DE60013848T2

DE60013848T2 - Mikrofluid-vorrichtungen zur gesteuerten handhabung von kleinstvolumen

Info

Publication number: DE60013848T2
Application number: DE60013848T
Authority: DE
Inventors: Michael J. Ramsey; C. Stephen JACOBSON
Original assignee: UT Battelle LLC
Current assignee: UT Battelle LLC
Priority date: 1999-08-12
Filing date: 2000-08-10
Publication date: 2005-09-22
Anticipated expiration: 2020-08-11
Also published as: DE60013848D1; KR20020043553A; EP1202802A1; CA2380614A1; ATE276044T1; CA2380614C; EP1202802B1; CN1378485A; AU768135B2; AU7758600A; JP2003507162A; MXPA02001437A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf eine mikrostruktur-hergestellte Fluidvorrichtung und insbesondere auf eine solche Vorrichtung, die so konfiguriert ist, dass sie eine Reihe von winzigen Volumensegmenten eines Materials bildet und transportiert und diese optimal einlagert, entnimmt und analysiert, sowie auf ein Verfahren zum Bilden und Transportieren sowie zum optimalen Einlagern und Entnehmen einer solchen Reihe von winzigen Volumensegmenten.
Hintergrund der Erfindung
Eine Reihe von elementaren mikrostruktur-hergestellten Fluidelementen wurde während der letzten Jahre präsentiert. Obwohl viele dieser Fluidelemente relativ einfach sind, sind sie in Hinblick auf ihre vielen realistischen Anwendungen beträchtlich wirksam und können die Art und Weise, wie biochemische Trennungen vorgenommen werden, sehr wohl revolutionieren. Die Mehrzahl dieser Darstellungen umfasste den Transfer bekannter chemischer Messtechniken wie Elektrophorese oder Flüssigchromatographie auf mikroskopisch kleine Plattformen. Solche Darstellungen lassen vermuten, dass mikroskopisch klein hergestellte Trennungsvorrichtungen zur Verbesserung des mit der Informationssammlung aus solchen Experimenten in Zusammenhang stehenden Zeit- und Kostenfaktors relativ nützlich sind. Die bekannten Vorrichtungen haben aber die neuen Versuchsansätze, die solche mikrostruktur-hergestellten Vorrichtungen möglicherweise ermöglichen können, noch keineswegs ausgeschöpft. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung sind davon überzeugt, dass sich durch die Verbesserungen in der Steuerung von Mikrofluidics neue und noch wirksamere biochemische Versuchsparadigmen ergeben werden.
Der Bereich von mikrostruktur-hergestellten Fluidics, der die meiste Aufmerksamkeit erhalten hat, sind die elektrokinetisch getriebenen Prozesse. Elektrokinetische Fluidmanipulationen wurden zum Mischen und Umsetzen von Reagenzien, zum Einspritzen oder Abgeben von Proben sowie für chemische Trennungen dargestellt. Elektrisch gesteuerte Trennungstechniken wie die Kapillarelektrophorese (CE), Offenkanal-Elektrochromatographie (OCEC) und elektrokinetische Mizellat-Kapillarchromatographie (MEKC) wurden von einer Reihe von Forschungsgruppen demonstriert. Sowohl dsDNA-Fragmente als auch Sequenzierungsprodukte wurden unter Verwendung von Mikrochip-Kapillargelelektrophorese, die mit einer laserinduzierten Fluoreszenzdetektion gekoppelt waren, größenmäßig bemessen. Weniger herkömmliche elektrophoretische Trennungen wurden in Post-Arrays unter Verwendung von Gleichstrom und elektrischen Impuls-Feldern untersucht. Zusätzlich dazu wurden konkurrierende Immunoassays auf Fluoreszenzbasis unter Verwendung von elektrophoretischer Mikrochip-Trennung des gebundenen und frei markierten Antigens gezeigt. Diese Miniaturvorrichtungen zeigten Leistungen, die in allen untersuchten Fällen entweder gleich gut wie oder besser als herkömmliche Laborvorrichtungen waren und gleichzeitig die seltene Kombination von "besserschneller-billiger" bieten zu scheinen. Die Mikrochip-Trennungsvorrichtungen zeigen gegenüber herkömmlichen Ansätzen Geschwindigkeitsvorteile von mehreren Größenordnungen. Die Effizienz von elektrophoretischen Trennungen unter Diffusions-eingeschränkten Bedingungen verhält sich proportional zu dem an der Probe hervorgerufenen Spannungsabfall. Diese Diffusions-eingeschränkten Bedingungen können für kurze Trennungsdistanzen auf Mikrochips aufgrund der schmalen axialen Erstreckung der erzeugten Injektions-Einlässe erreicht werden. Die Analysezeit verringert sich quadratisch mit der Trennungsdistanz bei einem konstant angelegten Potential, was einen grundlegenden Vorteil für Elektrophorese-Trennungen auf Mikrochip-Basis ergibt.
Andere bedeutende Vorteile von chemischen Trennungen auf Mikrochip-Basis sind kleine Volumina, die analysiert werden können, die Fähigkeit, die Probenverarbeitung und -analyse monolithisch zu integrieren, sowie die geringen Kosten eine Replikation, wodurch parallele Analysen höherer Anzahl ermöglicht werden. Alle diese Faktoren sind mit der hohen Durchgangsanalyse und den Kosten- und Zeitverringerungen zum Erzeugen der biochemischen Information konsistent.
Frühere Bemühungen, die eine Integration der Probenverarbeitung zeigen, umfassen die Ableitung von Aminosäuren, die an elektrophoretische Trennungen gekoppelt sind, nach der Trennung sowie vor der Trennung. DNA-Restriktionsdigestionen und PCR-Verstärkungen auf einem Chip wurden mit der elektrophoretischen Fragment-Größenzuordnung auf den integrierten monolithischen Mikrochips gekoppelt. Zell-Lyse, multiplexe PCR und CE-Analyse wurden auf Plasma enthaltenden E.coli Zellen in einer einzelnen Vorrichtung durchgeführt.
Parallele PCR/CE-Analysen von multiplen Proben in Chips, die multiple Reaktionsvertiefungen enthalten, wurden ebenfalls dargestellt. Zusätzlich dazu wurden konkurrierende Immunanalyseversuche auf einer Mikrochip-Vorrichtung durchgeführt, die Fluidelemente für das Mischen der Probe mit Reagenzien, Inkubation und Elektrophorese-Trennungen umfassten. Andere mikroskopisch klein erzeugten Fluidelemente, die an elektrisch betriebene Trennungen gekoppelt waren, umfassen die Elektrosprüh-Ionisierung für die Analyse mittels Massenspektrometrie sowie die Probenkonzentration unter Verwendung poröser Membranelemente und die Festphasenextraktion. Es wurden auch Vorrichtungen gezeigt, die den elektrokinetischen Transport ausschließlich zum Durchführen chemischer und biochemischer Reaktionen verwenden. Beispiele umfassen Vorrichtungen für die enzymatische Reaktionskinetik, Enzymanalysen, organische Synthesen und Zellmanipulationen. Alle vier dieser letzteren Anwendungen könnten letztendlich für die experimentelle Biologie von beträchtlicher Wichtigkeit sein, doch wurden sie bis dato noch nicht ausreichend weit entwickelt.
Eine Reihe von mikrostruktur-hergestellten Fluidvorrichtungen, die Hydraulikkräfte für den Fluidtransport einsetzen, wurde ebenfalls dargestellt. Während die Verwendung von Hydraulikkräften auf einen breiteren Bereich von Fluidmaterialien als die elektrokinetischen Phänomene angelegt werden kann, ist die Implementierung im Allgemeinen weniger praktisch. Externe Verbindungen an Mikrochips für eine hydraulisch betriebene Strömung sind beschwerlicher als das Anlegen eines elektrischen Potentials. Darüber hinaus folgen elektrokinetisch gesteuerte Kräfte dem elektrischen Stromfluss und ermöglichen somit eine größere Steuerung des Transports innerhalb eines Mikrokanal-Verteilers gegenüber dem Anlegen von Druck oder Vakuum auf einem Terminus eines solchen Verteilers. Elektrokinetische Kräfte können auch viel effektivere Drücke erzeugen, als dies mittels Hydraulik möglich ist. Die gezeigten Fähigkeiten von hydraulisch betriebenen Vorrichtungen scheinen hinter jenen von elektrokinetisch gesteuerten Vorrichtungen zurückzubleiben. Nichtsdestotrotz wurde von einer Reihe wichtiger Fähigkeiten berichtet.
Mikrofluid-Vorrichtungen zum Durchführen von PCR wurden mit beträchtlichem Interesse verfolgt. Frühe Vorrichtungen umfassten nur in Silicium hergestellte Kammern als Probenspeicher, während spätere Vorrichtungen die Siliciumstruktur für Widerstandserhitzung oder integrierte Filter für die Isolierung der weißen Blutzellen verwendeten. In der letzten Zeit wurde von einer interessanten Vorrichtung für eine kontinuierliche Strömungs-PCR berichtet, die einen einzelnen Mikrokanal verwendete, der durch die Temperaturzonen mäandert, um eine thermische Wechselbeanspruchung zu erreichen. Filter zum Verarbeiten der Zellmaterialien wurden in Silicium-Substrate in Mikrostrukturen verarbeitet. Strömungszytometrie-Vorrichtungen wurden ebenfalls in Silicium- und Glassubstrate mikrobearbeitet und hydraulisch angetrieben.
Die Fähigkeit, Reagenzien und Reaktionsprodukte auf dem Chip zu manipulieren, lässt die letztendliche Fähigkeit vermuten, praktisch alle Formen von Verfahren, die eine Handhabung von flüssigen Chemikalien auf Labortischen umfassen, auf einer mikroskopisch klein erzeugten Vorrichtung durchzuführen. Der Paradigmen-Wandel des Wechsels vom Labor zu einem Mikrochip umfasst den Vorteil von verringerten Reagensvolumina, Automatisierung der Materialmanipulation ohne bewegliche Teile, verringerten Kapitalkosten, größerer paralleler Verarbeitung und höherer Verarbeitungsgeschwindigkeit. Das Volumen von Fluiden, die manipuliert oder in den zuvor beschriebenen Mikrofluid-Strukturen dispergiert werden, befindet sich im Nanoliter-Bereich oder kleiner im Vergleich zu Dutzenden von Mikrolitern auf der Laborbasis, was einer Verringerung von drei Größenordnungen oder mehr entspricht. Strömungsraten auf den Vorrichtungen, die untersucht worden sind, liegen in der Größenordnung von 1 ml/Jahr des kontinuierlichen Betriebs. Indem multiple Prozesse in einer einzelnen Vorrichtung (vertikale Integration) implementiert sind, können diese geringen Fluidquantitäten effizient und automatisch unter Computersteuerung von Prozess zu Prozess manipuliert werden. Eine Bedienperson müsste nur mehr die zu analysierende Probe beladen. Klarerweise kann diese serielle Integration von zahlreichen Analyseschritten mit der parallelen Erweiterung der Verarbeitungskapazität kombiniert werden, indem die mikroskopisch klein erzeugten Strukturen, so z.B. parallele Trennungskanäle, auf derselben Vorrichtung repliziert werden.
Obwohl das sogenannte "Labor auf einem Chip" viele Versprechungen zu geben scheint, und obwohl man glaubt, dass es viele dieser auch halten wird, sind weitere Entwicklungen notwendig, um ein Wirkungsniveau zu erzielen, das dem auf dem Gebiet der Mikroelektronik realisierten Maßstab der Miniaturisierung gleichkommt. Es gibt zumindest vier wichtige Punkte, die in Betracht gezogen werden müssen, um Vorrichtungen vom Typ des "Labors auf einem Chip" über das nächste Jahrzehnt auf das nächsthöhergelegene Entwicklungsniveau oder die nächstbessere Verarbeitungsleistung zu bringen. Diese Punkte sind eine fortgeschrittene Mikrofluidsteuerung, die "Welt-Chip"-Schnittstelle, Detektion und lebensfähige Herstellungsstrategien. Zur Zeit stellt die elektrokinetische Manipulation von Fluiden in Mikrokanalstrukturen den Stand der Technik in der präzisen gesteuerten Handhabung geringer Volumina dar. Es war Strategie, das zeitabhängige elektrische Potential an jedem der Kanalenden zu steuern, um Materialien entlang eines erwünschten Wegs zu bewegen. Während sich diese Strategie für die Ventilkonfigurationen und das Mischen in einfachen Konstruktionen als sehr effektiv erwiesen hat, ist sie in ihrer Anwendungsmöglichkeit und Leistung begrenzt, da die Vorrichtungen immer komplexer werden. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung sind davon überzeugt, dass neue Strategien, die eine Steuerung der elektrischen Potentiale an zahlreichen Punkten in der Mikrokanal-Konfiguration zulassen, für diese komplexeren Strukturen erforderlich sind. Der elektrokinetische Transport hat auch in den Arten von manipulierbaren Lösungen und Materialien seine Grenzen.
Die Welt-Chip-Schnittstelle ist der Ausdruck, mit dem die Erfinder der vorliegenden Erfindung das Problem des Zuführens verschiedener Proben oder Reagenzien auf Mikrochips für eine hohe Durchgangsanalyse bezeichnet haben. Obwohl eine gegebene Probe in einer so kurzen Zeitspanne wie einer Millisekunde analysiert werden kann, können gegenwärtig zahlreichen Proben in den Mikrochip-Vorrichtungen mit einer solchen Geschwindigkeit nicht verwendet werden. Bis dato wurden nur sehr wenige Bemühungen in diese Richtung unternommen, aber dennoch stellt dieses Problem eine große Hürde für Versuche mit sehr hohem Durchsatz dar.
WO 98/00231 und EP-A-0815940 offenbaren Fluidvorrichtungen zum Bilden und Transportieren einer Reihe von winzigen Volumensegmenten von Materialien in Mikrokanälen.
Zusammenfassung der Erfindung
Nach einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren nach Anspruch 1 zum Bilden und Transportieren einer Reihe von winzigen Volumensegmenten (Nanoliter oder Subnanoliter) eines Materials, z.B. auf einem Fluid-Mikrochip, bereitgestellt. Reagenzien, Zellen oder Reaktionskügelchen können in die Transport-Fluidvolumina injiziert oder eingeführt werden, um eine Reihe von Untersuchungs- oder Analysevolumina bereitzustellen. Die Untersuchungs- oder Analysevolumina werden seriell transportiert, um somit eine serielle Registrierung derselben für das Einlagern und Entnehmen für eine spätere Analyse oder eine andere Manipulation auf dem Mikrochip bereitzustellen.
Nach einem weiteren Aspekt dieser Erfindung ist eine Vorrichtung nach Anspruch 16 zum Bilden und Transportieren einer Reihe von winzigen Volumensegmenten eines Materials bereitgestellt. Die Vorrichtung muss ein Fluid-Mikrochip sein.
Weitere Ausführungsformen der Vorrichtung gemäß dieser Erfindung umfassen zusätzliche Kanäle, Quellen von Reagenzien, Reagensverdünnungen, Zellen und/oder Reaktionsteilchen zum Einführen solcher Materialien in die durch sequentielle Paare der Segmentierungsfluidvolumina gebildeten Transportvolumina. In solchen Ausführungsformen sind auch Mittel zum Transportieren der Reagenzien, Zellen und/oder Reaktionskügelchen umfasst. In einer bevorzugten Anordnung umfasst der erste Mikrokanal eine oder mehrere Schleifen, um eine serielle Einlagerung der Reaktionsvolumina für eine spätere Entnahme und Analyse oder Manipulation bereitzustellen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorangegangene Zusammenfassung und die folgende detaillierte Beschreibung sind in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen besser verständlich, in welchen:
1A, 1B und 1C schematische Teilansichten eines Mikrochips sind, welche die Abfolge der Schritte beim Einführen eines Segmentierungsfluidvolumens in einen Mikrokanal, der ein Transportfluid gemäß einem Aspekt dieser Erfindung enthält, darstellen;
2 eine schematische Teildarstellung eines Mikrochips ist, die das Laden eines Reagens in die Transportvolumina zwischen alternierenden Paaren von Segmentierungsfluidvolumina in einem Mikrokanal gemäß einem weiteren Aspekt dieser Erfindung darstellt;
3 eine schematische Teilansicht eines Mikrochips ist, die das Laden von Teilchen zwischen alternierenden Paaren von Segmentierungsfluidvolumina in einem Mikrokanal gemäß einem weiteren Aspekt dieser Erfindung zeigt;
4 eine schematische Teilansicht eines Mikrochips ist, welche die serielle Abfolge des Einführens eines Segmentierungsfluids, eines Enzyms und eines Substrats in einen Mikrokanal gemäß einem weiteren Aspekt dieser Erfindung darstellt;
5 eine schematische Teildarstellung eines Mikrochips ist, welche die serielle Abfolge des Einführens eines Segmentierungsfluids, eines Reaktionsteilchens und eines Reagensfluids in einen Mikrokanal gemäß eines weiteren Aspekts dieser Erfindung darstellt;
6 eine schematische Teilansicht eines Mikrochips ist, welche die Anordnung zum Vorbereiten einer Reihe von Enzymkügelchen-Proben zeigt;
7 eine schematische Darstellung eines Mikrochips ist, die eine Anordnung zum Einlagern und Entnehmen einer Reihe von Zellen, Reaktionskügelchen oder Reagensvolumina darstellt; und
8 eine schematische Darstellung eines Systems zum Untersuchen und Identifizieren neuer Medikamente ist, die einen wie in 7 dargestellten Mikrochip umfasst.
Detaillierte Beschreibung
Mit Bezug nun auf die Zeichnungen, in welchen dieselben oder ähnliche Komponenten oder Merkmale mit denselben Bezugsziffern bezeichnet sind, und insbesondere in Bezug auf die 1A, 1B und 1C ist ein Haupt-Mikrokanal 10 dargestellt. Der Haupt-Mikrokanal 10 ist im Wesentlichen linear und verfügt über einen Einlass 12, der mit einer Quelle eines Transportfluids (nicht dargestellt) verbunden ist, und einen Auslass 14, der mit einem (nicht dargestellten) Abfallspeicher verbunden ist. Ein Zweigkanal 16 weist einen Einlass 18 und einen Auslass 20 auf und schneidet den Haupt-Mikrokanal 10, um ein Segmentierungs- oder Isolierungsfluid 22 in den Hauptkanal 10 zu leiten. Elektroden e1, e2, e3 und e4 sind an beabstandeten Positionen entlang des Haupt-Mikrokanals 10 zwischen dem Auslass 20 und dem Auslass 14 angeordnet. Die Elektroden e5, e6 und e7 sind an beabstandeten Positionen entlang der Seite des Haupt-Mikrokanals zwischen dem Auslass 20 und dem Einlass 12 angeordnet. Alle Elektroden sind mit dem in den Mikrokanälen enthaltenen Fluiden in Kontakt. Entweder das Transportfluid oder das Segmentierungsfluid oder beide können durch die Mikrokanäle transportiert werden, wenn sie einem axialen elektrischen Feld ausgesetzt werden. Diese Funktion wird als elektrokinetische Strömung bezeichnet und umfasst solche Phänomene wie Elektrophorese, Elektroosmose und elektrodynamischen Transport.
Mit der in den 1A, 1B und 1C dargestellten Anordnung kann das Segmentierungsfluid 22 in den Mikrokanal 10 als eine Reihe von diskreten und winzigen Volumina eingeführt werden. Die Schritte des Einführens von winzigen Volumina des Segmentierungsfluids 22 sind im Wesentlichen wie folgt: Der Mikrokanal 10 wird mit dem Transportfluid gefüllt. Eine elektrische Potential-Quelle 24a wird zwischen den Elektroden e1 und e2 angelegt, während eine zweite elektrische Potential-Quelle 24b zwischen den Elektroden e5 und e6 angelegt wird. Die Größe und Polarität der elektrischen Potentiale werden so gewählt, dass sie eine elektrokinetische Strömung des Transportfluids im Haupt-Mikrokanal 10 in die durch die Pfeile in 1A angezeigten Richtungen induzieren. Eine solche Strömung des Transportfluids bewirkt, dass das Segmentierungsfluid 22 in den Haupt-Mikrokanal 10, wie dies in 1B dargestellt ist, hineingezogen wird. Geht man davon aus, dass das Segmentierungsfluid eine geringere Leitfähigkeit als das Transportfluid aufweist, wenn das Segmentierungsfluid 22 mit der Überbrückungsmembran e5 in Kontakt kommt, so fällt der Strom zwischen den Elektroden e5 und e6 ab und die Fluidströmung in diese Richtung kommt zum Erliegen. Das Segmentierungsfluid 22 strömt aber auch weiterhin aufgrund des elektrischen Potentials an den Elektroden e1 und e2 zum Auslass 14 hin. Wurde das erwünschte Volumen des Segmentierungsfluid in den Haupt-Mikrokanal 10 hineingezogen, so wird das Volumen des Segmentierungsfluids im Haupt-Mikrokanal 10 abgegeben, indem eine elektrische Potential-Quelle 24c zwischen den Elektroden e6 und e7 angelegt wird. Die Größe und die Polarität des elektrischen Potentials zwischen den Elektroden e6 und e7 werden so gewählt, dass sie eine elektroosmotische Strömung des Transportfluids im Haupt-Mikrokanal 10 in die durch die Pfeile in 1C angezeigten Richtungen induzieren. Wenn das Volumen des Segmentierungsfluids mit der Überbrückungsmembran e1 in Kontakt kommt, fällt der Strom zwischen den Elektroden e1 und e2 ab und die Fluidströmung in diese Richtung kommt zum Erliegen. Daraufhin wird ein elektrisches Potential zwischen den Elektroden e2 und e3 angelegt, um den Transport des Transportfluids und des Segmentierungsfluidvolumens fortzusetzen. Auf ähnliche Weise fällt, wenn das Volumen des Segmentierungsfluids mit der Überbrückungsmembran e2 in Kontakt kommt, der Strom zwischen den Elektroden e2 und e3 ab und die Fluidströmung in diese Richtung kommt zum Erliegen. Daraufhin wird ein elektrisches Potential zwischen den Elektroden e3 und e4 angelegt, um den Transport des Transportfluids und des Segmentierungsfluidvolumens entlang des Haupt-Mikrokanals 10 fortzusetzen. Die physikalische Konstruktion und der Betrieb einer linearen Pumpenanordnung vom in der vorliegenden Erfindung verwendeten Typ ist im Detail in der ebenfalls anhängigen Patentanmeldung Nr. 09/244.914 der Erfinder der vorliegenden Erfindung beschrieben, wobei die gesamte Spezifikation hierin durch Verweis aufgenommen ist.
Als Alternative zu elektrokinetischen Transportmechanismen können das Bewegen des Transportfluids und das Einspritzen des Segmentierungsfluids sowie anderer in einer Vorrichtung oder einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Materialien dadurch erreicht werden, dass ein Druck oder Vakuum auf den geeigneten Kanal oder die geeigneten Kanäle angelegt wird. Es ist auch beabsichtigt, dass bei Bedarf auch Kombinationen von elektrokinetischen, Druck- und/oder Vakuumtransportmechanismen bei der Implementierung einer gegebenen Vorrichtung oder eines gegebenen Verfahrens gemäß dieser Erfindung verwendet werden können.
Nachdem das Segmentierungsvolumen eine ausreichende Distanz im Haupt-Mikrokanal 10 zurückgelegt hat, wird der Vorgang wiederholt, um ein anderes Segmentierungsvolumen einzuführen. Ist die Pumpgeschwindigkeit des Segmentierungsfluids in den Haupt-Mikrokanal 10 nicht ausreichend hoch, so können ähnliche Elektroden im Zweigkanal 16 angeordnet werden.
Das Segmentierungsfluid ist vorzugsweise eine Flüssigkeit, die im Transportfluid und dem/den Reaktionsfluid/en nicht mischbar ist. Auch sollte das Segmentierungsfluid mit den verwendeten biochemischen Reagenzien biokompatibel sein. Das Segmentierungsfluid ist vorzugsweise für die Operationssteuerung des Reaktions-/Transportvorgangs nicht leitend. So stellt z.B. ein nicht leitfähiges Fluid einen praktischen Weg dar, um die Position der Reaktions- und Pumpvolumina in der Reihe von winzigen im Mikrokanal transportierten Volumina zu verfolgen. Weiters sollte das Segmentierungsfluid auch einen minimalen chemischen Verteilungskoeffizienten für die verschiedenen verwendeten Reagenzien aufweisen. Paraffin und Mineralöl sind geeignet, weil sie zur Isolierung von Zellen in kleinen Volumina extrazellulärer Lösungen ohne jegliche nachteilige Effekte verwendet werden. Perfluorkohlenwasserstoffe können ebenfalls geeignet sein, da sie eine breite Anwendung finden, wenn Biokompatibilität erforderlich ist. Siliciumöle stellen eine weitere geeignete Klasse von Materialien für das Segmentierungsfluid dar. Gase wie Propan können ebenfalls für eine Verwendung als Segmentierungsfluide geeignet sein, aber sie können im Transport- oder Reaktionsfluid gelöst werden oder durch eine gasdurchlässige Abdeckplatte entweichen, wodurch sich ihre Wirksamkeit für die Isolierung von Fluidsegmenten verringert.
Im Anschluss folgt die Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen zum seriellen Implementieren verschiedener Manipulationen winziger Materialmengen auf einem Fluidic-Mikrochip. Obwohl in Verbindung mit den verschiedenen Ausführungsformen nicht dargestellt oder beschrieben, können die verschiedenen Konfigurationen Anordnungen von elektrischen Kontakten umfassen, wie sie mit Bezug auf 1 beschrieben sind, um die für die Durchführung des Transports von Fluidmaterialien in den Kanälen verschiedener mikroskopisch klein hergestellter Vorrichtungen erforderlichen elektrischen Potentiale bereitzustellen. Alternativ dazu können wie bereits zuvor ausgeführt auch Druck- oder Vakuummittel verwendet werden.
Ein bemerkenswertes Merkmal des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung besteht in der Fähigkeit, eine Reihe von winzigen Reaktionsfluidvolumina in die Reihe von winzigen Volumensegmenten im Haupt-Mikrokanal einzuführen. Mit Bezug nun auf 2 ist eine Anordnung für das gesteuerte Laden von Reagenzien in eine Reihe von Reaktionsvolumina im Haupt-Mikrokanal 10 dargestellt. Eine Vielzahl von Segmentierungsfluidvolumina 26a, 26b, 26d und 26e werden in den Haupt-Mikrokanal 10 in beabstandeten Intervallen, wie dies bereits zuvor erklärt wurde, eingeführt. Ein Reagenskanal 28 weist einen Einlass 30 und einen Auslass 32 auf, der den Haupt-Mikrokanal 10 schneidet, um ein chemisches oder biochemisches Reagens 34 in den Haupt-Mikrokanal 10 zu leiten. Ein Abfallkanal 38 ist mit dem Haupt-Mikrokanal 10 an einer im Wesentlichen gegenüber dem Auslass 32 befindlichen Position verbunden. Ein Verdünnungskanal 40 ist mit dem Reagenskanal 28 verbunden, so dass ein Verdünnungsmittel in das Reaktionsfluid 34 gemischt werden kann. Die Schritte für das Einführen von winzigen Volumina des Reaktionsfluids 34 sind im Wesentlichen wie folgt:
Das Transportfluid und die Segmentierungsfluidvolumina 26a, 26b, 26c, 26d und 26e werden durch den Haupt-Mikrokanal 10 gepumpt. Grenzt ein sequentielles Paar von Segmentierungsfluidvolumina 26b und 26c an den Auslass 32 an, so wird das Pumpen gestoppt und das Reaktionsfluid 34 wird in das Volumen zwischen den Segmentierungsfluidvolumina 26b und 26c gepumpt. Das zwischen den Segmentierungsfluidvolumina 26b und 26c enthaltene Transportfluid wird vorzugsweise in den Abfallkanal 38 geleitet. Alternativ dazu kann das Transportfluid dazugegeben oder ersetzt werden. Das Reaktionsfluidvolumen 36a wird daraufhin elektrokinetisch entlang des Haupt-Mikrokanals 10 transportiert. Obwohl der Prozess gemäß diesem Aspekt der Erfindung mit einem statischen Operationsmodus beschrieben wurde, ist zu erkennen, dass ein dynamischer Transfer des Reaktionsfluids in die Reaktionsvolumina einen höheren Durchsatz bereitstellt. Ein solcher dynamischer Betrieb könnte durch den gesteuerten Transport des Transportfluids und des Reaktionsfluids implementiert werden, so dass das Reaktionsfluid synchron mit der Ankunft eines Reaktionsvolumens am Auslass 32 eingespritzt wird.
Vorzugsweise sind die Reaktionsfluidvolumina 36a und 36b zwischen den alternierenden sequentiellen Paaren der Segmentierungsfluidvolumina enthalten. Somit ist, wie in 2 dargestellt, das Reaktionsfluidvolumen 36a zwischen den Segmentierungsfluidvolumina 26b und 26c enthalten, während das Reaktionsfluidvolumen 36b zwischen den Segmentierungsfluidvolumina 26d und 26e enthalten ist. Eine solche alternierende Sequenzierung ermöglicht, dass die Reaktionsfluidvolumina durch den Haupt-Mikrokanal gepumpt werden, ohne dass dabei das Reaktionsfluid einem axialen elektrischen Feld ausgesetzt wird, oder in Fällen, in welchen das Reaktionsfluid keine elektrokinetische Strömung trägt, ein Transport durchgeführt wird. Anders gesagt werden die elektrischen Potentiale nur an das Transportfluid enthaltende Segmente angelegt. Die Konzentration des Reaktionsfluids wird eingestellt, indem ein Verdünnungsmittel in das Reagens gemischt wird, bevor es in das Volumen zwischen den Segmentierungsvolumina eingespritzt wird. Auf diese Weise kann eine Reihe von Reagensvolumina, wobei jedes eine andere Konzentration aufweist, erzeugt werden.
Ein anderes bedeutsames Merkmal des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit, eine Reihe von Reaktionsteilchen, so z.B. Kügelchen oder Zellen, in die Reihe von winzigen Volumensegmenten im Haupt-Mikrokanal einzuführen. Mit Bezug nun auf 3 ist eine Anordnung zum Sortieren und Laden einer Vielzahl von Reaktionsteilchen 44 in eine Reihe von Reaktionsvolumina im Mikrokanal 10 dargestellt. Eine Vielzahl von Segmentierungsfluidvolumina 26a, 26b, 26c, 26d und 26e wird in den Haupt-Mikrokanal 10 in beabstandeten Intervallen, wie dies bereits zuvor ausgeführt wurde, hineingezogen. Ein Teilchenspeicher 42 enthält eine Vielzahl von Reaktionsteilchen 44 in einem Suspensionsfluid. Ein Teilchensortierungskanal 46 ist mit dem Auslass des Speichers 42 zum Aufnehmen der Teilchen 44 verbunden. Ein Paar Fokussierungskanäle 48a und 48b ist mit dem Teilchensortierungskanal 44 verbunden. Die Fokussierungskanäle 48a und 48b stellen ein Fokussierungsfluid bereit, um den Strom von Teilchen 44 zu einem Strom mit einer Breite von einem einzigen Teilchen zu verengen. Eine elektrokinetische Fokussierung dieser Art ist in der ebenfalls anhängigen Patentanmeldung Nr. 09/098.178 und dem erteilten US-Patent Nr. 5.858.187 der Erfinder der vorliegenden Erfindung beschrieben, wobei diese hierin durch Verweis aufgenommen sind.
Ein Reaktionsteilchenkanal 50 schneidet den Teilchensortierungskanal 46 an einer Position stromab der Fokussierungskanäle 48a und 48b. An der Schnittstelle des Reaktionsteilchenkanals 50 und des Teilchensortierungskanals 46 werden die erwünschten Reaktionsteilchen 44' von den nicht erwünschten Teilchen 44" getrennt. Ein Potential oder Druck wird auf den Einlass 50a des Kanals 50 angelegt, um die Teilchen 44' in den Kanal 50 und entlang desselben zum Haupt-Mikrokanal 10 zu leiten. Der Reaktionsteilchenkanal 50 weist einen Auslass 56 auf, der mit dem Haupt-Mikrokanal 10 verbunden ist, um die Reaktionsteilchen in den Haupt-Mikrokanal 10 zu leiten. Die nicht erwünschten Teilchen 44" werden entlang eines Teilchenabfallkanals 52, der sich vom Teilchensortierungskanal 46 erstreckt, geleitet.
Die Schritte zum Einführen der Reaktionsteilchen 44' in den Transportstrom sind im Wesentlichen wie folgt: Das Transportfluid und die Segmentierungsfluidvolumina 26a, 26b, 26c, 26d und 26e werden elektrokinetisch durch den Haupt-Mikrokanal 10 gepumpt. Grenzt ein sequentielles Paar von Segmentierungsfluidvolumina 26b und 26c an den Auslass 56 an, so wird das Teilchensuspensionsfluid mit einem einzelnen Teilchen elektrokinetisch in das Volumen zwischen den Segmentierungsfluidvolumina 26b und 26c gepumpt, und das darin enthaltene Transportfluid wird in den Abfallkanal 38 geleitet. In dieser Anordnung ist der Querschnitt des Abfallkanals oder zumindest seines Einlasses so groß, dass ein Hindurchtreten der Teilchen verhindert werden kann. Das Reaktionsteilchen und sein Volumen aus Suspensionsfluid wird daraufhin elektrokinetisch entlang des Haupt-Mikrokanals 10 zum Detektions-/Analysekanal 39 transportiert. Vorzugsweise sind die Reaktionsteilchen zwischen den alternierenden sequentiellen Paaren der Segmentierungsfluidvolumina enthalten. Somit ist, wie in 3 dargestellt, ein erstes Teilchen zwischen den Segmentierungsfluidvolumina 26b und 26c enthalten, während ein zweites Teilchen zwischen den Segmentierungsfluidvolumina 26d und 26e enthalten ist. Eine solche alternierende Sequenzierung ermöglicht, dass die Reaktionsfluidvolumina durch den Haupt-Mikrokanal gepumpt werden, ohne dass die Reaktionsteilchen einem axialen elektrischen Feld ausgesetzt sind. Aus diesem Grund werden die elektrischen Potentiale nur auf die das Transportfluid enthaltenden Segmente angelegt.
Die Fähigkeit, die Fluidströmung und das Mischen eines Reagens mit einem Fluid-Mikrochip genau zu manipulieren, führt selbst zur Untersuchung der enzymatischen Aktivität und Hemmung derselben. Ein Enzymproben-Chip spielt bei der Entwicklung von Medikamenten und der medizinischen Diagnose eine wichtige Rolle. Mit Bezug auf 4 ist eine Anordnung zum Bereitstellen von Enzymproben mit großem Durchsatz dargestellt. Eine Vielzahl von Segmentierungsfluidvolumina 26a, 26b, 26c und 26d wird in den Haupt-Mikrokanal 10 in beabstandeten Intervallen, wie bereits zuvor in dieser Beschreibung erläutert, eingeführt. Ein Enzymkanal 428 weist einen Einlass 430 und einen Auslass auf, der den Haupt-Mikrokanal 10 schneidet, um ein Fluidenzymmaterial 44 in den Haupt-Mikrokanal 10 zu leiten. Ein Abfallkanal 38 ist mit dem Haupt-Mikrokanal 10 an einer im Wesentlichen gegenüber dem Auslass des Enzymkanals 428 befindlichen Position verbunden. Ein Verdünnungskanal 440 ist mit dem Enzymkanal 428 verbunden, so dass ein Verdünnungsmittel in das Enzymmaterial 434 gemischt werden kann. Ein Substratkanal 68 weist einen Einlass und einen Auslass auf, der den Haupt-Mikrokanal 10 stromab des Enzymkanalauslasses schneidet, um ein Fluidsubstratmaterial 70 in den Haupt-Mikrokanal 10 zu leiten. Ein Verdünnungskanal 72 verbindet sich mit dem Substratkanal 68, so dass ein Verdünnungsmittel in das Substratmaterial 70 gemischt werden kann.
Die Schritte zum Einführen von winzigen Volumina des Enzymmaterials 434 in den Haupt-Mikrokanal sind im Wesentlichen dieselben wie jene, die für das Einspritzen der Reagensfluide mit Bezug auf 2 beschrieben wurden. Das Transportfluid und die Segmentierungsfluidvolumina 26a, 26b, 26c und 26d werden durch den Haupt- Mikrokanal 10 gepumpt. Grenzt ein Enzymvolumensegment 434a, das zwischen einem sequentiellen Paar von Segmentierungfluidvolumina 26b und 26c enthalten ist, an den Auslass des Substratkanals 68 an, so wird das Pumpen gestoppt und das Fluid-Substratmaterial 70 wird in das Enzymvolumensegment 434a gepumpt. Das Enzymmaterial und das Substrat werden im Reaktionsvolumen gemischt. Das kombinierte Fluidvolumen wird daraufhin entlang des Haupt-Mikrokanals 10 zu einem Detektions-/Analyse-Kanal 39 transportiert. Die Konzentration des Enzym- und Substratmaterials kann dadurch variiert werden, dass die Menge an gemischtem Verdünnungsmittel in jedem einzelnen variiert wird, wodurch eine Vielzahl verschiedener Enzymproben erzeugt wird, die entlang des Mikrokanals 10 seriell transportiert werden können.
Mittel zum Zugeben eines Inhibitors zum Reaktionsvolumen können ebenfalls vorgesehen sein. In einer Ausführungsform eines solchen Prozesses wird ein Kügelchen-Verschiebungsregister für das Zuführen der Inhibitoren implementiert. In einer solchen Anordnung werden das Enzym, das Substrat und der Inhibitor reagiert, und die Position des Kügelchen, das zu einer positiven Hemmung führt, wird für eine weitere Analyse aufgezeichnet. Eine alternative Anordnung besteht darin, eine Kügelchen-Datenbank in einem Speicher bzw. Reservoir zu vereinigen, von wo aus die Kügelchen zufällig abgegeben werden. Einzelne Kügelchen werden zu einer Position transportiert, an welcher eine Verbindung einem ein Reaktionsvolumen enthaltenden Probenziel zugeführt wird. Das Kügelchen ist in einer Verschiebungsregister-Anordnung in einem Verzeichnis aufgenommen, wie es mit Bezug auf 4 dargestellt und beschrieben ist, aber nur für eine Zeitspanne, die ausreicht, um ein Untersuchungsergebnis zu liefern. Ist das Resultat negativ, wird das Kügelchen in einen allgemeinen Einlagerungsspeicher transferiert, aber wenn eine Hemmung beobachtet wird, wird das Kügelchen im Verschiebungsregister für eine unmittelbar oder später erfolgende Identifizierung der Verbindung, z. B. mittels Eiektrosprüh-Massenspektrometrie, eingelagert.
Die Enzymaktivität des Reaktionsvolumen wird mit einer geeigneten Instrumentenanordnung im Analysekanal 39, der sich in einem geeigneten Abstand stromab des Mikrokanals 10 befindet, analysiert. Die tatsächliche Distanz hängt von der erforderlichen Inkubationszeit des Enzyms, des Substrats und des Inhibitors sowie von der mittleren linearen Geschwindigkeit des Proben-Reaktionsvolumen ab.
In einem Beispiel einer Enzymanalyse unter Verwendung von elektrokinetischem Mischen und des Transports eines Fluid-Mikrochips gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Fluorogen-Substrat (Resorufin-β-D-Galactopyranosid) mit der Enzym-β-Galactosidase gemischt. Die Kinetik der Reaktion wird dadurch erhalten, dass die Fluoreszenz des Hydrolyseprodukts, Resorufin, überwacht wird. Michaelis-Menten-Konstanten werden für die Hydrolysereaktion in Gegenwart und Abwesenheit von Inhibitoren erhalten. Ein zweites Beispiel für eine Enzymanalyse, die im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung implementiert werden kann, ist eine Untersuchung zur Bestimmung der Acetylcholinesterase-Aktivität (AchE-Aktivität). Dies ist eine zwei Schritte umfassende Untersuchung, wobei die AchE Acetylthiocholin zu Thiocholin hydrolisiert, welches dann wiederum mit Coumarinylphenylmaleimid (CPM) reagiert, um einen hochfluoreszierenden Thioether, CPM-Thiocholin, zu erzeugen. Die Fluoreszenz des letzteren Produkts wird überwacht, um die Enzymaktivität zu bestimmen. Die Gegenwart eines Inhibitors reduziert das Fluoreszenzsignal in Bezug auf das Fehlen eines solchen Inhibitors.
In 5 ist eine Anordnung für das Screening mit hohem Durchsatz für Zellproben, umfassend dabei die Zelllebensfähigkeit, dargestellt. Eine Vielzahl von Segmentierungsfluidvolumina 26a–26g wird, wie zuvor ausgeführt, in den Haupt-Mikrokanal 10 in beabstandeten Intervallen vom Zweigkanal 16 eingeführt. Ein Zellkanal 50 schneidet den Haupt-Mikrokanal 10, um die Zellen 44' in den Haupt-Mikrokanal 10 an einer Position stromab des Zweigkanals 16 zu leiten. Die Zellen sind in einem biokompatiblen Puffer suspendiert. Ein Abfallkanal 38 ist mit dem Haupt-Mikrokanal 10 an einer im Wesentlichen dem Auslass des Zellenkanals 50 gegenüberliegenden Position verbunden. Der Querschnitt des Abfallskanals 38 ist kleiner als der minimale Hauptquerschnitt der Zellen 44'. Ein Reagenskanal 28 schneidet den Haupt-Mikrokanal 10 an einer Position stromab des Zellkanals 50. Ein zweiter Abfallkanal 38' ist mit dem Haupt-Mikrokanal 10 an einer im Wesentlichen gegenüber dem Auslass des Reagenskanals 28 befindlichen Position verbunden.
Das Transportfluid und die Segmentierungsfluidvolumina 26a–26g werden durch den Haupt-Mikrokanal 10 gepumpt. Grenzt ein sequentielles Paar von Segmentierungsfluidvolumina 26b und 26c an den Auslass des Zellkanals 50 an, so wird das Suspensionsfluid in das Reaktionsvolumen zwischen den Segmentierungsfluidvolumina 26b und 26c gepumpt, so dass eine einzelne Zelle in das Reaktionsvolumen eingeführt wird. Alternativ dazu kann ein Ensemble von Zellen in ein Reaktionsvolumen eingeführt werden. Gleichzeitig dazu wird das darin enthaltene Transportfluid in den Abfallkanal 38 geleitet. Die Zelle und ihr Volumen an Suspensionsfluid im Reaktionsvolumen werden daraufhin entlang des Haupt-Mikrokanals 10 zum Auslass des Reagenskanals 28 transportiert. Das Reagens 34 wird in das die Zelle enthaltende Reaktionsvolumen gepumpt, wodurch das Zellsuspensionsfluid verdrängt wird. Das Zellsuspensionsfluid wird durch den Abfallkanal 38' weggeleitet. Die Zelle und das Reagens im Reaktionsvolumen werden daraufhin zum Detektions-/Analysekanal 39 transportiert. Dieser Vorgang wird für jede Zelle wiederholt. Vorzugsweise sind die Zellen 44' in Reaktionsvolumina zwischen alternierenden sequentiellen Paaren von Segmentierungsfluidvolumina enthalten, wie dies bereits zuvor beschrieben wurde. Zellproben werden daraufhin als eine Funktion von Zeit, Pumpbedingungen und Medienzusammensetzungen untersucht.
Der extrem niedrige Verbrauch an Reagensmaterialien in Mikrofluid-Chips stellt einen bemerkenswerten Vorteil für das Screenen teurer Reagens- und Inhibitormaterialien und ihrer Substratmaterialien bereit. Peptid-Datenbanken für solche Versuche können herkömmlich auf Kügelchen mit einem Durchmesser von 10 bis 100 Mikronen oder größer mit lotrechten lösbaren Linkern synthetisiert werden. In 6 ist eine Grundanordnung für das Implementieren eines Verfahrens zum Screenen von Kügelchen auf einem Fluid-Mikrochip gemäß der vorliegenden Erfindung dargestellt. Ein Paar Mikrokanäle 10 und 610 sind beabstandet und parallel zueinander angeordnet. Ein Pufferspeicher 80 ist mit dem Mikrokanal 610 durch einen Abfallkanal 86 verbunden. Ein Abfallreservoir 84 ist mit dem Mikrokanal 10 über einen Abfallkanal 86 verbunden. Ein Transferkanal 88 verbindet den Mikrokanal 610 mit dem Mikrokanal 10 an einer im Wesentlichen mit dem Pufferkanal 82 und dem Abfallkanal 86 fluchtend ausgerichteten Position.
Eine Reihe von Reaktionsvolumina werden zwischen den Segmentierungsfluidvolumina 26a–26d im Mikrokanal 10 gebildet, und eine entsprechende Reihe von Reaktionsvolumina wird zwischen den Segmentierungsfluidvolumina 626a–626d im Mikrokanal 610 gebildet. Die Reaktionsvolumina in jedem Mikrokanal werden entlang der jeweiligen Mikrokanäle transportiert, so dass die Reaktionsvolumina b_i–1, b_i und b_i+1 im Mikrokanal 610 synchron mit den Reaktionsvolumina c_j–1, c_j und c_j+1 in Mikrokanal 10 gehalten werden. Die Kügelchen 44a, 44b und 44c werden in die Reaktionsvoluminab_i–1, b_i bzw. b_i+1 in einer ähnlichen Weise, wie dies zuvor mit Bezug auf 3 ausgeführt wurde, eingeführt. Die Enzymvolumina 36a, 36b und 36c werden in einer ähnlichen Weise, wie dies zuvor mit Bezug auf die 2 beschrieben wurde, in die Reaktionsvolumina c_j–1, c_j bzw. c_j+1 eingeführt.
Wenn jedes Kügelchen am Transferkanal 88 ankommt, wird seine Verbindung vom Kügelchen freigesetzt und zum entsprechenden Reaktionsvolumen transferiert. Das Kügelchen und seine zugeordneten Reaktionsvolumina werden daraufhin in Übereinstimmung zu einer Stelle stromab verschoben, wo ein Fluorogen-Substrat dem Reaktionsvolumen (c_j–1, c_j und c_j+1) für eine Fluoreszenzanalyse zugesetzt wird. Ein Kügelchen, das einem Reaktionsvolumen entspricht, das Hemmung zeigt, kann aussortiert und zu einer Stelle transportiert werden, an welcher eine zweite Freisetzung der Verbindung durch ein orthogonales Spaltungsverfahren verursacht wird. Diese Verbindung kann mittels Elektrosprüh-Ionisierungsmassenspektrometrie analysiert werden, um ihre chemische Struktur zu bestimmen.
Die Verwendung jedes der zuvor beschriebenen Verfahren mit implementiertem Fluidic-Mikrochip ergibt eine erweiterte Reihe von diskreten Proben, Zellen, Kügelchen etc., die in einem Mikrokanal transportiert werden. Die beteiligten Reaktionsvolumina sind vorzugsweise Nanoliter- oder Subnanoliter-Volumina, wodurch sich zahlreiche verschiedene Verbindungen, Proben, Zellen, Kügelchen etc. ergeben. Es ist auch beabsichtigt, dass größere Volumina verwendet werden können. Da jedes Reaktionsvolumen diskret ist, kann seine Position identifiziert und nachverfolgt werden, wenn es durch den Mikrokanal wandert, analog einer Reihe von elektronischen Bits, die sich durch ein digitales Schieberegister bewegen. In 7 ist eine Anordnung zum Archivieren und Entnehmen zahlreicher Reaktionsvolumina dargestellt, die Reagenzien, Zellen, Kombidatenbank-Kügelchen etc. enthalten. Ein Mikrokanal 10 ist mit einer Quelle eines Transportfluids durch einen Transportfluidkanal 60 verbunden. Wie zuvor beschrieben, ist ein Segmentierungsfluid dem Mikrokanal 10 durch einen Zweigkanal 16 bereitgestellt. Reagenzien, Zellen oder Kügelchen werden in die Reaktionsvolumina im Mikrokanal 10 durch den Reagenskanal 28 eingeführt. Ein Abfallkanal 38 ist mit dem Mikrokanal 10 verbunden, um das Transportfluid vom Reaktionsvolumen wegzuleiten.
Der Mikrokanal 10 erstreckt sich in eine Richtung, um eine Vielzahl von Schleifen 64a, 64b und 64c zu bilden, und endet in einem Speicher 62a. Der Mikrokanal 10 erstreckt sich in eine entgegengesetzte Richtung, um eine zweite Vielzahl von Schleifen 66a, 66b und 66c zu bilden, und endet in einem Speicher 62b. In einem ersten Betriebsmodus werden die zwischen den Segmentierungsfluidvolumina gebildeten Reaktionsvolumina vorgeschoben, indem sie schrittweise in die durch durchgehende Pfeile dargestellte Richtung und durch Schleifen 64a, 64b und 64c zum Archivieren transportiert werden. In einem zweiten Betriebsmodus werden die Reaktionsvolumina entnommen, indem sie schrittweise in die durch strichliierte Pfeile dargestellte Richtung transportiert werden. Die kombinierte Länge der Schleifen 66a, 66b und 66c ist ähnlich lang wie die kombinierte Länge der Schleifen 64a, 64b und 64c, so dass die gesamte Reihe von in den Schleifen 64a, 64b und 64c archivierten Reaktionsvolumina für eine spätere Analyse entnommen werden können.
Obwohl dies in 7 nicht dargestellt ist, würde die elektronische Konfiguration, die für die Implementierung der Archivierungs-/Entnahmevorrichtung für das Verfahren 1 erforderlich ist, so aussehen, dass sie den Transport der Reaktionsvolumina in zwei Richtungen ermöglicht. Vorzugsweise treten die Elektroden oder Kontakte von jeder der vier Seiten der Schleifen ein. Die Elektrodengeometrie ist so gewählt, dass ein adäquater Kontakt mit den Mikrokanal-Schleifen in einer geeigneten räumlichen Periodizität bereitgestellt wird. Mit einer solchen Konfiguration können Materialien seriell in das Register geladen werden, um unmittelbar im Anschluss daran oder später analysiert zu werden. Die Materialien können den Reagens- oder Probenstellen zugeführt werden, wenn die Reaktionsvolumina zwischen den Mikrokanalschleifen hin- und hergeschoben werden.
Die Anzahl an Reaktionsvolumina, die in der durch die Schleifen 64a, 64b und 64c definierten Lagerungsbank gehalten werden können, kann unter Verwendung der nachfolgenden Gleichung 1 geschätzt werden.
L_S ist die Länge einer Seite der äußersten Schleife, L_R ist die Länge des Reaktionsvolumens, L_I ist die Länge des Isolierungssegments, L_C ist der Abstand von Mittelpunkt zu Mittelpunkt zwischen den angrenzenden Kanälen in den Schleifen, und n ist die Anzahl der Schleifen. Wenn z.B. L_S=100 mm, L_R+L_I =1 mm, L_C=0,1 mm und n=100, dann können etwa 19010 Reaktionsvolumina (N) in den Schieberegister-Einlagerungsschleifen eingelagert werden. Eine solche Vorrichtung nimmt nur etwa 10 % der Fläche eines 100 mm × 100 mm großen quadratischen Mikrochip-Substrats ein. Obwohl die hierin beschriebene bevorzugte Anordnung eine oder mehrere Schleifen umfasst, um den Einlagerungskanal zu bilden, ist für Fachleute auf dem Gebiet der Technik klar ersichtlich, dass auch andere Konfigurationen verwendet werden können. So ist einen Serpentinenanordnung z.B. ebenfalls wirksam.
Solche Schieberegistereinlagerungs-/Entnahmevorrichtungen sind für die Handhabung kombinierter Kügelchen-Datenbanken, wie zuvor mit Bezug auf die 5 und 6 beschrieben, sehr vorteilhaft. Kügelchen aus einer Split-Synthese könnten kollektiv in einen Speicher eingelagert und unter Einsatz der Kügelchen-Sortierfähigkeiten auf dem Chip im Einlagerungsregister abgegeben werden. Verbindungen können, je nach Bedarf, teilweise photolytisch aus den Kügelchen freigegeben werden, oder sie können in die Inhalte des Reaktionsvolumen vorher freigesetzt werden. Die Kügelchen-Datenbank kann durch die Aufnahme einer Elektrosprühonisierungsstation auf dem Mikrochip für die massenspektrometrische Identifizierung der Reaktionsverbindungen zertifiziert sein. Die Kügelchen können auch an eine Stelle gebracht werden, an welcher die Verbindung zu einem getrennten Reaktionsvolumen zugeführt wird, um eine biologische Untersuchung, wie zuvor mit Bezug auf die 6 beschrieben, durchzuführen.
Mit Bezug nun auf 8 ist ein System 800 zum Identifizieren neuer Medikamente dargestellt. Ein Synthesemodul 810 zum Synthetisieren einer Reihe von möglicherweise nützlichen Medikamentenverbindungen ist mit einem Haupt-Mikrokanal 812 durch eine Vielzahl von Einführungskanälen verbunden. Jede der synthetisierten Verbindungen wird in ein Transportvolumen eingeführt und entlang des Mikrokanals 812 auf die hierin zuvor ausgeführte Weise transportiert. Ein Zertifizierungsmodul 814 ist zum Analysieren und Zertifizieren der Molekularstruktur der synthetisierten Verbindungen bereitgestellt. Das Zertifizierungsmodul ist mit dem Mikrokanal 812 durch eine zweite Vielzahl von Kanälen verbunden, um Proben der synthetisierten Verbindungen zu erhalten. Ein Analysemodul 818 zum Durchführen von Screening-Untersuchungen auf der Reihe von synthetisierten Verbindungen gegen Molekül- oder Zellziele ist ebenfalls bereitgestellt. Das Screening-Modul 818 ist mit dem Mikrokanal 812 durch eine dritte Vielzahl von Kanälen verbunden, um so die Proben der synthetisierten Medikamentenverbindungen zu erhalten. Die Zielmoleküle oder -zellen sind seriell in den Zieleinlagerungsmodulen 820, 821 eingelagert. Ein zweiter Mikrokanal 822 ist zwischen den Zieleinlagerungsmodulen angeordnet, um die Ziele zum Screening-Modul 818 zu transportieren.
Die Reihe von Medikamentenverbindungen wird entlang des Mikrokanals zu den Einlagerungsmodulen 816, 817 transportiert, um später entnommen zu werden. Dieses Merkmal ermöglicht, dass die Medikamentenverbindungen zu einem Zeitpunkt, der wesentlich später ist als der Zeitpunkt der Synthese, analysiert und/oder gescreent werden. Die Ergebnisse der mit dem Screening-Modul 818 durchgeführten Screenings werden einem Entscheidungsmodul 824 bereitgestellt, das die Wirksamkeit der synthetisierten Verbindungen evaluieren und dem Synthesemodul 810 Feedback liefern kann, um neue und verschiedene Verbindungen auf der Basis der früheren Ergebnisse zu synthetisieren. Auf diese Weise kann eine Vielfalt an neuen Medikamentenverbindungen schnell und automatisch auf einem einzelnen Mikrochip synthetisiert, zertifiziert und gescreent werden.
Hinsichtlich der vorangegangenen Beschreibungen und begleitenden Zeichnungen ist für Fachleute auf dem Gebiet der Technik klar ersichtlich, dass das Verfahren und die Vorrichtung gemäß dieser Erfindung dazu in der Lage sind, eine große Reihe von biochemischen Analyseproblemen zu lösen, die von den präzisen und automatisierten Manipulationen im Nanoliter- und Subnanoliter-Maßstab mit hoher serieller Durchsatzkapazität profitieren. Die hierin beschriebene Vorrichtung und das Verfahren dienen selbst auch der multiplen parallelen Expansion, die für die Erzeugung von chemischer und biochemischer Information einen höheren Durchsatz liefert. Die beschriebenen Tulikrokanalvorrichtungen können biochemische Reaktionsvolumina in einer kontrollierten Weise manipulieren, um somit schnelle Ergebnisse bereitzustellen, d.h. Raten von zumindest etwa 1 bis 10 Hz pro Kanal, wobei Raten von bis zu 100 Hz oder 1.000 Hz erreichbar sein können. Die verwendeten Reaktionsvolumina können Molekül- oder Teilchenspezies ohne Diffusions-Verluste enthalten.
Die in der vorangegangenen Beschreibung verwendeten Termini und Ausdrücke dienen der Beschreibung und nicht der Einschränkung. Durch die Verwendung dieser Termini und Ausdrücke ist keineswegs beabsichtigt, jegliche Äquivalente der dargestellten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon auszuschließen. Es ist jedoch zu erkennen, dass verschiedene Modifikationen wie Kanaldimension, Position und Anordnung innerhalb des beanspruchten Schutzumfanges der Erfindung möglich sind.

Claims

Verfahren zur Bildung und zum Transport einer Reihe von winzigen Volumensegmenten eines Materials in einem Mikrokanal, umfassend die Schritte: a. des Bereitstellens eines ersten Kanals (10) mit einem Einlassende (12), das mit einer Quelle des Transportfluids verbunden ist, und einem mit einem Fluidspeicher verbundenen Austrittsende (14); b. des Bereitstellens eines zweiten Kanals (16) mit einem Einlassende (18), das mit einer Quelle eines Segmentierungsfluids verbunden ist, und einem mit dem ersten Kanal verbundenen Austrittsende (20); c. des Hineinziehens eines Volumens des Segmentierungsfluids (22) in den ersten Kanal; d. des Transportierens des Volumens des Segmentierungsfluids im ersten Kanal hin zum Fluidspeicher; und dann e. des Wiederholens der Schritte c. und d. zur Bildung einer Reihe einzelner Volumina des Segmentierungsfluids; dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt des Hineinziehens des Volumens des Segmentierungsfluids in den ersten Kanal folgende Schritte umfasst: a. Bereitstellen eines ersten (e1), zweiten (e2) und dritten (e3) elektrischen Kontakts im ersten Kanal an einer Stelle zwischen den Austrittsenden des ersten Kanals und des zweiten Kanals; b. Bereitstellen eines vierten (e5), fünften (e6) und sechsten (e7) elektrischen Kontakts im ersten Kanal an einer Stelle zwischen dem Einlassende des ersten Kanals und dem Austrittsende des zweiten Kanals; und c. Anlegen eines ersten elektrischen Potentials (24a) an dem ersten und zweiten elektrischen Kontakt und eines zweiten Potentials (24b) an dem vierten und fünften elektrischen Kontakt, wobei das erste und das zweite elektrische Potential eine Höhe und Polarität aufweist, die zum Hervorrufen einer Strömung des Trans portfluids im ersten Kanal wirksam ist, um das Segmentierungsfluid in den ersten Kanal zu ziehen.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Schritte: a. des Senkens der Höhe des zweiten elektrischen Potentials am vierten und fünften elektrischen Kontakt; und b. des Aufrechterhaltens der Höhe und der Polarität des ersten elektrischen Potentials am ersten und zweiten elektrischen Kontakt, bis das gewünschte Volumen des Segmentierungsfluids in den ersten Kanal hineingezogen worden ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin der Schritt des Transportierens des Volumens des Segmentierungsfluids im ersten Kanal folgende Schritte umfasst: a. Anlegen eines dritten elektrischen Potentials (24c) am fünften und sechsten elektrischen Kontakt, während das erste elektrische Potential an dem ersten und zweiten elektrischen aufrechterhalten wird, bis das Volumen des Segmentierungsfluids den ersten elektrischen Kontakt erreicht; und dann b. Anlegen eines vierten elektrischen Potentials an dem zweiten und dritten elektrischen Kontakt, wodurch das Volumen des Segmentierungsfluids zum zweiten elektrischen Kontakt hin transportiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend den Schritt des Einspritzens eines Volumens eines Reagens (34, 434) in den ersten Kanal zwischen einem aufeinander-folgenden Paar an Volumina des Segmentierungsfluids.
Verfahren nach Anspruch 4, worin der Schritt des Einspritzens des Reagens folgende Schritte umfasst: a. Bereitstellen eines dritten Kanals (28, 428) mit einem mit einer Quelle eines Reagens verbundenen Einlassende (30, 430) und einem mit dem ersten Kanal verbundenen Austrittsende (32); b. Bereitstellen eines vierten Kanals (38) mit einem mit dem ersten Kanal verbundenen Einlassende; und c. Anlegen eines elektrischen Potentials zwischen dem dritten Kanal und dem vierten Kanal, um herbeizuführen, dass das Volumen des Reagens in den ersten Kanal fließt und das Transportfluid in den vierten Kanal fließt.
Verfahren nach Anspruch 4, umfassend den Schritt des Verdünnens der Konzentration des Reagens, bevor dieses in den ersten Kanal eingespritzt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, umfassend den Schritt des Wiederholens der Einspritzung des Reagens in den ersten Kanal, sodass eine Vielzahl an Volumina (36a, 36b) des Reagens zwischen nicht aneinander liegenden, aber aufeinander folgenden Paaren an Volumina (26b, 26c; 26d, 26e) des Segmentierungsfluids injiziert werden.
Verfahren nach Anspruch 7, umfassend den Schritt des Transportierens der Vielzahl an eingespritzten Reagensvolumina den ersten Kanal entlang hin zum Fluidspeicher.
Verfahren nach Anspruch 8, umfassend den Schritt des sequentiellen Einlagerns der Vielzahl an eingespritzten Reagensvolumina, sodass ein ausgewähltes Reagensvolumen zur Analyse erhalten werden kann.
Verfahren nach Anspruch 9, umfassend den Schritt des Erhaltens des ausgewählten Reagensvolumens aus dem Lager.
Verfahren nach Anspruch 1, umfassend den Schritt des Einführens eines Reaktionsteilchens (44) in den ersten Kanal zwischen ein aufeinander folgendes Paar an Volumina des Segmentierungsfluids.
Verfahren nach Anspruch 11, umfassend den Schritt des Wiederholens des Einführens des Reaktionsteilchens in den ersten Kanal, sodass eine Vielzahl an Reaktionsteilchen zwischen nicht aneinander liegenden, aber aufeinander folgenden Paaren an Volumina (26b, 26c; 26d, 26e) des Segmentierungsfluids eingeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 11, umfassend den Schritt des Transportierens der Vielzahl an Reaktionsteilchen den ersten Kanal entlang hin zum Fluidspeicher.
Verfahren nach Anspruch 13, umfassend den Schritt des sequentiellen Einlagerns der Vielzahl an eingeführten Reaktionsteilchen, sodass ein ausgewähltes Reaktionsteilchen zur Analyse erhalten werden kann.
Verfahren nach Anspruch 14, umfassend den Schritt des Erhaltens des ausgewählten Reaktionsteilchens aus dem Lager.
Vorrichtung zur Bildung und zum Transport einer Reihe von winzigen Volumensegmenten eines Materials, umfassend: ein Substrat mit einem in diesem ausgebildeten ersten (10) und zweiten (16) Mikrokanal, wobei der erste Mikrokanal ein Einlassende (12), das mit einer Quelle eines Transportfluids verbunden ist, und ein mit einem Fluidspeicher verbundenes Austrittsende (14) aufweist, und der zweite Mikrokanal (16) ein Einlassende (18), das mit einer Quelle des Segmentierungsfluids verbunden ist, und ein mit dem ersten Mikrokanal verbundenes Austrittsende (20) aufweist; - dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zudem umfasst: einen ersten (e1), zweiten (e2) und dritten (e3) elektrischen Kontakt, die im ersten Mikrokanal an einer Stelle zwischen dem Austrittsende des ersten Mikrokanals und dem zweiten Mikrokanal angeordnet sind; einen vierten (e5), fünften (e6) und sechsten (e7) elektrischen Kontakt, die im ersten Mikrokanal an einer Stelle zwischen dem Einlassende des ersten Mikrokanals und dem zweiten Mikrokanal angeordnet sind; Mittel zum sequentiellen Anlegen von elektrischen Potentialen an den nebeneinander liegenden Paaren an elektrischen Kontakten, um (i) ein Volumen des Seg mentierungsfluids in den ersten Mikrokanal zu ziehen, (ii) das Hineinziehen des Segmentierungsfluidvolumens in den ersten Mikrokanal zu beenden und dann (iii) die Volumina des Segmentierungsfluids im ersten Mikrokanal hin zum Fluidspeicher zu transportieren.
Vorrichtung nach Anspruch 16, umfassend: einen dritten Kanal (28, 428) mit einem mit einer Quelle eines Reagens verbundenen Einlassende (30, 430) und einem mit dem ersten Kanal verbundenen Austrittsende (32); einen vierten Kanal (38) mit einem mit dem ersten Kanal verbundenen Einlassende; und Mittel zum Einspritzen eines Reagensvolumens zwischen ein Paar an aufeinander folgenden Volumina des Segmentierungsfluids im ersten Kanal, sodass das zwischen dem Paar an aufeinander folgenden Volumina des Segmentierungsfluids liegende Transportfluid veranlasst wird, in den vierten Kanal zu fließen.
Vorrichtung nach Anspruch 17, umfassend Mittel zum Anlegen eines elektrischen Potentials zwischen dem dritten Kanal und dem vierten Kanal zur Einspritzung des Reagensvolumens.
Vorrichtung nach Anspruch 17, umfassend Mittel zur Verdünnung des Reagens, wenn dieses in den ersten Kanal eingespritzt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 18, umfassend Mittel zum Variieren der Verdünnung des Reagens, um eine Reihe von Volumina an verdünnten Reagenzien mit unterschiedlichen Konzentrationen bereitzustellen, und Mittel zur Einspritzung eines jeden der Volumina in alternierende Paare an Segmentierungsfluidvolumina im ersten Kanal.
Vorrichtung nach Anspruch 17, umfassend: zusätzliche, entlang dem ersten Kanal und zwischen dem dritten Kanal und dem Fluidspeicher angeordnete elektrische Kontakte; und Mittel zum Anlegen elektrischer Potentiale zwischen den jeweiligen Paaren an zusätzlichen elektrischen Kontakten zum Transport des Reaktionsvolumens den ersten Kanal entlang hin zum Fluidspeicher.
Vorrichtung nach Anspruch 17, worin der erste Kanal eine Schleife (64a, b, c) zum Halten einer Vielzahl der verdünnten Reagensvolumina aufweist, die sich zwischen alternierenden Paaren an Segmentierungsfluidvolumina befinden.
Vorrichtung nach Anspruch 16, umfassend: einen dritten Kanal (50) mit einem mit einer Quelle der Reaktionsteilchen (44), die in einem Fluidmedium suspendiert sind, verbundenen Einlassende (50a) und einem mit dem ersten Kanal verbundenen Austrittsende; einen vierten Kanal (38) mit einem mit dem ersten Kanal verbundenen Einlassende; und Mittel zum Einspritzen eines im Fluidmedium suspendierten Reaktionsteilchens zwischen ein Paar an aufeinander folgenden Volumina des Segmentierungsfluids im ersten Kanal, sodass das zwischen dem Paar an aufeinander folgenden Volumina des Segmentierungsfluids angeordneten Transportfluid veranlasst wird, in den vierten Kanal zu fließen.
Vorrichtung nach Anspruch 23, umfassend Mittel zum Anlegen eines elektrischen Potentials zwischen dem dritten Kanal und dem vierten Kanal, um zu veranlassen, dass ein Volumen des das Reaktionteilchen beinhaltenden Fluidmediums in den ersten Kanal fließt und das Transportfluid in den vierten Kanal fließt.
Vorrichtung nach Anspruch 23, umfassend Mittel zum Sortieren der Reaktionsteilchen auf Grundlage eines Merkmals oder einer Eigenschaft des Reaktionsteilchens und Mittel zum Einspritzen einzelner Reaktionsteilchen zwischen ein Paar an aufeinander folgenden Volumina des Segmentierungsfluids im ersten Kanal.
Vorrichtung nach Anspruch 25, umfassend Mittel zum Steuern der Einspritzung eines jeden Reaktionsteilchens, sodass die Reaktionsteilchen zwischen al ternierende Paare an Segmentierungsfluidvolumina im ersten Kanal eingeführt werden.
Vorrichtung nach Anspruch 25, umfassend: zusätzliche, entlang dem ersten Kanal und zwischen dem dritten Kanal und dem Fluidspeicher angeordnete elektrische Kontakte; und Mittel zum Anlegen elektrischer Potentiale zwischen den jeweiligen Paaren an zusätzlichen elektrischen Kontakten zum Transport des Segmentierungsfluidvolumens den ersten Kanal entlang hin zum Fluidspeicher.
Vorrichtung nach Anspruch 25, worin der erste Kanal eine Schleife (64a, b, c) zum Halten einer Vielzahl an Reaktionsteilchen aufweist, die sich zwischen alternierenden Paaren an Segmentierungsfluidvolumen befinden.