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Diese
Erfindung betrifft die Mikrofluidtechnologie, und insbesondere betrifft
sie Mikrokanalvorrichtungen, bei denen Fluide zumindest teilweise durch
Anlegen elektrischer Felder manipuliert werden.
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Elektrophorese
wurde zu einem unabdingbaren Werkzeug in der Biotechnologie und
anderen Industrien, und sie wird bei einer Vielzahl von Anwendungen
umfangreich verwendet, einschließlich der Trennung, Identifizierung
und Präparierung
reiner Proben von Nukleinsäuren,
Proteinen, Kohlenwasserstoffen, der Identifizierung eines speziellen
Analyten in einem komplexen Gemisch und dergleichen. Von zunehmendem
Interesse auf dem erweiterten Gebiet der Elektrophorese ist Kapillarelektrophorese (CE),
bei der spezielle Einheiten und Spezies durch ein Medium in einer
Elektrophoresekammer von Kapillarabmessungen unter dem Einfluss
eines angelegten elektrischen Felds bewegt werden. Zu Vorteilen
von CE gehören
kurze Laufzeiten, hohe Trenneffizienz, kleine Probenvolumina usw.
Obwohl CE ursprünglich
in Kapillarröhrchen
ausgeführt
wurde, ist die Vorgehensweise von zunehmendem Interesse, Mikrokanäle oder
Mikrogräben
mit Kapillarabmessung auf einem ebenen Substrat zu verwenden, was als
Mikrokanalelektrophorese (MCE) bekannt ist. CE und MCE finden zunehmende
Verwendung bei einer Anzahl verschiedener Anwendungen sowohl in
der Grundlagenforschung als auch bei Industrieprozessen, einschließlich analytischen,
biomedizinischen, pharmazeutischen, Umwelt-Molekular-biologischen, Nahrungsmittel-
und klinischen Anwendungen.
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Trotz
der vielen Vorteile von CE und MCE ist der mögliche Nutzen dieser Techniken
aus verschiedenen Gründen
noch nicht vollständig
realisiert. Wegen der Art der bei CE und MCE verwendeten Elektrophoresekammern
sind bei Proben mit Analytkonzentrationen von unter ungefähr 10-6 M im Allgemeinen keine guten Ergebnisse
erzielbar. Diese untere Erkennungsgrenze betreffend die Analytkonzentration
hat die möglichen
Anwendungen von CE und MCE deutlich eingeschränkt. Beispielsweise fanden CE
und MCE bei klinischen Anwendungen keine breite Anwendung, bei denen
häufig
ein interessierender Analyt mit einer Kon zentration von Femtomol
bis Nanomol in einer komplexen Probe, wie Blut oder Urin, vorhanden
ist.
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Um
die Erkennungsgrenzen von CE zu verbessern, wurden verschiedene
Techniken entwickelt, einschließlich
verbesserter Probeninjizierprozeduren, wie Analytschichtung (Beckers
% Ackermans, "The
Effect of Sample Stacking for High Performance Capillary Electrophoresis", J. Chromatogr.
(1993) 629: 371–378),
Feldverstärkung
(Chien & Burgi, "Field Amplified Sample
Injection in High-Performance
Capillary Electrophoresis",
J. Chromatogr. (1991) 559: 141–152)
und transiente Isotachophorese (Stegehuis et al., "Isotachophoresis
as an On-Line Concentration
Pretreatment Technique in Capillary Electrophoresis", J. Chromatogr.
(1991) 538: 393–402),
wie auch verbesserte Probenerkennungsprozeduren und "Off-line"-Probenpräparationsprozeduren.
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Eine
andere Technik, die dazu entwickelt wurde, die bei CE erzielbare
Erfassungsgrenze zu verbessern, bestand darin, eine Analytvorkonzentriervorrichtung
zu verwenden, die direkt stromaufwärts gegenüber der Kapillare positioniert
ist, d. h. in "On-line"- oder "Einzelströmungspfad"-Beziehung. So wie
hier verwendet, sollen die Begriffe "on-line" und "Einzelströmungspfad" die Beziehung kennzeichnen, bei der
das gesamte in eine Analytvorkonzentrierkomponente eingeleitete
Fluid, d. h. die angereicherte Fraktion und die Restabfallfraktion
des ursprünglichen
Probenvolumens, notwendigerweise durch den Elektrophorese-Hauptabschnitt
der Vorrichtung fließen,
d. h. das Kapillarröhrchen
mit dem Trennmedium. Ein Überblick über die
verschiedenen verwendeten Konfigurationen ist von Tomlinson et al. in "Enhancement of Concentration
Limits of Detection in CE and CE-MS: A Review of On-Line Sample Extraction,
Cleanup, Analyte Preconcentration, and Microreactor Technology", J. Cap. Elec. (1995)
2: 247–266,
und den dort vorhandenen Figuren angegeben.
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Obwohl
diese letztere Vorgehensweise für verbesserte
Ergebnisse hinsichtlich der Analyterfassungsgrenzen sorgen kann,
insbesondere hinsichtlich der Konzentrationsgrenze bei der Erfassung, kann
sie einen schädlichen
Einfluss auf andere Aspekte bei CE haben und dadurch die erzielbare
Gesamtfunktion schmälern.
Beispielsweise können Analytpeakbreiten
bei On-line- oder Einzelströmungspfadvorrichtungen
mit Analytvorkonzentratoren breiter sein.
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Demgemäß besteht
andauerndes Interesse an der Entwicklung verbesserter CE-Vorrichtungen, die
bei Proben mit niedrigen Analytkonzentrationen, insbesondere solchen
im Femtomol- und Nanomolbereich, gute Ergebnisse liefern können.
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MCE-Vorrichtungen
sind in
US 5,126,022 ;
US 5,296,114 ,
US 5,180,480 ;
US 5,132,012 und
US 4,908,112 offenbart. Zu anderen
Literaturstellen, die MCE-Vorrichtungen beschreiben, gehören Harrison et
al., "Micromachining
a Miniaturized Capillary Electrophoresis-Based Chemical Analysis
System on a Chip",
Science (1992) 261: 895; Jacobson et al., "Precolumn Reactions with Electrophoretic
Analysis Integrated on a Microchip", Anal. Chem. (1994) 66: 2949; Effenhauser
et al., "High-Speed
Separation of Antisense Oligonucleotides on a Micromachined Capillary
Electrophoresis Device",
Anal. Chem. (1994) 66: 2949; und Woolley & Mathies, "Ultra-High-Speed DNA Fragment Separations
Using Capillary Array Electrophoresis Chips", P:N.A.S. USA (1994) 91: 11348.
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Zu
Patenten, die Vorrichtungen und Verfahren zur Analytvorkonzentrierung
in einer Probe auf "On-line"-Weise vor CE offenbaren,
gehören
US 5,202,010 ,;
US 5,246,577 und
US 5,340,452 . Ein Überblick über verschiedene Verfahren
der bei CE verwendeten Analytvorkonzentrierung ist von Tomlinson
et al., in "Enhancement
of Concentration Limits of Detection in CE and ME-MS: A Review of
On-Line Sample Extraction,
Cleanup, Analyte Preconcentration, and Microreactor Technology", J. Cap. Elec. (1995)
2: 247–266
angegeben.
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Die
internationale Patentanmeldung WO96/04547 offenbart eine Vorrichtung
und ein Verfahren zum Ausführen
von Mikrofluidmanipulationen zur chemischen Analyse oder Synthese.
Mikrofluidkanäle
werden unter Verwendung von Standardphotolithographieprozeduren
und chemischem Nassätzen
auf einem Mikrochip ausgebildet. Dann wird unter Verwendung eines
Direktbondvorgangs eine Deckplatte mit dem Mikrochip verbunden.
In den Mikrokanälen
können
Elektrophorese und Elektrochromatographie ausgeführt werden. Beispielsweise
können
Analyte durch elektrokinetisches Pumpen derselben durch eine Kreuzungsstelle
in eine Vierwegekreuzung von Kanälen
gefüllt
werden, gefolgt von einem Schalten von Potentialen, um einen Analytpfropfen
in einen Trennkanal zu drücken.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Es
sind integrierte Elektrophorese-Mikrovorrichtungen mit mindestens
einem Anreichungskanal und einem Elektrophorese-Hauptströmungspfad
sowie Verfahren zur Verwendung bei Elektrophoreseanwendungen geschaffen.
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Gemäß einer
ersten Erscheinungsform ist eine Mikrofluidvorrichtung zum Analysieren
einer Probe mit einem Analytanteil und einem Abfallanteil geschaffen,
wobei diese Mikrofluidvorrichtung ein Substrat mit einer Oberfläche sowie
ferner Folgendes aufweist:
eine mikrofluidische Vorrichtung
zum Analysieren einer einen Analytanteil und einen Abfallanteil
aufweisenden Probe, mit einem eine Oberfläche aufweisenden Substrat sowie
ferner:
mindestens einem Mikrokanal,
einem Einlass in
Fluidverbindung mit dem mindestens einen Mikrokanal zur Zuführung der
Probe an diesen,
einer Anreicherungseinrichtung in dem mindestens einen
Mikrokanal zum Trennen mindestens eines Teils des Analytanteils
von dem Abfallanteil,
einem Erfassungsbereich, der in dem mindestens
einen Mikrokanal stromabwärts
von der Anreicherungseinrichtung angeordnet und für den Detektor zum
Analysieren eines charakteristischen Merkmals der Probe zugänglich ist,
einem
Abfallauslass in Fluidverbindung mit dem mindestens einen Mikrokanal,
einer
Transporteinrichtung zum Bewegen der Probe von dem Einlass zu der
Anreicherungseinrichtung und des Abfallanteils von der Anreicherungseinrichtung
zu dem Abfallauslass, und
mindestens einer ersten und einer
in Abstand davon angeordneten zweiten Elektrode zur Herstellung
von elektrischem Kontakt mit einer in der mikrofluidischen Vorrichtung
vorhandenen Probe, um den Analytanteil mittels Elektrophorese von
der Anreicherungseinrichtung zu dem Erfassungsbereich zu bewegen,
dadurch
gekennzeichnet, dass der Abfallauslass stromaufwärts von dem Erfassungsbereich
angeordnet ist und die Anreicherungseinrichtung ein Material aufweist,
das ein selektives Zurückhalten
des Analytanteils der Probe gestattet, so dass der besagte Teil des
Analytanteils, nicht jedoch der Abfallanteil, zu dem Erfassungsbereich
bewegbar ist, um eine genaue Analyse des Teils des Analytanteils
in dem Erfassungsteil durch den Detektor zu ermöglichen.
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Gemäß einer
zweiten Erscheinungsform ist durch die Erfindung zum Analysieren
einer Substanz mit einem ersten und einem zweiten Anteil unter Verwendung
eines Substrats mit einer Oberfläche
und mindestens einem mit einem Anreicherungsbereich und einem stromabwärts in Bezug
auf diesen positionierten Erfassungsbereich versehenen Mikrokanal geschaffen,
das die folgenden Schritte aufweist:
die Substanz wird über einen
mit dem Mikrokanal in Fluidverbindung stehenden Einlass in den Mikrokanal
eingeleitet,
in dem Anreicherungsbereich wird mindestens ein Teil
des ersten Anteils von dem zweiten Anteil getrennt, wobei der zweite
Anteil den Erfassungsbereich nicht durchläuft,
der zweite Anteil
der Substanz wird über
einen mit dem Anreicherungsbereich in Fluidverbindung stehenden
Abfallauslass abgegeben, und
der besagte Teil des ersten Anteils
wird durch Elektrophorese zu dem Erfassungsbereich transportiert,
dadurch
gekennzeichnet, dass
(a) der Abfallauslass stromaufwärts von
dem Erfassungsbereich angeordnet wird,
(b) der Anreicherungsbereich
ein Anreicherungsmedium mit einem Material enthält, das ein selektives Zurückhalten
des ersten Anteils der Substanz gestattet, und
(c) zum Transport
durch Elektrophorese der von dem Anreicherungsmedium zurückgehaltene
Teil des ersten Anteils zu dem Erfassungsbereich transportiert wird,
wobei der besagte Teil des ersten Anteils, nicht aber der zweite
Anteil, zu dem Erfassungsbereich bewegt wird, um in dem Erfassungsbereich
eine genaue Analyse des besagten Teils des ersten Anteils durch
den Detektor zu gestatten.
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Der
Anreicherungskanal dient dazu, eine spezielle Fraktion einer flüssigen Probe
für anschließende Bewegung
durch den Elektrophorese-Hauptströmungspfad anzureichern. Bei
den betreffenden Vorrichtungen sind der Anreicherungskanal und der Elektrophoreseströmungspfad
so positioniert, dass Abfallfluide vom Anreicherungskanal nicht
durch den Elektrophorese-Hauptströmungspfad, sondern stattdessen
durch einen Abtransportauslass strömt. Die betreffenden Vorrichtungen
finden Anwendung bei einer Vielzahl von Elektrophoreseanwendungen,
bei denen Objekte auf ein angelegtes elektrisches Feld hin durch
ein Medium bewegt werden. Die betreffenden Vorrichtungen können beim
Screening mit hohem Durchsatz für
Genom- und pharmazeutische Anwendungen, wie Genentdeckung, Medikamentenentdeckung
und -entwicklung sowie klinische Entwicklung; für In-vitro-Diagnose am Ort einer Pflegemaßnahme;
für molekulare
Genanalyse und Nukleinsäurediagnose;
für Zelltrennvorgänge einschließlich Zellisolierung
und Zellerfassung; und allgemein für biologische Forschung von
besonderem Nutzen sein.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 liefert
eine schematische Ansicht eines Anreicherungskanals zur Verwendung
bei einer Vorrichtung gemäß der betrachteten
Erfindung.
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2 liefert
eine schematische Ansicht einer alternativen Ausführungsform
eines Anreicherungskanals, der ebenfalls zur Verwendung bei der
betrachteten Vorrichtung geeignet ist.
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3A liefert
eine schematische Draufsicht einer Vorrichtung gemäß dem Gegenstand
der Erfindung.
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3B liefert
eine Seitenansicht der Vorrichtung der 3A.
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4 liefert
eine schematische Draufsicht einer anderen Ausführungsform der betrachteten
Erfindung.
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5 liefert
eine schematische Ansicht einer Ausführungsform der betrachteten
Erfindung, bei der der Anreicherungskanal über einen einzelnen Fluideinlass
und -auslass verfügt.
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6 liefert
eine schematische Ansicht einer Vorrichtung gemäß der betrachteten Erfindung,
bei der der Anreicherungskanal über
ein Elektrophoresegelmedium anstelle des Chromatographiematerials, wie
in den 1 und 2 dargestellt, verfügt.
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7 liefert
eine schematische Draufsicht einer scheibenförmigen Vorrichtung gemäß der betrachteten
Erfindung.
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8 ist
ein Flussdiagramm einer Vorrichtung wie in der 1 oder 2.
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9 ist
ein Flussdiagramm einer Vorrichtung wie in den 3A, 3B.
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10 ist
ein Flussdiagramm einer Vorrichtung wie in der 4.
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11 ist
ein Flussdiagramm einer Vorrichtung wie in der 5.
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12 ist
ein Flussdiagramm einer Vorrichtung wie in der 6.
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13 ist
ein Flussdiagramm einer Vorrichtung wie in der 7.
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14 ist
ein Flussdiagramm eines Teils einer Ausführungsform einer Vorrichtung
gemäß der Erfindung,
das mehrere Einlässe
in den Trennkanal zeigt.
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15 ist
ein Flussdiagramm einer Ausführungsform
einer Vorrichtung gemäß der Erfindung, das
eine alternative Konfiguration der Kreuzungsstelle zwischen dem
Elektrophorese-Hauptströmungspfad
und einem Elektrophorese-Sekundärströmungspfad
zeigt.
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16 ist
ein Flussdiagramm einer Ausführungsform
einer Vorrichtung gemäß der Erfindung, das
mehrere Analysezonen zeigt, die der Reihe nach stromabwärts in Bezug
auf den Anreicherungskanal angeordnet sind.
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17 ist
ein Flussdiagramm einer Ausführungsform
einer Vorrichtung gemäß der Erfindung, das
mehrere Analysezonen zeigt, die parallel stromabwärts in Bezug
auf den Anreicherungskanal angeordnet sind.
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18 ist
ein Flussdiagramm einer Ausführungsform
einer Vorrichtung gemäß der Erfindung, das
mehrere Elektrophorese-Hauptströmungspfade stromabwärts in Bezug
auf den Anreicherungskanal zeigt.
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19 ist
ein Flussdiagramm einer Ausführungsform
einer Vorrichtung gemäß der Erfindung, das
mehrere parallel angeordnete Anreicherungskanäle zeigt.
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20 und 21 sind
Flussdiagramme von Ausführungsformen
einer Vorrichtung gemäß der Erfindung ähnlich denen
in der 15 bzw. 16, wobei
zusätzlich
ein Reagensströmungspfad
zum Transportieren eines Reagens von einem Reservoir direkt zum
Elektrophorese-Hauptströmungspfad
vorhanden ist.
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22 ist
ein Flussdiagramm einer Ausführungsform
einer Vorrichtung gemäß der Erfindung ähnlich dem
in der 17 dargestellten, wobei zusätzlich mehrere
Reagensströmungspfade
zum Transportieren eines Reagens von einem Reservoir direkt zu stromabwärtigen Zweigen
des Elektrophorese-Hauptströmungspfads
vorhanden sind.
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23 ist
ein Flussdiagramm einer Ausführungsform
einer Vorrichtung gemäß der Erfindung, bei
der ein Anreicherungsmedium über
beschichtete Magnetkügelchen
verfügt.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG
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Es
sind integrierte Elektrophorese-Mikrovorrichtungen mit mindestens
einem Anreicherungskanal und einem Elektrophorese-Hauptströmungspfad geschaffen.
Der Anreicherungskanal dient zum Anreichern eines speziellen Analyten
mit einer Fraktion einer flüssigen
Probe. Der Anreicherungskanal und der Elektrophorese-Hauptströmungspfad
sind so in der Vorrichtung positioniert, dass Abfallfluid aus dem Anreicherungskanal
nicht durch den Elektrophorese-Hauptströmungspfad
fließt,
sondern stattdessen von diesem durch einen Abtransportauslass abfließt. Die
betrachteten Vorrichtungen können
bei einer Vielzahl von Elektrophoreseanwendungen genutzt werden,
einschließlich
klinischen Untersuchungsanwendungen. Bei der weiteren Beschreibung
der Erfindung werden als erstes die Vorrichtungen in allgemeinen
Begriffen beschrieben, gefolgt von einer Erörterung repräsentativer,
spezieller Ausführungsformen
der betrachteten Vorrichtungen, wozu auf die Figuren Bezug genommen
wird.
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Die
betrachtete Vorrichtung ist eine integrierte Elektrophorese-Mikrovorrichtung.
Unter integriert ist zu verstehen, dass alle Komponenten der Vorrichtung,
beispielsweise der Anreicherungskanal, der Elektrophorese-Hauptströmungspfad
usw., in einer einzelnen, kompakten, leicht handhabbaren Einheit, wie
einem Chip, einer Scheibe oder dergleichen, vorhanden sind. Da die
Vorrichtungen mit Elektrophorese arbeiten, sind sie bei einer Vielzahl
von Anwendungen von Nutzen, bei denen Objekte wie Moleküle, Teilchen,
Zellen und dergleichen unter dem Einfluss eines angelegten elektrischen
Felds durch ein Medium bewegt werden. Abhängig von der Art der Objekte,
beispielsweise ob sie eine elektrische Ladung tragen oder nicht,
sowie der Oberflächenchemie
der Elektrophoresekammer, in der die Elektrophorese ausgeführt wird,
können
die Objekte unter direktem Einfluss des angelegten elektrischen
Felds oder als Ergebnis dessen durch das Medium bewegt werden, dass
ein sich aus dem angelegten elektrischen Feld ergebender Fluidvolumenstrom
durch den Pfad vorliegt, beispielsweise eine elektroosmotische Strömung (EOF).
Die Mikrovorrichtungen verfügen
als Elektrophorese-Hauptströmungspfad über einen
Mikrokanal. Unter Mikrokanal ist es zu verstehen, dass die Elektrophoresekammer
des Elektrophorese-Hauptströmungspfads,
in dem das Medium vorhanden ist, eine Leitung, beispielsweise ein
Graben oder ein Kanal, mit einer Querschnittsfläche ist, die für eine Kapillarströmung durch
die Kammer sorgt, wobei die Kammer auf einem ebenen Substrat vorhanden
ist, wie es unten detaillierter beschrieben wird.
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Kritisch
für die
betrachtete Vorrichtung ist ein Anreicherungskanal mit einem Probeneinlass,
einem Abfallfluidauslass, einem internen Anreicherungsmedium zum
Anreichern einer speziellen Fraktion einer Probe, und, optional,
einem Fluidauslass für
die angereicherte Fraktion. Der Zweck des Anreicherungskanals besteht
im Verarbeiten der Anfangsprobe zum Anreichern einer speziellen
Fraktion derselben, wobei die spezielle, angereicherte Fraktion
den interessierenden Analyt oder die Analyte enthält. Der
Anreicherungskanal dient so zum selektiven Zurückhalten und Trennen der den
Zielanalyt enthaltenden Fraktion aus den Restkomponenten oder dem
Abfallanteil des anfänglichen
Probenvolumens. Abhängig
von der speziellen Anwendung, bei der die Vorrichtung verwendet
wird, kann der Anreicherungskanal einer Anzahl verschiedener Funktionen
dienen. Der Anreicherungskanal kann dazu dienen, den interessierenden
Analyten in einem kleineren Volumen als dem anfänglichen Probenvolumen zu platzieren,
d. h., er kann als Analytkonzentrator dienen. Ferner kann er dazu
dienen, zu verhindern, dass möglicherweise störende Probenkomponenten
in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad
eindringen und durch diesen fließen, d. h., er kann als Proben"reinigungs"einrichtung dienen.
Außerdem
kann der Anreicherungskanal als Mikroreaktor für Präparationsprozesse an einem
in einer Fluidprobe vorhandenen Zielanalyten sorgen, wie für chemische,
immunologische und enzymatische Prozesse, beispielsweise Markierung, Proteinverdauung,
DNA-Verdauung oder
-Fragmentierung, DNA-Synthese und dergleichen.
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Der
Anreicherungskanal kann mit einer Anzahl von Konfigurationen, abhängig vom
in ihm untergebrachten speziellen Anreicherungsmedium, in der Vorrichtung
vorhanden sein. Das Innenvolumen des Kanals liegt im allgemeinen
im Bereich von ungefähr 1
pl bis 1 µl,
im allgemeinen von ungefähr
1 pl bis 100 nl, wobei seine Länge
im wesentlichen im Bereich von ungefähr 1 µm bis 5 mm, im allgemeinen
10 µm bis
1 mm liegt, und seine Querschnittsabmessungen (beispielsweise Breite,
Höhe) im
Bereich von ungefähr
1 µm bis
200 µm, üblicherweise
von ungefähr
10 µm
bis 100 µm,
liegen. Die Querschnittsform des Signals kann kreisförmig, elliptisch,
rechteckig, trapezförmig,
quadratisch oder von anderer zweckdienlicher Konfiguration sein.
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Im
Anreicherungskanal können
mehrere verschiedene Anreicherungsmedien vorhanden sein. Zu repräsentativen
Anreicherungsmedien oder -maßnahmen
gehören
solche Maßnahmen,
wie sie für
die Analytvorkonzentriervorrichtungen beschrieben sind, die in
US 5,202,010 ;
US 5,246,577 und
US 5,340,452 sowie von Tomlinson et
al. offenbart sind.
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Zu
speziellen Anreicherungsmaßnahmen, wie
sie in der Technik bekannt sind und wie sie zur Verwendung bei den
betrachteten integrierten Elektrophorese-Mikrokanalvorrichtungen anpassbar sind, gehören: diejenigen,
wie sie in von Kasicka & Prusik, in "Isotachophoretic
Electrodesorption of Proteins from an Affinity Adsorbent on a Microscale", J. Chromatogr.
81983) 273: 117128 beschriebenen Vorkonzentriervorrichtungen verwendet
sind; Kapillarbündel mit
einem Affinitätsadsorbenten,
wie in
US 5,202,101 und
WO 93/05390 beschrieben; mit Oktadodecylsilan beschichtete Festphasen
wie von Cai & El
Rassi in "On-Line Preconcentration
of Triazine Herbicides with Tandem Octadecyl Capillaries-Capillary
Zone Electrophoresis",
J. Liq. Chromatogr. (1992) 15: 1179–1192 beschrieben; mit einer
Metallchelatschicht beschichtete Festphasen, wie von Cai & El Rassi in "Selective On-Line
Preconcentration of Proteins bei Tandem Metal Chelate Capillaries-Capillary Zone
Electrophoresis",
J. Liq. Choromatogr. (1993) 16: 2007–2024 beschrieben; Umkehrphase-HPLC-Feststoff-Füllmaterialien, wie in
US 5,246,577 beschrieben;
mit Protein G beschichteten Festphasen, wie von Cole & Kennedy in "Selective Preconcentration
for Capillary Zone Electrophoresis Using Protein G Immunoaffinity
Capillary Chromatography",
Electrophoresis (1995) 16: 549–556
beschrieben; schmelzbare Agarosegels, wie in
US 5,423,966 beschrieben; Affinitätsabsorbensmaterialien,
wie von Guzman in "Biomedical
Applications of On-Line Preconcentration – Capillary Electrophoresis Using
an Analyte Concentrator: Investigation of Design Options", in J. Liq. Chromatogr.
(1995) 18: 3751–3568)
beschrieben; und Festphase-Reaktormaterialien, wie in
US 5,318,680 beschrieben.
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Eine
Klasse von Anreicherungsmedien oder Materialien, die als Anreicherungsmedium
Anwendung finden können,
sind Chromatographiemedien oder -materialien, insbesondere Materialien
einer Sorptionsphase. Zu derartigen Materialien gehören: Umkehrphasenmaterialien,
beispielsweise mit C8- oder C18-Verbundmaterial
beschichtete Teilchen; Ionenaustauschmaterialien; Affinitätschromatographiematerialien,
bei denen ein Bindungselement kovalent an eine unlösliche Matrix
gebunden ist, wobei ein Bindungselement gruppenspezifisch sein kann,
z. B. ein Lectin, ein Enzymkofaktor, Protein A und dergleichen,
oder substanzspezifisch sein kann, z. B. ein Antikörper oder
ein zugehöriges
Bindungsfragment, ein Antigen für
einen speziellen interessierenden Antikörper, ein Oligonukleotid und
dergleichen, wobei die unlösliche
Matrix, an die das Bindungselement gebunden ist, aus Teilchen bestehen
kann, wie porösem
Glas, Polymerkügelchen,
Magnetkügelchen, Netzen
von Glassträngen
oder -fasern, einer Anzahl schmaler Stäbe oder Kapillaren, der Wand
des Kanals und dergleichen. Abhängig
von der Art des als Anreicherungsmaßnahme verwendeten Chromatographiematerials
kann es erforderlich sein, eine Zurückhalteeinrichtung zu verwenden,
um das Chromatographiematerial im Anreicherungskanal zu halten. Zweckdienlicherweise
können
Glasfritten oder Pfropfen aus Agarosegel dazu verwendet werden,
die Fluidauslässe
oder -einlässe
der Kammer abzudecken, wobei die Fritten oder Pfropfen einen Fluidfluss
aus dem Anreicherungskanal, jedoch keinen Fluss von Teilchen oder
einer anderen unlöslichen
Matrix aus ihm zulassen. Bei Ausführungsformen, bei denen die Anreicherungseinrichtung
ein Chromatographiematerial ist, wird eine typische Probe in den
Anreicherungskanal eingeleitet und kann durch diesen fließen. Wenn
die Probe durch den Anreicherungskanal fließt, wird die den Analyt enthaltende
Fraktion im Anreicherungskanal zurückgehalten, jedoch fließen das Chromatographiematerial
und der verbliebene Abfallanteil der Probe durch den Abfallauslass
aus dem Kanal heraus.
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Bei
Ausführungsformen,
bei denen die Anreicherungseinrichtung ein Bett aus Polymerkügelchen oder
paramagnetischen Kügelchen
oder Teilchen ist, können
die Kügelchen
mit Antikörpern
oder einer anderen zielspezifischen Affinitätsbindungskomponente beschichtet
sein, wozu die folgenden gehören:
affinitätsgereinigte,
monoklonale Antikörper
für beliebige
einer Anzahl von Säugezellenmarkern,
speziellen Menschenzellenmarkern, einschließlich Markern für T-Zellen, T-Zellenuntergruppen,
B-Zellen, Monozyten, Stammzellen, Myeloidzellen, Leukozyten sowie positive
Zellen der HLA-Klasse II; sekundäre
Antikörper
beliebiger verschiedener Nagezellen-Marker, insbesondere Maus-,
Ratten- oder Kaninchen-Immunglobulinen zur Isolierung von B-Zellen,
T-Zellen und T-Zellenuntergruppen, unbeschichteten oder tosylaktivierten
Formen für
eine fallange passte Beschichtung mit einem beliebigen vorgegebenen
Biomolekül; und
mit einer Streptavidinbeschichtung zur Verwendung bei biotinylierten
Antikörpern.
Paramagnetische Kügelchen
oder Teilchen können
durch Anlegen eines Magnetfelds im Anreicherungskanal zurückgehalten
werden.
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Alternativ,
oder zusätzlich
zu Festphasenmaterialien wie beschichteten Teilchen oder anderen
unlöslichen
Matrizen als Anreicherungseinrichtung, kann eine beschichtete und/oder
imprägnierte
Membran verwendet werden, die für
ein selektives Zurückhalten
der den Analyt enthaltenden Fraktion der Probe sorgt, während der
Rest der Probe durch die Membran und durch den Abfallauslass aus
der Anreicherungseinrichtung herausfließen kann. Es wurde eine Anzahl
hydrophiler, hydrophober und Ionenaustauschmembranen zur Verwendung
bei einer Festphasenextraktion verwendet, die bei der betrachteten Erfindung
Anwendung finden können.
Siehe z. B. Tomlinson et al. in "Novel
Modifications and Clinical Applications of Preconcentration Capillary
Electrophoresis-Mass Spectrometry", J. Cap. Elect. (1995) 2: 97–104; und
Tomlinson et al. in "Improved
On-line Membrane Preconcentration-Capillary Electrophoresis (mPC-CE)", J. High Res. Chromatogr.
(1995) 18: 381-3.
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Alternativ
oder zusätzlich
kann der Anreicherungskanal oder das Anreicherungsmedium eine poröse Membran
oder ein Filter enthalten. Zu geeigneten Materialien zum Zurückhalten
von Genom-DNAs und viralen Nukleinsäuren gehören solche, die von QIAGEN
unter dem Namen QIAmp zur Analyse von Blut, Gewebe und viralen RNAs
verwendet werden; und zu geeigneten Materialien zum Zurückhalten
von DNAs aus Pflanzenzellen und -geweben gehören solche, wie sie von QIAGEN
unter dem Namen DNeasy vermarktet werden.
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Abhängig von
der Konfiguration der Vorrichtung kann durch eine Anzahl verschiedener
Maßnahmen
und Kombinationen von Maßnahmen
dafür gesorgt
werden, dass die Probe durch den Anreicherungskanal fließt. Bei
einigen Vorrichtungskonfigurationen kann es ausreichen, es zu ermöglichen,
dass die Probe als Ergebnis der Schwerkräfte an ihr durch die Vorrichtung
fließt;
bei einigen Konfigurationen kann die Vorrichtung um eine ausgewählte Achse
gedreht werden, um eine Zentrifugalkraft in einer gewünschten
Richtung auszuüben.
Bei anderen Ausführungsformen
kann eine aktive Pumpeinrichtung dazu verwendet werden, die Probe
durch den Anreicherungskanal und die darin aufgenommene Anreicherungseinrichtung
zu bewegen. Bei anderen Ausführungsformen
können
Magnetkräfte
angelegt werden, um die Probe zu bewegen oder einen paramagnetischen
Kügelchen- Ziel-Komplex während Wasch- und
Eluierungsschritten festzuhalten oder zu immobilisieren. Bei noch
anderen Ausführungsformen
der betrachteten Erfindung können
Elektroden dazu verwendet werden, ein elektrisches Feld anzulegen,
das dafür
sorgt, dass sich ein Fluid durch den Anreicherungskanal bewegt.
Dann wird dafür
gesorgt, dass sich eine Eluierungsflüssigkeit durch das Anreicherungsmedium
bewegt, um die angereicherte Probenfraktion aus dem Material freizusetzen
und sie zum Elektrophorese-Hauptströmungspfad zu transportieren.
Im allgemeinen wird ein angelegtes elektrisches Feld dazu verwendet,
die Eluierungsflüssigkeit
durch den Anreicherungskanal zu bewegen.
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Als
Anreicherungseinrichtung können
bei den betrachteten Anwendungen auch Elektrophoresegelmedien verwendet
werden. Es sind Gelmedien bekannt, die für eine Anzahl verschiedener
Siebfähigkeiten
sorgen. Durch Variieren der Porengröße der Medien, durch Verwenden
von zwei oder mehr Gelmedien mit verschiedener Porosität und/oder durch
Bereitstellen eines Gradienten der Porengröße und durch Auswählen der
geeigneten Beziehung zwischen dem Anreicherungskanal und dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad
kann dafür
gesorgt werden, dass nur die interessierende, den Analyten enthaltende
Fraktion der anfänglichen
Probe in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad eintritt. Beispielsweise
könnte
eine Vorrichtung mit einem Anreicherungskanal vorliegen, der den
Elektrophorese-Hauptströmungspfad
schneidet, wobei der Anreicherungskanal, in der Richtung des Probenflusses, über ein
Schichtungsgel großer
Porosität
und ein zweites Gel feiner Porosität verfügt, wobei die Grenze zwischen
den Gelen an der Kreuzungsstelle zwischen dem Anreicherungskanal
und dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad
vorliegt. Bei dieser Ausführungsform
bewegen sich, nachdem die Probe in das Schichtgel eingeleitet wurde
und ein elektrisches Feld an die Gele im Anreicherungskanal angelegt wurde,
Probenkomponenten durch das Schichtgel, und sie kondensieren an
der Gelgrenzfläche
an der Kreuzungsstelle zwischen dem Anreicherungskanal und dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad
zu einem schmalen Band. Dann kann ein zweites elektrisches Feld
an den Elektrophorese-Hauptströmungspfad
angelegt werden, damit sich das schmale Band der angereicherten
Probenfraktion in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad und durch diesen
bewegt. Alternativ könnte
der Anreicherungskanal über
ein Gel mit Porositätsgradient
verfügen.
Bei dieser Ausführungsform
kann, wenn das mindestens eine interessierende Band die Kreuzungsstelle
zwischen dem Anreicherungskanal und dem Elektrophoreseströmungspfad
erreicht, dieses mindestens eine interessierende Band in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad
und diesen entlang bewegt werden.
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Zu
Anreicherungsmedien, die zur Anreicherung und/oder Reinigung von
Nukleinsäuren
besonders nützlich
sein können,
gehören
sequenzspezifische Festhaltemedien sowie generische Festhaltemedien.
Zu generischen Festhaltemedien gehören beispielsweise Ionenaustausch-
und Silikatharze oder Membranen, die Nukleinsäuren unspezifisch binden und
von denen erwartet werden kann, dass sie im wesentlichen die gesamte
DNA in einer Probe zurückhalten;
Bindungsprotein für
immobilisierte, einsträngige
DNA (SSB-Protein), von dem erwartet werden kann, dass es im wesentlichen
die gesamte einsträngige
DAN in einer Probe bindet, mit Poly-dT modifizierte Kügelchen,
von denen erwartet werden kann, dass sie im Wesentlichen die gesamte
mRNA in einer Probe binden. Zu sequenzspezifischen Festhaltemedien
gehören
Kügelchen,
Membranen oder Flächen,
auf denen beliebige einer Anzahl von Festhaltemolekülen immobilisiert
sind, wie beispielsweise: Oligonukleotidsonden, von denen erwartet
werden kann, dass sie Nukleinsäuren
mit Komplementärsequenzen
in der Gruppe binden; Streptaviden, von dem erwartet werden kann,
dass es biotynilierte Sonden in der Lösungsphase bindet, die mit
Komplementärsequenzen
in der Probe hybridisiert wurden. Zu geeigneten Kügelchen
zur Immobilisierung von Festhaltemolekülen gehören chemisch oder physikalisch
vernetzte Gele und poröse
oder nichtporöse Harze
wie Polymerharze oder solche auf Silikatbasis.
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Zu
geeigneten Festhaltemedien für
Proteine gehören
die folgenden. Zu geeigneten Festhaltemedien für Proteine gehören: Ionenaustauschharze, einschließlich Anion-(z.
B. DEAE)- und Kation-Austausch; Verbundstoffe für hydrophobe Wechselwirkung
(z. B. Verbundstoffe C4, C8 und C18); Sulfhydryle; Heparine; von
Natur aus aktive Oberflächen
(z. B. Kunststoffe, Nitrozellulose-Löschpapiere);
aktivierte Kunststoffflächen;
aromatische Farbstoffe wie Cibacronblau, Remazolorange und Procionrot.
Für Kohlenwasserstoffkomponenten
von Proteinen können
Lektine, immobilisierte, hydrophobe Octyl- und Phenylalkanderivate
geeignet sein. Für
Enzyme können
Analoge eines spezifischen Enzymsubstrat-Produkt-Übergangszustandsvermittlers
geeignet sein; für
Chinasen kann Calmodulin geeignet sein. Zu geeigneten Festhaltemedien
für Rezeptoren
gehören Rezeptor-Ligand-Affinitätsverbundstoffe.
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Wie
oben angegeben, verfügt
der Anreicherungskanal über
mindestens einen Einlass und mindestens einen Auslass. Selbstverständlich muss, wenn
ein einzelner Einlass vorhanden ist, dieser dazu dienen, in einer
Anreicherungsphase des Prozesses eine Probe in den Anreicherungskanal
einzulassen und während einer
Eluierungsphase des Prozesses ein Eluierungsmedium einzulassen.
Wenn ein einzelner Auslass vorhanden ist, muss dieser dazu dienen,
denjenigen Teil der Probe auszulassen, der an der durch das Anreicherungsmedium
festgehaltenen Fraktion verarmt ist, um in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad
die während
der Eluierungsphase angereicherte Fraktion durchzulassen. Abhängig von
der speziellen, im Anreicherungskanal untergebrachten Anreicherungseinrichtung,
sowie abhängig
von der speziellen Vorrichtungskonfiguration, kann der Anreicherungskanal über mehr
als einen Fluideinlass verfügen,
der beispielsweise als Probeneinlass und Eluierungspuffereinlass
dient; oder der Anreicherungskanal kann über mehr als einen Auslass
verfügen,
der beispielsweise als Abfallauslass und Auslass für das Fluid
mit der angereicherten Fraktion dient. Wenn der Anreicherungskanal
in direkter Fluidverbindung mit dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad
steht, d. h., wenn der Anreicherungskanal und der Elektrophorese-Hauptströmungspfad
verbunden sind, so dass Fluid vom Anreicherungskanal direkt in den
Elektrophorese-Hauptströmungspfad
fließt,
verfügt
der Anreicherungskanal zusätzlich
zum Abfallauslass über
einen Auslass für das
Fluid mit der angereicherten Fraktion, durch den die angereicherte
Fraktion der Probe in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad
fließt.
Wenn es zweckdienlich ist, beispielsweise zum Einleiten eines Wasch-
und/oder Eluierungslösungsmittels
in den Anreicherungskanal, können
ein oder mehrere zusätzliche
Fluideinlässe
vorhanden sein, um derartige Lösungsmittel
aus Fluidreservoirs in den Anreicherungskanal zu leiten. Um den
Fluidvolumenfluss durch den Anreicherungskanal zu kontrollieren,
beispielsweise um zu verhindern, dass Probenabfall in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad
fließt,
können
Fluidkontrolleinrichtungen, beispielsweise Ventile, Membranen usw.
jedem der Einlässe
und Auslässe
zugeordnet sein. Wo es zum Bewegen von Fluiden und Objekten durch
den Anreicherungskanal, beispielsweise Probe, Eluierungspuffer,
Reagenzien, Reaktanten, Wasch- oder Spüllösungen usw., erwünscht ist,
können
Elektroden vorhanden sein, die ein elektrisches Feld an das Material
und das Fluid anlegen können,
wie sie im Anreicherungskanal vorhanden sind.
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Die
nächste
Komponente der betrachteten Vorrichtungen ist der Elektrophorese-Hauptströmungspfad.
Der Elektrophorese-Hauptströmungspfad
kann über
eine Anzahl von Konfigurationen verfügen, einschließlich rohrförmig, grabenförmig oder von
anderer zweckdienlicher Konfiguration, wobei die Querschnittsform
des Strömungspfads
kreisförmig,
elliptisch, quadratisch, rechteckig, dreieckig und dergleichen sein
kann, so dass er an der Oberfläche des
planaren Substrats, in der er vorhanden ist, einen Mikrokanal bildet.
Der Mikrokanal verfügt über eine Querschnittsfläche, die
für einen
Kapillarfluidfluss durch ihn sorgt, wobei mindestens eine der Querschnittsabmessungen,
beispielsweise die Breite, die Höhe,
der Durchmesser, mindestens ungefähr 1 µm beträgt, im allgemeinen mindestens
ungefähr
10 µm, wobei
jedoch ungefähr
200 µm
nicht überschritten werden
und im allgemeinen ungefähr
100 µm
nicht überschritten
werden. Abhängig
von der speziellen Art der integrierten Vorrichtung kann der Elektrophorese-Hauptströmungspfad
gerade, gekrümmt
oder von einer anderen zweckdienlichen Konfiguration an der Oberfläche des
planaren Substrats vorhanden sein.
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Der
Elektrophorese-Hauptströmungspfad sowie
beliebige zusätzliche
Elektrophoreseströmungspfade
verfügen über mindestens
ein zugeordnetes Paar von Elektroden zum Anlegen eines elektrischen
Felds an das im Strömungspfad
vorhandene Medium. Wenn ein einzelnes Paar von Elektroden verwendet
wird, ist typischerweise ein Element des Paars an jedem Ende des
Pfadverlaufs vorhanden. Wo es zweckdienlich ist, können mehrere
Elektroden dem Elektrophoreseströmungspfad
zugeordnet sein, wie es in
US
5,126,022 beschrieben ist, wobei die mehreren Elektroden
für eine
genaue Bewegung der Objekte den Elektrophoreseströmungspfad
entlang sorgen können.
Die bei der betrachteten Vorrichtung verwendeten Elektroden können von
jedem beliebigen zweckdienlichen Typ sein, der ein geeignetes elektrisches
Feld an das Medium anlegen kann, das im Elektrophoreseströmungspfad
vorhanden ist, dem sie zugeordnet sind.
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Kritisch
für die
betrachtete Erfindung ist es, dass der Anreicherungskanal und der
Elektrophorese-Hauptströmungspfad
so in der Vorrichtung positioniert sind, dass im wesentlichen alleine
die angereicherte Fraktion der Probe durch den Elektrophorese-Hauptströmungspfad
fließt.
Zu diesem Zweck verfügt
die Vorrichtung ferner über
einen Abtransportauslass zum Auslassen eines anderen Anteils der Probe
als die angereicherte Fraktion, beispielsweise den Abfallanteil,
weg vom Elektrophorese-Hauptströmungspfad.
Demgemäß steht
dann, wenn der Anreicherungskanal in direkter Fluidverbindung mit
dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad
steht, der Abfallfluid-Strömungspfad
durch den Anreicherungskanal in einer Schnittbeziehung zum Elektrophorese-Hauptströmungspfad.
Bei anderen Ausführungsformen
der betrachteten Erfindung, bei denen der Anreicherungskanal und
der Elektrophorese-Hauptströmungspfad
durch einen zweiten Elektrophoreseströmungspfad verbunden sind, so
dass sie in indirekter Fluidverbindung stehen, muss der Abfallströmungspfad
durch den Anreicherungskanal nicht notwendigerweise in einer Schnittbeziehung
zum Elektrophorese-Hauptströmungspfad
stehen; der Abfallströmungspfad
und der Elektrophorese-Hauptströmungspfad
könnten
parallel zueinander verlaufen.
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Die
betrachteten Vorrichtungen verfügen auch über eine
Einrichtung zum Transferieren der angereicherten Fraktion aus dem
Anreicherungskanal in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad.
Abhängig
von der speziellen Konfiguration der Vorrichtung kann die Transfereinrichtung
für die
angereicherte Fraktion ein Fluidauslass für diese, ein Elektrophorese-Sekundärströmungspfad
oder eine andere geeignete Transfereinrichtung sein. Wenn ein zweiter Elektrophoreseströmungspfad
zusätzlich
zum Elektrophorese-Hauptströmungspfad
vorliegt, besteht die Möglichkeit,
diesen zweiten Elektrophoreseströmungspfad
als Leitung für
die angereicherte Probenfraktion aus dem Anreicherungskanal zum
Elektrophorese-Hauptströmungspfad
zu verwenden. Bei denjenigen Ausführungsformen, bei denen der
Abfallauslass der einzige Fluidauslass ist, ist das Vorliegen eines
Elektrophorese-Sekundärströmungspfads wesentlich,
so dass der Anreicherungskanal und der Elektrophorese-Hauptströmungspfad
in indirekter Fluidverbindung stehen.
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Zusätzlich zum
Elektrophorese-Hauptströmungspfad
und beliebigen Elektrophorese-Sekundärströmungspfaden, die als Transfereinrichtung
für die
angereicherten Proben dienen, können
die betrachteten Vorrichtungen ferner über einen oder mehrere zusätzliche
Elektrophoreseströmungspfade
verfügen,
die über
Kapillarabmessungen verfügen
können,
was jedoch nicht der Fall sein muss, und die einer Anzahl von Zwecken
dienen können.
Bei der Vorrichtung mit mehreren Elektrophoreseströmungspfaden
ist eine Anzahl von Konfigurationen möglich, wie eine Verzweigungskonfiguration,
bei der mehrere Elektrophoreseströmungspfade in Fluidverbindung mit
dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad
stehen. Siehe
US 5,126,022 .
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Der
Elektrophorese-Hauptströmungspfad und/oder
beliebige Elektrophorese-Sekundärströmungspfade,
wie sie in der Vorrichtung vorhanden sind, können wahlweise über Fluidreservoire
an einem oder beiden Anschlüssen,
d. h. an jedem Ende, der Strömungspfade
verfügen,
und dies wird im allgemeinen der Fall sein. Wenn Reservoire vorhanden sind,
können
sie einer Anzahl von Zwecken dienen, wie als Maßnahme zum Einleiten eines
Puffers, einer Eluierungslösung,
eines Reagens, von Spül-
und Waschlösungen
und dergleichen in den Elektropho rese-Hauptströmungspfad, und zum Aufnehmen
von Abfallfluid aus dem Elektrophoreseströmungspfad, und dergleichen.
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Eine
andere Komponente, die wahlweise in den betrachteten Vorrichtungen
vorhanden sein kann, ist ein Abfallfluidreservoir zum Aufnehmen
und Lagern des Analytanteils des anfänglichen Probenvolumens aus
dem Anreicherungskanal, wobei das Abfallreservoir in Fluidverbindung
mit dem Abtransportauslass stehen wird. Abhängig von der speziellen Vorrichtungskonfiguration
kann der Abtransportauslass der Abfallauslass sein, oder er kann
von ihm getrennt vorliegen, und er kann in ein Abfallreservoir geöffnet sein
oder einen Auslass aus der Vorrichtung bilden. Das Abfallreservoir
kann in der Vorrichtung als Kanal, Kammer oder mit anderer zweckdienlicher Konfiguration
vorhanden sein, die die anderen Komponenten der Vorrichtung nicht
stört.
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Die
betrachtete Vorrichtung kann wahlweise auch über eine Schnittstelleneinrichtung
verfügen, um
die Einleitung der Probe in die Probenpräpariereinrichtung zu unterstützen. Wenn
beispielsweise die Probe durch eine Spritze in die Vorrichtung einzuleiten
ist, kann die Vorrichtung über
eine Spritzenschnittstelle verfügen,
die als Führung
für die
Spritzennadel in die Vorrichtung dient, wie als Abdichtung und dergleichen.
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Abhängig von
der speziellen Konfiguration und der Art der Materialien, aus denen
die Vorrichtung hergestellt ist, existiert zumindest in Zuordnung zum
Elektrophorese-Hauptströmungspfad
ein Erfassungsbereich zum Erfassen des Vorliegens einer speziellen
Spezies im Elektrophoreseströmungspfad enthaltenen
Medium. Mindestens ein Bereich des Elektrophorese-Hauptströmungspfads
im Erfassungsbereich wird aus einem Material hergestellt, das optisch
transparent ist, wobei es im wesentlichen Licht mit Wellenlängen im
Bereich von 180 bis 1500 nm, üblicherweise
220 bis 800 nm, noch üblicher
250 bis 800 nm so durchlässt,
dass geringe Übertragungsverluste
vorliegen. Zu geeigneten Materialien gehören Kieselglas, Kunststoffe,
Quarzglas und dergleichen.
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Die
integrierte Vorrichtung kann über
jede beliebige zweckdienliche Konfiguration verfügen, die über den Anreicherungskanal
und den Elektrophorese-Hauptströmungspfad
sowie beliebige zusätzliche Komponenten
verfügen
kann. Da die Vorrichtungen Elektrophoresevorrichtungen mit Mikrokanal
sind, sind an der Oberfläche
des planaren Substrats die Elektrophoreseströmungspfade vorhanden, wobei das
Substrat üblicherweise,
jedoch nicht notwendigerweise, mit einer ebenen Abdeckplatte abgedeckt ist,
um die an der Oberfläche
vorhandenen Mikrokanäle
gegen die Umgebung abzudichten. Im Allgemeinen sind die Vorrichtungen
klein, wobei die längste Abmessung
in der Oberflächenebene
nicht mehr als ungefähr
200 mm, üblicherweise
nicht mehr als 100 mm, beträgt,
so dass die Vorrichtungen leicht handhabbar und manipulierbar sind.
Wie oben erörtert, können die
Vorrichtungen über
eine Anzahl von Konfigurationen verfügen, einschließlich quaderförmig, beispielsweise
kreditkarten- oder chipförmig,
scheibenförmig,
spritzenförmig
oder irgendeine andere kompakte zweckdienliche Konfiguration.
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Die
betrachteten Vorrichtung können
aus einer großen
Anzahl von Materialien hergestellt werden, einschließlich Glas,
Kieselglas, Acrylen, thermoplastischen Stoffen und dergleichen.
Die verschiedenen Komponenten der integrierten Vorrichtung können aus
denselben oder verschiedenen Materialien hergestellt werden, was
von der speziellen Anwendung der Vorrichtung, wirtschaftlichen Gesichtspunkten,
der Verträglichkeit
mit Lösungsmitteln,
der optischen Klarheit, der Farbe, der mechanischen Festigkeit und
dergleichen abhängt.
Beispielsweise können sowohl
das ebene Substrat mit den Elektrophoreseströmungspfaden in Form von Mikrokanälen als
auch die Deckplatte aus demselben Material, beispielsweise Polymethylmethacrylat
(PMMA) oder verschiedenen Materialien, beispielsweise einem Substrat
aus PMMA und einer Abdeckplatte aus Glas, hergestellt sein. Für Anwendungen,
bei denen es wünschenswert
ist, über
eine wegwerfbare integrierte Vorrichtung zu verfügen, wird die Vorrichtung wegen
einfacher Herstellung und der Kosten der Materialien typischerweise
aus einem Kunststoff hergestellt. Zur einfachen Erfassung und Herstellung
kann die gesamte Vorrichtung aus einem Kunststoffmaterial hergestellt werden,
das optisch transparent ist, im Sinn des oben definierten Begriffs.
Auch sind bei bestimmten Anwendungen Kunststoffe mit niedriger Oberflächenladung
unter Elektrophoresebedingungen von Interesse. Zu speziellen Kunststoffen,
die Anwendung finden, gehören
Polymethylacrylat, Polycarbonat, Polyethylenterephthalat, Polystyren
oder Styrencopolymere und dergleichen.
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Die
Vorrichtungen können
unter Verwendung jeder zweckdienlichen Maßnahme hergestellt werden,
einschließlich
herkömmlichen
Formungs- und Gießtechniken.
Beispielsweise kann für
aus einem Kunststoffmaterial hergestellten Vorrichtungen ein Quarzformmaster,
der ein Negativ für
die Kanalstruktur im ebenen Substrat der Vorrichtung bildet, durch Ätzen oder
Lasermikrobearbeitung hergestellt werden. Zusätzlich dazu, dass eine erhöhte Rippe
vorliegt, die den Kanal im Substrat bildet, kann die Quarzform über ein
erhöhtes
Gebiet verfügen,
das für
einen Hohlraum im ebenen Substrat sorgt, um den Anreicherungskanal
aufzunehmen. Weiterhin kann ein Polymervorläuferansatz zwischen dem Quarzmaster
und einer ebenen Halteplatte, wie eine Glasplatte, thermisch ausgehärtet oder
durch Licht polymerisiert werden. Wenn es zweckdienlich ist, können die
in
US 5,110,514 beschriebenen
Prozeduren verwendet werden. Nachdem das ebene Substrat hergestellt
wurde, kann der Anreicherungskanal im Hohlraum in ihm platziert
werden, und es werden Elektroden dort eingesetzt, wo es erwünscht ist. Schließlich kann
eine Deckplatte auf der Oberfläche des
Substrats platziert und gegen sie abgedichtet werden, um dadurch
eine integrierte Vorrichtung aufzubauen. Die Abdeckplatte kann unter
Verwendung jeder zweckdienlichen Maßnahme, einschließlich Ultraschallschweißen, Klebern
usw., gegen das Substrat abgedichtet werden.
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Im
allgemeinen wird vor der Verwendung der betrachteten Vorrichtung
ein geeignetes erstes oder Elektrophoresemedium in die Elektrophoreseströmungspfade
oder die Mikrokanäle
der Vorrichtung eingegeben, wobei sich das erste Medium vom im Anreicherungskanal
vorhandenen Anreicherungsmedium unterscheidet. Elektrophoresemedien,
wie hier verwendet, bezeichnen beliebige Medien, an die ein elektrisches
Feld angelegt wird, um Spezies durch es zu bewegen. Die Elektrophoresemedien können zweckdienlicherweise
mittels der an den Enden der Elektrophoreseströmungspfade vorhandenen Reservoirs
oder vor dem Abdichten der Abdeckplatte gegen das Substrat direkt
in die Kanäle
oder Kammern der Elektrophoreseströmungspfade eingebracht werden.
Es kann jedes beliebige zweckdienliche Elektrophoresemedium verwendet
werden. Zu Elektrophoresemedien, die für die Verwendung geeignet sind,
gehören,
abhängig
von der speziellen Anwendung, vernetzte und unvernetzte Polymermedien,
organische Lösungsmittel,
Detergenzien und dergleichen, wie es von Barren & Blanch in "DNA Separations by Slab Gel and Capillary
Electrophoresis: Theory and Practice", Separation and Purification Methods
(1995) 24: 1–118
sowie in den US-Patentanmeldungen
mit den Serien-Nr. 08/241,048, 08/636,599 und 08/589,150 offenbart
ist. Von speziellem Interesse als Elektrophoresemedien sind Cellulosederivate,
Polyacrylamide, Polyvinylalkohole, Polyethylenoxide und dergleichen.
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Nun
wird die betrachtete Erfindung anhand der Figuren näher beschrieben.
Die 1 liefert eine schematische Ansicht eines Anreicherungskanals, der
bei den Vorrichtungen der betrachteten Erfindung Verwendung finden
kann. Der An reicherungskanal 10 verfügt über Seitenwände 1, die ein C18-Umkehrphasenmaterial 2 einschließen. Der
Kanal 10 verfügt ferner über Fluideinlässe 7 und 4 sowie
Fluidauslässe 5 und 6.
Um den Fluidfluss durch die Kanaleinlässe und -auslässe zu steuern,
sind Ventile 8, 9 und 10 vorhanden. Glasfritten 3 erlauben
einen Fluidfluss durch den Einlass 4 und den Auslass 5,
jedoch halten sie das Umkehrphasenmaterial 2 im Kanal fest.
Unter Verwendung dieses Anreicherungskanals wird eine Probe in der
Richtung des Strömungspfads 12 durch den
Probeneinlass 7 eingeleitet. Wenn sich die Probe durch
den Kanal 10 bewegt, wird die den Analyt enthaltende Fraktion
am Umkehrphasenmaterial 2 festgehalten, während die
restliche Abfallfraktion der Probe entlang dem Strömungspfad 13 aus
dem Abfallauslass 6 ausfließt. Ventile 8 und 9 sind
geschlossen, um zu verhindern, dass die Probe aus dem Einlass 4 oder
dem Auslass 5 ausströmt
oder "ausblutet". Nachdem die Probe
durch den Kanal 10 strömte, wird
das Ventil 11 geschlossen, und die Ventile 8 und 9 werden
geöffnet.
Dann wird durch die Glasfritte 3 und den Einlass 4 ein
Eluierungspuffer in der Richtung des Strömungspfads 14 in den
Kanal 10 eingeleitet. Während
sich der Eluierungspuffer durch das Material 2 bewegt,
wird die festgehaltene Probenfraktion freigesetzt und mit dem Eluierungspuffer durch
die Fritte 3 entlang dem Strömungspfad 15 aus dem
Auslass 5 für
die angereicherte Fraktion transportiert.
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In
der 2 ist derselbe Anreicherungskanal, wie er in der 1 dargestellt
ist, mit der Ausnahme dargestellt, dass das Umkehrphasenmaterial 2 durch
ein Netz vernetzter Glasfasern 16 ersetzt ist, an die ein
Bindungspaarelement kovalent gebunden ist.
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Die 3A liefert
eine schematische Draufsicht einer kreditkartenförmigen (quaderförmigen) Vorrichtung
gemäß der betrachteten
Erfindung. Die Vorrichtung 30 verfügt über einen Elektrophorese-Hauptströmungspfad 31 mit
einem Reservoir 32 an einem ersten Ende und einem Reservoir 33 an
einem zweiten Ende. In direkter Fluidverbindung mit dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad 31 befindet
sich ein Anreicherungskanal 34 (von oben her gesehen).
Es sind Elektroden 35 und 36 vorhanden, um an
das im Elektrophoreseströmungspfad 31 vorhandene
Medium ein elektrisches Feld anzulegen. Über dem Elektrophoreseströmungspfad 31 ist
ein Erfassungsbereich 37 zum Betrachten des Analyten positioniert,
der im im Strömungspfad
enthaltenen Medium vorhanden ist. Ein Erfassungsbereich kann auch über dem
Anreicherungskanal 34 vorhanden sein. Obwohl die in der 3A dargestellte
Vorrichtung über
einen einzelnen Anreiche rungskanal verfügt, könnten im Strömungspfad,
einschließlich
dem Erfassungsbereich, zusätzliche
Anreicherungskanäle vorhanden
sein.
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Die 3B liefert
eine schematische Seitenansicht der in der 3A dargestellten
Vorrichtung. Unter Verwendung dieser Ausführungsform der betrachteten
Erfindung wird eine Probe durch eine Spritzenschnittstelle 38 in
den Anreicherungskanal 34 eingeleitet, wo die den Analyt
enthaltende Fraktion der Probe zurückgehalten wird, während der
Abfallanteil durch den Abfallauslass 39 aus dem Anreicherungskanal 34 und
der Vorrichtung herausfließt. Dann
wird ein Eluierungspuffer durch die Öffnung 40 in das Reservoir 32 eingeleitet.
Dann wird zwischen Elektroden 35 und 36 ein elektrisches
Feld gelegt, das dafür
sorgt, dass sich der Eluierungspuffer durch den Anreicherungskanal 34 und
den Elektrophoreseströmungspfad 31 entlang
vom Reservoir 32 zum Reservoir 33 bewegt. Während sich
der Eluierungspuffer durch den Anreicherungskanal 34 bewegt,
gibt er die festgehaltene, den Analyt enthaltende Fraktion des anfänglichen
Probenvolumens frei und transportiert sie in den Elektrophoreseströmungspfad 31.
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Die 4 zeigt
eine schematische Ansicht einer Ausführungsform der betrachteten
Erfindung, bei der der Anreicherungskanal 62 durch einen
Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 55 vom
Elektrophorese-Hauptströmungspfad 52 getrennt
ist. Bei der Vorrichtung 50 wird eine Probe durch die Spritzenschnittstelle 66 in
den Anreicherungskanal 62 eingeleitet. Während die
Probe durch den Anreicherungskanal 62 fließt, fließt die Abfallprobe
durch den Abtransportauslass 64 in das Abfallreservoir 63.
Dann wird ein elektrisches Feld zwischen die Elektroden 61 und 60 gelegt,
was dafür
sorgt, dass sich der im Reservoir 57 vorhandene Eluierungspuffer
durch den Anreicherungskanal 62 bewegt, was zum Freisetzen des
Analyten führt.
Der Analyt wird dann gemeinsam mit dem Eluierungspuffer den Elektrophorese-Sekundärströmungspfad
entlang transportiert. Wenn der Analyt die Kreuzungsstelle 51 erreicht,
wird das elektrische Feld zwischen den Elektroden 60 und 61 durch
ein elektrisches Feld zwischen Elektroden 59 und 58 ersetzt.
Bei dieser und anderen analogen Ausführungsformen der betrachteten
Erfindung kann die Zeit, in der der Analyt die Kreuzungsstelle 51 erreicht,
dadurch bestimmt werden, dass das Vorliegen desselben an der Kreuzungsstelle
ermittelt wird, oder durch empirisches Bestimmen der Zeit, in der
er die Kreuzungsstelle erreichen sollte, was auf Grundlage der speziellen
Art des Analyten, des Mediums im Strömungspfad, der Stärke des
elektrischen Felds und dergleichen erfolgt. Folgend auf das An legen
des elektrischen Felds zwischen den Elektroden 59 und 58,
die im Reservoir 54 bzw. 53 platziert sind, bewegt sich
der Analyt von der Kreuzungsstelle 51 den Elektrophoreseströmungspfad 52 entlang
zum Reservoir 53 und durch den Erfassungsbereich 65.
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Die 5 liefert
eine schematische Draufsicht noch einer anderen Ausführungsform
der betrachteten Erfindung, bei der der Anreicherungskanal über einen
einzelnen Fluideinlass und -auslass verfügt. Die Vorrichtung 70 verfügt über einen
Elektrophorese-Hauptströmungspfad 71 in
schneidender Beziehung zum Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 73. Stromaufwärts in Bezug
auf die Kreuzungsstelle 82 befindet sich entlang dem Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 73 ein
Anreicherungskanal 72. Wenn diese Ausführungsform verwendet wird,
wird eine Probe durch die Spritzenschnittstelle 80 in den
Anreicherungskanal 72 eingeleitet, wodurch die den Analyt
enthaltende Fraktion der Probe eine reversible Bindung an das im
Anreicherungskanal vorhandene Material erfährt. Dann wird zwischen Elektroden 81 und 79 ein
elektrisches Feld gelegt, wodurch die nicht reversibel gebundene
oder Abfallfraktion der Probe den Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 73 entlang, über die
Kreuzungsstelle 82 hinweg und aus dem Analytanteil 84 in
das Abfallreservoir 78 bewegt wird. Dann wird ein Eluierungspuffer
durch die Spritzenschnittstelle 80 in den Anreicherungskanal 72 eingeleitet,
und ein elektrisches Feld wird zwischen die Elektroden 81 und 79 gelegt,
was dafür
sorgt, dass der Eluierungspuffer durch den Anreicherungskanal 72 in
den Attributwertstabilisator 73 fließt, wobei er den Analyt mit
sich nimmt. Wenn der Analyt die Kreuzungsstelle 82 erreicht,
wird das elektrische Feld zwischen den Elektroden 79 und 81 durch
ein elektrisches Feld zwischen den Elektroden 76 und 77 ersetzt,
was dafür
sorgt, dass sich der Analyt den Elektrophoreseströmungspfad 71 entlang durch
den Erfassungsbereich 99 zum Reservoir 74 bewegt.
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Die
in der 6 schematisch dargestellte Vorrichtung verfügt über einen
Anreicherungskanal mit einer Elektrophorese-Anreicherungseinrichtung anstelle
der Chromatographie-Anreicherungseinrichtung bei den Vorrichtungen
der 1 bis 5. Bei der Vorrichtung 90 wird
eine Probe in das Reservoir 96 eingeleitet, und ein elektrisches
Feld wird zwischen Elektroden 87 und 88 gelegt,
was dafür
sorgt, dass die Probe zum Reservoir 98 wandert. Wenn sich
die Probe zum Reservoir 98 bewegt, tritt sie in ein Schichtgel 93 mit
relativ großer
Porengröße ein und
läuft zu
einem Sekundärgel 92 mit
relativ feiner Porengröße. An der
Grenzfläche 94 werden
die Probenkomponenten zu einem engen Band zusammen gedrückt. An
diesem Punkt wird das elektrische Feld zwischen den Elektroden 87 und 88 durch
ein elektrisches Feld zwischen Elektroden 89 und 90 ersetzt, das
dafür sorgt,
dass das schmale Band der Probenkomponenten an der Grenzfläche 94 in
den Elektrophorese-Hauptströmungspfad 95,
durch den Erfassungsbereich 91 und zum Reservoir 85 wandert.
In der Vorrichtung 90 könnte
anstelle der Schichtgelkonfiguration eine Membran für Molekülgrößen im Bereich
der Grenzfläche 94 vorhanden
sein, die für ein
selektives Durchlaufen von Probenkomponenten unterhalb einer Schwellenmasse
und ein Zurückhalten
an der Membranfläche
für Komponenten über dieser
Schwellenmasse sorgen könnte.
Bei noch einer anderen Modifizierung bei der in der 6 dargestellten
Vorrichtung könnte
am Ort der Grenzfläche 94 eine
Elektrode vorhanden sein, durch die ein geeignetes elektrisches
Potential angelegt werden könnte,
um eine interessierende Probenkomponente im Bereich 93 zu
halten, um dadurch für
eine Komponentenkonzentration im Bereich 93 zu sorgen.
Beispielsweise wandert bei einem interessierenden anionischen Analyt
beim Einleiten einer Probe in das Reservoir 96 und beim
Anlegen eines elektrischen Felds zwischen 93 und 87,
wobei 93 die positive Elektrode ist und 87 die
Masse ist, der ionische Analyt zum Bereich 93 und wird
dort konzentriert. Nachdem der Analyt im Bereich der Elektrode 93 konzentriert
wurde, kann dann ein elektrisches Feld zwischen 89 und 90 gelegt
werden, was dafür
sorgt, dass der anionische Analyt zum Reservoir 85 wandert.
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Die 7 liefert
eine schematische Draufsicht einer scheibenförmigen Ausführungsform der betrachteten
Vorrichtung, im Gegensatz zu der kreditkartenförmigen Ausführungsformen der 3 bis 6. Bei der
Vorrichtung 100 wird als erstes eine Probe in den Anreicherungskanal 102 eingeleitet. Dann
wird zwischen Elektroden 108 und 109 ein elektrisches
Feld gelegt, um den Eluierungspuffer 103 durch den Anreicherungskanal 102 zu
bewegen, wodurch ein im Anreicherungskanal 102 festgehaltener
Analyt freigesetzt wird und mit dem Eluierungspuffer zur Kreuzungsstelle 114 transportiert
wird. Dann wird das elektrische Feld zwischen 108 und 109 durch
ein elektrisches Feld zwischen 110 und 111 ersetzt,
was dafür
sorgt, dass sich der Analyt von der Kreuzungsstelle 114 den
Elektrophorese-Hauptströmungspfad 112 entlang,
durch den Erfassungsbereich 113 und zum Reservoir 107 bewegt.
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Andere
Ausführungsformen
werden unter Bezugnahme auf die Flussdiagramme in den 8 bis 19 verständlich,
von denen einige Ausführungsformen
entsprechen, wie sie in den Skizzen in den 1 bis 7 dargestellt
sind. Es wird beispielsweise auf die 8 Bezug
genommen, in der ein Flussdiagramm eines Anreicherungskanals dargestellt
ist, wie er in der 1 oder der 2 dargestellt
ist, wobei entsprechende Bezugszahlen vorhanden sind. Demgemäß tritt,
wie es unter Bezugnahme auf die 1 und 2 beschrieben
wurde, eine Probe durch den Probeneinlass 7 über den
Strömungspfad 12 in
den Anreicherungskanal 10 ein. Wenn sich die Probe durch
den Anreicherungskanal 10 bewegt, wird die Fraktion, die
die interessierende Fraktion enthält, an einem Anreicherungsmedium festgehalten,
das beispielsweise ein C18-Umkehrphasenmaterial sein kann (wie es
unter Bezugnahme auf die 1 beschrieben wurde), oder bei
dem es sich um Bindungspaarelemente handeln kann, die kovalent an
ein Netz aus Glasfasern gebunden sind (wie es unter Bezugnahme auf
die 2 beschrieben wurde), während die restliche Abfallfraktion durch
den Abfallauslass 6 den Strömungspfad 13 entlang
herausfließt.
Nachdem eine geeignete Probenmenge durch den Anreicherungskanal 10 floss, wird
der Fluss durch den Einlass 7 und den Auslass 6 gestoppt,
und ein Eluierungspuffer tritt durch den Einlass 4 über den
Strömungspfad 14 in
den Anreicherungskanal 10. Im Anreicherungskanal 10 wird die
festgehaltene, interessierende Fraktion in den über das Anreicherungsmedium
laufenden Eluierungspuffer freigesetzt, und sie läuft über den
Strömungspfad 15 durch
den Auslass 5 für
die angereicherte Fraktion heraus.
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Weiterhin
wird auf die 9 Bezug genommen, in der ein
Flussdiagramm der Ausführungsform einer
Vorrichtung 30 dargestellt ist, wie sie skizzenhaft in
den 3A, 3B dargestellt ist und unter Bezugnahme
auf diese beschrieben wurde. In den Flussdiagrammen ist der Anreicherungskanal
(34 in der 3A, 3B, 9)
durch ein Quadrat dargestellt; die verschiedenen Reservoire (beispielsweise 32, 33 in
den 3A, 3B, 9) sind
durch kleine Kreise an den Enden der Strömungspfade (Kanäle) dargestellt,
die durch Linien dargestellt sind (beispielsweise der Elektrophorese-Hauptströmungspfad 31 in
den 3A, 3B, 9); Elektroden
(35, 36 in den 3A, 3B, 9)
sind durch dünne
Linien dargestellt, die zu den Zentren der Reservoirkreise verlaufen;
eine Schnittstelle für Spritzeneinleitung
(wo eine solche vorhanden sein kann; beispielsweise 38 in
den 3B, 9) ist durch ein Trapez am Ende
des Probeneinlass-Strömungspfads
dargestellt, und der Erfassungsbereich (37 in den 3A, 3B, 9)
ist durch einen fetten Pfeil repräsentiert, der den Elektrophorese-Hauptströmungspfad
berührt.
In ähnlicher
Weise ist in der 12 ein Flussdiagramm der Ausführungsform
der in der 6 skizzierten Vorrichtung 90 dargestellt,
die unter Bezugnahme darauf oben beschrieben wurde. Bei dieser Aus führungsform
wirkt der Anreicherungskanal (120 in der 12)
durch Elektrophoreseanreicherung, was zu einer Ansammlung der interessierenden
Fraktion am Punkt führt,
an dem der Anreicherungskanal 120 vom Elektrophorese-Hauptströmungspfad 95 geschnitten
wird. Eine Bewegung des Probenmaterials durch den Anreicherungskanal
kann dadurch bewerkstelligt werden, dass zwischen die Elektroden 87, 88 eine
elektrische Potentialdifferenz gelegt wird; und ein Eluieren der
interessierenden Fraktion aus dem Anreicherungskanal durch den Elektrophorese-Hauptströmungspfad und
zum Erfassungsbereich 91 kann dadurch bewerkstelligt werden,
dass zwischen die Elektrode 89, 90 eine elektrische
Potentialdifferenz gelegt wird. Wie es oben unter Bezugnahme auf
die 6 beschrieben ist, kann der Ansammlungspunkt die Grenzfläche 94 zwischen
einem Schichtgel 93 und einem Sekundärgel 92 sein; und
bei einer weiteren Modifizierung kann ein geeignetes elektrisches
Potential an eine Elektrode (121 in der 12)
am Ort der Grenzfläche 93 gelegt
werden, um für
eine Komponentenkonzentration in diesem Bereich des Anreicherungskanals
zu sorgen.
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Die 10 ist
ein Flussdiagramm der Ausführungsform
einer Vorrichtung, bei der der Anreicherungskanal 62 durch
einen Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 55 vom
Elektrophorese-Hauptströmungspfad 52 getrennt
ist, wie es in der 4 skizziert ist und oben unter
Bezugnahme auf diese beschrieben wurde. In ähnlicher Weise ist die 13 ein
Flussdiagramm der scheibenförmigen
Ausführungsform
einer Vorrichtung 100, wie sie in der 7 skizziert
ist und unter Bezugnahme auf diese beschrieben wurde. Die 13 zeigt
den Probeneinlass-Strömungspfad,
durch den die Probe von der Spritzenschnittstelle 66 in
den Anreicherungskanal 102 eingeleitet wird, und den Abtransportauslass 64, durch
den Abfall zu einem Abfallreservoir 63 herausläuft, während die
interessierende Fraktion am Zurückhaltemedium
im Anreicherungskanal festgehalten wird. Diese Merkmale sind in
den Draufsichten der 7 oder der 4 nicht
dargestellt.
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In
der 11 ist ein Flussdiagramm einer Vorrichtung 70 dargestellt,
bei der nur ein Fluideinlass in den Anreicherungskanal 72 hinein
und ein Fluidauslass aus ihm heraus vorhanden ist, wie es in der 5 skizziert
ist und unter Bezugnahme auf diese beschrieben wurde. Während der
Probeninjektion durch die Spritzenschnittstelle dient der Fluideinlass 116 als
Probeneinlass, und der Probenauslass 118 dient als Abfallauslass.
Während
die interessierende Fraktion durch das Zurückhaltemedium im Anreicherungskanal
festgehalten wird, strömt
die Abfallfraktion durch den Elektrophorese-Sekundärströmungs pfad 73 stromabwärts über die
Kreuzungsstelle 82 desselben mit dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad 71,
und in den Abtransportauslass 84, wo der Abfall vom Elektrophorese-Hauptströmungspfad 71 zum
Abfallreservoir 78 weggelenkt wird. Während des Eluierens wird der
Eluierungspuffer über
die Spritzenschnittstelle eingeleitet. Der Fluideinlass 116 dient
als Einlass für
den Eluierungspuffer, und der Fluidauslass 118 dient als
Auslass für
die angereicherte Fraktion zum Elektrophorese-Sekundärströmungspfad.
Die interessierende Fraktion bewegt sich in den Eluierungspuffer,
in dem sie elektrokinetisch in einem durch Anlegen einer Spannung
an Elektroden 79, 81 erzeugtes Feld zur Kreuzungsstelle
zwischen dem Elektrophorese-Sekundärströmungspfad und dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad
angetrieben wird. Wenn einmal die interessierende Fraktion die Kreuzungsstelle
erreicht hat, wird eine Spannung an die Elektroden 76, 77 gelegt,
um den Analyt oder die Analyten in der interessierenden Fraktion
in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad
und diesen entlang zur Erfassungszone 99 zu ziehen.
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Wie
es unter Bezugnahme auf die 5 angegeben
wurde, kann die Abfallfraktion (Material, das nicht an das Anreicherungsmedium
gebunden wird) aus dem Anreicherungskanal heraus und weg vom Elektrophorese-Hauptströmungspfad
dadurch ausgewaschen werden, dass ein elektrisches Feld zwischen
Elektroden stromaufwärts
in Bezug auf den Anreicherungskanal und stromabwärts in Bezug auf den Abtransportauslass
angelegt wird. D, h., dass vor dem Einleiten des Eluierungspuffers
in den Anreicherungskanal ein flüssiges
Waschmedium über
das Anreicherungsmedium geleitet und durch den Abtransportauslass
ausgelassen wird, um Abfallfraktionskomponenten abzutransportieren.
Jedes beliebige einer Anzahl von Materialien kann als Waschmedium geeignet
sein, solange es die interessierende Fraktion nicht wesentlich aus
dem Anreicherungsmedium eluiert. Darüber hinaus kann das Waschmedium
so gewählt
werden, dass es ein selektives Freisetzen oder Entfernen, vor dem
Eluieren, unerwünschter Komponenten
erleichtert, die an das Anreicherungsmedium gebunden oder ihm auf
andere Weise zugeordnet sein können.
Wenn beispielsweise die interessierenden Komponenten DNA-Fragmente
sind, kann das Waschmedium Enzyme enthalten, die Proteine oder Polypeptide
selektiv zerlegen oder RNAs selektiv zerlegen, was das Entfernen
dieser Verunreinigungen aus der interessierenden Fraktion vor dem Eluieren
erleichtert. Andernfalls kann, wenn die interessierenden Komponenten
beispielsweise Proteine sind, das Waschmedium DNAs und RNAs enthalten.
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Eine
sequenzielle Bewegung der verschiedenen Flüssigkeiten in den Anreicherungskanal
und durch ihn hindurch kann dadurch leicht gesteuert werden, dass
ein Reservoir und ein Elektrophoreseströmungspfad am stromaufwärtigen Teil
des Anreicherungskanals für
jede derartige Flüssigkeit
angebracht werden. Wie es im Flussdiagramm der 14 dargestellt
ist, wird beispielsweise ein Eingang 212 in den Anreicherungskanal 210 durch
einen von einem Probenreservoir 218 her verlaufenden Probenzuführ-Strömungspfad 220,
einen von einem Waschmediumreservoir 214 verlaufenden Waschmedium-Strömungspfad 218 und
einen von einem Eluierungsmediumreservoir 215 verlaufenden
Eluierungsmedium-Strömungspfad 216 versorgt.
Die Bewegung dieser Materialien kann dadurch selektiv gesteuert
werden, dass elektrische Potentiale an Elektroden (in der Figur
nicht dargestellt) an den jeweiligen Reservoiren und an geeigneten
Punkten (wie hier für
verschiedene Konfigurationen beschrieben) stromabwärts in Bezug
auf den Auslass 214 des Anreicherungskanals angelegt werden.
Zu geeigneten Waschmedien für
Proteine gehören
beispielsweise im pH-Wert eingestellte Puffer und organische Lösungsmittel;
und der Waschvorgang kann beispielsweise dadurch eingestellt werden,
dass die Ionenstärke
oder die Temperatur des Waschmediums eingestellt wird.
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Es
können
auch andere Materialien in den Eingangsströmungspfad eingeleitet werden,
und insbesondere können
ein oder mehrere Reagenzströme zur
Vorbehandlung der Probe selbst, bevor sich diese in den Anreicherungskanal
bewegt, vorhanden sein. Eine Rohprobe eines Körperfluids (beispielsweise Blut,
Lymphflüssigkeit,
amniotische Flüssigkeit,
Cerebrospinalflüssigkeit
oder Urin) kann dadurch vorbehandelt werden, dass die Probe im Probenströmungspfad
mit einem Reagens kombiniert wird. Beispielsweise kann DNA aus Zellen
in einer Rohprobe von Gesamtblut dadurch freigesetzt werden, dass
ein Reagens zugemischt wird, das ein Enzym oder ein Detergens enthält.
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Es
können
andere Strömungspfadkonfigurationen
stromabwärts
in Bezug auf den Anreicherungskanal verwendet werden, und bestimmte
derselben können
zu Vorteilen für
spezielle Arten einer stromabwärtigen
Behandlung oder Analyse der Komponenten der interessierenden Fraktion
sorgen. In der 15 schneidet beispielsweise
der Elektrophorese-Sekundärströmungspfad
nicht den Elektrophorese-Hauptströmungspfad; vielmehr ist der
Elektrophorese-Hauptströmungspfad 238 an
einer T-Kreuzungsstelle mit dem Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 236 verbunden
(siehe die 12). Bei dieser Konfiguration
läuft der
stromaufwärtige
Arm des Elektrophorese-Hauptströmungspfads
in denselben Kanal wie der Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 236. Bei
anderen Konfigurationen, wie sie hier beschrieben sind, tritt die
Probe über
einen Probenströmungspfad 234 vom
Probenreservoir 233 in den Anreicherungskanal 230 ein;
während
des Anreicherungsstadiums läuft
das Abfallfluid aus dem Anreicherungskanal 230 über den
Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 236,
dann über
die T-Kreuzungsstelle 237 und durch den Abtransportauslass 240 hindurch
zum Abfallreservoir 241 heraus. Wenn einmal das Anreicherungsstadium
abgeschlossen ist, kann ein Waschmedium durch den Anreicherungskanal
und auch durch den Abtransportauslass hindurch geschickt werden.
Das Waschmedium kann über
den Probenzuführ-Strömungspfad eingeleitet
werden, oder wahlweise über
einen getrennten Strömungspfad
für das
Waschmedium, wie es oben unter Bezugnahme auf die 14 beschrieben
wurde. Für
eine Bewegung der Probe und des Waschmediums kann dadurch gesorgt
werden, dass ein elektrisches Feld an Elektroden (in der Figur nicht dargestellt)
am Abfallreservoir 241 bzw. am Probenreservoir 233 (und
wahlweise an einem Waschreservoir) gelegt wird. Dann kann ein Eluierungsmedium von
einem Eluierungspufferreservoir 230 in den Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 236 und
durch diesen hindurch bewegt werden. Medien stromabwärts in Bezug
auf die Eluierungsfraktionskomponenten können aus dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad 238 und
den Abfallauslass-Strömungspfad 240 herausgeleitet
werden, bis die am weitesten stromabwärts vorhandene interessierende
Komponente die Kreuzungsstelle 237 erreicht hat. Dann kann
ein elektrisches Potential an das Reservoir 239 angelegt
werden, um die Komponenten aus dem Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 236 durch die
Kreuzungsstelle 237 und im Elektrophorese-Hauptströmungspfad 238 zum
Erfassungsbereich 242 und diesen hindurch zu ziehen.
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Eine
Kreuzungsstelle des Elektrophorese-Hauptströmungspfads und des Elektrophorese-Sekundärströmungspfads
an einer "Einleitkreuzung", wie sie beispielsweise
in den 5, 12 dargestellt ist, kann dort
von Vorteil sein, wo eine genaue Zumessung des Probenpfropfens erwünscht ist,
wie beispielsweise dann, wenn der Elektrophorese-Hauptströmungspfad
zur elektrophoretischen Trennung verwendet wird. Eine derartige
Einleitkreuzung kann für
das Einleiten eines geometrisch definierten Pfropfens von Probenkomponenten
aus der interessierenden Fraktion von der Kreuzungsstelle her führen.
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Wenn
andererseits eine genaue Kontrolle eines Probenpfropfens nicht wünschenswert
ist und insbesondere dann, wenn es wünschenswert ist, die gesamte
eluierte Probe durch den Elektrophorese-Hauptströmungspfad zu bewegen, kann eine T-Kreuzungsstelle
bevorzugt sein. Eine derartige Konfiguration kann beispielsweise
dann von Vorteil sein, wenn die Komponenten dadurch analysiert werden,
dass im wesentlichen die gesamte eluierte Fraktion durch ein Array
von Affinitätszonen
stromabwärts von
der Kreuzungsstelle geschickt wird.
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Beispielsweise
ist die 16 ein Diagramm, das den Fluss
bei einer Konfiguration mit einem seriellen Array von Affinitätszonen 244, 246, 248, 250 zeigt.
Jede Affinitätszone
ist mit einem Anreicherungsmedium versehen, das spezifische Affinität zu einer
ausgewählten
Komponente der interessierenden Fraktion zeigt. Beispielsweise kann
die interessierende Fraktion aus DNA in einem Rohzellenlysat bestehen,
wobei das Lysat stromabwärts
in Bezug auf den Anreicherungskanal 230 gebildet sein kann und
im Anreicherungskanal 230 konzentriert und/oder gereinigt
wurde, so dass die eluierte Fraktion, die in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad 238 gelaufen
ist, hauptsächlich
aus einem komplexen Gemisch von DNA-Fragmenten verschiedener Längen und
Basenzusammensetzungen besteht. Jede Hybridisierungszone ist selbst
ein Anreicherungskanal, in dem das Anreicherungsmedium eine immobilisierte
oligonukleotide Sonde mit einer Sequenz komplementär zu der
in einer Ziel-DNA enthält.
Wenn die eluierte Fraktion seriell durch die Affinitätszonen 244, 246, 248, 250 läuft, wird
jede Ziel-DNA, die in der Fraktion vorhanden ist und komplementär zur Sonde
in einer der Affinitätszonen
ist, in dieser Affinitätszone
gebunden. Die Affinitätszonen
sind mit Detektoren 243, 245, 247, 249 versehen,
die so konfiguriert sind, dass sie ein Signal (wie Fluoreszenz oder
Elektrochemielumineszenz) von interessierenden Komponenten, die
in den Affinitätszonen
gebunden sind, erfassen und, wahlweise, quantifizieren. Es kann
jede beliebige Art einer Biomolekülerkennung als Festhalteprinzip
in den Affinitätszonen
verwendet werden, wie es dem Fachmann bekannt ist. Zu nützlichen
Affinitätstypen
gehören
Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen;
das Binden von Poly-dT durch adenylierte DNA; Oligonukleotidsonden
für RNA,
DNA, PNA; Streptavidin-Biotin-Bindung;
Protein-DNA-Wechselwirkungen wie DNA bindendes Protein G oder Protein
A; und Moleküle
mit gruppenspezifischen Affinitäten
wie Arginin, Genzamidin, Heparin und Lectinen. Andere Beispiele
sind für
den Fachmann ersichtlich.
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Demgemäß kann beispielsweise
zum Festhalteprinzip Rezeptor-Liganden-Bindung, Antikörper-Antigen-Bindung
usw. gehören,
und so können Verfahren
und Vorrichtungen gemäß der Erfindung nützlich sein,
um Immunoassays, Rezeptorbindung sassays und dergleichen auszuführen, und
auch für Nukleinsäure-Hybridisierungsassays.
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Alternativ
kann, wie oben angegeben, der Elektrophorese-Hauptströmungspfad
stromabwärts in
Bezug auf die Kreuzungsstelle mit dem Elektrophorese-Sekundärströmungspfad
verzweigen, um ein paralleles Array von Elektrophorese-Hauptströmungspfaden
zu bilden, wie es beispielsweise in der 17 dargestellt
ist. Der Elektrophoreseströmungspfad 238 ist
als doppelt verzweigt dargestellt, so dass vier Elektrophorese-Hauptströmungspfade
stromabwärts
in Bezug auf ihre jeweiligen Abfallreservoire 262, 264, 266, 268 verlaufen.
Die Zweige sind bei diesem Beispiel mit Affinitätszonen 254, 256, 258, 260 mit
Detektoren 253, 255, 257, 259 versehen.
Einschlägige
Eigenschaften des Milieus (wie beispielsweise die Temperatur, der
pH-Wert, Pufferbedingungen und dergleichen) können in vorteilhafter Weise
in jedem Strömungspfadzweig
unabhängig
von den anderen kontrolliert werden, wie es unten unter Bezugnahme
auf die 22 detaillierter angegeben ist.
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Wenn
die Affinitätszonen
parallel angeordnet sind, wie beispielsweise in der 17,
kann jede Affinitätszone
eine Teilmenge der gesamten an den Elektrophorese-Hauptkanal gelieferten
Probe empfangen. Bei dieser Ausführungsform
erscheinen Probenkomponenten, die durch zwei oder mehr der Affinitätsmedien
festgehalten werden können,
in den jeweiligen zwei oder mehr Affinitätszonen. Beispielsweise wird
ein Nukleinsäurefragment,
das eine oder beide von zwei Sequenzen enthält, die komplementär zu zwei
der Sondensequenzen sind, in der Parallelanordnung, in den zwei
Affinitätszonen
festgehalten, die diese zwei Sonden enthalten. Wenn andererseits
die Affinitätszonen
seriell angeordnet sind, wie beispielsweise in der 16,
wird jede stromabwärtige
Affinitätszone
nur durch Probenkomponenten erreicht, die nicht durch eine Affinitätszone stromaufwärts in Bezug
auf sie festgehalten wurden. Hierbei wird beispielsweise ein Nukleinsäurefragment,
das beide von zwei Sequenzen enthält, die komplementär zu Sondensequenzen
in zwei der Affinitätszonen sind,
nur in der weiter stromaufwärts
liegenden zwei Affinitätszonen
festgehalten. Diese Anordnung kann dann von Vorteil sein, wenn es
wünschenswert
ist, Probenkomponenten zu identifizieren, die eine aber nicht eine
andere Komponentenart oder Sequenz enthalten.
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Außerdem können alternativ,
wie oben angegeben, mehrere Elektrophorese-Hauptströmungspfade
zur Behandlung der angereicherten, eluierten Probe vorhanden sein.
Wie es in der 18 beispielhaft dargestellt
ist, können
die Elektrophorese-Hauptströmungspfade 270 die
eluierte Probenfraktion aus dem Elektrophorese-Sekundärströmungspfad 236 über eine
Reihe von Kreuzungsstellen 272 transportieren. Jeder Elektrophorese-Hauptströmungspfad 270 ist
mit Reservoiren stromaufwärts
(274) und stromabwärts
(276) versehen, und jeder ist mit einem Detektor 278 versehen.
Diese Konfiguration kann dazu verwendet werden, eine Gruppe von
Tests oder Assays laufen zu lassen oder Messungen an Teilmengen
einer einzelnen angereicherten Probenfraktion auszuführen, und
dies ist dann besonders nützlich,
wenn, wie oben angegeben, eine genaue Zumessung der Analytmenge
wünschenswert
ist. Wie ersichtlich, kann jeder der Elektrophorese-Hauptströmungspfade 270 mit
einer Affinitätszone
oder einem Array von Affinitätszonen
(wie in der 18 dargestellt) versehen sein,
wie es oben unter Bezugnahme auf die 16, 17 beschrieben
wurde.
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Andernfalls
kann, wie es beispielhaft in der 19 dargestellt
ist, eine Anzahl von Anreicherungskanälen 280 eine Probe
aus einem verzweigenden Probenzuführverteiler 281 empfangen.
Jeder Anreicherungskanal 280 kann während des Eluierungsstadiums
eine angereicherte Fraktion an eine Kreuzungsstelle 288 mit
einem Elektrophorese-Hauptströmungspfad 284 liefern.
Während
des Anreicherungsstadiums (und wahlweise während eines Waschstadiums)
wird die Abfallfraktion über
einen verzweigten Auslassverteiler 283 von den Kreuzungsstellen 288 weg
und durch den Abtransportauslass 240 hindurch zum Abfallreservoir 241 transportiert.
Eine derartige Anordnung kann mit besonderem Vorteil beispielsweise
dann verwendet werden, wenn die interessierende Fraktion ein Gemisch
von DNA ist und wenn es wünschenswert
ist, sowohl Sequenzinformation als auch Größeninformation zu den DNAs
zu erhalten. Die Konfiguration der 19 kann beispielsweise
für eine
Durchflussanalyse analog zu einer Southern-Blot-Analyse verwendet
werden. Bei der herkömmlichen
Southern-Blot-Analyse
werden als erstes DNA-Fragmente an einem Gel getrennt, und dann
werden sie zu einer Membran transferiert, an der Sonden komplementäre Fragmente
binden können.
Die Southern-Blot-Analyse wird hauptsächlich als hochstehende, manuelle
Laborprozedur ausgeführt,
und sie ist sehr arbeitsintensiv, da sie zur Fertigstellung einige
Tage benötigt.
Die Durchflussanalyse gemäß der Erfindung
kann im Wesentlichen automatisiert werden, und sie kann viel schneller
abgeschlossen werden.
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Bei
der Durchflussanalyse ist jeder bis auf einer der Anreicherungskanäle mit einem
sequenzspezifischen Festhaltemedium versehen, wie einer sequenzspezifi schen,
immobilisierten Oligonukleotidsonde, und dieser mindestens eine
der Anreicherungskanäle
ist mit einem generischen Festhaltemedium versehen, das alle DNA-Fragmente
in der Probe bindet. Diese verschiedenen angereicherten Fraktionen
werden im Eluierungsstadium an die Kreuzungsstellen 288 geliefert,
und dann werden sie elektrophoretisch im jeweiligen Elektrophorese-Hauptströmungspfad 284,
von denen jeder mit einem Detektor 286 versehen ist, bewegt.
Die angereicherte Fraktion aus dem Anreicherungskanal, der ein generisches
Festhaltemedium enthält,
enthält
ein Gemisch aller Größen von
DNAs in der Probe, mit einem Bereich elektrophoretischer Beweglichkeiten,
die sequenziell am Detektor vorbeilaufen, was zu einer Reihe von
Signalpeaks führt.
Die angereicherte Fraktion von jedem der anderen Anreicherungskanälen enthält nur DNAs,
die komplementär
zum spezifischen Festhaltemedium im jeweiligen Anreicherungskanal sind.
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Bei
einigen Ausführungsformen
kann es wünschenswert
sein, ein oder mehrere Reagenzien mit der angereicherten Fraktion
stromabwärts
in Bezug auf die Kreuzungsstelle zwischen dem Sekundärströmungspfad
und dem Elektrophorese-Hauptströmungspfad
zu kombinieren. Die 20 ist ein Flussdiagramm, das ähnlich dem
in der 15 dargestellten ist. In der 20 transportiert
ein Reagenzströmungspfad 300 ein
Reagens (oder mehrere Reagenzien) von einem Reservoir 301 zum
Elektrophorese-Hauptströmungspfad 238,
wo das Reagens mit einem oder mehreren Analyten in der angereicherten
Fraktion kombinieren und reagieren kann. Außerdem kann, wie es ersichtlich
ist, wenn der Elektrophorese-Hauptströmungspfad stromabwärts in Bezug
auf die Kreuzungsstelle mit dem Elektrophorese-Sekundärströmungspfad
verzweigt, wodurch in den Zweigen Unterfraktionen gebildet werden,
jeder derartige stromabwärtige
Zweig mit einem Reagenzströmungspfad
versehen sein, der ein Reagens von einem Reservoir transportiert.
Eine derartige Konfiguration kann entweder für eine wiederholte Behandlung
der Unterfraktionen mit einem einzelnen Reagens oder für eine Behandlung
jeder Unterfraktion mit einem anderen Reagens oder für eine gleichzeitige
Behandlung von Unterfraktionen mit zwei oder mehreren Reagenzien
sorgen, wobei jeweils aufgrund der Wechselwirkung mit dem mindestens
einen Analyt in der angereicherten Unterfraktion ein spezielles
gewünschtes
Ergebnis erzeugt wird.
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Die 21 und 22 sind
Flussdiagramme, die denen ähnlich
sind, wie sie in den 16 und 17 dargestellt
sind, wobei mehrere verzweigte Elektrophorese-Hauptströmungspfade vorliegen, wobei
jeder Zweig mit einer Affinitätszone versehen ist.
In der 21 transportiert der Reagenzströmungspfad 300 ein
Reagens (oder mehrere Reagenzien) von einem Reservoir 301 zum
Elektrophorese-Hauptströmungspfad 238,
wo es mit einem oder mehreren Analyten in der angereicherten Fraktion kombinieren
und reagieren kann. Bei dieser Ausführungsform sorgt, da der Reagenzströmungspfad 300 den
Eingriffsabschnitt 238 an einem Punkt stromabwärts von
der ersten Gabelung schneidet, das durch das Reservoir 301 zugeführte Reagens
für eine
wiederholte Behandlung aller Unterfraktionen, die in den stromabwärtigen Zweigen
behandelt werden und in den jeweiligen Affinitätszonen erfasst werden. In
der 22 ist jeder der stromabwärtigen Zweige des Elektrophorese-Hauptströmungspfads 238 mit
einem Reagenzströmungspfad
(302, 304, 306, 308) versehen,
von denen jeder ein Reagens von einem separaten Reagenzreservoir
(303, 305, 307, 309) transportiert.
Eine derartige Konfiguration kann für verschiedene Behandlungen
der Unterfraktionen sorgen, um beispielsweise für eine unabhängige Stringenzkontrolle
paralleler Hybridisierungszonen zu sorgen.
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Beispielsweise
können
zum DNA-Profiling Vorrichtungen verwendet werden, die mit Strömungspfaden
gemäß einer
beliebigen der 18 bis 22 oder
einer Kombination derselben versehen sind. Genauer gesagt, kann
beispielsweise eine Restriktionsfragmentpolymorphie("RFLP")-Analyse dadurch
ausgeführt
werden, dass mehrere verschiedene Einzelort-RFLP-Sonden in Reservoiren 303, 305, 307 und 309 verwendet
werden, wie es in der 22 dargestellt ist. Durch paralleles
Betreiben einer Anzahl von Sonden sollte die sich ergebende Verteilung von
Allelen zu einem schnellen und repräsentativen DNA-Profil führen, während die
Möglichkeit
zufälliger Übereinstimmung
deutlich minimiert wird.
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Die
betrachteten Vorrichtungen können
bei einer Anzahl von Anwendungen verwendet werden, bei denen ein
oder mehrere elektrische Felder an ein Medium angelegt werden, um
Objekte durch dieses zu bewegen. Zu repräsentativen Anwendungen gehören Elektrophorese-Trennanwendungen,
Nukleinsäurehybridisierung,
Ligandenbindung, Präparationsanwendungen,
Sequenzieranwendungen, Syntheseanwendungen, Analytidentifizieranwendungen,
einschließlich
klinischen, umweltbezogenen, Qualitätskontrollanwendungen und dergleichen.
So kann abhängig
von der speziellen Anwendung eine Anzahl verschiedener Fluidproben
in die betrachtete Vorrichtung eingeleitet werden, wobei zu repräsentativen
Proben Körperfluide,
Fluidproben aus der Umwelt, beispielsweise Wasser und dergleichen,
oder andere Fluidproben gehören,
bei denen die Identifizierung und/oder Isolierung eines speziellen
Analyten erwünscht
ist. Abhängig
von der speziel len Anwendung kann eine Anzahl verschiedener Analyten von
Interesse sein, einschließlich
Medikamenten, Toxinen, natürlich
auftretenden Verbindungen wie Peptiden und Nukleinsäuren, Proteinen,
Glycoproteinen, organischen und anorganischen Ionen, Steroiden und
dergleichen. Von speziellem Interesse ist die Verwendung der betrachteten
Vorrichtungen bei klinischen Anwendungen, wo die zu analysierenden
Proben Blut, Urin, Plasma, Cerebrospinalfluid, Tränen, Nasen-
oder Ohrausfluss, Gewebelysat, Speichel, Okularabschabungen, Feinnadelbiopsien
und dergleichen enthalten können,
wobei die Probe wiederbehandelt, beispielsweise mit einem Lösungsmittel kombiniert,
werden kann, was jedoch nicht der Fall sein muss, um die Viskosität zu senken,
die Ionenstärke
zu verringern oder die Löslichkeit
zu erhöhen oder
auf einen speziellen pH-Wert zu puffern, und dergleichen, bevor
eine Einleitung in die Vorrichtung erfolgt. Bei klinischen Anwendungen
gehören
zu den interessierenden Analyten Anionen, Kationen, kleine organische
Moleküle
einschließlich
Stoffwechselprodukten von Medikamenten oder Xenobiotika, Peptide,
Proteine, Glycoproteine, Oligosaccharide, Oligonukleotide, DNA,
RNA, Lipide, Steroide, Cholesterole und dergleichen.
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Die
folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung und nicht zur Beschränkung angegeben.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Trennung hoher
Effizienz von organischen Analyten in einer wässrigen Probe
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Bei
der Trennung organischer Analyte in einer wässrigen Probe wird eine Karte,
wie sie in der 4 dargestellt ist, wie folgt
in Verbindung mit einer Vorrichtung verwendet, die für das Anlegen
geeigneter elektrischer Felder durch Einführen von Elektroden in jedes
Reservoir der Karte sorgt, sowie für Maßnahmen zum Erfassen eines
Analyten sorgt, wenn dieser durch einen Erfassungsbereich 35 läuft. Bei
der Karte 50 verfügt
der Anreicherungskanal 62 über poröse Kügelchen, die mit einer C18-Phase
bedeckt sind, während
die Reservoire und Kanäle,
mit Ausnahme des Abfallreservoirs, einen Boratpuffer von 20 Millimol
enthalten. In jeden Anreicherungskanal 62 werden über eine
Schnittstelle 66 100 µl
einer wässrigen
Probe injiziert. Im Wesentlichen der gesamte organische Analyt in
der Probe bindet reversibel an die porösen, mit C18 beschichteten
Kügelchen,
während
die restlichen Probenkomponenten aus dem Anreicherungskanal 32 in
das Abfallreservoir 63 fließen. 100 µl eines Eluierungspuffers
(90% Methanol/10% Boratpuffer von 20 Millimol mit dem pH-Wert 8,3)
werden dann durch die Schnittstelle 66 in den Anreicherungskanal 62 eingeleitet,
wobei der reversibel gebundene organische Analyt in den Eluierungspuffer
hinein freigesetzt wird. Wegen des kleinen verwendeten Volumens
des Eluierungspuffers ist die Konzentration des Analyten im Volumen
des Eluierungspuffers im Vergleich zur Analytkonzentration in der
ursprünglichen
Probe auf das 100- bis 1000-fache erhöht. Dann werden die Abdichtungen über den Reservoiren 57 und 56 entfernt,
und es wird ein elektrisches Feld zwischen die Elektroden 61 und 60 gelegt,
was dafür
sorgt, dass sich der in 57 vorhandene Puffer zu 56 hin
bewegt, wobei die Bewegung der Pufferfront den Eluierungspfropfen
mit dem konzentrierten Analyten zur Kreuzungsstelle 51 hin
bewegt. Dann wird zwischen Elektroden 58 und 59 ein
Spannungsgradient gelegt, was dafür sorgt, dass sich das schmale
Band des im Volumen des Eluierungspuffers vorhandenen Analyten durch
den Trennkanal 52 bewegt, was zu einer Trennung der organischen
Analyten mit hoher Effizienz führt.
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Der
obige Versuch wird auch bei einer modifizierten Version der in der 4 dargestellten
Vorrichtung ausgeführt.
Bei der modifizierten Vorrichtung verfügt diese, zusätzlich zum
Reservoir 57, über
ein Eluierungspufferreservoir, das ebenfalls in Fluidverbindung
mit dem Anreicherungskanal 62 steht. Bei diesem Versuch
wird die Probe in den Anreicherungskanal 62 eingeleitet,
wodurch die im Eluierungspuffer vorhandenen organischen Analyte
reversibel an die im Anreicherungskanal vorhandenen mit der C18-Phase
beschichteten Kügelchen
binden. Ein elektrisches Feld wird zwischen eine im Eluierungspufferreservoir
vorhandene Elektrode und die Elektrode 60 für eine begrenzte
Zeitperiode angelegt, die dazu ausreicht, dafür zu sorgen, dass sich 10 µl des Eluierungspuffers
durch den Anreicherungskanal bewegen und jeglichen reversibel gebundenen
organischen Analyten freisetzen. Nachdem sich der Eluierungspuffer
in den Anreicherungskanal bewegt hat, wird zwischen die Elektroden 61 und 60 ein
Spannungsgradient gelegt, was zu einer Bewegung des Puffers von 57 nach 56 sorgt,
wodurch das definierte Volumen des organischen Analyten mit dem
Eluierungspuffer zur Kreuzungsstelle 51 transportiert wird, wie
oben beschrieben.
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Beispiel 2
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Probenanreicherung
unter Verwendung paramagnetischer Kügelchen zur Anreicherung innerhalb
einer integrierten Mikrofluidvorrichtung
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Als
Ausführungsformen
der aktuellen Erfindung werden Versuchsprotokolle aufgrund biomagnetischer
Trennverfahren angegeben. Bei einer Mikrofluidvorrichtung, die so
konfiguriert ist, wie es allgemein in der 23 dargestellt
ist und unter Bezugnahme auf diese beschrieben wurde, wird eine
Rohprobe aus einem speziellen Ziel unter Verwendung von mit einem
Affinitätsmedium
behandelten Magnetkügelchen
behandelt, um ein Ziel mit Bindungsaffinität für das spezielle Affinitätsmedium
festzuhalten. Derartige Magnetkügelchen
werden beispielsweise von Dynal, Inc., New York unter dem Namen
Dynabeads® vermarktet.
Dynabeads sind superparamagnetische, monodisperse Polystyrol-Mikrokügelchen,
die mit Antikörpern
oder anderen Bindungsobjekten beschichtet sind, die selektiv an
ein Ziel binden, das aus Zellen, Genen, Bakterien oder anderen Biomolekülen bestehen
kann oder solche enthalten kann. Der Ziel-Dynabead-Komplex wird dann unter Verwendung
eines Magnets isoliert. Die sich ergebende biomagnetische Trennprozedur
ist einfach, schnell und zuverlässig,
wobei die Dynabeads als generisches Anreicherungsmedium zum Isolieren
spezieller Ziele aus komplexen, heterogenen, biologischen Gemischen
dienen. Derartige magnetische Anreicherungsmedien können gemäß der Erfindung
bei einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, einschließlich beispielsweise
der Zellbiologie, der Molekularbiologie, der HLA-Gewebetypisierung
und der Mikrobiologie. Hier werden zwei veranschaulichende Beispiele
speziell angegeben, nämlich
Verfahren zur DNA-Reinigung und zur Zellenisolierung.
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Als
erstes wird die auf einem Mikrokanal basierende Vorrichtung allgemein
beschrieben, und dann wird das Verfahren unter Verwendung von Kügelchen
von Dynal zur biomagnetischen Trennung allgemein beschrieben.
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Die
integrierte Mikrofluidvorrichtung, wie sie beispielhaft in der 23 dargestellt
ist, verfügt über einen
Elektrophorese-Hauptströmungspfad 394 in Verbindung
mit einem Anreicherungskanal, der über eine Festphasentrenn(SPE)kammer 380 verfügt, die mit
einem stromabwärtigen
Abfallreservoir 391 verbunden ist. Der Elektrophorese-Hauptströmungspfad,
der aus einem Erfassungsbereich 393 für die angereicherte Probe und
einem Fluidauslassreservoir 395 besteht, ist an einer T-Kreuzungsstelle 388 mit
dem Elektropho rese-Sekundärströmungspfad 384 verbunden.
Bei dieser Konfiguration erfolgt ein einfaches Handhaben auf elektrokinetische
Weise durch Steuern des elektrischen Potentials an den geeigneten
Elektroden, die in den Einlassreservoirs für den Waschpuffer 373 und
den Eluierungspuffer 375 sowie den Auslassreservoirs 391 und 395 platziert sind.
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Die
Dynabeads und dann die interessierende Probe werden durch einen
jeweiligen Einspritzeinlassport 379 bzw. 377 in
die Vorrichtung eingeleitet. Innerhalb der Anreicherungskammer kommt
es zu einer Inkubation der heterogenen Suspension der Probe und
der für
ein vorgegebenes Ziel spezifischen Dynabeads, wodurch diese durch
spezifische Absorption an den speziellen Festhalteobjekten an der Oberfläche der
Kügelchen
mit dem Ziel binden können.
Die Immobilisierung des Ziel-Kügelchen-Komplexes
seitens der Anreicherungskammer 380 erfolgt magnetisch.
Dies ist manuell dadurch möglich,
dass ein Seltenerd-Permanentmagnet
benachbart zur Anreicherungskammer platziert wird. Bei einer anderen Ausführungsform
der Erfindung wird ein automatisiertes Protokoll unter Verwendung
einer elektromagnetischen Einrichtung dazu verwendet, das angelegte,
auf die SPE-Kammer wirkende Magnetfeld zu kontrollieren.
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Bei
Abschluss des Schritts zur magnetischen Immobilisierung kann ein
im Waschpufferreservoir 373 enthaltenes Waschmedium über den
Pfad 374 in den Anreicherungskanal 380 und durch
diesen bewegt werden. Während
des Spülens
der Probe läuft das
Abfallfluid über
den Elektrophoreseströmungspfad 384 aus
der Anreicherungskammer 380 heraus, dann durch die T-Kreuzungsstelle 388,
und dann durch den Abtransportauslass 392 zum Abfallreservoir 391 heraus.
So wird der Überstand
aus den Waschschritten aus dem System entfernt, ohne dass der Abfall
durch den Elektrophorese-Hauptströmungspfad 394 geleitet
werden müsste.
Diese Ausführungsform
der Erfindung bildet eine vorteilhafte Maßnahme zum Isolieren und Anreichern
eines Zielbiomoleküls
aus einer Rohprobe, ohne dass zunächst der Erfassungsbereich 393 verschmutzt
würde.
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Beispiel 3
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DNA-Reinigung
aus Gesamtblut
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Es
ist ein Versuchsverfahren unter Verwendung einer Elektrophoresemikrovorrichtung,
wie sie schematisch in der 23 dargestellt
ist, geschaffen, bei der biomagnetische Kügelchen von Dynal® als Anreicherungsmedium
zum Extrahie ren und Reinigen von Genom-DNA aus Gesamtblut verwendet werden.
Die Blutquelle kann eine kleine, getrocknete, forensische Probe
auf einem Objektträger
(beispielsweise in der Größenordnung
eines Nanogramms), eine Teilmenge von frisch entnommenem Arterienblut
(kleine Menge von 10 µl)
oder Knochenmark (ungefähr
5 µl)
sein. Es wird ein Protokoll, das auf schnelle DNA-Isolierung und
-Eluierung anwendbar ist, angegeben, um eine automatisierte Prozedur zum
Behandeln von Gesamtblut auf der Vorrichtung der 23 zu
demonstrieren, die Teilmengen von DNA zur Verstärkung und Analyse oder zur
direkten Analyse ohne Verstärkung
liefert. Der Prozess beinhaltet die folgenden Schritte:
- 1. Laden des Reagens und der Probe;
- 2. Zelllysis/Festhalten der DNA;
- 3. Wiederholte DNA-Waschvorgänge;
und
- 4. Eluierung der DNA.
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Jeder
dieser Schritte wird nun detaillierter erörtert.
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Bei
dieser Ausführungsform,
bei der kommerziell abgepackte Reagenzien verwendet werden, erfolgt
das Beladen mit den biomagnetischen Trennmedien, der Lysislösung und
der Probe mittels speziell konzipierter Einfüllports, um Unterschiede bei
den Reagenzien und der Probe zu berücksichtigen. Die Reagenzien
DIRECTTM von Dynal, zu denen die Lysislösung und
Magnetkügelchen
gehören,
werden zunächst
direkt in die Festphase-Extraktionskammer 380 durch den
manuellen Injektionsport 379 eingefüllt, gefolgt von einem manuellen
Einfüllen
der Blutprobe in die SPE-Kammer über
den Einfüllport 377. Alternativ
können
andere kommerzielle Reagenzien verwendet werden, bei denen die Nukleinsäuren-Lysislösung und
die Kügelchen
nicht gemeinsam als Materialsatz verpackt sind, sondern die stattdessen getrennt
zugeführt
werden. In diesem Fall kann eine Lysislösung elektrokinetisch vom Einlassreservoir 371 aus
in die SPE-Kammer 380 geladen werden. Magnetkügelchen,
wie sie beispielsweise von Japan Synthetic Rubber geliefert werden,
werden als nächstes
entweder vom Einfüllort 379 oder
elektrokinetisch vom Einlassreservoir 369 aus geladen.
Bei der letzteren Vorgehensweise werden die Kügelchen durch elektromagnetisches
Festhalten, mechanische Einrichtungen (z. B. Membran, Maschengitter
oder Agarosegelpfropfen), die unmittelbar stromabwärts von
der SPE-Kammer im Strömungspfad 384 platziert
ist oder beides, in die Kammer eingegrenzt. Wenn die Kammer einmal
mit Kügelchen
und Lysislösung
gefüllt
ist, wird die DNA-Probe über
den Einfüllport 377 oder
kinetisch über
ein Probeneinlassreservoir zugesetzt, das mit einer Elektrode versehen ist,
die als Paar mit einer Elektrode stromabwärts von der Kammer vorliegt.
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Innerhalb
der Anreicherungskammer können die
Blutprobe, die Lysislösung
und die Dynabeads für fünf Minuten
inkubieren, in welcher Zeit die Zellen lysieren. Dann können freigesetzte
Nukleinsäuren
an den Festhalteobjekten absorbieren, die immobilisiert an der Oberfläche der
Mikroteilchen vorhanden sind, um einen DNA-Kügelchen-Komplex zu bilden.
Um die Zelllysis zu verbessern, kann ein Mischvorgang beispielsweise
dadurch erzielt werden, dass die Zuführkanäle so angeordnet werden, dass
die Ströme der
Kügelchen,
der Probe und der Lysislösung
sich vermischen. Das Mischen kann elektrokinetisch durch eine vernünftige Kontrolle
der angelegten elektrischen Felder unterstützt werden. Durch periodisches
Umkehren der Polarität
der im Einlass- und Auslassreservoir 271 und 391 platzierten
Elektroden ist es möglich,
das Blut-Lysispuffer-Gemisch
elektrisch auf schwingende Weise in der SPE-Kammer zu bewegen. Um
die auf die Zellen ausgeübte
mechanische Scherung weiter zu erhöhen, können in das SPE-Kammergehäuse öffnungsartige
Strukturen eingeformt werden.
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Folgend
auf die magnetische Isolierung und das Festhalten des DNA-Kügelchen-Komplexes seitens
der SPE-Kammer erfolgt ein Spülen
durch elektrokinetischen Transport der im Reservoir 373 enthaltenen
Waschpufferlösung
durch die Kammer und aus dem Abfallreservoir 391 heraus.
Nach diesem Spülen
für 45
Sekunden werden die Kügelchen
dadurch wieder in der Lösung
suspendiert, dass das Magnetfeld aufgehoben wird und dann eine Inkubation
für eine
Minute im Waschpuffer erfolgen kann. Gemäß demselben Protokoll wird
das Spülen
zwei weitere Male wiederholt, wodurch das Zelllysat und der Überstand
aus jedem der Waschschritte aus dem System entfernt werden können, ohne
dass der Abfall, einschließlich
PCR-Inhibitoren, durch den Elektrophorese-Hauptströmungspfad 394 laufen
müsste.
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Der
abschließende
Schritt des Reinigungsprozesses ist eine Eluierung der DNA. Wiederum werden
die Festhaltekügelchen
mit der gebundenen DNA elektromagnetisch immobilisiert, bevor der
Eluierungspuffer elektrokinetisch vom Reservoir 373 in die
SPE-Kammer transportiert wird. Um eine quantitative Eluierung zu
erzielen, ist eine genaue Manipulation der Elektrodenpotentiale
erforderlich, damit der Puffer nicht durch die Kammer laufen kann
und so die gereinigte DNA vorzeitig auswaschen kann. Alternativ
kann ein Eluierungspufferpfropfen durch Verwenden einer Einfüllkreuzungsstelle
(in der 23 nicht dargestellt) in die
Kammer bewegt werden, wie es von D. Benvegnu et al. im am 4. Mai
1999 und am 18. Juni 1997 (Attorney Docket No. A-64739/RFT/BK) eingereichten
US-Patent Nr. 5,900,130 beschrieben ist. Wenn sich der Eluierungspuffer
in der SPE-Kammer befindet, werden die Kügelchen durch Aufheben des
Magnetfelds wieder suspendiert, und dann kann eine Inkubation im
Eluierungspuffer für
zwei Minuten erfolgen, was eine abschließende DNA-Desorptionskinetik erlaubt. Nach Abschluss
der Eluierung der DNA werden die Kügelchen in der SP-Kammer elektromagnetisch
immobilisiert, und die gereinigte DNA wird elektrokinetisch als
Pfropfen zur Analyse in den Elektrophorese-Hauptströmungspfad 394 eingeleitet.
Der Elektrophoreseströmungspfad 395 kann
ein ausgeklügeltes
Mikrofluidsystem (in der 23 nicht dargestellt)
bilden, das aus mehreren Mikrokanälen für eingeschränkte Enzymverdauung, Blot-Hybridisierungen,
einschließlich
Southern- und Schlitz/Punkt-Blots, elektroforetische Fragmentsortierung
und quantitative PCR-Analyse, u. a. bestehen kann. Diese Ausführungsformen
der Erfindung werden jedoch bei diesem Beispiel nicht weiter erörtert.
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Zusammengefasst
gesagt, erlaubt es das obige Protokoll, für PCR bereitstehende Teilmengen gereinigter
DNA in weniger als zehn Minuten und ohne Eingriff durch den Benutzer
zu isolieren, wenn einmal die Rohprobe in die Mikrofluidvorrichtung
eingebracht wurde. Zu anderen Vorteilen des Verfahrens gehören die
winzigen Reagensmengen, die bei einem vorgegebenen Versuch verbraucht
werden, zusätzlich
dazu, dass nicht mehr arbeitsintensive Ausfäll- oder Zentrifugierschritte
erforderlich sind.
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Beispiel 4
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Zollanreicherung
unter Verwendung immunomagnetischer Isolation
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Es
wird ein Versuchsprotokoll angegeben, bei dem biomagnetische Kügelchen
von Dynal® als Anreicherungsmedium
zum Isolieren von Zielzellen verwendet sind. Die Prozedur ist derjenigen ähnlich, die
oben zur DNA-Reinigung beschrieben wurde. Wie beim Beispiel 3 wird
das Ziel selektiv durch Kügelchen
festgehalten, die mit speziellen Bindungsobjekten beschichtet sind,
die sich immobilisiert an der Oberfläche der paramagnetischen Mikroteilchen
befinden. Dynabeads sind in verschiedenen Formen zubereitet wie
folgt verfügbar:
- 1. Vorbeschichtet mit affinitätsgereinigten
monoklonalen Antikörpern
zu vielen menschlichen Zellmarkern, einschließlich T-Zellen, T- Zellenuntergruppen,
B-Zellen, Monozyten, Stammzellen, Myeloidzellen, Leukozyten und
positiven Zellen der HLA-Klasse II;
- 2. beschichtet mit Sekundärantikörpern auf Maus-,
Ratten- oder Kaninchenimmunoglobuline zur Isolierung von B-Zellen,
T-Zellen und T-Zellenuntergruppen
von Nagetieren;
- 3. in unbeschichteter oder tosylaktivierter Form für eine anwendungsspezifische
Beschichtung mit irgendeinem vorgegebenen Biomolekül; oder
- 4. in Streptavidin-beschichteter Form zur Verwendung bei biotinylierten
Antikörpern.
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In
einer Mikrofluidvorrichtung, die im wesentlichen so konfiguriert
ist, wie es in der 23 dargestellt ist, wird eine
homogene Zellensuspension unter Verwendung elektrokinetischer und
magnetischer Manipulationsmethoden behandelt, um gereinigte Teilmengen
von Zellen zur weiteren Verarbeitung und Analyse zu präparieren.
Eine biomagnetische Trennung ist manuell oder gemäß einem
automatisierten Format unter Verwendung einer elektromagnetischen
Steuerung des an die SPE-Kammer gelegten Magnetfelds möglich. Das
folgende Protokoll mit vier Schritten wird als repräsentative
Ausführungsform der
Erfindung angegeben.
- 1. Laden der Zielzellen
und der Reagenzien, einschließlich
biomagnetischer Trennmedien:
Laden der Lösung von Magnetkügelchen
in die SPE-Kammer 380, entweder direkt über den Einfüllport 379 oder
elektrokinetisch vom Einlassreservoir 371 aus, das eine
Lösung
von für
ein vorgegebenes Ziel spezifischen Dynal-Kügelchen enthält; oder
direktes Zusetzen der Probe in die SPE-Kammer, die mit einer Lösung von
Dynabeads gefüllt
ist, was mittels des Probeneinlassports 377 erfolgt.
- 2. Festhalten von Zellen unter Verwendung von Dynabeads, die
an ein spezielles Ziel binden können:
die
Probe und die Kügelchen
können
in der SPE-Kammer für
2,5 Minuten inkubieren, die Adsorption wird unter Verwendung eines
elektrokinetischen Mischschritts verbessert, und Zielzellen binden
an Dynabeads, um einen Ziel-Kügelchen-Komplex
zu bildeln.
- 3. Waschen der Zielzellen durch Immobilisieren des Kügelchen-Zielzelle-Komplexes:
Die
festgehaltenen Kügelchen,
die das Bindungsziel enthalten, werden elektromagnetisch immobilisiert,
und es erfolgt ein Spülen
mit Waschpufferlösung
durch elektrokinetische Manipulation:
Entfernen des Überstands
durch Kontrollieren von Elektrodenpotentialen in solcher Weise,
dass Waschpuffer vom Einlassreservoir 373 durch die SP-Kammer zum Abfallauslass 391 geleitet
wird;
Stoppen des Flusses nach 45 Sekunden und erneutes Suspendieren
des Ziel-Kügelchen-Komplexes
in Lösung
durch Aufheben des Magnetfelds;
Inkubieren des Ziel-Kügelchen-Komplexes
im Waschpuffer für
eine Minute;
Wiederholen der obigen Waschschritte für zwei weitere
Male.
- 4. Eluierung der Zielzellen unter Verwendung von Reagenzien
DETACHaBEADTM von Dynal:
elektromagnetisches
Immobilisieren der Festhaltekügelchen
und Einfüllen
der Lösung
DETACHaBEADTM in die SP-Kammer 380:
elektrokinetisches
Bewegen des auf einem Antikörper
basierenden Reagens von Dynal aus dem Eluierungspufferreservoir 373 durch
Manipulieren durch Elektrodenpotentialen in solcher Weise, dass
vermieden wird, dass der Eluierungspuffer durch die Kammer laufen
kann, oder alternativ kann eine Einfüllkreuzungsstelle (in der 22 nicht
dargestellt) dazu verwendet werden, einen Eluierungspufferpfropfen
in die SP-Kammer zu füllen;
erneutes
Suspendieren der Kügelchen
durch Aufheben des Magnetfelds;
Inkubieren der im Eluierungspuffer
suspendierten Kügelchen
für zwei
Minuten, um eine endliche Desorptionskinetik zu ermöglichen;
nach
Abschluss der Zieleluierung werden Kügelchen elektromagnetisch immobilisiert,
isolierte
Zielzellen können
zur weiteren Behandlung und Analyse elektrokinetisch aus der SPE-Kammer
in den Elektrophorese-Hauptkanal transportiert werden.
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Zelltrennvorgänge unter
Verwendung von Mikrofluidvorrichtungen und -verfahren sorgen für eine kostengünstige Alternative
zu herkömmlichen Strömungszytometrietechniken.
Außerdem
ermöglichen
es Mikrofluidvorgehensweisen, wenn sie mit einer biomagnetischen
Trenntechnologie kombiniert werden, eine Anreicherung und Erkennung
von Zellen, die zu erhöhter
Empfindlichkeit und verringertem Hintergrundrauschen führen. Auf
Mikrofluiden basierende, magnetische Iso lierverfahren unterziehen
die Zielsubstanzen einer minimalen Belastung, und sie können demgemäß Zellen
intakt und lebensfähig
halten, bereit zur direkten Verwendung bei Umkehrtranskription in
Verbindung mit Polymerasekettenreaktionsverstärkung (RT-PCR).
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Verfahren
auf Mikrofluidbasis verwenden keine Phenolextraktionsvorgänge, Ethanolausfällvorgänge oder
Zentrifugiervorgänge,
und sie verwenden wenig toxische Reagenzien. Trennvorgänge werden ohne
Verwendung teurer Anlagen ausgeführt,
und sie sind stark skalierbar.
-
Beispiel 5
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Werkzeuge
zum kosteneffektiven Krankheitsmanagement
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Wenn
Gentherapien vom Labor zum Krankenbett übergehen, werden Therapien
und Diagnosen enger gekoppelt. Demgemäß wird das Überwachen der Wirksamkeit von
Pharmazeutika auf DNA-Basis unter Verwendung biologischer Instrumente
am Krankenbett entscheidend dafür,
den Erfolg dieser Behandlungen zu gewährleisten. Genauer gesagt,
ist eine Vorrichtung auf Mikrofluidbasis zum Integrieren der Zellensammlungs-
und Isolierprozesse mit aufstrebenden Molekularverfahren zur DNA-Verstärkung und
-Erfassung vielversprechend, um diesen Markterfordernissen zu genügen. So
ist es durch Kombinieren von Verfahren, wie sie in dieser Anmeldung
beschrieben sind (insbesondere die Beispiele 3 und 4), möglich, in
einem Instrument über
die Fähigkeit
einer kosteneffizienten Krankheitsprognose und eine Überwachung
zu verfügen,
um den Arzt dabei zu unterstützen,
die Geeignetheit einer vorgegebenen Gentherapie zu bewerten. Derartige
effektive Krankheitsmanagementstrategien haben, zusätzlich zu
anderen pharmakogenetischen Vorgehensweisen, das Potential einer
weiten Verbreitung, da die Postgenomära schnell näher kommt.
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Um
diese Ausführungsform
der Erfindung zu veranschaulichen, wird ein System zum Verwalten von
blutbasierten Erkrankungen angegeben.
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Als
Hintergrund sei angegeben, dass ererbte Blutstörungen die üblichsten Gendefekte sind,
die Menschen beeinträchtigen.
Die World Health Organization schätzt, dass ungefähr 5 % der
Weltbevölkerung
Träger
verschiedener Typen von Hämoglobinstörungen sind
und dass jedes Jahr ungefähr 300.000
Fälle diagnostiziert
werden. Sichelzellenanämie
und β-Thallasämie sind
die zwei üblichs ten
Hämoglobinerkrankungen,
die unter Verwendung von Gentherapien behandelt werden können.
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Von
speziellem Interesse bei der Behandlung von Hämoglobinerkrankungen sowie
bei der Überwachung
des Fortschritts ihrer Behandlung sind die Sammlung und Isolierung
hämatopoetischer Stammzellen.
Unter Verwendung der in der 23 dargestellten
Mikrofluidvorrichtung ist in Kombination mit der Verwendung von
Dynal-Reagenzien zur Selektion menschlicher hämatopoetischer Progenitorzellen,
wie es beim Beispiel 4 beschrieben ist, ein schnelles und einfach
verwendbares Verfahren möglich,
um die gewünschte
Stammzellenisolierung zu bewerkstelligen. Beispielsweise isoliert
1 ml an Dynabeads M-450 CD34 ungefähr 8 × 107 Zellen.
100 μl (eine
Einheit) von DETACHaBEAD CD 34 wird dazu verwendet, 4 × 107 (100 μl)
Dynabeads M-450 CD 34 loszulösen.
Durch dieses Selektionssystem für
Progenitorzellen isolierte Zellen sind rein (95 % aus Knochenmark,
90 % aus Kapillar- und Aderblut) und phänotypisch unverändert. Mit
derselben Vorrichtung ist eine DNA-Analyse, einschließlich einer
Genexpressionsüberwachung,
unter Verwendung molekulargenetischer Verfahren möglich, wenn
einmal die Stammzellen isoliert und analysiert sind. So sollten
sich bioanalytische Vorrichtungen und Verfahren auf Mikrofluidbasis,
wie bei dieser Ausführungsform
der Erfindung beschrieben, als wertvolle Werkzeuge zum Krankheitsmanagement
an dieser aufstrebenden Schnittstelle zwischen der Molekularmedizin
und der Diagnose erweisen.
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Beispiel 6
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Festphasenisolation
und Anreicherung
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Eine
Festphasenextraktion (SP) eines speziellen Ziels aus einer heterogenen
Mischung erfolgt bei der folgenden Ausführungsform der Erfindung unter
Verwendung der selektiven Oberflächeneigenschaften
zielspezifischer Mikropartikel und mechanischer Maßnahmen
zum Zurückhalten
der Kügelchen innerhalb
der SP-Kammer. Obwohl biomagnetische Trennverfahren derzeit attraktiv
sind, da kommerzielle Reagenzien für eine große Anzahl von Bioforschungsanwendungen
leicht verfügbar
sind, sind andere Vorgehensweisen auf Basis unmagnetischer Mikrofluide
möglich,
um vergleichbare Trennungen zu erzielen. Bei ähnlichen Ausführungsformen
wie den obigen erfolgt eine Festphasenanreicherung auf Mikrofluidformat.
Kügelchen
mit zielspezifischen Bindungsobjekten können unter Verwendung mechanischer
Maßnahmen,
einschließlich
Filtriermembranen oder Maschensieben, in der Anreicherungskammer zurückgehalten
werden. Außerdem
kann ein Agarosegel (vor dem Versuch aus dem Abfallreservoir 391) am
Auslass der Anreicherungskammer 380 in den Kanal 384 injiziert
werden, um zu verhindern, dass die Kügelchen entweichen, wobei jedoch
immer noch die Wasch- und Eluierungspuffer durch die stark porösen Medien
laufen können.
So kann jede der beim Beispiel 2 zur Zielisolierung und -reinigung
aus komplexen Mischungen beschriebenen Ausführungsformen, zumindest dem
Prinzip nach, realisiert werden, ohne dass die Verwendung von Magnetfeldern
erforderlich wäre.
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Aus
den obigen Ergebnissen und der Erörterung ist es ersichtlich,
dass zweckdienliche, integrierte Elektrophoresevorrichtungen mit
Mikrokanal offenbart sind, die für
deutliche Vorteile gegenüber
aktuell verfügbaren
CE- und MCE-Vorrichtungen
sorgen. Da die betrachteten Vorrichtungen Mikrokanäle als Elektrophoreseströmungspfade
enthalten, sorgen sie für alle
Vorteile von CE- und
MCE-Vorrichtungen, einschließlich
kurzer Laufzeiten, der Fähigkeit,
kleine Probenvolumina zu verwenden, hoher Trenneffizienz und dergleichen.
Da die betrachteten integrierten Vorrichtungen über einen Anreicherungskanal
verfügen,
können
sie zur Analyse komplexer Probenmatrizen verwendet werden, die Analytkonzentrationen
im Bereich von Femtomol bis Nanomol enthalten. Jedoch treten wegen
der speziellen Positionsbeziehung des Anreicherungskanals und des
Elektrophorese-Hauptströmungspfads
die Mängel
von Onlinekonfigurationen, wie eine Bandverbreiterung und dergleichen,
bei den betrachteten Vorrichtungen nicht auf. Da die betrachteten
Vorrichtungen integriert und kompakt sind, sind sie leicht handhabbar,
und sie können
leicht mit automatisierten Vorrichtungen verwendet werden. Schließlich können die
Vorrichtungen, durch geeignete Auswahl der Materialien, als wegwerfbar
hergestellt werden. Wegen ihrer Vielseitigkeit und der Empfindlichkeit,
die sie zeigen, sind die betrachteten Vorrichtungen zur Verwendung
bei einer großen
Anzahl von Anwendungen geeignet, einschließlich klinischen Elektrophoreseassays.
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Nach
dem die Erfindung nun vollständig
beschrieben wurde, ist es für
den Fachmann ersichtlich, dass an ihr viele Änderungen und Modifizierungen vorgenommen
werden können,
ohne vom Schutzumfang der beigefügten
Ansprüche
abzuweichen.