CN113604344B - 一种高通量一体式微液滴数字pcr的实现系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，包括微液滴制备单元、PCR扩增单元和荧光检测分析单元；微液滴制备单元包括驱动器、扰动装置、微液滴生成器，微液滴生成器包括油相通道、样本通道和检测腔室，驱动器产生驱动信号并作用于扰动装置，扰动装置在油相中产生速度脉冲，进而油相剪切样本与PCR反应试剂的混合液体，生成微液滴；微液滴在检测腔室内均匀摊开，PCR扩增单元对检测腔室内的微液滴进行PCR扩增反应；然后荧光检测分析单元对微液滴进行数据读取和分析，完成对特定核酸的定量检测。实现了微液滴的快速制备，减少了用油量，降低微液滴大小对流体通道尺寸的依赖，检测精度和可靠性高，成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，属于核酸检测分析技术领域。
背景技术
在生命科学研究领域，PCR(聚合酶链式反应)是一种极其常用的核酸检测分析方法。目前，进行核酸检测时，主流的微滴数字PCR仪通常包括三部分：微滴生成系统、热循环仪和信号读取系统，其中微滴生成系统采用的原理是：通道呈十字形，通过油相(连续相)挤压样品水相(离散相)，使样品分散成若干微液滴，然后将成为微液滴的样品置于样品管内，将样品管置于热循环仪内进行扩增后，再将样品管置于信号读取系统进行检测，传统的信号读取系统的检测原理为：一个个微液滴在通道内依次快速通过，利用激光对微液滴进行检测。
传统微液滴生成多采用被动方式，液滴大小、频率与器件通道尺寸、流率、物性等多个参数相互关联，不易调节。即使操作参数固定，受芯片尺寸批次间差异的影响，液滴大小仍难以精确控制。采用被动方式制备微小液滴，所需求的流体通道尺寸相应地也比较小，加工精度要求高，成本增加；如果采用较大通道尺寸，则必须提高油相流率，后续工作中须去除多余的油，工艺复杂。
目前在采用主动方式制备微液滴的研究中，多数工作外部扰动频率与液滴生成频率并非一一对应，对液滴生成频率、大小仍需进行标定；并且液滴生成频率普遍偏低(<100Hz)；液滴的大小范围较窄。
另外，目前微液滴数字PCR涉及微液滴制备、扩增反应、检测分析，目前相关产品采用多设备、多步骤完成，液滴生成、PCR、检测为三个不同的系统，操作相对复杂，对PCR最后结果的影响因素较多，每次测试的时间较长，而且设备成本高，测试完的样品需要单独处理，以防止交叉污染。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，采用主动控制技术来制备微液滴，实现了微液滴的快速制备，减少了用油(连续相)量，同时降低了微液滴大小对流体通道尺寸的依赖，提高了微液滴大小的均一性，检测精度和可靠性高，成本低。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，所述微液滴数字PCR的实现系统包括微液滴制备单元、PCR扩增单元和荧光检测分析单元；
所述微液滴制备单元包括驱动器、扰动装置、微液滴生成器，所述微液滴生成器包括油相通道、样本通道和检测腔室，所述油相通道内通有油相，所述样本通道内通有离散相，所述离散相为待检测样本与PCR反应试剂的混合液体，所述油相通道和样本通道汇聚后与所述检测腔室连通；
电源连接所述驱动器，驱动器可以实现电信号的放大，所述驱动器产生的放大驱动信号作用于扰动装置，扰动装置将电信号转化为震动信号，所述扰动装置作用于油相，扰动装置在油相中产生速度脉冲，进而油相在微液滴生成器中剪切离散相，生成微液滴；生成的微液滴被收集在检测腔室，微液滴在检测腔室内均匀摊开，PCR扩增单元对检测腔室内的微液滴进行加热以实现PCR扩增反应；然后荧光检测分析单元直接对PCR扩增反应后的微液滴进行数据读取和分析，完成对样本的核酸定量检测。由于速度脉冲对应于微液滴的生成，即一次脉冲产生一个微液滴，因此生成微液滴的频率与速度脉冲的频率以及驱动信号的频率一致。为方便计，本说明书中所说的离散相，均指含有样本和PCR反应所需试剂的混合液体，即本发明说明书中的微液滴均是含有样本和PCR反应所需试剂的混合液体的微液滴。
本发明的有益效果是：
(1)本发明将外部扰动施加于连续相(油相)，通过产生速度脉冲增强剪切作用，主动控制微液滴的生成，消除了液滴被动生成时液滴大小、频率受油相通道尺寸、样本通道尺寸、两相流率及流率比等多参数影响因而难以调节、标定的缺点；
(2)本发明由流量、电信号来控制的微液滴生成，并通过离散相流量直接控制液滴大小，从而规避大批量生产芯片时的工差给微液滴生成带来的误差，降低硬件生产精度要求；
(3)本发明技术在工作范围内微液滴大小不受芯片通道尺寸影响，可通过离散相流量直接进行调节：V＝Qd/f，V为液滴体积，Qd为离散相流量，f为扰动装置的扰动频率，微液滴均一性仅受流量稳定性影响，均一性好，微液滴生成频率与扰动频率同步，便于调节液滴大小；
(4)本发明技术可以实现高频高幅扰动，可实现每秒大于一百个到几千个甚至更高速率的微液滴的生成。微液滴制备效率高，连续、高通量地产生微液滴，与被动方式相比，在大通道尺寸、高生成频率条件下用油量(连续相)或油水比大幅降低，利于后续在线处理与检测，可以使检测腔室内有几万个到几百万个以上的微液滴，保证在检测腔室内有比现有技术更多的微液滴来得到更准确的统计数据；而且所需连续相流率较低，降低了后续对液滴产物的收集处理难度；
(5)本发明所述微液滴数字PCR的实现系统结构简单，设备成本低，无需使用样品管，可以实现微液滴制备、PCR扩增和荧光检测分析的一体化设计，操作简便，设备成本低；
(6)本发明所述微液滴数字PCR的实现系统可与痕量细胞富集分选模块配套，实现痕量细胞、痕量核酸的高敏检测。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
进一步的，所述油相通道、样本通道和检测腔室设置在液滴芯片上，油相和样本通过输送泵分别进入所述油相通道和样本通道，所述扰动装置作用于油相产生速度脉冲，然后产生速度脉冲的油相与样本通道内的样本汇聚，油相将样本剪切成微液滴后，微液滴进入所述检测腔室，所述检测腔室上设有出口；所述循环加热机构对所述液滴芯片进行循环加热实现PCR扩增反应；所述荧光检测分析单元包括高敏照相机，所述高敏照相机对所述液滴芯片的微液滴进行拍照。所述循环加热机构、高敏照相机与液滴芯片的相对位置根据设计需求设定。
采用上述进一步方案的有益效果是：通过对油相施加外部脉冲扰动，强化剪切效果，主动控制微液滴的生成；由于用油量少，将微液滴样本的收集与检测直接集成在液滴芯片上，使用后液滴芯片作为一次性耗材连同废液一起处理，避免样本之间交叉污染，而且医疗垃圾处理方便；
采用高敏照相机一次性拍照的方式对PCR扩增反应后的微液滴进行数据读取和分析，与传统的激光检测方法相比，效率更高，准确度更高；另外，采用循环加热机构对液滴芯片进行循环加热实现PCR扩增反应，采用高敏照相机对微液滴拍照进行数据读取，与目前传统的主流微滴数字PCR仪相比，可以实现结构的集成，从而使结构更紧凑，使用更便利。
进一步的，所述的扰动装置为压电片、压电陶瓷管或偏心轮式振动器，所述输送泵为注射泵或压力泵，优选压力泵，但是输送泵不限于只选择注射泵或压力泵。
采用上述进一步方案的有益效果是：压电片、压电陶瓷管或偏心轮式振动器作为扰动装置，振幅较大，频率较高，可以利用较大的流体通道产生高通量微小液滴，而且成本低；使用压力泵进行流体驱动，用户操作方便，只需前期对流量进行标定，进而固化操作参数。
进一步的，所述扰动装置与液滴芯片分别独立安装设置，输送油相的输送泵出口油路先通过扰动装置再连接连通管路的一端，所述连通管路的另一端连接所述油相通道，所述扰动装置为压电片，所述油路的壁面上安装有一个或若干个压电片，或者所述油路的上下壁面均设有压电片。
采用上述进一步方案的有益效果是：扰动装置外置作为独立部件，液滴芯片为一次性耗材，扰动装置可以重复使用达到一定次数后进行更换，降低使用成本；
受压电片响应时间影响扰动强度通常会随频率增加而迅速衰减，因此压电片驱动频率应接近其谐振频率，以在高频下维持较大振幅。当扰动装置外置时，油相下游与微液滴生成器连接通道增长，振幅衰减，而单纯增大压电片面积会造成谐振频率下降，影响液滴制备效率。在油路壁面嵌入多个压电片，可以同步驱动，维持对油相的高频高幅扰动，而且压电片的成本非常低。
进一步的，所述油相通道和样本通道在液滴芯片上呈T字形错流结构、Y字形错流结构、十字形流动聚焦结构或共流结构，所述共流结构为油相通道套接于所述样本通道内部。
采用上述进一步方案的有益效果是：油相通道和样本通道采用T字形错流结构、Y字形错流结构、十字形流动聚焦结构或共流结构，均可实现油相对离散相的剪切，实现微液滴的制备。
进一步的，所述液滴芯片上设有若干组微液滴生成器，每组微液滴生成器均包括油相通道、样本通道和检测腔室，采用单一扰动装置驱动所有油路或者每条油路均设置独立的扰动装置。
采用上述进一步方案的有益效果是：在液滴芯片上设置若干组微液滴生成器，实现多通道并联运行，一个液滴芯片就可以同时测试多个样本而且不会造成交叉污染；在扰动强度足够的情况下，可使用单一扰动装置同时驱动多个油路。
进一步的，每条油路的出口处均设有转向阀，所述转向阀连接油路、气泵和油相通道。
采用上述进一步方案的有益效果是：多通道并联运行时借助转向阀实现各油路之间的转换和清洁，当转向阀控制气泵、油路和油相通道之间均断开时，则油相通道不工作，此功能用于不同样本离散相之间的转换；当转向阀控制气泵与油相通道断开、油路与油相通道接通，离散相进入样本通道，形成微液滴；当转向阀控制油路与油相通道断开、气泵与油相通道接通，气泵向油相通道内输入空气，将油路出口和油相通道内残留的少量油吹入检测腔室内，起到清洁作用，避免液滴芯片更换时导致残留油的外漏而产生工作环境的污染问题。
进一步的，所述检测腔室的进口处设有封堵机构，所述检测腔室的出口处设有封堵机构。
采用上述进一步方案的有益效果是：在微液滴生成完成后PCR扩增反应前，封堵机构将检测腔室的进口和出口封闭，避免检测腔室内的微液滴在PCR扩增反应过程中，微液滴从检测腔室漏出而影响检测分析结果；另外，将微液滴密封在检测腔室内，也可以避免样本之间的交叉污染和环境污染，封堵机构可以采用超声波焊接装置，但是不限于只使用超声波焊接装置。
进一步的，所述驱动器产生的驱动信号为三角波、矩形波或正弦波。优选的，所述驱动器产生的驱动信号为矩形波；所述微液滴的生成频率与驱动器产生的驱动信号频率一致；所述微液滴的生成频率大于每秒100个。
采用上述进一步方案的有益效果是：工作人员可以根据微液滴的形成需求以及扰动装置的性能，选择相应的驱动信号，可以根据需要对波形、频率、振幅进行调整。
进一步的，所述微液滴数字PCR的实现系统包括GUI及数据分析模块，GUI及数据分析模块控制所述微液滴数字PCR的实现系统的运行。
采用上述进一步方案的有益效果是：GUI及数据分析模块可以实现对液滴芯片放置模块、脉冲激励控制模块、样本流动控制模块、检测腔室封堵模块、温度控制模块和荧光信号采集模块相关的硬件进行控制及数据分析。
附图说明
图1为实施例1-4中微液滴数字PCR的实现系统工作原理示意图；
图2为实施例1所述液滴芯片的俯视图和主视图；
图3为实施例1-6中循环加热的典型温度曲线图；
图4为实施例1-6中封堵机构对检测腔室的进口和出口进行密封的示意图
图5为实施例1-6中扩增反应及荧光信号分析的原理图；
图6为实施例1-6中荧光检测分析单元的结构原理图；
图7为实施例1-6中荧光检测过程中不同滤镜下的视图；
图8为实施例2所述扰动装置和液滴芯片的俯视图；
图9为实施例3所述扰动装置和液滴芯片的俯视图；
图10为实施例4所述油路与压电片的安装俯视图和内部剖视图；
图11为实施例5的工作原理示意图；
图12为实施例6所述液滴芯片的结构示意图；
图13为实施例6的工作原理示意图；
图14为实施例6中转向阀的工作原理图；
图15为实施例1中得到的微液滴检测图；
图16为实施例1中通过控制离散相流量得到不同尺寸的微液滴检测图；
图中，1油相通道，2样本通道，3出口，4压电片，5检测腔室，6循环加热机构，7油路，8液滴芯片，9连通管路，10压电管。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，包括微液滴制备单元、PCR扩增单元、荧光检测分析单元、封堵机构和GUI及数据分析模块；GUI及数据分析模块控制所述微液滴数字PCR的实现系统硬件的运行及数据分析；
所述微液滴制备单元包括驱动器、扰动装置和微液滴生成器，所述扰动装置为压电片4，所述微液滴生成器包括油相通道1、样本通道2和检测腔室5，所述油相通道1内通有油相，所述样本通道2内通有离散相，所述离散相为待检测样本与PCR反应试剂的混合液体，所述油相通道1和样本通道2汇聚后与所述检测腔室5连通，检测腔室5设有出口3；所述油相通道1、样本通道2和检测腔室5设置在液滴芯片8上，所述油相通道1和样本通道2在液滴芯片8上呈T字形错流结构，油相和离散相通过输送泵分别进入所述油相通道1和样本通道2，所述输送泵为压力泵；
电源连接所述驱动器，所述驱动器产生驱动信号并作用于压电片4，所述压电片4作用于油相，压电片4在油相中产生速度脉冲，然后产生速度脉冲的油相与样本通道2内的离散相汇聚，油相将离散相剪切成微液滴后，微液滴进入所述检测腔室5，微液滴在检测腔室5内均匀摊开，工作流程图为图1所示，液滴芯片8的结构如图2所示。
所述PCR扩增单元包括循环加热机构6，所述循环加热机构6位于所述液滴芯片8的下方，循环加热机构6对检测腔室5内的微液滴进行加热以实现PCR扩增反应，循环加热的典型温度曲线如图3所示，微液滴生成完成后PCR扩增反应前，封堵机构对检测腔室5的进口和出口3进行密封，密封位置如图4所示；所述荧光检测分析单元包括高敏照相机，所述高敏照相机位于所述液滴芯片8的上方，高敏照相机对检测腔室5内的微液滴一次性照相，根据荧光信号分析生物指标，对PCR扩增反应后的微液滴进行数据读取和分析，完成对样本的核酸定量检测，荧光信号分析的过程为：扩增结束后对检测腔室5内的荧光信号进行采集；有荧光信号的微液滴记为1，无荧光信号的微液滴记为0；根据数字PCR反应单元总数(n)和有荧光信号的单元数(f)以及样品的稀释倍系数(m)，就可以得到样本的最初拷贝数(浓度c)扩增反应及荧光信号分析的原理如图5所示。另外荧光信号采集过程中荧光检测分析单元可以选择合适的滤光片(滤镜)，荧光检测分析单元的结构原理如图6所示，不同滤镜下的视图如图7所示。
通过控制离散相(样品)和连续相(油相)的流量情况，得到的微液滴尺寸情况如图15所示。在同一驱动频率下以及同样的通道情况下，通过控制离散相的流量，可以得到不同大小的微液滴，如图16所示。由此可以看出，本发明由流速流量、电信号来控制的微液滴生成，并通过离散相流量直接控制液滴大小，从而规避大批量生产液滴芯片8时的工差给微液滴生成带来的误差，降低硬件生产精度要求。
实施例2
一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，包括微液滴制备单元、PCR扩增单元、荧光检测分析单元、封堵机构和GUI及数据分析模块；GUI及数据分析模块控制所述微液滴数字PCR的实现系统硬件的运行及数据分析；
所述微液滴制备单元包括驱动器、扰动装置和微液滴生成器，所述扰动装置为压电片4，所述微液滴生成器包括油相通道1、样本通道2和检测腔室5，所述油相通道1内通有油相，所述样本通道2内通有离散相，所述离散相为待检测样本与PCR反应试剂的混合液体，油相和离散相通过输送泵实现输送，所述油相通道1和样本通道2汇聚后与所述检测腔室5连通，检测腔室5设有出口3；所述油相通道1、样本通道2和检测腔室5设置在液滴芯片8上，所述油相通道1和样本通道2在液滴芯片8上呈T字形错流结构，所述压电片4与液滴芯片8分别独立安装设置，压电片4外置，输送油相的输送泵出口油路7先通过压电片4再连接连通管路9的一端，所述连通管路9的另一端连接所述油相通道1，所述输送泵为压力泵，如图8所示，压电片4外置作为独立部件，液滴芯片8为一次性耗材，压电片4可以重复使用达到一定次数后进行更换，降低成本。
电源连接所述驱动器，所述驱动器产生驱动信号并作用于压电片4，所述压电片4作用于油相，压电片4在油相中产生速度脉冲，然后产生速度脉冲的油相与样本通道2内的离散相汇聚，油相将离散相剪切成微液滴后，微液滴进入所述检测腔室5，微液滴在检测腔室5内均匀摊开，工作原理流程图为图1所示。
所述PCR扩增单元包括循环加热机构6，所述循环加热机构6位于所述液滴芯片8的下方，循环加热机构6对检测腔室5内的微液滴进行加热以实现PCR扩增反应，循环加热的典型温度曲线如图3所示，微液滴生成完成后PCR扩增反应前，封堵机构对检测腔室5的进口和出口3进行密封，密封位置如图4所示；所述荧光检测分析单元包括高敏照相机，所述高敏照相机位于所述液滴芯片8的上方，高敏照相机对检测腔室5内的微液滴一次性照相，根据荧光信号分析生物指标，对PCR扩增反应后的微液滴进行数据读取和分析，完成对样本的核酸定量检测，荧光信号分析的过程为：扩增结束后对检测腔室5内的荧光信号进行采集；有荧光信号的微液滴记为1，无荧光信号的微液滴记为0；根据数字PCR反应单元总数(n)和有荧光信号的单元数(f)以及样品的稀释倍系数(m)，就可以得到样本的最初拷贝数(浓度c)，扩增反应及荧光信号分析的原理如图5所示。另外荧光信号采集过程中荧光检测分析单元可以选择合适的滤光片(滤镜)，荧光检测分析单元的结构原理如图6所示，不同滤镜下的视图如图7所示。
实施例3
一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，包括微液滴制备单元、PCR扩增单元、荧光检测分析单元、封堵机构和GUI及数据分析模块；GUI及数据分析模块控制所述微液滴数字PCR的实现系统硬件的运行及数据分析；
所述微液滴制备单元包括驱动器、扰动装置和微液滴生成器，所述扰动装置为压电管10，采用压电管10结构更简单，所述微液滴生成器包括油相通道1、样本通道2和检测腔室5，所述油相通道1内通有油相，所述样本通道2内通有离散相，所述离散相为待检测样本与PCR反应试剂的混合液体，油相和离散相通过输送泵实现输送，所述油相通道1和样本通道2汇聚后与所述检测腔室5连通，检测腔室5设有出口3；所述油相通道1、样本通道2和检测腔室5设置在液滴芯片8上，所述油相通道1和样本通道2在液滴芯片8上呈T字形错流结构，所述压电管10与液滴芯片8分别独立安装设置，压电管10外置，输送油相的输送泵出口油路7先通过压电管10再连接所述油相通道1，所述输送泵为压力泵，如图9所示，压电管10结构更简单，而且压电管10外置作为独立部件，液滴芯片8为一次性耗材，压电管10可以重复使用达到一定次数后进行更换，降低成本。
电源连接所述驱动器，所述驱动器产生驱动信号并作用于压电管10，所述压电管10作用于油相，压电管10在油相中产生速度脉冲，然后产生速度脉冲的油相与样本通道2内的离散相汇聚，油相将离散相剪切成微液滴后，微液滴进入所述检测腔室5，微液滴在检测腔室5内均匀摊开，工作原理流程图为图1所示。
所述PCR扩增单元包括循环加热机构6，所述循环加热机构6位于所述液滴芯片8的下方，循环加热机构6对检测腔室5内的微液滴进行加热以实现PCR扩增反应，循环加热的典型温度曲线如图3所示，微液滴生成完成后PCR扩增反应前，封堵机构对检测腔室5的进口和出口3进行密封，密封位置如图4所示；所述荧光检测分析单元包括高敏照相机，所述高敏照相机位于所述液滴芯片8的上方，高敏照相机对检测腔室5内的微液滴一次性照相，根据荧光信号分析生物指标，对PCR扩增反应后的微液滴进行数据读取和分析，完成对样本的核酸定量检测，荧光信号分析的过程为：扩增结束后对检测腔室5内的荧光信号进行采集；有荧光信号的微液滴记为1，无荧光信号的微液滴记为0；根据数字PCR反应单元总数(n)和有荧光信号的单元数(f)以及样品的稀释倍系数(m)，就可以得到样本的最初拷贝数(浓度c)，扩增反应及荧光信号分析的原理如图5所示。另外荧光信号采集过程中荧光检测分析单元可以选择合适的滤光片，荧光检测分析单元的结构原理如图6所示，不同滤镜下的视图如图7所示。
实施例4
一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，包括微液滴制备单元、PCR扩增单元、荧光检测分析单元、封堵机构和GUI及数据分析模块；GUI及数据分析模块控制所述微液滴数字PCR的实现系统硬件的运行及数据分析；
所述微液滴制备单元包括驱动器、扰动装置和微液滴生成器，所述扰动装置为压电片4，所述微液滴生成器包括油相通道1、样本通道2和检测腔室5，所述油相通道1内通有油相，所述样本通道2内通有离散相，所述离散相为待检测样本与PCR反应试剂的混合液体，油相和离散相通过输送泵实现输送，所述油相通道1和样本通道2汇聚后与所述检测腔室5连通，检测腔室5设有出口3；所述油相通道1、样本通道2和检测腔室5设置在液滴芯片8上，所述油相通道1和样本通道2在液滴芯片8上呈T字形错流结构，所述压电片4与液滴芯片8分别独立安装设置，压电片4外置，输送油相的输送泵出口油路7先通过压电片4再连接连通管路9的一端，所述连通管路9的另一端连接所述油相通道1，所述输送泵为压力泵，所述油路7的壁面上安装有若干小的压电片4，所述油路7的上下壁面均设有小的压电片4。当压电片4外置时，油相下游与微液滴生成器连接通道增长，振幅衰减，而单纯增大压电片4面积会造成谐振频率下降，影响液滴制备效率，在油路7壁面嵌入多个小的压电片4，可以同步驱动，维持对油相的高频高幅扰动，压电片4在油路7上的安装示意图如图10所示。
电源连接所述驱动器，所述驱动器产生驱动信号并作用于压电片4，所述压电片4作用于油相，压电片4在油相中产生速度脉冲，然后产生速度脉冲的油相与样本通道2内的离散相汇聚，油相将离散相剪切成微液滴后，微液滴进入所述检测腔室5，微液滴在检测腔室5内均匀摊开，工作原理流程图为图1所示。
所述PCR扩增单元包括循环加热机构6，所述循环加热机构6位于所述液滴芯片8的下方，循环加热机构6对检测腔室5内的微液滴进行加热以实现PCR扩增反应，循环加热的典型温度曲线如图3所示，微液滴生成完成后PCR扩增反应前，封堵机构对检测腔室5的进口和出口3进行密封，密封位置如图4所示；所述荧光检测分析单元包括高敏照相机，所述高敏照相机位于所述液滴芯片8的上方，高敏照相机对检测腔室5内的微液滴一次性照相，根据荧光信号分析生物指标，对PCR扩增反应后的微液滴进行数据读取和分析，完成对样本的核酸定量检测，荧光信号分析的过程为：扩增结束后对检测腔室5内的荧光信号进行采集；有荧光信号的微液滴记为1，无荧光信号的微液滴记为0；根据数字PCR反应单元总数(n)和有荧光信号的单元数(f)以及样品的稀释倍系数(m)，就可以得到样本的最初拷贝数(浓度c)，扩增反应及荧光信号分析的原理如图5所示。另外荧光信号采集过程中荧光检测分析单元可以选择合适的滤光片(滤镜)，荧光检测分析单元的结构原理如图6所示，不同滤镜下的视图如图7所示。
实施例5
一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，包括微液滴制备单元、PCR扩增单元、荧光检测分析单元、封堵机构和GUI及数据分析模块；GUI及数据分析模块控制所述微液滴数字PCR的实现系统硬件的运行及数据分析；
所述微液滴制备单元包括驱动器、扰动装置和微液滴生成器，所述微液滴生成器包括油相通道1、样本通道2和检测腔室5，所述油相通道1内通有油相，所述样本通道2内通有离散相，所述离散相为待检测样本与PCR反应试剂的混合液体，所述油相通道1和样本通道2汇聚后与所述检测腔室5连通，检测腔室5设有出口3；所述油相通道1、样本通道2和检测腔室5设置在液滴芯片8上，所述油相通道1和样本通道2在液滴芯片8上呈T字形错流结构。油相和离散相通过输送泵分别进入所述油相通道1和样本通道2，所述输送泵为压力泵；多个样品同时检测时，将多个液滴芯片8并联，工作原理如图11所示。
电源连接所述驱动器，所述驱动器产生驱动信号并作用于扰动装置，每个所述扰动装置作用于相应的油相，扰动装置在油相中产生速度脉冲，然后产生速度脉冲的油相与样本通道2内的离散相汇聚，油相将离散相剪切成微液滴后，微液滴进入所述检测腔室5，微液滴在检测腔室5内均匀摊开。
所述PCR扩增单元包括循环加热机构6，所述循环加热机构6位于所述液滴芯片8的下方，循环加热机构6对检测腔室5内的微液滴进行加热以实现PCR扩增反应，循环加热的典型温度曲线如图3所示，微液滴生成完成后PCR扩增反应前，封堵机构对检测腔室5的进口和出口3进行密封，密封位置如图4所示；所述荧光检测分析单元包括高敏照相机，所述高敏照相机位于所述液滴芯片8的上方，高敏照相机对检测腔室5内的微液滴一次性照相，根据荧光信号分析生物指标，对PCR扩增反应后的微液滴进行数据读取和分析，完成对样本的核酸定量检测，荧光信号分析的过程为：扩增结束后对检测腔室5内的荧光信号进行采集；有荧光信号的微液滴记为1，无荧光信号的微液滴记为0；根据数字PCR反应单元总数(n)和有荧光信号的单元数(f)以及样品的稀释倍系数(m)，就可以得到样本的最初拷贝数(浓度c)，扩增反应及荧光信号分析的原理如图5所示。另外荧光信号采集过程中荧光检测分析单元可以选择合适的滤光片(滤镜)，荧光检测分析单元的结构原理如图6所示，不同滤镜下的视图如图7所示。
实施例6
一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，包括微液滴制备单元、PCR扩增单元、荧光检测分析单元、封堵机构和GUI及数据分析模块；GUI及数据分析模块控制所述微液滴数字PCR的实现系统硬件的运行及数据分析；
所述微液滴制备单元包括驱动器、扰动装置和微液滴生成器，所述微液滴生成器包括油相通道1、样本通道2和检测腔室5，所述油相通道1内通有油相，所述样本通道2内通有离散相，所述离散相为待检测样本与PCR反应试剂的混合液体，所述油相通道1和样本通道2汇聚后与所述检测腔室5连通，检测腔室5设有出口3；所述油相通道1、样本通道2和检测腔室5设置在液滴芯片8上，所述油相通道1和样本通道2在液滴芯片8上呈T字形错流结构，所述液滴芯片8上设有若干组微液滴生成器，每组微液滴生成器均包括油相通道1、样本通道2和检测腔室5，实现多通道并联运行，一个液滴芯片8就可以同时测试多个样本而且不会造成交叉污染。油相和离散相通过输送泵分别进入所述油相通道1和样本通道2，所述输送泵为压力泵；液滴芯片8的结构如图12所示，工作原理如图13所示。每条油路7的出口处均设有转向阀，所述转向阀连接油路7、气泵和油相通道1，转向阀的工作状态如图14所示，多通道并联运行时借助转向阀实现各通道之间的转换和清洁，如图14所示，状态(a)：空气和油路7与下游通道皆断开，便于不同样本之间的转换；状态(b)：空气和下游通道断开，油路7接通，样本进入，形成微液滴；状态(c)：油路7和下游通道断开，气路接通，气泵向油相通道1内输入空气，将油路7出口和油相通道1内残留的少量油吹入检测腔室5内，起到清洁作用，避免液滴芯片8更换时导致残留油的外漏而产生工作环境的污染问题。
电源连接所述驱动器，所述驱动器产生驱动信号并作用于扰动装置，所述扰动装置作用于油相，使用单一扰动装置同时驱动多个油路7，扰动装置在油相中产生速度脉冲，然后产生速度脉冲的油相与样本通道2内的离散相汇聚，油相将离散相剪切成微液滴后，微液滴进入所述检测腔室5，微液滴在检测腔室5内均匀摊开。
所述PCR扩增单元包括循环加热机构6，所述循环加热机构6位于所述液滴芯片8的下方，循环加热机构6对检测腔室5内的微液滴进行加热以实现PCR扩增反应，循环加热的典型温度曲线如图3所示，微液滴生成完成后PCR扩增反应前，封堵机构对检测腔室5的进口和出口3进行密封，密封位置如图4所示；所述荧光检测分析单元包括高敏照相机，所述高敏照相机位于所述液滴芯片8的上方，高敏照相机对检测腔室5内的微液滴一次性照相，根据荧光信号分析生物指标，对PCR扩增反应后的微液滴进行数据读取和分析，完成对样本的核酸定量检测，荧光信号分析的过程为：扩增结束后对检测腔室5内的荧光信号进行采集；有荧光信号的微液滴记为1，无荧光信号的微液滴记为0；根据数字PCR反应单元总数(n)和有荧光信号的单元数(f)以及样品的稀释倍系数(m)，就可以得到样本的最初拷贝数(浓度c)，扩增反应及荧光信号分析的原理如图5所示。另外荧光信号采集过程中荧光检测分析单元可以选择合适的滤光片(滤镜)，荧光检测分析单元的结构原理如图6所示，不同滤镜下的视图如图7所示。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，其特征在于，所述微液滴数字PCR的实现系统包括微液滴制备单元、PCR扩增单元和荧光检测分析单元；
所述微液滴制备单元包括驱动器、扰动装置、微液滴生成器，所述微液滴生成器包括油相通道、样本通道和检测腔室，所述油相通道内通有油相，所述样本通道内通有离散相，所述离散相为待检测样本与PCR反应试剂的混合液体，所述油相通道和样本通道汇聚后与所述检测腔室连通；
电源连接所述驱动器，所述驱动器实现电信号的放大，所述驱动器产生的放大驱动信号作用于所述扰动装置，所述扰动装置将电信号转化为震动信号，所述扰动装置作用于油相，扰动装置在油相中产生速度脉冲，进而油相在微液滴生成器中剪切离散相，生成微液滴；生成的微液滴被收集在检测腔室，微液滴在检测腔室内均匀摊开，PCR扩增单元对检测腔室内的微液滴进行加热以实现PCR扩增反应；然后荧光检测分析单元直接对PCR扩增反应后的微液滴进行数据读取和分析，完成对样本的核酸定量检测；
所述微液滴的生成频率与驱动器产生的驱动信号频率一致；所述微液滴的生成频率大于每秒100个。
2.根据权利要求1所述的一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，其特征在于，所述油相通道、样本通道和检测腔室设置在液滴芯片上，油相和离散相通过输送泵分别进入所述油相通道和样本通道，所述扰动装置作用于油相产生速度脉冲，然后产生速度脉冲的油相与样本通道内的离散相汇聚，油相将离散相剪切成微液滴后，微液滴进入所述检测腔室，所述检测腔室上设有出口；所述PCR扩增单元包括循环加热机构，所述循环加热机构对所述液滴芯片进行循环加热实现PCR扩增反应；所述荧光检测分析单元包括高敏照相机，所述高敏照相机对所述液滴芯片内的微液滴进行拍照。
3.根据权利要求2所述的一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，其特征在于，所述的扰动装置为压电片、压电陶瓷管或偏心轮式振动器；所述输送泵为注射泵或压力泵。
4.根据权利要求2所述的一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，其特征在于，所述扰动装置与液滴芯片分别独立安装设置，输送油相的输送泵出口油路先通过扰动装置再连接连通管路的一端，所述连通管路的另一端连接所述油相通道；所述扰动装置为压电片，所述油路的壁面上安装有一个或若干压电片，或者所述油路的上下壁面均设有压电片。
5.根据权利要求2所述的一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，其特征在于，所述油相通道和样本通道在液滴芯片上呈T字形错流结构、Y字形错流结构或十字形流动聚焦结构。
6.根据权利要求2所述的一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，其特征在于，所述液滴芯片上设有若干组微液滴生成器，每组微液滴生成器均包括油相通道、样本通道和检测腔室，采用单一扰动装置驱动所有油路或者每条油路均设置独立的扰动装置。
7.根据权利要求6所述的一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，其特征在于，每条油路的出口处均设有转向阀，所述转向阀连接油路、气泵和油相通道。
8.根据权利要求2所述的一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，其特征在于，所述检测腔室的进口处设有封堵机构，所述检测腔室的出口处设有封堵机构。
9.根据权利要求1所述的一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，其特征在于，所述驱动器产生的驱动信号为三角波、矩形波或正弦波。
10.根据权利要求1-9任意一项所述的一种高通量一体式微液滴数字PCR的实现系统，其特征在于，所述微液滴数字PCR的实现系统包括GUI及数据分析模块，GUI及数据分析模块控制所述微液滴数字PCR的实现系统的运行。
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