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Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur passiven Trennung und Sortierung von Tropfen durch. Verwendung von nicht-optischen Markern für Reaktionen innerhalb der Tropfen.
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Die Verfahren sind vor allem für mikrofluidische Systeme mit hohem Durchsatz geeignet. Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich insbesondere für die Anwendung in Screening-Verfahren zur Analyse, Selektion und Identifizierung eines breiten Spektrums von Analyten, einschließlich Zellen, Katalysatoren, Enzyme und andere Substanzen, die physikalische, chemische oder biologische Reaktionen beeinflussen oder steuern können.
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Für solche Untersuchungs- und Screeningverfahren wurden in letzter Zeit zunehmend mikrofluidische Systeme mit Erfolg eingesetzt.
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Mikrofluidiksysteme bieten die einzigartige Möglichkeit, kleinste Flüssigkeitsmengen in mikrometergroßen Kanalstrukturen zu handhaben. Aufgrund der geringen Dimensionen lässt sich eine Vielzahl von Kanälen, Reaktionsräumen und Steuerelementen auf kleinstem Raum integrieren, wodurch die Möglichkeit einer effizienten Parallelisierung von Reaktionen gegeben ist. Eine wichtige Voraussetzung für Hochdurchsatz-Verfahren wird damit erfüllt. Neben der Größenreduktion zeichnen sich Mikrofluidiksysteme durch weitere physikalische Eigenschaften aus, die den Zugang zu neuen Anwendungen eröffnen: Der Fluss in solchen Systemen ist gewöhnlich laminar. Dadurch lassen sich Parameter wie Stoffkonzentration und Temperatur gezielt und örtlich begrenzt manipulieren. Das grosse Oberflächen-Volumen-Verhältnis, ein weiteres Charakteristikum der Mikrofluidik, ermöglicht einen effizienten Temperaturaustausch und damit kontrollierte Reaktionsbedingungen.
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Mikrotropfen lassen sich einfach erzeugen und können als Mikroreaktoren verwendet werden, in denen sich beispielsweise einzelne Zellen oder alle Reaktanten interessierender Reaktionen einschließen lassen.
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Durch die Verwendung mehrerer Flüssigkeitsphasen in Mikrofluidiksystemen kann das Anwendungsspektrum weiter ausgebaut werden: Die Herstellung monodisperser Tropfen mit Produktionsraten von bis zu 10,000 Tropfen pro Sekunde wird durch hydrodynamische Fokussierung zweier nicht-mischbarer Flüssigkeiten ermöglicht.
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Solche Tröpfen können als isolierte Picoliter-Reaktionsgefäße genutzt werden: Verschiedene Tropfen unterschiedlichen Inhalts lassen sich miteinander fusionieren oder in Tochtertropfen unterschiedlicher Größe aufspalten. Die flexiblen Gestaltungsoptionen und die speziellen physikalischen Eigenschaften zusammen mit der Möglichkeit, Systemparameter auf zellularer Ebene zu kontrollieren, machen die Mikrofluidiktechnologie damit gerade für zellbiologische Anwendungen zu einem vielversprechenden Werkzeug, da die Möglichkeit besteht, einzelne Zellen in separierten Reaktionsvolumina zu untersuchen.
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Die Möglichkeit, kleinste Volumina zu erzeugen und zu analysieren, bietet entscheidende Vorteile in verschiedensten Screening-Anwendungen gerade bei biologischen Assays:
- • Das benötigte Probenvolumen wird drastisch reduziert (ein Mikrotropfen mit einem Durchmesser von 25 μm besitzt ein Volumen von ~8 pl, damit lassen sich aus 1 μl Probenlösung mehr als 120,000 Tropfen erzeugen).
- • Eine Vielzahl von Reaktionen lässt sich damit parallelisieren. und auf kleinstem Raum durchführen.
- • Das geringe Probenvolumen bietet die Möglichkeit, einzelne Zellen in den Tropfen einzuschließen. Damit lassen sich ganze Zellpopulationen auf Einzel-Zell-Ebene analysieren.
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Der Einsatz der Tropfenmikrofluidik zur Hochdurchsatzanalyse wurde beispielsweise von Agresti et al. (PNAS 107, 4004–9 (2010)) beschrieben.
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Während die Reaktionsschritte in derzeitigen Mikrofluidikansätzen vollständig miniaturisiert sind, erfolgt die Analyse und Kontrolle allerdings weiterhin über klassische Verfahren, die eine aktive und externe Steuerung erfordern. So werden beispielsweise klassische Fluoreszenzmarker zur Assay-Analyse verendet (wie z. B. in
US 2009/0068170 A1 beschrieben). Das Fluoreszenzsignal eines jeden einzelnen Tropfens wird detektiert und ausgewertet (extern). Die Tropfen mit entsprechendem Signal werden schließlich mit Hilfe elektrischer Felder (aktiv) aussortiert.
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Aus dem Lab-on-Chip des Reaktionsschrittes wird damit wieder ein makroskopisches System, bei dem die notwendige Steuer- und Analyseeinheit die Größe und Kosten des Reaktionsmoduls um ein Vielfaches übersteigt.
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Vor diesem Hintergrund liegt die Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung neuer verbesserter Verfahren zur Analyse, Trennung und Sortierung von Tropfen, in denen chemische, biologische oder physikalische Reaktionen stattfinden oder stattgefunden haben, und darin enthaltenden Analyten, insbesondere in einem mikrofluidischen System, welche zur Durchführung von Hochdurchsatz-Screening- und Analyseverfahren geeignet sind und die genannten Nachteile des Standes der Technik nicht mehr aufweisen und insbesondere die Vorteile einer deutlich einfacheren Handhabung und hohen Kosteneffizienz bieten.
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Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst mit den Verfahren nach Anspruch 1 und 21 sowie der Vorrichtung nach Anspruch 25. Speziellere Ausführungsformen und weitere Aspekte der Erfindung sind Gegenstand der weiteren Ansprüche.
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Das erfindungsgemäße Verfahren nach Anspruch 1 umfasst die folgenden Schritte:
- a) Bereitstellen einer ersten Phase von primären Tropfen, die ein Reaktionsmedium umfassen und in denen chemische, biologische oder physikalische Reaktionen ablaufen, in einem Inkubationsraum, der eine zweite flüssige Trägerphase enthält, die mit der ersten Phase nicht mischbar ist;
- b) Ablaufen lassen der chemischen, biologischen oder physikalischen Reaktionen in den primären Tropfen, wodurch mindestens ein Teil der primären Tropfen in sekundäre Tropfen überführt wird, die sich von den primären Tröpfen durch eine Veränderung mindestens eines nicht-optischen physikalischen Parameters der Tropfen unterscheiden,
- c) passives Trennen der primären und sekundären Tropfen in Abhängigkeit von Unterschieden des mindestens einen nicht-optischen physikalischen Parameters der Tropfen durch Kontaktieren der Tropfen mit einer Trenneinrichtung, welche eine vorgegebene geometrische Form und/oder Oberflächengestaltung aufweist, dergestalt, dass hinsichtlich des mindestens einen nicht-optischen physikalischen Parameters unterschiedliche Tropfen eine unterschiedliche Wechselwirkung mit der geometrischen Form und/oder Oberfläche der Trenneinrichtung erfahren und dadurch getrennt werden.
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Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den meisten Trennverfahren des Standes der Technik besteht darin, dass auf die üblichen optischen Marker zum Nachweis einer stattgefundenen Reaktion in den Tropfen und die damit verbundenen externen Detektionssysteme verzichtet werden kann. Erfindungsgemäß wird als Marker ein veränderter nicht-optischer physikalischer Parameter der Tropfen, vorzugsweise ein geometrischer oder mechanischer Parameter, verwendet.
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Spezieller ist dieser physikalische Parameter aus der Gruppe ausgewählt, welche das Volumen, die spezifische Dichte, Adhäsion an oder Affinität zu bestimmten Oberflächen, Oberflächenspannung, Viskoelastizität oder Form der Tropfen umfasst.
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Besonders bevorzugt ist der physikalische Parameter eine Volumenänderung, d. h. eine Volumenverringerung oder -erhöhung der Tropfen. In diesem Fall erfolgt die Trennung von Tropfen unterschiedlicher Größe vorzugsweise durch eine Trenneinrichtung, die eine Oberfläche mit einer oder mehreren Öffnung(en) mit vorgegebenem Durchmesser umfasst. Diese Oberfläche kann beispielweise Bestandteil einer Sieb- oder Filtervorrichtung sein und/oder aus der Oberfläche einer Lochplatte oder Lochmembran bestehen.
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In einer speziellen und besonders vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Trenneinrichtung von mindestens einem Teil von mindestens einer Begrenzungsfläche, insbesondere Decke und/oder Boden, des Inkubationsraums gebildet.
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Falls die Tropfen eine geringere spezifische Dichte als die flüssige Trägerphase haben, sammeln sie sich an der mit Öffnungen versehenen Decke des Inkubationsraums und werden dort automatisch nach der Größe getrennt. Umgekehrt sammeln sich Tropfen mit einer größeren spezifischen Dichte als die flüssige Trägerphase am Boden und können dort nach der Größe getrennt werden.
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Auch bei einer Verfahrensgestaltung, bei welcher der veränderte physikalische Parameter der Tropfen eine Veränderung der spezifischen Dichte ist, kann eine Trennung von unterschiedlichen Tropfen durch Trenneinrichtungen am Boden und/oder der Decke des Inkubationsraums auf einfache und effiziente Weise erfolgen. Beispielsweise können die Tropfen mit der höheren Dichte am Boden und die Tropfen mit der geringeren Dichte an der Decke gesammelt und abgeführt werden.
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Bei einer Verfahrensgestaltung, bei welcher der veränderte physikalische Parameter der Tropfen die Tropfenform ist, kann die Trenneinrichtung z. B. eine Oberfläche mit Öffnungen vorgegebener Größe und Form umfassen, welche nur Tropfen einer bestimmten Form passieren lässt.
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Bei einer Verfahrensgestaltung, bei welcher der veränderte physikalische Parameter der Tropfen die Adhäsion an oder Affinität zu bestimmten Oberflächen ist, kann die Trenneinrichtung eine Oberfläche umfassen, welche ausschließlich oder bevorzugt nur die Adhäsion von bestimmten Tropfen, beispielsweise nur primären Tropfen oder nur sekundären Tropfen oder nur einer Art von sekundären Tropfen, gestattet.
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Bei einer Änderung der visko-elastischen Tropfeneigenschaften: Tropfen mit überwiegend viskosem Charakter lassen sich leicht deformieren und auch durch Öffnungen, die kleiner sind als der Tropfendurchmesser, bei entsprechenden Druckdifferenzen hindurchzwängen. Dies gelingt nicht oder nur bei einer wesentlicher höheren Druckdifferenz mit elastischen Tropfen. Elastische Tropfen können beispielsweise durch eine Polymerisation/Gelierung des Tropfenmediums entstehen, ausgelöst durch eine chemische oder biologische Reaktion innerhalb der Tropfen. Das unterschiedliche Deformationsverhalten der Tropfen erlaubt schließlich eine einfache Trennung.
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Bei einer Änderung der Oberflächenspannung der Tropfen: Eine Veränderung der Oberflächenspannung von Mikrotropfen kann durch eine reaktionsbedingte Veränderung der in den Tropfen zur Stabilisierung verwendeten Tenside oder durch die Bildung weiterer oberflächenaktiver Substanzen hervorgerufen werden. Dadurch können Tropfen stabilisiert bzw. destabilisiert werden: Destabilisierte Tropfen können miteinander fusionieren und größere Tropfen bilden. Die stabilisierten Tropfen behalten ihre ursprüngliche Größe und verschmelzen nicht mit anderen Tropfen. Diese Tropfen können wiederum durch ein Filterverfahren von den fusionierten großen Tropfen getrennt werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Inkubationsraum und/oder die Trenneinrichtung Bestandteil eines mikrofluidischen Systems. In diesem Fall kann die Trenneinrichtung auch vorteilhaft von mindestens einer inneren Oberfläche eines mikrofluidischen Kanals gebildet werden. Ein solches mikrofluidisches System kann eine Vielzahl von Kanälen und damit auch von Inkubationsräumen und/oder Trenneinrichtungen parallel nutzen.
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Bei einer Verfahrensgestaltung, bei welcher der veränderte physikalische Parameter der Tropfen das Volumen ist, wird diese mindestens eine innere Oberfläche des mikrofluidischen Kanals mindestens eine Öffnung mit vorgegebenem. Durchmesser aufweisen. Durch die mögliche parallele Verwendung vieler Kanäle können auch parallele Trenneinrichtungen mit jeweils nur einer Austrittsöffnung (oder einigen wenigen Öffnungen) zu einer sehr effizienten und schnellen Trennung und Sortierung von Tropfen führen.
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In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung ist der veränderte physikalische Parameter der Tropfen das Resultat eines Stoffaustausches zwischen den Tropfen und ihrer Umgebung.
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Typischerweise wird dieser Stoffaustausch durch eine osmotische Druckdifferenz zwischen den Tropfen und ihrer Umgebung, welche durch den Ablauf der chemischen, biologischen oder physikalischen Reaktionen in den Tropfen aufgebaut wurde, hervorgerufen.
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Die osmotische Druckdifferenz zwischen den Tropfen und ihrer Umgebung führt zu einem Ausstrom oder Einstrom von Wasser oder einem anderen Lösungsmittel des Reaktionsmediums aus den Tropfen und damit zu einer Volumenverringerung oder Volumenerhöhung der Tropfen. Die Art der Volumenänderung wird durch die in den Tropfen ablaufenden Reaktionen bestimmt: Die Erhöhung der Gesamtzahl an gelösten Stoffen in den Tropfen, beispielsweise durch enzymatischen Polymerabbau, führt zu einem Lösungsmitteleinfluss und damit zu einer Volumenvergrößerung. Umgekehrt führt eine Verringerung der Gesamtzahl gelöster Stoffe in den Tropfen, beispielsweise durch Glukoseverbrauch durch Zellen, zu einer Volumenverringerung.
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Der Stoffaustausch zwischen den Tropfen und ihrer Umgebung kann mit einer reaktionsmedium-enthaltenden Trägerphase und/oder mit mindestens einer reaktionsmedium-enthaltenden Oberfläche des Inkubationsraums stattfinden. Die letztere Alternative ist in der Regel bevorzugt, da sie auch den Einsatz solcher Trägerphasen erlaubt, die kein oder kaum Reaktionsmedium aufnehmen können.
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Die reaktionsmedium-enthaltende Oberfläche weist vorzugsweise das gleiche Reaktionsmedium wie das der Tropfenphase daran adsorbiert und/oder darin absorbiert auf. Das Material dieser Oberfläche ist nicht besonders beschränkt und kann in Abhängigkeit von der Art und Zusammensetzung des Reaktionsmedium ausgewählt werden. Ein spezielles, nicht beschränkendes Beispiel für ein solches Material mit hydrophilen Eigenschaften ist Polydimethylsiloxan, das gut mit wässrigen Medien, z. B. Zellmedien, gesättigt werden kann.
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Die reaktionsmedium-enthaltende Oberfläche kann auch eine für das Lösungsmittel des Reaktionsmediums permeable Membran, welche die Tropfen von einem Reaktionsmedium-Reservoir trennt, umfassen oder daraus bestehen, so dass der Stoffaustausch durch diese Membran erfolgen kann.
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In einer Ausführungsform der Erfindung kann auch eine weitere Tropfenphase als reaktionsmedium-enthaltende Umgebung dienen. Diese Tropfen, im folgenden inaktive Tropfen genannt, enthalten lediglich das Reaktionsmedium oder Reaktionsmedium zusammen mit einem inaktiven oder schwach aktiven Katalysator oder einer inaktiven oder schwach aktiven Zelle. Es findet daher keine Reaktion bzw. nur eine schwache Reaktion in den inaktiven Tropfen statt. Damit wird zwischen den inaktiven Tropfen und den aktiven Tropfen, in denen gewünschte chemische, biologische oder physikalische Reaktionen ablaufen, eine osmotische Druckdifferenz aufgebaut, die schließlich einen Stoffaustausch zwischen diesen Tropfen hervorruft. Die Volumenänderung der inaktiven Tropfen verhält sich damit umgekehrt wie diejenige der aktiven Tropfen: Ein Lösungsmittelfluss findet von den aktiven Tropfen in die inaktiven Tropfen bzw. in umgekehrter Richtung statt. Der relative Größenunterschied zwischen aktiven und inaktiven Tropfen wird dadurch verstärkt und erleichtert damit die Selektion aktiver Tropfen.
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Nachdem in den aktiven Tropfen chemische, biologische oder physikalische Reaktionen stattfinden, enthalten diese Tropfen alle erforderlichen Reaktionspartner und Hilfstoffe für die jeweilige Reaktion. Vorzugsweise enthalten sie neben den Edukten der chemischen, biologischen oder physikalischen Reaktionen mindestens eine weitere Komponente, die einen Einfluss auf die jeweiligen chemischen, biologischen oder physikalischen Reaktionen haben kann. Diese Komponente stellt häufig gleichzeitig einen Analyten dar, der mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens untersucht oder identifiziert werden soll.
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Spezieller ist diese Komponente aus der Gruppe aus Katalysatoren, einschließlich Enzymen, Kokatalysatoren und Inhibitoren ausgewählt.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann so durchgeführt werden, dass die chemischen, biologischen oder physikalischen Reaktionen in Schritt b) für eine vorbestimmte Zeit ablaufen. Diese Zeitspanne wird mindestens so lange sein, dass der Ablauf der jeweiligen Reaktion zu einer ausreichenden Veränderung des vorgesehenen physikalischen Parameters der Tropfen führt. Diese Zeitspanne kann in Abhängigkeit von der jeweiligen Reaktion und den Reaktionsbedingungen stark variieren, kann jedoch von einem Fachmann auf diesem Gebiet unschwer in Routineversuchen ermittelt werden.
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In einer speziellen Ausführungsform enthalten die Tropfen Gebilde, in oder auf denen chemische, biologische oder physikalische Reaktionen ablaufen. Diese Gebilde können beispielsweise natürliche oder künstliche Zellen, Partikel, Beads, Vesikel oder Kapseln, oder andere Molekülaggregate sein.
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In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um biologische Zellen, deren Zellaktivität, insbesondere metabolische Aktivität und/oder Teilungsaktivität, untersucht werden soll.
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Die zu untersuchenden Zellen werden durch hydrodynamische Flussfokussierung einer Zellsuspension (L1) in Tropfen eingeschlossen (1). Als inertes Öl (L2) werden beispielsweise perfluorierte Kohlenwasserstoffe mit einer höheren Dichte als Wasser (z. B. FC-40 von 3 M; ca. 1,9 g/ml) verwendet. Es können jedoch prinzipiell alle Arten von Lösungsmittel verwendet werden, die sich nicht mit der Tropfenphase mischen und damit ein Zwei-Phasen-System (Mikroemulsion) erlauben: Kohlenwasserstoffe, Mineralöle etc.
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Aufgrund metabolischer Aktivitäten verändert sich die Zusammensetzung der Tropfenflüssigkeit: So sinkt beispielsweise die Konzentration kleiner Nährstoffmoleküle drastisch außerhalb der Zellen. Diese werden von den aktiven Zellen aufgenommen, metabolisiert und schließlich zum Aufbau intrazellulärer Strukturen verwendet.
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Diese Verarmung des Tropfenmediums führt zum Aufbau einer osmotischen Druckdifferenz zwischen Tropfenmedium und der mit Medium gesättigten mikrofluidischen Umgebung. Die Umgebung besteht z. B. aus Polydimethylsiloxan (PDMS), einem elastischen Polymer, das sich mit wässrigen Lösungen einfach sättigen lässt, einer für das Lösungsmittel permeablen Membran, welche die Tropfen von einem Medium-Reservoir trennt, oder anderen Tropfen, die lediglich Tropfenmedium enthalten, ohne eine aktive Komponente, die eine Reaktion innerhalb der Tropfen bewirkt.
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Die osmotische Druckdifferenz führt zu einem Wasserausstrom aus den Tropfen in die Umgebung (PDMS-Wände). Der Verlust von Wasser gleicht den Konzentrationsunterschied wieder aus und führt zu einer Verkleinerung der Tröpfen. Die Größenänderung dient schließlich als neuer mikrofluidischer Marker für die biologische Aktivität der in den Tropfen eingeschlossenen Zellen.
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Eine Selektion und Sortierung in aktive und nicht-aktive Zellen kann nun auf rein passive Weise durch eine geeignete Mikrostrukturierung erfolgen: Die Tropfen besitzen ein geringere Dichte als das sie umgebende Trägeröl. Die Tropfen steigen auf. Kleinere Tropfen können durch eine Filterdecke von den übrigen separiert und entnommen werden (2).
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Zur Selektion sind damit keine externen und aktiven Analyseverfahren notwendig, die beispielsweise ein Fluoreszenzsignal jedes einzelnen Tropfen messen, auswerten und darauf basierend Tropfen aussortieren. Es genügt ein einfaches integriertes Mikrofluidiksystem.
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In einer typischen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in Schritt a) mehrere Arten von primären Tropfen mit unterschiedlicher Zusammensetzung bereitgestellt und in Schritt b) verschiedene sekundäre Tropfen erzeugt, die sich durch mindestens einen physikalischen Parameter der Tropfen voneinander unterscheiden, und in Schritt c) erfolgt dann eine passive Trennung und Sortierung der verschiedenen sekundären Tropfen.
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In den verschiedenen primären Tropfen können beispielsweise unterschiedliche chemische, biologische oder physikalische Reaktionen ablaufen oder die gleichen chemischen, biologischen oder physikalischen Reaktionen in unterschiedlicher Weise, z. B. unterschiedlich schnell, ablaufen. Diese Unterschiede können beispielsweise auf die Anwesenheit einer bestimmten Komponente, eines bestimmten Analyten, zurückzuführen sein und können zur die Identifizierung einer Komponente mit bestimmten gewünschten Eigenschaften genutzt werden.
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In einer speziellen Ausführungsform enthalten die verschiedenen primären Tropfen verschiedene Arten von Zellen, die sich hinsichtlich mindestens einer Zellaktivität unterscheiden, und die Trennung der aufgrund der unterschiedlichen Zellaktivität gebildeten unterschiedlichen sekundären Tropfen ermöglicht eine Unterscheidung und Sortierung von aktiven und nicht-aktiven Zellen.
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Die Größe der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Tropfen ist nicht besonders kritisch und kann an die zu untersuchenden Systeme und Reaktionsbedingungen angepasst werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird dieses in einem mikrofluidischen System durchgeführt, und die Tropfendurchmesser liegen in dem mit herkömmlichen mikrofluidischen Techniken erzeugten Größenbereich. Dieser Bereich beträgt etwa 1 Mikrometer bis 500 Mikrometer Typischerweise liegt die Tropfengröße in einem Bereich von 5 Mikrometer bis 100 Mikrometer, vorzugsweise von 10 Mikrometerbis 50 Mikrometer Bei Tropfen, die Gebilde wie biologische Zellen enthalten, wird die Mindestgröße von der Größe dieser Gebilde bestimmt und die Tropfengröße liegt typischerweise in einem Bereich von 10 Mikrometer bis 50 Mikrometer.
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Bei Tropfen ohne Gebilde hängt die Untergrenze im Wesentlichen nur vom verwendeten Tropfenerzeugungssystem ab. Grundsätzlich ist die Verwendung möglichst kleiner Tropfen, soweit noch handhabbar, bevorzugt, da materialsparend und somit kostengünstiger. Wie bereits oben ausgeführt, liegt ein Hauptvorteil aller mikrofluidischen Verfahren und insbesondere auch des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Möglichkeit zur parallelen Durchführung einer großen Anzahl von Reaktionen und nachfolgenden Analyse- und Trennschritten auf kleinstem Raum.
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Ein wesentlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung besteht in der Anwendung des beschriebenen Trennungsverfahrens zur Selektion und Identifizierung von Zellen, die eine bestimmte Zellaktivität aufweisen oder nicht aufweisen, oder zur Selektion und Identifizierung von Substanzen, die einen bestimmten qualitativen oder quantitativen Einfluss auf bestimmte chemische, biologische oder physikalischen Reaktionen haben oder nicht haben. Diese Selektions- und Analyseverfahren sind vorzugsweise Verfahren mit hohem Durchsatz.
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Spezieller handelt es sich bei den untersuchten Substanzen um Substanzen aus der Gruppe aus Katalysatoren, einschließlich Enzymen, Cokatalysatoren und Inhibitoren.
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Ein spezielleres Verfahren zur Selektion und Identifizierung von Zellen, die eine bestimmte Zellaktivität aufweisen oder nicht aufweisen, oder zur Selektion und Identifizierung von Substanzen, die einen bestimmten qualitativen oder quantitativen Einfluss auf bestimmte chemische, biologische oder physikalischen Reaktionen haben oder nicht haben,
umfasst die Schritte a)–c) des. Verfahrens nach einem der Ansprüche 1–18, wobei in Schritt a) primäre Tropfen bereitgestellt werden, von den mindestens ein Teil die zu untersuchenden Zellen oder Substanzen enthält, und ferner
d) Isolieren von Tropfen mit einem vorgegebenen physikalischen Zielparameter und Identifizieren der Zellen oder Substanzen, welche in diesen Tropfen vorliegen.
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In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Selektions- bzw. Screeningverfahren wird das Verfahren mehrmals hintereinander durchgeführt, wobei die nach dem ersten Durchgang des Verfahrens selektierten Zellen oder Substanzen weiteren Selektionsdurchgängen unterworfen werden. In diesen weiteren Durchgängen können sie z. B. anderen, insbesondere stringenteren, Reaktionsbedingungen unterworfen werden, um dadurch einen höheren Grad an Selektion zu erhalten.
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Daneben ist die serielle Durchführung auch geeignet, um Substanzen durch „gerichtete Evolution” zu optimieren: Nach jedem Reaktionschritten werden die selektierten Zellen und Substanzen einer Veränderung unterworfen, inbesondere durch Mutagenese. Anschließend erfolgt eine weitere Selektion und Veränderung. Auf diese Weise lässt sich eine schrittweise Optimierung der gewünschten Eigenschaften erreichen.
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Vorteilhafte Anwendungsmöglichkeiten sind beispielsweise das Enzym-Screening und die Enzymoptimierung durch „gerichtete Evolution” für verschiedenste Zwecke, z. B. Celluloseabbau, Ethanolproduktion, Waschmittelenzyme etc.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Vorrichtung, insbesondere zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1–24, umfassend
- a) einen Inkubationsraum, der zur Aufnahme einer ersten Phase in Form von Tropfen, die ein Reaktionsmedium umfassen, und einer zweiten flüssigen Trägerphase, die mit der ersten Phase nicht mischbar ist, ausgelegt ist;
- b) eine Trenneinrichtung, welche eine vorgegebene geometrische Form und/oder Oberflächengestaltung aufweist, dergestalt, dass unterschiedliche Tropfen eine unterschiedliche Wechselwirkung mit der geometrischen Form und/oder Oberflächengestaltung der Trenneinrichtung erfahren und dadurch getrennt werden können.
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In einer bevorzugten Ausführungsform, insbesondere zur Trennung von Tropfen mit unterschiedlichem Durchmessser, ist die Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, dass die Trenneinrichtung eine Oberfläche mit einer oder mehreren Öffnung(en) mit vorgegebenem Durchmesser umfasst. Diese Oberfläche kann beispielweise Bestandteil einer Sieb- oder Filtervorrichtung sein oder die Oberfläche einer Lochplatte oder Lochmembran.
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In einer speziellen und besonders vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird die Trenneinrichtung von mindestens einem Teil von mindestens einer Begrenzungsfläche, insbesondere Decke und/oder Boden, des Inkubationsraums gebildet. Falls die Tropfen eine geringere spezifische Dichte als die flüssige Trägerphase haben, sammeln sie sich an der mit Öffnungen oder einer anderen selektierenden Oberfläche versehenen Decke des Inkubationsraums und werden dort automatisch z. B. nach der Größe getrennt. Umgekehrt sammeln sich Tropfen mit einer größeren spezifischen Dichte als die flüssige Trägerphase am Boden und können dort getrennt werden.
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Auch in dem Fall, dass der veränderte physikalische Parameter der Tropfen eine Veränderung der spezifischen Dichte ist, kann zur Trennung von unterschiedlichen Tropfen mindestens eine Trenneinrichtung am Boden und/oder der Decke des Inkubationsraums vorgesehen sein.
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In dem Fall, dass der veränderte physikalische Parameter der Tropfen die Tropfenform ist, kann die Trenneinrichtung z. B. eine Oberfläche mit öffnungen vorgegebener Größe und Form umfassen, welche nur Tropfen einer bestimmten Form passieren lässt.
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In dem Fall, dass der veränderte physikalische Parameter der Tropfen die Adhäsion an oder Affinität zu bestimmten Oberflächen ist, kann die Trenneinrichtung eine Oberfläche umfassen, welche ausschließlich oder bevorzugt nur die Adhäsion von bestimmten Tropfen, beispielsweise nur primären Tropfen oder nur sekundären Tropfen oder nur einer Art von sekundären Tropfen, gestattet.
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In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist der Inkubationsraum und/oder die Trenneinrichtung Bestandteil eines mikrofluidischen Systems. In diesem Fall kann die Trenneinrichtung auch vorteilhaft von mindestens einer inneren Oberfläche eines mikrofluidischen Kanals gebildet werden. Ein solches mikrofluidisches System kann eine Vielzahl von Kanälen und damit auch von Inkubationsräumen und/oder Trenneinrichtungen parallel nutzen.
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Bei einer Verfahrensgestaltung, bei welcher der veränderte physikalische Parameter der Tropfen das Volumen ist, wird diese mindestens eine innere Oberfläche des mikrofluidischen Kanals mindestens eine Öffnung mit vorgegebenem Durchmesser. aufweisen. Durch die mögliche parallele Verwendung vieler Kanäle können auch parallele Trenneinrichtungen mit jeweils nur einer Austrittsöffnung (oder einigen wenigen Öffnungen) zu einer sehr effizienten und schnellen Trennung und Sortierung von Tropfen führen.
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Vorrichtung dadurch gekennzeichnet, dass der Inkubationsraum mindestens eine Oberfläche umfasst, die das gleiche Reaktionsmedium wie das der Tropfenphase daran adsorbiert und/oder darin absorbiert aufweist. Der Inkubationsraum kann auch eine Oberfläche aufweisen, die eine für das Lösungsmittel des Reaktionsmediums permeable Membran, welche die Tropfen im Inkubationsraum von einem Reaktionsmedium-Reservoir trennt, umfasst oder daraus besteht. Auch eine solche Oberfläche kann im weiteren Sinne als reaktionsmedium-enthaltende Oberfläche betrachtet werden.
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3 zeigt ein erfindungsgemäßes kompaktes neues Mikrofluidiksystem, welches die Tropfenerzeugung, Inkubation mit einhergehender Größenänderung der Tropfen und Selektion durch eine Lochmembran erlaubt.
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Die Realisierung der vorliegenden Erfindung in einem mikrofluidischen Systembasiert auf vier Kernschritten, um die zu untersuchenden Reaktionen und die anschließende Detektion und Selektion zu miniaturisieren: Der zu detektierende Zielparameter (I) wird in eine mikrofluidische Größe, eine Änderung bestimmter Tropfeneigenschaften, transformiert (II). Dies geschieht durch die Wechselwirkung von Mikrotropfen mit ihrer Umgebung, die sich durch eine geeignete Geometrie und Materialeigenschaften auszeichnet. Der mikrofluidische Marker (III) ermöglich schließlich eine rein passive Selektion (IV), die keiner aktiven und externen Kontrolle bedarf. Das System arbeitet autonom.
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4 zeigt in Feld A die Darstellung eines Zell-Screenings unter Bezugnahme auf die vier oben erläuterten Kernschritte. Nach Inkubation hat sich das Volumen der Tropfen mit teilungsaktiven Hefezellen (Nr. 1, 2, 3 und 6) deutlich verkleinert (Feld B). Die Selektion kleiner Tropfen erfolgt durch passiven Auftrieb durch einen Mikrofilter (Feld C). Feld D zeigt einen Prototyp für die Tropfenproduktion, Inkubation und anschließende Filterung (entspricht 3).
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Die hier vorgestellten erfindungsgemäßen Verfahren beruhen auf einem grundsätzlich neuen Ansatz:
Durch den Einsatz einer passiven Sortierung unter Nutzung spezieller Marker, bei denen es sich um einen nicht-optischen physikalischen Parameter der Tropfen handelt, der durch den Reaktionsablauf so weit verändert wird, dass er zur Unterscheidung und Trennung von verschiedenen Tropfen verwendet werden kann, entfällt die Notwendigkeit zur aktiven und externen Beobachtung und Steuerung der Tropfen.
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Bei der bevorzugten Anwendung in einem mikrofluidischen System ergeben sich noch weitere Vorteile:
- a) nicht nur die zu untersuchenden Reaktionen werden miniaturisiert, sondern ebenso die anschließenden Schritte der Analyse und Kontrolle/Sortierung;
- b) die Miniaturisierung von Analyse und Sortierung erfolgt durch die Nutzung spezieller mikrofluidischer Marker in Kombination mit einer geeigneten mikrofluidischen Umgebung;
- c) diese Kombination führt zu einer passiven Sortierung, die keiner aktiven und externen Steuerung bedarf und die Zahl der notwendigen Mikro-Makro-Schnittstellen wird damit auf ein Minimum reduziert.
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Die vorliegende Erfindung eröffnet den Zugang zu einer neuen universellen Basis und Plattform-Technologie, die für unterschiedlichste Mikrofluidikanwendungen (und andere Anwendungen) eingesetzt werden kann und nicht auf eine Produktnische beschränkt ist.
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Die Reduktion der Mikro-Makro-Schnittstellen und der größtmögliche Verzicht auf externe Kontrollelemente steigern die Robustheit erheblich. Eine Eigenschaft, die gerade in der Mikrofluidik entscheidend für eine erfolgreiche Anwendung ist.
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Zudem reduziert der Verzicht auf aktive Steuerelemente und das einfache Grundkonzept die Kosten des Systems drastisch: Da das erfindungsgemäße Konzept die notwendigen Analyseelemente auf mikrostrukturierte Geometrien und Materialeigenschaften reduzieren kann, werden die Produktionskosten für einen erfindungsgemäßen Chip im wesentlichen durch das verwendete Material bestimmt: im Falle des derzeit eingesetzten PDMS ca. 1 EUR pro Einheit.
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Neuartige mikrofluidische Marker erlauben die Selektion globaler Systemeigenschaften ohne die Notwendigkeit spezifische, oft kostspielige Assays zu entwickeln: So lässt sich die Gesamteffizienz eines enzymatischen Polymerabbaus als Zielgröße messen, unabhängig von den molekularen Details (Schnittposition, Fragmentlänge, Substratmodifikationen oder Substratheterogenität). Das System arbeitet „assay-frei”.
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Das einfache Design erlaubt darüber hinaus die Realisierung kompakter und mobiler Produkte für den flexiblen Einsatz in Forschungslaboratorien in Form von einfachen Verbrauchsmaterialien („Kit-Konzept”): Bereits ein 20 × 20 cm2 großes System erlaubt die Inkubation und die parallele Selektion von ca. 2,5 × 107 Tropfencontainern. Weiterhin ist durch das einfache Design eine Parallelisierung und Kaskadierung problemlos möglich.
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Kurzbeschreibung der Figuren
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1: Schema der Erzeugung von Mikrotropfen durch Flussfokussierung zweier nicht-mischbarer Flüssigkeiten
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2: Schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen passiven Sortierung auf Basis der Tropfengröße durch einfaches Neigen der Vorrichtung mit den Tropfen
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3: Aufsicht auf eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
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4: schematische Darstellung einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
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5: Erzeugung von Mikrotropfen durch Flussfokussierung von Wasser und Öl
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6: Volumenänderung von Modelltropfen durch osmotische Druckdifferenzen zwischen Tropfen und PDMS-Umgebung;
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6a: Salzgradient; 6b Zuckergradient
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7 und 8: Volumenverkleinerung von Tropfen mit eingeschlossenen Hefezellen; 7: mikroskopische Aufnahme der Tropfen in mikro-fluidischen Kanälen, 8: graphische Darstellung der Volumenverkleinerung
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9: Volumenverkleinerung von Tropfen mit eingeschlossenen E. coli-Bakterien
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10: Wachstumskurve der E. coli-Bakterien in den Tropfen im Vergleich zu herkömmlichen belüfteten Kulturen
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11: Volumenvergrößerung von Tropfen mit eingeschlossenen Algen
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12: Tropfenbildung für zellfreie Enzymsysteme
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13: Volumenvergrößerung von Tropfen mit einem zellfreien Enzymsystem (DNAseI)
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14: DNAseI-Kontrolle
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15: Ansicht einer erfindungsgemäßen Trenneinrichtung
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16: Detailansicht der Trenneinrichtung von 15 mit zwei Tropfen, welche diese passieren
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Die folgenden, nicht-beschränkenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.
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In diesen Beispielen wurde der Mechanismus der Größenänderung an verschiedenen Zellsystemen und Enzymsystemen getestet. Es wurde gezeigt, dass sich das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur auf Zellsysteme, sondern auch auf Nicht-Zell-Systeme zur Detektion chemischer Reaktionen innerhalb der Tropfen, z. B. enzymatischer Auf- und Abbau von Polymeren, erfolgreich anwenden lässt.
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In den folgenden Experimenten wurden Tropfen mit einem Durchmesser von 20 bis 50 μm verwendet. Hergestellt wurden diese durch das mikrofluidische Verfahren der Flussfokussierung (5). Dazu wurde ein inertes perfluoriertes Trägeröl verwendet (FC-40, 3M). Die wässrige Phase enthielt zur Stabilisierung das Tensid Zonyl FSO-100. Als weiteres wurde das Ammoniumsalz des fluorierten Tensids Krytox 157 FSL zur Ölphase gegeben (2 Gewichts-%) um die Tropfenstabilität zu erhöhen. FC-40 besitzt eine Dichte von 1,855 g/ml. Wässrige Tropfen erfahren damit einen Auftrieb, der eine Filterung durch eine löchrige Decke ermöglicht.
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Um eine definierte System für den Austausch von Wasser zwischen Tropfen und der Umgebung zu erzeugen, wurde ein Mikrofluidik-Kanalsystem verwendet, dessen Wände und Decke aus PDMS bestehen und mit der entsprechenden wässrigen Lösung (z. B. Zellmedium) gesättigt sind. Zur Sättigung wurde das PDMS-System für mindestens einen Tag in der entsprechenden Lösung inkubiert. Das PDMS nimmt in dieser Zeit die Lösung auf und stellt damit ein Reservoir mit definierter Osmolarität dar, das den Austausch von Wasser mit Tropfen und dem PDMS-System durch die Ölphase hindurch und in direkten Kontakt mit den Tropfen erlaubt.
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BEISPIEL 1
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Volumenänderung durch unterschiedliche Stoffkonzentrationen innerhalb und außerhalb der Tropfen
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Die Möglichkeit, die Tropfengröße durch osmotische Druckdifferenzen in einem geeigneten mikrofluidischen System zu verändern, wurde anhand von definierten Modellsystemen charakterisiert:
Um den Wasseraustausch zwischen den Tropfen und der mit einer Lösung gesättigten PDMS-Umgebung näher zu untersuchen wurden verschiedene statische Systeme mit jeweils einer unveränderlichen Lösungs-Zusammensetzung hinsichtlich der Zahl gelöster Stoffe innerhalb und außerhalb der Tropfen verwendet. 6 zeigt die Größenänderung von Tropfen, die eine 1% Zonyl-Lösung enthalten, in einer Mikroumgebung aus PDMS, das mit der gleichen Lösung bzw. einer 100 mM NaCl; 1% Zonyl-Lösung gesättigt wurde.
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Nach ca. 10h Inkubation hat sich die Querschnittsfläche auf etwa 80% der Ausgangsgröße der Tropfen reduziert, was einer Volumenänderung von etwa 30% entspricht (6a).
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Eine Verwendung einer 1 M Zuckerlösung in den Tropfen führte in der gleichen gesättigten PDMS-Umgebung zu einer Vergrößerung der Tropfenquerschnittsfläche um mehr als 20% nach 48 Stunden (6b).
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BEISPIEL 2
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Volumenverkleinerung durch Hefezellen
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Der Einschluss und die anschließende Inkubation von Hefezellen führt innerhalb weniger Stunden zu einer merklichen Änderung der Tropfengröße (7). Das Ausmaß der Volumenabnahme pro tropfen wird bestimmt durch die metabolische Aktivität, die Teilungsfähigkeit der Zellen sowie durch die Zahl der zu Beginn der Tropfenbildung in den Tropfen eingeschlossenen Zellen (8).
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BEISPIEL 3
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Volumenverkleinerung durch Bakterien
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Auch E. coli-Bakterien zeigen den Effekt der Volumenreduktion durch Inkubation der Bakterien in den Tropfen (9 und 10B).
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Interessanterweise zeigen die Bakterien in den Tropfen eine höhere Wachstumsrate und erreichen eine höhere Zelldichte im Vergleich zu klassischen Zell-Kulturbedingungen (Zellinkubation im Brutschrank unter Schütteln in Millilitervolumina) (10).
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BEISPIEL 4
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Volumenvergrößerung durch Algen
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Der Mechanismus der Volumenänderung der Tropfen durch Veränderung der osmotischen Druckdifferenz lässt für zuckeraufbauende Organismen eine Vergrößerung des Volumens erwarten. In Experimenten mit Algen, die zur Photosynthese und damit zur Produktion von Glukose in der Lage sind, konnte dies auch tatsächlich beobachtet werden: Tropfen mit Algen (11 rechts unten) nahmen an Größe zu, während Hefe enthaltende Tropfen kleiner wurden.
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BEISPIEL 5
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Volumenvergrößerung durch Enzymsysteme
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Zur Demonstration des Volumeneffektes bei nicht-lebenden Reaktionssystemen wurde ein DNA/DNase-System für die Tropfen entwickelt. Dazu wurde DNase an Polystyrolbeads angebunden und mit Hilfe eines Doppelzufluss-Mikrofluidiksystem gemeinsam mit einer DNA-Lösung in Tropfen eingeschlossen.
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Das Doppelzufluss-System gewährleistet, dass Enzym und Substrat erst unmittelbar vor der Tropfenbildung in Kontakt (12) kommen. Damit ist sichergestellt, dass der Polymerabbau der DNA erst mit der Tropfenbildung beginnt.
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Die Anbindung der DNase an Beads erlaubt die einfache Herstellung eines „binären” Tropfen-Systems, mit Tropfen, die entweder Beads und damit DNase enthalten oder kein Enzym enthalten. Die Beads erlauben zudem die einfache Visualisierung (13).
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Die Aktivität der DNase-Bead-Systeme wurde mittels Gelelektrophorese geprüft (14): Nach Inkubation mit den DNase-Beads ist die zuvor zugegebene Lambda-DNA in kleine Bruchstücke zerlegt worden.
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Beschreibung von Fig. 14:
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Control 1: DNaseI in Lösung; reaction 1–3: DNaseI-Beads in verschiedenen Konzentrationen (0.67 mg, 3.33 mg, 0.33 mg); control 2: Überstand von Beads with DNA; control 3: Hitze-Inaktivierung; control 4: nur DNA; ladder (Spur ganz rechts): DNA-Leiter (Banden von unten nach oben: 1–10 kb in Schritten von 1 kb und 15 kb).
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Die erwartete Volumenvergrößerung der Tropfen durch den Polymerabbau und die damit einhergehende Erhöhung der Osmolarität fiel aufgrund der eingesetzten sehr geringen DNA-Menge (90 μM) nur gering aus (13). Dennoch konnte damit eindeutig die Anwendbarkeit des Verfahrens auf Enzymsysteme demonstriert werden. Anwendungsmöglichkeiten bestehen damit für das Enzym-Screening und die Enzymoptimierung durch „gerichtete Evolution” für verschiedenste Zwecke.
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BEISPIEL 6
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Passive Filterung basierend auf Tropfenauftrieb durch ein Gitter
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Die passive Filterung von Tropfen unterschiedlicher Größe, die durch eines der oben beschriebenen Verfahren erzeugt wurden konnte mit Hilfe eines einfachen Metallgitters (TEM-Grid) demonstriert werden, dass als Trennfilter zwischen zwei Mikrofluidikkanälen platziert wurde (15).
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Dieses System ermöglichte die einfache Trennung durch den Tropfenauftrieb: Eine Deformierung der Tropfen findet unter statischen Bedingungen oder bei geringen Fließgeschwindigkeiten nicht statt. Nur Tropfen mit einem Durchmesser, der kleiner als die Lochgröße des Gitters ist, gelangen von der unteren Kammer in den darüberliegenden Kanal.
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Die Größentrennung der Tropfen erfolgt durch die Permeation genügend kleiner Tropfen durch eine Gitterstruktur, wobei der Trenndurchmesser durch die Gittergeometrie und die Flussgeschwindigkeiten in den hin- und wegführenden Kanälen festgelegt wird. Das Gitter und eine darüberliegenden Auffanggeometrie ersetzen in einem bestimmten Bereich der Flusszelle die Kanaldecke. Bei genügend kleinem Durchmesser steigen im Kanal entlangfließende Tropfen getrieben von der Auftriebskraft durch das Gitter auf und können aus dem Auffangkanal abgesogen werden.
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15 zeigt einen möglichen Aufbau der Trenngeometrie in einer Flusszelle: Eine untere PDMS-Schicht beinhaltet eine Kanalstruktur, in der Tropfen entlangfließen. Eine obere PDMS-Schicht mit einem Auffangkanal schließt die Flusszelle dicht ab. In dem Bereich, in dem sich die Kanäle unterer und oberer PDMS-Schicht überschneiden, befindet sich ein dünnes hexagonales TEM-Gitter. In 16 ist der Aufstieg zweier kleiner Tropfen dargestellt, die von unten kommend unter das Gitter fließen und dann durch das Gitter aufsteigen, erkennbar am Herauslaufen aus dem Fokus.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 2009/0068170 A1 [0010]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- Agresti et al. (PNAS 107, 4004–9 (2010)) [0009]
