JP5738597B2 - 核酸の配列決定のためのシステムおよび方法 - Google Patents

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    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation

Description

政府の資金拠出
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによって与えられたＤＭＲ−０６０２６８４の下で、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
関連出願
この出願は、２００７年１２月２１日に出願された、Ｗｅｉｔｚらによる表題「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」の米国仮特許出願第６１／００８，８６２号、および２００８年９月１９日に出願された、Ｗｅｉｔｚらによる表題「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」の米国仮特許出願第６１／０９８，７１０号（各々、参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
発明の分野
本発明は、流体液滴中で核酸を配列決定することを含む、核酸を配列決定するためのシステムおよび方法に関する。
核酸配列を決定する能力は、遺伝子の機能および制御の理解などの用途のために、または分子生物学の基本的技法の多くを利用するために重要である。ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）は、最近開発されたＤＮＡ配列決定への手法である。ハイブリダイゼーションによる配列決定では、大規模なセットの１本鎖断片またはプローブを基質に付着させる。標識１本鎖標的ＤＮＡ断片の溶液を基質に曝露する。これらの断片は基質上で相補的断片とハイブリダイズして、ハイブリダイズされた断片は、選択された標識に応じて検出装置または蛍光／リン光染料を使用して識別することができる。次に、チップを用いて、断片のハイブリダイゼーションのパターンに基づいて標的ＤＮＡを配列決定する。しかし、現在のＳＢＨ技法は、比較的大量の試薬を必要とすること、またはスループットが比較的小さいことなどの、その用途を制限するいくつかの問題を有している。
本発明は、流体液滴中で核酸を配列決定することを含む、核酸を配列決定するためのシステムおよび方法に関する。本発明の主題は、いくつかの場合において、相関した生成物、特定の問題に対する別の解決策、ならびに／または１つ以上のシステムおよび／もしくは物品の複数の異なる効果を含む。
一態様において、本発明は方法に関する。第１のセットの実施形態により、本発明は、核酸プローブおよび少なくとも３つの区別可能な識別要素を含有する第１のマイクロ流体液滴を提供する行為と、標的核酸を含む第２のマイクロ流体液滴を提供する行為と、第１のマイクロ流体液滴および第２のマイクロ流体液滴を融合して融合液滴を形成する行為とを含む。別のセットの実施形態において、方法は、少なくとも３つの区別可能な識別要素を含むマイクロ流体液滴を提供する行為と、液滴を変形させて、少なくとも３つの識別要素それぞれが標的区域を個別に通過するように液滴に標的区域を通過させる行為と、標的区域を通過する少なくとも３つの識別要素それぞれを決定する行為とを含む。




また別のセットの実施形態による方法は、液滴に第１の識別要素と、第１の識別要素と区別可能な第２の識別要素と、第１の識別要素および第２の識別要素から区別可能な第３の識別要素を添加することによって、核酸プローブを含有する液滴の少なくとも一部を測定する行為を含む。
１セットの実施形態において、方法は、識別要素が要素のうち少なくとも２つをそれぞれ有する少なくとも３つの群に分類される、少なくとも６つの識別要素を定義する行為と、少なくとも８つの区別可能な種のそれぞれを、８つの区別可能な種のうち２つが識別要素の同じセットと関連しないように、少なくとも３つの群それぞれから選択される少なくとも１つの識別要素と関連付ける行為と、少なくとも８つの異なる種のうち１つおよび少なくとも３つの群それぞれから得た関連付けた要素をそれぞれ含有する、少なくとも８つの区別可能な液滴を調製する行為とを含む。
なお別のセットの実施形態において、方法は、複数の区別可能な核酸プローブおよび複数の区別可能な識別要素を提供する行為と、複数の区別可能な核酸プローブから少なくとも１個の核酸プローブと、複数の区別可能な識別要素から少なくとも３つの区別可能な識別要素を選択する行為と、選択した１個の核酸プローブおよび少なくとも３つの区別可能な識別要素を含有する流体液滴を形成する行為と、少なくとも１０の区別可能な流体液滴を含む、流体液滴の集団を形成するために選択工程および形成工程を反復する行為とを含む。いくつかの場合において、各液滴は少なくとも１個の核酸プローブおよび少なくとも３つの区別可能な識別要素を含有する。
別の態様において、本発明はキットに関する。いくつかの場合において、キットは、核酸プローブをそれぞれ含有する第１の複数の少なくとも１０の区別可能な流体液滴と、少なくとも３つの区別可能な識別要素をそれぞれ含有する第２の複数の少なくとも１０の区別可能な流体液滴とを含む。
本発明の他の利点および新規の特徴は、添付図面と併せて考慮したときに、本発明の各種の非限定的な実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。本明細書および参考文献に含まれる文書が相反するおよび／または一致しない開示を含む場合、本明細書が優先するものとする。参考文献に含まれる２つ以上の文書が相互に対して相反するおよび／または一致しない開示を含む場合には、発効日が遅いほうの文書が優先するものとする。
本発明の非限定的な実施形態は、添付図面を参照して一例として説明され、添付図面は概略的であり、原寸に比例して描かれるものではない。図面において、図解された同一またはほぼ同一の各構成要素は、通例、１つの数字によって表される。明瞭さを期するために、すべての構成要素がすべての図で番号付けされているわけではなく、当業者に本発明を理解させるために図解が必要でない場合には、本発明の各実施形態のすべての構成要素が示されているわけでもない。
図１は、本発明の一実施形態において標的核酸を配列決定する方法を示す。 図２Ａ〜図２Ｆは、核酸プローブの非限定的な例を示す。 図３は、本発明の別の実施形態において標的核酸を配列決定する方法を示す。 図４は、本発明の別の実施形態において標的核酸を配列決定するまた別の方法を示す。 図５は、液滴の集合の調製の例を示す。 図６Ａは、標的核酸を配列決定する方法の非限定的な例を示す。 図６Ｂは、標的核酸を配列決定する方法の非限定的な例を示す。 図６Ｃは、標的核酸を配列決定する方法の非限定的な例を示す。 図６Ｄは、標的核酸を配列決定する方法の非限定的な例を示す。 図７Ａは、標的核酸を配列決定する方法の非限定的な例を示す。 図７Ｂは、標的核酸を配列決定する方法の非限定的な例を示す。 図７Ｃは、標的核酸を配列決定する方法の非限定的な例を示す。 図８Ａは、標的核酸を配列決定する方法の非限定的な例を示す。 図８Ｂは、標的核酸を配列決定する方法の非限定的な例を示す。 図８Ｃは、標的核酸を配列決定する方法の非限定的な例を示す。 図８Ｄは、標的核酸を配列決定する方法の非限定的な例を示す。 図８Ｅは、標的核酸を配列決定する方法の非限定的な例を示す。 図８Ｆは、標的核酸を配列決定する方法の非限定的な例を示す。 図８Ｇは、標的核酸を配列決定する方法の非限定的な例を示す。 図９Ａ〜図９Ｃは、本発明のいくつかの実施形態における蛍光偏光（ＦＰ）検出に関する情報を表す。 図１０は、本発明の一実施形態における実験装置の非限定的な例を示す。 図１１は、本発明の別の実施形態における実験装置の非限定的な例を示す。 図１２Ａ〜図１２Ｂは、識別要素としての液体標識を利用する例を示す。 図１３Ａ〜図１３Ｂは、ある実施形態において蛍光強度および蛍光偏光が独立して制御され得ることを示す。 図１４は、本発明の一実施形態における、液滴内に発生したＤＮＡの連結の例を示す。 図１５は、別の実施形態による標識核酸プローブを使用する連結アッセイの結果を示す。 図１６Ａ〜図１６Ｅは、本発明の一実施形態における第１および第２の核酸を連結する方法を表す。 図１７Ａは、いくつかの実施形態による、本発明の１つの方法で使用され得る第１の群の核酸プローブおよび第２の群の核酸プローブを表す。 図１７Ｂは、一実施形態による、図１７Ａに表した第１の群の核酸プローブからの第１の核酸プローブおよび第２の群の核酸プローブからの第２の核酸プローブを組み合せることによって形成され得る複数の液滴を表す。 図１８Ａは、単一のマイクロ流体チャネルにおいて、液滴中の信号発信実体（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｅｎｔｉｔｙ）および／または識別要素が１つずつ決定されることを表す。 図１８Ｂおよび図１８Ｃは、複数のチャネルまたは封じ込め区域それぞれにおいて、複数の液滴中の信号発信実体および／または識別要素が１つずつ決定されることを表す。 図１８Ｂおよび図１８Ｃは、複数のチャネルまたは封じ込め区域それぞれにおいて、複数の液滴中の信号発信実体および／または識別要素が１つずつ決定されることを表す。 図１９は、一実施形態による複数の液滴へと形成される複数の標的核酸を含む溶液を示す。 図２０Ａおよび図２０Ｂは、第１および第２のマイクロ流体液滴が融合するようにチャネル内に流入した画像を示す。 図２１は、本発明の一実施形態における、液滴を融合するために使用したプロセスの概略図を示す。 図２２は、遅延ラインにおける融合した複数の液滴のインキュベーションを示す。 図２３は、本発明の一実施形態による、融合液滴の速度の、インキュベーションチャネルに沿った位置に対するグラフを示す。 図２４は、発明の一実施形態による、ハイブリダイゼーションを測定するために使用されるシステムの写真を示す。 図２５Ａは、図２４に記載したシステムに類似したシステムの概略図を示す。図２５Ｂは、図２５Ａに示すシステムのようなシステムを使用して液滴を測定するときに、観察され得る蛍光偏光を示す。 図２６は、一実施形態による、測定の間に液滴が変形を受けるシステムの写真を示す。 図２７Ａ〜図２７Ｄは、一実施形態による、各種の強度の検出に基づく液滴の検出を示す。 図２７Ａ〜図２７Ｄは、一実施形態による、各種の強度の検出に基づく液滴の検出を示す。 図２７Ａ〜図２７Ｄは、一実施形態による、各種の強度の検出に基づく液滴の検出を示す。 図２７Ａ〜図２７Ｄは、一実施形態による、各種の強度の検出に基づく液滴の検出を示す。 図２８は、一実施形態による、本発明の方法を使用して調製および測定した緑色および／または赤色染料を含む複数の液滴のプロットを示す。 図２９は、本発明のいくつかの実施形態による、ｉ）標的核酸が存在しない、ｉｉ）ミスマッチ標的核酸が存在する、およびｉｉｉ）マッチ標的核酸が存在する、３ｕＭテンプレートの結合アッセイの結果を示す。 図３０は、一実施形態による、第１の群の核酸プローブからの第１の核酸プローブおよび第２の群の核酸プローブからの第２の核酸プローブを含むライブラリの概略図を示す。 図３１Ａは、一実施形態による、異なる濃度の異なる染料を含む４つの群の液滴を産生するために使用され得るマイクロ流動装置の概略図を示す。 図３１Ｂは、図３１Ａに示す装置を使用して形成された複数の液滴の産生を示すムービーの最初のフレームの画像を示す。 図３２は、一実施形態による、複数の種類の液滴を混合することにより形成された液滴のエマルジョンの概略図を示す。 図３３Ａおよび図３３Ｂは、本発明のいくつかの実施形態による、第１の核酸プローブ、第２の核酸プローブ、および標的核酸を含む複数の液滴の形成を示す。 図３４は、一実施形態による、マイクロ流体液滴を通じた光の屈折および液滴像の表面に出現する生じた液滴のグレアの概略図を示す。 図３５は、一実施形態による、液滴グレアを生成するために使用され得る実験装置の例を表す。 図３６Ａは、一実施形態による、２つの３ｍｅｒ核酸プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションを示す。図３６Ｂは、図３６Ａに示した２つの３ｍｅｒ核酸プローブの連結を示す。 図３７は、一実施形態による、緑色波長フィルタの下での液滴グレアを含む複数のマイクロ流体液滴のＣＣＤカメラ・ビデオ・キャプチャからの静止画像を示す。 図３８は、一実施形態による、液滴グレアを含む複数の液滴のＣＣＤカメラ静止画像の強度閾値を示す。 図３９Ａおよび図３９Ｂは、液滴グレアを含む複数の液滴の蛍光強度読み取り値でそれぞれ生成された、マスクおよびマスクオーバーレイを示す。 図４０および図４１は、一実施形態による、緑色フィルタカメラおよび赤色フィルタカメラそれぞれからの複数の液滴の画像を示す。 図４０および図４１は、一実施形態による、緑色フィルタカメラおよび赤色フィルタカメラそれぞれからの複数の液滴の画像を示す。 図４２は、２つの別個の液滴の集団を示す、図４０および４１それぞれからの緑色および赤色カメラデータのオーバーレイを含む合成画像を示す。 図４３は、一実施形態による、図４２に示すような画像からの秒でサンプリングしたデータ点での強度カウントのヒストグラムを示し、（Ａ）緑色チャネルおよび（Ｂ）赤色チャネルは二峰性分布を示す。 図４４は、２つの別個の蛍光強度集団がある、複数のマイクロ流体液滴の蛍光強度のＣＣＤカメラからの静止画像キャプチャを示す。 図４５は、液滴グレアを含む２つの別個の蛍光強度集団がある、複数の液滴の蛍光強度のＣＣＤカメラからの静止画像キャプチャを示す。
配列の簡単な説明
配列番号１は、合成ＤＮＡ配列のＡＣＴＴＣＧである；
配列番号２は、合成ＤＮＡ配列の＊ＧＡＴＣＣであり、＊は信号発信実体である；
配列番号３は、合成ＤＮＡ配列のＧＡＴＣＴＧＮＮＮＮであり、Ｎはユニバーサル塩基である；
配列番号４は、合成ＤＮＡ配列のＣＡＴＡＴＣである；
配列番号５は、合成ＤＮＡ配列のＧＡＴＣＴＮＧＮＮＮであり、Ｎはユニバーサル塩基である；
配列番号６は、合成ＤＮＡ配列のＣＸＡＣＡＴＣであり、Ｘは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴの１つである；
配列番号７は、合成ＤＮＡ配列のＧＡＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＣＣＣＴＴＧＴＣＴＡＣＣＣＴＧＴＧＣＧＴＣＣＣＴＡＣＴＣＴＡＣＣである；
配列番号８は、合成ＤＮＡ配列のビオチン−ＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧである；
配列番号９は、合成ＤＮＡ配列のＣＴＡＡＧＴＴＡである；
配列番号１０は、合成ＤＮＡ配列のＣＴＮＡＧＮＴＡであり、Ｎはユニバーサル塩基である；
配列番号１１は、合成ＤＮＡ配列のＣＴＡＮＮＴＴＡであり、Ｎはユニバーサル塩基である；
配列番号１２は、合成ＤＮＡ配列のＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＣＣＡＴである。
本発明は、流体液滴中で核酸を配列決定することを含む、核酸を配列決定するためのシステムおよび方法に関する。１セットの実施形態において、本発明は、マイクロ流体液滴などの液滴を使用するハイブリダイゼーションによる配列決定を利用する。いくつかの実施形態において、標的核酸、核酸プローブ、および少なくとも１つの識別要素、たとえば蛍光粒子を含む液滴が形成される。標的核酸にハイブリダイズする核酸プローブは、いくつかの例において、少なくとも１つの識別要素を決定することによって決定される。標的核酸にハイブリダイズする核酸プローブを使用して、標的核酸の配列が決定され得る。ある例において、マイクロ流体液滴は核酸プローブを修飾する試薬と共に提供される。いくつかの場合において、上述のような液滴は、液滴の構成要素が標的区域を個別に通過するように変形される。
一態様において、本発明は、標的核酸を配列決定するためのシステムおよび方法に関する。各種の実施形態において、標的核酸は、複製され、核酸プローブ、識別要素なども含有し得る複数の流体液滴中に含有され得る。以下で詳細に議論するように、流体液滴中の核酸プローブを決定することによって、標的核酸の配列が決定され得る。一実施形態において、本発明は、核酸プローブおよび少なくとも１つの識別要素を含むマイクロ流体液滴を提供する工程と、標的核酸を含む第２のマイクロ流体液滴を提供する工程と、第１のマイクロ流体液滴および第２のマイクロ流体液滴を融合して融合液滴を形成する工程とを含む、マイクロ流体液滴を提供する方法に関する。いくつかの場合において、方法は、核酸プローブおよび標的核酸が共に溶解したままであり、たとえば水素結合、塩基対合などの非共有相互作用を通じて比較的安定な２本鎖を形成して、溶解している間にただちに分離しないように、核酸プローブが標的核酸と結合しているか否かを決定する工程をさらに含む。いくつかの例において、核酸プローブは標的核酸分子にハイブリダイズし得る。さらに、いくつかの場合において、少なくとも１つの識別要素の同一性が決定され得る。
非限定的な例として、第１の実施形態を図１に示す。本図において、核酸プローブ１１および少なくとも１つの識別要素１２を含有する第１の流体液滴１０が提供される。さらに、本実施例において、標的核酸１４を含有する第２の流体液滴１３が提供される。第１の流体液滴は第２の流体液滴と融合して、矢印１００によって示すように、融合流体液滴１５を形成する。いくつかの場合において、核酸プローブ１１は、矢印１０１によって示すように標的核酸１４と結合するようになり得て、標的核酸と核酸プローブとの結合は、矢印１０２によって示すように決定され得る。たとえば、核酸プローブおよび標的核酸配列は、相補的配列または実質的な相補的配列のために結合１６するようになり得る。いくつかの場合において、核酸プローブの配列は、以下で詳細に議論するように、少なくとも１つの識別要素１２（矢印１０３および１０４によって示される）を決定することによって、標的核酸の少なくとも一部の配列を決定するために決定され得る。
いくつかの場合において、液滴の集合が使用され、該液滴は区別可能な核酸プローブおよび／または識別要素を含む。たとえば識別要素を使用することによって、標的核酸と区別可能な核酸プローブとの結合を測定することにより、標的核酸の配列が決定され得る。通例、流体液滴それぞれに含有される標的核酸配列のすべてが核酸プローブのすべてと結合するわけではなく、標的核酸と結合することができる核酸プローブを決定することによって、標的核酸の配列が決定され得る。液滴の集合を調製する方法は、以下でさらに詳細に議論される。
言及したように、本発明の各種の実施形態は、流体液滴中に核酸および／または他の種を含有することに関する。本明細書で使用するように、「流体」は、その普通の意味、すなわち流動してその容器の輪郭に従う傾向のある物質を示す。通例、流体は、静的剪断応力に耐えられない物質であり、剪断応力が印加されると、流体は継続的および永久的な歪みを受ける。それゆえ流体は、いくつかの場合において、流体の少なくとも多少の流動を可能にする任意の好適な粘度を有し得る。流体の非限定的な例は液体および気体を含むが、自由流動固体粒子、粘弾性流体なども含み得る。
「液滴」は、本明細書で使用するように、第２の流体に完全に包囲されている第１の流体の単離された部分である。液滴は必ずしも球形ではないが、たとえば外部環境に応じて同様の他の形状をとり得ることに注目すべきである。一実施形態において、液滴は、液滴が中に位置する流体流に垂直なチャネルの最大寸法に実質的に等しい最小断面寸法を有する。液滴の直径は、非球形液滴では、非球形液滴と同じ体積を有する完全な数学的球の直径である。
流体液滴は、任意の好適な技法を使用して形成され得る。たとえば、液滴は、液体を撹拌または振とうして個々の液滴を形成すること、個々の液滴を含有する懸濁液またはエマルジョンを生成すること、またはピペッティング技法、針などによって液滴を形成することによって形成され得る。液滴の生成の他の非限定的な実施例は、それぞれ参照により本明細書に組み入れられている、Ｓｔｏｎｅらによる“Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｆｌｕｉｄ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ”という名称の、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００５／０１７２４７６として２００５年８月１１日に公開され、２００４年１２月２８日に出願されたＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．１１／０２４，２２８；Ｌｉｎｋらによる“Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ”という名称の、２００６年７月２７日にＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００６／０１６３３８５として公開され、２００５年１０月７日に出願されたＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．１１／２４６，９１１；またはＬｉｎｋらによる“Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ”という名称の、２００７年１月４日にＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００７／０００３４４２として公開され、２００６年２月２３日に出願されたＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．１１／３６０，８４５、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ”という名称の、２００８年６月２６日に公開されたＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００７９４１に開示されている。
本発明の各種の実施形態は、複数または一連の流体液滴を使用する。流体液滴は、多分散系（たとえば一連の異なるサイズを有する）であり得る、またはいくつかの場合では、流体液滴は、たとえば液滴の約１０％、約５％、約３％、約１％、約０．０３％、または約０．０１％以下が、平均直径の約１０％、約５％、約３％、約１％、約０．０３％、または約０．０１％を超える平均直径を有するように、たとえば直径の均質分散を有する単分散系または実質的に単分散系であり得る。液滴の集団の「平均直径」は、本明細書で使用するように、液滴の直径の算術平均である。当業者は、たとえばレーザ光散乱または他の公知の技法を使用して、液滴の集団の平均直径を測定できるであろう。非限定的な例として、液滴の平均直径は、約１ｍｍ未満、約５００マイクロメートル未満、約２００マイクロメートル未満、約１００マイクロメートル未満、約７５マイクロメートル未満、約５０マイクロメートル未満、約２５マイクロメートル未満、約１０マイクロメートル未満、または約５マイクロメートル未満であり得る。液滴の平均直径は、ある場合では、少なくとも約１マイクロメートル、少なくとも約２マイクロメートル、少なくとも約３マイクロメートル、少なくとも約５マイクロメートル、少なくとも約１０マイクロメートル、少なくとも約１５マイクロメートル、または少なくとも約２０マイクロメートルでもあり得る。
流体液滴は、配列決定される標的核酸を含有し得て、標的核酸は任意の好適な核酸であり得る。たとえば、標的核酸は、生物学的実体、たとえばタンパク質、酵素、抗体、受容体、リボザイム、リボソームなど、および／またはその一部をコードする核酸であり得る。別の実施例として、標的核酸は、調節配列または非コード配列、たとえば低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡなどであり得る。標的核酸は、長さが任意の数のヌクレオチド、たとえば長さが約２５、約５０、約６０、約６４、約７０、約８０、約９０、約１００、約２００、約４００、約８００、約１６００、約３２００、約６４００、またはなおそれ以上のヌクレオチドであり得る。標的核酸（および本明細書に記載するような他の種類の核酸）の非限定的な例は、天然源から単離され得る、組換え産生され得る、人工的に合成され得るなどのリボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、またはその混合物もしくはコポリマーを含む。核酸は、残基、たとえばアデノシンすなわち「Ａ」、チミジンすなわち「Ｔ」、グアノシンすなわち「Ｇ」、シチジンすなわち「Ｃ」、またはウリジンすなわち「Ｕ」、または他の残基、たとえば以下で詳細に議論するユニバーサル残基を含有し得る。核酸は、ハイブリダイゼーションを促進するために２本鎖または１本鎖であり得る。さらに、核酸は実質的にいずれの源からも得ることができる。たとえば、核酸は、細胞またはウイルスから単離され得る、在来の化学合成を使用して合成され得る、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して合成され得るなどである。
液滴内に含有された標的核酸は次に、核酸プローブおよび／または１つ以上の識別要素に露出され得る。たとえば、先に議論したように、標的核酸を含有する流体液滴は、核酸プローブおよび少なくとも１つの識別要素を含有する第２の流体液滴と融合され得る。液滴を共に融合する各種の技法を下でさらに詳細に議論する。
核酸プローブは、ある実施形態において、標的核酸内のある配列を決定するために一般に使用される。しばしば、標的核酸の短い部分は、核酸プローブ、たとえば約２０未満の残基の、約１５未満の残基の、約１０未満の残基の、９未満の残基の、８未満の残基の、７未満の残基の、６未満の残基の、５未満の残基の、４未満の残基などの配列と結合することができる。残基は標的核酸内で通例隣接しているが、下で議論するようにいくつかの場合では、標的核酸内の残基のいくつかは必ずしも隣接していない。いくつかの実施形態において、核酸プローブは、標的核酸配列の少なくとも一部を認識することができ、標的核酸の認識された部分と同じ長さを有することが多い、核酸残基の比較的短い配列を含有し得る。たとえば核酸プローブは、いくつかの場合では約２０未満のヌクレオチドもしくは約１０ヌクレオチド未満の長さを、または上述のような長さを有する配列を有し得る。１つの場合において、核酸プローブ配列の長さは４残基であり得る（たとえば図２Ａを参照）。別の場合では、長さは５残基であり得る（たとえば図２Ｂを参照）。また別の場合では、長さは６残基であり得る（たとえば図２Ｃを参照）。核酸プローブ内の核酸プローブ配列は隣接し得るか、または配列は非隣接であり得る。たとえば、ユニバーサル残基またはギャップが存在し得る。いくつかの例において、核酸プローブは、信号発信実体、たとえば放射性同位体によって、または蛍光タグによって（たとえば図２Ｄ）などのある方式で標識され得る。各種の信号発信実体および核酸プローブの他の例は、下でさらに詳細に議論されるであろう。
核酸プローブは、プローブの少なくとも一部が標的核酸配列に対して相補的または少なくとも相補的な配列を含有するように選択され得る。たとえば、一実施形態において、核酸プローブ配列は、あるサイズまたは数（またはサイズもしくは数の範囲）の核酸残基の各順列が示されて、それによりこれらの核酸プローブ配列の少なくとも１つが標的核酸に対して実質的に相補的であるように選択される。本明細書で使用するように、第２の配列に対して「実質的に相補的」である第１の配列は、第１および第２の配列の少なくとも約７５％が相補的である（たとえばワトソン−クリック相補的対形成によって、または場合によりＧ：Ｕゆらぎも含む）および／または配列が最大で１または２塩基ミスマッチを含む配列である。いくつかの実施形態において、２つの配列は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％相補的であり得る。
いくつかの実施形態において、複数の区別可能なまたは同一でない核酸プローブ、たとえば核酸プローブ内に含有される残基の配列に１つ以上の相違を有する核酸プローブが使用される。たとえば、複数の流体液滴が使用され得て、流体液滴は特異的な核酸プローブ配列をそれぞれ含有し得る。流体液滴は、（核酸プローブの複数のコピーが存在し得るが）各流体液滴が唯一の核酸プローブを含有するように調製され得る。さらにいくつかの場合で、異なる流体液滴は、（たとえば多少の冗長性を持たせて、各流体液滴が液滴の所与の集団または集合において必ずしも唯一ではないようにするために）同じまたは異なる核酸プローブ配列を独立して含有し得る。
いくつかの場合で、核酸プローブをたとえば信号発信実体によって標識することができる。信号発信実体は、下で議論する方法などの検出方法を使用していくつかの方式で決定され得る。信号発信実体は核酸内の任意の好適な位置に、たとえば核酸プローブの核酸配列の５’末端部位、３’末端部位に、または核酸プローブ内の内部部位に含まれ得る。いくつかの場合で、信号発信実体は、核酸プローブが標的核酸配列と結合されないときと比較して、核酸プローブが標的核酸と結合されるときに、異なるシグナルを生成する（またはシグナルを生成しない）ように選択することができる。信号発信実体は、これに限定されるわけではないが、蛍光染料、化学発光実体、放射性標識、同位体、たとえば非放射性同位体または質量分析法によって検出可能な同位体（たとえばエレクトロフォア質量標識（ＥＭＬ））、標識抗体への特異的結合パートナーとして作用できるリガンド、酵素、標識リガンドの特異的結合パートナーとして作用できる抗体、抗原、特異的反応性を有する基、および／または電気化学的に検出可能な部分を含むことができる。蛍光信号発信実体の非限定的な例は、フルオレセイン、ローダミン、またはヘキサクロロフルオレセインを含む。当業者は、ただちに商業的に入手できる他の蛍光実体を認識するであろう。信号発信実体のまた他の例は、本明細書で詳細に議論する。
たとえば一実施形態において、核酸プローブは、核酸残基の配列、信号発信実体、および消光剤（ｑｕｅｎｃｈｅｒ）または増感剤（ｅｎｈａｎｃｅｒ）を含むことができる（たとえば図２Ｅに示すように、シグナル伝達プローブはＳで示し、消光剤はＱで示す）。信号発信実体は、たとえば蛍光実体であり得て、核酸プローブの任意の場所に配置され得る、たとえば核酸配列の５’末端に共有結合され得る。各種の実施形態において核酸プローブとして使用するのに潜在的に好適な蛍光実体の非限定的な例は、６−カルボキシフルオレセインおよびテトラクロロフルオレセインを含む。消光剤または増感剤は、ある方式で、たとえば信号発信実体の決定を個別に抑制または促進することによって、信号発信実体に影響を及ぼすことができる任意の実体であり得る。たとえば、核酸プローブ内に蛍光信号発信実体および消光剤が近接していることは、信号発信実体の蛍光が部分的または完全に抑制できるようなことであり得るのに対して、増感剤を信号発信実体に近接して配置すると、増感剤は蛍光信号発信実体の蛍光を増強することが可能であり得る。消光剤または増感剤はまた、核酸プローブの任意の位置に配置され得て、たとえば核酸配列の３’末端に結合され得る。消光剤の非限定的な例は、テトラメチルローダミンおよびジヒドロシクロピロロインドールトリペプチドを含む。
非限定的な例として、消光剤（または同様に増感剤）は、核酸プローブ中の信号発信実体内で以下のように使用することができる。標的核酸と結合した核酸プローブは、ある酵素または他の種、たとえばＴａｑポリメラーゼなどのポリメラーゼの作用によって、標的核酸から除去または解離され得る。たとえば、いくつかの場合で、ポリメラーゼは、核酸プローブ内の核酸配列の分解を引き起こし得て、それにより信号発信実体および／または消光剤もしくは増感剤の放出を生じさせ得て、消光剤または増感剤はもはや、信号発信実体に近接していないか、または信号発信実体に少なくとも実質的に影響を及ぼさない可能性がある。それゆえ核酸プローブの分解は、信号発信実体の変化を決定することによって決定することができる。これに対して、核酸プローブが標的核酸と十分に結合しない系では（たとえば十分な相補的配列が存在しない場合）、ポリメラーゼまたは他の種の作用による核酸プローブの分解は起こらず（たとえば標的核酸と核酸プローブとの間に存在する結合がごく一時的または短期間であるために、酵素作用が発生しない）、それゆえ信号発信実体のシグナルの著しい変化を決定できなかった。したがって、一実施形態において、Ｔａｑポリメラーゼなどのポリメラーゼが、核酸プローブおよび標的核酸を含む流体液滴に供給され得る。ポリメラーゼは、本明細書で議論するような任意の好適な技法を使用して流体液滴に供給され得る。
いくつかの場合で、核酸プローブは、少なくとも１つのロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）残基を含み得る（たとえば図２Ｆを参照）。ロックド核酸残基は、天然発生型核酸残基に類似した化学的形状を有する核酸類似体（たとえば相補的残基と２個または３個の水素結合を形成することができる）であるが、天然発生型核酸残基と同数の次元で自由に回転することができない。たとえば、いくつかの場合で、ロックド核酸残基は、２’−Ｏ、４’−Ｃメチレンブリッジを含有し得て、メチレンブリッジは、ＤＮＡまたはＲＮＡのある形でよく見出される、３’−エンド構造立体配座にリボースを「ロック」する。ロックされたリボース立体配座は、残基の積み重ねおよび／または主鎖の予備構成を増強し得る。このことは、いくつかの場合で核酸配列の熱安定性（たとえば溶融温度）を著しく上昇させることができる。下で詳細に議論するように、１個以上のロックド核酸残基を含有する核酸プローブがある実施形態で有用であり得るのは、ロックド核酸残基は、たとえば内部で回転するその能力に対する制限のために、標的核酸との結合に対する親和性の上昇を示し得る。
ある実施形態において、核酸プローブは、残基対形成関係で２つ以上の天然ヌクレオチドと、いくつかの場合では天然ヌクレオチドすべてと結合し得るユニバーサル残基を含有し得る。例示的なユニバーサル残基は、５−ニトロインドールおよび３−ニトロピロールを含むが、本明細書に記載するシステムおよび方法に有用な他のユニバーサル残基が当業者に公知となるであろう。下で議論するように、１つ以上のユニバーサル塩基を含有する核酸がある実施形態において有用であり得る。核酸プローブは、任意の好適な技法、たとえば固相ホスホラミダイトトリエステル法を使用して合成され得る。いくつかの場合で、複数の核酸プローブが合成され、このようなプローブのライブラリを形成する。ライブラリは、たとえば複数の流体液滴で構成された複数の配列を含み得る。いくつかの（すべてではない）実施形態において、ライブラリは、ほぼ同じ数の残基、たとえば約４残基、約５残基、約６残基、約７残基などを有する配列を含有し得る。核酸プローブのライブラリは、任意の好適な技法を使用して作製され得て、手動技法または自動化を使用して、たとえばロボット装置を使用して産生され得る。
一実施形態において、核酸プローブは並行して産生することができる。たとえば、マイクロ流体装置を使用して核酸プローブのライブラリの並行生成が可能になり得る。たとえば、１個のチップ上にマイクロ流体液滴メーカーを何回も複製して、各液滴メーカーを使用して異なる核酸プローブを作製し得る。液体に包囲された流体の液滴を産生する技法の非限定的な例は、それぞれ参照により本明細書に組み入れられている、“Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｆｌｕｉｄ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ”という名称であり、２００５年８月１１日にＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００５／０１７２４７６として公開され、２００４年１２月２８日に出願されたＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．１１／０２４，２２８；“Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ”という名称であり、２００７年１月４日にＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００７／０００３４２として公開され、２００６年２月２３日に出願されたＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．１１／３６０，８４５；または“Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”という名称であり、２００７年３月８日にＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ２００７／００５４１１９として公開され、２００６年３月３日に出願されたＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．１１／３６８，２６３に記載されている。たとえば、いくつかの実施形態において、電荷が液体に包囲された流体で生成されて、これにより流体は液体内で個々の液滴に分離され得る。
一実施形態において、ライブラリは、ある長さを有する核酸配列のセットのために考えられるあらゆる配列を含み得る。別の実施形態において、ライブラリは、ある長さを有する考えられるすべての配列の少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％を含み得る。ライブラリを調製するためのいくつかの技法を下で議論する。
多くの実施形態において、少なくとも１つの識別要素が存在する。「識別要素」とは、本明細書で使用するように、ある方式で決定することができる構成成分を含む種であり、たとえば識別要素は液滴内に含有されているときに識別され得る。識別［スペルチェッカが作動していない？］要素は、液滴内で不溶性（たとえば懸濁）または可溶性であり得る。非限定的な例は、蛍光、化学発光、放射能などによって検出可能な識別要素を含む。具体的な例は、これに限定されるわけではないが、染料を含有する粒子、量子ドット、または、いくつかの実施形態において、他の種、たとえば本明細書に記載するようなオリゴヌクレオチドも結合され得る蛍光粒子を含む。いくつかの場合で、２つ以上の同一の識別要素が所与の液滴内に存在し得る。
ある実施形態において、同じでない識別要素が、たとえば液滴内で使用され得る。たとえば、液滴は少なくとも２つの区別可能な識別要素、少なくとも３つの区別可能な識別要素、少なくとも４つの区別可能な識別要素、少なくとも５つの区別可能な識別要素などを含有し得る。識別要素は、任意の好適な方法、たとえば色、蛍光、吸収、強度、サイズ、電荷、放射能、質量などを使用して区別され得る。
１セットの実施形態において、粒子または微粒子（たとえばビーズ）は識別要素として使用され得る。粒子は、任意の寸法を有し得て、球形または非球形であり得る。たとえば粒子は、いくつかの場合で直径が約１００ｎｍ〜約１００ｕｍに及ぶ平均直径を有し得る。ある実施形態において、粒子は約１マイクロメートル未満の、約３００ｎｍ未満の、約１００ｎｍ未満の、約３０ｎｍ未満の、または約１０ｎｍ未満の平均直径を有し得る。平均直径は、本明細書で使用するように、液滴内に含有された粒子の直径の算術平均である。非球形粒子の直径は、本明細書で使用するように、粒子と同じ体積を有する完全な数学的球の直径である。
いくつかの実施形態において、少なくとも３つの区別可能な識別要素、少なくとも４つの区別可能な識別要素、少なくとも６つの区別可能な識別要素、少なくとも８つの区別可能な識別要素、少なくとも９つのつの区別可能な識別要素、少なくとも１０の区別可能な識別要素、少なくとも２０の区別可能な識別要素、少なくとも３０の区別可能な識別要素、少なくとも４０の区別可能な識別要素、少なくとも５０の区別可能な識別要素、少なくとも６０の区別可能な識別要素、少なくとも７０の区別可能な識別要素、少なくとも８０の区別可能な識別要素、少なくとも９０の区別可能な識別要素、少なくとも１００の区別可能な識別要素などがあるように、複数の識別要素が液滴を識別するために選択され得る。複数の区別可能な識別要素の１つの非限定的な例は、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．から市販されているＬｕｍｉｎｅｘ ＦｌｅｘＭＡＰ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓビーズである。これらのようなビーズまたは粒子は、一実施形態により、各ビーズまたは粒子内で独立して変化することができる２つ以上の染料または他の化合物の使用によって区別され得る。したがって、複数の区別可能なビーズは、ある実施形態により、複数の識別要素として使用され得る。別の詳細な非限定的な例として、ポリスチレンおよび１つ以上の染料を含む粒子が識別要素として使用され得る。粒子内で利用される染料はたとえばスクアリン酸ベースの分子またはたとえば近赤外線および／または赤外範囲に及ぶ蛍光を呈する他の蛍光分子を含み得る。いくつかの場合で、濃度が独立して制御できる２つ以上の染料を各粒子内で使用することができる。
一態様において、標的核酸は、核酸プローブおよび少なくとも１つの識別要素に曝露され得る。たとえば核酸プローブおよび少なくとも１つの識別要素は、第１の流体液滴内に含有され得て、標的核酸は第２の流体液滴内に含有され得て、次に共に融合されて（たとえば下で議論するように）、それにより標的核酸が核酸プローブに曝露される。標的核酸と核酸プローブとの結合を測定するために、標的核酸プローブの少なくとも一部の配列が決定され得る。いくつかの場合において、複数の異なる核酸プローブを用いてこれを反復することによって、標的核酸プローブ全体の配列が決定され得る。
標的核酸を配列決定するための１セットの実施形態は、一般に次のように説明される。核酸プローブおよび少なくとも１つの識別要素を含む第１の流体液滴が提供される。この例では、核酸プローブは信号発信実体に結合した核酸残基の配列および消光剤または増感剤を含む。たとえば、核酸プローブは４、５、６、７、８、または９残基を含有し得る。信号発信実体、消光剤、および増感剤は上で議論した。標的核酸を含む第２の流体液滴も提供される。第１の流体液滴および第２の流体液滴は、本明細書で議論した方法を含む、任意の好適な方法に従って融合され得る。融合した流体液滴もポリメラーゼを含むことができる。ポリメラーゼは、液滴が融合する前にポリメラーゼを第１の流体液滴もしくは第２の流体液滴に、または第１の流体液滴および第２の流体液滴が融合された後に直接第３の流体液滴に供給することによって、融合流体液滴に包含され得る。ある場合において、たとえば核酸プローブおよび標的核酸の各配列が相補的または実質的に相補的である場合、核酸プローブは、第１および第２の液滴の融合後に標的核酸にハイブリダイズし得るか、またはそうでなければ標的核酸と結合し得る。これらの場合において、上で議論したように、信号発信実体および消光剤または増感剤を含む核酸プローブを使用するときに、ポリメラーゼは、核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズするまたは標的核酸と結合する際に核酸プローブの分解を引き起こし得る。信号発信実体および／または消光剤または増感剤は次に、ポリメラーゼの作用のために核酸プローブから放出され得て、それゆえ消光剤または増感剤は信号発信実体にもはや実質的に影響を及ぼし得ず、信号発信実体を決定することができる。しかし、核酸プローブが、たとえば十分な相補性がないために標的核酸にハイブリダイズしない、またはそうでなければ標的核酸と結合しない場合には、第１および第２の液滴の融合後に信号発信実体の変化は測定できない。それゆえ、信号発信実体の変化の測定は、核酸プローブが標的核酸にハイブリダイズしたか、またはそうでなければ標的核酸と結合したか否かを決定するために使用され得る。少なくとも１つの識別要素も、核酸プローブの配列決定で決定および／または利用され得る。
非限定的な例を図３に示す。本図において、核酸プローブ２１および少なくとも１つの識別要素２２を含有する第１の流体液滴２０が提供される。しかし他の実施形態において、２、３、または４つ以上の識別要素が液滴内で使用され得る。本図において、核酸プローブ２１は、信号発信実体２４に結合された核酸配列２３および消光剤（「Ｑ」）２５（他の実施形態において、増感剤が消光剤の代わりに使用され得るが）を含む。さらに、標的核酸２７を含有する第２の流体液滴２６が提供される。本例では、第１の流体液滴２０は第２の流体液滴２６と融合して、矢印２００によって示すように、融合流体液滴２８を形成する。ポリメラーゼ２９は融合流体液滴内に存在する（たとえば、それは第１および／または第２流体液滴中に存在していた）。矢印２０１で示すように核酸プローブ２１が標的核酸２７と結合する場合、信号発信実体２４は矢印２０２で示すように核酸２３および消光剤２５から移動される。ある例において、核酸プローブ２１および標的核酸２７は結合し得て（たとえば核酸プローブおよび標的核酸が相補的または実質的に相補的である場合）、その結合は、矢印２０３によって示すように信号発信実体２４の変化を測定することによって検出することができる。いくつかの場合で、核酸２３の配列は次に、識別要素２２（矢印２０４および２０５によって示す）を決定することによって決定され得る。
標的核酸を配列決定するための別のセットの実施形態は、リガーゼを使用して、標的核酸の存在下で核酸プローブを共に結合させる。例は次の通りである。核酸プローブの第１の群および第２の群よりそれぞれ選択された、第１および第２の核酸プローブを含む、第１の流体液滴が提供され得る。しかし、いくつかの場合で、核酸プローブの第１または第２の群からそれぞれ選択される第１または第２の核酸プローブのどちらかを含む、２つの流体液滴が要求され得る。核酸プローブはそれぞれ、本明細書でさらに議論するように、信号発信実体に結合した核酸残基の配列、消光剤および／または増感剤を含む。標的核酸を含む第２の流体液滴も提供される。第１の流体液滴（または２つの別個の流体液滴）および第２の流体液滴は次に、本明細書で議論するように、任意の好適な方法を使用して融合することができる。
さらに、リガーゼを融合流体液滴に包含することができる。リガーゼは、液滴が融合する前にリガーゼを第１の流体液滴もしくは第２の流体液滴に、または第１の流体液滴および第２の流体液滴が融合された後に直接融合流体液滴に供給することによって、融合流体液滴に包含させることができる。
いくつかの実施形態において、第１および第２の核酸プローブは、たとえば標的核酸および核酸プローブが実質的な相補性を有する場合、標的核酸と結合することができる。これらの例において、核酸プローブは（たとえばリガーゼとの連結を介して）共に結合され得て、（下で議論するように）核酸プローブとの結合を測定するために使用することができる。たとえば、いくつかの場合において、第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブは標的核酸と、相互に隣接した位置で結合する（たとえば標的核酸にハイブリダイズする）であろう（たとえば第１の核酸の配列は、標的核酸と実質的に相補的であり、第２の核酸の配列は、第１の核酸プローブと実質的に相補的である配列に隣接した標的核酸と実質的に相補的である）。このような場合、第１および第２の核酸プローブの連結は、リガーゼの存在のために発生することができる。しかし、第１および第２の核酸プローブが標的核酸プローブが標的核酸の隣接した位置で結合しない他の例では、連結は発生することができない。例として、第１および第２の核酸は、標的核酸と実質的に相補的である配列を有し得るが、該配列は相互に隣接していない（たとえば１つ以上の残基は、標的核酸プローブにて第１および第２の核酸プローブに相補的な配列の間に存在し得る）。
いくつかの実施形態において、標的核酸を配列決定するために上述のような連結方法を利用することが好都合であり得る。たとえば、本明細書でさらに記載するように、このような方法によって、より小規模のライブラリからの比較的大規模な配列決定ライブラリの形成が可能になり得る。これによりライブラリの合成のための時間および／または費用（たとえば試薬の費用）を低減することができる。さらに連結方法がいくつかの実施形態において、非連結方法と比較して増強されたシグナルを含むことが可能であるのは、連結によってプローブ長が増大されて、次に結合エネルギーを増大することができるためである。いくつかの場合で、このような方法によって、単一塩基対の特異性が上昇して、それにより配列決定プロセスの精度が上昇することがある。これは、より短い核酸プローブが、より長い核酸プローブと比較してより高い単一塩基対特異性を有し得るためである。特異性および結合エネルギーは、いくつかの場合で、たとえば本明細書で議論するように、プローブ構造を改変して、プロセスを最適化するために、ユニバーサル塩基、ロックド核酸、ギャップ、または他の生化学試薬を含む核酸プローブを使用することによっても増強され得る。連結方法はまた、いくつかの場合で長いおよび短い核酸プローブの両方より成るライブラリを使用することの利点を好都合に組み合せ得る。たとえば短いプローブを使用して、一般に核酸プローブにより密接に結合されるであろう、より長いプローブが形成され得る。他方、より長いプローブはプローブの可撓性のために、短いプローブよりも特異性が一般に低い。したがって、ある連結方法は、より短いおよびより長いプローブの利点のいくつかを利用し得る（たとえばより短いプローブの特異的結合、より短いプローブが連結されてより長いプローブを形成し、したがって結合がより密接である）。
本発明の連結方法の非限定的な例を図１６に示す。図１６Ａに示すように、標的核酸８０は、第１の核酸プローブ８２および第２の核酸プローブ８４に曝露される。いくつかの場合で、第１および第２の核酸プローブは、図１６Ｂに示し、矢印８１で示すように、相互に隣接した標的核酸とハイブリダイズし得る。第１の核酸プローブ８２および第２の核酸プローブ８４を含む標的核酸８０は次に、矢印８３によって示すように、リガーゼ８６に曝露され得る。図１６Ｃに示すように、第１および第２の核酸プローブは連結されて、核酸オリゴマー８８を形成し得る。しかしいくつかの場合で、第１および第２の核酸プローブは、図１６Ｅに示し、矢印８７で示すように、標的核酸において相互に隣接してハイブリダイズしない。このような例において、矢印８９によって示すように、第１核酸プローブ８２および第２の核酸プローブ８４を含む標的核酸８０のリガーゼ８６への曝露時に、核酸プローブの実質的な連結は発生しないであろう。いくつかの場合で、核酸プローブの一方または両方が標的核酸にハイブリダイズせず（たとえば核酸は、実質的に相補的ではない）、第１の核酸プローブと第２の核酸プローブとの間に連結は発生しないであろう。一例として、図１６Ｄに示し、矢印８５で示すように、第１の核酸プローブ８２のみが標的核酸８０とハイブリダイズし、これに対して第２の核酸プローブ８４は標的核酸８０とハイブリダイズしない。
別の非限定的な例として、２個の３ｍｅｒ核酸プローブが相補的であり、隣接して、正しい順序でハイブリダイズする場合、それらは連結されて、図３６Ａおよび３６Ｂに示すように新たな６ｍｅｒが形成され得る。図３６Ａは、隣接する相補的３ｍｅｒの標的核酸へのハイブリダイゼーションを示す。図３６Ｂは、核酸プローブのリガーゼとの連結を示す。連結は、２個の３ｍｅｒプローブを共に共有結合して、さらに密接に結合された６ｍｅｒを形成する。連結前に、プローブの結合エネルギーは、３ｍｅｒの結合エネルギーのみであり、このエネルギーは一般に、あまりに低すぎて室温では検出できない。連結後に、２個の３ｍｅｒは６ｍｅｒとなり、６ｍｅｒは３ｍｅｒの２倍の結合エネルギーを有し、それゆえ図５３Ｃに示すように、ハイブリダイズすることができる。それゆえプローブの連結は、短いプローブの非常に特異的であるが過渡的な結合に依存して、密接に結合した複合プローブを産生する。
第１および第２の核酸プローブの結合は、たとえば核酸プローブの少なくとも１つと結合した信号発信実体の変化によって測定され得る。第１および第２の核酸プローブが隣接位置にて標的核酸に対して相補的または実質的に相補的である場合、ここで第１および第２の核酸プローブ（信号発信実体を含む）は上で議論したように標的核酸と結合して、連結反応に関与する。したがって、連結された核酸プローブの信号発信実体を決定することにより、核酸プローブの両方の配列に基づいて標的核酸の配列の一部が決定され得る。反対に、第１および第２の核酸プローブが標的核酸配列と結合できない場合（たとえば配列が十分に相補的でない場合）、ここで連結反応は起こり得ず、決定されたシグナル実体は異なる信号を有するであろう。いくつかの場合で、第１の群からの各核酸プローブは第１の信号発信実体または識別要素を含み、第２の群からの各核酸プローブは第２の信号発信実体または識別要素を含む。第１および第２の核酸プローブの連結は、第１および／もしくは第２の信号発信実体ならびに／または識別要素を決定することによって決定され得る。
いくつかの場合で、核酸プローブの第１の群および／または核酸プローブの第２の群は、選択した長さの配列すべての少なくとも一部を含み得る。たとえば核酸プローブの第１の群は、３核酸残基を持つすべてのプローブの各部分の少なくとも１つを含み得る。核酸プローブの第１の群および核酸プローブの第２の群は、実質的に類似していてもしていなくてもよい。いくつかの場合で、核酸プローブの第１の群は、核酸プローブの第２の群と本質的に同じプローブを含む。いくつかの場合で、核酸プローブの第１および第２の群は、実質的に考えられるすべての３ｍｅｒを含む。いくつかの場合で、液滴は第１の群からの１個のプローブおよび第２の群からの１個のプローブを含み得る。他の場合では、液滴は第１の群からの第１の種類の複数のプローブおよび第２の群からの第２の種類の複数のプローブを含み得る。
核酸プローブの第１の群およびまたは第２の群は、実質的に類似しているか、または異なり得る。たとえば核酸の第１の群および第２の群は、第１の群および第２の群が考えられるすべての３ｍｅｒの少なくとも一部を含む場合に実質的に類似しているが、それらが異なる信号発信実体を含む、または信号発信実体が異なる位置に配置されている（たとえば３’末端対５’末端）という点で異なり得る。区別可能な識別要素の第１の群および区別可能な識別要素の第２の群は、実質的に類似しているか、または異なり得る。いくつかの実施形態において、核酸プローブの第１の群および／または第２の群は、考えられる３ｍｅｒ、４ｍｅｒ、５ｍｅｒ、６ｍｅｒ、７ｍｅｒ、８ｍｅｒ、９ｍｅｒ、１０ｍｅｒなどを含む。
Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴに加えて、他の核酸残基もいくつかの場合で存在し得る。たとえばいくつかの場合で、核酸プローブの少なくともいくつかは少なくとも１個のユニバーサル残基をさらに含み得る。たとえばさらなるユニバーサル残基を含む３ｍｅｒは、配列ＮＮＮＸＸＸを有し得て、ここでＮはユニバーサル残基であり、ＸＸＸの各残基は独立して、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴのいずれか１つである（たとえば３ｍｅｒ）。
ユニバーサル塩基またはユニバーサル残基（たとえば「Ｎ」）は、本明細書で使用するように、核酸塩基（たとえばヌクレオチドまたはＰＮＡ）の形でポリマー構造中に包含されたときに、核酸塩基を有する相補的ポリマー構造の塩基を顕著に区別しない。たとえばユニバーサル塩基は、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧから選択された１を超えるヌクレオチドにハイブリダイズできる。ユニバーサル残基は当業者に公知となるであろう。核酸塩基の非限定的な例は、デオキシイノシン、３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、６−ニトロインドール、５−ニトロインドール、６−メチル−７−アザインドール、ピロールピリジン、イミダゾピリジン、イソカルボスチリル、プロピニル−７−アザインドール、プロピニルイソカルボスチリル、アレニル−７−アザインドール、８−アザ−７−デアザ−２’−デオキシグアノシン、８−アザ−７−デアザ−２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシシチジン、２’−デオキシウリジン、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、７−デアザ−２’−デオキシイノシン、２’−アザ−２’−デオキシイノシン、３’−ニトロアゾール、４’−ニトロインドール、５’−ニトロインドール、６’−ニトロインドール、４−ニトロベンズイミダゾール、ニトロインダゾール（たとえば５’−ニトロインダゾール）、４−アミノベンズイミダゾール、イミダゾ−４，５−ジカルボキサミド、３’−ニトロイミダゾール、イミダゾール−４−カルボキサミド、３−（４−ニトロアゾール−１−イル）−１，２−プロパンジオール、および８−アザ−７−デアザアデニンを含む。
いくつかの場合で、第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブそれぞれの一端のみが相互に連結し得るように、核酸プローブの第１の群は３’末端で連結することが可能であり、核酸プローブの第１の群は５’末端で連結することが可能であり得る。したがって、連結を発生させるためには、プローブは標的核酸に正しい順序でハイブリダイズする必要がある。すなわちプローブは、第１のプローブの３’末端および第２のプローブの５’末端が相互に隣接してプローブが連結できるように、標的核酸にハイブリダイズしなければならない。第１のプローブの５’末端および第２のプローブの３’末端が相互に隣接するように、第１のプローブおよび第２のプローブが標的核酸にハイブリダイズする場合、プローブは結合可能でないことがある（たとえば第１のプローブの５’末端および第２のプローブの３’末端は、その末端でのハイブリダイゼーションを防止する実体（たとえば識別要素、信号発信実体など）を含む）。
連結方法によって、比較的より少ない数の液滴が最初に調製され得る。たとえば、考えられるすべての６ｍｅｒの総数を含む複数の液滴が生成される場合、本明細書に記載した技法を使用して４，０９６種類の液滴が産生されねばならない。しかし、２つの群の３ｍｅｒを用いて上述の連結方法を使用して考えられるすべての６ｍｅｒを調査する場合、わずか１２８種類の液滴が産生されねばならない（たとえば３ｍｅｒの第１の群（６４）および３ｍｅｒの第２の群（６４）。第１の群の液滴は、第２の群の液滴と融合して液滴のライブラリを形成し得て、各液滴は第１の群からの液滴および第２の群からの液滴を含む。
ＳＢＨ（ハイブリダイゼーションによる配列決定）バイオインフォマティクスを使用して、シングルパスで配列決定できる標的核酸の長さは、ライブラリ内のプローブ数の約４分の１になると予測できる。たとえば、６４要素がある３ｍｅｒのライブラリ（４３）の場合、約１０〜１２塩基の標的核酸を配列決定できる。たとえば、４０９６要素がある６ｍｅｒのライブラリの場合、約１０００塩基の標的核酸を配列決定できる。また別の例として、約１７００万のプローブがある１２ｍｅｒのライブラリの場合、約４００万塩基の標的核酸を配列決定できる。しかしこのように大きなライブラリは、標準方法によって合成するには実用的ではない大きさである。しかし本発明のある方法により、１２ｍｅｒは、２個の６ｍｅｒを共に連結することによって形成可能であり、これには６ｍｅｒライブラリの４０９６＋４０９６＝８１９２プローブが合成されることが必要である。これは、１７００万要素のライブラリ全体のプローブ数の０．０００５％である。上述のように、１２ｍｅｒを作製する６ｍｅｒは３ｍｅｒを連結することによってそれ自体形成できるため、１２ｍｅｒは４個の３ｍｅｒプローブを連結することによって形成可能であり、合計２５６個のプローブを合成することが必要である。この関係は式：
ｆ（ｎ）＝（４ｎｌ＋４ｎ２．．．）／４（ｎｌ＋ｎ２．．）、式中
ｎｌ＋ｎ２＋．．．＝Ｒ、
によって得られ、式中、ｆ（ｎ）は、全ライブラリと比較して合成されねばならないプローブの割合であり、Ｒは最終連結プローブの長さであり、ｎ１、ｎ２は、共に連結される第１、第２の．．．プローブ内の塩基の数である。いくつかの場合で、核酸プローブの少なくとも２個の、少なくとも３個の、少なくとも４個の、少なくとも５個の、少なくとも６個などの群が提供され得る。本明細書に記載する連結方法は、核酸プローブの２個を超える群を含むように拡大され得る。連結により形成されたプローブの全長は、長さが少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６残基などである。
核酸プローブの第１の群および第２の群の組み合せの非限定的な例を図１７に示す。簡単にするために、核酸プローブ２４６の第１の群および核酸プローブ２４８の第２の群についての以下の例を示し、図１７Ａに示すように、プローブの各群は、４個のユニバーサル核酸残基および１個のＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴ残基を含む（たとえばＮＮＮＮＸまたは４個のユニバーサル残基を含むモノマー）。核酸プローブ２４６の第１の群は、４個のプローブ（２５０、２５２、２５４、２５６）を含み、ここで各プローブは信号発信実体または識別要素を（表示したように）３’または５’側に含む。核酸プローブ２４８の第２の群は、４個のプローブ（２５８、２６０、２６２、２６４）を含み、ここで各プローブは、核酸プローブの第１の群と比較して、信号発信実体または識別要素を（表示したように）５’または３’側に含む。図１７Ｂに示すように、それぞれ第１の群からの少なくとも１個のプローブおよび第２の群からの少なくとも１個のプローブを含む、複数の液滴２６６が形成される。この例において、第１の群からの各プローブが第２の群からの各液滴を有する液滴中に含有される場合、１６個の液滴が形成されるであろう。しかしいくつかの場合では、第１の群からのすべての液滴が、第２の群からの各液滴を有する液滴と組み合されるわけではない。
ある例において、第１の群の核酸プローブはそれぞれ少なくとも１個の区別可能な識別要素と組み合わされ、第２の群の核酸プローブはそれぞれ少なくとも１個の区別可能な識別要素と組み合われ得る。たとえば、第１の群の区別可能な核酸プローブおよび第１の群の区別可能な識別要素を含む第１の群の液滴が形成され、第２の群の区別可能な核酸プローブおよび第１の群の区別可能な識別要素を含む第２の群の液滴が形成され得て、流体液滴の第２の集団を形成する。融合液滴に含まれる核酸プローブは次に、核酸プローブを決定することに関連して本明細書で議論するように、区別可能な識別要素を識別することによって識別され得る。識別要素は、標的核酸への液滴の曝露後に各プローブの配列を決定するためにも使用され得る。第１の群の核酸プローブと結合した区別可能な識別要素および第２の群の核酸プローブと結合した区別可能な識別要素は、相互から区別され得るまたはされ得ない。いくつかの場合で、すべて（たとえばすべての第１およびすべての第２の核酸プローブ）が区別可能な識別要素を決定することによって識別できるように、それらが区別可能であろう。いくつかの場合で、第１の群および第２の群からの液滴それぞれは、第１および第２の群からの各プローブの配列が区別可能な識別要素に関連付けられるように、少なくとも区別可能な識別要素を含み得る。
第１の群の核酸プローブおよび第２の群の核酸プローブを含むライブラリは、各種の方法を使用して生成され得る。液滴のライブラリは、本明細書に記載するように、非マイクロ流体またはマイクロ流体法を使用して生成され得る。一般に、第１および第２の核酸プローブの連結は、それらが標的核酸に曝露された後まで発生しない。
非マイクロ流体法の非限定的な例として、核酸プローブの第１および第２の群からの各核酸プローブが別個の容器に配置され得る。第１の群からの各プローブが第２の群からの各プローブと組み合されるまで、第１の群からの各核酸プローブは、別個の容器内の第２の群からの各核酸プローブと組み合され得る。たとえば図３０は、それぞれ３ｍｅｒを含む第１の群からの６４プローブおよび第２の群の核酸プローブをそれぞれ含む、ライブラリＡおよびライブラリＢの概略図を示す。ライブラリＡからの各プローブは、ライブラリＢからの各プローブと組み合されて、６４×６４＝４０９６要素の複合ライブラリを形成する。いくつかの実施形態において、このことはアレイを使用して実施され得る。たとえば少なくとも４０９６の空のウェルを含有する大型ウェルプレートが用意され、各ウェルではライブラリＡおよびライブラリＢからの核酸プローブの独自の組み合せが混合され得る。たとえばウェルの第１列では、プローブＡ（１，１）は、プローブＢ（１，１）、Ｂ（１，２）、．．．、Ｂ（２，１）、Ｂ（２，２）、．．．、Ｂ（８，７）、およびＢ（８，８）と混合され得る。次の列において、プローブＡおよびプローブＢの考えられるすべての組み合せが混合されるまで、プローブＡ（１，２）はＢ（１，１）、Ｂ（１，２）、．．．、Ｂ（２，ｌ）、Ｂ（２，２）、．．．、Ｂ（８，７）、およびＢ（８，８）などと混合される。これらの２つの小型ライブラリから、合計４０９６の組み合せが産生される（６４×６４＝４０９６）。組み合されたＡ×Ｂライブラリの各要素は乳化され、エマルジョンはプールされて、各乳化からの少なくとも１個の液滴を含むプールライブラリが形成され得る。プールライブラリは、本明細書に記載して、図３３Ｂに示すように、マイクロ流体装置に再注入され、標的核酸と融合され得る。
いくつかのマイクロ流体の実施形態において、第１の群および第２の群からの核酸プローブはマイクロ流体装置で組み合され得る。たとえば、第１の群からの各核酸プローブは個別に乳化され、第１の群からの各プローブのエマルジョンは、核酸プローブの第１の群（たとえばライブラリＡ）に組み合され得る。ライブラリＢを形成するために、このことが第２の群の核酸プローブにも実施され得る。ライブラリＡおよびライブラリＢは、図３３Ａに示すように、マイクロ流体装置に注入され得る。いくつかの実施形態において、図３３Ａの左に示すように、同時に、標的核酸を含む液滴もチャネル中に導入され得る。当業者に公知の技法を使用して、液滴を含む標的核酸および再注入されたライブラリの流量は、標的核酸を含む１個の液滴がライブラリＡからの１個の液滴およびライブラリＢからの１個の液滴と組み合されるように調整され得る。マイクロ流体液滴を融合するために本明細書に記載した技法を使用して、３個の液滴が融合され得る。
別の非限定的な例として、第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブを含む複数の液滴は、第１の核酸プローブを含む複数の液滴を第２の核酸プローブを含む複数の液滴のうち１個と融合させることによって調製され得る。すなわち、第１の群の核酸プローブから選択される少なくとも１個の核酸プローブをそれぞれ含む第１の複数の液滴が調製され、第２の群の核酸プローブから選択される少なくとも１個の核酸プローブをそれぞれ含む第２の複数の液滴が調製され得る。第１の複数の液滴からの液滴は、第２の群の液滴からの液滴と融合され得て、それにより第１の群の核酸プローブから選択される少なくとも１個の核酸プローブおよび第２の群の核酸プローブから選択される少なくとも１個の核酸プローブを含む液滴が形成される。この工程は、第１の群からの核酸プローブの実質的にすべてが第２の群からの核酸プローブの実質的にすべてを含む液滴に含まれるように、複数の融合液滴が形成されるまで反復され得る。形成された融合液滴のライブラリは次に、標的核酸を含む第３の液滴と融合され得る。
標的核酸を配列決定するための別のセットの実施形態は、次の通りである。核酸プローブ（信号発信実体を含有し得る）ならびに、少なくとも、第１の識別要素、第１の識別要素から区別可能な第２の識別要素、ならびに第１の識別要素および第２の識別要素から区別可能な第３の識別要素を含む第１の流体液滴が提供され得る。いくつかの場合で、第１、第２および第３の識別要素から区別可能な第４の識別要素も存在し得る。いくつかの実施形態において、各識別要素はオリゴヌクレオチドも含み得て、液滴内のいくつかの識別要素は区別可能なオリゴヌクレオチドをしばしば含み得る。いくつかの場合で、オリゴヌクレオチドはそれぞれ１個以上のユニバーサル核酸残基を含有する。たとえば、所与の液滴内のオリゴヌクレオチドはそれぞれ複数のユニバーサル核酸残基を含有し得て、液滴中の各オリゴヌクレオチドは、ユニバーサル残基ではない残基によって異なり得る。
詳細で非限定的な実施例として、流体液滴中に４個の区別可能な識別要素が存在するとき、４個の区別可能な識別要素のオリゴヌクレオチドは、Ａ（Ｎ）ｎ−１、Ｃ（Ｎ）ｎ−１、Ｇ（Ｎ）ｎ−１、およびＴ（Ｎ）ｎ−１であり得て、式中、Ｎはユニバーサル核酸残基であり、ｎはオリゴヌクレオチドの長さである。この例において、オリゴヌクレオチドは１個の残基によってすべて異なる。いくつかの場合で、オリゴヌクレオチドのユニバーサル核酸部分の長さは４残基である。他の場合では５残基である。また他の場合では、６残基である。いくつかの例において、異なる残基は、オリゴヌクレオチドの５’末端位置に位置して、たとえば５’−ＸＮ（ｎ−１）−３’である（Ｘは天然発生型核酸残基である）。しかし他の例において、異なる残基はオリゴヌクレオチドの５’末端からの第２の位置に配置され、たとえば５’−ＮＸＮ（ｎ−２）−３’である。また他の例において、異なる核酸は他の位置に配置され、たとえば５’−ＮＮＸＮ（ｎ−３）−３’である。
この例では、標的核酸を含む第２の流体液滴も提供され得る。流体液滴および第２の流体液滴は次に融合されて、融合流体液滴を形成することができる。いくつかの場合で、標的核酸と結合することができる核酸プローブは、たとえばそれらが相補的および実質的に相補的である場合に存在し得る。さらに、識別要素のオリゴヌクレオチドの１個も標的核酸と結合され得る。
核酸プローブおよび識別要素のオリゴヌクレオチドの１個が標的核酸と結合されるようになったいくつかの例において、核酸プローブおよび識別要素のオリゴヌクレオチドは、（たとえば連結より）共に結合され得て、これは結合を測定するために（下で議論するように）使用することができる。識別要素のオリゴヌクレオチドおよび核酸プローブの配列が標的核酸に対して相互に隣接して位置決めされるときに、通例連結が発生して、オリゴヌクレオチドおよび核酸プローブが標的核酸に対して正しく位置決めされていない場合には、実質的な連結は発生しないであろう。いくつかの場合で、オリゴヌクレオチドおよび核酸プローブ配列の連結は、たとえばＤＮＡリガーゼなどの任意の好適な技法を使用して、融合流体液滴中にリガーゼを供給することによって引き起こされ得る。たとえばリガーゼは、液滴が融合流体液滴に直接融合される前に第１の流体液滴または第２の流体液滴にポリメラーゼ供給することによって、融合流体液滴に包含され得る。
核酸プローブおよび識別要素のオリゴヌクレオチドの連結はたとえば、識別要素および核酸プローブの信号発信実体の結合を測定することによって決定され得る。核酸プローブが標的核酸に対して相補的または実質的に相補的である場合、ここで（信号発信実体を含む）標的核酸は標的核酸を結合して、連結反応に関与することができる。区別可能な識別要素は、それぞれの結合したオリゴヌクレオチドが１個の位置のみで異なるように選択され（たとえば残りの残基はユニバーサル核酸残基である場合）、ここで区別可能な識別要素の１個のみが連結反応に関与できるであろう。したがって、核酸プローブの信号発信実体と結合した区別可能な識別要素を決定することによって、標的核酸の配列の一部が、核酸プローブの配列および識別要素のオリゴヌクレオチドの配列の両方に基づいて決定され得る。反対に、核酸プローブが標的核酸配列と結合できない場合（たとえば核酸が十分に相補的でない場合）、ここで連結反応は発生することはなく、識別要素のいずれも核酸プローブの信号発信実体と結合することが見出されないであろう。
上の方法の非限定的な例を図４に示す。この例において、核酸プローブ３１、第１の識別要素３２、第１の識別要素から区別可能な第２の識別要素３３、第１の識別要素および第２の識別要素から区別可能な第３の識別要素３４、および第１、第２および第３の識別要素から区別可能な第４の識別要素３５を含有する、第１の流体液滴３０が提供される。もちろん、１コピーを超える識別要素が液滴内に存在し得る。区別可能な識別要素はそれぞれ、結合されたオリゴヌクレオチドを含むことができる。これらの核酸オリゴヌクレオチド配列はそれぞれ他の識別要素と結合した他の核酸オリゴヌクレオチドと１個の残基が異なるが、残りの残基がユニバーサル核酸残基であり得るように選択され得る。たとえば４個の区別可能な識別要素と結合した４個のオリゴヌクレオチドはＮＡＮＮＮＮ、ＮＴＮＮＮＮ、ＮＧＮＮＮＮ）、およびＮＣＮＮＮＮ（または本明細書で記載するような、他の任意の組み合せ）であり得る。この実施例において、標的核酸３７を含む第２の流体液滴３６も提供される。第１の流体液滴および第２の流体液滴は、矢印３００によって示すように、本明細書に記載する任意の好適な技法を使用して融合され、流体液滴３８を形成する。いくつかの場合で、核酸プローブ３１は標的核酸３７と結合するようになり、矢印３０１によって示すように、識別要素のオリゴヌクレオチドの１つ（３２、３３、３４、または３５）も標的核酸３７と結合するようになり得る。図に示すように、それぞれのオリゴヌクレオチドおよび核酸プローブ配列が標的核酸３７と適正に結合する場合に、識別要素のオリゴヌクレオチドを核酸プローブの核酸配列に結合することができるリガーゼ３９が融合流体液滴に供給される。いくつかの場合で、リガーゼは配列間に任意のギャップまたはインタリング配列がある場合には連結しないであろう。核酸プローブの信号発信実体と結合した識別要素は次に、矢印３０２によって示すように決定され得る。このような決定の技法は下で議論する。
本発明の複数の詳細な例を上で議論したが、上の工程および／またはさらなる工程の任意の組み合せも標的核酸を配列決定するために使用され得ることに注意すべきである。
標的核酸の配列は、複数の区別可能な核酸プローブの１個への標的核酸の結合（または非結合）を決定することによって決定され得る。標的核酸は、それらが実験条件下で水素結合によって比較的安定な２本鎖を形成するときに、核酸プローブと結合され得る。比較的安定な水素結合は、本明細書で議論するように、ワトソン−クリック相補性（たとえばＡはＴに対応するが、ＧまたはＣには対応せず、ＧはＣに対応するが、ＡまたはＴには対応しない）および／またはＧＣゆらぎなどの他の効果、もしくはロックド核酸またはユニバーサル塩基によって引き起こされる他の結合のために形成され得る標的核酸の配列を決定するための好適な方法の非限定的な例は、当業者に公知であるハイブリダイゼーション技法による配列決定を含む。
ハイブリダイゼーションによる配列決定は（ＳＢＨ）、たとえば米国特許第５，２０２，２３１号で以前に記載された、標的核酸中の核酸残基配列を調べる方法である。一般にＳＢＨは、定義された配列の核酸配列プローブのセットを使用して、標的配列のより長い標的鎖で相補的配列を探す。標的にハイブリダイズする定義された配列は、標的核酸の配列を構築するために、コンピュータアルゴリズムを使用して整列させることができる。
それゆえ本発明の一実施形態において、標的核酸は核酸プローブのある組み合せと結合して、特徴的な「ハイブリダイゼーション」パターンをもたらし得る。所与の試料における正の結合（またはハイブリダイゼーション）イベントはそれぞれ、標的核酸に関する不連続な情報を与える。いくつかの場合で、標的核酸は、任意の特定の核酸プローブが標的核酸と結合する場所を正確に決定せずにサンプリングされ得る。標的核酸再構築のためのアルゴリズムおよびソフトウェアが、ハイブリダイゼーションパターンに基づいて開発されており、当業者に公知である。しかし他の場合では、本明細書に記載するようなハイブリダイゼーションパターンの分析は、標的核酸配列自体を特異的に決定せずに、標的核酸配列の「指紋」識別を与え得る。ハイブリダイゼーションのパターンも手動またはコンピュータによって分析され得る。
本発明の別の態様は一般に、液滴が区別可能な核酸プローブおよびまたは識別要素を含有する、液滴の集合を生成するシステムおよび技法に関する。いくつかの実施形態において、複数の区別可能な識別要素を使用して複数の流体液滴を識別することができ、いくつかの場合では、区別可能な識別要素を使用して、各液滴内に存在する（たとえば核酸プローブの）核酸配列を決定する。たとえば、一実施形態において、少なくとも６４、少なくとも２５６、少なくとも１０２４、少なくとも４０９６、または少なくとも約１６，３８４またはそれ以上の流体液滴が調製され得て、各流体液滴は核酸プローブ（核酸プローブの複数のコピーを含む）および組み合されてその核酸プローブを識別して、別の核酸プローブは識別しない１つ以上の識別要素を含有する。本発明は、１セットの実施形態において、流体液滴のこのような集合を調製するためのシステムおよび方法を提供する。
一実施形態において、複数の区別可能な識別要素を使用して、複数の流体液滴または核酸プローブまたは他の好適な試料を識別する。たとえば蛍光粒子を使用する場合、たとえば少なくとも５個の区別可能な粒子、少なくとも約１０個の区別可能な粒子、少なくとも約２０個の区別可能な粒子、少なくとも約３０個の区別可能な粒子、少なくとも約４０個の区別可能な粒子、少なくとも約５０個の区別可能な粒子、少なくとも約７５個の区別可能な粒子、または少なくとも１００個以上の区別可能な粒子を有する区別可能な粒子のセットが最初に決定される。このようなセットの非限定的な例はＬｕｍｉｎｅｘから入手できる。区別可能な識別要素は、複数の群（たとえば、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上）に分割され得て、ここで各群は区別可能な識別要素のセットのうち少なくとも２つの構成要素を含有し得る。
試料は次に区別可能な識別要素の群のそれぞれから選択した１つの構成要素と結合され得る。たとえば、第１の試料は、第１の群から選択された第１の要素、第２の群から選択された第１の要素、および第３の群から選択された第１の要素の組み合せによって、これらの要素が相互から区別可能であるために識別され得る；第２の試料は、第１の群から選択された第１の要素、第２の群から選択された第１の要素と、ただし第３の群から選択された第２の要素との組み合せによって識別され得る。独自の組み合せの数は、この例では、各群の構成要素の数の単なる積である；それゆえ多数の識別要素の区別可能なセットが調製できる。それゆえ、たとえば少なくとも６つの識別要素を定義することによって、識別要素が少なくとも３つの群に配置され、各群が少なくとも２つの識別要素を有する場合、少なくとも８つの試料のそれぞれを、少なくとも３つの各群から１つの識別要素が存在するように選択された少なくとも３つの識別要素と結合させることによって、少なくとも８つの異なる試料を決定することができる。各群の構成要素の数および／または存在する群の数を増加させることによって、なお多くの数が得られる。さらに、各群の構成要素の数はいくつかの場合で同じでもまたは異なっていてもよい。
他の実施形態において、他のコード化方法も可能であることに注意すべきである。たとえば、核酸プローブおよび他の試料が任意に番号付けされ、存在する区別可能な識別要素に対応する２進数字を加算することによって識別されるように、区別可能な要素を使用して２進数字を表し得る。
したがっていくつかの実施形態において、流体液滴は、流体液滴にこのような方式で配置された１つ以上の識別要素を導入することによって識別され得る。比較的多数の流体液滴が識別され得る。たとえば異なる核酸プローブを含有する数１０、数１００、または数１０００の流体液滴の集合は、各液滴にこのような方法で決定された３つまたは４つの識別要素を添加することによって識別され得る。
非限定的な例として、１セットの実施形態において、４０の区別可能な識別要素を使用して、最大約１０，０００の区別可能な核酸プローブを以下のようにコードし得る。４０の区別可能な識別要素は、それぞれ１０要素の４つの群に分割される。各群の各要素は番号１〜０であり、４つの群はＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤと呼ばれる。各群からの１つの要素を（たとえば核酸プローブを含有する）流体液滴に添加して、識別要素をＡＢＣＤ順に読み取る。それゆえたとえば、群Ａからの要素２、群Ｂからの要素１、群Ｃからの要素７、および群Ｄからの要素６は、流体液滴内に含有されていることが見いだされ、ここで液滴はＡ２−Ｂ１−Ｃ７−Ｄ６、すなわち液滴番号２１７６であろう。液滴の同一性、および／または液滴に含有されている種は、この液滴番号に基づいて、たとえば任意のルックアップテーブルによって、または何らかのコード方法によって決定できる。たとえば別の非限定的な例として、各要素が異なる塩基（たとえばＡ、Ｃ、Ｔ、またはＧ）を表すのに対して、各群が位置を表すように、４要素をそれぞれ含有する６つの群に識別要素を分割することによって、２４の区別可能な識別要素のセットを使用して（たとえば核酸プローブ内に含有された）６ｍｅｒをコードすることができる。６ｍｅｒを含有する流体液滴内に６つの群それぞれからの１つの要素を含めることによって、６ｍｅｒは液滴内に存在する識別要素のセットによって識別され得る。それゆえ一例として、群１からの要素Ａ、群２からの要素Ｃ、群３からの要素Ｔ、群４からの要素Ｔ、群５からの要素Ｃ、および群６からの要素Ｇが存在する場合、液滴内に含有された６ｍｅｒは１Ａ２Ｃ３Ｔ４Ｔ５Ｃ６Ｇであり、配列はＡＣＴＴＣＧ（配列番号１）を表す。
液滴の集合の生成の非限定的な例を図５に示す。複数の８個の流体液滴５０が提供され、液滴はそれぞれ核酸プローブ（番号５１〜５８）を含有する。（１および２は群１、３および４は群２、ならびに５および６は群３として）３つの群に分類されている、６つの区別可能な識別要素６０も提供される。区別可能な識別要素および核酸プローブは、液滴６１中で組み合され、８個の核酸プローブのうち２個が同一の３つの区別可能な識別要素のセットと関連しないように、８個の液滴のそれぞれに、各群から１つずつ選択された３つの区別可能な識別要素が存在している。したがって、この詳細な例では、核酸プローブをそれぞれ含有する８個の各流体液滴は、３つの区別可能な識別要素によって識別される。
詳細な実施形態での識別要素および／または信号発信実体の決定方法は、流体液滴内に存在する構成成分に依存するであろう。上述のように、決定は、放射能、蛍光、リン光、光散乱、光吸収、蛍光偏光などの技法を使用して行われ得る。このような原理を使用して動作する多くの検出装置が市販されている。検出装置を使用して液滴内に存在し得る信号発信実体および／または識別要素の少なくとも１つが決定され、いくつかの場合では、２個以上の検出装置が使用され得る。
いくつかの実施形態において、液滴内に含有された信号発信実体および／または識別要素が検出装置の単一のファイルを通過するように、液滴が変形される。液滴は、液滴がたとえば図６Ｃに示すように遊離溶解状態にあるときに、狭窄部の断面積が液滴の断面積よりも小さくなるように、狭窄部を有するチャネルを介してそれを通過することによって変形され得る。いくつかの場合において、信号発信実体および／または識別要素の実質的にすべてが液滴内に配置されて、２つの液滴が液滴の移動方向に垂直である仮想面を同時に通過しないように、液滴が変形される。
いくつかの実施形態において、検出は並行化され得る、すなわちいくつかの信号発信実体および／または識別要素は、１つのチャネル内でおよび／または複数のチャネル内で同時に決定され得る。たとえば、計時装置を使用して並列パスの検出を同期し得る。並列化検出の別の非限定的な例は、２つ以上のチャネルを、たとえば同時に撮像できるように位置決めされたカメラまたは他の撮像装置を使用することである。カメラはたとえば、ラインスキャナカメラ、２Ｄ ＣＣＤカメラなどであり得る。一実施形態において、少なくとも１個の水銀灯が選択した数のチャネルを照明して、（個別のフィルタを有し得る）複数のカメラを使用して特定の色スペクトルを取り込み得る。画像は、連続的に、または同時に取り込まれ得るので、各液滴の位置はすべてのカメラ画像で同じである。
いくつかの場合で、単一の液滴の信号発信実体および／または識別要素はある時点で決定され得る。たとえば、図１８Ａに示すように、複数の液滴２７２がマイクロ流体チャネル２７０を貫流する。検出装置２７４はチャネル２７０に対して、単一の液滴２７８（または液滴２７８の一部）がある時点で決定されるように位置決めされ得る。＞検出装置２７４は、信号発信実体および／または識別要素を断面２７６にて決定し得る。他の場合では、複数の液滴からの信号発信実体および／または識別要素はある時に決定され得る。たとえば、図１８Ｂに示すように、複数の液滴２８２が複数のマイクロ流体チャネル２８０を貫流する（この非限定的な例では、４個のチャネルが示されている）。検出装置２８６はチャネル２８０に対して、検出装置をマイクロ流体チャネル２８２の断面２８７で通過する複数の液滴２８４からの信号発信実体および／または識別要素が決定されるように位置決めされる。別の非限定的な例として、図１８Ｃに示すように、複数の流体液滴２９５は、入口２９１を通じて封じ込め区域２９０に流入し得る。検出装置２９４は封じ込め区域２９０に対して、複数の流体液滴２９５からの信号発信実体および／または識別要素が断面２９６にて決定され得るように位置決めされる。いくつかの場合で、封じ込め区域２９０は、ゲート２９３（たとえば弁）を含み得る出口２９２を有して複数の流体液滴の流れを制御し得る。いくつかの例では、ゲート２９３によって、流体の流れは可能になるが、流体液滴の流れは可能になり得ない。いくつかの場合で、１秒間に少なくとも約１００個の、少なくとも約１０００個の、少なくとも約１００００個の、少なくとも約１０００００個の、少なくとも約５０００００個の、少なくとも約１００万個の、少なくとも約５００万個の、少なくとも１０００万個の液滴が決定され得る。
１回に複数の液滴が測定され得る例では、複数の液滴の測定を補助する方法および／またはシステムが使用され得る。いくつかの場合で、液滴のアレイを同時に撮影するために、検出装置は、液滴１個当りシグナルが１つのみ決定されるように、隣接する液滴の境界を決定する必要があり得る。１セットの実施形態により、光源を利用して液滴グレアを生成する以下の方法および／またはシステムは、封じ込め区域に収集される複数の液滴を測定するときに好都合であり得るのは、液滴を測定するために液滴の境界（たとえば縁）を決定することが困難であり得るためである。
いくつかの場合で、液滴は基準スポットに対する位置のシグナルを測定することによって測定され得る。すなわち各液滴は基準スポットに関連付けられて、液滴のシグナルの測定は基準スポットとの関係によって測定され得る。基準スポットの生成は、たとえば液滴グレアが各液滴に生成されるように、液滴表面に光を当てることによって実施され得る。このことにより、本明細書でさらに記載するように、検出装置は各液滴の相対位置を決定して、それにより各液滴のシグナルを測定することができる。
いくつかの場合で、複数の液滴を測定するときに、蛍光を調べるために使用した光源に加えて、第２の光源（たとえばランプ、ＬＥＤアレイ）が利用され得る。第２の光源は、測定される（たとえば顕微鏡下で描出される）液滴に対してある角度（たとえば直交しない角度）で照射され得る。球状液滴内での光および屈折の向きのために（本明細書で議論するように）、散乱光はカメラのレンズによって取り込まれて、各液滴の画像上に比較的集中した明るいグレア（たとえば液滴グレア）が生成され、これは容易に観察可能であり、バックグラウンドシグナルから区別可能である。それゆえ実質的に集束されたグレアは、液滴内の光の散乱のために液滴によって生成され得る。たとえば図４４は、２つの別個の蛍光強度集団でのマイクロ流体液滴の蛍光強度のＣＣＤカメラからの静止画像取り込みを示す。液滴の密充填によって、液滴の境界の決定に問題が発生し得る。図４５は、液滴に対して斜角で照射する第２の光源を利用する、図４４での上と同様の環境のＣＣＤカメラからの静止画像取り込みを示す。液滴グレアは、各液滴について描出され、各液滴にて見ることができる。
いくつかの場合で、液滴内の光散乱のために液滴グレアが実質的にすべての複数の液滴で生成されるように、光源は複数のマイクロ流体液滴の表面に向けられ得る。液滴に形成された液滴グレアが利用されて液滴の位置が決定され得る。いくつかの例において、液滴グレアが定量され得る。いくつかの場合で、ソフトウェアを使用して液滴に関連する液滴グレアが測定および／または定量され得る。たとえば液滴グレアは、液滴の中心からほぼ同じ角度および距離に位置決めされて、したがって各液滴の基準点として作用し得る。いくつかの場合で、液滴グレアは各液滴の中心から外れることがあり、したがって液滴を使用して蛍光データの収集に使用されるのと同じフレームにて、各液滴の基準点を識別することができる。それゆえ、いくつかの例において、（たとえば光源を点灯および消灯することによって）液滴グレアを作用および停止させたり、ならびに／または液滴識別およびデータ取り込みプロセスを分離したりする必要はない。
図３４は、マイクロ流体液滴を通じた照明の屈折および液滴の画像に出現するであろう発生したグレアについて詳説する、この例で説明した方法の概略図を示す。この非限定的な例において、光は５５°の角度で照射される（しかし他の場合では、直交角度以外のほぼいずれも使用できる）。液滴に対する対物レンズのサイズおよび距離は、縮尺通りに描かれていない。この図では、照明５００（たとえば斜角照明）は、顕微鏡ステージ上で撮像されている５０５マイクロ流体液滴５０２に対して５５°の角度で示されている。屈折光線５０４は、液滴を介した屈折経路を追跡して、対物レンズ５０６によって収集される散乱光５０４のごく小さい領域と、焦点面の屈折光５０７があることがわかる。これより、顕微鏡を通じて観察したときに、粒子の画像上に液滴グレアが生じる。焦点面にない散乱光５０８の領域が多数ある。
いくつかの実施形態において、斜角照明が十分に離れた（たとえば液滴から約１フィート）光源から発生する場合、ここで顕微鏡ステージの表面に密充填された液滴のアレイには、各液滴を同じ入射角でステージに接近させる平行照明が見えるはずである。これにより各液滴に同じ屈折パターンが生じるであろう；それゆえ液滴グレアは各液滴の画像で同じ位置に発生して、それにより各液滴の中心からほぼ同じ角度および距離にある、各液滴の基準点が生成される。
液滴グレアは斜角照明を各種の角度で使用することによって生成され得るが、最良の結果を与えるであろう角度に対する範囲に制限があり得る。たとえば、照明が急角度で行われる場合、ここで生じた液滴グレアは液滴画像の中心に接近して発生し得て、このことにより蛍光強度などの液滴からの他の光学情報の収集が妨害され得る。他方、いくつかの実施形態において、照明があまりに浅い角度で照射される場合、いくつかの場合で、屈折光線のいずれも対物レンズによって収集されず、したがって液滴画像には液滴グレアが見られないであろう。所与の実験装置に好適である角度は実験的に決定され得る。
液滴グレアの存在および／または位置は画像を観察することによって決定され得て、光源の角度はそれに従って調整されて液滴グレアを所望の存在および／または位置で産生し得る。いくつかの実施形態において、第２の光源の角度は、約３０°未満、約３０〜約８０°、約８０°超、約４０°〜約７０°、約２０°、約３０°、約４０°、約５０°、約６０°、約７０°、約８０°などである。
いくつかの場合で、第２の光源を利用する実験装置は、図３５に表す通りであり得る。たとえば発光フィルタ５２０、二色性ミラー５２２、アーク灯５２４、励起フィルタ５２６、および対物レンズ５２８を備えた蛍光顕微鏡が提供され得る。測定される複数の液滴は顕微鏡ステージ５３０に位置決めされ得る。斜角照明５３２（たとえば第２の光源）は、ある角度（たとえば約５５°）で提供され得る。顕微鏡５３４の光励起は、検出装置または撮像装置（たとえばＣＣＤカメラなど）によって記録され得る。上の実験装置は、決して制限的ではなく、当業者は、追加の構成要素および／または日常的な技能のみで使用可能である他の機構を決定できるであろう。
複数の液滴の画像は、検出装置またはＣＣＤカメラなどの撮像装置によって取り込まれ得る。いくつかの実施形態において、規定の蛍光画像が得られるように、ＣＣＤカメラは狭いスペクトルの光（たとえば赤色光、緑色光など）のみにカメラまで通過させるフィルタを含み得る。２個以上のカメラが利用される例では、画像の取り込みは同期されても、されなくてもよい。詳細な実施形態において、画像の取り込みが同期されて、第１および第２の波長での蛍光情報の同時取り込みが可能となる。いくつかの実施形態において、第２の光源は、液滴グレアが少なくとも２つの画像の一方のみで観察される（たとえば緑色ＬＥＤ光源からの光は、緑色波長取り込みを有するカメラによって取り込まれた画像でのみ観察され得る）ように選択され得る。
いくつかの実施形態において、形成された液滴グレアがバックグラウンドよりも明らかに強力である場合、液滴の位置のソフトウェア識別は簡単な方法を使用して完了され得る。液滴グレアは一般に各液滴の中心からの方向および距離の両方に関して常に出現するため、液滴グレアを基準点として使用できる。斜角照明の装置に応じて、液滴グレアを液滴の中心から外して配置して、液滴識別およびデータ取り込みの両方に同じ画像フレームを与えることができる。したがって、斜角照明は点灯および消灯していてもいなくてもよく、ならびに／または画像をわずかに異なる時点で撮像してもしなくてもよい。
収集した画像は以下のように処理され得る。いくつかの場合で、（たとえば液滴グレアを含む）少なくとも１つの画像は、各液滴の液滴グレアを測定する簡単な強度閾値プログラムを使用することによって処理され得る。ソフトウェアが計算して、または人間の入力を使用して、液滴グレアと液滴の中心との間の角度および／または距離を決定することができる。いくつかの実施形態において、液滴グレアと液滴の中心との間の角度および／または距離は１回記録され得る（たとえば実験装置が変更されない場合）。ソフトウェアを使用して、（たとえば対応する液滴グレアに対する各液滴の位置を決定するために）各液滴グレアに対するサンプリングマスクが生成され得る。サンプリングマスクは、対応する時点で取り込んだ各画像（たとえば第１および第２のカメラによって取り込まれた第１および第２の画像）に重ねることができる。これにより、シグナル（たとえば蛍光強度読み取り値）が取り込まれる場合に液滴内に境界を定義する各液滴のためのマーキングシステムの生成が可能となる。この方法の詳細な例を実施例１２に記載する。
いくつかの場合で、複数のマイクロ流体液滴を表面（たとえばマイクロ流体チャネルまたは封じ込め区域）に撮像するために使用され得る撮像システムが提供され得る。該撮像システムは、表面上に配置された複数のマイクロ流体液滴に向かって直交するように光を集束させることができる第１の光源と、表面上に配置された複数のマイクロ流体液滴に向かって実質的に非直交角度で光を集束させることができる第２の光源を含み得る。たとえば第１の光源は顕微鏡からの光源であり、第２の光源はランプ、ＬＥＤなどであり得る。撮像システムは、表面に配置された複数のマイクロ流体液滴から生じる散乱（たとえば液滴グレア）および非散乱光（たとえば蛍光）を撮像できる撮像装置も含み得る。非散乱光は、第１の光源から発生し得て、散乱光は第２の光源から発生し得る。いくつかの場合で、撮像装置は、表面に配置された複数のマイクロ流体液滴から生じる散乱および非散乱光を同時に撮像することが可能であり得る。たとえば撮像装置は、カメラ、たとえばＣＣＤカメラであり得る。いくつかの場合で、撮像システムは２個以上の撮像装置、少なくとも２個の撮像装置、少なくとも３個の撮像装置、少なくとも４個の撮像装置などを含み得る。当業者は、記載した撮像システムに付随し得るさらなる機構および構成要素（たとえば第３の光源、フィルタ）を決定することができるであろう。撮像システムは、少なくとも１０００個の、少なくとも５０００個の、少なくとも１００００個の、少なくとも２００００個の、少なくとも３００００個の、少なくとも４００００個の、少なくとも５００００個の、少なくとも１０００００個などの液滴を同時に撮像することが可能であり得る。
すべてではなく、いくつかの実施形態において、本明細書に記載したシステムおよび方法のすべての構成要素はマイクロ流体性である。「マイクロ流体性」は本明細書で使用するように、１ｍｍ未満の断面寸法、および少なくとも約３：１の長さの、チャネルに垂直な最大断面寸法に対する比を有する少なくとも１つの流体チャネルを含む装置、器具またはシステムを指す。「マイクロ流体チャネル」は本明細書で使用するように、この基準を満たすチャネルである。
２個以上の液滴が当業者に公知であるように、たとえば組成物、表面張力、液滴サイズなどのために普通は融合または合体できない場合に、２個以上の液滴を融合または合体させて１個の液滴にすることができるマイクロ流体システムが提供され得る。２個以上の液滴が融合される実施形態の例は、本明細書で上述されている。流体液滴は、たとえばそれぞれ参照により本明細書に組み入れられている、Ｌｉｎｋらによる“Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ”という名称の、２００６年７月２７日Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００６／０１６３３８５として公開され、２００５年１０月７日に出願されたＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．１１／２４６，９１１；またはＬｉｎｋらによる“Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ”という名称の、２００７年１月４日にＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００７／０００３４４２として公開され、２００６年２月２３日に出願されたＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．１１／３６０，８４５で議論されているような任意の好適な技法を使用して共に融合され得る。一例として、マイクロ流体システムにおいて、液滴のサイズに対する液滴の表面張力によって、液滴の融合または合体の発生が防止され得る。一実施形態において、２個の液滴は、液滴の融合または合体を発生させるように２個の液滴の電気的相互作用を上昇させ得る、反対の電荷（すなわち必ずしも同じ大きさではない、正および負の電荷）を与えられ得る。電荷（正または負）は、テイラーコーンの使用によって、またはその他の好適な技法によって液滴に印加され得る。たとえば電場は液滴を含有する反応装置に印加され、液滴はコンデンサを貫流して、化学反応が起こって液滴を帯電させて、該液滴を反対の湿潤特性などを持つ領域上を流動させ得る。
チャネルの「断面寸法」は、流体流の向きに対して垂直に測定される。本発明の構成要素の大半の流体チャネルは、約２ｍｍ未満の、いくつかの場合では約１ｍｍ未満の最大断面寸法を有する。１セットの実施形態において、本発明の実施形態を含有するすべての流体チャネルはマイクロ流体性であるか、または約２ｍｍまたは約１ｍｍを超えない最大断面寸法を有し得る。別の実施形態では、流体チャネルは一部は単一の構成要素（たとえばエッチングされた基材または成形ユニット）によって形成され得る。もちろん、より大きいチャネル、チューブ、チャンバ、リザーバなどを使用して、流体を大量に収容して、流体を本発明の構成要素に送達することができる。１セットの実施形態において、本発明の実施形態を含有するチャネルの最大断面寸法は、約５００ミクロン未満、約２００ミクロン未満、約１００ミクロン未満、約５０ミクロン未満、または約２５ミクロン未満である。
「チャネル」は本明細書で使用するように、流体流を少なくとも部分的に方向付ける物品（基材）の上または中の機構を意味する。チャネルは任意の断面形状（円形、楕円形、三角形、不規則、正方形または長方形など）を有することができ、被覆することもしないこともできる。チャネルが完全に被覆される実施形態において、チャネルの少なくとも一部は、完全に包囲された断面を有することができるか、またはチャネル全体はその入口および出口を除いて、その全長に沿って完全に包囲され得る。チャネルは、少なくとも約２：１、より通例には少なくとも約３：１、少なくとも約５：１、または少なくとも約１０：１またはそれ以上の縦横比（平均断面寸法に対する長さ）も有し得る。開チャネルは一般に、流体輸送に対する制御を促進する特徴、たとえば構造的特徴（細長いくぼみ）および／または物理的もしくは化学的特徴（疎水性対親水性）または流体に力（たとえば含有力）を及ぼすことができる他の特徴を含むであろう。チャネル内の流体は、チャネルを部分的または完全に充填し得る。開チャネルが使用されるいくつかの場合で、流体は、たとえば表面張力（たとえば凹または凸メニスカス）を使用してチャネル内に保持され得る。
チャネルは、たとえば少なくとも約５ｍｍもしくは約２ｍｍ未満の、または約１ｍｍ未満の、または約５００ミクロンの、約２００ミクロン未満の、約１００ミクロン未満の、約６０ミクロン未満の、約５０ミクロン未満の、約４０ミクロン未満の、約３０ミクロン未満の、約２５ミクロン未満の、約１０ミクロン未満の、約３ミクロン未満の、約１ミクロン未満の、約３００ｎｍ未満の、約１００ｎｍ未満の、約３０ｎｍ未満の、または約１０ｎｍ未満の流体流に対して垂直な最大寸法を有する任意のサイズであり得る。いくつかの場合で、チャネルの寸法は、流体が物品または基板を自由に貫流できるように選択され得る。チャネルの寸法も、たとえばチャネルである体積流量または線流量を与えるように選択され得る。もちろんチャネルの数およびチャネルの形状は、当業者に公知の任意の方法によって変更され得る。いくつかの場合で、２個以上のチャネルまたは毛管が使用され得る。たとえば、２つ以上のチャネルが使用され得るのは、それが相互の内側に位置決めされる、相互に隣接して位置決めされる、相互に交差して位置決めされるなどの場合である。
本発明で使用され得るマイクロ流体システムの非限定的な例は、たとえばその全体がそれぞれ参照により本明細書に組み入れられている、“Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ”という名称の、２００６年７月２７日にＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００６／０１６３３８５として公開され、２００５年１０月７日に出願されたＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．１１／２４６，９１１；“Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｆｌｕｉｄ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ”という名称の、２００５年８月１１日Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００５／０１７２４７６として公開され、２００４年１２月２８日に出願されたＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．１１／０２４，２２８；“Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ”という名称の、２００７年１月４日にＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００７／０００３４２として公開され、２００６年２月２３日に出願されたＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．１１／３６０，８４５；“Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ”という名称の、２００６年９月１４日にＷＯ ２００６／０９６５７１として公開され、２００６年３月３日に出願されたＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００７７７２；“Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”という名称の、２００７年３月８日にＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００７／００５４１１９として公開され、２００６年３月３日に出願されたＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．１１／３６８，２６３；“Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ”という名称の、２００７年３月２８日に出願されたＵ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．６０／９２０，５７４；ならびに“Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｒｏｐｌｅｔｓ Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｉｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｓｕｃｈ ａｓ Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”という名称の、２００６年の７月２７日にＷＯ ２００６／０７８８４１として公開され、２００６年１月２０日に出願されたＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００１９３８に開示されている。
いくつかの実施形態において、本発明のシステムは、非マイクロ流体装置であり得る。たとえば２個以上の液滴は、クエット剪断破断試験セル、振とうエマルジョン、および／または膜乳化を使用して融合、操作および／または合体され得る。いくつかの実施形態において、２個以上の液滴は、基板に含有された１個以上の場発生構成要素からの電場および／または磁場を使用して１個の液滴に融合、操作および／または合体され得る。試料との相互作用および／または試料の操作ができるように配置された複数の電場および／または磁場発生構成要素を含むシステムの非限定的な例は、それぞれ参照により本明細書に組み入れられている、Ｈａｍらによる“Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｏｂｊｅｃｔｓ”という名称の、２００６年１月２６日にＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００６／００２０３７１として公開され、２００５年４月１３日に出願されたＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．１１／１０５，３２２、および“Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｒｏｐｌｅｔｓ”という名称の、２００８年６月２６日に出願されたＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００７９４１に開示されている。
いくつかの場合で、磁場発生構成要素はアレイとして配列され得る。１個以上の電場および／または磁場発生構成要素を使用して構成要素を特定の順序で作動させて電場および／または磁場を発生させることによって、流体液滴または他の試料を基板に対して移動させることができる。たとえば２個の液滴は、その反対の電荷のために液滴の融合または合体を発生させるように２個の液滴の電気的相互作用を上昇させ得る、反対の電荷（すなわち必ずしも同じ大きさではない、正および負の電荷）を与えられることができる。たとえば電場は、１個以上の電場発生構成要素を使用して液滴に印加され得る。
一実施形態において、上の組成物の１つ以上を含有するキットが提供され得る。「キット」は本明細書で使用するように、本発明の組成物の、および／またはたとえば先に記載したような本発明に関連する他の組成物の１つ以上を含むパッケージまたはアセンブリを通例定義する。キットの各組成物は液体形（たとえば溶液で）、固体形（たとえば乾燥粉末）などで提供され得る。本発明のキットは、いくつかの場合で、説明書が本発明の組成物と関連していることを当業者が認識するような方式で、本発明の組成物と関連して提供される任意の形式の説明書を含み得る。たとえば説明書は、組成物および／またはキットに関連する他の組成物の使用、修飾、混合、希釈、保存、投与、構築、貯蔵、包装、および／または調製のための説明書を含み得る。説明書は、任意の方式で提供されるこのような説明を含有する好適な媒体、たとえば記載または印刷、言葉、音声（たとえば電話）、デジタル、光学、視覚（たとえばビデオテープ、ＤＶＤなど）または電子コミュニケーション（たとえばインターネットまたはウェブベースのコミュニケーション）として、当業者によって認識可能な任意の形式で提供され得る。
それぞれ参照により本明細書に組み入れられている、以下の参考文献：Ｗｅｉｔｚらによる“Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”という名称の、２００７年１２月２１日に出願されたＵ．Ｓ． Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．６１／００８，８６２およびＷｅｉｔｚらによる“Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”という名称の、２００８年９月１９日に出願されたＵ．Ｓ．Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．６１／０９８，７１０は、参照により本明細書に組み入れられている。またＷｅｉｔｚらによる“Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｆ Ｄｒｏｐｌｅｔｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｓｐｅｃｉｅｓ”という名称の、同日付に出願されたＵ．Ｓ．ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ ｐａｔｅｎｔが参照により本明細書に組み入れられている。
以下の実施例は、本発明の各種の実施形態を示すために含まれている。当業者は、本開示に照らして開示され、なお同様または類似の結果を得る具体的な実施形態において、本発明の精神および範囲から逸脱せずに多くの変更を行えることを認識するであろう。したがって、以下の実施例は本発明のある実施形態を例証するためであって、本発明の全範囲を例示するものではない。
（実施例１）
ＤＮＡ配列決定方法の非限定的な例を、以下の予言的な実施例に記載する。図は、例証目的のためだけに５ｍｅｒを使用して表示する。他の長さも使用され得る。さらに、ロックド核酸残基、および／またはユニバーサル残基などの修飾残基もいくつかの場合で使用され得る。
図６を参照して方法例を議論する。特にこの方法は、ビーズに基づく標識方法、修飾ヌクレオチド、および蛍光を使用する例である。図６Ａは、識別要素として使用される複数の色分けビーズ、たとえばＬｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが製造したようなビーズを示す。この実施例のビーズは、たとえば２つの別の染料の蛍光強度に基づいて１００の区別可能な種類に分類できる直径５μｍのビーズである（１５０）。これらのビーズに任意に１〜１００の番号を付ける。
ビーズは次のように識別のために使用され得る。これらの区別可能なビーズ４０個を、図６Ｂに示すように、１０個の構成要素をそれぞれ含有する４つのビーズ群に分割することができる（この実施例ではビーズ４１〜１００は使用しない）。この詳細な実施例では、すべての液滴は、（存在する各種類のビーズには、２個以上の同一のコピーがあり得るが）４つのビーズセットそれぞれから得た区別可能なビーズ１個を有する（図６Ｂ）。この実施例では簡単にするために、各ビーズは、（他の実施例では他の方法が使用され得るが）基数（１０）系で桁数値を表す。たとえばビーズ１、１１、２１、および３１が選択されて値１を表し得て、ビーズ１０、２０、３０および４０は値０を表す。詳細な例として、２１７６番目の溶液または標識は、ビーズ６（１５１）、１７（１５２）、２１（１５３）、および３２（１５４）（図６Ｃ）を含有する。
示した例において、この液滴は、いくつかの場合で１個以上のロックヌクレオチドおよび／またはユニバーサル残基を包含するように修飾され得る、標識核酸プローブ５’−＊ＧＡＴＣＴ−３’（１５５）（配列番号２）（ここで＊は、蛍光実体などの信号発信実体である）も含有する。核酸プローブおよびビーズを含有する溶液はそれぞれ個別に乳化およびプールされて、核酸プローブおよび少なくとも４つの区別可能なビーズを含有する分析用液滴の集合１５８を生成することができる（図６Ｄ）。標的核酸１５６がマイクロ流体装置（図示せず）に供給され、それぞれ核酸を含有する複数の液滴１５７がたとえば液滴−液滴融合技法によって形成される。液滴１５７は次に液滴１５８と融合されて、標的核酸、核酸プローブおよび対応する識別要素をそれぞれ含有する複数の融合液滴１５９を形成する。
標的核酸および核酸プローブの結合はこの例では次のように測定されるが、他の場合では他の技法も使用され得る。複数の融合液滴１５９は矢印１６０で示すようにチャネル１６７内へ通過して、液滴は液滴内の各ビーズが検出装置１６１の単一のファイルを通過するように変形を受ける。示した実施例において、核酸プローブが液滴内の核酸に結合する場合、ここでは検出装置を使用して測定可能である核酸プローブの蛍光スペクトルの変化があるであろう。液体内のビーズおよび信号発信実体は、検出装置１６１の単一のファイルをそれらが通過するときに測定され、生じた蛍光量が記録される。この実施例では、標的核酸および核酸プローブの結合を示す（たとえば核酸プローブからの消光剤の放出によって引き起こされる）信号発信実体の蛍光の変化がある場合、ここで液滴の同一性は液滴内に含有される４個の区別可能なビーズを決定することによって決定される。たとえば、検出装置によって測定されたビーズがビーズ６、１７、２１、および３２（プローブ標識核酸プローブ５’−＊ＧＡＴＣＴ−３’（配列番号２）に相当）として識別される場合、ここで標的核酸に５’−ＧＡＴＣＴ−３’（配列番号２）の補体が発生することが決定できる。
（実施例２）
この実施例は、ビーズベースの標識方法、Ｔａｑｍａｎプローブ、および蛍光を利用する。実施例１と同様に、液滴は、４セットの識別要素ビーズタイプそれぞれから得た１個の構成要素を有する。図７Ａは、図６に示したように、１個の液滴１７１中の考えられる構成要素の例を示す。この実施例の液滴ではＴａｑｍａｎ分析が使用されるであろう。
核酸プローブ１６９は、オリゴヌクレオチド１７４、信号発信実体１７２、および消光剤１７３を含み、消光剤は、光子の放出なしで別の染料により引き起こされた１つの染料の阻害である、蛍光（またはＦｏｅｒｓｔｅｒ）共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の使用により信号発信実体１７２からの蛍光を低減（または増強）する。この詳細な実施例で、信号発信実体はオリゴヌクレオチドの５’末端に、消光剤は３’末端に見出される。
Ｔａｑｍａｎプローブは、図７Ｂの１７５によって示すように標的核酸にアニーリングする。次にＴａｑポリメラーゼは、１７６によって示すようにＴａｑｍａｎプローブに達するまでヌクレオチドを付加する。非相補的Ｔａｑｍａｎプローブは置換される。相補的Ｔａｑｍａｎプローブは、Ｔａｑポリメラーゼ５’→３’エキソ活性によって標的核酸から分解される。それゆえ１７７に示すように、核酸プローブが標的核酸と結合する場合、消光剤１７３は信号発信実体１７２から分離して、１７８に示すように信号発信実体１７２を測定できるようにする。
実施例１と同様に、標的核酸と核酸プローブの結合はここで任意の好適な技法を使用して測定できる。この実施例では、複数の核酸プローブ（この場合、信号発信実体および消光剤に結合されている）および１つ以上の識別要素が組み合されて分析的液滴の集合１７９が形成されて、図７Ｃに示すように標的核酸と、この実施例ではＴａｑポリメラーゼを含有する複数の液滴１８０と融合される。液滴１７９は次に液滴１８０と融合されて、複数の融合液滴１８１を形成する。液滴１８１は矢印１８２によって示すように、チャネル１６７を通過して、検出装置１６１によって測定される。核酸プローブが標的核酸に結合する場合、ここで信号発信実体が放出され得る。したがって信号発信実体の蛍光の差を使用して、核酸プローブと標的核酸との結合を測定できる。
（実施例３）
この詳細な実施例は、ＤＮＡ連結、ビーズ標識および蛍光を利用する。Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは、図８Ａに示すように、１００個の区別可能なビーズ２１０に分離できるビーズを提供している。各ビーズタイプは特定のバイオアッセイに特異的な試薬でコーティングすることが可能であり、試料からの特異的検体の捕捉および検出が可能となる。レーザは、各ビーズ粒子を識別する内部染料、およびアッセイ中に捕捉された任意のレポータ染料も励起する。
図８Ｂおよび８Ｃは、以下を示す：４０個のビーズを区別可能なビーズ１０個をそれぞれ含む４つの群に分けて、各ビーズは、第１のセットの１０個のビーズが「Ａ」型セットおよび各種のユニバーサル残基２１４（すなわちビーズ１〜１０はそれぞれオリゴヌクレオチドプローブセット５’−ＡＮＮＮＮ−３’がそれらに結合されている）を有し、第２のセットの１０個のビーズタイプ（すなわちビーズ１１〜２０）は、「Ｃ」型オリゴヌクレオチド２１３（すなわち５’−ＣＮＮＮＮ−３’）がそれらに結合され、第３のセットの１０個のビーズタイプ（すなわちビーズ２１〜３０）は、「Ｇ」型オリゴヌクレオチド２１２（すなわち５’−ＧＮＮＮＮ−３’）がそれらに結合され、第４のセットの１０個のビーズタイプ（すなわちビーズ３１〜４０）は、「Ｔ」型オリゴヌクレオチド２１１（すなわち５’−ＴＮＮＮＮ−３’）がそれらに結合されるように、結合されたプライマを有するであろう。
各ビーズタイプは、先に議論した系に類似した基数（１０）系の数値も表す。たとえばビーズ１、１１、２１、および３１は値１を表す（簡単にするために、ビーズ１０、２０、３０および４０は値０を表す）。第１の１０個のビーズタイプ（Ａ型セット）は、１の位の値（０〜９の数値）を表す。第２の桁は「Ｃ桁」であり、１０の位の値を表す。第３の桁は「Ｇ桁」であり、最後の桁は「Ｔ桁」である。４桁数は、この詳細な例では、４０個のビーズタイプによってＴＧＣＡの順でコードされる（図８Ｄ）。たとえば、２１７６番目の液滴タイプ２１９は、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズタイプ６−Ａ（２１５）、１７−Ｃ（２１７）、２１−Ｇ（２１６）、および３２−Ｔ（２１８）を含有する（図８Ｃおよび７Ｄ）。図において、一例として、液滴２１９は、核酸プローブ、たとえばプローブ５’−＊ＧＡＴＣＴ−３’（配列番号２）（２２６）も（その配列プローブの複数のコピーが液滴内に存在し得るが）含有する。
標的核酸および核酸プローブの結合はこの例では次のように測定されるが、他の場合では他の技法も使用され得る。核酸プローブおよびビーズを含有する溶液はそれぞれ個別に乳化することが可能であり、次にエマルジョンはプールされて分析用液滴２２０の集合が生成される。すべての液滴は、４セットそれぞれから得た１個のビーズを有するであろう（しかしそのビーズの複数のコピーが存在し得る）。核酸プローブおよびビーズは次に、液滴中に共にカプセル化されることができる。標的核酸およびＤＮＡリガーゼを含有する複数の液滴２２１も提供される。プールされたエマルジョンライブラリ液滴は、複数の２２１の液滴と（矢印２２２によって示すように）融合されて（図８Ｅ）、複数の融合液滴２２３を形成する。融合液滴２２３は、矢印２２４によって示すように、検出装置２２５を通過する。核酸プローブのテンプレートで方向付けされた結合によって、ビーズ上で核酸プローブおよびオリゴヌクレオチドの両方が相互に隣接しており、標的核酸に相補的である場合、ビーズは標的核酸と結合されるようになる。４個のビーズが１つを除くすべての位置でユニバーサル核酸残基を含有するため、図８Ｆに示すように、ビーズ上のオリゴヌクレオチドの核酸プローブへの結合が起こるように、４個のビーズのうち１個のみが標的核酸および核酸プローブに隣接して位置決めされる。
ビーズ、標的核酸、および核酸プローブの結合はここで任意の好適な技法を使用して測定できる。たとえば図８Ｆに示すように、上述の４個のビーズ（２１５、２１６、２１７、および２１８）はもちろんのこと、核酸プローブ２２６および標的核酸２２７も含有する液滴が提供される。核酸プローブの配列が標的核酸の配列に相補的である場合、核酸プローブは標的核酸と結合するであろう。４個のビーズのうち１個は、図８Ｆに示すように（この図の２１６）、隣接して位置決めされている場合に核酸プローブの配列に連結可能であるオリゴヌクレオチドも含む；他の配列（２１５、２１７、および２１８）は、配列のヌクレオチドミスマッチのために隣接して位置決めできない。核酸プローブ２１６は、標的核酸プローブと結合したビーズのオリゴヌクレオチドに連結されるようになり、それゆえビーズ２１６のオリゴヌクレオチドは、核酸プローブ２２６に隣接する標的核酸２２７と結合できるようになる。ビーズは、それらが単一のファイルのチャネル狭窄部を通過する通過するときにデコードされて、ビーズに連結（すなわち結合）された標識核酸プローブの量が定量される。この実施例で示すように、「Ｇ」桁ビーズ（ビーズ２１）２１６は核酸プローブ２２６と結合され、このことは標的核酸に相補的な配列が５’−ＧＡＴＣＴＧＮＮＮＮ−３’（配列番号３であり、それゆえ標的核酸配列は配列５’−ＣＡＴＡＴＣ−３’（配列番号４）を含有することを示す。
上で議論したように、ビーズと結合したオリゴヌクレオチドの異なる残基は、他の実施形態と同様に他の位置、たとえばオリゴヌクレオチドの５’末端からの第２の位置、たとえば５’−ＮＸＮ（ｎ−２）−３’に配置され得る。この実施例を図８Ｇに示す。この実施例において、識別要素２２９は、ビーズおよび配列５’−ＮＧＮＮＮ−３’を有するオリゴヌクレオチドを含む。区別可能なビーズに結合するオリゴヌクレオチドを含む３つの他の識別要素（５’−ＮＣＮＮＮ−３’、５’−ＮＡＮＮＮ−３’、５’−ＮＴＮＮＮ−３’）も、液滴中に存在する。この実施例において、識別要素２２９は、核酸プローブ２２６の標的核酸２２７と結合される。識別要素および核酸プローブは、上述の実施形態と同様に連結することができる。ビーズは上で議論したようにデコードされて、標的核酸に相補的な配列が５’−ＧＡＴＣＴＮＧＮＮＮ−３’（配列番号５）であり、標的核酸が配列５’−ＣＸＡＣＡＴＣ（配列番号６）（Ｎはユニバーサル塩基であり、ＸはＡ、Ｃ、ＧまたはＴのいずれか１つである）を含有することを示し得る。
（実施例４）
いくつかの、しかしすべてではない実施形態において、本明細書に記載したシステムおよび方法のすべての構成要素がマイクロ流体性である。検出のための機器装置をここで示す。
機器は、本実施例では、蛍光強度および蛍光偏光の両方を測定するように構成され得る光学縦列を含む。図９は、蛍光偏光（ＦＰ）検出に関する情報を表す。光学縦列は、光学機器内の一連のミラー、レンズおよびプリズムなどである。いくつかの実施形態において、光学縦列は、３個のレーザ、約５個の検出装置を含み得て、３０μｍ液滴内の約１０００個以上のフルオロフォアを測定することができる。蛍光分子が偏光によって励起される場合、分子がその発光寿命の間に著しく回転しないと仮定すると、蛍光分子は実質的に同じ偏光の光を放出するであろう。偏光解消、すなわち同じ偏光方向で放出される光の低減は、分子がその発光寿命の間に回転するときに起こる。より大型の分子３１１に結合した（そしてより長い転動時間を示す）染料は、溶解した遊離染料よりも低速で光を偏光解消し、したがって光は図９Ａに示すように、偏光を維持するであろう３１３。他方、より小型の分子３１２に結合した染料は、溶解した遊離染料よりも高速で光を偏光解消し、したがって光３１４はもはや偏光されないであろう。図９Ｂは、異なる染料がその蛍光寿命に応じて異なる偏光を呈するであろうことを示す。ＦＰは、染料が結合する分子の分子量によっても影響される。図９Ｃはこのことを表し、遊離フルオレセイン染料３１５、フルオレセイン標識２０ｍｅｒオリゴヌクレオチド３１６、および第２のＤＮＡ分子にハイブリダイズしたフルオレセイン標識２０ｍｅｒオリゴヌクレオチド３１７のＦＰを示す。この詳細な場合では、転動速度は残基スタッキングのために低下し得る。
（実施例５）
この実施例は、本発明の一実施形態において、単一の液滴内中の少なくとも４個の異なる着色ビーズならびに蛍光偏光（ＦＰ）および／または蛍光強度（ＦＩ）を、液滴がチャネルを通過するときに分析およびデコードする装置を示す。レーザは、Ｐｏｗｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，ＡＲ）を含む複数の製造者から購入され得る。光学縦列例を図１０に示す。この光学縦列はモジュール式であり、フィルタおよびレーザは必要なときに交換できる。検出装置を５個備えたこの構成例は、２つの異なる発光波長にてＦＰを読み取ることができる。該装置は、ＦＰを３つのチャネルで測定できるであろう。ＰＤＭＳチップが上に設置されるステージは加熱される。
この図では、使用される励起源はレーザであり、平行光線として照射される各種の色の複数のレーザを含むことができる。励起は、レーザ波長は反射するが、他のすべての波長は通過させる２色性レーザ線ミラーから反射される。レーザは、組み合されたテレスコープ型レンズを通過することによって拡大することができるか、または円柱レンズを通過することによってレーザ線に変わることができる。それらは次に、開口数の高いレンズを通じて集束されて小さいスポットとなる。高い開口数によって、試料により放出された蛍光の大きい立体角が対物レンズによって逆方向に取り込まれるようになる。蛍光は次に２色性ミラーを通過して、図に示すように、使用される特定のフルオロフォアおよびフィルタによって、各種の波長が検出装置アセンブリ中に反射される。蛍光偏光の測定には、偏光ビームスプリッタが必要である。偏光ビームスプリッタは一方の偏光（Ｓ）を反射して、他方（Ｐ）を通過させる。それぞれの強度は次に、別個のＰＭＴを使用して測定される。次に値を組み合せて、ＧがＧ因子であり、通常は１である、式（Ｓ−Ｇ＊Ｐ）／（Ｓ＋Ｇ＊Ｐ）に従って、蛍光極性を計算する。［ｍＰ］の単位で数値を生成するために、上の計算の数に１０００を掛ける。代表的なＦＰ値は、約２０〜約１０００ｍＰの範囲に及ぶ。検出装置アセンブリは、ＰＭＴ、ダイオード、またはアバランシェダイオードであり得る。シグナルは、ＬａｂＶＩＥＷで記載されたＮＩ ＦＰＧＡカード実行カスタムコードによって、コンピュータを使用しても監視される。図１１のアセンブリは同様であるが、光学テーブル上に配置されている。この実施形態では、ＦＰを最適化するために温度勾配が必要であり得る。これは装置ステージの下にペルチェ素子を配置して温度を制御することによって実施される。一実施形態において、実験は１ｋＨｚの周波数（１秒当り１，０００液滴）で実行され、ＧＨｚ周波数でデータを収集するであろう。別の実施形態において、検出感度は、異なるＰＭＴの選択、より高い染料濃度を持つビーズの選択、および／または液滴中の染料標識の量の増加によって上昇され得る。いくつかの例において、装置は、ビーズの目詰まりを防止するために、幅広チャネルを備え得る、および／または流体力学的集束を使用し得る。いくつかの例では、一方の狭窄部が目詰まりした場合に、第２の狭窄部が作動可能となるように、チップ上で狭窄部を重複させることもできる。
蛍光スタンドおよび液滴モニタを表す詳細な装置構成を図１１に示す。レーザは左上に配置される。赤色レーザ４００（３０ｍＷ、６３５ｎｍ）を使用してＣｙ５蛍光を作用させる。緑色レーザ４０１（１２５ｍＷ、５３２ｎｍ）を使用してＨＥＸ蛍光を作用させる。ビームは、５６２ｎｍ以下すべてを反射する５６２ ２色性ミラー４０２（Ｓｅｍｒｏｃｋ Ｂｒｉｇｈｔｌｉｎｅ ＦＦ５６２−Ｄｉ０２−２５×３６）を使用して平行される。ビームは、左下のミラー４０３から右下の光学機器４０４中に反射する。光は、４８８／５３２／６３８レーザ線２色性ミラー４０５（Ｓｅｍｒｏｃｋ Ｂｒｉｇｈｔｌｉｎｅ Ｄｉ０１Ｔ４８８／５３２／６３８−２５×３６×５．０）を通過するが、このミラーはこれらに近い波長は通過させて、他の波長はすべて反射する。ビームは次に、ＩＲを反射して、他の波長は通過させるＩＲホットミラー４０６（Ｅｄｍｕｎｄ Ｏｐｔｉｃｓ ＮＴ４３−９５５）を通過する。次にビームは対物レンズ（Ｍｉｔｏｔｕｙｏ Ｐｌａｎ ＡＰＯ、５×、１０×、２０×、または５０×）の背面に入り、試料上に集束される。いくつかの場合で、倍率が大きければ大きいほど、検出がより高感度となる。このことは、より高倍率の対物レンズがより高い開口数を有し、したがって試料から放出された光のより大きい立体角を取り込むためであると考えられている。試料４０７を、２インチ（５０．８ｍｍ）移動するＸＹＺ平行移動ステージ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ）上に載せる。逆方向に移動する２つの撮像経路がある。蛍光撮像は、光源としてレーザを使用する。直接撮像は、蛍光データを取り込む間に画像が取り込まれるようにする赤外照明を使用して実施する。ＩＲ光源４０８は、１５ｍｍレンズ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ，ＬＡ １２２２）を通じて集束されるＩＲ−ダイオード（Ｄｉｇｉｋｅｙ）である。ＩＲおよび蛍光ビームは次に、対物レンズを通じて逆戻りする。ＩＲはＩＲミラー４０６からＣＣＤカメラ（Ｓｏｎｙ ＸＣＤ−Ｖ５０、右上）内へ反射される。蛍光はＩＲミラーを介してレーザ線２色性ミラーまで通過して、そこで検出ＰＭＴ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｈ５７８４−２０、図の中心）内へ反射される。緑色ＦＰ ＰＭＴ ４１０および赤色ＰＭＴ４１１の両方が存在する。ＩＰ検出装置およびカメラを使用して液滴を描出する。ＩＰ検出装置およびカメラを使用して、各種のテンプレート液滴の開始と収量を監視することもできる。ＨＥＸシグナルをＦＰ検出装置内に反射する５９３ｎｍハイパス２色性ミラー４１２（Ｓｅｍｒｏｃｋ Ｂｒｉｇｈｔｌｉｎｅ ＦＦ５９３−Ｄｉ０２−２５ｘ３６）がある。これはＣｙ５シグナル（約６８０ｎｍ）をＣｙ５チャネルＰＭＴ内に通過させる。ＦＰ検出装置（画像の中心のＴ形の物体）は、５０−５０ビームスプリッタ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ ＣＭ１−ＢＳ１）内に、互いに垂直に取り付けられたＰＭＴを２個含む。ビームスプリッタの前には５６０／２５バンドパスフィルタ（Ｓｅｍｒｏｃｋ Ｂｒｉｇｈｔｌｉｎｅ ＦＦ０１−５６０／２５−２５）が取り付けられている。各ＰＭＴの前には偏光子（Ｍｅａｄｏｗｌａｒｋ Ｏｐｔｉｃｓ ＤＰＭ−１００−ＶＩＳ１）およびｆ＝２５ｍｍレンズ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ ＬＡ１９５１）が取り付けられている。ＰＭＴは回転ケージマウント（Ｔｈｏｒｌａｂｓ ＣＲＭ１）に取り付けられているので、それらは相互に対して９０度で回転することができる。
この詳細な実施例において、該装置は、信号発信実体を励起させるために５３２ｎｍ緑色レーザを、ビーズを色分けするために使用した染料からの赤色および近赤外蛍光を励起させるためには６３５ｎｍダイオードレーザを使用する。別の実施例において、識別要素としてのＬｕｍｉｎｅｘビーズおよびヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）で標識した核酸プローブを利用するとき、装置は、ＨＥＸチャネル（約５６０ｎｍ）でＦＰを読み取って核酸プローブが標的核酸に結合しているか否かを決定するように構成され得て、ＦＩもＨＥＸおよびＣｙ５両方のチャネル（約６９０ｎｍ）によって読み取られ得る。
ＰＭＴデータはデジタル処理され得て、デジタルシグナルはＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔフィールドプログラマブル・ゲート・アレイ（ＮＩ−ＦＰＧＡ）カードによって解析される。このゲートアレイは、数百キロヘルツ同時におよび／または複数のチャネルのデータを取り込みおよび解析するようにプログラムされ得る。ＦＰＧＡカードは、液滴が流れてレーザを通過するためにピークとして出現するときに、液滴を測定するようにプログラムされ得る。液滴が検出装置の前にある期間にわたって液滴が測定されるときに、いくつかの場合では各色チャネルの最大強度、および／またはその時間積分を監視することができる。次にこのような測定値を組み合せて、標的核酸と関連する識別要素および核酸プローブの蛍光偏光（たとえば信号発信実体により）を測定することができる。
複数の区域を加熱するマイクロ流体チップは加熱ステージ上に配置され得る。チップ上の高温区域（たとえば９５℃）と温区域（たとえば６５〜７２℃）との間を蛇行するチャネルを下る水性液滴中の反応をサイクルすることによって、２温度サイクルＰＣＲがチップ上で実施され得る。
ＰＭＴシグナルは、ＣＡ−１０００接続アセンブリの内部に取り付けられたＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔコネクタブロックに入力される。コネクタブロックは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ小型ＦＰＧＡカードに差し込まれている１本のケーブル内にＰＭＴシグナルをまとめる。カードはＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ＸＰを実行中のＰＣにインストールされ得る。データは、Ｌａｂ ＶＩＥＷプログラミング環境で開発されたソフトウェアを使用して取り込みおよび解析することができる。
ミクロスフェア蛍光はバルクで、Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｌａｂ ＭＡＰハードウェアおよびソフトウェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を使用して測定され得る。緑色蛍光測定値は、ＦＩＴＣ校正粒子のＭＥＳＦユニット用のＱｕａｎｔｕｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＫｉｔおよびＱｕｉｃｋＣａｌソフトウェア（すべてＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより）を使用して、同等の溶解性蛍光色素の分子（ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｏｆ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ、ＭＥＳＦ）に変換され得る。ミクロスフェアのみが寄与する緑色蛍光は、すべてのデータ点から引かれるであろう。ビーズ蛍光およびプローブ結合の液滴内測定は上述の装置を使用するであろう。
（実施例６）
この実施例は、市販のＬｕｍｉｎｅｘビーズ（直径５．６ｕｍ）に似た、複数の区別可能な蛍光ビーズの調製について説明する。ＦＰは、染料濃度とは無関係であり得て（たとえばフルオレセインの１Ｍ濃度は、同じＦＰを０．０１Ｍとして有する）、標識の際に独立変数として処理され得る。したがって、１つの染料が２次元において１０単位で変化する場合、それは１００の染料標識を生成するために使用できる。したがって２つの染料によって、１０，０００の標識が生成され得る。図１２は、染料をより大きい分子に結合することによって、染料のＦＰを変更できることを示す。図１２Ａは、フルオレセイン３３０、ビオチン３３１およびビオチン＋ストレプトアビジン３３２のＦＰを示す。図１２Ｂは、２つの異なる化合物の相対濃度を変化させることによって、総ＦＰ値を制御自在に変更できることを示す。ＦＰがフルオロフォアの濃度とは無関係に制御され得ることに注意することが重要である。
図１３は、蛍光強度（ＦＩ）およびＦＰが無関係に制御できることを示す。したがって、染料濃度および液滴ＦＰ値の範囲を拡大することによって、多くの識別要素を生成することができる。図１３Ａは、発光スペクトルが重複して、それぞれ異なるＦＰを有する２つの染料を混合したときの結果を示す。２つの染料を各種の比で混合すると各種のＦＰ値が得られ、染料の総濃度を変更すると各種のＦＩが得られる。図１３Ｂは、総ＦＩを変更するための広いスパンを表す、比較的広範な濃度範囲を示す。この図は、図１３Ａに示した染料の総濃度の１０倍の上昇も含む。
（実施例７）
識別要素はいくつかの場合で、直径約１０ｎｍ〜１００ｕｍに及ぶサイズのポリスチレンビーズであり得て、ビーズは染色され得る。一例として、利用される染料は、近赤外および／または赤外領域にまで及ぶ蛍光を呈するスクアリン酸ベースの分子であることが可能である。これにより独立した濃度の２つ以上の染料が各ビーズに均一に吸収されて、ビーズ中に存在する染料の数それぞれについて複数の蛍光シグナルが生じる、再現プロセスが可能となる。異なる蛍光特徴を備えたビーズの集団を作製するために、この実施例では、得られた集団が前の集団と光学的に重複しないように、染料の割合を十分に増大することによって、赤色：オレンジ色染料の比を変更することができる。たとえば、ビーズの所与の集団の２つの染料の濃度と前記集団のＸ−Ｙマップの位置との間に関係があり得る。各位置は、線形蛍光チャネルユニットで表されるような第１の色（ＦＬ３）または第２の色（ＦＬ２）の染料の強度によって割り当てられ得る。ビーズがカラムを垂直に上昇するとき、ビーズ内の第１の色および第２の色の染料の量はどちらも増加させることができる。このことは、一方の染料から他方の染料へのエネルギー移動のためであり得る。列を左から右へ水平に移動するとき、定常のＦＬ３値を維持するために、一方の染料を減少させることができる。これは、一方の染料のスペクトルが他方の染料の領域に重複するためであり得る。この方法を使用して、ビーズの複数の重複しない集合を構築することができる。２つのパラメータ、すなわち蛍光色および色強度または輝度（蛍光チャネル単位トで表される）を利用してビーズを分類することができる。
（実施例８）
この実施例は、一実施形態によるＤＮＡテンプレート調製について説明する。この実施例では、改良Ａｅｒｏｍｉｓｔ Ｎｅｂｕｌｉｚｅｒ（Ａｌｌｉａｎｃｅ Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｒｕｓｓｅｌｌｖｉｌｌｅ，ＭＯ）を使用して、ＤＮＡ断片化を実施する。噴霧された断片のサイズ分布は、ＤＮＡ １０００ ＬａｂＣｈｉｐを使用してＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）で、噴霧物質の分割量２ｕＬを分析することによって決定できる。
ＤＮＡ噴霧によって、圧倒的多数の摩滅末端を持つ断片が生成された。断片は、平滑末端であり、各種の酵素、たとえばＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ断片）（ＮＥＢ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）の活性によってホスホリル化され得る。研磨反応物は、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎカラムで精製され得る。
ゲノムＤＮＡライブラリの断片化および研磨の後に、プライマ配列をＤＮＡ断片の各末端に付加することができる。４４塩基プライマ配列（「アダプタ」）は、５’２０塩基ＰＣＲ増幅プライマと、続く２０塩基配列決定プライマを含む２本鎖オリゴヌクレオチドである。アダプタの２つのクラスである、アダプタＡおよびアダプタＢを各反応で使用することができる。ＡアダプタとＢアダプタは、両方のヌクレオチド配列およびＢアダプタでの５’ビオチンタグの存在で異なる。アダプタ対は、平滑末端の断片化ゲノムＤＮＡへの定方向連結を可能にするように設計される。たとえば、アダプタＡはＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＣＣＡＴＣＴＧＴＴＣＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＣＡＧ（配列番号７）であり、アダプタＢは５ビオチンＴＥＧ／ＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＡＧ（配列番号８）である。各アダプタ対で、ＰＣＲプライミング領域は、５’４塩基突出および平滑末端３’領域を含有する。方向性は、平滑末端ゲノムＤＮＡ断片に連結されたアダプタの３’平滑末端側として達成されるであろうが、５’突出はアダプタのＰＣＲプライマ領域への連結を防止する。２％アガロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）／ＴＢＥスラブゲルは、臭化エチジウム１０ｍｇ／ｍＬストック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）４．５ｕＬと共にゲル精製に使用することができる。３’接合部における２つの切れ目は、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、大型断片の鎖置換作用によって修復できる。ストックＭ−２７０ストレプトアビジンビーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を使用すると、ＡＢリンカー連結断片が単離され得る。１本鎖ライブラリは、使用前に室温まで加温しておいたＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）の１個のカラムで濃縮されるであろう。
（実施例９）
この実施例は、本発明の一実施形態において、液滴の集合の調製について説明する。この実施例では、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズは特定のバイオアッセイに特異的な試薬でコーティングされ、試料からの特異的検体の捕捉および検出が可能となる。レーザは、各ビーズを識別する内部染料、およびアッセイ中に捕捉された任意の信号発信実体も励起した。
カルボキシル化ミクロスフェア（５×１０６、４００ｕＬ）は、Ｌｕｍｉｎｅｘ（ビーズ製造者）の勧告に従って核酸プローブに結合される。結合反応の成否は、結合されたミクロスフェアを、ビーズ結合配列に相補的なモル過剰のビオチン化オリゴヌクレオチドによってハイブリダイズすることによって評価され得る。有効な結合によって、２０００〜４０００Ｕまでの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を持つミクロスフェアが産生される。１０００未満のＭＦＩを持つミクロスフェアは、いくつかの場合で、使用されるミクロスフェアが良好な強度を有するように置換することができる。
分析用液滴の集合を調製する一例として、適切に標識されたビーズを９６ウェルプレートで、各ウェルが４個のビーズのセットを含有し、（各ビーズの複数の同一のコピーが存在し得るが）各ビーズが他のビーズから区別できるように懸濁させることができる。各ウェルは、核酸プローブのライブラリから選択される核酸プローブがそのウェルに添加されるであろう。核酸プローブは標識され得る。各ウェルの内容を別々に使用して、３０ミクロン液滴のエマルジョンが作製されるであろう。各エマルジョン中で得られた水性液滴はそれぞれ、４つの区別可能なビーズそれぞれのうちビーズ３〜４個および各種の濃度、たとえば１０〜１００ｕＭの標識核酸プローブを含有するであろう。乳化は各個別のウェルで完了され得る。ウェルの集合全体が乳化されたときに、液滴を共にプールして分析用液滴の集合を生成する。集合をたとえば１時間未満から数ヶ月間に及ぶ任意の好適な期間にわたって貯蔵できる。
（実施例１０）
本発明のいくつかの実施形態において、ＤＮＡの連結は液滴中で行うことができる。これはこのような連結の説明例である。この実施例において、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在時（レーン３）および非存在時（レーン４）のテンプレートＤＮＡ＋３３ｍｅｒ＋ホスホリル化７ｍｅｒの同時流を図１４に表す。水相をポリアクリルアミドゲルに添加した。４０ｍｅｒを生じる７ｍｅｒの３３ｍｅｒへの連結は液滴内で起こった。
液滴融合前にリガーゼ活性を防止する前に、ＡＴＰ補酵素は活性酵素から隔離され得る。連結反応のためのＡＴＰは、テンプレート液滴に含まれ得る。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは分析用液滴の集合に含まれ得る。したがって、ＤＮＡテンプレートおよび分析用液滴の集合が融合されるときにのみ、リガーゼは活性になるであろう。
テンプレート（２本鎖ＰＣＲ生成物、長さ２５０〜４５０塩基対）は、３〜２０ｎｇ／ｍｌ濃度で使用することができる。緑色蛍光シグナルは、この濃度範囲を通じて観察されている。核酸オリゴヌクレオチドを含む識別要素は１０ｎＭ範囲で使用可能であり、これらの要素の核酸プローブに対する比は１：５０であり得る。核酸オリゴヌクレオチドを含む識別要素のＤＮＡ結合ミクロスフェアへの連結は、最低３０分間のインキュベーションを有し得る。
連結されていないジップコードハイブリダイズ錯体であるサンドイッチ錯体から生成される潜在的なバックグラウンド蛍光源を避けるために、バックグラウンド蛍光はリガーゼの非存在下で測定され得る。流れ分析の直前にミクロスフェア懸濁物を４５℃にて最低１５分間インキュベートすると、バックグラウンド蛍光が最小化される。
連結アッセイは標識核酸プローブを使用して試験されている。変性部位を０個または２個のどちらか含有した８塩基配列を試験した。標準連結アッセイ反応を使用する一塩基多型（ＳＮＰ）分析のために、短い８塩基ポリヌクレオチド（ＣＴＡＡＧＴＴＡ（配列番号９）を設計した。ＳＮＰは、ゲノム中の１個のヌクレオチドが種の構成要素間で異なるときに発生するＤＮＡ配列多様性である。連結アッセイは、ＳＮＰ１（Ａ、Ｇ多型性）について、ＰＣＲ増幅されたホモ接合標的ＤＮＡ（ＲＦＬＰ分析によって以前にＧＧと遺伝子型決定された）を使用して実施した。対応条件のために、連結プローブは、標的ＤＮＡの２５塩基に問合せされる１個の塩基まで相補的であるように設計された。図１５Ａに示すように、８塩基核酸プローブ（ＣＴＡＡＧＴＴＡ（配列番号９））は、ＧＣホモ接合標的ＤＮＡによって正しく識別された。８塩基プローブからのシグナル強度は、１８塩基プローブで観察されるシグナル強度の６５％であった。図１５Ｂおよび１５Ｃに示すように、どちらの変性オリゴヌクレオチド（ＣＴＮＡＧＮＴＡ（配列番号１０）およびＣＴＡＮＮＴＴＡ（配列番号１１）もそれぞれ（Ｎがユニバーサル塩基である場合）、標的ＤＮＡのＳＮＰ遺伝子型を正しく識別した。各プローブは５’ＰＯ４および３’フルオレセインを含有していた。連結プローブの核酸プローブに対する比は、連結アッセイ前に添加された２つのプローブのモル比を指す。正しい５’−ＣＴＡＡＧＴＴＡ−３’（配列番号９）核酸プローブの濃度の１６倍の低下を補正するために、変性核酸プローブを非変性配列の１６倍高い濃度で使用した。
（実施例１１）
以下の実施例は、区別可能な核酸プローブおよび区別可能な識別要素を含む液滴のライブラリを使用する、核酸プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションの測定について記載する。
第１の実施例において、それぞれ少なくとも１つの染料を含有する４つのエマルジョンを生成および混合した。この実施例を使用して複数の液滴からのシグナルを測定した。エマルジョンは次のように生成した。４個のリザーバに蛍光染料およびＤＮＡ分子の４つの組み合せを充填することによって、最初に４つの流体を調製した。第１のリザーバにはＣｙ５染料２０ｕＭを供給した。第２のリザーバにはＣｙ５染料１５ｕＭを供給した。第３のリザーバには、Ｃｙ５染料１０ｕＭを、未連結核酸プローブＡ（カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）結合６−ｍｅｒ）および核酸プローブＢ（６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）結合９−ｍｅｒ）２ｕＭと共に供給した。第４のリザーバには、連結核酸プローブＡ（ＴＡＭＲＡ結合６−ｍｅｒ）および核酸プローブＢ（ＦＡＭ結合９−ｍｅｒ）のＣｙ５ ２ｕＭを供給した。第４のリザーバにはＣｙ５染料は供給しなかった。この実施例では、４つの濃度のＣｙ５染料は標識として作用したが、同じ濃度の連結および未連結核酸プローブＡおよび核酸プローブＢは液滴中のＦＲＥＴの検出性の検査のために供給された。
４つのリザーバからの流体を乳化させた。４つの異なる溶液をフローフォーカス液滴生成装置に注入することによって、４つの異なるエマルジョンを生成した。フッ化炭素油も各液滴生成装置に注入した。利用した４つの装置はすべて実質的に同じであり、フローフォーカス寸法は約２５×２５ミクロンであった。内部相は約５００マイクロリットル／時、外部相は約１０００マイクロリットル／時のほぼ同じ速度で、４つの液体すべてを装置に注入した。結果として、すべての液滴生成装置は、ほぼ同じ速度およびほぼ同じサイズの液滴を産生した。
各液滴生成装置で産生された液滴は次に、出口に接続された管を通じて流出する。４個の液滴生成装置および４個の出口管があった。管はまとめて束ねられ、共用注射器内に配置された。液滴が管から滴下したときに、液滴を注射器中にプールした。この液滴形成を約３０分間進行させて、その後、液滴約１ｍＬを収集した。すべての液滴が同時に乳化されるため、液滴は収集注射器内でランダムに混合された。図３２は、区別可能な核酸プローブと、少なくとも１つの独自の識別要素をそれぞれ含む複数の種類の液滴３４２を混合することによって形成された、液滴の３４０エマルジョンの概略図を示す。
図３１Ａは、１〜４つの異なる染料の組み合せをそれぞれ含有する４つの群の液滴を並行して産生するために使用した、マイクロ流体装置の概略図を示す。上入口６００によって、油が装置に供給される。内部入口６０２によって、４つの異なる組み合せの染料が装置に注入される。フローフォーカス接合部６０４は、それぞれ独自の染料の組み合せを有する４種類の液滴が形成される箇所である。液滴は次にチャネル内を流れて、収集チャンバ６０６に収集される。液滴は装置を出る前に、収集チャンバ内で撮像される。図３１Ｂは、ムービーの最初のフレームの、および液滴が産生された後に、しかし装置を出る前に流入する収集チャンバの拡大図の画像を示す。このフレームでは、液滴はまだ形成されておらず、チャネルは蛍光染料水およびフッ化炭素油の同時流で充填されていた。
標的核酸を含む複数の液滴が形成された。標的核酸は、５’−ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧＡＡＴＣＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧＣＣＡＴ−３’（配列番号１２）であった。図１９に示すように、複数の標的核酸を含む溶液３４４が、少なくとも１つの標的核酸をそれぞれ含む複数の液滴３４６へとマイクロ流体装置３４８が形成される。
標的核酸を含む複数の液滴および核酸プローブを含む液滴のライブラリは、マイクロ流体技法、たとえば“Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ”という名称の２００４年４月９日に出願されたＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１０９０３、および“Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ”という名称の２００４年８月２７日に出願されたＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２７９１２に記載された技法を使用して融合され得る。図２０Ａに示すように、核酸プローブを含む液滴は、標的核酸を含む液滴３５４が核酸プローブを含む液滴３５６に隣接するように、マイクロ流体チャネル３５２内に流入した。図２０Ｂは、電気融合を使用する液滴の融合を示す。図２１は、図２０Ａ〜２０Ｂに記載するプロセスの概略図を示す。図２２は、融合液滴が遅延ラインでインキュベートされることを示す。この実施例では、融合液滴は約５分間インキュベートされた。
図２３は、融合液滴の速度（ｕｍ／秒）の、インキュベーションチャネルに沿った位置に対するグラフを示す。さらに詳細には、図２３は、チャネルにわたる液滴の速度プロフィールを示す。ｙ軸はｐｉｖ（粒子画像速度測定）を使用して測定した速度を示すが、ｘ軸は位置を示す。いくつかの実施形態において、円形断面チャネルにおけるポアズイユ流れの場合、流れの速度プロフィールは、チャネル壁での滑りのない境界条件のために、放物線状であることが予想されるかもしれない。しかしいくつかの場合で、エマルジョンのチャネル中への流れによって、流体は非ニュートン流で流れ得て、流れプロフィールは放物線状でないことがある。流れプロフィールは、チャネルにわたる流れ速度が壁付近を除いてほぼ一定であったことを示す。理論に縛られたくはないが、このことが発生し得るのは、液滴が非常に高い体積分率で産生されたためであった（たとえば水体積の油体積に対するパーセンテージが高い）。したがって、液滴は、液滴がチャネル内をほぼ同じ速度で流れるように、液滴がチャネル内を流れるときに相互に対して残存することができた。これを使用して異なる液滴間のインキュベーション時間の変動を低減することができる。
非限定的な例として、いくつかの場合で、液滴がインキュベートする必要がある時間は、液滴がインキュベーションチャネル内で費やす時間である。液滴が希薄である場合、ここで流体はニュートニアン流体のように挙動することができ、流れは放物線状になるであろう。液滴がチャネル内を移動する速度はそれゆえ、チャネルの幅での液滴の位置に依存し得る（たとえば、チャネルの中央にある液滴は、チャネル端付近の液滴よりも高い速度を有し得る）。したがって、流れの速度が実質的に非放物線状でない場合には、２個の液滴のインキュベーション時間が異なり得る。しかし流れプロフィールが一定である場合、液滴の速度はほぼ等しくなり、したがってインキュベーション時間はほぼ等しくなるであろう。いくつかの場合で、非放物線状の流れプロフィールは低い体積分率のエマルジョンで達成され得る。たとえば、縦横比の小さいチャネルの場合、流れ場の空間的勾配は最も短い寸法によって支配され得る。いくつかの例において、チャネルがそれが幅広であるよりも著しく短い場合、ここで最も短い寸法がその高さとなるであろう。このことにより派生する流れプロフィールは非常に鋭くなり得て、これにより壁付近に大きな勾配が生じる。
図２４は、ハイブリダイゼーション結果が測定された、本実施例で使用したシステムの区域を示す。このシステムでは、融合液滴３８０がマイクロ流体チャネル３８１中に放出され、光源３８４（たとえばレーザ線）を１度に１個ずつ（たとえば液滴３８２）通過して、ハイブリダイゼーション結果が測定される。測定の後に、液滴（たとえば液滴３８６）は流れ続けて、マイクロ流体チャネルから出る。図２５Ａは、上述の装置の概略図を示す。液滴はたとえば図２６に示すように、測定中にも変形させることができる。
図２７Ａ〜２７Ｄは、速度／利得対時間（ｍｓ）を示す定量的結果のグラフ（（ｉ）緑色、（ｉｉ）赤色））である。これらの図は、蛍光を使用する各種の標的の検出を表している。さらに詳細には、図２７は４つの異なる液滴の種類の赤色および緑色蛍光信号を示す。この実施例の実験手順は、上述の実験手順と類似していた。この実施例では、検出にはＣＣＤ検出装置の代わりに光電子増倍管（ＰＭＴ）を使用した。４個のプロットは、調製した４つの異なる種類の液滴の赤色および緑色ＰＭＴシグナルを示した。信号の各スパイクは、検出装置を流れ過ぎた液滴に相当した。液滴が検出装置を通過するときに、赤色および緑色レーザは蛍光を励起して、蛍光は対物レンズによって撮像されＰＭＴに戻された。
図２８は、赤色および緑色強度の検出に基づく液滴の検出を示す。個々の液滴の赤色および緑色蛍光強度を測定した。プロットの各スポットは、検出された液滴を表す。このプロットを生成するために、（上述した）赤色および緑色蛍光染料の独自の組み合せをそれぞれ含有する４種類の液滴を最初に調製した。たとえばスポット６１０は、少量の緑色染料および大量の赤色染料を含んだ液滴を表すのに対して、スポット６１６は、大量の緑色染料および少量の染料を含んだ液滴を表す。プロットの各位置の複数のプロット（たとえば６１０、６１２、６１４、６１６）は、赤色および緑色染料をほぼ同じ比で有した複数の液滴を表した。液滴を測定するために、緑色および赤色レーザを液滴に集束させた。レーザ光により液滴内に含有された染料は蛍光を放出して、放出光は顕微鏡の対物レンズにより取り込まれた。光は、赤色光を通過させて、緑色光を反射する２色性ビームスプリッタを通過した。次に赤色および緑色フィルタによってさらにフィルタリングされて、さらにＰＭＴセンサ上に集束された光路。赤色フィルタ後ろのＰＭＴは赤色光の強度を測定したが、緑色フィルタ後ろのＰＭＴは緑色光の強度を測定した（たとえば図１１に示す装置）。測定は同時に実施して、結果はコンピュータで記憶および処理した。コンピュータは測定値を処理して、各液滴からの赤色および緑色蛍光の量を決定した。次に結果を図２８に示すグラフにプロットした。
図２９は、３ｕＭテンプレートの結合アッセイの結果を示す。プロットは、ここでｉ）標的核酸は存在しなかった（たとえばテンプレート）、ｉｉ）ミスマッチ標的核酸が存在した、およびｉｉｉ）マッチ標的核酸が存在した、核酸プローブの蛍光偏光対長さを示す。
いくつかの場合で、液滴の検出および／または定量にコンピュータを利用した。検出装置がＰＭＴ検出装置である例では、Ｌａｂ Ｖｉｅｗ ＦＰＧＡを使用した。液滴を３個のＰＭＴで監視して、各ＰＭＴには異なるフィルタおよび／偏光子が組み合されていた。各ＰＭＴには数字が割り当てられた。ＰＭＴ１は、平行偏光で緑色光を監視した。ＰＭＴ２は、垂直偏光で緑色光を監視した。ＰＭＴ３は、偏光なしで赤色光を監視した。これら３個のＰＭＴはそれぞれ、それらが時間の関数として検出した光の強度に比例する、時間の関数としての電圧を出力した。これらの電圧時間追跡は、それらが解析されるコンピュータに送信された。
コンピュータプログラムは、液滴を検出するためにユーザが指定したシグナルの１つを検索した。図２７に示すように、各液滴は時間の関数としての電圧のピークに相当するように見える。ピークの立ち上りは、液滴がレーザビームの経路中に移動するときの液滴の立ち上りであった。ピークは、液滴がピークの中心にあったときの液滴に相当する。立ち下りは、液滴がビームから移動するときの液滴の立ち下りであった。液滴がレーザを流れ過ぎるときに時間の関数として電圧が変化するシーケンスは、液滴が検出されたか否かを決定するために使用した。
コンピュータはシグナルを監視して、シグナルがユーザ指定の閾値レベルを超えて上昇した時点を決定する。シグナルが閾値レベルより上であった場合、このサイクルと前のサイクルとの間の電圧差を計算した。差が正であった場合、シグナルは上昇しており、これが液滴の立ち上りであることが示された。コンピュータは、液滴のシグナルの測定を継続して、液滴に関連する最高電圧を記憶する。シグナルが閾値より下に降下するとき、液滴の立ち下りが観察される。液滴の最高電圧が決定され、３つすべてのＰＭＴからのシグナルは相関している。各液滴と関連付けられた測定値は、立ち上りが検出された時間、ピーク電圧の値、立ち下りが検出された時間、電圧が閾値を超えた期間（たとえば一定の流速である場合に、流速が液滴の長さに比例している、ピークの幅）、および電圧が閾値を超えている間の積分シグナルであった。同時に収集された３つすべてのＰＭＴシグナルについて、これらの測定値を収集した。測定値は次にさらに組み合されて、ユーザが選択した少なくとも１個の値を決定した。たとえば、蛍光偏光測定値が望ましい場合、次に緑色平行および垂直ピークの比または積分強度が計算可能であった。これらの数値はまた、ユーザの指定と比較して、液滴が決定および／または定量に有用な液滴であることをさらに確認するための基準を満足しているか否かを決定することも可能であった。いくつかの例において、液滴情報（たとえば測定値）は記憶され得る、および／または液滴は選別のために選択され得る。
（実施例１２）
以下の実施例は、エマルジョンベースのマイクロ流体アッセイからのリアルタイム高スループットデータ取り込みを可能にする液滴検出のためのシステムおよび方法について説明する。
この実施例に記載する方法を使用して、マイクロ流体液滴、たとえば蛍光シグナルを含むマイクロ流体液滴（たとえば少なくとも２つの蛍光染料集団を含むマイクロ流体液滴）を撮像した。マイクロ流体液滴の２つの群、すなわち液滴がフルオレセイン誘導体染料（緑色波長にて可視）を含む液滴の第１の群およびＣｙ５染料（赤色波長にて可視）を含む液滴の第２の群を調製した。液滴を同じ容器内で共に混合すると、サイズまたは形態に基づく区別は不可能であった。液滴を混合集団として容器チャネルに流入させて、蛍光顕微鏡装置で描出した。この例では、緑色ＬＥＤアレイを斜角照明を液滴に当てるために使用して、ほぼ５５°の角度および顕微鏡ステージから約１フィート離して配置し、液滴グレアを生成させた。図３５は、実験装置の例を表す。発光フィルタ５２０、２色性ミラー５２２、アーク灯５２４、励起フィルタ５２６、および対物レンズ５２８を含む蛍光顕微鏡を用意した。複数の液滴を顕微鏡ステージ５３０に位置決めした。斜角照明５３２は約５５°の角度で当てられた。顕微鏡５３４を励起させる光は検出装置または撮像装置（たとえばＣＣＤカメラなど）によって記録した。
この実施例では、一方は緑色波長の狭いスペクトル内の光のみ通過させるフィルタの下に配置されたのに対して、他方のカメラは赤色波長の狭いスペクトル内の光のみ通過させるフィルタの下に配置された２個のＣＣＤカメラによって、画像を取り込んだ。両方のカメラでのフレームの取り込みを同期させて、緑色波長および赤色波長両方の蛍光情報の同時取り込みを可能とした。斜角照明は緑色ＬＥＤ源からであったため、液滴グレアは緑色波長取り込みのみで観察された。
緑色波長取り込みからの画像フレームは、各液滴の液滴グレアを選抜する簡単な強度閾値プログラムを使用して処理した。この場合、人による入力でソフトウェアに液滴グレアと液滴中心との間の角度および距離を指示する；しかしいくつかの場合では、これはソフトウェアプログラムを使用して自動化され得る。いくつかの実施形態において、液滴グレアと液滴中心との間の角度および距離は、機器装置を変更しないという条件で、１回記録する必要があるだろう。ソフトウェアを使用して、各液滴グレアに対するサンプリングマスクを生成した。サンプリングマスクを赤色および緑色波長カメラ画像フレームと重ねて、蛍光強度読み取り値が得られる液滴の境界内の同じ範囲を定義する、各液滴のマーキングシステムを生成する。コンピュータは緑色波長画像と対応する赤色波長画像をマージして、両方のカメラからの情報を持つ合成画像を形成した。液滴グレアから生成されたマスクを使用して、蛍光強度情報を合成画像から収集した。この実施形態において、液滴からの強度を測定する正確度の程度は高く、隣接する液滴をサンプリングリスクはほとんどなかった。
図３７は、緑色波長フィルタ下のマイクロ流体液滴のＣＣＤカメラビデオ取り込みからの静止フレームを示す。この画像では、密充填液滴の間の境界は区別が困難であるが、液滴グレアは容易に目視できる。この画像では、フルオレセインを含む液滴はは色がより明るく見えるが、Ｃｙ５を含む液滴は画像ではより暗く見える。図３８は、ＣＣＤカメラ静止画像の強度閾値を示す。図３９Ａおよび３９Ｂは、蛍光強度読み取り値のためのマスクおよびマスクオーバーレイをそれぞれ示す。図４０および図４１は、緑色フィルタカメラおよび赤色フィルタカメラそれぞれからの画像を示す。図４２は、フルオレセイン（暗い灰色）およびＣｙ５（明るい灰色）を含む液滴の２つの別個の集団を示す、緑色および赤色カメラデータのオーバーレイを含む合成画像を示す。図４３は、秒でサンプリングした５０，０００のデータ点の強度カウントのヒストグラムを示し、（ａ）緑色チャネルおよび（ｂ）赤色チャネルは予想された二峰性分布を示している。
この実施例に記載する方法は、強度を計算せずに完了することが可能であり、データ取り込みに使用した同じ画像フレームで実施され得る。このことにより、液滴ベースアッセイにおけるボトルネックとしてのデータ取り込みが不要となり得る。たとえば、上述のような実験を実行するコンピュータは、１２ビット３２０×２４０データストリームから１秒当り数百フレームの速度で強度データを取り込んだ。約２，０００液滴／フレームの充填アレイを用いると、これは２００，０００液滴／秒からのデータの処理の取り込みに変換される。
いくつかの実施形態において、この実施例で記載したような方法は、複数の液滴を測定するときに好都合であり得る。液滴グレアはバックグラウンドよりも強いことがあり、液滴の位置の容易な識別を可能にし得るので、これにより液滴グレアを利用しない方法と比較して液滴の簡単な測定を可能にする。いくつかの実施形態において、液滴グレアのソフトウェアによる識別は簡単な方法を使用して完了され得る。液滴グレアは各液滴の中心からの方向および距離の両方に関して一般に一貫して出現するため、液滴グレアは基準点として使用することができる。さらに、第２の光源によって各種の角度で液滴を照明することができ、実質的に集束したグレアを生じる特定の角度が（たとえば目視検出に基づいて）選択され得る。角度は、液滴グレアが液滴の中心に関して外れるようにも選択され得る。液滴の中心から外れている液滴グレアによって、液滴識別およびデータ取り込みの両方に同じ画像フレームが与えられることがある。したがって、斜角照明は点灯および消灯する必要はなく、ならびに／またはわずかに異なる時点で合成画像を撮像する必要はない。
本発明の複数の実施形態を本明細書で記載および例証したが、当業者は機能を実施するためのならびに／または本明細書に記載した結果および／もしくは利点の１つ以上を得るための、多種多様の他の手段および／または構造を想定するであろうし、このような変更形態または修飾形態はそれぞれ本発明の範囲内であると見なされる。さらに一般的には、当業者は、本明細書に記載したすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示であるとされることと、実際のパラメータ、寸法、材料、および構成が、本発明の教示が使用される特定の利用または複数の利用に応じて変わるであろうこととをただちに認識するであろう。当業者は、せいぜい日常的な実験を用いて、本明細書に記載した本発明の具体的な実施形態の多くの等価物を認識する、またはそれを確認できるであろう。したがって、上述の実施形態が例示のためのみに与えられていることと、添付請求項およびその等価物の範囲内で、本発明が、特に記載および／または請求されているのと違うふうに実施され得ることとが理解されるであろう。本発明は、本明細書に記載したそれぞれ個別の特徴、システム、材料および／または方法に関する。さらに、このような特徴、システム、物品、材料および／または方法の２つ以上の任意の組み合せは、このような特徴、システム、物品、材料および／または方法が相互に矛盾するわけではない場合、本発明の範囲内に含まれる。
本明細書で使用するようなすべての定義は、本開示の目的のためのみである。これらの定義は、この開示に関連するまたは関連しないにかかわらず、同一出願人による他の特許および／または特許出願に必ずしも帰するべきではない。定義は、本明細書に記載するように、辞書の定義、参考文献に組み入れられている文書での定義、および／または定義した用語の普通の意味に優先することを理解すべきである。
明らかにそれとは反対に指摘されない限り、１つ以上の行為を含む本明細書で請求するいずれの方法においても、方法の行為の順序は、本発明の行為が列挙される順序に必ずしも限定されないことも理解されるべきである。
請求項においては、上の明細書においてと同様に、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「担持する」、「有する」、「含有する」、「包含する」、「保持する」などのすべての移行句は、オープンエンドである、すなわち含むが、限定されないことを意味することが理解されるべきである。「成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という移行句のみが、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ２１１１．０３で述べられているように、クローズまたはセミクローズ移行句であるものとする。

Claims (107)

  1. 核酸プローブおよび少なくとも３つの区別可能な識別要素を含有する第１のマイクロ流体液滴を提供する工程、
    標的核酸を含む第２のマイクロ流体液滴を提供する工程、ならびに、
    該第１のマイクロ流体液滴および該第２のマイクロ流体液滴を融合して融合液滴を形成する工程を含む、方法。
  2. 前記融合液滴内に含有された前記標的核酸を決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記標的核酸の少なくとも一部の配列を決定する工程を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記標的核酸を表面に接触させずに該標的核酸を決定する工程を含む、請求項２に記載の方法。
  5. 前記融合液滴内に含有された前記少なくとも３つの識別要素を決定することによって、前記標的核酸の少なくとも一部を決定する工程をさらに含む、請求項２に記載の方法。
  6. 前記液滴が少なくとも４つの区別可能な識別要素を含有する、請求項１に記載の方法。
  7. 前記少なくとも３つの識別要素を決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  8. 蛍光を使用して前記少なくとも３つの識別要素を決定する工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
  9. 少なくとも１つの識別要素が粒子である、請求項１に記載の方法。
  10. 少なくとも１つの識別要素が蛍光性である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記核酸プローブが少なくとも４個の残基を含有する、請求項１に記載の方法。
  12. 前記核酸プローブが少なくとも５個の残基を含有する、請求項１に記載の方法。
  13. 前記核酸プローブが少なくとも６個の残基を含有する、請求項１に記載の方法。
  14. 前記核酸プローブが少なくとも１個のロックド核酸残基を含有する、請求項１に記載の方法。
  15. 前記核酸プローブが少なくとも１個のユニバーサル残基を含有する、請求項１に記載の方法。
  16. 前記核酸プローブが信号発信実体を含む、請求項１に記載の方法。
  17. 前記標的核酸および前記核酸プローブの結合を測定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  18. 前記標的核酸および前記少なくとも３つの識別要素の結合を測定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  19. 前記標的核酸および前記核酸プローブの結合を測定する工程が前記信号発信実体の変化を測定する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
  20. 前記標的核酸および前記核酸プローブの結合を決定する工程が該核酸プローブの少なくとも一部の蛍光の変化を測定する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
  21. 前記核酸プローブが消光剤を含む、請求項１に記載の方法。
  22. 前記核酸プローブが増感剤を含む、請求項１に記載の方法。
  23. ポリメラーゼを前記融合液滴に提供する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  24. 前記第１の流体液滴および前記第２の流体液滴の少なくとも１つがポリメラーゼをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  25. 前記ポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼである、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記標的核酸および前記核酸プローブの結合時に、前記ポリメラーゼが前記消光剤を該核酸プローブから解離させる、請求項２１に記載の方法。
  27. 前記核酸プローブが少なくとも１つの識別要素に対して固定される、請求項１に記載の方法。
  28. 前記核酸プローブが核酸配列を含み、前記少なくとも１つの識別要素がオリゴヌクレオチドを含み、該核酸配列が該オリゴヌクレオチドに連結されている、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記少なくとも１つの識別要素がそれに対して固定された少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを有する、請求項１に記載の方法。
  30. 前記液滴が４つの区別可能な識別要素を含有し、各区別可能な識別要素がそれに対して固定された少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを有する、請求項１に記載の方法。
  31. 前記４つの区別可能な識別要素のそれぞれに対して固定された前記オリゴヌクレオチドそれぞれが、他のオリゴヌクレオチドに対して１つの位置でのみ異なる配列を有する、請求項３０に記載の方法。
  32. それぞれの前記オリゴヌクレオチドが複数のユニバーサル残基を含有する、請求項３１に記載の方法。
  33. それぞれの前記オリゴヌクレオチドが１つの位置を除いて全ての位置においてユニバーサル残基より成る、請求項３２に記載の方法。
  34. 少なくとも３つの区別可能な識別要素を含むマイクロ流体液滴を提供する工程；
    該液滴を変形させて、該少なくとも３つの識別要素それぞれが標的区域を個別に通過するように該液滴に該標的区域を通過させる工程；ならびに
    該標的区域を通過する該少なくとも３つの識別要素それぞれを測定する工程；
    を含む、方法。
  35. 前記マイクロ流体液滴が核酸および核酸プローブをさらに含有する、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記核酸が前記少なくとも３つの識別要素を決定することによって決定される、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記少なくとも３つの識別要素の少なくともいくつかが粒子である、請求項３４に記載の方法。
  38. 前記少なくとも３つの識別要素の少なくともいくつかがナノ粒子である、請求項３４に記載の方法。
  39. 前記少なくとも３つの識別要素の少なくともいくつかが蛍光性である、請求項３４に記載の方法。
  40. 液滴に、第１の識別要素と、該第１の識別要素と区別可能な第２の識別要素と、該第１の識別要素および該第２の識別要素から区別可能な第３の識別要素を添加することによって、核酸プローブを含有する該液滴の少なくとも一部を測定する工程を含む、方法。
  41. 前記液滴に前記第１、前記第２、および前記第３の識別要素それぞれから区別可能な第４の識別要素を添加する工程をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記液滴に含有された核酸を決定する工程を含む、請求項４０に記載の方法。
  43. 前記核酸および前記核酸プローブの結合を測定する工程をさらに含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記第１、前記第２、および前記第３の識別要素がそれぞれ粒子である、請求項４０に記載の方法。
  45. 少なくとも６つの識別要素を定義する工程であって、該識別要素が少なくとも３つの群に分類され、各群は該要素のうちの少なくとも２つを有する、工程；
    少なくとも８つの区別可能な種のそれぞれを、該８つの区別可能な種のうち２つが識別要素の同じセットと関連しないように、該少なくとも３つの群それぞれから選択される少なくとも１つの識別要素と関連付ける工程；ならびに
    少なくとも８つの区別可能な液滴を調製する工程であって、各液滴は、該少なくとも８つの異なる種のうち１つおよび該少なくとも３つの群それぞれから得た関連付けた要素を含有する、工程；
    を含む、方法。
  46. 少なくとも１０の区別可能な識別要素を定義する工程を含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 少なくとも４０の区別可能な識別要素を定義する工程を含む、請求項４６に記載の方法。
  48. 少なくとも１００の区別可能な識別要素を定義する工程を含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記要素を少なくとも４つの群に分類する工程を含む、請求項４５に記載の方法。
  50. 各群が少なくとも５つの要素を有する、請求項４５に記載の方法。
  51. 各群が少なくとも１０の要素を有する、請求項４５に記載の方法。
  52. 少なくとも１０の区別可能な種のそれぞれを関連付ける工程を含む、請求項４５に記載の方法。
  53. 少なくとも３０の区別可能な種のそれぞれを関連付ける工程を含む、請求項４５に記載の方法。
  54. 少なくとも約１００の区別可能な種のそれぞれを関連付ける工程を含む、請求項４５に記載の方法。
  55. 少なくとも３００の区別可能な種のそれぞれを関連付ける工程を含む、請求項４５に記載の方法。
  56. 少なくとも１，０００の区別可能な種のそれぞれを関連付ける工程を含む、請求項４５に記載の方法。
  57. 少なくとも４，０００の区別可能な種のそれぞれを関連付ける工程を含む、請求項４５に記載の方法。
  58. 前記種が核酸プローブである、請求項４５に記載の方法。
  59. 少なくとも１００個の区別可能な液滴を調製する工程を含む、請求項４５に記載の方法。
  60. 少なくとも１０００個の区別可能な液滴を調製する工程を含む、請求項４５に記載の方法。
  61. 標的核酸を前記少なくとも８個の区別可能な液滴それぞれに添加する工程をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
  62. 前記液滴の少なくともいくつかがマイクロ流体性である、請求項４５に記載の方法。
  63. 複数の区別可能な核酸プローブおよび複数の区別可能な識別要素を提供する工程；
    該複数の区別可能な核酸プローブから少なくとも１個の核酸プローブと、該複数の区別可能な識別要素から少なくとも３つの区別可能な識別要素を選択する工程；
    該選択した１個の核酸プローブおよび該少なくとも３つの区別可能な識別要素を含有する流体液滴を形成する工程；ならびに
    １個の核酸プローブおよび該少なくとも３つの区別可能な識別要素をそれぞれ含有する少なくとも１０の区別可能な流体液滴を含む、流体液滴の集団を形成するために該選択工程および該形成工程を反復する工程；
    を含む、方法。
  64. 前記複数の区別可能な識別要素から少なくとも４つの区別可能な識別要素を選択する工程を含む、請求項６３に記載の方法。
  65. 少なくとも１０の区別可能な識別要素を提供する工程を含む、請求項６３に記載の方法。
  66. 少なくとも２０の区別可能な識別要素を提供する工程を含む、請求項６５に記載の方法。
  67. 少なくとも４０の区別可能な識別要素を提供する工程を含む、請求項６６に記載の方法。
  68. 少なくとも１０の区別可能な核酸プローブを提供する工程を含む、請求項６３に記載の方法。
  69. 少なくとも１００の区別可能な核酸プローブを提供する工程を含む、請求項６３に記載の方法。
  70. 少なくとも１，０００の区別可能な核酸プローブを提供する工程を含む、請求項６３に記載の方法。
  71. 少なくとも１００個の区別可能な流体液滴を含む流体液滴の集団を形成するために前記選択工程および前記形成工程を反復する工程を含む、請求項６３に記載の方法。
  72. 少なくとも１，０００個の区別可能な流体液滴を含む流体液滴の集団を形成するために前記選択工程および前記形成工程を反復する工程を含む、請求項６３に記載の方法。
  73. １個の核酸プローブおよび少なくとも３つの区別可能な識別要素を選択する行為が：
    前記複数の区別可能な識別要素を少なくとも３つの群に分類する工程；ならびに
    該少なくとも３つの群それぞれから１つの識別要素を選択する工程；
    を含む、請求項６３に記載の方法。
  74. 核酸プローブをそれぞれ含有する第１の複数の少なくとも１０個の区別可能な流体液滴；ならびに
    少なくとも３つの区別可能な識別要素をそれぞれ含有する第２の複数の少なくとも１０個の区別可能な流体液滴；
    を含む、キット。
  75. 前記第１の流体液滴が少なくとも第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブを含有する、請求項１に記載の方法。
  76. 前記第１のマイクロ流体液滴が、前記第１の核酸プローブを含むマイクロ流体液滴および第２の核酸プローブを含むマイクロ流体液滴を融合することによって形成される、請求項７５に記載の方法。
  77. リガーゼを前記融合した液滴に供給する工程をさらに含む、請求項７５に記載の方法。
  78. 前記第１の核酸プローブが前記第２の核酸プローブに連結される、請求項７５に記載の方法。
  79. 前記第１の核酸プローブおよび前記第２の核酸プローブの配列を決定する工程をさらに含む、請求項７５に記載の方法。
  80. 前記液滴が第１の核酸プローブおよび第２の核酸プローブを含有する、請求項４０に記載の方法。
  81. 前記第１および前記第２の核酸プローブと前記液滴内に含有された標的核酸との関連を決定する工程をさらに含む、請求項８０に記載の方法。
  82. 流体液滴の第１の集団を形成するための区別可能な核酸プローブの第１の群および区別可能な識別要素の第１の群、ならびに流体液滴の第２の集団を形成するための区別可能な核酸プローブの第２の群および区別可能な識別要素の第２の群に対する提供、選択、形成および反復工程を完了させる工程を含む、請求項６３に記載の方法。
  83. 前記核酸プローブの第１の群が前記核酸プローブの第２の群と実質的に同様である、請求項８２に記載の方法。
  84. 前記核酸プローブの第１の群が前記核酸プローブの第２の群とは異なる、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記識別要素の第１の群が前記識別要素の第２の群と実質的に同様である、請求項８２に記載の方法。
  86. 前記識別要素の第１の群が前記識別要素の第２の群とは異なる、請求項８３に記載の方法。
  87. 前記核酸プローブの少なくともいくつかが少なくとも３個の核酸残基を含む、請求項８２に記載の方法。
  88. 前記核酸プローブの少なくともいくつかが少なくとも１つのユニバーサル残基をさらに含む、請求項８２に記載の方法。
  89. 核酸プローブの少なくとも１つの群が３個の残基を含む考えられるすべての配列の少なくとも一部を含む、請求項８２に記載の方法。
  90. 核酸プローブの少なくとも１つの群が４個の残基を含む考えられるすべての配列の少なくとも一部を含む、請求項８２に記載の方法。
  91. 前記第１の集団からの少なくとも１個の流体液滴を前記第２の集団からの少なくとも１個の流体液滴と融合して第３の流体液滴とする工程を含む、請求項８２に記載の方法。
  92. 液滴の第３の集団を形成するために、前記第１の集団からの実質的にすべての液滴を前記第２の集団からの実質的にすべての液滴と融合する工程を反復する工程を含む、請求項９１に記載の方法。
  93. 液滴グレアが液滴内の光散乱のために複数の液滴の実質的にすべてで生成されるように、表面上の該複数のマイクロ流体液滴に光を向ける工程；
    該液滴グレアの位置に基づいて液滴の位置を決定する工程；および
    前記マイクロ流体液滴から生じる非散乱光を測定する工程、を含む方法。
  94. 前記光が前記複数のマイクロ流体液滴に非直交角度で向けられる、請求項９３に記載の方法。
  95. 非散乱光を測定する行為と、液滴グレアを定量する行為が実質的に同時である、請求項９３に記載の方法。
  96. 前記液滴グレアが前記液滴による散乱光の実質的な集束によって生成される、請求項９３に記載の方法。
  97. 前記液滴が実質的に単分散である、請求項９３に記載の方法。
  98. 前記非散乱光が蛍光により生成される、請求項９３に記載の方法。
  99. 前記複数のマイクロ流体液滴から生じる前記液滴グレアを定量する工程をさらに含む、請求項９３に記載の方法。
  100. 表面上の複数のマイクロ流体液滴；
    該表面上に配置された該複数のマイクロ流体液滴に対して直交して光を集束させることができる第１の光源；
    該表面上に配置された該複数のマイクロ流体液滴に対して実質的に非直交の角度で光を集束させることができる第２の光源；ならびに
    該表面上に配置された該複数のマイクロ流体液滴から生じた、該第２の光源から生じる散乱光および該第１の光源から生じる非散乱光を撮像することができる撮像装置；
    を備えた、撮像システム。
  101. 前記撮像装置が、前記表面上に配置された前記複数のマイクロ流体液滴から生じた前記散乱光および前記非散乱光を同時に撮像することができる、請求項１００に記載の撮像システム。
  102. 前記撮像装置がカメラである、請求項１００に記載の撮像システム。
  103. 前記カメラがＣＣＤカメラである、請求項１０２に記載の撮像システム。
  104. 前記第１の光源がＬＥＤである、請求項１００に記載の撮像システム。
  105. 撮像システムが少なくとも１，０００個のマイクロ流体液滴を同時に撮像することができる、請求項１０１に記載の撮像システム。
  106. 撮像システムが少なくとも５，０００個のマイクロ流体液滴を同時に撮像することができる、請求項１０５に記載の撮像システム。
  107. 撮像システムが少なくとも１０，０００個のマイクロ流体液滴を同時に撮像することができる、請求項１０６に記載の撮像システム。
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