CN110945139B - 用于分选液滴和珠的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
提供了用于分选液滴的方法和系统。在一些情况下，被占据的液滴可以与未被占据的液滴分选开。在一些情况下，被单独占据的液滴可以与未被占据的液滴和被多重占据的液滴分选开。提供了用于分选细胞珠的方法和系统。在一些情况下，细胞珠可以从未被细胞衍生物占据的颗粒分选出来。在一些情况下，被单独占据的细胞珠可以与未被占据的颗粒和多重占据的细胞珠分选开。提供了用于基于液滴的占据率和尺寸选择性地聚合液滴的方法和系统。
Description
交叉引用
本申请要求于2017年5月18日提交的美国临时专利申请号62/508,219的权益，该申请通过引用整体并入本文。
背景
样品可以被处理用于多种目的，诸如鉴定样品内部分的类型。样品可以是生物样品。生物样品可以被处理，诸如用于检测疾病(例如，癌症)或鉴定特定物质。存在用于处理样品的多种方法，诸如聚合酶链式反应(PCR)和测序。
生物样品可以使用多种反应环境诸如分配区(partition)来处理。分配区可以是孔或液滴。液滴或孔可以使得生物样品能够被分区并单独处理。例如，此类液滴可以与其他液滴在流体上分离，使得能够精确控制液滴中的各个环境。
可以生成多个液滴，使得一个或更多个液滴包括细胞和/或颗粒。细胞和/或颗粒可以是用于多种(例如，单细胞)应用，诸如核酸扩增和/或测序应用所感兴趣的。
概述
如本文所认识到的，当生成多个液滴时，一些液滴可以不包括任何颗粒，诸如细胞和珠。颗粒可以是珠，诸如凝胶珠和/或细胞珠。颗粒可以是生物颗粒，诸如细胞或细胞衍生物。颗粒，诸如凝胶珠，可以具有与其偶联的分子条形码。因此，本文认识到需要将多个液滴分选成第一子集的包括颗粒的液滴和第二子集的不包括颗粒的液滴。在一些情况下，当生成多个细胞珠时，与多个细胞珠一起生成的一些颗粒可以不包括任何细胞(例如，非细胞珠)。本文认识到需要分离多个细胞珠，诸如通过将多个颗粒分选成包括细胞第一子集的颗粒(例如，细胞珠)和不包括细胞的第二子集的颗粒。
在一些方面中，本文所描述的用于分选的系统和方法可以产生包含主要被单独占据的液滴(包含感兴趣的单个颗粒)的输出物。例如，多个液滴中的至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多可以是被单独占据的液滴。液滴可以诸如通过以下来分选：(i)将场可吸引的颗粒(例如，磁性颗粒)引入到液滴中并且使液滴经受场(例如，磁场)，(ii)使液滴经受压力脉冲并且基于流体动力分离液滴，和/或(iii)将液滴引导至液滴的流动路径中的界面物理结构(例如，具有孔)并且基于液滴的机械性质(例如，可变形性)分离液滴。
在一些方面中，本文所描述的用于分选的系统和方法可以产生包含主要是被单独占据的细胞珠(包含单个细胞)的输出物。例如，珠(或颗粒)的群体中的至少约90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多可以是被单独占据的细胞珠。细胞珠可以诸如通过以下来分离(或分选)：(i)诸如通过聚合包含场可吸引的颗粒的液滴来生成具有场可吸引的颗粒(例如，磁性颗粒)的细胞珠，并且使细胞珠经受场(例如，磁场)，(ii)使细胞珠经受压力脉冲并且经由流体动力分离细胞珠，和/或(iii)将细胞珠引导至细胞珠的流动路径中的界面物理结构(例如，具有孔)并且基于细胞珠的机械性质(例如，可变形性)分离细胞珠。在一些情况下，已经分选的液滴(其主要是被单独占据的液滴(例如，包含单个细胞))可以被聚合以生成主要被单独占据的细胞珠。在一些情况下，多个液滴可以被选择性地聚合，使得主要是(或仅)被单独占据的液滴被聚合以生成主要是被单独占据的细胞珠。
本文提供了用于分选液滴的方法和系统，该方法和系统可以将包括生物颗粒(例如，细胞)和/或其他颗粒(例如，凝胶珠、细胞珠等)的液滴与不包括生物颗粒和/或其他颗粒的液滴分离。所述方法和系统可以将被单独占据的液滴与非被单独占据的液滴分离，诸如与未被占据的液滴或被多重占据的液滴分离。在另一个方面中，本文提供了可以将包括细胞的颗粒(例如，细胞珠)与不包括细胞的颗粒分离的方法和系统。所述方法和系统可以将被单独占据的细胞珠与非被单独占据的颗粒分离，诸如与被未被占据的颗粒或被多重占据的细胞珠分离。分离的液滴(包括生物颗粒和/或其他颗粒)和/或分离的细胞珠(包括细胞)可以经受另外的应用，诸如核酸扩增和/或测序。有益地，这样的预分选可以通过显著节省时间和资源(例如，很贵的试剂)来增加下游应用的效率。
所述方法和系统通常通过生成多个液滴，使得多个液滴的每一个包含场可吸引的颗粒来操作。多个液滴中的给定液滴可以包括或可以不包括一个或更多个颗粒(例如，生物颗粒、珠等)。因此，包含场可吸引的颗粒的多个液滴可以包含包括一个或更多个颗粒的第一子集的液滴和不包括任何颗粒的第二子集的液滴。包括一个或更多个颗粒的第一子集的液滴中的给定液滴可以包含与不包括任何颗粒的第二子集的液滴中的给定液滴相比足够有差异的数目或浓度的场可吸引的颗粒，使得当多个液滴经受电场或磁场时，第一子集的液滴和第二子集的液滴彼此分离。在一些情况下，当多个液滴经受电场或磁场时，被单独占据的液滴可以与未被占据的液滴和另外的被多重占据的液滴分离。
在一些情况下，可以生成具有场可吸引的颗粒的多个颗粒，诸如通过聚合包含场可吸引的颗粒的多个液滴进行。给定的颗粒可以包括或可以不包括细胞。因此，包含场可吸引的颗粒的多个颗粒可以包含包括细胞的第一子集的颗粒(例如，细胞珠)和不包括细胞的第二子集的颗粒。第一子集的颗粒中的给定细胞珠可以包含与第二子集的颗粒中的给定颗粒相比足够有差异的数目或浓度的场可吸引的颗粒，使得当多个颗粒经受电场或磁场时，第一子集的颗粒和第二子集的颗粒彼此分离。在一些情况下，当多个颗粒经受电场或磁场时，被单独占据的细胞珠可以与未被占据的颗粒和另外的被多重占据的细胞珠分离。
在一些情况下，可以生成不具有场可吸引的颗粒的多个液滴。多个液滴中的给定液滴可以包括或可以不包括一个或更多个颗粒。因此，多个液滴可以包含包括一个或更多个颗粒的第一子集的液滴和不包括任何颗粒的第二子集的液滴。多个液滴可以经受压力脉冲，并且第一子集的液滴和第二子集的液滴可以经由流体动力彼此分离。在一些情况下，多个液滴可以经受电场，并且第一子集和第二子集的液滴可以经由介电泳分离。在一些情况下，被单独占据的液滴可以与未被占据的液滴和另外的被多重占据的液滴分离。
在一些情况下，可以生成不具有场可吸引的颗粒的多个颗粒。多个颗粒中的给定颗粒可以包括或可以不包括一个或更多个细胞。因此，多个颗粒可以包含包括一个或更多个细胞的第一子集的颗粒(例如，细胞珠)和不包括任何细胞的第二子集的颗粒。多个颗粒可以经受压力脉冲，并且第一子集的颗粒和第二子集的颗粒可以经由流体动力彼此分离。在一些情况下，多个颗粒可以经受电场，并且第一子集和第二子集可以经由介电泳分离。在一些情况下，被单独占据的细胞珠可以与未被占据的颗粒和另外的被多重占据的细胞珠分离。
在一些情况下，包含包括一个或更多个颗粒的第一子集的液滴和不包括任何颗粒的第二子集的液滴的多个液滴可以基于液滴的机械性质诸如液滴的各自的可变形性性质，经由被动机制来分选。当多个液滴被引导穿过一个或更多个孔口(aperture)(每个孔口具有小于液滴的最小尺寸的尺寸)时，仅变形的液滴可以穿过孔口，并且未变形的液滴可以被捕获在孔口上。未被占据的液滴与被占据的液滴相比可以具有更高的可变形性和/或更低的表面张力性质，从而允许被占据的液滴被捕获在一个或更多个孔口上，并且允许未被占据的液滴穿过一个或更多个孔口，从而从多个液滴中分离第一子集和第二子集的液滴。
在一些情况下，包含包括一个或更多个细胞的第一子集的颗粒(例如，细胞珠)和不包括任何颗粒的第二子集的颗粒的多个颗粒可以基于颗粒的机械性质诸如颗粒的各自的可变形性性质(或刚性)，经由被动机制来分选。当多个颗粒被引导穿过一个或更多个孔口(每个孔口具有小于颗粒的最小尺寸的尺寸)时，仅变形的颗粒可以穿过孔口，并且未变形的颗粒可以被捕获在孔口上。未被占据的颗粒(例如，不具有细胞或其衍生物)与细胞珠相比可以具有更高的可变形性和/或更低的表面张力性质，从而允许细胞珠被捕获在一个或更多个孔口上，并且允许未被占据的颗粒穿过一个或更多个孔口，从而从多个颗粒中分离第一子集和第二子集的颗粒。
在一个方面中，提供了用于分选液滴的方法，该方法包括：(a)使第一相与第二相接触以生成多个液滴，其中所述第一相和所述第二相是不混溶的，其中所述多个液滴包含场可吸引的颗粒，并且其中(i)第一子集的所述多个液滴包括生物颗粒或具有与其偶联的分子条形码的颗粒，以及(ii)第二子集的所述多个液滴不包括生物颗粒；(b)将多个液滴沿着第一通道引导至第一通道与第二通道和第三通道的交叉点；以及(c)在足以将第一子集的多个液滴中的至少一部分与第二子集的多个液滴中的至少一部分分离的条件下，使包含场可吸引的颗粒的多个液滴经受电场或磁场，其中在分离后，第一子集的多个液滴中的至少所述部分沿着第二通道流动，并且第二子集的多个液滴中的至少所述部分沿着第三通道流动。
在一些实施方案中，第二子集的多个液滴不包括具有与其偶联的分子条形码的颗粒。
在一些实施方案中，第二子集的多个液滴中的场可吸引的颗粒的浓度是基本上均匀的。
在一些实施方案中，第一子集的多个液滴中的每个液滴包含比第二子集的多个液滴中的每个液滴少的场可吸引的颗粒。在一些实施方案中，其中电场或磁场在第二子集的多个液滴上感应的力大于在第一子集的多个液滴上感应的力。
在一些实施方案中，场可吸引的颗粒是磁场可吸引的颗粒。在一些实施方案中，场可吸引的颗粒是顺磁性颗粒。
在一些实施方案中，场可吸引的颗粒是电场可吸引的颗粒。在一些实施方案中，场可吸引的颗粒是导电颗粒。
在一些实施方案中，第一子集的多个液滴包括生物颗粒和具有与其偶联的分子条形码的颗粒。在一些实施方案中，具有与其偶联的分子条形码的颗粒是珠。在一些实施方案中，珠是凝胶珠。
在一些实施方案中，所述方法还包括在(c)之后，使来源于第一子集中的生物颗粒的核酸分子经受核酸测序。在一些实施方案中，所述方法还包括在(c)之后，使第一子集的多个液滴经受核酸扩增条件，以产生来自第一子集中的生物颗粒的核酸分子的扩增产物。在一些实施方案中，所述方法还包括使扩增产物经受核酸测序。
在一些实施方案中，足以分离第一子集的多个液滴中的至少所述部分和第二子集的多个液滴中的至少所述部分的电场或磁场的条件至少部分地基于多个液滴的尺寸和第一子集的多个液滴中的生物颗粒和/或具有与其偶联的分子条形码的颗粒的尺寸之间的比率来确定。
在一些实施方案中，多个液滴使用压力脉冲沿着第一通道被引导。
在一些实施方案中，分子条形码被可释放地偶联至颗粒。
在一些实施方案中，所述方法还包括使第一子集的多个液滴中的单独的液滴经受刺激，以促进生物颗粒中的聚合。在一些实施方案中，刺激是光学刺激。在一些实施方案中，光学刺激是激光或紫外光。在一些实施方案中，刺激是化学刺激。在一些实施方案中，刺激在交叉点之前被施加。在一些实施方案中，刺激沿着第一通道被施加。在一些实施方案中，刺激沿着第二通道被施加。在一些实施方案中，所述方法还包括(i)检测单独的液滴，以及(ii)在检测单独的液滴后使单独的液滴经受刺激。
在一些实施方案中，生物颗粒是封闭在凝胶或聚合物基体内或构成(comprising)凝胶或聚合物基体的细胞。
在一些实施方案中，第一子集包含第三子集的液滴和第四子集的液滴，第三子集的液滴各自包含单个生物颗粒，第四子集的液滴各自包含多个生物颗粒，所述方法还包括：将第一子集的多个液滴沿着第二通道引导至第二通道与第四通道和第五通道的第二交叉点，以及在足以将第三子集中的至少一部分与第四子集中的至少一部分分离的条件下，使第一子集经受电场或磁场，其中在分离后，第三子集的液滴中的至少所述部分沿着第四通道流动，并且第四子集的液滴中的至少所述部分沿着第五通道流动。
在另一个方面中，提供了用于分选液滴的系统，该系统包括：流体流动路径，该流体流动路径包含第一通道、第二通道和第三通道；流体流动单元，该流体流动单元被配置成使多个液滴沿着第一通道流动，其中所述多个液滴在使第一相与第二相接触后生成，其中所述第一相和所述第二相是不混溶的，其中所述多个液滴包含场可吸引的颗粒，并且其中(i)第一子集的所述多个液滴包括生物颗粒或具有与其偶联的分子条形码的颗粒，以及(ii)第二子集的所述多个液滴不包括生物颗粒；场施加单元，该场施加单元被配置成施加电场或磁场；以及控制器，该控制器被可操作地耦接至流体流动单元和场施加单元，其中所述控制器被编程为(i)引导流体流动单元，以使多个液滴沿着第一通道流动至第一通道与第二通道和第三通道的交叉点，以及(ii)引导场施加单元，以在足以将第一子集的多个液滴中的至少一部分与第二子集的多个液滴中的至少一部分分离的条件下，使包含场可吸收的颗粒的多个液滴经受电场或磁场，其中在分离后，第一子集的多个液滴中的至少所述部分沿着第二通道流动，并且第二子集的多个液滴中的至少所述部分沿着第三通道流动。
在一些实施方案中，第二子集的多个液滴不包括具有与其偶联的分子条形码的颗粒。
在一些实施方案中，场施加单元被配置成施加电场。在一些实施方案中，场施加单元被配置成施加磁场。在一些实施方案中，场施加单元被配置成施加电场和磁场。
在一些实施方案中，场可吸引的颗粒是磁场可吸引的颗粒。在一些实施方案中，场可吸引的颗粒是顺磁性颗粒。
在一些实施方案中，场可吸引的颗粒是电场可吸引的颗粒。在一些实施方案中，场可吸引的颗粒是导电颗粒。
在一些实施方案中，流体流动单元包括至少一个被配置成提供负压的泵。在一些实施方案中，流体流动单元包括至少一个被配置成提供正压的压缩机。
在一些实施方案中，流体流动单元被配置成施加压力脉冲以沿着第一通道引导多个液滴。
在一些实施方案中，流体流动单元被配置成施加压力脉冲，以分别沿着第二通道或第三通道引导第一子集或第二子集的多个液滴。
在一些实施方案中，控制器被编程为引导流体流动单元，以使第一子集的多个液滴在交叉点处经受压力脉冲，以使第一子集的多个液滴沿着第二通道流动。
在一些实施方案中，流体流动单元包括致动器，该致动器被配置成使多个液滴流动。
在一些实施方案中，控制器被编程为至少部分地基于多个液滴的尺寸和/或第一子集的多个液滴中的生物颗粒或具有与其偶联的分子条形码的颗粒的尺寸之间的比率来确定足以分离第一子集的多个液滴中的至少所述部分和第二子集的多个液滴中的至少所述部分的电场或磁场的条件。
在一些实施方案中，第一子集的多个液滴中的每个液滴包含比第二子集的多个液滴中的每个液滴少的场可吸引的颗粒。在一些实施方案中，其中电场或磁场在第二子集的多个液滴上感应的力大于在第一子集的多个液滴上感应的力。
在一些实施方案中，生物颗粒是封闭在凝胶或聚合物基体内或构成凝胶或聚合物基体的细胞。
在另一个方面中，提供了非暂时性计算机可读介质，该非暂时性计算机可读介质包含机器可执行代码，该机器可执行代码在被一个或更多个计算机处理器执行时实现用于分选液滴的方法，所述方法包括：(a)使第一相与第二相接触以生成多个液滴，其中所述第一相和所述第二相是不混溶的，其中所述多个液滴包含场可吸引的颗粒，并且其中(i)第一子集的所述多个液滴包括生物颗粒或具有与其偶联的分子条形码的颗粒，并且(ii)第二子集的所述多个液滴不包括生物颗粒；(b)将多个液滴沿着第一通道引导至第一通道与第二通道和第三通道的交叉点；以及(c)在足以将第一子集的多个液滴中的至少一部分与第二子集的多个液滴中的至少一部分分离的条件下，使包含场可吸引的颗粒的多个液滴经受电场或磁场，其中在分离后，第一子集的多个液滴中的至少所述部分沿着第二通道流动，并且第二子集的多个液滴中的至少所述部分沿着第三通道流动。
在另一个方面中，提供了用于分选液滴的方法，该方法包括：(a)使第一相与第二相接触以生成多个液滴，其中所述第一相和所述第二相是不混溶的，并且其中(i)第一子集的所述多个液滴包括生物颗粒或其颗粒包含与其偶联的分子条形码的颗粒，并且(ii)第二子集的所述多个液滴不包括生物颗粒；(b)将多个液滴沿着第一通道引导至第一通道与第二通道和第三通道的交叉点；以及(c)在交叉点处，在足以将第一子集的多个液滴中的至少一部分与第二子集的多个液滴中的至少一部分分离的条件下，使多个液滴经受压力脉冲，其中在分离后，第一子集的多个液滴中的至少所述部分沿着第二通道流动，并且第二子集的多个液滴中的至少所述部分沿着第三通道流动。
在一些实施方案中，第二子集的多个液滴不包括具有与其偶联的分子条形码的颗粒。
在一些实施方案中，压力脉冲在第二子集的多个液滴上感应的力大于在第一子集的多个液滴上感应的力。
在一些实施方案中，第一子集的多个液滴包括生物颗粒和具有与其偶联的分子条形码的颗粒。在一些实施方案中，具有与其偶联的分子条形码的颗粒是珠。在一些实施方案中，珠是凝胶珠。
在一些实施方案中，所述方法还包括在(c)之后，使来源于第一子集中的生物颗粒的核酸分子经受核酸测序。在一些实施方案中，所述方法还包括在(c)之后，使第一子集的多个液滴经受核酸扩增条件，以产生来自第一子集中的生物颗粒的核酸分子的扩增产物。在一些实施方案中，所述方法还包括使扩增产物经受核酸测序。
在一些实施方案中，分子条形码被可释放地偶联至颗粒。
在一些实施方案中，所述方法还包括使第一子集的多个液滴中的单独的液滴经受刺激，以促进生物颗粒中的聚合。在一些实施方案中，所述方法还包括(i)检测单独的液滴，以及(ii)在检测单独的液滴后使单独的液滴经受刺激。
在一些实施方案中，生物颗粒是封闭在凝胶或聚合物基体内或构成凝胶或聚合物基体的细胞。
在另一个方面中，提供了用于分选液滴的系统，该系统包括：流体流动路径，该流体流动路径包含第一通道、第二通道和第三通道；流体流动单元，该流体流动单元被配置成使多个液滴沿着第一通道流动，其中所述多个液滴在使第一相与第二相接触后生成，其中所述第一相和所述第二相是不混溶的，并且其中(i)第一子集的所述多个液滴包括生物颗粒或具有与其偶联的分子条形码的颗粒，以及(ii)第二子集的所述多个液滴不包括生物颗粒；压力施加单元，该压力施加单元被配置成施加压力脉冲；以及控制器，该控制器被可操作地耦接至流体流动单元和压力施加单元，其中所述控制器被编程为(i)引导流体流动单元，以使多个液滴沿着第一通道流动至第一通道与第二通道和第三通道的交叉点，以及(ii)引导压力施加单元，以在足以将第一子集的多个液滴中的至少一部分与第二子集的多个液滴中的至少一部分分离的条件下，使多个液滴经受压力脉冲，其中在分离后，第一子集的多个液滴中的至少所述部分沿着第二通道流动，并且第二子集的多个液滴中的至少所述部分沿着第三通道流动。
在另一个方面中，提供了非暂时性计算机可读介质，该非暂时性计算机可读介质包含机器可执行代码，该机器可执行代码在被一个或更多个计算机处理器执行时实现用于分选液滴的方法，所述方法包括：(a)使第一相与第二相接触以生成多个液滴，其中所述第一相和所述第二相是不混溶的，并且其中(i)第一子集的所述多个液滴包括生物颗粒或具有与其偶联的分子条形码的颗粒，以及(ii)第二子集的所述多个液滴不包括生物颗粒；(b)将多个液滴沿着第一通道引导至第一通道与第二通道和第三通道的交叉点；以及(c)在足以将第一子集的多个液滴中的至少一部分与第二子集的多个液滴中的至少一部分分离的条件下，使多个液滴经受压力脉冲，其中在分离后，第一子集的多个液滴中的至少所述部分沿着第二通道流动，并且第二子集的多个液滴中的至少所述部分沿着第三通道流动。
在另一个方面中，提供了用于液滴处理的方法，该方法包括：(a)使第一相与第二相接触以生成多个液滴，其中所述第一相和所述第二相是不混溶的，其中(i)第一子集的所述多个液滴包括生物颗粒，以及(ii)第二子集的所述多个液滴不包括生物颗粒；(b)将多个液滴沿着第一通道引导至第一通道与第二通道和第三通道的交叉点；(c)在交叉点之前，选择性地使第一子集的多个液滴中的单独的液滴经受刺激，以促进生物颗粒中的聚合；以及(d)在交叉点处将第一子集的多个液滴中的至少一部分与第二子集的多个液滴中的至少一部分分离，其中在分离后，第一子集的多个液滴中的至少所述部分沿着第二通道流动，并且第二子集的多个液滴中的至少所述部分沿着第三通道流动。
在一些实施方案中，第一子集的多个液滴包括具有与其偶联的分子条形码的颗粒。
在一些实施方案中，第二子集的多个液滴不包括具有与其偶联的分子条形码的颗粒。
在一些实施方案中，所述方法还包括(i)检测单独的液滴，以及(ii)在检测单独的液滴后，选择性地使单独的液滴经受刺激。
在另一个方面中，提供了用于分选液滴的方法，该方法包括：(a)使第一相与第二相接触以生成多个液滴，其中所述第一相和所述第二相是不混溶的，其中所述多个液滴包含场可吸引的颗粒，并且其中所述多个液滴包含(i)第一子集的液滴，该第一子集的液滴各自包括但不多于一个生物颗粒，和(ii)第二子集的液滴，该第二子集的液滴各自不包括任何生物颗粒或包括多于一个生物颗粒；(b)将多个液滴沿着第一通道引导至第一通道与第二通道和第三通道的交叉点；以及(c)在足以将第一子集的多个液滴中的至少一部分与第二子集的多个液滴中的至少一部分分离的条件下，使包含场可吸引的颗粒的多个液滴经受电场或磁场，其中在分离后，第一子集的多个液滴中的至少所述部分沿着第二通道流动，并且第二子集的多个液滴中的至少所述部分沿着第三通道流动。
在一些实施方案中，第一子集的多个液滴包括具有与其偶联的分子条形码的颗粒。在一些实施方案中，具有与其偶联的分子条形码的颗粒是珠。在一些实施方案中，珠是凝胶珠。
在一些实施方案中，不包括任何生物颗粒的第二子集的液滴中的场可吸引的颗粒的浓度是基本上均匀的。
在一些实施方案中，第一子集的多个液滴中的每个液滴包含(i)比不包括任何生物颗粒的第二子集的多个液滴中的每个液滴少的场可吸引的颗粒，以及(ii)比包括多于一个生物颗粒的第二子集的多个液滴中的每个液滴多的场可吸引的颗粒。在一些实施方案中，由电场或磁场在不包括任何生物颗粒的第二子集的液滴上感应的力大于在第一子集上感应的力，该在第一子集上感应的力大于在包括多于一个第二子集的生物颗粒中的液滴上感应的力。
在一些实施方案中，场可吸引的颗粒是磁场可吸引的颗粒。在一些实施方案中，场可吸引的颗粒是顺磁性颗粒。
在一些实施方案中，场可吸引的颗粒是电场可吸引的颗粒。在一些实施方案中，场可吸引的颗粒是导电颗粒。
在一些实施方案中，所述方法还包括在(c)之后，使来源于第一子集中的生物颗粒的核酸分子经受核酸测序。
在一些实施方案中，所述方法还包括在(c)之后，使第一子集的多个液滴经受核酸扩增条件，以产生来自第一子集中的生物颗粒的核酸分子的扩增产物。在一些实施方案中，所述方法还包括使扩增产物经受核酸测序。
在一些实施方案中，足以分离第一子集的多个液滴中的至少所述部分和第二子集的多个液滴中的至少所述部分的电场或磁场的条件至少部分地基于多个液滴的尺寸和第一子集的多个液滴中的生物颗粒的尺寸之间的比率来确定。
在一些实施方案中，多个液滴使用压力脉冲沿着第一通道被引导。
在一些实施方案中，所述方法还包括使第一子集的多个液滴中的单独的液滴经受刺激，以促进生物颗粒中的聚合。在一些实施方案中，刺激在交叉点之前被施加。在一些实施方案中，所述方法还包括(i)检测单独的液滴，以及(ii)在检测单独的液滴后使单独的液滴经受刺激。
在一些实施方案中，生物颗粒是封闭在凝胶或聚合物基体内或构成凝胶或聚合物基体的细胞。
在另一个方面中，提供了用于分选液滴的方法，该方法包括：(a)使第一相与第二相接触以生成多个液滴，其中所述第一相和所述第二相是不混溶的，其中所述多个液滴包含(i)第一子集的液滴，该第一子集的液滴各自包括但不多于一个生物颗粒和(ii)第二子集的液滴，该第二子集的液滴各自不包括任何生物颗粒或包括多于一个生物颗粒；(b)将多个液滴沿着第一通道引导至第一通道与第二通道和第三通道的交叉点；以及(c)在足以将第一子集的多个液滴中的至少一部分与第二子集的多个液滴中的至少一部分分离的条件下，使多个液滴经受压力脉冲，其中在分离后，第一子集的多个液滴中的至少所述部分沿着第二通道流动，并且第二子集的多个液滴中的至少所述部分沿着第三通道流动。
在一些实施方案中，第一子集的多个液滴包括具有与其偶联的分子条形码的颗粒。在一些实施方案中，具有与其偶联的分子条形码的颗粒是珠。在一些实施方案中，珠是凝胶珠。
在一些实施方案中，由压力脉冲在不包括任何第二子集的生物颗粒中的液滴上感应的力大于在第一子集上感应的力，该在第一子集上感应的力大于在包括多于一个第二子集的生物颗粒中的液滴上感应的力。
在一些实施方案中，所述方法还包括在(c)之后，使来源于第一子集中的生物颗粒的核酸分子经受核酸测序。在一些实施方案中，所述方法还包括在(c)之后，使第一子集的多个液滴经受核酸扩增条件，以产生来自第一子集中的生物颗粒的核酸分子的扩增产物。在一些实施方案中，所述方法还包括使扩增产物经受核酸测序。
在一些实施方案中，所述方法还包括使第一子集的多个液滴中的单独的液滴经受刺激，以促进生物颗粒中的聚合。在一些实施方案中，所述方法还包括(i)检测单独的液滴，以及(ii)在检测单独的液滴后使单独的液滴经受刺激。
在一些实施方案中，生物颗粒是封闭在凝胶或聚合物基体内或构成凝胶或聚合物基体的细胞。
在另一个方面中，提供了用于分选颗粒的方法，该方法包括：(a)提供多个颗粒，其中所述多个颗粒包含(i)第一子集的颗粒，该第一子集的颗粒各自包括来自多个细胞的生物颗粒或多个细胞的内容物和(ii)第二子集的颗粒，该第二子集的颗粒各自不包括来自多个细胞的生物颗粒或多个细胞的内容物；以及(b)对多个颗粒进行分选，从而将第一子集的颗粒中的至少一部分与第二子集的颗粒中的至少一部分分离。
在一些实施方案中，第一子集的颗粒包含第三子集的颗粒和第四子集的颗粒，第三子集的颗粒各自包括但不多于来自多个细胞的一个生物颗粒，第四子集的颗粒各自包括来自多个细胞的多于一个生物颗粒。在一些实施方案中，所述方法还包括对第一子集的颗粒进行分选，从而将第三子集的颗粒中的至少一部分与颗粒的第四子集中的至少一部分分离。
在一些实施方案中，(b)包括使多个颗粒经受磁场或电场。在一些实施方案中，多个颗粒中的每个颗粒包含场可吸引的颗粒。
在一些实施方案中，其中(b)包括使多个颗粒经受压力脉冲。
在另一个方面中，提供了用于分选颗粒的方法，该方法包括：(a)提供由多个细胞生成的多个颗粒，其中所述多个颗粒包含(i)第一子集的颗粒，第一子集的颗粒各自包括但不多于来自多个细胞的单个细胞的一个生物颗粒或来自多个细胞的单个细胞的内容物和(ii)第二子集的颗粒，该第二子集的颗粒各自不包括来自多个细胞的生物颗粒或多个细胞的内容物，或者包括来自多个细胞的多于一个生物颗粒或多个细胞的内容物；以及(b)对多个颗粒进行分选，从而将第一子集的颗粒中的至少一部分与第二子集的颗粒中的至少一部分分离。
在一些实施方案中，(b)包括使多个颗粒经受磁场或电场。在一些实施方案中，多个颗粒中的每个颗粒包含场可吸引的颗粒。
在一些实施方案中，(b)包括使多个颗粒经受压力脉冲。
在另一个方面中，提供了用于处理液滴的方法。所述方法可以包括：在第一相中提供多个凝胶珠，其中所述多个凝胶珠包含(i)分子条形码和(ii)场可吸引的颗粒；以及在足以将多个凝胶珠与第一相的至少50％分离的条件下，使包含场可吸引的颗粒的多个凝胶珠经受电场或磁场，从而在相对于第一相不混溶的第二相中提供多个凝胶珠。
在一些实施方案中，多个凝胶珠可以与第一相的至少60％分离。在一些实施方案中，多个凝胶珠可以与第一相的至少80％分离。在一些实施方案中，多个凝胶珠可以与第一相的至少90％分离。
在一些实施方案中，第一相可以是油相。在一些实施方案中，第二相可以是水相。
在另一个方面中，提供了用于对凝胶珠进行分选的方法，该方法包括：处理多个液滴以生成多个凝胶珠，其中所述多个液滴包含场可吸引的颗粒，并且其中(i)第一子集的所述多个凝胶珠包括生物颗粒或具有与其偶联的分子条形码的颗粒，以及(ii)第二子集的所述多个凝胶珠不包括生物颗粒，将多个凝胶珠沿着第一通道引导至第一通道与第二通道和第三通道的交叉点；以及在足以将第一子集的多个凝胶珠与第二子集的多个凝胶珠分离的条件下，使多个凝胶珠经受电场或磁场，其中在分离后，第一子集的多个凝胶珠沿着第二通道流动，并且第二子集的多个凝胶珠沿着第三通道流动。
在一些实施方案中，处理包括聚合多个液滴。
在另一个方面中，提供了用于对凝胶珠进行分选的方法，该方法包括：处理多个液滴以生成多个凝胶珠，其中(i)第一子集的所述多个凝胶珠包括生物颗粒或具有与其偶联的分子条形码的颗粒，并且(ii)第二子集的所述多个凝胶珠不包括生物颗粒，将多个凝胶珠沿着第一通道引导至第一通道与第二通道和第三通道的交叉点；以及在交叉点处，在足以将第一子集的多个凝胶珠与第二子集的多个凝胶珠分离的条件下，使多个凝胶珠经受压力脉冲，其中在分离后，第一子集的多个凝胶珠沿着第二通道流动，并且第二子集的多个凝胶珠沿着第三通道流动。
从以下详细描述，本公开内容的另外的方面和优点对本领域技术人员而言将容易地变得明显，详细描述中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方案。如将意识到的，本公开内容能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在多种明显的方面进行修改，所有这些都不偏离本公开内容。相应地，附图和描述被认为本质上是说明性的，而不是限制性的。
通过引用并入
在本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请通过引并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地且单独地指示通过引用并入一样。如果通过引用并入的出版物和专利或专利申请与包含在本说明书中的公开内容相矛盾，则本说明书意图取代和/或优先于任何此类矛盾的材料。
附图简述
在所附权利要求中具体阐述本发明的新颖特征。通过参考阐述说明性实施方案的以下详细描述和附图(在本文中也称为“图(Figure)”和“图(FIG)”)将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述说明性实施方案中利用本发明的原理，在附图中：
图1示出了用于分配单独的生物颗粒的微流体通道结构的实例。
图2A示出了用于将被占据的液滴与未被占据的液滴分离的微流体通道结构的实例。
图2B示出了用于分离被单独占据的液滴的多级微流体通道结构的实例。
图3示出了用于将被占据的液滴与未被占据的液滴分离的微流体通道结构的另一个实例。
图4示出了用于基于占据率选择性聚合分配区的微流体通道结构的实例。
图5示出了用于基于占据率选择性聚合分配区的微流体通道结构的另一个实例。
图6示出了用于基于液滴尺寸选择性聚合分配区的微流体通道结构的实例。
图7示出了对被占据的液滴和未被占据的液滴进行分选的方法的流程图。
图8示出了对被占据的液滴和未被占据的液滴进行分选的另一种方法的流程图。
图9示出了选择性地聚合被占据的液滴的方法的流程图。
图10示出了选择性地聚合适当尺寸的液滴的方法的流程图。
图11示出了用于将被占据的液滴与未被占据的液滴分离的微流体通道结构的实例。
图12示出了用于将携带条形码的珠递送至液滴的微流体通道结构的实例。
图13示出了用于共分配生物颗粒和试剂的微流体通道结构的实例。
图14示出了用于将珠受控地分配到离散液滴中的微流体通道结构的实例。
图15示出了用于增加液滴生成通量的微流体通道结构的实例。
图16示出了用于增加液滴生成通量的微流体通道结构的另一个实例。
图17A示出了具有用于受控分配的几何特征的微流体通道结构的另一个实例的横截面图。图17B示出了图17A的通道结构的透视图。
图18示出了被编程或以其他方式被配置为实现本文所提供的方法的示例性计算机控制系统。
图19图示出了携带条形码的珠的实例。
详细描述
虽然本文已经示出和描述了本发明的多种实施方案，但是对于本领域技术人员将明显的是，此类实施方案仅通过实例的方式提供。本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换而不偏离本发明。应当理解，可以采用本文所描述的本发明的实施方案的多种替代方案。
在将值描述为范围的情况下，将理解的是，此类公开内容包括在这样的范围内的所有可能的子范围的公开内容，以及落入这样的范围内的特定数值，不管特定数值或特定子范围是否明确说明。
如本文中所使用的，术语“条形码”通常指的是传达或能够传达关于分析物的信息的标签或标识符。条形码可以是分析物的一部分。条形码可以独立于分析物。除了分析物的内源性特征(例如，分析物的尺寸或者一个或多个末端序列)之外，条形码可以是附接至分析物(例如，核酸分子)的标签或标签的组合。条形码可以是独特的。条形码可以具有多种不同的格式。例如，条形码可以包括：多核苷酸条形码；随机核酸和/或氨基酸序列；以及合成核酸和/或氨基酸序列。条形码可以以可逆或不可逆的方式附接至分析物。条形码可以在样品的测序之前、期间和/或之后被添加至例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)样品的片段中。条形码可以允许鉴定和/或定量个体测序读段。
如本文中所使用的，术语“实时”可以指的是小于约1秒、十分之一秒、百分之一秒、毫秒或更小的响应时间。响应时间可以大于1秒。在一些情况下，实时可以指的是同时或基本上同时处理、检测或鉴定。
如本文中所使用的，术语“受试者”通常指的是动物诸如哺乳动物(例如，人)或禽类(例如，鸟)，或其他生物体诸如植物。例如，受试者可以是脊椎动物、哺乳动物、啮齿动物(例如，小鼠)、灵长类动物、猿猴或人。动物可以包括但不限于农场动物、运动型动物和宠物。受试者可以是健康的或无症状的个体、患有或疑似患有疾病(例如，癌症)或易患疾病的个体、和/或需要治疗或疑似需要治疗的个体。受试者可以是患者。受试者可以是微生物(microorganism)或微生物(microbe)(例如，细菌、真菌、古细菌、病毒)。
如本文中所使用的，术语“基因组”通常指的是来自受试者的基因组信息，其可以是例如受试者遗传信息的至少一部分或全部。基因组可以以DNA或以RNA来编码。基因组可以包含编码区域(例如，编码蛋白)以及非编码区域。基因组可以包括生物体中所有染色体的序列的集合。例如，人类基因组通常具有总计46条染色体。所有这些的序列可以共同构成人类基因组。
术语“衔接子(adaptor)”、“衔接子(adapter)”和“标签”可以同义地使用。衔接子或标签可以通过任何方法包括连接、杂交或其他方法与待“加标签”的多核苷酸序列偶联。
如本文中所使用的，术语“测序”通常指的是用于确定一种或更多种多核苷酸中的核苷酸碱基的序列的方法和技术。多核苷酸可以是例如核酸分子诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，包括其变体或衍生物(例如，单链DNA)。测序可以通过目前可用的多种系统来进行，诸如但不限于通过Pacific Biosciences/>Oxford或Life Technologies(Ion/>)的测序系统。可选择地或另外地，测序可以使用核酸扩增、聚合酶链式反应(PCR)(例如，数字PCR、定量PCR或实时PCR)或等温扩增来进行。此类系统可以提供对应于受试者(例如，人)的遗传信息的多个原始遗传数据，如通过系统从由受试者所提供的样品中生成的。在一些实例中，此类系统提供测序读段(在本文中也称为“读段”)。读段可以包括对应于已经被测序的核酸分子的序列的一串核酸碱基。在一些情况下，本文所提供的系统和方法可以与蛋白质组信息一起使用。
如本文中所使用的，术语“珠”通常指的是颗粒。珠可以是固体或半固体颗粒。珠可以是凝胶珠。凝胶珠可以包括聚合物基体(例如，通过聚合或交联形成的基体)。聚合物基体可以包括一种或更多种聚合物(例如，具有不同的官能团或重复单元的聚合物)。聚合物基体中的聚合物可以诸如在无规共聚物中随机地排列，和/或诸如在嵌段共聚物中具有有序结构。交联可以经由共价、离子或诱导、相互作用或物理缠结。珠可以是大分子。珠可以由结合在一起的核酸分子形成。珠可以经由分子(例如，大分子)诸如单体或聚合物的共价或非共价组装来形成。此类聚合物或单体可以是天然的或合成的。此类聚合物或单体可以是例如核酸分子(例如，DNA或RNA)或包括例如核酸分子(例如，DNA或RNA)。珠可以由聚合物材料形成。珠可以是磁性的或非磁性的。珠可以是刚性的。珠可以是柔性的和/或可压缩的。珠可以是可破坏的或可溶解的。珠可以是覆盖有包含一种或更多种聚合物的涂层的固体颗粒(例如，包括但不限于氧化铁、金或银的基于金属的颗粒)。这样的包衣可以是可破坏的或可溶解的。
如本文中所使用的，术语“样品”通常指的是受试者的生物样品。生物样品可以包含任何数目的大分子，例如细胞大分子。样品可以是细胞样品。样品可以是细胞系或细胞培养物样品。样品可以包括一个或更多个细胞。样品可以包括一个或更多个微生物。生物样品可以是核酸样品或蛋白质样品。生物样品也可以是碳水化合物样品或脂质样品。生物样品可以来源于另一个样品。样品可以是组织样品，诸如活组织检查、核心活组织检查(corebiopsy)、针吸出物或细针吸出物。样品可以是流体样品，诸如血液样品、尿液样品或唾液样品。样品可以是皮肤样品。样品可以是脸颊拭子。样品可以是血浆样品或血清样品。样品可以是无细胞(cell-free)样品或不含细胞(cell free)样品。无细胞样品可以包括细胞外多核苷酸。细胞外多核苷酸可以从身体样品中分离，所述身体样品可以选自由以下组成的组：血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜分泌物、痰、粪便和泪液。
如本文中所使用的，术语“生物颗粒”通常指的是来源于生物样品的离散生物系统。生物颗粒可以是大分子。生物颗粒可以是小分子。生物颗粒可以是病毒。生物颗粒可以是细胞或细胞的衍生物。生物颗粒可以是细胞器。生物颗粒可以是来自细胞群体的稀有细胞。生物颗粒可以是任何类型的细胞，包括但不限于原核细胞、真核细胞、细菌、真菌、植物、哺乳动物或其他动物细胞类型、支原体、正常组织细胞、肿瘤细胞或任何其他细胞类型，无论是来源于单细胞生物体还是多细胞生物体。生物颗粒可以是细胞的成分。生物颗粒可以是或可以包括DNA、RNA、细胞器、蛋白质或其任何组合。生物颗粒可以是或可以包括基体(例如，凝胶或聚合物基体)，所述基体包含细胞或来自细胞的一种或更多种成分(例如，细胞珠)，诸如来自细胞的DNA、RNA、细胞器、蛋白质或其任何组合。生物颗粒可以从受试者的组织获得。生物颗粒可以是硬化细胞。这样的硬化细胞可以包括或可以不包括细胞壁或细胞膜。生物颗粒可以包括细胞的一种或更多种成分，但是可以不包括细胞的其他成分。此类成分的实例是细胞核或细胞器。细胞可以是活细胞。活细胞可以能够被培养，例如，当被包封在凝胶或聚合物基体中时被培养，或者当构成凝胶或聚合物基体时被培养。
如本文中所使用的，术语“大分子成分”通常指的是包含在生物颗粒内或来自生物颗粒的大分子。大分子成分可以包含核酸。在一些情况下，生物颗粒可以是大分子。大分子成分可以包含DNA。大分子成分可以包含RNA。RNA可以是编码的或非编码的。例如，RNA可以是信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)或转移RNA(tRNA)。RNA可以是转录物。RNA可以是长度小于200个核酸碱基的小RNA，或者长度大于200个核酸碱基的大RNA。小RNA可以包括5.8S核糖体RNA(rRNA)、5S rRNA、转移RNA(tRNA)、微RNA(miRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、Piwi-相互作用RNA(Piwi-interacting RNA)(piRNA)、tRNA衍生的小RNA(tsRNA)和小rDNA衍生的RNA(srRNA)。RNA可以是双链RNA或单链RNA。RNA可以是环状RNA。大分子成分可以包含蛋白质。大分子成分可以包含肽。大分子成分可以包含多肽。
如本文中所使用的，术语“分子标签”通常指的是能够结合大分子成分的分子。分子标签可以以高亲和力结合大分子成分。分子标签可以以高特异性结合大分子成分。分子标签可以包含核苷酸序列。分子标签可以包含核酸序列。核酸序列可以是分子标签的至少一部分或全部。分子标签可以是核酸分子或者可以是核酸分子的一部分。分子标签可以是寡核苷酸或多肽。分子标签可以包含DNA适配体。分子标签可以是或包含引物。分子标签可以是或包含蛋白质。分子标签可以包含多肽。分子标签可以是条形码。
如本文中所使用的，术语“分配区”通常指的是可以适合于包含一种或更多种物质或进行一个或更多个反应的空间或体积。分配区可以是物理隔室，诸如液滴或孔。分配区可以将空间或体积与另一个空间或体积分隔。液滴可以是与第一相不混溶的第二相(例如，油)中的第一相(例如，水相)。液滴可以是不与第一相相分离的第二相中的第一相，诸如例如水相中的胶囊或脂质体。分配区可以包含一个或更多个其他(内部)分配区。在一些情况下，分配区可以是虚拟隔室，该虚拟隔室可以由跨越多个和/或远程物理隔室的索引物(例如，索引的文库)来定义和鉴定。例如，物理隔室可以包含多个虚拟隔室。
许多单细胞应用的效率可以通过改善细胞通量来增加。例如，这可以通过对在其中可以包含或可以不包含细胞和/或颗粒的多个液滴进行分选，以仅收集在其中包含细胞和/或颗粒的液滴来实现。可以对多个液滴进行分选，以将被单独占据的液滴与非被单独占据的液滴(例如，未被占据的、被多重占据的等)分离。在另一个实例中，更高的效率可以通过将多个细胞珠与在其中可以包含或可以不包含细胞的多个颗粒分离来实现。可以对多个颗粒进行分选，以将被单独占据的细胞珠(例如，包含细胞或其衍生物的颗粒)与非被单独占据的细胞珠(例如，未被占据的颗粒、被多重占据的细胞珠等)分离。然后，在其中包含(例如，单独包含)细胞和/或颗粒的液滴的分离的群体和/或在其中包含(例如，单独包含)细胞的细胞珠的分离的群体可以经受另外的应用，诸如核酸扩增和/或测序应用。
提供了用于分选液滴的方法和系统。所述方法和系统通常通过生成多个液滴，使得多个液滴的每一个包含场可吸引的颗粒来操作。多个液滴中的给定液滴可以包括或可以不包括一个或更多个细胞和/或其他颗粒(例如，细胞珠、凝胶珠等)。在一些情况下，其他颗粒(例如，凝胶珠)可以具有与其偶联的分子条形码。因此，包含场可吸引的颗粒的多个液滴可以包含包括一个或更多个细胞和/或其他颗粒的第一子集的液滴和不包括任何细胞和/或其他颗粒的第二子集的液滴。包括一个或更多个细胞和/或其他颗粒的第一子集的液滴中的给定液滴可以包含与不包括任何细胞和/或其他颗粒的第二子集的液滴中的给定液滴相比足够有差异的数目或浓度的场可吸引的颗粒，使得当多个液滴经受电场或磁场时，第一子集的液滴和第二子集的液滴彼此分离。在一些情况下，当多个液滴经受电场或磁场时，被单独占据的液滴可以与未被占据的液滴和另外的被多重占据的液滴分离。
在一些情况下，可以生成具有或不具有场可吸引的颗粒的多个液滴。多个液滴中的给定液滴可以包括或可以不包括一个或更多个细胞和/或颗粒。因此，多个液滴可以包含包括一个或更多个细胞和/或颗粒的第一子集的液滴和不包括任何细胞和/或颗粒的第二子集的液滴。多个液滴可以经受压力脉冲，并且第一子集的液滴和第二子集的液滴可以经由流体动力彼此分离。在一些情况下，被单独占据的液滴可以与未被占据的液滴和另外的被多重占据的液滴分离。
在一个方面中，本文所描述的方法和系统提供了将来自包含生物颗粒的样品材料的单独的生物颗粒的大分子成分内容物区室化、沉积或分配到离散隔室或分配区(在本文中可互换地被称为分配区)中，其中每个分配区保持其自己的内容物与其他分配区的内容物的分离。分配区可以是乳液中的液滴。分配区可以是孔。分配区可以是珠，诸如凝胶珠和/或细胞珠。分配区可以包含或可以不包含生物颗粒和/或其大分子成分。根据一些实施方案，每个分配区可以包含至少一些场可吸引的颗粒。每个分配区中场可吸引的颗粒的量和/或浓度可以取决于分配区是否包含生物颗粒(或其他颗粒，诸如珠)而变化。根据一些其他实施方案，分配区可以不包含场可吸引的颗粒。
在一些情况下，独特的标识符诸如条形码可以被预先、随后或同时递送至容纳区室化的或分配的生物颗粒的分配区，以便允许稍后将单独的生物颗粒的特征归属于特定分配区。条形码可以经由任何合适的机制例如在寡核苷酸上被递送至分配区。条形码化的寡核苷酸可以经由微胶囊被递送至分配区。在一些情况下，条形码化的寡核苷酸可以最初与微胶囊缔合，并且然后在施加允许寡核苷酸解离或从微胶囊释放的刺激后从微胶囊释放。
在一些情况下，微胶囊可以包含珠。在一些情况下，珠可以是多孔的、无孔的、固体的、半固体的、半流体的、流体的和/或其组合。在一些情况下，珠可以是可溶解的、可破坏的和/或可降解的。在一些情况下，珠可以是不可降解的。在一些情况下，珠可以是凝胶珠。凝胶珠可以是水凝胶珠。凝胶珠可以由分子前体形成，诸如聚合物物质或单体物质。半固体珠可以是脂质体珠。固体珠可以包含金属，包括氧化铁、金和银。在一些情况下，珠可以是二氧化硅珠。在一些情况下，珠可以是刚性的。在其他情况下，珠可以是柔性的和/或可压缩的。
在一些情况下，珠可以包含分子前体(例如，单体或聚合物)，该分子前体可以经由前体的聚合来形成聚合物网络。在一些情况下，前体可以是已经聚合的物质，该物质能够经由例如化学交联经历进一步聚合。在一些情况下，前体可以包含丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺单体、低聚物或聚合物中的一种或更多种。在一些情况下，珠可以包含预聚物，该预聚物是能够进一步聚合的低聚物。例如，可以使用预聚物制备聚氨酯珠。在一些情况下，珠可以包含可以被进一步聚合在一起的单独的聚合物。在一些情况下，珠可以经由不同前体的聚合来生成，使得它们包含混合的聚合物、共聚物和/或嵌段共聚物。
珠可以包含天然材料和/或合成材料。例如，聚合物可以是天然聚合物或合成聚合物。在一些情况下，珠可以包含天然聚合物和合成聚合物两者。天然聚合物的实例包括蛋白质和糖诸如脱氧核糖核酸、橡胶、纤维素、淀粉(例如，直链淀粉、支链淀粉)、蛋白质、酶、多糖、丝、聚羟基链烷酸酯、壳聚糖、葡聚糖、胶原蛋白、角叉菜胶、卵叶车前子(ispaghula)、阿拉伯胶、琼脂、明胶、虫胶、刺梧桐树胶(sterculia gum)、黄原胶、玉米糖胶、瓜尔胶、刺梧桐胶(gumkaraya)、琼脂糖、藻酸、藻酸盐或其天然聚合物。合成聚合物的实例包括丙烯酸树脂、尼龙、硅酮、氨纶、粘胶人造丝、聚羧酸、聚乙酸乙烯酯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙二醇、聚氨酯、聚乳酸、二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚(氯三氟乙烯)、聚(环氧乙烷)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、聚乙烯、聚异丁烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲醛)(poly(oxymethylene))、聚甲醛(polyformaldehyde)、聚丙烯、聚苯乙烯、聚(四氟乙烯)、聚(乙酸乙烯酯)、聚(乙烯醇)、聚(氯乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、聚(偏二氟乙烯)、聚(氟乙烯)和/或其组合(例如，共聚物)。珠也可以由除了聚合物之外的材料形成，所述材料包括脂类、胶束、陶瓷、玻璃陶瓷、材料复合物、金属、其他无机材料以及其他。
在一些情况下，化学交联剂可以是用于在单体的聚合期间交联单体的前体和/或可以用于将寡核苷酸(例如，条形码化的寡核苷酸)附接至珠。在一些情况下，聚合物可以进一步与交联剂物质或其他类型的单体聚合，以生成另外的聚合物网络。化学交联剂(在本文中也被称为“交联剂(crosslinker)”或“交联剂(crosslinker agent)”)的非限制性实例包括胱胺、戊二醛、辛二亚氨酸二甲酯(dimethyl suberimidate)、N-羟基琥珀酰亚胺交联剂BS3、甲醛、碳二亚胺(EDC)、SMCC、磺基-SMCC、乙烯基硅烷、N,N’二烯丙基酒石酸二酰胺(DATD)、N,N’-双(丙烯酰基)胱胺(BAC)或其同系物。在一些情况下，在本公开内容中使用的交联剂包含胱胺。
交联可以是永久的或可逆的，这取决于所使用的特定交联剂。可逆交联可以允许聚合物在适当的条件下线性化或解离。在一些情况下，可逆交联还可以允许结合至珠表面的物质的可逆附接。在一些情况下，交联剂可以形成二硫键。在一些情况下，形成二硫键的化学交联剂可以是胱胺或修饰的胱胺。
在一些情况下，二硫键可以在掺入到珠中的分子前体单元(例如，单体、低聚物或线性聚合物)或前体和寡核苷酸之间形成。例如，胱胺(包括改性的胱胺)是包含二硫键的有机剂，其可以被用作珠的单独的单体或聚合物前体之间的交联剂。聚丙烯酰胺可以在胱胺或包含胱胺(例如，改性的胱胺)的物质的存在下聚合，以生成包含二硫键的聚丙烯酰胺凝胶珠(例如，包含化学可还原的交联剂的化学可降解珠)。二硫键可以允许珠在将珠暴露于还原剂后降解(或溶解)。
在一些情况下，壳聚糖(一种线性多糖聚合物)可以经由亲水链与戊二醛交联以形成珠。壳聚糖聚合物的交联可以通过由热、压力、pH的变化和/或辐射引发的化学反应来实现。
在一些情况下，珠可以包含在聚合物前体(例如，单体、低聚物、线性聚合物)、寡核苷酸、引物和其他实体之间的共价键或离子键。在一些情况下，共价键可以是碳-碳键或硫醚键。
在一些情况下，珠可以包含acrydite部分，其在某些方面中可以用于将一个或更多个寡核苷酸(例如，条形码序列、条形码化的寡核苷酸、引物或其他寡核苷酸)附接至珠。在一些情况下，acrydite部分可以指的是由acrydite与一种或更多种物质的反应，诸如acrydite与其他单体和交联剂在聚合反应期间的反应所生成的acrydite类似物。acrydite部分可以被修饰以与待附接的物质，诸如寡核苷酸(例如，条形码序列、条形码化的寡核苷酸、引物或其他寡核苷酸)形成化学键。acrydite部分可以用能够形成二硫键的硫醇基团来改性，或者可以用已经包含二硫键的基团来改性。硫醇或二硫化物(经由二硫化物交换)可以被用作待附接的物质的锚点，或者acrydite部分的另一个部分可以用于附接。在一些情况下，附接可以是可逆的，使得当二硫键断裂时(例如，在还原剂的存在下)，附接的物质从珠释放。在其他情况下，acrydite部分可以包含可以用于附接的反应性羟基基团。
用于附接寡核苷酸的珠的官能化可以通过多种不同的方法来实现，所述方法包括活化聚合物内的化学基团、将活性或可活化的官能团掺入聚合物结构中或者在珠生产的预聚物或单体阶段处附接。
例如，被聚合以形成珠的前体(例如，单体、交联剂)可以包含acrydite部分，使得当生成珠时，珠还包含acrydite部分。acrydite部分可以被附接至核酸分子(例如，寡核苷酸)，该核酸分子可以包括引发序列(例如，用于扩增靶核酸的引物、随机引物、用于信使RNA的引物序列)和/或一个或更多个条形码序列。一个或更多个条形码序列可以包括对于与给定珠偶联的所有核酸分子相同的序列和/或跨与给定珠偶联的所有核酸分子不同的序列。核酸分子可以被掺入到珠中。
在一些情况下，核酸分子可以包含例如用于附接至测序流动池的功能序列，诸如例如用于测序的P5序列。在一些情况下，核酸分子或其衍生物(例如，由核酸分子生成的寡核苷酸或多核苷酸)可以包含另一种功能序列，诸如例如用于附接至测序流动池用于Illumina测序的P7序列。在一些情况下，核酸分子可以包含条形码序列。在一些情况下，引物还可以包含独特的分子标识符(UMI)。在一些情况下，引物可以包含用于Illumina测序的R1引物序列。在一些情况下，引物可以包含用于IIllumina测序的R2引物序列。如可以与本公开内容的组合物、装置、方法和系统一起使用的此类核酸分子(例如，寡核苷酸、多核苷酸等)及其用途的实例在美国专利公布号2014/0378345和2015/0376609中被提供，其每一个通过引用整体并入本文。
图19图示出了携带条形码的珠的实例。核酸分子1902(诸如寡核苷酸)可以通过可释放键1906(诸如例如二硫化物接头)与珠1904偶联。相同的珠1904可以与一个或更多个其他核酸分子1918、1920偶联(例如，经由可释放键)。核酸分子1902可以是条形码或包含条形码。如本文其他地方所提到的，条形码的结构可以包含许多序列元素。核酸分子1902可以包含可以被用于随后的处理的功能序列1908。例如，功能序列1908可以包括测序仪特异性流动池附接序列(例如，用于测序系统的P5序列)和测序引物序列(例如，用于测序系统的R1引物)中的一种或更多种。核酸分子1902可以包含用于对样品(例如，DNA、RNA、蛋白质等)进行条形码化的条形码序列1910。在一些情况下，条形码序列1910可以是珠特异性的，使得条形码序列1910对于与相同珠1904偶联的所有核酸分子(例如，包括核酸分子1902)是共用的。可选择地或另外地，条形码序列1910可以是分配区特异性的，使得条形码序列1910是与被分配到相同分配区的一个或更多个珠偶联的所有核酸分子所共用的。核酸分子1902可以包含特异性引发序列1912，诸如mRNA特异性引发序列(例如，聚-T序列)、靶向引发序列和/或随机引发序列。核酸分子1902可以包含锚定序列1914，以确保特异性引发序列1912在(例如，mRNA的)序列末端处杂交。例如，锚定序列1914可以包括随机的短核苷酸序列，诸如1-聚体、2-聚体、3-聚体或更长的序列，其可以确保聚-T区段更有可能在mRNA的多聚-A尾部的序列末端处杂交。
核酸分子1902可以包含独特的分子识别序列1916(例如，独特的分子标识符(UMI))。在一些情况下，独特的分子识别序列1916可以包含约5个至约8个核苷酸。可选择地，独特的分子识别序列1916可以包含小于约5个或多于约8个核苷酸。独特的分子识别序列1916可以是在与单个珠(例如，珠1904)偶联的单独的核酸分子(例如，1902、1918、1920等)间变化的独特序列。在一些情况下，独特的分子识别序列1916可以是随机序列(例如，诸如随机N-聚体序列)。例如，UMI可以提供被捕获的起始mRNA分子的独特标识符，以便允许定量原始表达的RNA的数目。如将理解的是，尽管图19示出了与珠1904的表面偶联的三个核酸分子1902、1918、1920，但是单独的珠可以与任何数目的单独的核酸分子偶联，例如从一个到数十个到数千个甚至数百万个单独的核酸分子。单独的核酸分子各自的条形码可以在与相同珠偶联的不同单独的核酸分子之间包含共同的序列区段或相对共同的序列区段(例如，1908、1910、1912等)和可变的或独特的序列区段(例如，1916)两者。
在操作中，生物颗粒(例如，细胞、DNA、RNA等)可以连同携带条形码的珠1904一起被共分配。条形码化的核酸分子1902、1918、1920可以在分配区中从珠1904释放。通过实例的方式，在分析样品RNA的上下文中，释放的核酸分子中的一个(例如，1902)的聚-T区段(例如，1912)可以与mRNA分子的聚-A尾部杂交。逆转录可以导致mRNA的cDNA转录物，但是所述转录物包括核酸分子1902的序列区段1908、1910、1916的每一个。因为核酸分子1902包含锚定序列1914，所以将更有可能与mRNA的聚-A尾部杂交并且引发在mRNA的聚-A尾部的序列末端处的逆转录。在任何给定的分配区内，单独的mRNA分子的所有cDNA转录物可以包括共同的条形码序列区段1910。然而，由给定分配区内的不同mRNA分子制备的转录物可以在独特的分子识别序列1912区段(例如，UMI区段)处变化。有益地，即使在对给定分配区的内容物进行任何随后扩增之后，不同的UMI的数目也可以指示源自给定分配区，并且因此源自生物颗粒(例如，细胞)的mRNA的量。如上所提到的，可以对转录物进行扩增、清除和测序，以识别mRNA的cDNA转录物的序列，以及对条形码区段和UMI区段进行测序。虽然描述了聚-T引物序列，但是其他靶向或随机引发序列也可以用于引发逆转录反应。同样地，尽管描述为将条形码化的寡核苷酸释放到分配区中，但在一些情况下，与珠(例如，凝胶珠)结合的核酸分子可以用于杂交并捕获珠的固相上的mRNA，例如，以便促进RNA与其他细胞内容物的分离。
在一些情况下，包含反应性或能够被活化使得其变得具有反应性的官能团的前体可以与其他前体聚合，以生成包含活化或可活化的官能团的凝胶珠。然后，可以使用官能团以将另外的物质(例如，二硫化物接头、引物、其他寡核苷酸等)附接至凝胶珠。例如，包含羧酸(COOH)基团的一些前体可以与其他前体共聚合，以形成还包含COOH官能团的凝胶珠。在一些情况下，丙烯酸(包含游离COOH基团的物质)、丙烯酰胺和双(丙烯酰基)胱胺可以被共聚在一起，以生成包含游离COOH基团的凝胶珠。凝胶珠的COOH基团可以被活化(例如，经由1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM))，使得它们是反应性的(例如，与其中EDC/NHS或DMTMM用于活化的胺官能团反应)。然后，活化的COOH基团可以与包含待连接至珠的部分的适当的物质(例如，包含胺官能团的物质，其中羧酸基团被活化以与胺官能团反应)反应。
在其聚合物网络中包含二硫键的珠可以经由将一些二硫键还原成游离硫醇来用另外的物质官能化。二硫键可以经由例如还原剂(例如，DTT、TCEP等)的作用被还原，以生成游离硫醇基团，而不溶解珠。然后，珠的游离硫醇可以与物质的游离硫醇或包含另一个二硫键的物质(例如，经由硫醇-二硫化物交换)反应，使得物质可以与珠连接(例如，经由生成的二硫键)。在一些情况下，珠的游离硫醇可以与任何其他合适的基团反应。例如，珠的游离硫醇可以与包含acrydite部分的物质反应。珠的游离硫醇可以经由迈克尔加成化学与acrydite反应，使得包含acrydite的物质与珠连接。在一些情况下，可以通过包含硫醇封端剂诸如N-乙基马来酰胺或碘乙酸酯来防止不受控制的反应。
珠内二硫键的活化可以被控制，使得仅少量的二硫键被活化。例如，可以通过控制用于生成游离硫醇基团的还原剂的浓度和/或用于在珠聚合中形成二硫键的试剂的浓度来进行控制。在一些情况下，低浓度(例如，小于或等于约1:100,000,000,000、小于或等于约1:10,000,000,000、小于或等于约1:1,000,000,000、小于或等于约1:100,000,000、小于或等于约1:10,000,000、小于或等于约1:1,000,000、小于或等于约1:100,000、小于或等于约1:10,000的还原剂分子:凝胶珠比率)的还原剂可以用于还原。对被还原成游离硫醇的二硫键的数目进行控制可以用于确保在官能化期间珠结构的完整性。在一些情况下，光学活性剂诸如荧光染料可以经由珠的游离硫醇基团与珠偶联，并且用于定量存在于珠中的游离硫醇的数目和/或追踪珠。
在一些情况下，在凝胶珠形成之后向凝胶珠添加部分可以是有利的。例如，在凝胶珠形成之后添加寡核苷酸(例如，条形码化的寡核苷酸)可以避免在聚合期间可能发生的链转移终止期间物质的损失。此外，较小的前体(例如，不包含侧链基团和连接部分的单体或交联剂)可以用于聚合，并且由于粘性效应而可以被最小程度地阻碍链末端生长。在一些情况下，凝胶珠合成之后的官能化可以使待负载的物质(例如，寡核苷酸)暴露于潜在的破坏剂(例如，自由基)和/或化学环境最小化。在一些情况下，生成的凝胶可以具有最高临界共溶温度(upper critical solution temperature)(UCST)，其可以允许温度驱使的珠溶胀和塌陷。这样的功能性可以在随后用寡核苷酸对珠进行官能化期间有助于寡核苷酸(例如，引物)渗透到珠中。制备后官能化(post-production functionalization)也可以用于控制珠中物质的负载比率，使得例如负载比率的可变性最小化。物质负载也可以在分批工艺中进行，使得多个珠可以在单个批次中用物质官能化。
在一些情况下，珠可以非共价地负载有一种或更多种试剂。珠可以通过例如使珠经受足以使珠溶胀的条件，允许试剂有足够的时间扩散到珠的内部，并且使珠经受足以使珠去溶胀的条件来非共价地负载。例如，可以通过将珠置于热力学上有利的溶剂中，使珠经受较高或较低的温度，使珠经受较高或较低的离子浓度，和/或使珠经受电场来完成珠的溶胀。珠的溶胀可以通过如本领域技术人员已知的任何溶胀方法来完成。珠的去溶胀可以例如通过在热力学上不利的溶剂中转移珠，使珠经受较低或较高的温度，使珠经受较低或较高的离子浓度和/或除去电场来完成。珠的去溶胀可以通过如本领域技术人员已知的任何去溶胀方法来完成。转移珠可以引起珠中的孔收缩。然后，收缩可以阻碍珠内的试剂从珠的内部扩散出来。阻碍可能是由于在试剂和珠的内部之间的空间相互作用。转移可以以微流体方式完成。例如，转移可以通过将珠从一种共流动的溶剂流移动至不同的共流动的溶剂流中来实现。珠的溶胀性和/或孔径可以通过改变珠的聚合物组成来调节。
在一些情况下，与前体连接的acrydite部分、与前体连接的另一种物质或前体本身包含不稳定键诸如化学敏感键、热敏感键或光敏键，例如二硫键、UV敏感键等。在acrydite部分或包含不稳定键的其他部分被掺入珠中后，珠也可以包含不稳定键。例如，不稳定键可以用于将物质(例如，条形码、引物等)可逆地连接(例如，共价地连接)至珠。在一些情况下，热不稳定键可以包括基于核酸杂交的附接，例如，在寡核苷酸与被附接至珠的互补序列杂交的情况下，使得杂合体的热解链(melting)将寡核苷酸(例如，包含条形码的序列)从珠或微胶囊中释放出来。
向凝胶珠添加多种类型的不稳定键可以导致能够对变化的刺激响应的珠的生成。每种类型的不稳定键可以对相关的刺激(例如，化学刺激、光、温度等)敏感，使得经由每个不稳定键附接至珠的物质的释放可以通过施加适当的刺激来控制。这样的官能性可以用于从凝胶珠中控制释放物质。在一些情况下，包含不稳定键的另一种物质可以在凝胶珠形成之后经由例如如上文所描述的凝胶珠的活化官能团与凝胶珠连接。如将理解的是，可释放地、可裂解地或可逆地附接至本文所描述的珠的条形码包括通过裂解条形码分子和珠之间的键而被释放或可释放的条形码，或者通过下面的珠本身的降解而被释放的条形码，从而允许条形码被其他试剂接近或可接近，或两者兼而有之。
如本文所描述的可释放的条形码有时可以被称为可活化的，因为它们在释放后可用于反应。因此，例如，可活化的条形码可以通过从珠(或本文所描述的其他合适类型的分配区)释放条形码来活化。在所描述的方法和系统的上下文中也设想了其他可活化的配置。
除了热可裂解的键、二硫键和UV敏感键之外，可以与前体或珠偶联的不稳定键的其他非限制性实例包括酯键(例如，用酸、碱或羟胺可裂解的)、邻位二醇键(例如，经由高碘酸钠可裂解的)、狄尔斯-阿尔德键(例如，经由热可裂解的)、砜键(例如，经由碱可裂解的)、甲硅烷基醚键(例如，经由酸可裂解的)、糖苷键(例如，经由淀粉酶可裂解的)、肽键(例如，经由蛋白酶可裂解的)或磷酸二酯键(例如，经由核酸酶(例如，DNA酶)可裂解的)。
不参与聚合的物质也可以在珠生成期间(例如，在前体的聚合期间)被包封在珠中。此类物质可以进入聚合反应混合物中，使得生成的珠在珠形成后包含物质。在一些情况下，此类物质可以在形成之后被添加至凝胶珠中。此类物质可以包括例如寡核苷酸、用于核酸扩增反应的试剂(例如，引物、聚合酶、dNTP、辅因子(例如，离子辅因子))(包括本文所描述的那些)、用于酶促反应的试剂(例如，酶、辅因子、底物)或用于核酸修饰反应诸如聚合、连接或消化的试剂。此类物质的捕获可以通过在前体的聚合期间生成的聚合物网络密度、控制凝胶珠内的离子电荷(例如，经由与聚合的物质连接的离子物质)或者通过释放其他物质来控制。在珠降解后和/或通过施加能够从珠释放物质的刺激，可以从珠释放包封的物质。
珠可以具有均匀尺寸或不均匀尺寸。在一些情况下，珠的直径可以是至少约1微米(μm)、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更大。在一些情况下，珠可以具有小于约1μm、5μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、250μm、500μm、1mm或更小的直径。在一些情况下，珠可以具有在约40-75μm、30-75μm、20-75μm、40-85μm、40-95μm、20-100μm、10-100μm、1-100μm、20-250μm或20-500μm的范围内的直径。
在某些方面中，珠可以以具有相对单分散尺寸分布的珠群体或多个珠提供。在可能期望在分配区内提供相对一致量的试剂的情况下，保持相对一致的珠特性诸如尺寸可以有助于整体一致性。特别地，本文所描述的珠可以具有其横截面尺寸的变异系数小于50％、小于40％、小于30％、小于20％，并且在一些情况下小于15％、小于10％、小于5％或更小的尺寸分布。
珠可以具有任何合适的形状。珠形状的实例包括但不限于球形、非球形、椭圆形、长圆形、无定形、圆形、圆柱形及其变型。
除了在珠与缔合分子诸如上文所描述的含有条形码的寡核苷酸之间的可裂解键之外或作为其替代，珠可以自发地或在暴露于一种或更多种刺激(例如，温度变化、pH变化、暴露于特定化学物质或相、暴露于光、还原剂等)后是可降解的、可破坏的或可溶解的。在一些情况下，珠可以是可溶解的，使得珠的材料组分在暴露于特定化学物质或环境变化诸如变化温度或pH变化时被溶解。在一些情况下，凝胶珠可以在升高的温度和/或在碱性条件中降解或溶解。在一些情况下，珠可以是热可降解的，使得当珠被暴露于适当的温度变化(例如，热)时，珠降解。与物质(例如，寡核苷酸，例如条形码化的寡核苷酸)结合的珠的降解或溶解可以导致该物质从珠中释放。
可降解的珠可以包含一种或更多种具有不稳定键的物质，使得当珠/物质暴露于适当的刺激时，键被断裂并且珠降解。不稳定键可以是化学键(例如，共价键、离子键)，或者可以是另一种类型的物理相互作用(例如，范德华相互作用、偶极-偶极相互作用等)。在一些情况下，用于生成珠的交联剂可以包含不稳定键。在暴露在适当的条件后，不稳定键可以被断裂并且珠被降解。例如，在将包含胱胺交联剂的聚丙烯酰胺凝胶珠暴露于还原剂后，胱胺的二硫键可以被断裂并且珠被降解。
与不降解的珠相比，当将适当的刺激施加至珠时，可降解的珠可以用于更快速地从珠释放附接的物质(例如，寡核苷酸、条形码序列、引物等)。例如，对于与多孔珠的内表面结合的物质或者在包封物质的情况下，物质可以在珠的降解后具有较大的流动性和对溶液中的其他物质的可接近性。在一些情况下，物质也可以经由可降解的接头(例如，二硫化物接头)附接至可降解的珠。可降解的接头可以对与可降解的珠相同的刺激做出响应，或者两种可降解的物质可以对不同的刺激做出响应。例如，条形码序列可以经由二硫键被附接至包含胱胺的聚丙烯酰胺珠。在将条形码化珠暴露于还原剂后，珠降解并且条形码序列在条形码序列与珠之间的二硫键以及珠中胱胺的二硫键两者断裂后释放。
可降解的珠可以被引入到分配区，诸如乳液的液滴或孔中，使得珠在分配区内降解，并且当施加适当的刺激时，任何缔合的物质(例如，寡核苷酸)在液滴内释放。游离物质(例如，寡核苷酸)可以与包含在分配区中的其他试剂相互作用。例如，包含胱胺并且经由二硫键与条形码序列连接的聚丙烯酰胺珠可以与油包水乳液的液滴中的还原剂组合。在液滴内，还原剂破坏多种二硫键，导致珠降解并且将条形码序列释放到液滴的含水内部环境中。在另一个实例中，对在碱性溶液中包含结合珠的条形码序列的液滴进行加热也可以导致珠降解并且将附接的条形码序列释放到液滴的含水内部环境中。
如从上文的公开内容将理解的是，虽然被称为珠的降解，但是在如上文所提到的许多情况下，此降解可以指的是在具有和没有结构上降解物理珠本身两者的情况下，结合的或夹带的物质从珠中解离。例如，可以通过例如由于改变化学环境引起的渗透压差从珠中释放夹带的物质。通过实例的方式，由于渗透压差引起的珠孔经的改变通常可以在没有珠本身的结构降解的情况下发生。在一些情况下，由于珠的渗透溶胀引起的孔径的增加可以允许珠内夹带的物质的释放。在其他情况下，珠的渗透收缩可以由于孔径收缩而使珠更好地保留夹带的物质。
在提供可降解的珠的情况下，可以期望避免在期望的时间之前将此类珠暴露于引起这样的降解的一个刺激或更多个刺激，以便避免过早的珠降解和由这样的降解引起的问题，包括例如差的流动特性和聚集。通过实例的方式，在珠包含可还原的交联基团诸如二硫化物基团的情况下，将期望避免使此类珠与还原剂例如DTT或其他二硫化物裂解试剂接触。在这样的情况下，对本文所描述的珠的处理将在一些情况下不含还原剂诸如DTT。因为还原剂通常在商业酶制剂中被提供，所以可以期望在处理本文所描述的珠中提供不含还原剂(或不含DTT)的酶制剂。此类酶的实例包括，例如聚合酶酶制剂、逆转录酶酶制剂、连接酶酶制剂以及可以用于处理本文所描述的珠的许多其他酶制剂。术语“不含还原剂”或“不含DTT”的制剂可以指的是对于用于降解珠的此类材料而言具有小于约1/10、小于约1/50或甚至小于约1/100的较低范围的制剂。例如，对于DTT，不含还原剂的制剂可以具有小于约0.01毫摩尔(mM)、0.005mM、0.001mM DTT、0.0005mM DTT或甚至小于约0.0001mM DTT。在许多情况下，DTT的量可以是不可检测的。
可以使用许多化学触发物来触发珠的降解。这些化学变化的实例可以包括但不限于pH介导的珠内组分完整性的改变、珠的组分经由裂解交联键的降解以及珠的组分的解聚。
在一些实施方案中，珠可以由包含可降解的化学交联剂诸如BAC或胱胺的材料形成。此类可降解的交联剂的降解可以通过许多机制来完成。在一些实例中，珠可以与可诱导氧化、还原或其他化学变化的化学降解剂接触。例如，化学降解剂可以是还原剂，诸如二硫苏糖醇(DTT)。还原剂的另外的实例可以包括β-巯基乙醇、(2S)-2-氨基-1,4-二巯基丁烷(二硫代丁胺或DTBA)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其组合。还原剂可以降解在形成珠的凝胶前体之间形成的二硫键，并且因此降解珠。在其他情况下，溶液的pH的变化，诸如pH的增加，可以触发珠的降解。在其他情况下，暴露于含水溶液诸如水可以触发水解降解，并且因此触发珠的降解。
还可以在施加热刺激后诱导珠以释放它们的内容物。温度的变化可以引起珠的多种变化。例如，热可以引起固体珠液化。热的变化可以引起珠解链，使得珠的一部分降解。在其他情况下，热可以增加珠组分的内部压力，使得珠破裂或爆炸。热还可以作用于用作构建珠的材料的热敏聚合物。
本公开内容的方法、组合物、装置和试剂盒可以与任何合适的剂一起用于降解珠。在一些实施方案中，温度或pH的变化可以用于降解珠内的热敏感性键或pH敏感性键。在一些实施方案中，化学降解剂可以用于通过氧化、还原或其他化学变化使珠内的化学键降解。例如，化学降解剂可以是还原剂，诸如DTT，其中DTT可以使在交联剂与凝胶前体之间形成的二硫键降解，从而使珠降解。在一些实施方案中，可以添加还原剂以使珠降解，所述还原剂可以使或不可以使珠释放其内容物。还原剂的实例可以包括二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、(2S)-2-氨基-1,4-二巯基丁烷(二硫代丁胺或DTBA)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)或其组合。还原剂可以以约0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM的浓度存在。还原剂可以以至少约0.1mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM或大于10mM的浓度存在。还原剂可以以至多约10mM、5mM、1mM、0.5mM、0.1mM或更低的浓度存在。
任何合适数目的分子标签分子(例如，引物、条形码化的寡核苷酸)可以与珠缔合，使得在从珠释放后，分子标签分子(例如，引物、例如条形码化的寡核苷酸)以预先定义的浓度存在于分配区中。可以选择这样的预先定义的浓度，以促进用于在分配区内生成测序文库的某些反应，例如扩增。在一些情况下，引物的预先定义的浓度可以通过产生携带寡核苷酸的珠的过程来限制。
隔室或分配区可以在流体流内是可流动的。分配区可以包含例如微囊泡，该微囊泡具有围绕内部流体中心或核心的外部屏障。在一些情况下，分配区可以包含多孔基体，该多孔基体能够在其基体内夹带和/或保留材料。分配区可以包含非含水连续相例如油相内的含水流体的液滴。分配区可以包含第二相内的第一相的液滴，其中第一相和第二相是不混溶的。多种不同的容器在例如美国专利申请公布号2014/0155295中描述，其出于所有目的通过引用整体并入本文。用于在非含水连续相或油性连续相中产生稳定液滴的乳液体系被详细地描述于例如美国专利申请公布号2010/0105112中，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
就乳液中的液滴而言，将单独的生物颗粒分配至离散分配区中通常可以通过以下来完成：将含水流体中的生物颗粒的流动流引入到非含水流体的流动流中，使得液滴在两个流的汇合点处生成。通过提供一定浓度的生物颗粒的含水流，可以控制所得到的分配区的占据率(例如，每个分配区的生物颗粒的数目)。在需要单个生物颗粒分配区的情况下，可以选择不混溶流体的相对流速，使得平均而言，分配区包含每个分配区少于一个生物颗粒，以便确保被占据的那些分配区主要地被单独占据。在一些实施方案中，可以选择流体的相对流速，使得大多数分配区被占据，例如，仅允许一小部分未被占据的分配区。可以控制流和通道架构以确保期望数目的被单独占据的分配区、小于一定水平的未被占据的分配区和/或小于一定水平的被多重占据的分配区。
本文所描述的系统和方法可以被操作使得大多数被占据的分配区包括每个被占据的分配区不多于一个的生物颗粒。在一些情况下，进行分配过程，使得被占据的分配区的少于25％包含多于一个生物颗粒，并且在许多情况下，被占据的分配区的少于20％具有多于一个生物颗粒。在一些情况下，被占据的分配区的少于10％或甚至少于5％包括每个分配区多于一个的生物颗粒。
在一些情况下，期望避免创建过量数目的空分配区。例如，从成本和/或效率的角度来看，可以期望使空分配区的数目最小化。然而，虽然这可以通过向分配区域提供足够数目的生物颗粒来完成，但是泊松分布可以预期地增加可包含多个生物颗粒的分配区的数目。这样，生成的分配区的至多约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或更少可以是未被占据的。在一些情况下，可以进行一个或更多个细胞或被引导到分配区域的其他流体的流动，使得在许多情况下，生成的分配区的不多于约50％、生成的分配区的不多于约25％或生成的分配区的不多于约10％是未被占据的。可以控制这些流，以便呈现单一被占据的分配区的非泊松分布，同时提供较低水平的未被占据的分配区。可以实现上文所提到的范围的未被占据的分配区，同时仍然提供上文所描述的任何单一占据率。例如，在许多情况下，使用本文所描述的系统和方法产生具有小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％，并且在许多情况下小于约5％的多个占据率的所得到的分配区，同时具有小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％或更少的未被占据的分配区。
在生成包含部分地被单独占据的分配区、部分地被多重占据的分配区和/或部分地未被占据的分配区的分配区之后，被占据的分配区可以从未被占据的分配区分选出来。在一些情况下，被单独占据的分配区可以与非被单独占据的分配区(例如，被多重占据的分配区和未被占据的分配区)分离。这样的分选可以通过在生成乳液中的液滴期间包括场可吸引的颗粒来实现。例如，包含生物颗粒和场可吸引的颗粒的含水流体的流动流可以被引入到非含水流体的流动流中，使得液滴在两个流的汇合点处生成。
如将理解的是，上文描述的占据率也适用于包括生物颗粒和另外的试剂两者的分配区，包括但不限于携带条形码化的寡核苷酸的微胶囊。被占据的分配区(例如，被占据的分配区的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％)可以包括包含条形码化的寡核苷酸的微胶囊(例如，珠)和生物颗粒两者。
尽管上文根据提供基本上被单独占据的分配区被描述，但是在某些情况下，期望提供例如包含两个、三个、四个或更多个细胞的被多重占据的分配区和/或在单个分配区内包含条形码化的寡核苷酸的微胶囊(例如，珠)。因此，如上文所提到的，可以控制含有生物颗粒和/或珠的流体和分配区流体的流动特性，以提供此类被多重占据的分配区。特别地，可以控制流动参数，以提供分配区的大于约50％、大于约75％、并且在一些情况下大于约80％、90％、95％或更高的期望的占据率。
在一些情况下，使用另外的微胶囊以将另外的试剂递送至分配区。在这样的情况下，可以有利的是，将不同的珠从不同的珠源(即包含不同的缔合的试剂)，通过不同的通道入口进入公共通道或液滴生成汇合点来引入到这样的公共通道或液滴生成汇合点中。在这样的情况下，可以控制不同的珠进入通道或汇合点的流动和频率，以提供来自每个源的期望比率的微胶囊，同时确保到分配区中的此类珠与期望数目的生物颗粒的期望配对或组合。
本文所描述的分配区可以包含小体积，例如小于约10微升(μL)、5μL、1μL、900皮升(pL)、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL、500纳升(nL)、100nL、50nL或更小。
例如，在基于液滴的分配区的情况下，液滴可以具有小于约1000pL、900pL、800pL、700pL、600pL、500pL、400pL、300pL、200pL、100pL、50pL、20pL、10pL、1pL或更小的总体积。在与微胶囊共分配的情况下，将理解的是，分配区内的样品流体体积，例如包括共分配的生物颗粒，可以小于上文描述的体积的约90％、小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、或小于上文描述的体积的约10％。
如本文其他地方所描述的，分配物质可以生成分配区群体或多个分配区。在这样的情况下，可以生成任何合适数目的分配区以生成多个分配区。例如，在本文所描述的方法中，可以生成多个分配区，包含至少约1,000个分配区、至少约5,000个分配区、至少约10,000个分配区、至少约50,000个分配区、至少约100,000个分配区、至少约500,000个分配区、至少约1,000,000个分配区、至少约5,000,000个分配区、至少约10,000,000个分配区、至少约50,000,000个分配区、至少约100,000,000个分配区、至少约500,000,000个分配区、至少约1,000,000,000个分配区或更多。此外，多个分配区可以包含未被占据的分配区(例如，空分配区)和被占据的分配区两者。
微流体通道网络可用于生成如本文所描述的分配区。在单独的生物颗粒的分配区中还可以采用可选择的机制，包括多孔膜，通过该多孔膜，细胞的含水混合物被挤压成非含水流体。
图1示出了用于分配单独的生物颗粒的微流体通道结构的实例。如本文其他地方所描述的，在一些情况下，大多数被占据的分配区可以包括每个被占据的分配区不多于一个的生物颗粒，并且在一些情况下，一些生成的分配区可以未被(任何生物颗粒)占据。但是，在一些情况下，一些被占据的分配区可以包括多于一个生物颗粒。在一些情况下，可以控制分配过程，使得被占据的分配区的少于约25％包含多于一个生物颗粒，并且在许多情况下，被占据的分配区的少于约20％具有多于一个生物颗粒，而在一些情况下，被占据的分配区的少于约10％或甚至少于约5％包括每个分配区多于一个的生物颗粒。
如图1中所示出的，通道结构可以包括在通道汇合点110处连通的通道区段102、104、106和108。在操作中，包括悬浮的生物颗粒(例如，细胞)114和悬浮的场可吸引的颗粒115的第一含水流体112可以沿着通道区段102被输送到汇合点110中，而与第一含水流体112不混溶的第二流体116从通道区段104和106的每一个递送至汇合点110，以产生流入通道区段108并且从汇合点110流出的第一含水流体112的离散液滴118、120。所生成的离散液滴可以包括单独的生物颗粒114和场可吸引的颗粒115(诸如液滴118)。所生成的离散液滴可以包括多于一个单独的生物颗粒114和场可吸引的颗粒115(在图1中未示出)。离散的液滴可以包含场可吸引的颗粒115，但是不包含生物颗粒114(诸如液滴120)。
场可吸引的颗粒115可以是顺磁性颗粒。在一些情况下，场可吸引的颗粒可以是超顺磁性颗粒。例如，场可吸引的颗粒可以包含聚苯乙烯磁性颗粒(例如，涂覆有至少一层磁铁矿(例如，氧化铁)和聚苯乙烯的聚苯乙烯核心颗粒)、氨基磁性颗粒、羧基磁性颗粒、二甲基氨基磁性颗粒、羟乙基磁性颗粒和/或上文颗粒的组合。顺磁性颗粒可以包含胺硅烷、葡萄糖醛酸、溴乙酰基、壳聚糖、羧甲基葡聚糖、柠檬酸、淀粉、DEAE-淀粉、磷酸酯-淀粉、葡聚糖、硫酸葡聚糖、脂质、油酸、二磷酸、聚天冬氨酸、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚二甲基胺、聚乙二醇α-甲氧基-ω-胺、聚乙二醇α-,ω-二磷酸、聚(马来酸-共-烯烃)、聚苯乙烯磺酸酯、聚乙烯醇、聚(4-乙烯基吡啶)、聚-二烯丙基二甲基胺、未涂覆的磁铁矿的聚合物基质、和/或其他基质。顺磁性颗粒可以具有微米尺寸或纳米尺寸。例如，顺磁性颗粒可以具有至多约20微米(μm)、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm、1μm、0.5μm或更小的最大尺寸(例如，宽度、长度、高度、直径等)。顺磁性颗粒可以具有至多约500纳米(nm)、400nm、300nm、200nm、100nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm或更小的最大尺寸。可选择地，顺磁性颗粒可以具有大于约20μm的最大尺寸。顺磁性颗粒当暴露于磁场时可以是响应的。在一些情况下，顺磁性颗粒可以是光滑的表面颗粒，其中厚的聚合物层覆盖磁铁矿(例如，氧化铁)层。光滑的表面可以保护磁铁矿免受酶活性的干扰或由于暴露于磁铁矿而对其他颗粒或细胞产生的其他不期望的影响。在一些情况下，顺磁性颗粒可以是交联颗粒，其中所述颗粒在氧化铁晶体的表面上涂覆有交联聚合物。交联聚合物可以使顺磁性颗粒对常见的有机溶剂，诸如丙酮、乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)和氯仿具有抗性。可以调整每个顺磁性颗粒上的磁铁矿含量(例如，至具有更高或更低的百分比)以对相同的磁场做出更多的响应或更少的响应。在一些情况下，场可吸引的颗粒可以是反磁性颗粒或铁磁颗粒。
在一些情况下，场可吸引的颗粒115可以是导电颗粒。导电颗粒可以具有微米尺寸或纳米尺寸。例如，导电颗粒可以具有至多约20微米(μm)、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm、1μm、0.5μm或更小的最大尺寸(例如，宽度、长度、高度、直径等)。导电颗粒可以具有至多约500纳米(nm)、400nm、300nm、200nm、100nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、9nm、8nm、7nm、6nm、5nm、4nm、3nm、2nm、1nm或更小的最大尺寸。可选择地，导电颗粒可以具有大于约20μm的最大尺寸。导电颗粒可以具有基本上球形的形状。可选择地，导电颗粒可以具有不同的形状。导电颗粒当暴露于电场时可以是响应的。可以调整每个导电颗粒上的导电(例如，金属)含量(例如，至具有更高或更低的百分比)以对相同的电场做出更多的响应或更少的响应。在一些情况下，场可吸引的颗粒115可以包含顺磁性颗粒和导电颗粒两者。
随着第一含水流体112被引入到汇合点110中，第一含水流体112可以具有基本上均匀浓度的场可吸引的颗粒115。例如，在时间x在通道区段102中的第一含水流体112中的场可吸引的颗粒115的浓度可以与在时间x+δ(其中x和δ是正的)在通道区段102中的第一含水流体112中的场可吸引的颗粒115的浓度基本上一致。在一些情况下，场可吸引的颗粒115的浓度在仅第一含水流体112的体积(也就是说，不包含悬浮在第一含水流体112中的每个生物颗粒114的体积的体积)中可以是基本上均匀的。
该第二流体116可以包含油，诸如氟化油，其包括用于使所得液滴稳定化(例如，抑制所得液滴的随后聚结)的含氟表面活性剂。特别有用的分配流体和含氟表面活性剂的实例在例如美国专利申请公布号2010/0105112中描述，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
生成的液滴可以包含两个子集的液滴：(1)包含一个或更多个生物颗粒114的被占据的液滴118，以及(2)不包含任何生物颗粒114的未被占据的液滴120。生成的被占据的或未被占据的每个液滴可以包含一定数目和/或浓度的场可吸引的颗粒115。在一些情况下，每个未被占据的液滴120中的场可吸引的颗粒115的浓度可以是基本上均匀的，其中所述浓度是每个总液滴体积(而不仅仅是液滴中第一含水流体112的体积)的场可吸引的颗粒的数目。在一些情况下，每个被占据的液滴118中的场可吸引的颗粒115的浓度可以是基本上均匀的，其中所述浓度是每个总液滴体积的场可吸引的颗粒的数目。在其他情况下，如可以容易理解的是，每个被占据的液滴118中的场可吸引的颗粒115的浓度可以随着包含在液滴中的生物颗粒114的尺寸和/或数目而变化。在任何情况下，任何未被占据的液滴120中的场可吸引的颗粒的浓度可以大于任何被占据的液滴118中的场可吸引的颗粒的浓度，以解释被在被占据的液滴118中的生物颗粒114占据的体积。在大多数情况下，来自未被占据的液滴120的液滴中的场可吸引的颗粒的浓度可以大于来自被占据的液滴118的液滴中的场可吸引的颗粒的浓度，以解释被在被占据的液滴118中的生物颗粒114占据的体积。
例如，假设(i)液滴是球形的并且具有半径RD，(ii)生物颗粒是球形的并且具有半径R+，并且(iii)含水流体的体积中场可吸引的颗粒的浓度是基本上均匀的，被单独占据的液滴中的场可吸引的颗粒的数目(N+)与未被占据的液滴中的场可吸引的颗粒的数目(N-)的比率将是：
如可以理解的是，上文比率可以随着与上文假设的偏差而变化。例如，包含三个生物颗粒的被占据的液滴可以具有约以下的比率：
在另一个方面中，除了基于液滴的分配之外或作为基于液滴的分配的替代，生物颗粒可以被包封在微胶囊诸如细胞珠内，所述微胶囊包含其中夹带有一个或更多个单独的生物颗粒或少量生物颗粒的外壳或层或多孔基体，并且可以包含其他试剂。可以通过多种方法进行生物颗粒的包封。此类方法将含有生物颗粒并且还含有待被分析的场可吸引的颗粒的含水流体与聚合物前体材料组合，所述聚合物前体材料在将特定刺激施加至聚合物前体后可以能够形成凝胶或者其他固体或半固体基体。这样的刺激包括例如热刺激(加热或冷却)、光刺激(例如，通过光固化)、化学刺激(例如，通过交联、前体的聚合引发(例如，通过额外的引发剂)等。
包含生物颗粒的微胶囊的制备可以通过多种方法进行。例如，气刀液滴或气溶胶发生器可以用于将前体流体的液滴分配到胶凝溶液中，以便形成包含单独的生物颗粒或少量生物颗粒的微胶囊。同样地，基于膜的包封系统可以用于产生包含如本文所描述的包封的生物颗粒的微胶囊。本公开内容的微流体系统，诸如图1中所示出的微流体系统，可以如本文所描述的容易地用于包封细胞，诸如以生成多个颗粒，每个颗粒包含场可吸引的颗粒。多个颗粒可以包含被生物颗粒(例如，细胞珠)占据的第一子集的颗粒和未被生物颗粒占据的第二子集的颗粒。特别地，并且参考图1，使包含(i)生物颗粒114、(ii)场可吸引的颗粒115以及(iii)聚合物前体材料(未示出)的含水流体流入通道汇合点110，在此处含水流体通过非含水流体的流动被分配成液滴118或120，所述液滴118或120分别包含或不包含单独的生物颗粒114，但总是包含场可吸引的颗粒115。就包封方法而言，非含水流体还可以包括引发剂，以引起聚合物前体的聚合和/或交联，以形成包括夹带的生物颗粒的微胶囊。聚合物前体/引发剂对的实例包括在美国专利申请公布号2014/0378345中所描述的那些聚合物前体/引发剂对，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
例如，在其中聚合物前体材料包含线性聚合物材料，例如线性聚丙烯酰胺、PEG或其他线性聚合物材料的情况下，活化剂可以包含交联剂或活化在所形成的液滴中的交联剂的化学品。同样地，对于包含可聚合单体的聚合物前体，活化剂可以包含聚合引发剂。例如，在某些情况下，在聚合物前体包含丙烯酰胺单体与N,N’-双-(丙烯酰基)胱胺(BAC)共聚单体的混合物的情况下，可以在通道区段104和106中的第二流体流内提供诸如四乙基亚甲基二胺(TEMED)的试剂，其引发丙烯酰胺和BAC共聚成交联聚合物网络或水凝胶。
在第二流体116与第一含水流体112在液滴的形成中在汇合点110处接触后，TEMED可以从第二流体116扩散到包含线性聚丙烯酰胺的第一含水流体112中，这将活化液滴内聚丙烯酰胺的交联，导致以夹带细胞的固体或半固体珠或颗粒的形式的凝胶(例如，水凝胶、微胶囊(例如，液滴118、120))的形成。尽管在聚丙烯酰胺包封方面进行了描述，但是在本文所描述的方法和组合物的上下文中也可以采用其他“可活化的”包封组合物。例如，形成藻酸盐液滴，随后是暴露于二价金属离子例如Ca2+，可以被用作使用所描述的方法的包封方法。同样地，琼脂糖液滴也可以通过基于温度的凝胶化(例如，在冷却后)等被转化成胶囊。在一些情况下，包封的生物颗粒可以选择性地从微胶囊中释放，例如通过时间推移或在施加特定刺激时，所述刺激使微胶囊充分降解以允许细胞或其内容物从微胶囊释放，例如进入分配区诸如液滴中。例如，就上文所描述的聚丙烯酰胺聚合物而言，微胶囊的降解可以通过引入适当的还原剂诸如DTT等以裂解交联聚合物基体的二硫键来完成(参见，例如，美国专利申请公布号2014/0378345，其出于所有目的通过引用整体并入本文)。
包封的生物颗粒(例如，细胞珠)可以提供具有可储存的和与基于液滴分配的生物颗粒相比更便携的某些潜在的优点。此外，在一些情况下，可以期望允许待被分析的生物颗粒孵育持续选定的时间段，以便表征在不同刺激的存在或不存在下此类生物颗粒随时间的变化。在这样的情况下，单独的生物颗粒的包封与在乳液液滴中分配相比可以允许更长时间的孵育，但是在一些情况下，液滴分配的生物颗粒也可以孵育不同的时间段，例如至少10秒、至少30秒、至少1分钟、至少5分钟、至少10分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时或至少10小时或更长时间。生物颗粒的包封可以构成生物颗粒的分配，其他试剂在其中共分配。可选择地，包封的生物颗粒可以容易地沉积到如上文所描述的其他分配区例如液滴中。
根据某些方面，生物颗粒可以连同裂解试剂一起被分配，以便释放分配区内生物颗粒的内容物。在这样的情况下，裂解剂可以在通过例如通道汇合点110上游的另外的一个或更多个通道，将生物颗粒引入到分配汇合点/液滴生成区中的同时或临将生物颗粒引入到分配汇合点/液滴生成区中之前与生物颗粒悬浮液接触。裂解剂的实例包括生物活性试剂，诸如用于裂解不同细胞类型(例如，革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌、植物、酵母、哺乳动物等)的裂解酶，诸如溶菌酶、无色肽酶、溶葡球菌素、labiase、kitalase、溶细胞酶和从例如Sigma-Aldrich,Inc.(St Louis,MO)可购得的多种其他裂解酶，以及其他可商购的裂解酶。其他裂解剂可以另外地或可选择地与生物颗粒共分配，以引起生物颗粒的内容物释放到分配区中。例如，在一些情况下，基于表面活性剂的裂解溶液可以用于裂解细胞，但是这些可能不太适用于基于乳液的系统，在基于乳液的系统中表面活性剂可以干扰稳定的乳液。在一些情况下，裂解溶液可以包括非离子型表面活性剂，诸如例如TritonX-100和吐温20。在一些情况下，裂解溶液可以包括离子型表面活性剂，诸如例如十二烷基肌氨酸钠和十二烷基硫酸钠(SDS)。在某些情况下，也可以使用电穿孔、热、声学或机械细胞破坏，例如，可以除了液滴分配之外或代替液滴分配的基于非乳液的分配诸如生物颗粒的包封，其中包封物的任何孔径足够小以在细胞破坏之后保留期望尺寸的核酸片段。
除了与上文所描述的生物颗粒共分配的裂解剂之外，其他试剂也可以与生物颗粒共分配，包括例如DNA酶和RNA酶灭活剂或抑制剂(诸如蛋白酶K)、螯合剂(诸如EDTA)和用于除去或以其他方式降低不同细胞裂解物组分对核酸的随后处理的负面活性或影响的其他试剂。此外，就包封的生物颗粒而言，可以将生物颗粒暴露于适当的刺激，以从共分配的微胶囊中释放生物颗粒或其内容物。例如，在一些情况下，化学刺激可以连同包封的生物颗粒一起被共分配，以允许微胶囊的降解和细胞或其内容物释放到更大的分配区中。在一些情况下，这种刺激可以与本文其他地方所描述的用于从其各自的微胶囊(例如，珠)中释放寡核苷酸的刺激相同。在可选择的方面中，这可以是不同的且非重叠的刺激，以便允许包封的生物颗粒在与寡核苷酸释放到相同分配区中不同的时间释放到分配区中。
另外的试剂也可以与生物颗粒共分配，诸如使生物颗粒的DNA片段化的核酸内切酶、DNA聚合酶和用于扩增生物颗粒的核酸片段并将条形码分子标签附接至扩增的片段的dNTP。另外的试剂还可以包括逆转录酶，包括具有末端转移酶活性的酶、引物和寡核苷酸、以及可用于模板转换的转换寡核苷酸(在本文中也被称为“转换寡核苷酸(switcholigos)”或“模板转换寡核苷酸”)。在一些情况下，模板转换可以用于增加cDNA的长度。在一些情况下，模板转换可以用于将预先定义的核酸序列附加至cDNA。在模板转换的实例中，cDNA可以从模板(例如，细胞mRNA)的逆转录生成，其中具有末端转移酶活性的逆转录酶可以以模板非依赖性方式向cDNA添加另外的核苷酸，例如聚C。转换寡核苷酸可以包括与另外的核苷酸(例如，聚G)互补的序列。cDNA上的另外的核苷酸(例如，聚C)可以与转换寡核苷酸上的另外的核苷酸(例如，聚G)杂交，由此所述转换寡核苷酸可以被逆转录酶用作模板以进一步延伸cDNA。模板转换寡核苷酸可以包含杂交区和模板区。杂交区可以包含能够与靶杂交的任何序列。在一些情况下，如先前所描述的，杂交区包含一系列G碱基，以与cDNA分子的3’末端处的突出C碱基互补。所述系列G碱基可以包含1个G碱基、2个G碱基、3个G碱基、4个G碱基、5个G碱基或多于5个G碱基。模板序列可以包含待被掺入cDNA中的任何序列。在一些情况下，模板区包含至少1个(例如，至少2个、3个、4个、5个或更多个)标签序列和/或功能序列。转换寡核苷酸可以包含脱氧核糖核酸；核糖核酸；修饰的核酸，其包括2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、反向dT、5-甲基dC、2'-脱氧肌苷、Super T(5-羟基丁炔-2'-脱氧尿苷)、Super G(8-氮杂-7-脱氮鸟苷)、锁核酸(LNA)、解锁核酸(UNA，例如UNA-A、UNA-U、UNA-C、UNA-G)、Iso-dG、Iso-dC、2'氟代碱基(例如，氟代C、氟代U、氟代A和氟代G)或任何组合。
在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可以是2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个、250个核苷酸或更长。
在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可以是至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个或250个核苷酸或更长。
在一些情况下，转换寡核苷酸的长度可以是至多2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、101个、102个、103个、104个、105个、106个、107个、108个、109个、110个、111个、112个、113个、114个、115个、116个、117个、118个、119个、120个、121个、122个、123个、124个、125个、126个、127个、128个、129个、130个、131个、132个、133个、134个、135个、136个、137个、138个、139个、140个、141个、142个、143个、144个、145个、146个、147个、148个、149个、150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个、160个、161个、162个、163个、164个、165个、166个、167个、168个、169个、170个、171个、172个、173个、174个、175个、176个、177个、178个、179个、180个、181个、182个、183个、184个、185个、186个、187个、188个、189个、190个、191个、192个、193个、194个、195个、196个、197个、198个、199个、200个、201个、202个、203个、204个、205个、206个、207个、208个、209个、210个、211个、212个、213个、214个、215个、216个、217个、218个、219个、220个、221个、222个、223个、224个、225个、226个、227个、228个、229个、230个、231个、232个、233个、234个、235个、236个、237个、238个、239个、240个、241个、242个、243个、244个、245个、246个、247个、248个、249个或250个核苷酸。
一旦将细胞的内容物释放到它们各自的分配区中，其中包含的大分子组分(例如，生物颗粒的大分子成分，诸如RNA、DNA或蛋白质)可以在分配区内被进一步处理。根据本文所描述的方法和系统，单独的生物颗粒的大分子组分内容物可以提供有独特的标识符，使得在表征那些大分子组分后，它们可以被归属为来源于相同的一个或更多个生物颗粒。通过将独特的标识符特异性地分配至单独的生物颗粒或生物颗粒群组来提供将特征归属于单独的生物颗粒或生物颗粒群组的能力。独特的标识符(例如，以核酸条形码的形式)可以被指定或与单独的生物颗粒或生物颗粒群体缔合，以便用独特的标识符对生物颗粒的大分子组分(并且导致其特征)加标签或标记。然后，可以使用这些独特的标识符以将生物颗粒的组分和特征归属于单独的生物颗粒或生物颗粒群组。在一些方面中，这通过将单独的生物颗粒或生物颗粒群组与独特的标识符共分配来进行。在一些方面中，独特的标识符以寡核苷酸的形式提供，所述寡核苷酸包含核酸条形码序列，所述核酸条形码序列可以被附接至单独的生物颗粒的核酸内容物或以其他方式与单独的生物颗粒的核酸内容物缔合，或者附接至生物颗粒的其他组分，并且特别是那些核酸的片段。将寡核苷酸分配，使得在给定的分配区中的寡核苷酸之间，其中包含的核酸条形码序列是相同的，但是在不同分配区之间，寡核苷酸可以并且确实具有不同的条形码序列，或者至少表示在给定的分析中跨所有分配区间的大量不同条形码序列。在一些方面中，仅一个核酸条形码序列可以与给定的分配区缔合，尽管在一些情况下，可以存在两个或更多个不同的条形码序列。
核酸条形码序列可以在寡核苷酸的序列内包括6个至约20个或更多个核苷酸。在一些情况下，条形码序列的长度可以是6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以是至少6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码序列的长度可以是至多6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个核苷酸或更短。这些核苷酸可以是完全连续的，即在相邻核苷酸的单个区段中，或者它们可以被分成两个或更多个由一个或更多个核苷酸分开的单独子序列。在一些情况下，分开的条形码子序列的长度可以是约4个至约16个核苷酸。在一些情况下，条形码子序列可以是4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以是至少4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个核苷酸或更长。在一些情况下，条形码子序列可以是至多4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个核苷酸或更短。
共分配的寡核苷酸还可以包含可用于处理来自共分配的生物颗粒的核酸的其他功能序列。这些序列包括例如靶向或随机/通用扩增引物序列，其用于扩增来自分配区内的单独的生物颗粒的基因组DNA，同时附接缔合的条形码序列，对引物或引物识别位点进行测序，杂交或探测序列，例如用于鉴定序列的存在或用于下拉条形码化的核酸；或许多其他潜在的功能序列中的任一种。也可以采用共分配寡核苷酸的其他机制，包括例如两个或更多个液滴的聚结，其中一个液滴包含寡核苷酸，或将寡核苷酸微分配到分配区，例如微流体系统内的液滴中。
在实例中，提供微胶囊诸如珠(例如，参见图19)，其各自包括大量可释放地附接至珠的上文描述的条形码化的寡核苷酸，其中附接至特定珠的所有寡核苷酸将包括相同的核酸条形码序列，但是其中跨所使用的珠的群体之间表现出大量不同的条形码序列。在一些实施方案中，水凝胶珠(例如，包含聚丙烯酰胺聚合物基质)被用作寡核苷酸进入分配区的固体支持物和递送媒介物，因为它们能够携带大量寡核苷酸分子，并且可以被配置成在暴露于特定刺激后释放那些寡核苷酸，如本文其他地方所描述的。在一些情况下，珠的群体将提供不同的条形码序列文库，所述条形码序列文库包括至少约1,000个不同的条形码序列、至少约5,000个不同的条形码序列、至少约10,000个不同的条形码序列、至少约50,000个不同的条形码序列、至少约100,000个不同的条形码序列、至少约1,000,000个不同的条形码序列、至少约5,000,000个不同的条形码序列、或至少约10,000,000个不同的条形码序列或更多。此外，每个珠可以提供有大量附接的寡核苷酸分子。特别地，在单独的珠上包括条形码序列的寡核苷酸分子的数目可以是至少约1,000个寡核苷酸分子、至少约5,000个寡核苷酸分子、至少约10,000个寡核苷酸分子、至少约50,000个寡核苷酸分子、至少约100,000个寡核苷酸分子、至少约500,000个寡核苷酸分子、至少约1,000,000个寡核苷酸分子、至少约5,000,000个寡核苷酸分子、至少约10,000,000个寡核苷酸分子、至少约50,000,000个寡核苷酸分子、至少约100,000,000个寡核苷酸分子并且在一些情况下至少约10亿个寡核苷酸分子或更多。
此外，当分配珠群体时，所得到的分配区群体还可以包括多种条形码文库，所述条形码文库包括至少约1,000个不同的条形码序列、至少约5,000个不同的条形码序列、至少约10,000个不同的条形码序列、至少约50,000个不同的条形码序列、至少约100,000个不同的条形码序列、至少约1,000,000个不同的条形码序列、至少约5,000,000个不同的条形码序列、或至少约10,000,000个不同的条形码序列。此外，所述群体的每个分配区可以包括至少约1,000个寡核苷酸分子、至少约5,000个寡核苷酸分子、至少约10,000个寡核苷酸分子、至少约50,000个寡核苷酸分子、至少约100,000个寡核苷酸分子、至少约500,000个寡核苷酸分子、至少约1,000,000个寡核苷酸分子、至少约5,000,000个寡核苷酸分子、至少约10,000,000个寡核苷酸分子、至少约50,000,000个寡核苷酸分子、至少约100,000,000个寡核苷酸分子并且在一些情况下至少约10亿个寡核苷酸分子。
在一些情况下，可以期望将多个不同的条形码掺入给定的分配区内，或者附接至分配区内的单个珠或多个珠。例如，在一些情况下，混合的但已知的条形码序列集可以在随后处理中提供更大的识别保证，例如通过向给定的分配区提供更强的地址或条形码属性，作为从给定的分配区输出的重复或独立确认。
寡核苷酸在向珠施加特定刺激后从珠可释放。在一些情况下，刺激可以是光刺激，例如通过裂解释放寡核苷酸的光不稳定键。在其他情况下，可以使用热刺激，其中珠环境的温度的升高将导致键的裂解或寡核苷酸从珠的其他释放。在又其他情况下，使用化学刺激，其裂解寡核苷酸与珠的键，或以其他方式导致寡核苷酸从珠中释放。在一种情况下，此类组合物包括上文所描述的用于包封生物颗粒的聚丙烯酰胺基质，并且可以通过暴露于还原剂诸如DTT而降解以释放附接的寡核苷酸。
例如，在图1中，与第一含水流体112的流通过通道区段102流向汇合点110的同时，包含悬浮在第三流体中的携带条形码的珠的第二含水流可以通过另一个通道(在图1中未示出)流向汇合点110。第三流体可以是与第一含水流体112相同的流体材料。非含水分配区流体从侧通道区段104和106的每一个引入到通道汇合点110中，并且合并的流流入出口通道区段108。在通道汇合点110内，将来自通道区段102和携带第三流体的其他通道的两个合并的含水流合并，并且分配成液滴118、120。被占据的液滴可以包含一个或更多个生物颗粒、一个或更多个携带条形码的珠、或者至少一个生物颗粒和至少一个携带条形码的珠两者。未被占据的液滴可以既不包含生物颗粒也不包含携带条形码的珠。然而，所有液滴(被占据的液滴和未被占据的液滴两者)可以包含至少一定浓度的场可吸引的颗粒115。如先前所提到的，通过控制在通道汇合点110处合并的每种流体的流动特性以及控制通道汇合点的几何形状，可以优化分配区，以在所生成的分配区内实现珠、生物颗粒或两者的期望的占据水平。
在一些情况下，假设(i)液滴是球形的并且具有半径RD，(ii)生物颗粒是球形的并且具有半径R+，(iii)携带条形码的珠是球形的并且具有半径RB，以及(iv)含水流体的体积中场可吸引的颗粒的浓度是基本上均匀的，被单独占据的液滴(包含生物颗粒和携带条形码的珠的每一个之一)中的场可吸引的颗粒的数目(N+,B)与未被占据的液滴中的场可吸引的颗粒的数目(N-)的比率将是：
图2A示出了用于将被占据的液滴与未被占据的液滴分离的微流体通道结构的实例。如本文其他地方所描述的，当生成液滴时，可以存在包含一个或更多个生物颗粒的第一子集的被占据的液滴群体和不包含任何生物颗粒的第二子集的未被占据的液滴群体。在一些情况下，液滴可以另外地包含一个或更多个携带条形码的珠。例如，液滴可以仅具有生物颗粒，液滴可以仅具有携带条形码的珠，液滴可以具有生物颗粒和携带条形码的珠两者，或者液滴可以既没有生物颗粒也没有携带条形码的珠。在一些情况下，大多数被占据的分配区可以包括每个被占据的分配区不多于一个的生物颗粒，并且在一些情况下，一些生成的分配区可以未被(任何生物颗粒)占据。但是，在一些情况下，一些被占据的分配区可以包括多于一个生物颗粒。在一些情况下，可以控制分配过程，使得被占据的分配区的少于25％包含多于一个生物颗粒，并且在许多情况下，被占据的分配区的少于20％具有多于一个生物颗粒，而在一些情况下，被占据的分配区的少于10％或甚至少于5％包括每个分配区多于一个生物颗粒。
如图2A中所示出的，通道结构可以包括在通道交叉点211处相遇的通道区段202、204和206。在一些情况下，携带图1中生成的液滴的乳液的流出通道区段108可以在通道区段202的上游，使得生成的液滴被引导流向通道交叉点211用于随后的分选。控制器220可以被可操作地耦接至流体流动单元218，以促进通道结构中流体的流动，并且被可操作地耦接至场施加单元216，以将一个或更多个场施加至通道结构。
在操作中，多个离散液滴(每个包含第一含水流体210)可以作为乳液在第二流体208中流动，其中第二流体208与第一含水流体210不混溶。沿着通道区段202被输送到交叉点211的液滴可以包含第一子集的液滴214和第二子集的液滴212，所述第一子集的液滴214各自被至少生物颗粒和/或携带条形码的珠占据，所述第二子集的液滴212各自未被占据。每个液滴(包括被占据的液滴和未被占据的液滴)可以包含一定浓度的场可吸引的颗粒。如上文所描述的，给定的未被占据的液滴可以具有比给定的被占据的液滴更高浓度的场可吸引的颗粒，以解释在被占据的液滴中被生物颗粒和/或条形码珠占据的体积。
在交叉点211处或附近分选之后，第一子集的液滴214可以被引导以沿着通道区段206并远离交叉点211流动，并且第二子集的液滴212可以被引导以沿着通道区段204并远离交叉点211流动。
流体流动单元218可以被配置成使包含多个液滴(包括被占据的液滴和未被占据的液滴两者)的第二流体208沿着通道区段202流向交叉点211。流体流动单元218可以被配置成使包含多个液滴(其中大多数液滴是未被占据的液滴)的第二流体208沿着通道区段204远离交叉点211流动。流体流动单元218可以被配置成使包含多个液滴(其中大多数液滴是被占据的液滴)的第二流体208沿着通道区段206远离交叉点211流动。可选择地，流体流动单元218可以被配置成使包含多个液滴(其中大多数液滴是未被占据的液滴)的第二流体208沿着通道区段206远离交叉点211流动，并且被配置成使包含多个液滴(其中大多数液滴是被占据的液滴)的第二流体208沿着通道区段204远离交叉点211流动。流体流动单元218可以被可操作地耦接至控制器220。例如，流体流动单元218可以从控制器220接收关于流体压力和/或速度的指令。
在一些情况下，流体流动单元218可以包含压缩机，以在上游位置处提供正压，以将流体从上游位置引导流向下游位置。在一些情况下，流体流动单元218可以包含泵，以在下游位置处提供负压，以将流体从上游位置引导流向下游位置。在一些情况下，流体流动单元218可以包含压缩机和泵两者，每个在不同的位置处。在一些情况下，流体流动单元218可以在不同位置处包含不同装置。流体流动单元218可以包含致动器。虽然图2A描绘了一个流体流动单元218，但是可以理解的是，可以存在多个流体流动单元218，每个流体流动单元218与控制器220通信和/或彼此通信。例如，可以存在将通道区段202中的流体引导朝向交叉点211的单独的流体流动单元、将通道区段204中的流体引导远离交叉点211的单独的流体流动单元、以及将通道区段206中的流体引导远离交叉点211的单独的流体流动单元。
场施加单元216可以被配置成向通道结构施加力场。在一些情况下，场施加单元216可以被配置成在交叉点211处或附近施加力场，使得第二子集的液滴(未被占据的液滴)通常被引导沿着通道区段204并远离交叉点211，并且第一子集的液滴(被占据的液滴)通常被引导沿着通道区段206并远离交叉点211，从而分离液滴的两个子集。
例如，场施加单元216可以在交叉点211处或附近施加磁场。场施加单元216可以是被配置成生成磁场的磁体和/或回路(例如，载流装置)。由于每个液滴包含场可吸引的颗粒(例如，顺磁性颗粒)，每个液滴可以分别被吸引(例如，由于顺磁性颗粒)或被排斥(例如，由于反磁性颗粒)至磁场或远离磁场。吸引(或排斥)的程度可以与每个液滴中场可吸引的颗粒的数目(和/或浓度)成比例。也就是说，来自相同磁场的作用于液滴上的磁力可以与液滴中场可吸引的颗粒的数目(和/或浓度)成比例。如上文先前所描述的，假设(i)液滴是球形的并且具有半径RD，(ii)生物颗粒是球形的并且具有半径R+，以及(iii)含水流体的体积中场可吸引的颗粒的浓度是基本上均匀的，被单独占据的液滴中场可吸引的颗粒的数目(N+)(其中所述被占据的液滴包含单个生物颗粒)与未被占据的液滴中场可吸引的颗粒的数目(N-)的比率，以及因此作用于被单独占据的液滴上的磁力(FM+)与作用于未被占据的液滴上的磁力(FM-)的比率将是：
也就是说，可以存在与作用于给定的占据的液滴上相比更强的(有差异的)作用于给定的未被占据的液滴上的力。如可以理解的是，上文比率可以随着与上文假设的偏差(例如，非球形的生物颗粒、非球形的液滴、含水流体的体积中场可吸引的颗粒的不均匀浓度等)而变化。
在另一个实例中，场施加单元216可以在交叉点211处或附近施加电场。由于每个液滴包含场可吸引的颗粒(例如，导电颗粒)，每个液滴可以分别被吸引或被排斥至电场或远离电场。吸引(或排斥)的程度可以与每个液滴中场可吸引的颗粒的数目(和/或浓度)成比例。也就是说，来自相同电场的作用于液滴上的电力可以与液滴中场可吸引的颗粒的数目(和/或浓度)成比例。如上文先前所描述的，假设(i)液滴是球形的并且具有半径RD，(ii)生物颗粒是球形的且具有半径R+，以及(iii)含水流体的体积中场可吸引的颗粒的浓度是基本上均匀的，被单独占据的液滴中场可吸引的颗粒的数目(N+)(其中所述占据的液滴包含单个生物颗粒)与未被占据的液滴中场可吸引的颗粒的数目(N-)的比率将是，并且因此作用于被单独占据的液滴上的电力(FE+)与作用于未被占据的液滴上的电力(FE-)的比率将是：
如可以理解的是，上文比率可以随着与上文假设的偏差(例如，非球形的生物颗粒、非球形的液滴、含水流体的体积中场可吸引的颗粒的不均匀浓度等)而变化。在一些情况下，流体流动单元218可以施加电场和磁场两者。
场施加单元216可以被可操作地耦接至控制器220。例如，场施加单元216可以从控制器220接收关于力场强度、方向、频率和/或其他变量的指令。虽然图2A描绘了一个场施加单元216，但是可以理解的是，可以存在多个场施加单元216，每个场施加单元216与控制器220、其他控制器通信和/或彼此通信。例如，可以存在多个场施加单元，每个场施加单元位于不同的位置处。控制器220可以指示场施加单元216朝向混合的(被占据的和未被占据的)液滴施加足够强且以足够的靶向方向的力场，诸如以将未被占据的液滴引导在一个通道中并将被占据的液滴引导至另一个通道中。在实例中，场施加单元216可以被放置在比第二通道(例如，通道区段206)更靠近第一通道(例如，通道区段204)的位置，以将未被占据的液滴(其经受来自相同场的更强的力)引导至第一通道，假设场在最靠近场施加单元216时最强。来自场的力作用于液滴上越强，液滴将偏离初始流动方向(例如，在通道区段202中的流动方向)进入具有另一个方向的另一个通道越有可能。在一些情况下，场施加单元可以至少部分地位于意图分离未被占据的液滴的通道(例如，通道区段204)的交叉点211的下游。
例如，所施加的力场可以足够强以引导未被占据的液滴流向第一通道，但是可以足够弱以引导(或留下)被占据的液滴流向第二通道。在一些情况下，由场施加单元216施加的磁场可以具有从至少约10-5特斯拉(T)至约1T的范围的磁通量密度。可选择地，磁通量密度可以小于或等于约10-5T和/或大于或等于约1T。在一些情况下，由场施加单元216施加的电场可以具有至少约1伏特/米(V/m)、2V/m、3V/m、4V/m、5V/m、10V/m或更多的电场强度。可选择地，电场强度可以小于约10V/m、5V/m、4V/m、3V/m、2V/m、1V/m或更小。
图2B示出了用于分离被单独占据的液滴的多级微流体通道结构的实例。如本文其他地方所描述的，当生成液滴时，可以存在包含单个生物颗粒(例如，细胞)的第一子集的被占据的液滴群体、不包含任何生物颗粒的第二子集的未被占据的液滴群体、以及包含多个(例如，两个或更多个)生物颗粒的第三子集的被占据的液滴群体。在一些情况下，液滴可以另外地包含一个或更多个携带条形码的珠。例如，液滴可以仅具有生物颗粒，液滴可以仅具有携带条形码的珠，液滴可以具有生物颗粒和携带条形码的珠两者，或者液滴可以既没有生物颗粒也没有携带条形码的珠。可以对生成的液滴进行分选以在多个阶段中分离第一子集群体、第二子集群体和第三子集群体。
如图2B中所示出的，通道结构可以包括通道区段222、224、226、244和246。通道区段222、224和226可以在通道交叉点231处相遇。通道区段226、244和246可以在通道交叉点233处相遇。在一些情况下，携带图1中生成的液滴的乳液的流出通道区段108可以在通道区段222的上游，使得生成的液滴被引导流向通道交叉点231用于随后的分选。生成的液滴可以包含第一子集的被单独占据的液滴群体(例如，230A)、第二子集的未被占据的液滴群体(例如，230B)和第三子集的被多重占据的液滴群体(例如，230C)。第一控制器240可以被可操作地耦接至流体流动单元238，以促进通道结构中流体的流动，以及被可操作地耦接至第一场施加单元236，以将一个或更多个场施加至通道结构。第二控制器241可以被可操作地耦接至第二场施加单元237，以将一个或更多个场施加至通道结构。
在操作中，多个离散液滴可以作为乳液在流体228中流动。沿着通道区段222被输送到交叉点231的液滴可以包含第一子集的被单独占据的液滴群体(例如，230A)、第二子集的未被占据的液滴群体(例如，230B)和第三子集的被多重占据的液滴群体(例如，230C)。每个液滴(包括被单独占据的液滴、被多重占据的液滴和未被占据的液滴)可以包含一定浓度的场可吸引的颗粒。如上文所描述的，给定的未被占据的液滴可以具有比给定的被占据的液滴更高浓度的场可吸引的颗粒，以解释在被占据的液滴中被生物颗粒和/或条形码珠占据的体积。在被占据的液滴内，给定的被单独占据的液滴可以具有比给定的被多重占据的液滴更高浓度的场可吸引的颗粒，以解释被液滴中不同数目的生物颗粒(和/或条形码珠)占据的差异体积。
在交叉点231处或附近分选的第一阶段之后，第一子集和第三子集的液滴(例如，230A，230C)可以被引导以沿着通道区段226并远离交叉点231流动，并且第二子集的液滴230B可以被引导以沿着通道区段224并远离交叉点231流动。
流体流动单元238可以被配置成使包含多个液滴的流体228经受沿着通道区段222、224、226、244和246往返于交叉点231、233，所述多个液滴包括被占据的液滴和/或未被占据的液滴(例如，作为乳液悬浮液)。流体流动单元238可以被可操作地耦接至第一控制器240。例如，流体流动单元238可以从第一控制器240接收关于流体压力和/或速度的指令。
在一些情况下，流体流动单元238可以包含压缩机，以在上游位置处提供正压，以将流体从上游位置引导流向下游位置。在一些情况下，流体流动单元238可以包含泵，以在下游位置处提供负压，以将流体从上游位置引导流向下游位置。在一些情况下，流体流动单元238可以包含压缩机和泵两者，每个在不同的位置处。在一些情况下，流体流动单元238可以在不同位置处包含不同装置。流体流动单元238可以包含致动器。虽然图2B描绘了一个流体流动单元238，但是可以理解的是，可以存在多个流体流动单元238，每个流体流动单元238与第一控制器240、其他控制器(例如，第二控制器241)通信和/或彼此通信。例如，可以存在将通道区段222中的流体引导朝向交叉点231的单独的流体流动单元、将通道区段224中的流体引导远离交叉点231的单独的流体流动单元、以及将通道区段226中的流体引导远离交叉点231的单独的流体流动单元。
第一场施加单元236可以被配置成向通道结构施加力场。在一些情况下，第一场施加单元236可以被配置成在交叉点231处或附近施加力场，使得第二子集的液滴(未被占据的液滴)通常被引导沿着通道区段224并远离交叉点231，并且第一子集和第三子集的液滴(被占据的液滴)通常被引导沿着通道区段226并远离交叉点231，从而分离液滴的子集。例如，如本文其他地方所描述的，第一场施加单元236可以在交叉点231处或附近施加磁场。由于每个液滴包含场可吸引的颗粒(例如，顺磁性颗粒)，每个液滴可以分别被吸引(例如，由于顺磁性颗粒)或被排斥(例如，由于反磁性颗粒)至磁场或远离磁场。吸引(或排斥)的程度可以与每个液滴中场可吸引的颗粒的数目(和/或浓度)成比例。也就是说，来自相同磁场的作用于液滴上的磁力可以与液滴中场可吸引的颗粒的数目(和/或浓度)成比例。如上文所描述的，假设(i)液滴是球形的并且具有半径RD，(ii)生物颗粒是球形的并且具有半径R+，以及(iii)含水流体的体积中场可吸引的颗粒的浓度是基本上均匀的，单被独占据的液滴中场可吸引的颗粒的数目(N+)(其中所述被占据的液滴包含单个生物颗粒)与未被占据的液滴中场可吸引的颗粒的数目(N-)的比率，以及因此作用于被单独占据的液滴上的磁力(FM+)与作用于未被占据的液滴上的磁力(FM-)的比率将是：
类似地，被双重占据的液滴中场可吸引的颗粒的数目(N2+)(其中所述被占据的液滴包含两个生物颗粒)与未被占据的液滴中场可吸引的颗粒的数目(N-)的比率，以及因此作用于被双重占据的液滴上的磁力(FM,2+)与作用于未被占据的液滴上的磁力(FM-)的比率将是：
也就是说，可以存在与作用于给定的被占据的液滴上相比更强的(有差异的)作用于给定的未被占据的液滴上的力。在被占据的液滴之间，可以存在与作用于给定的被双重占据的液滴上相比更强的(有差异的)作用于给定的被单独占据的液滴上的力。类似地，液滴被占据越多(具有更多的生物颗粒)，它将受磁场的影响越小。如可以理解的是，上文比率可以随着与上文假设的偏差(例如，非球形的生物颗粒、非球形的液滴、含水流体的体积中场可吸引的颗粒的不均匀浓度等)而变化。
在另一个实例中，如本文其他地方所描述的，第一场施加单元236可以在交叉点231处或附近施加电场。由于每个液滴包含场可吸引的颗粒(例如，导电颗粒)，每个液滴可以分别被吸引或被排斥至电场或远离电场。吸引(或排斥)的程度可以与每个液滴中场可吸引的颗粒的数目(和/或浓度)成比例。也就是说，来自相同电场的作用于液滴上的电力可以与液滴中场可吸引的颗粒的数目(和/或浓度)成比例。
第一场施加单元236可以被可操作地耦接至第一控制器240。例如，第一场施加单元236可以从第一控制器240接收关于力场强度、方向、频率和/或其他变量的指令。第一控制器240可以指示第一场施加单元236朝向混合的(被占据的和未被占据的)液滴施加足够强且以足够的靶向方向的力场，诸如以将未被占据的液滴引导在一个通道中并将被占据的液滴引导至另一个通道中。在实例中，第一场施加单元236可以被放置在比第二通道(例如，通道区段226)更靠近第一通道(例如，通道区段224)的位置，以将未被占据的液滴(其经受来自相同场的更强的力)引导至第一通道，假设场在最靠近第一场施加单元236时最强。来自场的力作用于液滴上越强，液滴将偏离初始流动方向(例如，在通道区段222中的流动方向)进入具有另一个方向的另一个通道越有可能。在一些情况下，场施加单元可以至少部分地位于意图分离未被占据的液滴的通道(例如，通道区段224)的交叉点231的下游。
例如，所施加的力场可以足够强以引导未被占据的液滴流向第一通道，但是可以足够弱以引导(或留下)被占据的液滴(无论是被单独占据的、被双重占据的还是另外的被多重占据的)流向第二通道。在一些情况下，由第一场施加单元236施加的磁场可以具有至少约10-5特斯拉(T)至约1T的范围的磁通量密度。可选择地，磁通量密度可以小于或等于约10-5T和/或大于或等于约1T。在一些情况下，由第一场施加单元236施加的电场可以具有至少约1伏特/米(V/m)、2V/m、3V/m、4V/m、5V/m、10V/m或更多的电场强度。可选择地，电场强度可以小于约10V/m、5V/m、4V/m、3V/m、2V/m、1V/m或更小。
分离至通道区段226的第一子集和第三子集的液滴(例如，230A、230C)可以经受在交叉点233处或附近分选的第二阶段。在交叉点233处或附近分选的第二阶段之后，第三子集的液滴(例如，230C)可以被引导以沿着通道区段246并远离交叉点233流动，并且第一子集的液滴230A可以被引导以沿着通道区段244并远离交叉点233流动。因此，被单独占据的液滴(第一子集的液滴)可以与未被占据的液滴和被多重占据的液滴分离。
第二场施加单元237可以被配置成向通道结构施加力场。在一些情况下，第二场施加单元237可以被配置成在交叉点233处或附近施加力场，使得第一子集的液滴(被单独占据的液滴)通常被引导沿着通道区段244并远离交叉点233，并且第三子集的液滴(被多重占据的液滴)通常被引导沿着通道区段246并远离交叉点233，从而分离第一子集和第三子集的液滴。例如，如本文其他地方所描述的，第二场施加单元237可以在交叉点233处或附近施加磁场。如本文其他地方所描述的，如在被占据的液滴之间，可以存在与作用于给定的被双重占据的液滴上相比更强的(有差异的)作用于给定的被单独占据的液滴上的力。类似地，液滴被占据越多(具有更多的生物颗粒)，它将受磁场的影响越小。在另一个实例中，如本文其他地方所描述的，第二场施加单元237可以在交叉点233处或附近施加电场。
第二场施加单元237可以被可操作地耦接至第二控制器241。例如，第二场施加单元237可以从第二控制器241接收关于力场强度、方向、频率和/或其他变量的指令。第二控制器241可以指示第二场施加单元237朝向混合的(被单独占据的和被多重占据的)液滴施加足够强且以足够的靶向方向的力场，诸如以将被单独占据的液滴引导在一个通道中并将被多重占据的液滴引导至另一个通道中。在实例中，第二场施加单元237可以被放置在比第二通道(例如，通道区段246)更靠近第一通道(例如，通道区段244)的位置，以将被单独占据的液滴(其经受来自相同场的、比被多重占据的液滴更强的力)引导至第一通道，假设场在最靠近第二场施加单元237时最强。来自场的力作用于液滴上越强，液滴将偏离初始流动方向(例如，在通道区段226中的流动方向)进入具有另一个方向的另一个通道越有可能。在一些情况下，场施加单元可以至少部分地位于意图分离被单独占据的液滴的通道(例如，通道区段244)的交叉点233的下游。可选择地或另外地，第二场施加单元237可以被可操作地耦接至第一控制器240。
例如，所施加的力场可以足够强以引导被单独占据的液滴流向第一通道，但是可以足够弱以引导(或留下)被多重占据的液滴(无论是被单独占据的、被双重占据的还是另外的被多重占据的)流向第二通道。在一些情况下，由第二场施加单元237施加的力场可以比由第一场施加单元236施加的力场更强。在一些情况下，由第二场施加单元237施加的磁场可以具有从至少约10-5特斯拉(T)至约1T的范围的磁通量密度。可选择地，磁通量密度可以小于或等于约10-5T和/或大于或等于约1T。在一些情况下，由第一场施加单元236施加的电场可以具有至少约1伏特/米(V/m)、2V/m、3V/m、4V/m、5V/m、10V/m或更多的电场强度。可选择地，电场强度可以小于约10V/m、5V/m、4V/m、3V/m、2V/m、1V/m或更小。
关于图2A-B所描述的系统和方法可以用于将细胞珠与未被生物颗粒占据的颗粒分离，和/或将被单独占据的细胞珠与未被占据的细胞珠和被多重占据的细胞珠分离。如本文其他地方所描述的，多个颗粒可以包含第一子集的被生物颗粒(例如，细胞)占据的颗粒(例如，细胞珠)和第二子集的未被生物颗粒占据的颗粒。被占据的颗粒和未被占据的颗粒两者可以包含场可吸引的颗粒。被占据的颗粒可以包括被单独占据的细胞珠和被多重占据的细胞珠，每个被单独占据的细胞珠包含单个生物颗粒，每个被多重占据的细胞珠包含两个或更多个生物颗粒。例如，此类包含场可吸引的颗粒的颗粒可以通过聚合包含场可吸引的颗粒的多个液滴而生成(例如，在图1中)。在包括在通道交叉点211处相遇的通道区段202、204和206的通道结构中，多个颗粒可以被引导以(例如，作为流体(例如，含水流体)中的悬浮液)流向通道交叉点211，用于随后的分选。控制器220可以被可操作地耦接至流体流动单元218，以促进通道结构中的流体的流动，以及被可操作地耦接至场施加单元216，以将一个或更多个场施加至通道结构。
在操作中，多个离散颗粒(包括细胞珠和未被占据的颗粒两者)可以被引导以沿着通道区段202流入交叉点211。多个颗粒可以包含各自被至少一个生物颗粒占据的第一子集的颗粒(例如，细胞珠)和各自未被占据的第二子集的颗粒。每个颗粒(包括细胞珠和未被占据的颗粒)可以包含一定浓度的场可吸引的颗粒。如关于在被占据的液滴和未被占据的液滴中场可吸引的颗粒的相对浓度所描述的，给定的未被占据的颗粒可以具有比给定的细胞珠(例如，给定的被占据的颗粒)更高浓度的场可吸引的颗粒，以解释被细胞珠中的生物颗粒占据的体积。
在交叉点211处或附近分选之后，第一子集的颗粒(例如，细胞珠)可以被引导以沿着通道区段206并远离交叉点211流动，并且第二子集的颗粒可以被引导以沿着通道区段204并远离交叉点211流动。
流体流动单元218可以被配置成使包含多个颗粒(包括细胞珠和未被占据的颗粒两者)的第二流体208沿着通道202朝向交叉点211流动。流体流动单元218可以被配置成使包含多个颗粒(其中大多数颗粒是未被占据的)的第二流体208沿着通道204远离交叉点211流动。流体流动单元218可以被配置成使包含多个颗粒(其中大多数颗粒是细胞珠(被占据的颗粒))的第二流体208沿着通道206远离交叉点211流动。可选择地，流体流动单元218可以被配置成使包含多个颗粒(其中大多数颗粒是未被占据的颗粒)的第二流体208沿着通道206远离交叉点211流动，并且被配置成使包含多个颗粒(其中大多数颗粒是细胞珠)的第二流体208沿着通道204远离交叉点211流动。流体流动单元218可以被可操作地耦接至控制器220。例如，流体流动单元218可以从控制器220接收关于流体压力和/或速度的指令。
场施加单元216可以被配置成向通道结构施加力场。在一些情况下，场施加单元216可以被配置成在交叉点211处或附近施加力场，使得第二子集的颗粒(未被占据的颗粒)通常被引导沿着通道区段204并远离交叉点211，并且第一子集的颗粒(细胞珠)通常被引导沿着通道区段206并远离交叉点211，从而分离两个子集的颗粒。
例如，场施加单元216可以在交叉点211处或附近施加磁场。场施加单元216可以是被配置成生成磁场的磁体和/或回路(例如，载流装置)。由于每个颗粒包含场可吸引的颗粒(例如，顺磁性颗粒)，每个颗粒可以分别被吸引(例如，由于顺磁性颗粒)或被排斥(例如，由于反磁性颗粒)至磁场或远离磁场。吸引(或排斥)的程度可以与每个颗粒中场可吸引的颗粒的数目(和/或浓度)成比例。也就是说，来自相同磁场的作用于颗粒上的磁力可以与颗粒中场可吸引的颗粒的数目(和/或浓度)成比例。例如，假设(i)颗粒是球形的并且具有半径RCB，(ii)生物颗粒是球形的并且具有半径R+，以及(iii)颗粒中场可吸引的颗粒的浓度是基本上均匀的，被单独占据的细胞珠中场可吸引的颗粒的数目(N+)(其中所述细胞珠包含单个生物颗粒)与未被占据的颗粒中场可吸引的颗粒的数目(N-)的比率，以及因此作用于被单独占据的细胞珠上的磁力(FM+)与作用于未被占据的颗粒上的磁力(FM-)的比率将是：
也就是说，可以存在与作用于给定的细胞珠上相比更强的(有差异的)作用于给定的未被占据的颗粒上的力。如可以理解的是，上文比率可以随着与上文假设的偏差(例如，非球形的生物颗粒、非球形的颗粒、颗粒的体积中场可吸引的颗粒的不均匀浓度等)而变化。
在另一个实例中，场施加单元216可以在交叉点211处或附近施加电场。由于每个颗粒包含场可吸引的颗粒(例如，导电颗粒)，每个颗粒可以分别被吸引或被排斥至电场或远离电场。吸引(或排斥)的程度可以与每个颗粒中场可吸引的颗粒的数目(和/或浓度)成比例。也就是说，来自相同电场的作用于颗粒上的电力可以与颗粒中场可吸引的颗粒的数目(和/或浓度)成比例。如上文先前所描述的，假设(i)颗粒是球形的并且具有半径RCB，(ii)生物颗粒是球形的并且具有半径R+，以及(iii)颗粒的体积中场可吸引的颗粒的浓度是基本上均匀的，被单独占据的细胞珠中场可吸引的颗粒的数目(N+)(其中所述细胞珠包含单个生物颗粒)与未被占据的颗粒中场可吸引的颗粒的数目(N-)的比率，以及因此作用于被单独占据的细胞珠上的电力(FE+)与作用于未被占据的颗粒上的电力(FE-)的比率将是：
如可以理解的是，上文比率可以随着与上文假设的偏差(例如，非球形的生物颗粒、非球形的颗粒、颗粒的体积中场可吸引的颗粒的不均匀浓度等)而变化。在一些情况下，流体流动单元218可以施加电场和磁场两者。
场施加单元216可以被可操作地耦接至控制器220。例如，场施加单元216可以从控制器220接收关于力场强度、方向、频率和/或其他变量的指令。控制器220可以指示场施加单元216朝向混合的(被占据的和未被占据的)颗粒施加足够强且以足够的靶向方向的力场，诸如以将未被占据的颗粒引导在一个通道中并将被占据的颗粒引导至另一个通道中。在实例中，场施加单元216可以被放置在比第二通道(例如，通道区段206)更靠近第一通道(例如，通道区段204)的位置，以将未被占据的颗粒(其经受来自相同场的更强的力)引导至第一通道，假设所述场在最靠近场施加单元216时最强。来自场的力作用于颗粒上越强，颗粒将偏离初始流动方向(例如，在通道区段202中的流动方向)进入具有另一个方向的另一个通道越有可能。在一些情况下，场施加单元可以至少部分地位于意图分离未被占据的颗粒的通道(例如，通道区段204)的交叉点211的下游。
例如，所施加的力场可以足够强以引导未被占据的颗粒流向第一通道，但是可以足够弱以引导(或留下)被占据的颗粒流向第二通道。在一些情况下，由场施加单元216施加的磁场可以具有从至少约10-5特斯拉(T)至约1T的范围的磁通量密度。可选择地，磁通量密度可以小于或等于约10-5T和/或大于或等于约1T。在一些情况下，由场施加单元216施加的电场可以具有至少约1伏特/米(V/m)、2V/m、3V/m、4V/m、5V/m、10V/m或更多的电场强度。可选择地，电场强度可以小于约10V/m、5V/m、4V/m、3V/m、2V/m、1V/m或更小。
类似地，被单独占据的细胞珠可以通过以下从未被占据的颗粒和被多重占据的细胞珠分选出来：使用关于图2B所描述的系统和方法，但是引入多个颗粒(包含被单独占据的第一子集的细胞珠、未被占据的第二子集的颗粒和被多重占据的第三子集的细胞珠)，每个颗粒包含场可吸引的颗粒，代替包含场可吸引的颗粒的多个液滴。
虽然图2A和图2B各自描绘了通道结构，其中第二通道(例如，通道区段204)在分选交叉点(例如，交叉点211)处从第一通道(例如，通道区段202)分支出来，使得第三通道(通道区段204)在与第一通道相同的方向上继续，但是可以理解的是，本文所公开的系统和方法可以应用于不同的通道结构。例如，第三通道可以与第一通道成不同的角度(例如，不是180°)。在一些实例中，通道结构可以具有从第一通道分支出来的多于两个通道，其中场施加单元216被配置成将液滴分离成未被占据的液滴、包含仅一个生物颗粒的液滴、包含多于一个生物颗粒的液滴、包含仅携带条形码的珠的液滴、包含生物颗粒和携带条形码的珠两者的液滴或其他变型。在一些实例中，通道结构可以具有从第一通道分支出来的多于两个通道，其中场施加单元216被配置成将颗粒分离成未被占据的颗粒、包含仅一个生物颗粒的颗粒、包含多于一个生物颗粒的颗粒、包含仅携带条形码的珠的颗粒、包含生物颗粒和携带条形码的珠两者的颗粒或其他变型。例如，被其中包含的一个或更多个生物颗粒和/或一个或更多个携带条形码的珠占据的液滴或颗粒的体积越大，通过由场施加单元216所施加的场作用于液滴或颗粒上的力就可以越弱，并且因此流动方向相对于第一通道中的流动方向的偏差就越小。也就是说，在施加力场后，未被占据的液滴或颗粒可以能够偏离最大(例如，至最靠近场施加单元的通道)，包含单个生物颗粒(例如，被单独占据的细胞珠)的液滴或颗粒可以能够偏离，但是没有未被占据的液滴或颗粒那么多(例如，至第二最靠近场施加单元的通道)，并且包含生物颗粒和携带条形码的珠两者的液滴或颗粒可以能够在三种类型的液滴或颗粒中偏离最少(例如，至离场施加单元最远的通道)。
虽然图2A-2B描绘了允许液滴和/或颗粒仅以单排(single file)流动的窄通道，但是本文所公开的系统和方法可以适用于具有较宽宽度(例如，直径)的通道，该通道允许液滴和/或颗粒以多于单排流动。
虽然图2A描绘了可操作地耦接至流体流动单元218和场施加单元216两者的一个控制器220，但是单独的控制器可以被耦接至流体流动单元218，并且单独的控制器可以被耦接至场施加单元216。两个单独的控制器可以彼此通信或可以不彼此通信。在一些情况下，可以存在多个控制器(例如，耦接至流体流动单元218的两个控制器)，其中每个控制器可以彼此通信或可以不彼此通信。控制器220可以经由有线连接和/或无线连接(例如，Wi-Fi、蓝牙、NFC等)向流体流动单元218和/或场施加单元216发送指令。
图3示出了用于将被占据的液滴与未被占据的液滴分离的微流体通道结构的另一个实例。如本文其他地方所描述的，当生成液滴时，可以存在包含一个或更多个生物颗粒的第一子集的被占据的液滴群体和不包含任何生物颗粒的第二子集的未被占据的液滴群体。在一些情况下，液滴可以另外地包含一个或更多个携带条形码的珠。例如，液滴可以仅具有生物颗粒，液滴可以仅具有携带条形码的珠，液滴可以具有生物颗粒和携带条形码的珠两者，或者液滴可以既没有生物颗粒也没有携带条形码的珠。在一些情况下，大多数被占据的分配区可以包括每个被占据的分配区不多于一个的生物颗粒，并且在一些情况下，一些生成的分配区可以未被(任何生物颗粒)占据。但是，在一些情况下，一些被占据的分配区可以包括多于一个生物颗粒。在一些情况下，可以控制分配过程，使得被占据的分配区的少于约25％包含多于一个生物颗粒，并且在许多情况下，被占据的分配区的少于约20％具有多于一个生物颗粒，而在一些情况下，被占据的分配区的少于约10％或甚至少于约5％包括每个分配区多于一个生物颗粒。
如图3中所示出的，通道结构可以包括在通道交叉点311处相遇的通道区段302、304和306。在一些情况下，携带图1中生成的液滴的乳液的流出通道区段108可以在通道区段302的上游，使得生成的液滴被引导流向通道交叉点211用于随后的分选。控制器322可以被可操作地耦接至流体流动单元318，以促进通道结构中流体的流动；被可操作地耦接至传感器320，以检测一个液滴或多个液滴的至少一个特征；以及被可操作地耦接至压力施加单元316，以将压力脉冲施加至通道结构。
在操作中，多个离散液滴(每个包含第一含水流体310)可以作为乳液在第二流体308中流动，其中第二流体308与第一含水流体310不混溶。沿着通道区段302被输送到交叉点311的液滴可以包含第一子集的液滴314和第二子集的液滴312，所述第一子集的液滴314各自被至少生物颗粒和/或携带条形码的珠占据，所述第二子集的液滴312各自未被占据。每个液滴(包括被占据的液滴和未被占据的液滴)可以包含或可以不包含一定浓度的场可吸引的颗粒。尽管图3将每个液滴描绘为包含场可吸引的颗粒315，但是这不是必需的。
在交叉点311处或附近分选之后，第一子集的液滴314可以被引导以沿着通道区段306并远离交叉点311流动，并且第二子集的液滴312可以被引导以沿着通道区段304并远离交叉点311流动。
流体流动单元318可以被配置成使包含多个液滴(包括被占据的液滴和未被占据的液滴两者)的第二流体308沿着通道区段302朝向交叉点311流动。流体流动单元318可以被配置成使包含多个液滴(其中大多数液滴是未被占据的液滴)的第二流体308沿着通道区段304远离交叉点311流动。流体流动单元318可以被配置成使包含多个液滴(其中大多数液滴是被占据的液滴)的第二流体308沿着通道区段306远离交叉点311流动。可选择地，流体流动单元318可以被配置成使包含多个液滴(其中大多数液滴是未被占据的液滴)的第二流体308沿着通道区段306远离交叉点311流动，并且被配置成使包含多个液滴(其中大多数液滴是被占据的液滴)的第二流体308沿着通道区段304远离交叉点311流动。流体流动单元318可以被可操作地耦接至控制器322。例如，流体流动单元318可以从控制器322接收关于流体压力和/或速度的指令。
在一些情况下，流体流动单元318可以包含压缩机，以在上游位置处提供正压，以将流体从上游位置引导流向下游位置。在一些情况下，流体流动单元318可以包含泵，以在下游位置处提供负压，以将流体从上游位置引导流向下游位置。在一些情况下，流体流动单元318可以包含压缩机和泵两者，每个在不同的位置处。在一些情况下，流体流动单元318可以在不同位置处包含不同装置。流体流动单元318可以包含致动器。虽然图3描绘了一个流体流动单元318，但是可以理解的是，可以存在多个流体流动单元318，每个流体流动单元318与控制器322通信和/或彼此通信。例如，可以存在将通道区段302中的流体引导朝向交叉点311的单独的流体流动单元、将通道区段304中的流体引导远离交叉点311的单独的流体流动单元、以及将通道区段306中的流体引导远离交叉点311的单独的流体流动单元。
传感器320可以被配置成感测第一通道区段302中的一个液滴或多个液滴的至少一个特征。在一些情况下，传感器320可以在液滴经过传感器320时检测液滴的特征。传感器320可以位于交叉点311的上游。由传感器320检测到的液滴的一个或更多个特征可以指示液滴的类型，诸如液滴是被占据的还是未被占据的，或者液滴是否包含生物颗粒和/或携带条形码的珠。在一些情况下，传感器320可以是被配置成当液滴经过传感器320时测量本体阻抗(bulk impedance)的阻抗传感器。在一些情况下，与未被占据的液滴相比对于被占据的液滴可以测量到更高的阻抗(例如，由于被占据的液滴的质量和/或重量分布等)。在一些情况下，传感器320可以是光学传感器，该光学传感器被配置成测量液滴的光学性质，诸如以区分液滴是被占据的还是未被占据的。光学传感器和/或支撑装置可以被配置成发射被配置成探测一个或更多个液滴的检测信号，包括例如电磁信号(例如，以任何波长)和/或声信号。在一些情况下，光学传感器和/或支撑装置可以包含照射源，该照射源被配置成用一种或更多种类型的电磁辐射来照射一个或更多个液滴。在一些情况下，电磁辐射可以包括可见光谱、红外光谱、紫外光谱和电离辐射光谱中的一种或更多种的照射。在一些情况下，电离辐射可以包括x射线。可选择地，传感器320可以是一个或更多个装置，所述装置被配置成提供光学感测、热感测、激光成像、红外成像、电容感测、质量感测、跨越电磁光谱的至少一部分的振动感测和磁感应感测中的一个或更多个。传感器320可以被可操作地耦接至控制器322。例如，传感器320可以将传感器数据(例如，关于一个液滴或多个液滴的一个或更多个特征)传输至控制器322。然后，控制器322可以使用这样的数据来确定液滴是被占据的还是未被占据的。
虽然图3描绘了一个传感器320，但是可以理解的是，可以存在多个传感器，每个传感器与控制器322通信和/或彼此通信。例如，在交叉点311的上游在不同位置处可以存在多个传感器，例如，在不同的角度检测一个液滴或多个液滴的一个或更多个特征。
压力施加单元316可以被配置成对通道结构施加压力脉冲。在一些情况下，压力施加单元316可以被配置成在交叉点311处或附近施加压力脉冲，使得经由流体动力，第二子集的液滴(未被占据的液滴)通常被引导沿着通道区段304并远离交叉点311，并且第一子集的液滴(被占据的液滴)通常被引导沿着通道区段306并远离交叉点311，从而分离两个子集的液滴。
在一些情况下，压力施加单元316可以包含压缩机，以在上游位置处提供正压脉冲，以将流体从上游位置引导流向下游位置。在一些情况下，压力施加单元316可以包含泵，以在下游位置处提供负压脉冲，以将流体从上游位置引导流向下游位置。在一些情况下，压力施加单元316可以包含压缩机和泵两者，每个在不同的位置处。在一些情况下，压力施加单元316可以在不同位置处包含不同装置。压力施加单元316可以包含致动器。虽然图3描绘了一个压力施加单元316，但是可以理解的是，可以存在多个压力施加单元，每个压力施加单元与控制器322通信和/或彼此通信。在一些情况下，压力施加单元316和流体流动单元318可以是一个或更多个相同的装置(same device or same devices)。在一些情况下，压力施加单元316可以全部地或至少部分地在微流体结构(例如，微流体通道)的外部，如图3中所图示出的。在一些情况下，压力施加单元316可以全部地或至少部分地在微流体结构的内部和/或集成到微流体结构中。例如，压力脉冲可以由膜的偏转来生成。在一些情况下，压力脉冲可以由气泡的生成而生成，其中气泡的膨胀可以使流体包移位。
例如由于有差异的预先确定的颗粒和流体特征，被占据的液滴和未被占据的液滴可以对压力脉冲不同地响应。在一些情况下，被单独占据的液滴和被多重占据的液滴可以对压力脉冲不同地响应。预先确定的颗粒和流体特征可以包括液滴的尺寸、液滴的质量、乳液中液滴悬浮液的粘度、可变形性和其他特征。也就是说，给定的被单独占据的液滴、被多重占据的液滴和未被占据的液滴当经受由压力脉冲触发的流体动力时可以不同地响应。在一些情况下，控制器322可以基于由从传感器320接收的数据做出的确定(例如，确定液滴是被占据的还是未被占据的)，指示压力施加单元316例如通过改变脉冲的频率和/或改变压差来施加不同的压力脉冲。例如，压力施加单元316可以当被占据的液滴接近交叉点311时施加第一类型的压力脉冲，并且当未被占据的液滴接近交叉点311时施加第二类型的压力脉冲。可选择地，可以对于接近交叉点311的任何类型的液滴施加相同的压力脉冲，并且液滴可以取决于液滴是被占据的还是未被占据的而不同地反应(或响应)(例如，以不同的角度偏离流体流动方向)。
压力施加单元316可以被可操作地耦接至控制器322。例如，压力施加单元316可以从控制器322接收关于压力脉冲强度、频率和/或其他变量的指令。
关于图3所描述的系统和方法可以用于将被占据的颗粒与未被占据的颗粒分离。如本文其他地方所描述的，多个颗粒可以包含被生物颗粒(例如，细胞)占据的第一子集的颗粒(例如，细胞珠)和未被生物颗粒占据的第二子集的颗粒。在包括在通道交叉点311处相遇的通道区段302、304和306的通道结构中，多个颗粒可以被引导以(例如，作为流体(例如，含水流体)中的悬浮液)流向通道交叉点311，用于随后的分选。控制器322可以被可操作地耦接至流体流动单元318，以促进通道结构中流体的流动；被可操作地耦接至传感器320，以检测一个颗粒或多个颗粒的至少一个特征；以及被可操作地耦接至压力施加单元316，以将压力脉冲施加至通道结构。
在交叉点311处或附近分选之后，第一子集的颗粒(例如，细胞珠)可以被引导以沿着通道区段306并远离交叉点311流动，并且第二子集的颗粒可以被引导以沿着通道区段304并远离交叉点311流动。
流体流动单元318可以被配置成使包含多个颗粒(包括细胞珠和未被占据的颗粒两者)的第二流体308沿着通道区段302朝向交叉点311流动。流体流动单元318可以被配置成使包含多个颗粒(其中大多数颗粒是未被占据的颗粒)的第二流体308沿着通道区段304远离交叉点311流动。流体流动单元318可以被配置成使包含多个颗粒(其中大多数颗粒是被占据的颗粒)的第二流体308沿着通道区段306远离交叉点311流动。可选择地，流体流动单元318可以被配置成使包含多个颗粒(其中大多数颗粒是未被占据的颗粒)的第二流体308沿着通道区段306远离交叉点311流动，并且被配置成使包含多个颗粒(其中大多数颗粒是被占据的颗粒)的第二流体308沿着通道区段304远离交叉点311流动。流体流动单元318可以被可操作地耦接至控制器322。例如，流体流动单元318可以从控制器322接收关于流体压力和/或速度的指令。
传感器320可以被配置成感测第一通道区段302中的一个颗粒或多个颗粒的至少一个特征。在一些情况下，传感器320可以在颗粒经过传感器320时检测颗粒的特征。传感器320可以位于交叉点311的上游。由传感器320检测到的颗粒的一个或更多个特征可以指示颗粒的类型，诸如颗粒是被占据的还是未被占据的，或者颗粒是否包含生物颗粒和/或携带条形码的珠。在一些情况下，传感器320可以是被配置成当颗粒经过传感器320时测量本体阻抗的阻抗传感器。在一些情况下，与未被占据的颗粒相比对于被占据的颗粒可以测量到更高的阻抗(例如，由于被占据的颗粒的质量和/或重量分布等)。在一些情况下，传感器320可以是光学传感器，该光学传感器被配置成测量颗粒的光学性质，诸如以区分颗粒是被占据的还是未被占据的。光学传感器和/或支撑装置可以被配置成发射被配置成探测一个或更多个颗粒的检测信号，包括例如电磁信号(例如，以任何波长)和/或声信号。在一些情况下，光学传感器和/或支撑装置可以包含照射源，该照射源被配置成用一种或更多种类型的电磁辐射来照射一个或更多个颗粒。在一些情况下，电磁辐射可以包括可见光谱、红外光谱、紫外光谱和电离辐射光谱中的一种或更多种的照射。在一些情况下，电离辐射可以包括x射线。可选择地，传感器320可以是一个或更多个装置，所述装置被配置成提供光学感测、热感测、激光成像、红外成像、电容感测、质量感测、跨越电磁光谱的至少一部分的振动感测和磁感应感测中的一个或更多个。传感器320可以被可操作地耦接至控制器322。例如，传感器320可以将传感器数据(例如，关于一个颗粒或多个颗粒的一个或更多个特征)传输至控制器322。然后，控制器322可以使用这样的数据来确定颗粒是被占据的还是未被占据的。
虽然图3描绘了一个传感器320，但是可以理解的是，可以存在多个传感器，每个传感器与控制器322通信和/或彼此通信。例如，在交叉点311的上游在不同位置处可以存在多个传感器，例如，在不同的角度检测一个颗粒或多个颗粒的一个或更多个特征。
压力施加单元316可以被配置成对通道结构施加压力脉冲。在一些情况下，压力施加单元316可以被配置成在交叉点311处或附近施加压力脉冲，使得经由流体动力，第二子集的颗粒(未被占据的颗粒)通常被引导沿着通道区段304并远离交叉点311，并且第一子集的颗粒(细胞珠)通常被引导沿着通道区段306并远离交叉点311，从而分离两个子集的颗粒。
例如由于有差异的预先确定的颗粒和流体特征，被占据的颗粒和未被占据的颗粒可以对压力脉冲不同地响应。预先确定的颗粒和流体特征可以包括颗粒的尺寸、颗粒的质量、流体中颗粒悬浮液的粘度、可变形性和其他特征。也就是说，给定的被单独占据的细胞珠、被多重占据的细胞珠和未被占据的颗粒当经受由压力脉冲触发的流体动力时可以不同地响应。在一些情况下，控制器322可以基于由从传感器320接收的数据做出的确定(例如，确定颗粒是被占据的还是未被占据的)，指示压力施加单元316例如通过改变脉冲的频率和/或改变压差来施加不同的压力脉冲。例如，压力施加单元316可以当被占据的颗粒接近交叉点311时施加第一类型的压力脉冲，并且当未被占据的颗粒接近交叉点311时施加第二类型的压力脉冲。可选择地，可以对于接近交叉点311的任何类型的颗粒施加相同的压力脉冲，并且颗粒可以取决于颗粒是被占据的还是未被占据的而不同地反应(或响应)(例如，以不同的角度偏离流体流动方向)。在一些情况下，不同的压力脉冲可以如在被占据的液滴和未被占据的液滴、被占据的颗粒和未被占据的颗粒、被单独占据的液滴和被多重占据的液滴、和/或被单独占据的细胞珠和被多重占据的细胞珠之间被施加。
压力施加单元316可以被可操作地耦接至控制器322。例如，压力施加单元316可以从控制器322接收关于压力脉冲强度、频率和/或其他变量的指令。
虽然图3描绘了通道结构，其中第二通道(通道区段304)从第一通道(通道区段302)分支出来，使得第三通道(通道区段306)在与第一通道相同的方向上继续，但是可以理解的是，本文所公开的系统和方法可以应用于不同的通道结构。例如，第三通道可以与第一通道成不同的角度(例如，不是180°)。在一些实例中，通道结构可以具有从第一通道分支出来的多于两个通道，其中压力施加单元316被配置成将液滴分离成未被占据的液滴、包含仅一个生物颗粒的液滴、包含多于一个生物颗粒的液滴、包含仅携带条形码的珠的液滴、包含生物颗粒和携带条形码的珠两者的液滴或其他变型。压力施加单元316可以被配置成将颗粒分离成未被占据的颗粒、包含仅一个生物颗粒的颗粒、包含多于一个生物颗粒的颗粒、包含仅携带条形码的珠的颗粒、包含生物颗粒和携带条形码的珠两者的颗粒或其他变型。例如，在施加压力脉冲后，未被占据的液滴或颗粒可以能够偏离最多(例如，至第一通道)，包含单个生物颗粒的液滴或颗粒可以能够偏离，但是没有未被占据的液滴或颗粒那么多(例如，至第二通道)，并且包含生物颗粒和携带条形码的珠两者的液滴或颗粒可以能够在三种类型的液滴或颗粒中偏离最少(例如，至第三通道)。
虽然图3描绘了允许液滴或颗粒仅以单排流动的窄通道，但是本文所公开的系统和方法可以适用于具有较宽宽度(例如，直径)的通道，该通道允许液滴或颗粒以多于单排流动。
虽然图3描绘了可操作地耦接至所有流体流动单元318、传感器320和压力施加单元316的一个控制器322，但是单独的控制器可以被耦接至流体流动单元318，单独的控制器可以被耦接至传感器320，并且单独的控制器可以被耦接至压力施加单元316。三个单独的控制器可以彼此通信或可以不彼此通信。在一些情况下，可以存在多个控制器(例如，耦接至流体流动单元318的两个控制器)，其中每个控制器可以彼此通信或可以不彼此通信。控制器322可以经由有线连接和/或无线连接(例如，Wi-Fi、蓝牙、NFC等)向流体流动单元318、传感器320和/或压力施加单元316发送指令。控制器322可以经由有线连接和/或无线连接(例如Wi-Fi、蓝牙、NFC等)从流体流动单元318、传感器320和/或压力施加单元316接收数据。在一些情况下，部件可以在穿过或不穿过控制器322的情况下直接地或间接地彼此通信。例如，传感器320可以被直接地耦接至压力施加单元316。
本文所公开的分离系统和方法可以实现超泊松加载。例如，液滴可以被分离成两个子集，使得被分离的第一子集的液滴的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多是被占据的液滴(例如，包含至少一个生物颗粒)。这样的占据率可以大于或等于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。可选择地，第一子集的液滴的少于约97％可以是被占据的液滴。在一些情况下，被分离的第二子集的液滴的至少约97％、98％、99％或更高百分比可以是未被占据的液滴(例如，不包含任何生物颗粒并且不包含任何携带条形码的珠)。可选择地，第二子集的液滴的少于约97％可以是未被占据的液滴。例如，颗粒可以被分离成两个子集，使得被分离的第一子集的颗粒的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多是细胞珠(例如，包含至少一种生物颗粒)。这样的占据率可以大于或等于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。可选择地，第一子集的颗粒的少于约97％可以是被占据的颗粒(例如，细胞珠)。在一些情况下，被分离的第二子集的颗粒的至少约97％、98％、99％或更高百分比可以是未被占据的颗粒(例如，不包含任何生物颗粒并且不包含任何携带条形码的珠)。可选择地，第二子集的颗粒的少于约97％可以是未被占据的颗粒。
例如，如本文中的上文或下文进一步所描述的，通道网络可以被流体地耦接至适当的流体部件。例如，入口通道区段(例如，图2A中的通道区段202，图1中的通道区段102、104、106)被流体地耦接至它们待被递送至通道汇合点(例如，图2A中的交叉点211，图1中的汇合点110)的材料的适当来源。例如，通道区段202将被流体耦接至待被分析的生物颗粒(例如，图1中的生物颗粒114)和场可吸引的颗粒(例如，图1中的场可吸引的颗粒115)的含水悬浮液的来源。然后，通道区段104和106可以被流体连接至非含水(或其他不混溶)流体的一个或更多个来源。这些来源可以包括多种不同的流体部件中的任一种，从在微流体装置的主体结构中限定或与其连接的简单贮存器，到从装置外(off-device)来源递送流体的流体导管、歧管、流体流动单元(例如，致动器、泵、压缩机)等。同样地，出口通道区段206可以被流体耦接至分配的细胞的接收容器或导管，以用于随后处理。再次地，这可以是在微流体装置的主体中限定的贮存器，或者它可以是用于将分配的细胞递送至随后的处理操作、仪器或部件的流体导管。
在一些情况下，不包含任何场可吸引的颗粒的多个液滴也可以使用介电泳进行分选。例如，被占据的液滴和未被占据的液滴可以具有不同的介电特性。当电场诸如在其中第一通道分支成第二通道和第三通道的交叉点处诸如经由本文其他地方所描述的方法(例如，参考图2A)被施加至包含被占据的液滴和未被占据的液滴两者的多个液滴时，被占据的液滴可以被引导流过第一通道，并且未被占据的液滴可以被引导流过第二通道，其至少部分地由于与具有不同的介电特性的被占据的液滴和未被占据的液滴的电场的变化的相互作用(或影响)。用于介电泳的这样的系统和方法也可以用于将多个颗粒分选成第一子集的被占据的颗粒(例如，细胞珠)和第二子集的未被占据的颗粒。
生物颗粒可以经受足以聚合或凝胶化前体的条件。足以聚合或凝胶化前体的条件可以包括暴露于加热、冷却、电磁辐射或光。足以聚合或凝胶化前体的条件可以包括足以聚合或凝胶化前体的任何条件。在聚合或凝胶化之后，聚合物或凝胶可以围绕生物颗粒形成。聚合物或凝胶可以对于化学试剂或生物化学试剂是扩散地可渗透的。聚合物或凝胶可以对于生物颗粒的大分子成分是扩散地不可渗透的。以这种方式，聚合物或凝胶可以用于允许生物颗粒经受化学操作或生物化学操作，同时空间上将大分子成分限制在由聚合物或凝胶限定的液滴区域中。聚合物或凝胶可以包括二硫化物交联的聚丙烯酰胺、琼脂糖、藻酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)-二丙烯酸酯、PEG-丙烯酸酯、PEG-硫醇、PEG-叠氮化物、PEG-炔烃、其他丙烯酸酯、壳聚糖、透明质酸、胶原蛋白、纤维蛋白、明胶或弹性蛋白中的一种或更多种。聚合物或凝胶可以包含任何其他聚合物或凝胶。
聚合物或凝胶可以被官能化以与目标分析物，诸如核酸、蛋白质或其他分析物结合。聚合物或凝胶可以经由被动机制聚合或凝胶化。聚合物或凝胶在碱性条件下或在升高的温度可以是稳定的。聚合物或凝胶可以具有与珠的机械性质类似的机械性质。例如，聚合物或凝胶可以具有与珠类似的尺寸。聚合物或凝胶可以具有与珠的机械强度(例如，拉伸强度)类似的机械强度(例如，拉伸强度)。聚合物或凝胶可以具有比油低的密度。聚合物或凝胶可以具有与缓冲液的密度大致类似的密度。聚合物或凝胶可以具有可调的孔径。可以选择孔径，以例如保留变性的核酸。可以选择孔径，以保持对外源性化学物质诸如氢氧化钠(NaOH)和/或内源性化学物质诸如抑制剂的扩散渗透性。聚合物或凝胶可以是生物相容的。聚合物或凝胶可以保持或增强细胞活力。聚合物或凝胶可以是生物化学相容的。聚合物或凝胶可以以热、化学、酶促和/或光学的方式聚合和/或解聚。
聚合物可以包含与二硫键交联的聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)。聚合物的制备可以包括两个步骤反应。在第一活化步骤中，可以将聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)暴露于酰化剂以将羧酸转化为酯。例如，可以将聚(丙烯酰胺-共-丙烯酸)暴露于4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(DMTMM)。可以将聚丙烯酰胺-共-丙烯酸暴露于4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓的其他盐。在第二交联步骤中，可以将在第一步骤中形成的酯暴露于二硫化物交联剂。例如，可以将酯暴露于胱胺(2,2’-二硫代双(乙胺))。在这两个步骤之后，生物颗粒可以被通过二硫桥连接在一起的聚丙烯酰胺链包围。以这种方式，生物颗粒可以被包裹在凝胶或基体(例如，聚合物基体)内部或构成凝胶或基体(例如，聚合物基体)以形成“细胞珠”。细胞珠可以包含生物颗粒(例如，细胞)或生物颗粒的大分子成分(例如，RNA、DNA、蛋白质等)。细胞珠可以包括单个细胞或多个细胞，或者单个细胞或多个细胞的衍生物。例如，在裂解和洗涤细胞之后，来自细胞裂解物的抑制组分可以被洗掉，并且大分子成分可以被结合为细胞珠。本文所公开的系统和方法可以适用于包含生物颗粒的细胞珠(和/或液滴或其他分配区)和包含生物颗粒的大分子成分的细胞珠(和/或液滴或其他分配区)。在一些情况下，细胞珠还可以包含一个或更多个场可吸引的颗粒(例如，顺磁性颗粒、导电颗粒等)，诸如经由本文其他地方所描述的系统和方法，以用于促进随后的分选和/或溶剂交换。场可吸引的颗粒可以被捕获在凝胶基体中。在一些情况下，场可吸引的颗粒可以被均匀地捕获在整个凝胶基体中。在一些情况下，场可吸引的颗粒可以被捕获在整个凝胶基体中，诸如以使整个细胞珠均匀地经受力(例如，磁、电)场。
在另一个方面中，本文提供了用于选择性聚合分配区(或其中的细胞)的系统和方法。在一些情况下，分配区可以基于占据率选择性地聚合。在一些情况下，分配区可以基于尺寸选择性地聚合。
图4示出了用于基于占据率选择性聚合分配区的微流体通道结构的实例。如本文其他地方所描述的，在一些情况下，大多数被占据的分配区可以包括每个被占据的分配区不多于一个的生物颗粒，并且在一些情况下，一些生成的分配区可以未被(任何生物颗粒)占据。但是，在一些情况下，一些被占据的分配区可以包括多于一个生物颗粒。在一些情况下，可以控制分配过程，使得被占据的分配区的少于25％包含多于一个生物颗粒，并且在许多情况下，被占据的分配区的少于20％具有多于一个生物颗粒，而在一些情况下，被占据的分配区的少于10％或甚至少于5％包括每个分配区多于一个生物颗粒。
图4的乳化机制可以在很大程度上平行于图1的乳化机制。如图4中所示出的，通道结构可以包括通道区段401、402、404、406和408。通道区段401和402可以在通道汇合点409处连通。通道区段402、404、406和408可以在通道汇合点410处连通。在操作中，第一含水流体412可以从通道区段402和401的每一个递送至汇合点409。细胞可以作为沿着通道区段401流动的第一含水流体412中的悬浮液经由通道区段401被引入到汇合点409中。第一含水流体412可以包含或可以不包含悬浮的场可吸引的颗粒115。如本文其他地方所描述的，被占据的液滴和未被占据的液滴可以经由场可吸引的颗粒115进行分选。与第一含水流体412不混溶的第二流体416从通道区段404和406的每一个递送至汇合点410，以产生流入通道区段408并从汇合点410流走的第一含水流体412的离散液滴418、420。所生成的离散液滴可以包括或可以不包括生物颗粒414。
第二流体416可以包含油诸如氟化油和表面活性剂诸如含氟表面活性剂，用于使所得液滴稳定化(例如，抑制所得液滴的随后聚结)。特别有用的分配区流体和含氟表面活性剂的实例在例如美国专利申请公布号2010/0105112中描述，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
生成的液滴可以包含两个子集的液滴：(1)包含一个或更多个生物颗粒414的被占据的液滴418，以及(2)不包含任何生物颗粒414的未被占据的液滴420。
光聚合光源424诸如激光可以位于汇合点410的下游，以选择性地聚合被占据的液滴(例如，聚合其中的生物颗粒)。在一些情况下，光源424可以是灯或发光二极管(LED)。光源可以是紫外(UV)辐射源。光源424可以在靶向方向上生成光脉冲或电磁波束。例如，光源424可以被配置成仅当被占据的液滴经过时发射电磁波。光源424可以被可操作地耦接至控制器426。光源424可以接收来自控制器426的关于经过光源424的液滴或者预期在某个时间经过光源的液滴是否被占据的指令。虽然图4描绘了一个光源424，但是可以理解的是，可以存在多个光源，每个光源与控制器426通信和/或彼此通信。例如，多个光源可以各自位于不同的位置，包括流体通道中不同的上游/下游位置处。可选择地，可以使用不同的聚合应用单元以使液滴经受刺激，诸如以经由加热、冷却、电磁辐射和/或光来触发聚合。刺激可以是化学刺激。在一些情况下，可以在不同的位置处使用多个相同类型或不同类型的聚合应用单元。
传感器422可以被配置成感测流体流中生物颗粒(或细胞)414的存在。例如，传感器422可以被配置成感测在汇合点409的上游的通道区段401中生物颗粒(或细胞)414的存在。传感器422可以位于汇合点409的上游。在一些情况下，传感器422可以是被配置成当细胞经过传感器422时测量本体阻抗的阻抗传感器。在一些情况下，当细胞经过时与当仅第一含水流体412经过时相比可以测量到更高的阻抗。在一些情况下，传感器422可以是被配置成测量细胞的光学性质的光学传感器。光学传感器和/或支撑装置可以被配置成发射被配置成探测一个或更多个液滴的检测信号，包括例如电磁信号(例如，以任何波长)和/或声信号。在一些情况下，光学传感器和/或支撑装置可以包含照射源，该照射源被配置成用一种或更多种类型的电磁辐射来照射细胞。在一些情况下，电磁辐射可以包括可见光谱、红外光谱、紫外光谱和电离辐射光谱中的一种或更多种的照射。在一些情况下，电离辐射可以包括x射线。照射可以是透照或落射(epi-illumination)。可选择地，传感器422可以是一个或更多个装置，所述装置被配置成提供光学感测、热感测、激光成像、红外成像、电容感测、质量感测、跨越电磁光谱的至少一部分的振动感测和磁感应感测中的一个或更多个。传感器422可以收集关于细胞的一个或更多个性质(例如，光学性质、阻抗性质等)或特征的传感器数据。
传感器422可以被可操作地耦接至控制器426。例如，传感器422可以将传感器数据(例如，关于一个或更多个细胞的存在)传输至控制器426。控制器426可以从传感器数据确定细胞何时经过传感器位置。然后，控制器426可以使用这样的传感器数据、传感器的位置和/或流体通道中检测到细胞的存在的位置、传感器检测到流中细胞的存在的时间、通道区段402中第一含水流体412的流体流速、通道区段408中乳液的流体流速、光源424的位置、传感器422检测数据和/或向控制器426传输数据所需的时间、和/或控制器426向光源424发送指令所需的时间，以向光源424发送关于是否发射电磁波以聚合液滴的指令。例如，假设通道区段402和/或408中的流体流速是基本上恒定的，控制器426可以确定在特定时间(例如，在汇合点410处)产生的液滴包含细胞还是不包含细胞。基于通道区段402和/或408中的流体流速，控制器426可以确定在特定时间(例如，液滴每次从汇合点410行进至光源424位点的位置所需的时间是相同的)经过光源424的液滴是被占据的还是未被占据的。
虽然图4描绘了一个传感器422，但是可以理解的是，可以存在多个传感器，每个传感器与控制器426通信和/或彼此通信。例如，在不同的位置处在汇合点409的上游和/或汇合点410的上游可以存在多个传感器，例如检测细胞的存在。
虽然图4描绘了可操作地耦接至传感器422和光源424两者的一个控制器426，但是单独的控制器可以被耦接至传感器422，并且单独的控制器可以被耦接至光源424。单独的控制器可以彼此通信或可以不彼此通信。在一些情况下，可以存在多个控制器(例如，耦接至传感器422的两个控制器)，其中每个控制器可以彼此通信或可以不彼此通信。控制器426可以经由有线连接和/或无线连接(例如，Wi-Fi、蓝牙、NFC等)向传感器422和/或光源424发送指令。控制器426可以经由有线连接和/或无线连接(例如，Wi-Fi、蓝牙、NFC等)从传感器422和/或光源424接收数据。在一些情况下，部件可以在穿过或不穿过控制器426的情况下直接地或间接地彼此通信。例如，传感器422可以被直接地耦接至光源424。
图5示出了用于基于占据率选择性聚合分配区(例如，其中的生物颗粒)的微流体通道结构的另一个实例。
图5的乳化机构可以在很大程度上平行于图1和图4的乳化机构。如图5中所示出的，通道结构可以包括通道区段501、502、504、506和508。通道区段501和502可以在通道汇合点509处连通。通道区段502、504、506和508可以在通道汇合点510处连通。在操作中，第一含水流体512可以从通道区段502和501的每一个递送至汇合点509。细胞可以作为沿着通道区段501流动的第一含水流体512中的悬浮液经由通道区段501被引入到汇合点509中。第一含水流体512可以包含或可以不包含悬浮的场可吸引的颗粒515。如本文其他地方所描述的，被占据的液滴和未被占据的液滴可以随后经由场可吸引的颗粒515进行分选。与第一含水流体512不混溶的第二流体516从通道区段504和506的每一个递送至汇合点510，以产生流入通道区段508并从汇合点510流走的第一含水流体512的离散液滴518、520。所生成的离散液滴可以包括或可以不包括生物颗粒514。引入到液滴中的每个细胞可以包括荧光标记物(诸如根据广泛使用的荧光活化细胞分选(FACS)机制)或允许通过光学传感器检测的其他光学标记物。
第二流体516可以包含油，诸如氟化油，其包括用于使所得液滴稳定化(例如，抑制所得液滴的随后聚结)的含氟表面活性剂。特别有用的分配区流体和含氟表面活性剂的实例在例如美国专利申请公布号2010/0105112中描述，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
生成的液滴可以包含两个子集的液滴：(1)包含一个或更多个生物颗粒514的被占据的液滴518，以及(2)不包含任何生物颗粒514的未被占据的液滴520。
光聚合光源524诸如激光可以位于汇合点510的下游，以选择性地聚合被占据的液滴。在一些情况下，光源524可以是灯或发光二极管(LED)。光源524可以在靶向方向上生成光脉冲或电磁波束。例如，光源524可以被配置成仅当被占据的液滴经过时发射电磁波。光源524可以被可操作地耦接至控制器526。光源524可以接收来自控制器526的关于经过光源524的液滴或者预期在特定时间经过光源的液滴是否被占据的指令。虽然图5描绘了一个光源524，但是可以理解的是，可以存在多个光源，每个光源与控制器526通信和/或彼此通信。例如，多个光源可以各自位于不同的位置，包括流体通道中不同的上游/下游位置处。可选择地，可以使用不同的聚合应用单元以使液滴经受刺激，诸如以经由加热、冷却、电磁辐射和/或光来触发其中的一个或更多个生物颗粒的聚合。刺激可以是化学刺激。在一些情况下，可以在不同的位置处使用多个相同类型或不同类型的聚合应用单元。
传感器522可以被配置成感测指示液滴是被占据的还是未被占据的液滴的一个或更多个特征。传感器522可以位于汇合点510的下游。在一些情况下，传感器522可以是被配置成当液滴经过传感器522时测量本体阻抗的阻抗传感器。在一些情况下，当被占据的液滴518经过时与当未被占据的液滴520经过时相比可以测量到更高的阻抗。在一些情况下，传感器522可以是被配置成测量液滴的光学性质的光学传感器。光学传感器和/或支撑装置可以被配置成发射被配置成探测一个或更多个液滴的检测信号，包括例如电磁信号(例如，以任何波长)和/或声信号。在一些情况下，光学传感器和/或支撑装置可以包含照射源，该照射源被配置成用一种或更多种类型的电磁辐射来照射一个或更多个液滴。在一些情况下，电磁辐射可以包括可见光谱、红外光谱、紫外光谱和电离辐射光谱中的一种或更多种的照射。在一些情况下，电离辐射可以包括x射线。照射可以是透照或落射。可选择地，传感器522可以是一个或更多个装置，所述装置被配置成提供光学感测、热感测、激光成像、红外成像、电容感测、质量感测、跨越电磁光谱的至少一部分的振动感测和磁感应感测中的一个或更多个。传感器522可以收集关于液滴的一个或更多个性质(例如，光学性质、阻抗性质等)或特征的传感器数据。例如，由传感器522所确定的一个或更多个性质或特征可以指示特定类型的液滴，诸如被占据的液滴、未被占据的液滴、被单独占据的液滴、被多重占据的液滴、特定尺寸或尺寸范围的液滴等。
传感器522可以被可操作地耦接至控制器526。例如，传感器522可以将传感器数据(例如，指示液滴的占据率的一个或更多个特征)传输至控制器526。然后，控制器526可以使用这样的数据、传感器的位置和/或流体通道中检测到被占据的液滴518的位置、传感器522检测到被占据的液滴518的时间、通道区段508中的流体流速、光源524的位置、传感器522检测数据和/或向控制器526传输数据所需的时间、和/或控制器526向光源524发送指令所需的时间，以向光源524发送关于是否发射电磁波以聚合液滴的指令。例如，使用这样的数据，控制器526可以确定在特定时间经过传感器522位置的液滴是被占据的还是未被占据的。基于通道区段508中的流体流速，控制器526可以确定在特定时间(例如，假设液滴每次从传感器522位置行进到光源524的位置所需的时间是相同的)经过光源524的液滴是被占据的还是未被占据的。
虽然图5描绘了一个传感器522，但是可以理解的是，可以存在多个传感器，每个传感器与控制器526通信和/或彼此通信。例如，在不同的位置处在汇合点510的上游或下游可以存在多个传感器，例如，检测液滴的占据率。
虽然图5描绘了可操作地耦接至传感器522和光源524两者的一个控制器526，但是单独的控制器可以被耦接至传感器522，并且单独的控制器可以被耦接至光源524。单独的控制器可以彼此通信或可以不彼此通信。在一些情况下，可以存在多个控制器(例如，耦接至传感器522的两个控制器)，其中每个控制器可以彼此通信或可以不彼此通信。控制器526可以经由有线连接和/或无线连接(例如，Wi-Fi、蓝牙、NFC等)向传感器522和/或光源524发送指令。控制器526可以经由有线连接和/或无线连接(例如，Wi-Fi、蓝牙、NFC等)从传感器522和/或光源524接收数据。在一些情况下，部件可以在穿过控制器526或不穿过控制器526的情况下直接地或间接地彼此通信。例如，传感器522可以被直接地耦接至光源524。
图6示出了用于基于液滴尺寸选择性聚合分配区的微流体通道结构的实例。
图6的乳化机构可以在很大程度上平行于图1、图4和图5的乳化机构。如图6中所示出的，通道结构可以包括通道区段601、602、604、606和608。通道区段601和602可以在通道汇合点609处连通。通道区段602、604、606和608可以在通道汇合点610处连通。在操作中，第一含水流体612可以从通道区段602和601的每一个递送至汇合点609。细胞可以作为沿着通道区段601流动的第一含水流体612中的悬浮液经由通道区段601被引入到汇合点609中。第一含水流体612可以包含或可以不包含悬浮的场可吸引的颗粒615。如本文其他地方所描述的，被占据的液滴和未被占据的液滴可以随后经由场可吸引的颗粒615进行分选。与第一含水流体612不混溶的第二流体616从通道区段604和606的每一个递送至汇合点610，以产生流入通道区段608并从汇合点610流走的第一含水流体612的离散液滴618、620。所生成的离散液滴可以包括或可以不包括生物颗粒614。引入到液滴中的每个细胞可以包括荧光标记物(诸如根据广泛使用的荧光活化细胞分选(FACS)机制)。
在一些情况下，由上文乳液生成的每个液滴可以具有基本上均匀的尺寸，所述尺寸对于进料至随后的单细胞应用是适合的(和/或可接受的)。在一些情况下，一些液滴可以具有基本上一致的尺寸，而一些液滴可以具有不同的尺寸。例如，所生成的液滴可以具有尺寸分布，其中所生成的液滴的至少约10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高百分比可以具有基本上一致的尺寸。可选择地，所生成的液滴的少于10％可以具有尺寸分布，其中所生成的液滴的少于10％具有基本上一致的尺寸。本文所描述的系统和方法可以选择性地仅聚合具有适当的(和/或可接受的)尺寸的液滴(例如，聚合液滴中包含的生物颗粒)和/或被占据的液滴。
第二流体616可以包含油，诸如氟化油，其包括用于使所得液滴稳定化(例如，抑制所得液滴的随后聚结)的含氟表面活性剂。特别有用的分配区流体和含氟表面活性剂的实例在例如美国专利申请公布号2010/0105112中描述，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
生成的液滴可以包含两个子集的液滴：(1)包含一个或更多个生物颗粒614的被占据的液滴618A、618B，以及(2)不包含任何生物颗粒614的未被占据的液滴620。如上文所描述的，在被占据的液滴618A、618B的子集内，一些液滴可以具有适当的尺寸(例如，液滴618A)，而一些液滴可以具有不适当的尺寸(例如，液滴618B)。
光聚合光源624诸如激光可以位于汇合点610的下游，以选择性地聚合被占据的液滴。在一些情况下，光源624可以是灯或发光二极管(LED)。光源624可以在靶向方向上生成光脉冲或电磁波束。例如，光源624可以被配置成仅当被占据的液滴经过时发射电磁波。光源624可以被可操作地耦接至控制器626。光源624可以接收来自控制器626的关于经过光源624的液滴或者预期在特定时间经过光源的液滴是否被占据的指令。虽然图6描绘了一个光源624，但是可以理解的是，可以存在多个光源，每个光源与控制器626通信和/或彼此通信。例如，多个光源可以各自位于不同的位置，包括流体通道中不同的上游/下游位置处。可选择地，可以使用不同的聚合应用单元以使液滴经受刺激，诸如以经由加热、冷却、电磁辐射和/或光来触发聚合。刺激可以是化学刺激。在一些情况下，可以在不同的位置处使用多个相同类型或不同类型的聚合应用单元。
传感器622可以被配置成感测指示液滴是被占据的还是未被占据的液滴的一个或更多个特征。传感器622可以位于汇合点610的下游。在一些情况下，传感器622可以是被配置成当液滴经过传感器622时测量本体阻抗的阻抗传感器。在一些情况下，当较大的液滴(例如，液滴618B)经过时与当较小的液滴(例如，液滴618A或液滴620)经过时相比可以测量到更高的阻抗。在一些情况下，当被占据的液滴(例如，液滴618A、618B)经过时与当未被占据的液滴(例如，液滴620)经过时相比可以测量到更高的阻抗。在一些情况下，传感器622可以是被配置成测量液滴的光学性质的光学传感器。光学传感器和/或支撑装置可以被配置成发射被配置成探测一个或更多个液滴的检测信号，包括例如电磁信号(例如，以任何波长)和/或声信号。在一些情况下，光学传感器和/或支撑装置可以包含照射源，该照射源被配置成用一种或更多种类型的电磁辐射来照射一个或更多个液滴。在一些情况下，电磁辐射可以包括可见光谱、红外光谱、紫外光谱和电离辐射光谱中的一种或更多种的照射。在一些情况下，电离辐射可以包括x射线。照射可以是透照或落射。可选择地，传感器622可以是一个或更多个装置，所述装置被配置成提供光学感测、热感测、激光成像、红外成像、电容感测、质量感测、跨越电磁光谱的至少一部分的振动感测和磁感应感测中的一个或更多个。传感器622可以收集关于液滴的一个或更多个性质(例如，光学性质、阻抗性质等)或特征的传感器数据。例如，由传感器622所测量的液滴的一个或更多个性质和/或其他特征可以指示液滴的尺寸和/或占据率。
传感器622可以被可操作地耦接至控制器626。例如，传感器622可以将传感器数据(例如，液滴的尺寸和/或占据率)传输至控制器626。然后，控制器626可以使用这样的数据、传感器的位置和/或流体通道中检测到液滴的占据率和/或尺寸的位置、传感器622检测到的时间、通道区段608中的流体流速、光源624的位置、传感器622检测数据和/或向控制器626传输数据所需的时间、和/或控制器626向光源624发送指令所需的时间，以向光源624发送关于是否发射电磁波以聚合液滴的指令。例如，假设通道区段608中的流体流速是基本上恒定的，控制器626可以确定在特定时间经过传感器622位置的液滴是被占据的还是未被占据的。基于通道区段608中的流体流速，控制器626可以确定在特定时间(例如，假设液滴每次从传感器622位置行进到光源624的位置所需的时间是相同的)经过光源624的液滴是被占据的还是未被占据的。
虽然图6描绘了一个传感器622，但是可以理解的是，可以存在多个传感器，每个传感器与控制器626通信和/或彼此通信。例如，在不同的位置处在汇合点610的上游或下游可以存在多个传感器，例如，检测液滴的占据率。在一些情况下，单独的传感器可以检测液滴的占据率，并且单独的传感器可以检测液滴的尺寸。单独的传感器在流体通道的相同的上游/下游位置处可以检测此类特征或可以不检测此类特征。
虽然图6描绘了可操作地耦接至传感器622和光源624两者的一个控制器626，但是单独的控制器可以被耦接至传感器622，并且单独的控制器可以被耦接至光源624。单独的控制器可以彼此通信或可以不彼此通信。在一些情况下，可以存在多个控制器(例如，耦接至传感器622的两个控制器)，其中每个控制器可以彼此通信或可以不彼此通信。控制器626可以经由有线连接和/或无线连接(例如，Wi-Fi、蓝牙、NFC等)向传感器622和/或光源624发送指令。控制器626可以经由有线连接和/或无线连接(例如，Wi-Fi、蓝牙、NFC等)从传感器622和/或光源624接收数据。在一些情况下，部件可以在穿过控制器626或不穿过控制器626的情况下直接地或间接地彼此通信。例如，传感器622可以被直接地耦接至光源624。
在一些情况下，多个液滴(其中第一子集包含聚合的液滴，并且第二子集包含聚合前的(pre-polymerized)液滴)可以基于聚合状态诸如经由溶剂交换进行进一步分选。例如，聚合前的液滴可以在溶剂交换期间被洗掉，以分离聚合的液滴。
上文和下文进一步所描述的用于分选和/或选择性聚合的分离系统和方法可以实现超泊松加载。例如，液滴可以被分离成两个子集，使得被分离的第一子集的液滴的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多是被占据的液滴(例如，包含至少一个生物颗粒)。这样的占据率可以大于或等于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。可选择地，第一子集的液滴的少于约97％可以是被占据的液滴。在一些情况下，被分离的第二子集的液滴的至少约97％、98％、99％或更高百分比是未被占据的液滴(例如，不包含任何生物颗粒并且不包含任何携带条形码的珠)。可选择地，第二子集的液滴的少于约97％可以是未被占据的液滴。上文和下文所描述的分离系统和方法可以实现超泊松单分散性。例如，液滴可以被分离成两个子集，使得被分离的第一子集的液滴的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多在给定的液滴尺寸范围内。这样的单分散性可以大于或等于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。可选择地，第一子集的液滴的少于约97％可以在给定的液滴尺寸范围内。
如本文其他地方所描述的，细胞珠可以在聚合过程之后形成，诸如经由本文所描述的选择性聚合系统和方法。可选择地，可以使用不同的聚合程序。例如，细胞珠可以通过选择性地聚合液滴内的一个或更多个生物颗粒来形成，诸如经由关于图4-6所描述的方法。在另一个实例中，细胞珠可以通过聚合悬浮在第一溶剂诸如油中的一个或更多个生物颗粒来形成。在一些情况下，多个生物颗粒(例如，细胞)可以通过对携带多个生物颗粒的第一溶剂(例如，作为悬浮液)施加刺激(例如光、化学、温度等)来批量(in bulk)硬化和/或聚合。在形成后，多个细胞珠可以被第一溶剂诸如油包围。为了促进细胞珠与凝胶珠整合成液滴，细胞珠可以通过溶剂交换过程置于含水环境中。溶剂交换过程可以包括以下的操作：收集被油包围的多个细胞珠(例如，在Eppendorf管或其他收集容器中)，除去过量的油(例如，通过移液)，添加连接缓冲液(诸如3x连接缓冲液)，涡旋，添加缓冲液(诸如1x 1H,1H,2H,2H-全氟-1-辛醇(PFO)缓冲液)，涡旋，离心和分离。分离操作可以包括磁分离。
每个细胞珠可以包含场可吸引的颗粒(例如，顺磁性颗粒)。例如，包含场可吸引的颗粒的细胞珠可以使用本文其他地方所描述的系统和方法来形成(例如，将图1中的场可吸引的颗粒115悬浮在形成乳液液滴的流体中，所述乳液液滴可以被聚合以形成细胞珠)。磁分离可以通过使用磁分离设备将包含顺磁性颗粒的细胞珠从不想要的剩余油和溶剂中拉开来实现。在一些情况下，磁分离设备可以是如本文其他地方所描述的场施加单元(例如，图2A中的相同类型的场施加单元216，图3中的压力施加单元316)。例如，磁分离设备可以用于将包含顺磁性颗粒的细胞珠从连接缓冲液和PFO中拉开，以允许除去连接缓冲液和PFO(例如通过移液)。然后，可以将包含顺磁性颗粒的细胞珠悬浮在连接缓冲液中并且进行涡旋。包含顺磁性颗粒的细胞珠可以再次被磁性分离，并且可以除去连接缓冲液。可以重复该重新悬浮、涡旋和磁分离的循环，直到细胞珠是干净的。例如，循环可以重复1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或多于10次。然后，可以将细胞珠置于含水介质中。
一旦细胞珠在含水介质中，细胞珠可以被进一步处理。例如，含水溶液中的细胞珠可以被过滤(例如，使用70μm过滤器)以从该溶液中除去团块和/或大细胞珠。在一些情况下，可以将另外的试剂添加至含水介质中和/或从含水介质中除去，以进一步处理细胞珠。然后，细胞珠可以与凝胶珠组合成液滴，如本文所描述的。
本文还提供了如上文所描述的用于分配细胞的微流体装置。此类微流体装置可以包含用于进行如图1、图4、图5和图6所阐述的那些的分配过程的通道网络。这些微流体装置可以包含通道网络，诸如本文所描述的那些通道网络，用于将细胞分配到单独的分配区中并且将此类细胞与寡核苷酸条形码文库成员(例如，设置在珠上)共分配。这些通道网络可以被设置在其中限定了通道的固体主体(例如，玻璃、半导体或聚合物主体结构)内，其中那些通道在其末端处与用于接收多种输入流体和用于最终沉积来自通道网络的输出的分配细胞等的贮存器连通。通过实例的方式，并且参考图1，流体地耦接至通道区段102的贮存器可以提供有细胞的含水悬浮液，而耦接至另一个通道(未示出)的贮存器可以提供有携带寡核苷酸的珠的含水悬浮液。通道区段106和108可以提供有非含水溶液，例如油，含水流体在通道汇合点110处作为液滴被分配到非含水溶液中。最后，出口贮存器可以被流体地耦接至通道区段108，分配的细胞和珠可以被递送至通道区段108中，并且它们可以从通道区段108中收获。如将理解的是，虽然被描述为贮存器，但是将理解的是，通道区段可以被耦接至多种不同的流体源或接收部件中的任一个，包括其他系统的管道、歧管或流体部件。
还提供了例如通过施加的压力差、离心力、电动泵送、压缩机、毛细管或重力流等来控制这些流体通过通道网络的流动的系统。
本文所描述的系统和方法可以允许产生包含单个生物颗粒和/或单个珠的一个或更多个液滴。所述系统和方法还可以允许产生包含单个生物颗粒和多于一个珠的一个或更多个液滴、包含多于一个生物颗粒和单个珠的一个或更多个液滴、或者包含多于一个生物颗粒和多于一个珠的一个或更多个液滴。本文所描述的系统和方法可以允许产生包含单个生物颗粒和/或单个珠的一个或更多个细胞珠。所述系统和方法还可以允许被占据的液滴和/或适当尺寸的液滴的选择性聚合，该聚合的液滴和聚合前的液滴的混合物可以经受随后的分选或可以不经受随后的分选。
图7示出了用于对被占据的液滴和未被占据的液滴进行分选的方法的流程图，其中被占据的液滴至少包含生物颗粒(细胞)和/或携带条形码的珠(颗粒)。
在操作701中，在使第一相与第二相接触后生成多个液滴，其中所述第一相和所述第二相是不混溶的。多个液滴的每一个包含一定数目和/或浓度的场可吸引的颗粒。第一子集的多个液滴在其中包含细胞和/或携带条形码的颗粒，并且第二子集的多个液滴在其中不包含细胞和/或携带条形码的颗粒。第一子集的多个液滴中给定的液滴可以包含单个细胞或多个细胞。第一子集的多个液滴中给定的液滴可以包含单个携带条形码的颗粒或多个携带条形码的颗粒。由于被包含在被占据的液滴中的细胞和/或携带条形码的颗粒所占据的体积，第一子集的多个液滴中给定的液滴与第二子集的多个液滴中给定的液滴相比可以包含更少数目和/或更低浓度的场可吸引的颗粒。
在操作702中，多个液滴沿着第一通道被引导至第一通道的交叉点。交叉点可以在第一通道、第二通道和第三通道之间。多个液滴可以诸如经由流体流动单元沿着流体流(例如，用于生成液滴的第一相或第二相)中的一个或更多个通道被引导。
在操作703中，多个液滴在交叉点处或附近诸如经由场施加单元经受力场。力场可以是磁场和/或电场。多个液滴可以在足以将第一子集的液滴与第二子集的液滴分离的条件下经受力场，其中在分离后，第一子集的液滴沿着第二通道流动，并且第二子集的液滴沿着第三通道流动。例如，当施加磁场时，场可吸引的颗粒可以是顺磁性颗粒。当施加电场时，场可吸引颗粒可以是导电颗粒。因为第二子集的多个液滴中给定的液滴与第一子集的多个液滴中给定的液滴相比具有更大数目和/或浓度的场可吸引的颗粒，所以对于所施加的相同场，与作用于第一子集的液滴中给定的液滴上相比，更强的力可以作用于第二子集的液滴中给定的液滴上。力差可以诸如通过影响对于第二子集的液滴中的给定液滴与对于第一子集的液滴中的给定液滴相比在流体流动路径方向上的更大偏差来分离两个子集。
图7的方法可以分离具有超泊松加载的被占据的液滴(例如，第一子集的液滴)。例如，多个液滴可以被分离成两个子集，使得被分离的第一子集的液滴的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多是被占据的液滴(例如，包含至少一个生物颗粒)。这样的占据率可以大于或等于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。可选择地，多个液滴的分离的子集中少于约97％的液滴可以是被占据的液滴。
图7的方法可以类似地用于从包含被占据的颗粒和未被占据的颗粒的多个颗粒中分离占据的颗粒。例如，可以生成多个颗粒，以包含第一子集的被占据的颗粒(其中包含生物颗粒和/或携带条形码的颗粒)和第二子集的未被占据的颗粒，其中第一子集和第二子集两者的颗粒包含场可吸引的颗粒。由于被包含在被占据的颗粒中的细胞和/或携带条形码的颗粒所占据的体积，第一子集中给定的颗粒与第二子集中给定的颗粒相比可以包含更少数目和/或更低浓度的场可吸引的颗粒。多个颗粒可以沿着第一通道被引导至第一通道的交叉点。交叉点可以在第一通道、第二通道和第三通道之间。
多个颗粒可以在交叉点处或附近诸如经由场施加单元经受力场。力场可以是磁场和/或电场。多个颗粒可以在足以将第一子集与第二子集分离的条件下经受力场，其中在分离后，第一子集的颗粒沿着第二通道流动，并且第二子集的颗粒沿着第三通道流动。例如，当施加磁场时，场可吸引的颗粒可以是顺磁性颗粒。当施加电场时，场可吸引颗粒可以是导电颗粒。因为第二子集中给定的颗粒与第一子集中给定的颗粒相比具有更大数目和/或浓度的场可吸引的颗粒，所以对于所施加的相同场，与作用于第一子集中给定的颗粒上相比，更强的力可以作用于第二子集中给定的颗粒上。力差可以诸如通过影响对于第二子集中的给定颗粒与对于第一子集中的给定颗粒相比在流体流动路径方向上的更大偏差来分离两个子集。
图7的方法可以分离具有超泊松加载的被占据的颗粒(例如，第一子集的颗粒)。例如，多个颗粒可以被分离成两个子集，使得被分离的第一子集的颗粒的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多是被占据的颗粒(例如，包含至少一个生物颗粒)。这样的占据率可以大于或等于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。可选择地，多个颗粒的分离的子集中少于约97％的颗粒可以是被占据的颗粒。
图8示出了用于对被占据的液滴和未被占据的液滴进行分选的方法的流程图，其中被占据的液滴至少包含生物颗粒(细胞)和/或携带条形码的珠(颗粒)。
在操作801中，在使第一相与第二相接触后生成多个液滴，其中所述第一相和所述第二相是不混溶的。多个液滴的每一个液滴可以包含或可以不包含一定数目和/或浓度的场可吸引的颗粒。场可吸引的颗粒的存在不是必需的。第一子集的多个液滴在其中包含细胞和/或携带条形码的颗粒，并且第二子集的多个液滴在其中不包含细胞和/或携带条形码的颗粒。第一子集的多个液滴中给定的液滴可以包含单个细胞或多个细胞。第一子集的多个液滴中给定的液滴可以包含单个携带条形码的颗粒或多个携带条形码的颗粒。
在操作802中，多个液滴沿着第一通道被引导至第一通道的交叉点。交叉点可以在第一通道、第二通道和第三通道之间。多个液滴可以诸如经由流体流动单元沿着流体流(例如，用于生成液滴的第一相或第二相)中的一个或更多个通道被引导。
在操作803中，多个液滴在交叉点处或附近诸如经由压力施加单元经受压力脉冲。压力脉冲可以作为正压脉冲或负压脉冲提供。多个液滴可以在足以将第一子集的液滴与第二子集的液滴分离的条件下经受压力脉冲，其中在分离后，第一子集的液滴沿着第二通道流动，并且第二子集的液滴沿着第三通道流动。因为第二子集的多个液滴中给定的液滴与第一子集的多个液滴中给定的液滴相比在流体中具有不同的颗粒和/或悬浮特性，所以对于所施加的相同压力脉冲，与作用于第一子集的液滴中给定的液滴上相比，不同的流体动力可以作用于第二子集的液滴中给定的液滴上。压力脉冲可以诸如通过影响对于第二子集的液滴中的给定液滴与对于第一子集的液滴中的给定液滴相比在流体流动路径方向上的更大偏差来分离两个子集。
在一些情况下，传感器诸如阻抗传感器或光学传感器可以在交叉点的上游位置处测量液滴的一个或更多个特性。感测数据可以指示液滴的占据率。可以将感测数据传输至控制器。控制器可以使用感测数据来确定液滴的占据率，并且指示压力施加单元生成或不生成压力脉冲，以将第一子集与第二子集分离。
图8的方法可以分离具有超泊松加载的被占据的液滴(例如，第一子集的液滴)。例如，多个液滴可以被分离成两个子集，使得被分离的第一子集的液滴的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多是被占据的液滴(例如，包含至少一个生物颗粒)。这样的占据率可以大于或等于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。可选择地，多个液滴的分离的子集中少于约97％的液滴可以是被占据的液滴。
图8的方法可以类似地用于从包含细胞珠和未被占据的颗粒两者的多个颗粒中分离细胞珠。例如，可以生成多个颗粒，以包含第一子集的被占据的颗粒(其中包含生物颗粒和/或携带条形码的颗粒)和第二子集的未被占据的颗粒。场可吸引的颗粒的存在不是必需的。多个颗粒可以沿着第一通道被引导至第一通道的交叉点。交叉点可以在第一通道、第二通道和第三通道之间。多个颗粒可以在交叉点处或附近诸如经由压力施加单元经受压力脉冲。压力脉冲可以作为正压脉冲或负压脉冲提供。
多个颗粒可以在足以将第一子集的颗粒(例如，细胞珠)与第二子集的颗粒(例如，未被占据的颗粒)分离的条件下经受压力脉冲，其中在分离后，第一子集的颗粒沿着第二通道流动，并且第二子集的颗粒沿着第三通道流动。因为多个第二子集的颗粒中给定的颗粒与多个第一子集的颗粒中给定的颗粒相比在流体中具有不同的颗粒和/或悬浮特性，所以对于所施加的相同压力脉冲，与作用于第一子集的颗粒中给定的颗粒上相比，不同的流体动力可以作用于第二子集的颗粒中给定的颗粒上。压力脉冲可以诸如通过影响对于第二子集的颗粒中的给定颗粒与对于第一子集的颗粒中的给定颗粒相比在流体流动路径方向上的更大偏差来分离两个子集。
在一些情况下，传感器诸如阻抗传感器或光学传感器可以在交叉点的上游位置处测量颗粒的一个或更多个特性。感测数据可以指示颗粒的占据率。可以将感测数据传输至控制器。控制器可以使用感测数据来确定颗粒的占据率，并且指示压力施加单元生成或不生成压力脉冲，以将第一子集与第二子集分离。
图8的方法可以分离具有超泊松加载的细胞珠(例如，第一子集的颗粒)。例如，多个颗粒可以被分离成两个子集，使得被分离的第一子集的颗粒的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多是细胞珠(例如，包含至少一个生物颗粒)。这样的占据率可以大于或等于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。可选择地，多个颗粒的分离的子集中少于约97％的颗粒可以是细胞珠。
图9示出了用于选择性地聚合被占据的液滴的方法的流程图，其中被占据的液滴至少包含生物颗粒(细胞)和/或携带条形码的珠(颗粒)。
在操作901中，在使第一相与第二相接触后生成多个液滴，其中所述第一相和所述第二相是不混溶的。多个液滴的每一个液滴可以包含或可以不包含一定数目和/或浓度的场可吸引的颗粒。场可吸引的颗粒的存在不是必需的。第一子集的多个液滴在其中包含细胞和/或携带条形码的颗粒，并且第二子集的多个液滴在其中不包含细胞和/或携带条形码的颗粒。第一子集的多个液滴中给定的液滴可以包含单个细胞或多个细胞。第一子集的多个液滴中给定的液滴可以包含单个携带条形码的颗粒或多个携带条形码的颗粒。
在操作902中，在上游位置处，传感器检测和/或测量穿过上游位置的液滴的一个或更多个特性。一个或更多个特性可以指示液滴的占据率。在一些情况下，传感器可以是被配置成当液滴或多个液滴穿过上游位置时检测本体阻抗的阻抗传感器。与未被占据的液滴相比对于被占据的液滴可以测量到更高的阻抗。在一些情况下，传感器可以是光学传感器，该光学传感器被配置成当液滴穿过上游位置时检测液滴的一个或更多个光学特性。可选择地，可以使用多个相同类型或不同类型的传感器来检测和/或测量穿过上游位置的液滴的一个或更多个特性。
在操作903中，可以将感测数据传输至控制器。例如，传感器可以被可操作地耦接至控制器。控制器可以至少部分地基于传感器数据来确定穿过下游位置的液滴是被占据的还是未被占据的。例如，控制器可以使用这样的传感器数据、传感器的位置和/或流体通道中检测到液滴的占据率的位置、传感器检测到液滴的占据率的时间、一个或更多个通道的流体流速、光源的位置、传感器检测数据和/或向控制器传输数据所需的时间、和/或控制器向光源发送指令所需的时间，以向光源发送关于是否发射电磁波以聚合液滴的指令。
可选择地，在一些情况下，传感器可以在生成液滴之前(例如，在交叉点处)检测悬浮在流体流中的细胞的存在，并且使用细胞存在的这样的传感器数据和其他信息(例如，位置、时间、流体流速)来确定下游位置处的液滴是否被占据。
在操作904中，控制器可以向下游位置处的光源传输指令，以在液滴是被占据的情况下发射电磁波以聚合液滴，而在液滴是未被占据的情况下不发射电磁波，从而让未被占据的液滴未聚合穿过。可选择地，其他聚合应用单元可以代替光源使用或连同光源一起使用。
图9的方法可以聚合具有超泊松分布的被占据的液滴(例如，第一子集的液滴)。本文所公开的分离系统和方法可以实现超泊松加载。例如，被聚合的多个液滴中的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多可以是被占据的液滴。这样的占据率可以大于或等于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。可选择地，聚合的液滴的少于约97％可以是被占据的液滴。
图10示出了选择性地聚合适当尺寸的液滴的方法的流程图。
在操作1001中，在使第一相与第二相接触后生成多个液滴，其中所述第一相和所述第二相是不混溶的。多个液滴中的每一个液滴可以包含或可以不包含一定数目和/或浓度的场可吸引的颗粒。场可吸引的颗粒的存在不是必需的。第一子集的多个液滴在其中包含细胞和/或携带条形码的颗粒，并且第二子集的多个液滴在其中不包含细胞和/或携带条形码的颗粒。第一子集的多个液滴中给定的液滴可以包含单个细胞或多个细胞。第一子集的多个液滴中给定的液滴可以包含单个携带条形码的颗粒或多个携带条形码的颗粒。
在操作1002中，在上游位置处，传感器检测和/或测量穿过上游位置的液滴的一个或更多个特性。一个或更多个特性可以指示液滴的尺寸。在一些情况下，传感器可以是被配置成当液滴或多个液滴穿过上游位置时检测本体阻抗的阻抗传感器。与较小的液滴相比对于较大的液滴可以测量到更高的阻抗。在一些情况下，传感器可以是光学传感器，该光学传感器被配置成当液滴穿过上游位置时检测液滴的一个或更多个光学特性。可选择地，可以使用多个相同类型或不同类型的传感器来检测和/或测量穿过上游位置的液滴的一个或更多个特性。
在操作1003中，可以将感测数据传输至控制器。例如，传感器可以被可操作地耦接至控制器。控制器可以至少部分地基于传感器数据来确定穿过下游位置的液滴是适当尺寸的还是不适当尺寸的。例如，控制器可以使用这样的传感器数据、传感器的位置和/或流体通道中检测到液滴的尺寸的位置、传感器检测到液滴的尺寸的时间、一个或更多个通道的流体流速、光源的位置、传感器检测数据和/或向控制器传输数据所需的时间、和/或控制器向光源发送指令所需的时间，以向光源发送关于是否发射电磁波以聚合液滴的指令。
在操作1004中，控制器可以向下游位置处的光源传输指令，以在液滴是适当尺寸的情况下发射电磁波以聚合液滴，而在液滴是不适当尺寸的情况下不发射电磁波，从而让不适当尺寸的液滴未聚合穿过。可选择地，其他聚合应用单元可以代替光源使用或连同光源一起使用。
图10的方法可以聚合具有超泊松分布的适当尺寸的液滴(例如，第一子集的液滴)。例如，聚合的多个液滴中的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多可以是适当尺寸的液滴。可选择地，聚合的液滴的少于约97％可以是适当尺寸的液滴。
在一些情况下，可以组合图9和图10的方法，使得一个或更多个传感器检测上游位置(或多个上游位置)处的液滴的一个或更多个特性，其中液滴的一个或更多个特性指示液滴的尺寸和占据率两者，并且将传感器数据传输至控制器。控制器将指令传输至下游位置处的光源，以仅在液滴是适当尺寸的和被占据的两者的情况下聚合液滴。
在另一个方面中，提供了用于将未被占据的液滴与被占据的液滴分选开的被动机构。被动机构可以不需要对液滴施加外力(例如磁场、电场、压力脉冲等)以实现分选。被动机构可以至少部分地基于液滴的机械性质来对液滴进行分选。例如，被动机制可以至少部分地基于诸如液滴的可变形性和表面张力(例如，表面界面能量)的性质来对液滴进行分选。在一些情况下，由于在被占据的液滴中存在一个或更多个生物颗粒，被占据的液滴可以展现出与未被占据的液滴相比更低的可变形性和/或更高的表面张力性质，使得被占据的液滴比未被占据的液滴‘更坚固(harder)’或‘更硬(stiffer)’。因此，当包含第一子集的被占据的液滴和第二子集的未被占据的液滴两者的多个液滴被引导穿过其尺寸小于多个液滴中给定液滴的直径的孔时，仅能够变形的那些液滴(例如，具有较高的可变形性性质的未被占据的液滴)可以穿过该孔，捕获被占据的液滴，从而将被占据的液滴与未被占据的液滴分选开。
图11示出了用于将被占据的液滴与未被占据的液滴分离的微流体通道结构的示意性实例。如本文其他地方所描述的，当生成液滴时，可以存在至少第一子集的包含一个或更多个生物颗粒的被占据的液滴群体和至少第二子集的不包含任何生物颗粒的未被占据的液滴群体。在一些情况下，液滴可以另外地包含一个或更多个携带条形码的珠。例如，液滴可以仅具有生物颗粒，液滴可以仅具有携带条形码的珠，液滴可以具有生物颗粒和携带条形码的珠两者，或者液滴可以既没有生物颗粒也没有携带条形码的珠。在一些情况下，大多数被占据的分配区(例如，液滴)可以包括每个被占据的分配区不多于一个生物颗粒，并且在一些情况下，一些生成的分配区可以未被(例如，任何生物颗粒)占据。但是，在一些情况下，一些被占据的分配区可以包括多于一个生物颗粒。在一些情况下，分配过程可以被控制使得被占据的分配区的少于25％包含多于一个生物颗粒，被占据的分配区的少于20％具有多于一个生物颗粒，或者被占据的分配区的少于10％或甚至少于5％包括每个分配区多于一个生物颗粒。
如图11中所示出的，通道结构可以包括具有入口1102和出口1104的通道区段1100。在一些情况下，携带图1中生成的液滴的乳液的流出通道可以在通道区段1100的上游。流体流动单元(未示出)可以被配置成有助于流体在通道结构中流动。
在操作中，多个离散液滴(各自包含第一含水流体1110)可以作为乳液在第二流体1112中流动，其中第二流体1112与第一含水流体1110不混溶。沿着通道区段1100输送的液滴可以包含第一子集的液滴1108和第二子集的液滴1106，所述第一子集的液滴1108各自被至少生物颗粒和/或携带条形码的珠占据，所述第二子集的液滴1106各自未被占据。如上文所描述的，由于在被占据的液滴中存在一个或更多个生物颗粒，给定的未被占据的液滴与给定的被占据的液滴相比可以具有更高的可变形性和/或更低的表面张力性质。
通道区段1100可以包含多个截留结构1114。截留结构可以限定孔口。孔口的尺寸可以小于液滴的直径(或其他尺寸大小)。孔口的尺寸可以小于液滴的最小尺寸。在一些情况下，孔口的尺寸可以是液滴直径的至多约90％、80％、70％、60％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％(在变形前状态)。孔口的尺寸可以小于液滴直径的约5％。可选择地，孔口的尺寸可以大于液滴直径的50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％或200％。孔口的尺寸可以大于液滴的直径。当包含第一子集的被占据的液滴和第二子集的未被占据的液滴两者的多个液滴被引导穿过限定其尺寸小于多个液滴中给定液滴的直径的孔口的截留结构1114时，仅那些变形1118(例如，具有更高的可变形性性质的未被占据的液滴)使得液滴的至少一个尺寸小于孔口的尺寸的液滴可以穿过由截留结构1114限定的一个或更多个孔口。因为被占据的液滴由于液滴中存在一个或更多个生物颗粒而可以‘更坚固’或‘更硬’，所以被占据的液滴可以抵抗变形(至少抵抗变形到小于孔口尺寸的尺寸)并且保持被截留结构1114捕获。
在一些实施方案中，在通道结构中可以存在比穿过通道结构的第二子集的液滴1106、第一子集的液滴1108更多的截留结构1114(并且因此更多的孔口)。有益地，当被占据的液滴被阻止流过截留结构1114并且被占据的液滴堵塞(或阻塞)截留结构1114的一些孔口时，未被占据的液滴仍然可以变形并且流过其他孔口。在分选之后，截留结构1114可以从多个液滴中仅保留第一子集的被占据的液滴。未被占据的液滴1104可以流过所有截留结构1114，并且离开通道区段1100到单独的隔室，诸如用于再循环或丢弃。虽然图11示出了通道结构中截留结构的示例性配置和布局，但是截留结构的配置和布局不限于此。例如，截留结构可以是具有限定在板上的多个孔口(例如，洞)的单个板。所述板可以是平面的、弯曲的和/或它们的组合。通道结构和截留结构1114可以被配置成使得来自多个液滴的液滴穿过至少一个截留结构(以及其中限定的孔口)。在截留和/或分选被占据的液滴之后，流体流动单元(未示出)可以被配置成反转流体流动方向，以从截留结构收集被占据的液滴。
在一些情况下，流体流动单元可以包含压缩机，以在上游位置处提供正压，以将流体从上游位置引导流向下游位置。在一些情况下，流体流动单元可以包含泵，以在下游位置处提供负压，以将流体从上游位置引导流向下游位置。在一些情况下，流体流动单元可以包含压缩机和泵两者，每个在不同的位置处。在一些情况下，流体流动单元可以在不同位置处包含不同装置。流体流动单元可以包含致动器。
关于图11所描述的系统和方法可以用于将被占据的颗粒(例如，细胞珠)与未被占据的颗粒分离。如本文其他地方所描述的，多个颗粒可以包含被生物颗粒(例如，细胞)占据的第一子集的颗粒和未被生物颗粒占据的第二子集的颗粒。如上文所描述的，由于在被占据的颗粒中存在一个或更多个生物颗粒，给定的未被占据的颗粒与给定的被占据的颗粒(例如，细胞珠)相比可以具有更高的可变形性和/或更低的表面张力性质。在包括具有入口1102和出口1104的通道区段1100并且包含多个截留结构1114的通道结构中，多个颗粒可以被引导沿着通道区段1100从入口1102到出口1104跨过多个截留结构1114流动(例如，作为流体(例如含水流体)中的悬浮液)。
截留结构可以限定孔口。孔口的尺寸可以小于颗粒的直径(或其他尺寸大小)。孔口的尺寸可以小于颗粒的最小尺寸。在一些情况下，孔口的尺寸可以是颗粒直径的至多约90％、80％、70％、60％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％(在变形前状态)。孔口的尺寸可以小于颗粒直径的约5％。可选择地，孔口的尺寸可以大于颗粒直径的50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％或200％。孔口的尺寸可以大于颗粒的直径。当包含第一子集的被占据的颗粒和第二子集的未被占据的颗粒的多个颗粒被引导穿过限定其尺寸小于多个颗粒中给定颗粒的直径的孔口的截留结构1114时，仅那些变形1118(例如，具有更高的可变形性性质的未被占据的颗粒)使得颗粒的至少一个尺寸小于孔口的尺寸的颗粒可以穿过由截留结构1114限定的一个或更多个孔口。因为被占据的颗粒(例如，细胞珠)由于颗粒中存在一个或更多个生物颗粒而可以更坚固或更硬，所以被占据的颗粒可以抵抗变形(至少抵抗变形到小于孔口尺寸的尺寸)并且保持被截留结构1114捕获。
在一些实施方案中，在通道结构中可以存在比穿过通道结构的颗粒更多的截留结构1114(并且因此更多的孔口)。有益地，当被占据的颗粒被阻止流过截留结构1114并且被占据的颗粒堵塞(或阻塞)截留结构1114的一些孔口时，未被占据的颗粒仍然可以变形并且流过其他孔口。在分选之后，截留结构1114可以从多个颗粒中仅保留被占据的颗粒的第一子集。未被占据的颗粒1104可以流过所有截留结构1114，并且离开通道区段1100到单独的隔室，诸如用于再循环或丢弃。
本文所公开的分离系统和方法(诸如参考图11)可以实现超泊松加载。例如，液滴可以被分离成两个子集，使得被分离的第一子集的液滴的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多是被占据的液滴(例如，包含至少一个生物颗粒)。这样的占据率可以大于或等于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。可选择地，第一子集的液滴的少于约97％可以是被占据的液滴。在一些情况下，被分离的第二子集的液滴的至少约97％、98％、99％或更高百分比可以是未被占据的液滴(例如，不包含任何生物颗粒并且不包含任何携带条形码的珠)。可选择地，第二子集的液滴的少于约97％可以是未被占据的液滴。例如，多个颗粒可以被分离成两个子集，使得被分离的第一子集的颗粒的至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多是细胞珠(例如，包含至少一个生物颗粒)。这样的占据率可以大于或等于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高。可选择地，第一子集的颗粒的少于约97％可以是细胞珠。在一些情况下，被分离的第二子集的颗粒的至少约97％、98％、99％或更高百分比可以是未被占据的颗粒(例如，不包含任何生物颗粒并且不包含任何携带条形码的珠)。可选择地，第二子集的颗粒的少于约97％可以是未被占据的颗粒。
微流体架构
在一个方面中，本文提供了可以连同本文所描述的系统和方法一起使用的多种微流体架构。
根据某些方面，可以将珠输送至液滴中。图12示出了用于将携带条形码的珠递送至液滴的微流体通道结构1200的实例。关于图19描述了携带条形码的珠的实例。通道结构1200可以包括在通道汇合点1210处连通的通道区段1201、1202、1204、1206和1208。在操作中，通道区段1201可以将包括多个珠1214(例如，具有核酸分子、寡核苷酸、分子标签)的含水流体1212沿着通道区段1201输送到汇合点1210中。多个珠1214可以源自珠的悬浮液。例如，通道区段1201可以被连接至包含珠1214的含水悬浮液的贮存器。通道区段1202可以将包括多个生物颗粒1216的含水流体1212沿着通道区段1202输送到汇合点1210中。多个生物颗粒1216可以源自生物颗粒的悬浮液。例如，通道区段1202可以被连接至包含生物颗粒1216的含水悬浮液的贮存器。在一些情况下，在通道区段1201或通道区段1202中或者在两个区段中的含水流体1212可以包括一种或更多种试剂，如下文进一步描述的。与含水流体1212(例如，油)不混溶的第二流体1218可以从通道区段1204和1206的每一个递送至汇合点1210。在来自通道区段1201和1202的每一个的含水流体1212和来自通道区段1204和1206的每一个的第二流体1218在通道汇合点1210处相遇后，含水流体1212可以被分配为第二流体1218中的离散液滴1220，并且沿着通道区段1208从汇合点1210流出。通道区段1208可以将离散液滴递送至流体地耦接至通道区段1208的出口贮存器，在此处它们可以被收获。
作为替代方案，通道区段1201和1202可以在汇合点1210的上游的另一个汇合点处相遇。在这样的汇合点处，珠和生物颗粒可以形成混合物，该混合物沿着另一个通道被引导至汇合点1210以产生离散液滴1220。混合物可以以交替的方式提供珠和生物颗粒，使得例如液滴包含单个珠和单个生物颗粒。
珠、生物颗粒和液滴可以以基本上常规的流动轮廓(例如，以常规流速)沿着通道流动。此类常规的流动轮廓可以允许液滴包括单个珠和单个生物颗粒。此类常规的流动轮廓可以允许液滴具有大于5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的占据率(例如，具有珠和生物颗粒的液滴)。例如，在例如美国专利公布号2015/0292988中提供此类常规的流动轮廓和可以用于提供此类常规的流动轮廓的装置，其通过引用整体并入本文。
第二流体1218可以包含油，诸如氟化油，其包括用于使所得液滴稳定化(例如，抑制所得离散液滴1220的随后聚结)的含氟表面活性剂。
所生成的离散液滴可以包括单独的生物颗粒1216。所生成的离散液滴可以包括携带条形码或其他试剂的珠1214。所生成的离散液滴可以包括单独的生物颗粒和携带条形码的珠诸如离散液滴1220两者。在一些情况下，离散液滴可以包括多于一个单独的生物颗粒或不包括生物颗粒。在一些情况下，离散液滴可以包括多于一个珠或不包括珠。离散液滴可以是未被占据的(例如，没有珠、没有生物颗粒)。
有益地，分配生物颗粒和携带条形码的珠的离散液滴可以有效地允许将条形码归属于分配区内的生物颗粒的大分子成分。分配区的内容物可以保持与其他分配区的内容物离散。
如将理解的是，本文所描述的通道区段可以被耦接至多种不同的流体源或接收部件中的任一个，包括其他系统的贮存器、管道、歧管或流体部件。如将理解的是，微流体通道结构1200可以具有其他几何形状。例如，微流体通道结构可以具有多于一个通道汇合点。例如，微流体通道结构可以具有2个、3个、4个或5个通道区段，每个通道区段携带在通道汇合点处相遇的珠。可以经由一个或更多个流体流动单元引导流体沿着一个或更多个通道或贮存器流动。流体流动单元可以包含压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。流体还可以或以其他方式经由施加的压力差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流等来控制。
根据某些方面，生物颗粒可以连同裂解试剂一起被分配，以便释放分配区内生物颗粒的内容物。在这样的情况下，裂解剂可以在将生物颗粒诸如通过通道汇合点上游的另外的一个或更多个通道引入到分配区汇合点/液滴生成区的同时或临在其之前与生物颗粒悬浮液接触。根据其他方面，另外地或可选择地，生物颗粒可以连同其他试剂一起分配，如下文将进一步描述的。
图13示出了用于共分配生物颗粒和试剂的微流体通道结构1300的实例。通道结构1300可以包括通道区段1301、1302、1304、1306和1308。通道区段1301和1302在第一通道汇合点1309处连通。通道区段1302、1304、1306和1308在第二通道汇合点1310处连通。
在示例性操作中，通道区段1301可以将包括多个生物颗粒1314的含水流体1312沿着通道区段1301输送到第二汇合点1310中。作为替代方案或除此之外，通道区段1301可以输送珠(例如，凝胶珠)。珠可以包含条形码分子。
例如，通道区段1301可以被连接至包含生物颗粒1314的含水悬浮液的贮存器。在第二汇合点1310的上游和临达到其之前，通道区段1301可以在第一汇合点1309处与通道区段1302相遇。通道区段1302可以将悬浮在含水流体1312中的多种试剂1315(例如，裂解剂)沿着通道区段1302输送到第一汇合点1309中。例如，通道区段1302可以被连接至包含试剂1315的贮存器。在第一汇合点1309之后，通道区段1301中的含水流体1312可以将生物颗粒1314和试剂1315两者携带到第二汇合点1310。在一些情况下，通道区段1301中的含水流体1312可以包括一种或更多种试剂，所述一种或更多种试剂可以是与试剂1315相同或不同的试剂。与含水流体1312(例如，油)不混溶的第二流体1316可以从通道区段1304和1306的每一个递送至第二汇合点1310。在来自通道区段1301的含水流体1312和来自通道区段1304和1306的每一个的第二流体1316在第二汇合点1310处相遇后，含水流体1312可以被分配为第二流体1316中的离散液滴1318，并且沿着通道区段1308从第二汇合点1310流出。通道区段1308可以将离散液滴1318递送至流体地耦接至通道区段1308的出口贮存器，在那里它们可以被收获。
第二流体1316可以包含油，诸如氟化油，其包括用于使所得液滴稳定化(例如，抑制所得离散液滴1318的随后聚结)的含氟表面活性剂。
所生成的离散液滴可以包括单独的生物颗粒1314和/或一种或更多种试剂1315。在一些情况下，所生成的离散液滴可以包括携带条形码的珠(未示出)，诸如经由本文其他地方所描述的其他微流体结构。在一些情况下，离散液滴可以是未被占据的(例如，没有试剂、没有生物颗粒)。
有益地，当裂解试剂和生物颗粒被共分配时，裂解试剂可以促进分配区内生物颗粒的内容物的释放。分配区中释放的内容物可以保持与其他分配区的内容物离散。
如将理解的是，本文所描述的通道区段可以被耦接至多种不同的流体源或接收部件中的任一个，包括其他系统的贮存器、管道、歧管或流体部件。如将理解的是，微流体通道结构1300可以具有其他几何形状。例如，微流体通道结构可以具有多于两个通道汇合点。例如，微流体通道结构可以具有2个、3个、4个、5个或更多个通道区段，每个通道区段携带在通道汇合点处相遇的相同或不同类型的珠、试剂和/或生物颗粒。可以控制每个通道区段中的流体流动，以控制不同元素到液滴中的分配。可以经由一个或更多个流体流动单元引导流体沿着一个或更多个通道或贮存器流动。流体流动单元可以包含压缩机(例如，提供正压)、泵(例如，提供负压)、致动器等以控制流体的流动。流体还可以或以其他方式经由施加的压力差、离心力、电动泵送、真空、毛细管或重力流等来控制。
在一些方面中，提供了用于受控分配的系统和方法。液滴尺寸可以通过调整通道架构(例如，微流体通道架构)中的某些几何特征来控制。例如，可以调整通道的扩张角、宽度和/或长度来控制液滴尺寸。
图14示出了用于将珠受控分配到离散液滴中的微流体通道结构的实例。通道结构1400可以包括在通道汇合点1406(或交叉点)处与贮存器1404连通的通道区段1402。贮存器1404可以是腔室。如本文中所使用的，对“贮存器”的任何提及也可以指的是“腔室”。在操作中，包括悬浮珠1412的含水流体1408可以沿着通道区段1402输送到汇合点1406，以遇见与贮存器1404中的含水流体1408不混溶的第二流体1410，以产生流入贮存器1404中的含水流体1408的液滴1416、1418。在含水流体1408和第二流体1410相遇的汇合点1406处，可以基于诸如在汇合点1406处的流体动力、含水流体1408和第二流体1410的流速、流体性质以及通道结构1400的某些几何参数(例如，w、h0、α等)的因素形成液滴。多个液滴可以通过连续地从通道区段1402注入含水流体1408通过汇合点1406而收集在贮存器1404中。
所生成的离散液滴可以包括珠(例如，如在被占据的液滴1416中)。可选择地，所生成的离散液滴可以包括多于一个珠。可选择地，所生成的离散液滴可以不包括任何珠(例如，如在未被占据的液滴1418中)。在一些情况下，所生成的离散液滴可以包含一个或更多个生物颗粒，如本文其他地方所描述的。在一些情况下，所生成的离散液滴可以包含一种或更多种试剂，如本文其他地方所描述的。
在一些情况下，含水流体1408可以具有基本上均匀浓度或频率的悬浮珠1412。悬浮珠1412可以从单独的通道(图14中未示出)引入到通道区段1402中。通道区段1402中悬浮珠1412的频率可以通过控制悬浮珠1412被引入到通道区段1402中的频率和/或通道区段1402和单独的通道中流体的相对流速来控制。在一些情况下，珠可以从多个不同的通道引入到通道区段1402中，并且相应地控制频率。
在一些情况下，通道区段1402中的含水流体1408可以包含生物颗粒。在一些情况下，含水流体1408可以具有基本上均匀浓度或频率的生物颗粒。与珠一样，生物颗粒可以从单独的通道引入到通道区段1402中。通道区段1402中的含水流体1408中生物颗粒的频率或浓度可以通过控制生物颗粒被引入到通道区段1402中的频率和/或通道区段1402和单独的通道中流体的相对流速来控制。在一些情况下，生物颗粒可以从多个不同的通道被引入到通道区段1402中，并且相应地控制频率。在一些情况下，第一单独的通道可以引入珠，并且第二单独的通道可以将生物颗粒引入到通道区段1402中。引入珠的第一单独的通道可以在引入生物颗粒的第二单独的通道的上游或下游。
第二流体1410可以包含油，诸如氟化油，其包括用于使所得液滴稳定化(例如，抑制所得液滴的随后聚结)的含氟表面活性剂。
在一些情况下，第二流体1410可以不进行进入或出贮存器1404的任何流动和/或被引导以进行进入或出贮存器1404的任何流动。例如，第二流体1410可以在贮存器1404中是基本上静止的。在一些情况下，第二流体1410可以在贮存器1404内经受流动，但不流入或流出贮存器1404，诸如经由向贮存器1404施加压力和/或如在汇合点1406处受到含水流体1408的进入流(incoming flow)的影响。可选择地，第二流体1410可以进行进入或出贮存器1404的流动和/或被引导以进行进入或出贮存器1404的流动。例如，贮存器1404可以是将第二流体1410从上游引导到下游的通道，从而输送生成的液滴。
在汇合点1406处或附近的通道结构1400可以具有某些几何特征，其至少部分地决定通过通道结构1400形成的液滴的尺寸。通道区段1402可以在汇合点1406处或附近具有高度h0和宽度w。通过实例的方式，通道区段1402可以包括矩形横截面，其通向具有较宽横截面(诸如在宽度或直径方面)的贮存器1404。可选择地，通道区段1402的横截面可以是其他形状，诸如圆形形状、梯形形状、多边形形状或任何其他形状。在汇合点1406处或附近的贮存器1404的顶壁和底壁可以以扩张角α倾斜。扩散角α允许舌部(在汇合点1406处离开通道区段1402并在液滴形成之前进入贮存器1404的部分含水流体1408)增加深度并且有助于减小中间形成的液滴的曲率。液滴尺寸可以随着扩张角的增加而减小。可以通过针对前面提及的几何参数h0、w和α的以下等式预测所得到的液滴半径Rd：
通过实例的方式，对于w＝21μm、h＝21μm和α＝3°的通道结构，预测的液滴尺寸为121μm。在另一个实例中，对于w＝25μm、h＝25μm和α＝5°的通道结构，预测的液滴尺寸为123μm。在另一个实例中，对于w＝28μm、h＝28μm和α＝7°的通道结构，预测的液滴尺寸为124μm。
在一些情况下，扩张角α可以在从约0.5°至约4°、从约0.1°至约10°、或从约0°至约90°的范围之间。例如，扩张角可以是至少约0.01°、0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°或更高。在一些情况下，扩张角可以是至多约89°、88°、87°、86°、85°、84°、83°、82°、81°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、1°、0.1°、0.01°或更小。在一些情况下，宽度w可以在从约100微米(μm)至约500μm的范围之间。在一些情况下，宽度w可以在从约10μm至约200μm的范围之间。可选择地，宽度可以小于约10μm。可选择地，宽度可以大于约500μm。在一些情况下，进入汇合点1406的含水流体1408的流速可以在约0.04微升(μL)/分钟(min)和约40μL/min之间。在一些情况下，进入汇合点1406的含水流体1408的流速可以在约0.01微升(μL)/分钟(min)和约100μL/min之间。可选择地，进入汇合点1406的含水流体1408的流速可以小于约0.01μL/min。可选择地，进入汇合点1406的含水流体1408的流速可以大于约40μL/min，诸如45μL/min、50μL/min、55μL/min、60μL/min、65μL/min、70μL/min、75μL/min、80μL/min、85μL/min、90μL/min、95μL/min、100μL/min、110μL/min、120μL/min、130μL/min、140μL/min、150μL/min或更大。在较低的流速诸如约小于或等于10微升/分钟的流速，液滴半径可以不取决于进入汇合点1406的含水流体1408的流速。
在一些情况下，所生成的液滴的至少约50％可以具有一致的尺寸。在一些情况下，所生成的液滴的至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多可以具有一致的尺寸。可选择地，所生成的液滴的少于约50％可以具有一致的尺寸。
可以通过增加生成点，诸如增加含水流体1408通道区段(例如，通道区段1402)和贮存器1404之间的汇合点(例如，汇合点1406)的数目来增加液滴生成的通量。可选择地或另外地，可以通过增加通道区段1402中的含水流体1408的流速来增加液滴生成的通量。
图15示出了用于增加液滴生成通量的微流体通道结构的实例。微流体通道结构1500可以包含多个通道区段1502和贮存器1504。多个通道区段1502的每一个可以与贮存器1504流体连通。通道结构1500可以在多个通道区段1502和贮存器1504之间包含多个通道汇合点1506。每个通道汇合点可以是液滴生成点。来自图14中的通道结构1400的通道区段1402以及对其部件的任何描述可以对应于通道结构1500中的多个通道区段1502的给定通道区段以及对其相应部件的任何描述。来自通道结构1400的贮存器1404以及对其部件的任何描述可以对应于来自通道结构1500的贮存器1504以及对其相应部件的任何描述。
多个通道区段1502中的每个通道区段可以包含包括悬浮珠1512的含水流体1508。贮存器1504可以包含与含水流体1508不混溶的第二流体1510。在一些情况下，第二流体1510可以不进行进入或出贮存器1504的任何流动和/或被引导进行进入或出贮存器1504的任何流动。例如，第二流体1510可以在贮存器1504中是基本上静止的。在一些情况下，第二流体1510可以在贮存器1504内经受流动，但不流入或流出贮存器1504，诸如经由向贮存器1504施加压力和/或如在汇合点处受到含水流体1508的进入流的影响。可选择地，第二流体1510可以进行进入或出贮存器1504的流动和/或被引导进行进入或出贮存器1504的流动。例如，贮存器1504可以是将第二流体1510从上游引导到下游的通道，从而输送生成的液滴。
在操作中，包括悬浮珠1512的含水流体1508可以沿着多个通道区段1502输送到多个汇合点1506中以与贮存器1504中的第二流体1510相遇，以产生液滴1516、1518。可以在与贮存器1504的每个相应汇合点处从每个通道区段形成液滴。在含水流体1508和第二流体1510相遇的汇合点处，可以基于诸如在汇合点处的流体动力、含水流体1508和第二流体1510的流速、流体性质以及通道结构1500的某些几何参数(例如，w、h0、α等)的因素形成液滴，如本文其他地方所描述的。多个液滴可以通过连续地从多个通道区段1502注入含水流体1508通过多个汇合点1506而收集在贮存器1504中。通量可以随着通道结构1500的平行通道配置而显著增加。例如，具有包含含水流体1508的五个入口通道区段的通道结构可以生成频率是具有一个入口通道区段的通道结构五倍的液滴，条件是通道区段中的流体流速是基本上相同的。不同入口通道区段中的流体流速可以是或可以不是基本上相同的。通道结构可以具有依据实际并且允许贮存器的尺寸那么多的平行通道区段。例如，通道结构可以具有至少约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、5000个或更多个平行或基本上平行的通道区段。
对于多个通道区段1502中的每个通道区段，几何参数w、h0和α可以是或可以不是一致的。例如，每个通道区段可以在其与贮存器1504的相应通道汇合点处或附近具有相同或不同的宽度。例如，每个通道区段可以在其与贮存器1504的相应通道汇合点处或附近具有相同或不同的高度。在另一个实例中，贮存器1504可以在与多个通道区段1502的不同通道汇合点处具有相同或不同的扩张角。当几何参数一致时，有益地，即使增加了通量，也可以控制液滴尺寸是一致的。在一些情况下，当期望具有不同的液滴尺寸分布时，可以相应地改变多个通道区段1502的几何参数。
在一些情况下，所生成的液滴的至少约50％可以具有一致的尺寸。在一些情况下，所生成的液滴的至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多可以具有一致的尺寸。可选择地，所生成的液滴的少于约50％可以具有一致的尺寸。
图16示出了用于增加液滴生成通量的微流体通道结构的另一个实例。微流体通道结构1600可以包含围绕贮存器1604的周边大致圆形布置的多个通道区段1602。多个通道区段1602的每一个可以与贮存器1604流体连通。通道结构1600可以在多个通道区段1602和贮存器1604之间包含多个通道汇合点1606。每个通道汇合点可以是液滴生成点。来自图14中的通道结构1400的通道区段1402以及对其部件的任何描述可以对应于通道结构1600中的多个通道区段1602的给定通道区段以及对其相应部件的任何描述。来自通道结构1400的贮存器1404以及对其部件的任何描述可以对应于来自通道结构1600的贮存器1604以及对其相应部件的任何描述。
多个通道区段1602中的每个通道区段可以包含包括悬浮珠1612的含水流体1608。贮存器1604可以包含与含水流体1608不混溶的第二流体1610。在一些情况下，第二流体1610可以不进行进入或出贮存器1604的任何流动和/或被引导进行进入或出贮存器1604的任何流动。例如，第二流体1610可以在贮存器1604中是基本上静止的。在一些情况下，第二流体1610可以在贮存器1604内经受流动，但不流入或流出贮存器1604，诸如经由向贮存器1604施加压力和/或如在汇合点处受到含水流体1608的进入流的影响。可选择地，第二流体1610可以进行进入或出贮存器1604的流动和/或被引导进行进入或出贮存器1604的流动。例如，贮存器1604可以是将第二流体1610从上游引导到下游的通道，从而输送生成的液滴。
在操作中，包括悬浮珠1612的含水流体1608可以沿着多个通道区段1602输送到多个汇合点1606中以与贮存器1604中的第二流体1610相遇，以产生多个液滴1616。可以在与贮存器1604的每个相应汇合点处从每个通道区段形成液滴。在含水流体1608和第二流体1610相遇的汇合点处，可以基于诸如在汇合点处的流体动力、含水流体1608和第二流体1610的流速、流体性质以及通道结构1600的某些几何参数(例如，通道区段1602的宽度和高度、贮存器1604的扩张角等)的因素形成液滴，如本文其他地方所描述的。多个液滴可以通过连续地从多个通道区段1602注入含水流体1608通过多个汇合点1606而收集在贮存器1604中。通量可以随着通道结构1600的基本上平行通道配置而显著增加。通道结构可以具有依据实际并且允许贮存器的尺寸那么多的基本上平行通道区段。例如，通道结构可以具有至少约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、600个、700个、800个、900个、1000个、1500个、5000个或更多个平行或基本上平行的通道区段。多个通道区段可以基本上均匀地间隔开，例如，围绕贮存器的边缘或周边。可选择地，多个通道区段的间隔可以是不均匀的。
贮存器1604可以在每个通道汇合点处或附近具有扩张角α(图16中未示出)。多个通道区段1602中的每个通道区段可以在通道汇合点处或附近具有宽度w和高度h0。对于多个通道区段1602中的每个通道区段，几何参数w、h0和α可以是或可以不是一致的。例如，每个通道区段可以在其与贮存器1604的相应通道汇合点处或附近具有相同或不同的宽度。例如，每个通道区段可以在其与贮存器1604的相应通道汇合点处或附近具有相同或不同的高度。
贮存器1604可以在与多个通道区段1602的不同通道汇合点处具有相同或不同的扩张角。例如，圆形贮存器(如图16中所示出的)可以具有圆锥形、圆顶状或半球形顶板(ceiling)(例如，顶壁)，以在多个通道汇合点1606处或附近为每个通道区段1602提供相同或基本上相同的扩张角。当几何参数一致时，有益地，即使增加了通量，也可以控制所得液滴尺寸是一致的。在一些情况下，当期望具有不同的液滴尺寸分布时，可以相应地改变多个通道区段1602的几何参数。
在一些情况下，所生成的液滴的至少约50％可以具有一致的尺寸。在一些情况下，所生成的液滴的至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多可以具有一致的尺寸。可选择地，所生成的液滴的少于约50％可以具有一致的尺寸。注入液滴中的珠和/或生物颗粒可以具有或可以不具有一致的尺寸。
图17A示出了具有用于受控分配的几何特征的微流体通道结构的另一个实例的横截面图。通道结构1700可以包括在通道汇合点1706(或交叉点)处与贮存器1704连通的通道区段1702。在一些情况下，通道结构1700以及其一个或更多个部件可以对应于本文所描述的任何其他通道结构以及其一个或更多个部件。图17B示出了图17A的通道结构1700的透视图。
包含多个颗粒1716的含水流体1712可以沿着通道区段1702输送到汇合点1706中，以遇到与贮存器1704中的含水流体1712不混溶的第二流体1714(例如，油等)，以产生流入贮存器1704的含水流体1712的液滴1720。在含水流体1712和第二流体1714相遇的汇合点1706处，可以基于诸如在汇合点1706处的流体动力、含水流体1712和第二流体1714的相对流速、流体性质以及通道结构1700的某些几何参数(例如，Δh等)的因素形成液滴。多个液滴可以通过连续地从通道区段1702注入含水流体1712在汇合点1706处收集在贮存器1704中。
所生成的离散液滴可以包含多个颗粒1716中的一个或更多个颗粒。如本文其他地方所描述的，颗粒可以是任何颗粒，诸如珠、细胞珠、凝胶珠、生物颗粒、生物颗粒的大分子成分或其他颗粒。可选择地，所生成的离散液滴可以不包括任何颗粒。
在一些情况下，含水流体1712可以具有基本上均匀浓度或频率的颗粒1716。如本文其他地方所描述的(例如，参考图14)，颗粒1716(例如，珠)可以从单独的通道(图17A和图17B中未示出)引入到通道区段1702中。通道区段1702中颗粒1716的频率可以通过控制颗粒1716被引入到通道区段1702中的频率和/或通道区段1702和单独的通道中流体的相对流速来控制。在一些情况下，颗粒1716可以从多个不同的通道引入到通道区段1702中，并且相应地控制频率。在一些情况下，不同的颗粒可以经由单独的通道引入。例如，第一单独的通道可以引入珠，并且第二单独的通道可以将生物颗粒引入到通道区段1702中。引入珠的第一单独的通道可以在引入生物颗粒的第二单独的通道的上游或下游。
在一些情况下，第二流体1714可以不经受和/或被引导任何流入或流出贮存器1704。例如，第二流体1714可以在贮存器1704中是基本上静止的。在一些情况下，第二流体1714可以在贮存器1704内经受流动，但不流入或流出贮存器1704，诸如经由向贮存器1704施加压力和/或如在汇合点1706处受到含水流体1712的进入流的影响。可选择地，第二流体1714可以经受和/或被引导流入或流出贮存器1704。例如，贮存器1704可以是将第二流体1714从上游引导到下游的通道，从而输送生成的液滴。
在汇合点1706处或附近的通道结构1700可以具有某些几何特征，其至少部分地决定通过通道结构1700形成的液滴的尺寸和/或形状。通道区段1702可以具有第一横截面高度h1，并且贮存器1704可以具有第二横截面高度h2。第一横截面高度h1和第二横截面高度h2可以是不同的，使得在汇合点1706处存在Δh的高度差。第二横截面高度h2可以大于第一横截面高度h1。在一些情况下，贮存器此后可以逐渐增加横截面高度，例如，它距离汇合点1706越远。在一些情况下，贮存器的横截面高度可以根据在汇合点1706处或附近的扩张角β而增加。高度差Δh和/或扩张角β可以允许舌部(在汇合点1706处离开通道区段1702并在液滴形成之前进入贮存器1704的部分含水流体1712)增加深度并且有助于中间形成的液滴的曲率的减小。例如，液滴尺寸可以随着高度差的增加和/或扩张角的增加而减小。
高度差Δh可以为至少约1μm。可选择地，高度差可以是至少约1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、11μm、12μm、13μm、14μm、15μm、16μm、17μm、18μm、19μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、200μm、300μm、400μm、500μm或更多。可选择地，高度差可以是至多约500μm、400μm、300μm、200μm、100μm、90μm、80μm、70μm、60μm、50μm、45μm、40μm、35μm、30μm、25μm、20μm、19μm、18μm、17μm、16μm、15μm、14μm、13μm、12μm、11μm、10μm、9μm、8μm、7μm、6μm、5μm、4μm、3μm、2μm、1μm或更小。在一些情况下，扩张角β可以在从约0.5°至约4°、从约0.1°至约10°、或从约0°至约90°的范围之间。例如，扩张角可以是至少约0.01°、0.1°、0.2°、0.3°、0.4°、0.5°、0.6°、0.7°、0.8°、0.9°、1°、2°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°或更高。在一些情况下，扩张角可以是至多约89°、88°、87°、86°、85°、84°、83°、82°、81°、80°、75°、70°、65°、60°、55°、50°、45°、40°、35°、30°、25°、20°、15°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、1°、0.1°、0.01°或更小。
在一些情况下，进入汇合点1706的含水流体1712的流速可以在约0.04微升(μL)/分钟(min)和约40μL/min之间。在一些情况下，进入汇合点1706的含水流体1712的流速可以在约0.01微升(μL)/分钟(min)和约100μL/min之间。可选择地，进入汇合点1706的含水流体1712的流速可以小于约0.01μL/min。可选择地，进入汇合点1706的含水流体1712的流速可以大于约40μL/min，诸如45μL/min、50μL/min、55μL/min、60μL/min、65μL/min、70μL/min、75μL/min、80μL/min、85μL/min、90μL/min、95μL/min、100μL/min、110μL/min、120μL/min、130μL/min、140μL/min、150μL/min或更大。在较低的流速诸如约小于或等于10微升/分钟的流速，液滴半径可以不取决于进入汇合点1706的含水流体1712的流速。第二流体1714在贮存器1704中可以是静止的或者基本上静止的。可选择地，第二流体1714可以是流动的，诸如以上文针对含水流体1712所描述的流速。
在一些情况下，所生成的液滴的至少约50％可以具有一致的尺寸。在一些情况下，所生成的液滴的至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多可以具有一致的尺寸。可选择地，所生成的液滴的少于约50％可以具有一致的尺寸。
虽然图17A和图17B图示出了在汇合点1706处陡峭的高度差Δh(例如，阶度增加)，但高度差可以逐渐增加(例如，从约0μm至最大高度差)。可选择地，高度差可以从最大高度差逐渐减小(例如，渐缩)。如本文中所使用的，高度差的逐渐增加或减小可以指的是高度差的连续增量增加或减小，其中高度轮廓的任一差别段和高度轮廓的紧邻的差别区段之间的角度大于90°。例如，在汇合点1706处，通道的底壁和贮存器的底壁可以以大于90°的角度相遇。可选择地或另外地，通道的顶壁(例如，顶板)和贮存器的顶壁(例如，顶板)可以以大于90°的角度相遇。逐渐增加或减小可以是线性的或非线性的(例如，指数的、正弦的等)。可选择地或另外地，高度差可以线性地或非线性地可变地增加和/或减小。虽然图17A和图17B图示出了呈线性(例如，恒定的扩张角，β)的扩张贮存器横截面高度，但是横截面高度可以非线性地扩张。例如，贮存器可以至少部分地由具有可变的扩张角的圆顶状(例如，半球形)形状限定。横截面高度可以以任何形状扩张。
例如，如上文或本文其他地方所描述的通道网络可以流体地耦接至适当的流体部件。例如，入口通道区段被流体地耦接至它们待被递送至通道汇合点的材料的适当来源。这些来源可以包括多种不同的流体部件中的任一种，从在微流体装置的主体结构中限定或与其连接的简单贮存器，到从装置外来源递送流体的流体导管、歧管、流体流动单元(例如，致动器、泵、压缩机)等。同样地，出口通道区段(例如，通道区段1208、贮存器1604等)可以被流体地耦接至用于分配细胞的接收容器或导管，以用于随后的处理。再次地，这可以是在微流体装置的主体中限定的贮存器，或者它可以是用于将分配的细胞递送至随后的处理操作、仪器或部件的流体导管。
本文所描述的方法和系统可以用于大大增加单细胞应用和/或接收基于液滴的输入的其他应用的效率。例如，在对被占据的细胞和/或适当尺寸的细胞进行分选之后，可以进行的随后操作可以包括扩增产物的生成、纯化(例如，经由固相可逆固定化(SPRI))、进一步处理(例如，剪切、功能序列的连接和随后的扩增(例如，经由PCR))。这些操作可以批量发生(例如，在分配区外)。在其中分配区是乳液中的液滴的情况下，乳液可以被破坏，并且将液滴的内容物汇集用于另外的操作。可以连同携带条形码的珠一起共分配的另外的试剂可以包括阻断核糖体RNA(rRNA)的寡核苷酸和消化来自细胞的基因组DNA的核酸酶。可选择地，可以在另外的处理操作期间应用rRNA去除剂。通过这样的方法生成的构建体的构型可以有助于在测序期间最小化(或避免)对聚-T序列进行测序和/或测序多核苷酸序列的5’末端。可以对扩增产物(例如，第一扩增产物和/或第二扩增产物)进行测序用于序列分析。在一些情况下，可以使用测序用部分发夹扩增(Partial Hairpin Amplification forSequencing；PHASE)方法来进行扩增。
多种应用需要生物颗粒群体内不同生物颗粒或生物体类型的存在的评估和其定量，包括例如微生物菌群分析和表征、环境测试、食品安全测试、流行病学分析，例如，追踪污染等。
计算机控制系统
本公开内容提供了被编程为实现本公开内容的方法的计算机控制系统。图18示出了计算机系统1801，其被编程或以其他方式被配置成(i)通过在每个液滴中包括场可吸引的颗粒并且施加力场来将被占据的液滴与未被占据的液滴分选开，(ii)通过施加压力脉冲来将被占据的液滴与未被占据的液滴分选开，(iii)通过施加力场使用场可吸引的颗粒来将被占据的颗粒(例如，细胞珠)与未被占据的颗粒分选开，(iv)通过施加压力脉冲来将被占据的颗粒(例如，细胞珠)与未被占据的颗粒分选开，(v)选择性地聚合被占据的液滴，和/或(vi)选择性地聚合适当尺寸的液滴。计算机系统1801可以调整本公开内容的各个方面，诸如例如将单个生物颗粒定时暴露于多种化学或生物操作，调整微流体结构中一个或更多个通道中的流体流速，调整由一个或更多个场施加单元所施加的场强，调整由一个或更多个压力施加单元所施加的压力脉冲，和/或调整聚合应用单元的时间安排。计算机系统1801可以是用户的电子设备或相对于该电子设备远程定位的计算机系统。电子设备可以是移动电子设备。
计算机系统1801包括中央处理单元(CPU，在本文中也被称为“处理器”和“计算机处理器”)1805，其可以是单一核心或多核心处理器，或用于并行处理的多个处理器。计算机系统1801还包括存储器或存储器位置1810(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)、电子存储单元1815(例如，硬盘)、用于与一个或更多个其他系统通信的通信界面1820(例如，网络适配器)和外围设备1825，诸如高速缓冲存储器、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器1810、电子存储单元1815、界面1820和外围设备1825与CPU 1805通过通信总线(实线)，诸如主板(motherboard)通信。电子存储单元1815可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统1801可以借助于通信界面1820来可操作地耦接至计算机网络(“网络”)1830。网络1830可以是因特网(Internet)、互联网(internet)和/或外联网、或与因特网通信的内联网和/或外联网。在一些情况下，网络1830为电信和/或数据网络。网络1830可以包括一个或更多个计算机服务器，这可以实现分布式计算，诸如云计算。在一些情况下，借助于计算机系统1801，网络1830可以实现对等网络(peer-to-peernetwork)，其可以使得耦接至计算机系统1801的设备能够作为客户端或服务器运作。
CPU 1805可以执行一系列的机器可读指令，该机器可读指令可以以程序或软件来体现。指令可以被存储于存储器位置，诸如存储器1810中。指令可以被引导至CPU 1805，其可以随后编程或以其他方式配置CPU 1805，以实现本公开内容的方法。由CPU 1805执行的操作的实例可以包括撷取、解码、执行和写回。
CPU 1805可以是电路的一部分，诸如集成电路。系统1801的一个或更多个其他部件可以被包含在该电路中。在一些情况下，电路是专用集成电路(ASIC)。
电子存储单元1815可以存储文件，诸如驱动程序、文库和保存的程序。电子存储单元1815可以存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。在一些情况下，计算机系统1801可以包括一个或更多个另外的数据存储单元，该数据存储单元在计算机系统1801的外部，诸如位于通过内联网或因特网与计算机系统1801通信的远程服务器上。
计算机系统1801可以通过网络1830与一个或更多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统1801可以与用户(例如，操作者)的远程计算机系统通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)、板型或平板PC(例如，iPad、/>Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如，/>iPhone、Android支持的设备、/>)或个人数字助理。用户可以经由网络1830访问计算机系统1801。
如本文所描述的方法可以通过机器(例如，计算机处理器)可执行代码的方式实现，该机器可执行代码被存储在计算机系统1801的电子存储位置，诸如，例如存储器1810或电子存储单元1815上。机器可执行代码或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，代码可以由处理器1805执行。在一些情况下，代码可以从电子存储单元1815检索并且存储在存储器1810上，以用于由处理器1805即时访问。在一些情况下，可以排除电子存储单元1815，并且将机器可执行指令存储于存储器1810上。
代码可以被预编译并且被配置成用于与具有适合于执行该代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行时间期间被编译。代码可以以编程语言的形式提供，该编程语言可以被选择以使得代码能够以预编译的或按编译原样(as-compiled)的方式执行。
本文所提供的系统和方法的各方面，诸如计算机系统1801，可以以编程来体现。技术的各个方面可以被认为是通常呈机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式的“产品”或“制品”，所述数据以机器可读介质的类型来承载或体现。机器可执行代码可以被存储于电子存储单元诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘上。“存储”型介质可以包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器，或其相关模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以在任何时间为软件编程提供非暂时性存储。软件的所有或部分有时可以通过因特网或各种其他电信网络进行通信。例如，这样的通信可以使得能够将软件从一个计算机或处理器加载到另一个计算机或处理器，例如，从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以携带软件元件的另一种类型的介质包括诸如跨越本地设备之间的物理界面、通过有线和光纤陆线网络以及在各种空中链路(air-links)上所使用的光波、电波和电磁波。携带这样的波的物理元件，诸如有线或无线链路、光链路等，也可以被认为是携带软件的介质。如本文中所使用的，除非限于非暂时性的、有形的“储存”介质，否则术语诸如计算机或机器“可读介质”指的是参与将指令提供至处理器用于执行的任何介质。
因此，机器可读介质，诸如计算机可执行代码，可以采取许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括，例如光盘或磁盘，诸如在任何计算机等中的任何存储设备，诸如可以用于实现附图中示出的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这样的计算机平台的主存储器。有形的传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括构成计算机系统内的总线的导线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间生成的那些。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘(floppy disk)、软磁盘(flexible disk)、硬盘、磁带、任何其他磁介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、具有孔图案的任何其他物理存储器介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或盒、传输数据或指令的载波、传输这样的载波的缆线或链路，或者计算机可以从其读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些计算机可读介质的形式中的许多形式可以涉及向处理器传送一个或更多个指令的一个或更多个序列以用于执行。
计算机系统1801可以包括电子显示器1835或与电子显示器1835通信，该电子显示器1835包含用户界面(UI)1840，用于提供例如流体控制选项(例如，流体流速、施加聚合源(例如，光)的时间安排、电力场的磁强度、压力脉冲的强度和/或频率等)。UI的实例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网络的用户界面。
本公开内容的方法和系统可以通过一个或更多个算法来实现。算法可以在由中央处理器1805执行后通过软件来实现。所述算法可以例如(i)通过在每个液滴中包括场可吸引的颗粒并且施加力场来将被占据的液滴与未被占据的液滴分选开，(ii)通过施加压力脉冲来将被占据的液滴与未被占据的液滴分选开，(iii)通过施加力场使用场可吸引的颗粒来将被占据的颗粒(例如，细胞珠)与未被占据的颗粒分选开，(iv)通过施加压力脉冲来将被占据的颗粒(例如，细胞珠)与未被占据的颗粒分选开，(v)选择性地聚合被占据的液滴，和/或(vi)选择性地聚合适当尺寸的液滴。所述算法还可以例如生成多个液滴，该液滴可以包含或可以不包含生物颗粒(细胞)和/或携带条形码的珠(颗粒)。
虽然本文已经示出和描述本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员将明显的是，此类实施方案仅通过实例的方式提供。并不意图将本发明限制于本说明书中提供的具体实例。虽然已经参考前面提及的说明书描述了本发明，但是本文中的实施方案的描述和说明不意图以限制性意义来解释。本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换而不偏离本发明。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文所阐述的具体描写、配置或相对比例，其取决于多种条件和变量。应当理解，可以在实践本发明时采用本文所描述的本发明实施方案的各种替代方案。因此，预期本发明还应该涵盖任何此类替代方案、修改、变化或等同物。以下权利要求意图界定本发明的范围，并且由此涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。
Claims (18)
1.一种用于分选液滴的方法，包括：
(a)使第一相与第二相接触以生成多个液滴，其中所述第一相和所述第二相是不混溶的，其中所述多个液滴包含场可吸引的颗粒，并且其中所述多个液滴包含(i)第一子集的液滴，所述第一子集的液滴各自包括但不多于一个生物颗粒，和(ii)第二子集的液滴，所述第二子集的液滴各自包括多于一个生物颗粒，其中所述生物颗粒是细胞、细胞的衍生物或细胞的成分；
(b)将所述多个液滴沿着第一通道引导至所述第一通道与第二通道和第三通道的交叉点；以及
(c)在足以将所述第一子集的所述多个液滴中的所有或一部分与所述第二子集的所述多个液滴中的所有或一部分分离的条件下，使包含所述场可吸引的颗粒的所述多个液滴经受电场或磁场，其中在分离后，所述第一子集的所述多个液滴中的所有或所述部分沿着所述第二通道流动，并且所述第二子集的所述多个液滴中的所有或所述部分沿着所述第三通道流动。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述第一子集的所述多个液滴包括具有与其偶联的分子条形码的颗粒。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述具有与其偶联的分子条形码的颗粒是珠。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述珠是凝胶珠。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述第一子集的所述多个液滴中的每个液滴包含比包括多于一个生物颗粒的所述第二子集的所述多个液滴中的每个液滴多的场可吸引的颗粒。
6.如权利要求5所述的方法，其中在所述第一子集上感应的力大于在包括多于一个生物颗粒的所述第二子集的液滴上感应的力。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述场可吸引的颗粒是磁场可吸引的颗粒或电场可吸引的颗粒。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述场可吸引的颗粒是顺磁性颗粒或导电颗粒。
9.如权利要求1所述的方法，还包括在(c)之后，使来源于所述第一子集中的所述生物颗粒的核酸分子经受核酸测序。
10.如权利要求9所述的方法，还包括在(c)之后，使所述第一子集的所述多个液滴经受核酸扩增条件，以产生来自所述第一子集中的所述生物颗粒的所述核酸分子的扩增产物。
11.如权利要求10所述的方法，还包括使所述扩增产物经受核酸测序。
12.如权利要求1所述的方法，其中足以将所述第一子集的所述多个液滴中的所有或所述部分和所述第二子集的所述多个液滴中的所有或所述部分分离的所述电场或磁场的所述条件至少部分地基于所述多个液滴的尺寸和所述第一子集的所述多个液滴中的所述生物颗粒的尺寸之间的比率来确定。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述多个液滴使用压力脉冲沿着所述第一通道被引导。
14.如权利要求1所述的方法，还包括使所述第一子集的所述多个液滴中的单独的液滴经受刺激，以促进所述生物颗粒中的聚合。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述刺激在所述交叉点之前被施加。
16.如权利要求14所述的方法，还包括(i)检测所述单独的液滴，以及(ii)在检测所述单独的液滴后，使所述单独的液滴经受所述刺激。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述生物颗粒是封闭在聚合物基体内或构成聚合物基体的细胞。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述生物颗粒是封闭在凝胶内或构成凝胶的细胞。
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