置4的温度升降和光学成像与检测装置5的工作状态的计算机程序可根据当前应用场景预先编制好的计算机程序，在其他应用场景中，只需更改相应参数即可。

在本发明实施例提供的技术方案中，将光学成像与检测装置安装至微管道上，利用微泵装置驱动微液滴的运动速度和运动方向将其抽入至微管道设置光学成像与检测装置的位置处，从而实现对PCR扩增户的原菌液样本进行荧光检测，构建出光机电一体化的数字PCR检测定量系统，从而解决了传统数字PCR系统需要依赖多个仪器的弊端，同时依靠控制器控制微泵装置、液滴温度循环装置和光学成像与检测装置实现直接从样本放入样本池到检测结果输出的全自动化工作流程，解决传统技术需要多次手动转移样本避免样本污染的弊端，最终实现体积小，能耗低，重量轻且可实时在线检测的数字PCR系统，满足原位快速检测需求。

考虑到微流控微液滴芯片价格昂贵，为了解决数字PCR系统对昂贵微流控微液滴芯片的依赖，本申请还提供了另外一种不依赖微流控微液滴芯片来生成液滴，可包括下述内容：

液滴生成装置1可为在离心管中快速产生大量小液滴的离心管模组。离心管模组可包括置于集液瓶的离心管、与微泵装置输出端相连并用于注射水性试剂的注射器、与注射器的注射头连通的导流管、导流管的末端伸入到离心管内，且导流管的末端与离心管的底端保持用于生成预设尺寸液滴的预设距离；离心管预先设置容量不高于预设容量阈值的油性试剂，例如矿物油，以形成由油性试剂所覆盖于液滴上表面的分层结构；水性试剂为原菌液样本和PCR试剂的混合试剂。如图2所示为离心管加入一定量的矿物油，如图3所示在离心管中生成微液滴的示意图。微泵装置作为单一动力源，其输出端与注射器相连可将水相混合试剂通过动力灌注到注射器中。注射器的注射头与导流管连通，可将灌注的水相混合试剂按照一定速度和频率注射到导流管中，使得水相混合试剂沿着导流管流动。导流管的末端一直延伸到离心管中，离心管安装在集液瓶中，而离心管内盛装一定量的油相，可将离心管的管壁隔离，以避免离心管的管壁破坏液滴，保证水相混合试剂在离心管内均匀乳化，从而顺利得到所需液滴。重要的是，导流管的末端伸入到离心管中时，需要在导流管的末端与离心管的底端之间保持预设距离，从而使得两者并不直接接触。当注射器将水相从导流管的末端往外注射时，可以在静止的油相进行乳化，从而将水相离散成均匀的小液滴。同时，液滴的尺寸为重要参数，可跟导流管的末端与离心管的底端距离相关。

可以理解的是，本发明实施例形成了由油性试剂所覆盖于液滴上表面的分层结构，在整个扩增过程之中盖于高通量液滴上表面的矿物油可以抑制相应的水相混合试剂挥发，为了进一步降低水相混合试剂的挥发，离心管还包括第一孔和插入第一孔的第一管道，第一管道的另一端与连续相存储装置，以用于在PCR扩增过程中通过微泵装置将连续相存储装置中的连续相试剂以不高于预设流速阈值的流速冲入至离心管内；预设流速阈值根据连续相试剂的挥发速度确定。举例来说，整个温度循环过程之中可以从微泵装置2的一端以极低的流速冲入添加表面活性剂的氟化液来进一步弥补温度循环过程之中连续相的少量损失。

在本发明实施例的另外一种实施方式中，离心管模组还可包括调节机构和步进电机垂直架；调节机构用于夹持导流管并调节其末端高度；利用调节机构调节导流管的末端高度，从而调节导流管的末端与离心管的底端之间的距离，进而方便地控制生成液滴的尺寸参数。步进电机垂直架用于夹持离心管并推到离心管在液滴流出过程中向上移动，从而保证离心管中没有死体积的残留。相应的，为了提高系统的自动化性能，控制器6还可用于控制调节机构和步进电机垂直架的工作状态和运动参数；工作状态是指调节机构和步进电机垂直架开启、关闭和运动，运动参数是指调节机构和步进电机垂直架的驱动方向和驱动轨迹。此外，为了确保没有死体积在离心管中的残留，还可以在整个温度循环之后通过离心管连接的另一个出口管道将所有微液滴通过微泵装置2推出从而在微管道3末端实现荧光信号的检测与分析。

在本发明实施例中，微液滴的PCR扩增过程可在离心管中进行，那么离心管3可直接放置在液滴温度循环装置4上，也可在微管道3中进行。对于微液滴在微管道3中进行PCR扩增，微管道3可为由多个子管道通过相应微阀门串联而成，且包括用于容纳液滴以进行PCR扩增的PCR扩增子管道和荧光检测子管道。PCR扩增子管道设置在液滴温度循环装置4上，且PCR扩增子管道的深度与液滴直径相匹配，以使泵入PCR扩增子管道的液滴在管道内平铺排列；也就是说，如果直接在产生微液滴的离心管之内进行PCR扩增反应，可以在微液滴反应完之后，直接通过微泵装置推出离心管并与光学成像与检测装置5进行耦合；也可以将微液滴从离心管之内收集出来放置于一个深度跟微液滴直径相当的微管道之中平铺开，然后进行温度循环反应在循环之后检测所有平铺微液滴的荧光信号。荧光检测子管道的管道外安装光学成像与检测装置5，如图5所示，荧光检测子管道的管道内径与液滴直径相匹配，以使泵入荧光检测子管道的所有液滴在进行荧光检测过程中依次单独通过管道。也即为了实现液滴可以在荧光检测子管道之中单独通过，可以将检测区域的管道，例如铁氟龙管道进行4倍以上拉伸确保在检测区域管径狭窄，而且流速提高从而实现单一液滴快速检测的分辨率。

在本发明实施例中，如图4所示，在离心管41之中形成大量小液滴，并且将离心管放置于液滴温度循环装置之上，通过液滴温度循环装置实现所有小液滴的温度循环过程以完成PCR扩增的目标。当整个温度循环结束之后可通过在电脑端或者是嵌入式单片机对注射泵，恒压泵或者旋转泵等微泵装置2反向移动从而将所有小液滴快速的从离心管之中抽回到微管道3的荧光检测子管道，开启在荧光检测子管道上的光学成像与检测装置5以实现对所有微液滴的荧光信号采集与分析，图4中的透镜标识表明实现所有微液滴荧光检测，图5为图4中A部分的放大图。通过这一系统实现了免除微流控芯片依赖的数字PCR系统的新型工作流程，并且满足整个数字PCR系统的光机电一体化以及全自动化。

作为另外一种实施方式，为了实现多通亮样本平行分析，可将上述数字PCR检测定量系统的整个系统进行原件重复组装即可完成。例如，如果构建POCT全自动一体化八通量数字PCR扩增系统，可以首先在离心管里面提前加上矿物油，然后通过单个小型的旋转微泵接通通微型十二阀的微型电磁阀门，通过阀门系统直接连接并行排列组装的8个离心管里同时实现4分钟之内对8个样本实现超过16万小液滴。

可选的，对于多色荧光数据同步采集，可以采用二极管以及光源系统各自耦合光纤并光路优化同轴化、在光纤另一侧通过不同波段截止滤光片的镜头聚焦于温度循环之后微液滴出口微管道上的不同位置，并分别同时进行图像采集与荧光信号处理。具体来说，本申请还可包括位于PCR扩增子管道和荧光检测子管道之间的多荧光数据同步采集装置；

多荧光数据同步采集装置包括多个光电二极管、光源装置、光纤束、设置有截止滤光片的镜头组；光纤束包括多根光纤，每根光纤对应一个光电二极管和一个镜头，镜头组内不同镜头设置有不同波段截止滤光片；各光电二极管用于采集从PCR扩增子管道输出的微液滴的荧光信号并将采集的荧光信号通过相应光纤传输至对应镜头，以使各微液滴的荧光信号在通过相应截止滤光片后聚焦至荧光检测子管道的不同位置，以利用光学成像与检测装置实现多荧光数据同步采集。

为了提升基于TEC(Thermo Electric Cooler，半导体制冷器)温度循环的液滴温度循环装置的加热效率和受热均匀性，可在离心管或者微流控微液滴芯片的周边加上一定厚度的导入金属块实现更好温控，在反应结束之后，通过反向回旋微型微泵系统可实现光电倍增管/光电二极管/雪崩二极管/CMOS传感器对极小液滴高通量快速检测。

可以理解的是，由于TEC自身的电子属性限制，升降温速度最快只能达到4～7度之间，通过TEC温度循环模块无法实现快速精准地温度循环。为了实现更快速的全自动升降温温度循环，可通过机械位移温控来替代TEC温控的技术。在一种实施方式中，对于上述步骤中所生成液滴的离心管放置于金属浴孔板槽之内从而实现扩增管更好的四周环境温度控制。这样只需要对这样的一个离心管与金属浴孔板槽耦合的结构，在一次通过机械移动的方式实现温控模块快速的移动即可以实现更快的升降温速度，例如可包括退火/延伸温度模块，变性温度模块，过冷温度模块以及过热温度模块等。详细来说，对于液滴生成装置1为离心管模组，且原菌液样本的PCR扩增在离心管内进行，液滴温度循环装置4可包括恒温热源、金属浴孔板槽、机械移动装置及导入金属块；离心管插入金属浴孔板槽内，且在离心管四周的插孔内设置导入金属块；恒温热源设置在机械移动装置上，以在机械移动装置的驱动下到达离心管需要加热的位置；相应的，控制器6还可用于控制机械移动装置的工作状态和移动轨迹。通过这一方式，在实现快速温度循环之后，再按照上述步骤微泵装置2的反转实现液滴荧光分析与图像统计。对于多通亮样本梯度PCR温度循环控制，可以通过每一个样本单独的退火/延伸温度模块温控并且构建退火温度差异化来实现结合上述全自动工作流程实现每一个平行样本不同梯度退火温度的快速升降温数字PCR检测。

为了解决传统数字PCR技术对于每一个样本可产生有效液的通量不足2万、从而造成可测样本的DNA量程不超过4个数量级的弊端，本申请还提出一种快速对每一个样本实现超过百万级甚至千万级有效液滴生成的技术从而实现更高可测核酸量程。若液滴生成装置1为离心管模组，离心管模组中还包括设置在离心管中的高通量点阵基片，以使原菌液样本和PCR试剂的混合试剂通过在微泵装置作用下顺着导流管通过高通量基片后在油性试剂之中分散成微液滴。若液滴生成装置1为微流控微液滴芯片，微流控微液滴芯片中还包括高通量点阵基片，高通量点阵基片设置在具有中空结构或空腔结构、且与高通量点阵基片尺寸相匹配的芯片夹层之中，以构建多个液滴平行生成通道。也就是说，本申请将采取高通量点阵基片技术结合微流体传输与控制手段来实现高通量微液滴生成，只需要将价格非常便宜的不同材质的高通量例如从几千到几十万微孔结构点阵基片，例如可为金属基片、硅基基片或者塑料基片，相对于传统的基于微芯片形成液滴的手段，本申请相当于构建大量液滴平行形成通道，实现了几千甚至几十万倍的增长，从而在相同的时间内所实现的液滴通量增长几千倍至几十万倍从而满足短时间之内形成高通量为液滴的要求。上述技术可以通过高通量基片的表面处理方法以及流体传输优化方法实现更有效的高通胀液滴生成。例如如果对高通量点阵基片与油相或连续相接触的一侧进行表面钝化从而实现更高的接触角与斥水性就有利于微液滴的剪切与更小尺寸微液滴的产生。而如果是在微液滴产生的过程之中让连续下可以向前方移动同样可以有利于剪切力的形成以及液滴的产生。对于上述所产生的高通量微液滴的系统，只需要将其放置于不同的温度循环控制系统之上,或者将液滴收集之后放在不同的温控系统之上就可以实现后续的高通量微液滴温度循环以及数字PCR检测功能。

可以理解的是，不同数字PCR系统所采用的扩增试剂不兼容、以及数字PCR系统与实时荧光定量PCR系统的试剂盒不兼容的原因是因为软件处理的欠缺。例如，对于实时荧光定量PCR系统已经非常成功的试剂盒放在数字PCR系统上检测的时候往往不能将阳性液滴与阴性液滴很明显的区分，所画出来的散点图阳性液滴与阴性液滴往往交缠在一起因此无法找到准确的阈值线位置，从而导致最后分析的失败。通过调研发现，无论是对于赛默飞数字PCr阵列芯片的分析，还是通过对伯乐qx 200数字PCr工作流程的分析，通过光路系统优化往往在肉眼的情况下就可以准确的区别出来，液滴的明暗差异并且判断哪一些液滴是阳性液滴或者是阴性液滴，这是因为人眼识别往往可以更好的分析局部以及全局的图像结果从而在比较中判断出阴性与阳性。所以本申请中的光学成像与检测装置5还可包括人机交互模块和阈值线生成模块；光学成像与检测装置将所有微液滴的荧光亮度散点图及各微液滴在图中的位置通过人机交互模块展示给用户，以使用户通过人机交互模块输入各微液滴为阴性还是阳性属性信息；阈值线生成模块用于根据用户输入的各微液滴的属性信息在荧光亮度散点图中生成阴性液滴与阳性液滴的阈值线。也就是说，本申请提出一种类似于人眼识别的图像处理算法技术，即对高通量微液滴在荧光检测时，所绘制的所有微液滴的荧光亮度散点图原图之中的微液滴位置展示给用户，这样结合人眼识别此微液滴阴性或者阳性,辅助快速准确的找到阈值线，从而将阴性与阳性液滴阈值线不明显的试剂盒也找到准确的阈值从而拓展数字PCR试剂普适性。从而摆脱了传统图像处理由于完全利用计算机算法与程序分析绝对值而欠缺相对值比较分析的弊端。

此外，作为另外一种可选的实施方式，光学成像与检测装置5还可包括液滴荧光亮度统计模块和液滴属性分类模块；液滴荧光亮度统计模块用于对每个液滴在温度循环过程中的每一圈的荧光亮度进行统计分析，得到每个液滴的每一圈的荧光亮度值；液滴属性分类模块用于将第一圈激光亮度值和最后一圈荧光亮度值的差值大于预设亮度阈值的微液滴设置为阳性微液滴；将第一圈激光亮度值和最后一圈荧光亮度值的差值不大于预设亮度阈值的微液滴设置为阴性微液滴。也就是说，对每一个液滴在温度循环过程之中，每一圈的荧光亮度都进行分析的图像处理技术，从而在整个温度循环过程结束之后只是将那一些最后一圈荧光亮度相对于第1圈荧光亮度有明显提升的液滴作为阳性液滴进行统计与数字计算，同样可以实现阈值线不明显的扩增试剂盒数字PCr定量。例如对于伯乐Qx200系统，可以通过连续流动数字PCR技术通过CMOS传感器或者是光电管等手段实现所有微液滴温度循环的每一圈实时荧光在微管道中进行监测的手段，来替代Qx200终点检测的手段，并通过图像处理软件与算法优化绘制出定位出每一个液滴在每一圈为管道中荧光亮度值从而比对反应前后荧光差值；或者对于赛默飞AbI数字PCR系统，同样改变其终点荧光检测的弊端，采用在温度循环过程中每一圈都对所有微液滴的荧光信号进行数据采集与分析从而得出所有微液滴反应前后的亮度差值。通过这样的方式进而取代传统系统只是比较所有微液滴在温度循环之后荧光亮度绝对值而造成的因为每一个微液滴背景噪音不一样，造成的检测误差以及阈值线不明显导致传统数字PCR系统难以应用于普通的实时荧光定量PCR试剂盒的弊端。

最后，控制器可以包括一个或多个处理核心，比如4核心处理器、8核心处理器等。控制器可以采用DSP(Digital Signal Processing，数字信号处理)、FPGA(Field－Programmable Gate Array，现场可编程门阵列)、PLA(Programmable Logic Array，可编程逻辑阵列)中的至少一种硬件形式来实现。控制器也可以包括主处理器和协处理器，主处理器是用于对在唤醒状态下的数据进行处理的处理器，也称CPU(Central Processing Unit，中央处理器)；协处理器是用于对在待机状态下的数据进行处理的低功耗处理器。在一些实施例中，控制器可以在集成有GPU(Graphics Processing Unit，图像处理器)，GPU用于负责显示屏所需要显示的内容的渲染和绘制。一些实施例中，控制器还可以包括AI(ArtificialIntelligence，人工智能)处理器，该AI处理器用于处理有关机器学习的计算操作。

数字PCR检测定量系统中包括用于存储数据和计算机程序的存储器，存储器可以包括一个或多个计算机可读存储介质，该计算机可读存储介质可以是非暂态的。存储器还可包括高速随机存取存储器，以及非易失性存储器，比如一个或多个磁盘存储设备、闪存存储设备。本实施例中，存储器至少用于存储以下计算机程序，其中，该计算机程序被处理器加载并执行之后，能够实现前述任一实施例公开方法的相关步骤。另外，存储器所存储的资源还可以包括操作系统和数据等，存储方式可以是短暂存储或者永久存储。其中，操作系统可以包括Windows、Unix、Linux等。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

专业人员还可以进一步意识到，结合本文中所公开的实施例描述的各示例的单元及算法步骤，能够以电子硬件、计算机软件或者二者的结合来实现，为了清楚地说明硬件和软件的可互换性，在上述说明中已经按照功能一般性地描述了各示例的组成及步骤。这些功能究竟以硬件还是软件方式来执行，取决于技术方案的特定应用和设计约束条件。专业技术人员可以对每个特定的应用来使用不同方法来实现所描述的功能，但是这种实现不应认为超出本发明的范围。

以上对本申请所提供的一种数字PCR检测定量系统进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本申请进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本申请权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种数字PCR检测定量系统，其特征在于，包括液滴生成装置、微泵装置、微管道、液滴温度循环装置、光学成像与检测装置和控制器；

其中，所述液滴生成装置用于将原菌液样本在预设时间内生成数量不低于预设数量阈值的微液滴；

所述微泵装置用于将所有微液滴泵入所述微管道内，并将完成PCR扩增的微液滴抽回到管道的预设位置处；

所述液滴温度循环装置用于对位于所述液滴生成装置内的微液滴或者是位于所述微管道非所述预设位置处的微液滴进行温度循环以完成所述原菌液样本的PCR扩增；

所述光学成像与检测装置安装在所述微管道的预设位置处，用于对所述预设位置处的微液滴进行荧光信号采集并绘制相应散点图以计算得到所述原菌液样本的模板数量；

所述控制器用于控制所述微泵装置驱动流体运动的流动速度和流动方向、所述液滴温度循环装置的温度升降和所述光学成像与检测装置的工作状态。

2.根据权利要求1所述的数字PCR检测定量系统，其特征在于，所述液滴生成装置为微流控微液滴芯片或离心管模组；

所述离心管模组包括置于集液瓶的离心管、与所述微泵装置输出端相连并用于注射水性试剂的注射器、与所述注射器的注射头连通的导流管、所述导流管的末端伸入到所述离心管内，且所述导流管的末端与所述离心管的底端保持用于生成预设尺寸液滴的预设距离；

所述离心管预先设置容量不高于预设容量阈值的油性试剂，以形成由油性试剂所覆盖于液滴上表面的分层结构；所述水性试剂为所述原菌液样本和PCR试剂的混合试剂。

3.根据权利要求2所述的数字PCR检测定量系统，其特征在于，所述离心管还包括第一孔和插入所述第一孔的第一管道，所述第一管道的另一端与连续相存储装置相连，以用于在PCR扩增过程中通过所述微泵装置将所述连续相存储装置中的连续相试剂以不高于预设流速阈值的流速冲入至所述离心管内；所述预设流速阈值根据所述连续相试剂的挥发速度确定。

4.根据权利要求2所述的数字PCR检测定量系统，其特征在于，所述离心管模组还包括调节机构和步进电机垂直架；

所述调节机构用于夹持所述导流管并调节其末端高度；所述步进电机垂直架用于夹持所述离心管并推到所述离心管在液滴流出过程中向上移动；相应的，

所述控制器还用于控制所述调节机构和所述步进电机垂直架的工作状态和运动参数。

5.根据权利要求1至4任意一项所述的数字PCR检测定量系统，其特征在于，所述微管道为由多个子管道通过相应微阀门串联而成，且包括用于容纳液滴以进行PCR扩增的PCR扩增子管道和荧光检测子管道；

所述PCR扩增子管道设置在所述液滴温度循环装置上，且所述PCR扩增子管道的深度与液滴直径相匹配，以使泵入所述PCR扩增子管道的液滴在管道内平铺排列；

所述荧光检测子管道的管道外安装所述光学成像与检测装置，所述荧光检测子管道的管道内径与液滴直径相匹配，以使泵入所述荧光检测子管道的所有液滴在进行荧光检测过程中依次单独通过管道。

6.根据权利要求5所述的数字PCR检测定量系统，其特征在于，还包括位于所述PCR扩增子管道和所述荧光检测子管道之间的多荧光数据同步采集装置；

所述多荧光数据同步采集装置包括多个光电二极管、光源装置、光纤束、设置有截止滤光片的镜头组；所述光纤束包括多根光纤，每根光纤对应一个光电二极管和一个镜头，所述镜头组内不同镜头设置有不同波段截止滤光片；

各光电二极管用于采集从所述PCR扩增子管道输出的微液滴的荧光信号并将采集的荧光信号通过相应光纤传输至对应镜头，以使各微液滴的荧光信号在通过相应截止滤光片后聚焦至所述述荧光检测子管道的不同位置，以利用所述光学成像与检测装置实现多荧光数据同步采集。

7.根据权利要求2至4任意一项所述的数字PCR检测定量系统，其特征在于，所述液滴生成装置为所述离心管模组，且所述原菌液样本的PCR扩增在所述离心管内进行，所述液滴温度循环装置包括恒温热源、金属浴孔板槽、机械移动装置及导入金属块；

所述离心管插入所述金属浴孔板槽内，且在所述离心管四周的插孔内设置导入金属块；所述恒温热源设置在所述机械移动装置上，以在所述机械移动装置的驱动下到达所述离心管需要加热的位置；相应的，所述控制器还用于控制所述机械移动装置的工作状态和移动轨迹。

8.根据权利要求2至4任意一项所述的数字PCR检测定量系统，其特征在于，所述液滴生成装置为所述离心管模组，所述离心管模组中还包括设置在所述离心管中的高通量点阵基片，以使所述原菌液样本和PCR试剂的混合试剂通过在所述微泵装置作用下顺着所述导流管通过所述高通量基片后在所述油性试剂之中分散成微液滴；

所述液滴生成装置为所述微流控微液滴芯片，所述微流控微液滴芯片中还包括高通量点阵基片，所述高通量点阵基片设置在具有中空结构或空腔结构、且与所述高通量点阵基片尺寸相匹配的芯片夹层之中，以构建多个微液滴平行生成通道。

9.根据权利要求1至4任意一项所述的数字PCR检测定量系统，其特征在于，所述光学成像与检测装置还包括人机交互模块和阈值线生成模块；

所述光学成像与检测装置将所有微液滴的荧光亮度散点图及各微液滴在所述荧光亮度散点图中的位置通过所述人机交互模块展示给用户，以使用户通过所述人机交互模块输入各微液滴为阴性还是阳性的属性信息；

所述阈值线生成模块用于根据用户输入的各微液滴的属性信息在所述荧光亮度散点图中生成阴性液滴与阳性液滴的阈值线。

10.根据权利要求1至4任意一项所述的数字PCR检测定量系统，其特征在于，所述光学成像与检测装置还包括液滴荧光亮度统计模块和液滴属性分类模块；

所述液滴荧光亮度统计模块用于对每个微液滴在温度循环过程中的每一圈的荧光亮度进行统计分析，得到每个微液滴的每一圈的荧光亮度值；

所述液滴属性分类模块用于将第一圈激光亮度值和最后一圈荧光亮度值的差值大于预设亮度阈值的微液滴设置为阳性微液滴；将第一圈激光亮度值和最后一圈荧光亮度值的差值不大于所述预设亮度阈值的微液滴设置为阴性微液滴。

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