CN1200111C - 一种基于微流控技术的流式细胞仪 - Google Patents

Abstract

一种基于微流控技术的流式细胞仪涉及的是采用微流控芯片微型流失细胞仪。主要结构由底座、机箱、微流控芯片、光学检测单元、流体输入输出接口、微位移调节平台、信号处理箱、连接电缆、控制主机等组成。底座固定在机箱上，微位移平台固定在底座上，微流控芯片固定在微位移平台上，流体输入输出接口通过平台与微流控芯片相连接，光学检测单元位于微流控芯片的上方，通过调节相对位置完成光学检测，同时芯片上的分选单元完成分选工作。

Description

一种基于微流控技术的流式细胞仪

技术领域

本发明涉及的是一种基于微流控技术的新型流式细胞仪。流式细胞仪可以对生物颗粒(主要是细胞、微生物、人工合成微球)的多种物理和生物学特性进行快速定量分析，并对特定细胞群体加以分选。

背景技术

流式细胞仪在当前的细胞生物学、免疫学、肿瘤学、血液学、病理学、遗传学、临床检验学等多学科领域有着广泛的用途。从首次对流动状态的细胞进行观察至今已经过了半个世纪，流式细胞术从显微镜下肉眼观察毛细管中流动的细胞，用简单的光电装置加以记录，发展到今天一种快速(每秒测量数干个细胞)、多参数相关测量(不仅能对细胞群体或组成的亚群进行定量分析，还可以同时定量细胞的DNA或RNA含量，酶量活性)和进行分选(从细胞群体中分离和纯化某个亚群以便进一步的对其功能、形态学研究和培养或做其他分析)的高度先进的技术方法。流式细胞术是对微生物粒子的光学特性敏感和多功能的探测方法。流式细胞仪的工作原理是将待测细胞制备成单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在气体的压力作用下进入流动室。流动室内充满鞘液，鞘液约束细胞排列成单列由流动室的喷嘴喷出，成为细胞液柱。液柱与入射的激光束椭圆形焦斑垂直相交，相交点为测量区。通过测量区的细胞被激光激发产生荧光。在激光入射光束和液柱垂直方向放置光学系统(透镜、光阑、滤片和检测器等)用以收集荧光信号。荧光检测器为光电倍增管，用以收集不同波长的荧光信号。散射光检测器为光电二极管，用来收集前向散射光和侧向散射光。细胞分选的原理是：液滴形成频率约30KHZ的信号，此信号加在压电晶体上使之产生不同频率的机械振动，流动室也随之振动，于是液柱断裂成一连串均匀的液滴，其形成速度约为3万/秒。如果细胞的特性与被选定要进行分选的细胞特性相符，则仪器在这个被选定的细胞刚形成液滴时给整个液柱充以指定的电荷，带有电荷的液滴在高压静电场的作用下偏转落入指定的容器，从而实现对细胞分类的收集。传统的商用的流式细胞仪是大型的、复杂的仪器，需要有经验的操作者使用。

微流控芯片技术的提出由来已久。随着半导体制造技术的推进，半导体芯片的存储能力以几何级数增长，人们对信息的处理能力也随着并行处理技术的提出得到迅速的发展。信息的并行化处理促进了对未知探求能力的提高。典型的事例就是人类基因组计划。大规模测序能力为人类基因组计划的提前完成奠定了基础。同时利用人类基因的海量信息，各国的科学家设计出生物芯片来并行检测人们的各种生化病理的指标，目前的这个领域的飞速发展证明了该产业的巨大的潜在的市场和发展前景。

将传统的生化实验的方法和仪器微型化和小型化的思路在90年代初A。MANZ的微化学分析系统的论文中得到初步的实现。随后出现了各种起源于半导体微细加工技术的微型化化学处理芯片技术，例如NANOGEN公司的电场化学处理芯片，CALIPER公司的流体芯片，REDWOODMICRO公司的微流体系统等。HP公司和专注于生物信息处理的CALIPER公司组成联合开发计划从事芯片实验室的开发。他们预计芯片实验室的市场在未来几年有10亿美圆。典型的专禾U有US6071394，5632286，5639423，5824204，5890745，6099803，5296114等。

同时有关微流体板、微流体泵、微流体阀等执行器的研究也得到开展。各种利用硅加工技术的微阀，利用热源，压力源，电驱动硅膜、形状记忆合金薄膜实现微阀的开闭对微流体的通断进行控制。微流体的泵利用对流体压力驱动实现。微泵的分类从驱动角度来分为：热驱动、压电驱动、静电驱动、电磁驱动等。泵的流量由7。5UL/MIN到1200UL/MIN。德国学者研制出微流体板，将微泵、微阀、微流体通道集成起来，同时采用柔性连接的思路对流体板进行组合完成更强的功能。

微流体通道的研究得到了许多可喜的结果。在硅基体上利用硅光刻、腐蚀、反应离子刻蚀、离子铣削等方法成功地得到各种形状和深宽比的微通道。此外借助LIGA技术、微注塑技术能够大批量生产带有微流体通道的零件。

芯片材料主有玻璃、硅片、石英、塑料、PCB板等。采用腐蚀或注塑的方法在基体的表面加工出流体腔或者流体槽。每种材料各有千秋。石英绝缘性能良好，紫外光透过性强，是电泳分析理想基材。聚合物材料适用于廉价的批量生产。硅片因为IC工艺也适用于大批量生产，但由于其半导体材料，施加高压从现实的使用角度不可行。

微流体芯片的处理过程中的微质量的疏运过程，微热量的输运过程，电场、磁场、使用过程中的应力、应变，流体管道和反应室表面特性的改变等微流体的输入、输出的接口一直是困绕研究者的难题。目前典型的方法借用流体系统内置式细管与外面的流体池或流体驱动系统相连接。加州大学DAVIS分校的研究小组提出了利用机械榫接的各种接口，腐蚀内圆外方的转接头连接微流体通道与外部的流体源。同时他们又提出一种利用玻璃毛细管接口微流体的方法。在硅片上腐蚀微孔环，将毛细管固定在微孔中，流体通过毛细管和微孔进入流道。此外，细管的材料有不锈钢管，聚四氟等。微流体芯片的纯化功能主要采用电场或磁场对带电流体进行分离。典型的应用电泳芯片和细胞流变学测量芯片。芯片的检测主要采用光学检测的方法。目前根据芯片的不同应用目的采用不同的检测手段。典型的应用例子是毛细管电泳芯片，采用CCD扫描方法将芯片上不同的条带图象记录下来，利用专用图象处理软件对CE的结果进行分析。此外采用类似激光共聚焦的方法对弱信号(荧光信号)检测，典型的例子是基因芯片检测仪·

发明内容

鉴于微流体系统巨大的潜在的产业价值，我们经过大量的调研和初步的研究，利用各种可以得到的先进制造技术研制小型化和微型化的微流体芯片以及包含微流控芯片和紧凑的光学平台的微型流式细胞仪。

针对传统流式细胞仪复杂、不利于个体化诊断和治疗的不足，提出一种基于微流控技术的流式细胞仪。本发明的目的是为了提高流式细胞仪的实用性以及个人化的需求，研制一种微型的流式细胞仪。

一种基于微流控技术的流式细胞仪是采用下列方案实现的：微型流式细胞仪主要结构由底座、机箱、可更换的微流控芯片、紧凑的光学检测单元、流体输入输出接口、微位移调节平台、信号处理箱、连接电缆、控制主机等组成。底座固定在机箱上，微位移平台固定在底座上，微流控芯片固定在微位移平台上，流体输入输出接口通过平台与微流控芯片相连接，光学检测单元位于微流控芯片的上方，通过调节相对位置完成光学检测，同时芯片上的分选单元完成分选工作。微流控芯片包括接口板、微流道板、传感器和电路板组成，在微流道板上有流道、分选支路和分选微阀。

光学检测单元包括激光器，光纤，聚焦头，小角度散射检测器，大角度散射检测器以及各种镜组。

其工作原理是：流体经过流体输入输出进入微流体的通道，由于微流体通道宽度尺寸在粒子直径的2-4倍，进入流道的粒子排列成行，激光器或光纤将激发光引入检测区，当粒子通过检测区时，光线发生散射和激发荧光，在流道的前方放置小角度的检测器和在与入射光和散射光相交面垂直方向的放置大角度检测器，用以收集大角度散射和荧光。细胞在液流中通过检测区时经过激光照射，细胞向空间360度立体角的所有方向散射光线，散射的信号与细胞的大小、形状、质膜和细胞内部的折射率有关。小角度散射的强度与细胞的大小有关。大角度散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率较为敏感，与细胞内部的精细结构和颗粒性质信息有关。当细胞染色后在入射光的照射下产生荧光，通过大角度散射检测器收集。小角度检测器采用光电二极管，大角度检测器采用光电倍增管。从功能模块上分类，基于微流控技术的流式细胞仪其组成包括可任意更换的微流体单元(1)和光学检测单元(2)以及流体的输入输出单元(3)、流体粒子的分选单元(4)和控制系统(5)。

根据本发明(1)，微流体单元采用传统IC的微细加工的方法获得或微注塑方法。微流道的截面可以是半圆形、方形、梯形、三角形、六边形等形状。注塑的材料可以是聚碳酸脂、硅胶、聚四氟乙烯等。检测窗在流道的盖板上加工出来。流道采用精密电火花、电解、线切割、激光加工等方法获得。流道的直径介于流体中最大粒子直径的1倍到4倍之间。根据本发明(2)，光学检测单元包括激光器、扩束镜组、聚焦镜组，分光器镜组、滤色片组、光电转换器件等各种器件组合。流体或鞘流流经微流体通道时，由于细胞或粒子成行排列，入射光与细胞相互作用，导致光的散射或激发荧光。根据本发明(3)，流体的输入输出采用软管、毛细管、头皮针管等。采用腐蚀或打孔的方法在微流道的两端加工出流体输入输出的接口，为了提高液体的密封能力，在接口出采用橡胶微密封零件，同时安装流体微阀一控制流体进入流道。流体的进样采用压力进样，柱塞泵进样、电渗进样等方法。根据本发明(4)，在主流道的两侧加工微电极，当对流体中的粒子进行完识别后，给粒子及该段液柱施加电场，同时打开分选支路入口的微阀，将粒子牵引到支路上去，完成对粒子的分选。根据本发明(5)，流体的进样，检测数据，光源的调节等由控制软件完成，当液体中的细胞在激光的照射下向各个方向发射散射光和荧光，通过放在各个方向的检测器收集每个细胞的相关参数。检测器的输出经过A/D转换由控制软件处理成各种结果。

本发明与现有的商用流式细胞仪相比具有如下优点：(1)由于采用微流体控制芯片，仪器功能与商用相同，但仪器小型化，便于携带；(2)由于采用紧凑的光学检测设计，芯片与光学检测平台之间进行快插式连接，同时采用自动调节平台完成光学对准，操作简便：(3)快插式的流体接口，密封可靠安全。

附图说明

结合附图对本实用新型作进一步说明。

图1是流体单元和光学检测示意图，虚线表示红细胞的散射光。

图2是外围流体进样示意图。

图3是PDMS流体的通道示意图。

图4是控制系统的框图。

具体实施方式

参照附图1-4，微型流式细胞仪主要结构由外围流体进样、流体单元和光学检测单元组成。一种基于微流控技术的流式细胞仪，其特征在于：主要结构由底座、机箱、可更换的微流控芯片、紧凑的光学检测单元、流体输入输出接口、微位移调节平台、信号处理箱、连接电缆、控制主机组成，底座固定在机箱上，微位移平台固定在底座上，微流控芯片固定在微位移平台上，流体输入输出接口通过平台与微流控芯片相连接，光学检测单元位于微流控芯片的上方，光学检测单元通过连接电缆与信号处理箱相连，信号处理箱通过连接电缆与控制主机相连接。微流控芯片包括接口板、微流道板、传感器和电路板组成，在微流道板上有流道、分选支路和分选微阀。微流控芯片10与微位移平台放置在支撑板(底座)9上，在芯片10加工出输入输出12和14，微流道13，玻璃盖片11与10键合构成封闭的流道。流体储液池17的流体在电磁阀16的控制下进入微流道，流体最后流入废液池15。激光器1、光纤2、聚焦头3、大角度检测器4、镜头5、小角度检测器6、阻挡区7、微流体基片和玻璃盖片8，红细胞在流道中定向流动时，激光器1的光经过光纤2和聚焦头3(488nmHe-Ne激光器)入射到流道13(流道器件的本体为8)相交区，在测量区光束在细胞的表面向各个方向散射，向前的小角度散射光照射到小角度检测器6上，直接反射的光被阻挡区7隔断，降低检测噪声，荧光和大角度散射光照射到大角度散射检测器4上。检测器的光电信号经过放大进入A/D采集板，利用数据处理软件获得不同散射强度的各种处理图，从而对粒子的特性进行表征。

参照附图1，根据本发明，流体单元和检测的设计如图1所示。图1流体单元和光学检测示意图，虚线表示红细胞的散射光，光学检测单元包括激光器1、光纤2、聚焦头3、大角度检测器4、镜头5、小角度检测器6、阻挡区7、微流体基片和玻璃盖片8，红细胞在流道中定向流动时，激光器1的光经过光纤2和聚焦头3(488nmHe-Ne激光器)入射到流道13相交区，在测量区光束在细胞的表面向各个方向散射，向前的小角度散射光照射到小角度检测器6上，直接反射的光被阻挡区7隔断，降低检测噪声，荧光和大角度散射光照射到大角度散射检测器4上。检测器的光电信号经过放大进入A/D采集板，利用数据处理软件获得不同散射强度的各种处理图，从而对粒子的特性进行表征。

根据本发明，外围流体进样示意图，如图2所示。调节流体的水头压力和调节阀的通断，获得微量流体的进样。微流控芯片10放置在支撑板(底座)9上，在芯片10加工出输入输出12和14，微流道13，玻璃盖片11与10键合构成封闭的流道。流体储液池17的流体在电磁阀16的控制下进入微流道，流体最后流入废液池15。

根据本发明，PDMS流体的通道如图3所示。流体芯片接口板18带有接口19与微流道板20和传感器和控制电路板21键合构成微流控芯片10。在微流道板上带有分选支路和相关的微阀。

根据本发明，控制系统的框图如图4所示。系统在主界面的控制下进入模块控制将硬件有机联系形成功能化的仪器。

Claims (2)

1、一种基于微流控技术的流式细胞仪，其特征在于：主要结构由底座、机箱、可更换的微流控芯片、紧凑的光学检测单元、流体输入输出接口、微位移调节平台、信号处理箱、连接电缆、控制主机组成，底座固定在机箱上，微位移平台固定在底座上，微流控芯片固定在微位移平台上，流体输入输出接口通过平台与微流控芯片相连接，光学检测单元位于微流控芯片的上方，微流控芯片包括接口板、微流道板、传感器和电路板组成，在微流道板上有流道、分选支路和分选微阀。

2、根据权利要求1所述的一种基于微流控技术的流式细胞仪，其特征在于：光学检测单元包括激光器，光纤，聚焦头，小角度散射检测器，大角度散射检测器以及各种镜组。

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