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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung
zum Ausschleusen definierter Fraktionen von Proben nach einer präparativen
oder analytischen Flüssigphasentrennung
in planaren, miniaturisierten Analysensystemen aus dem Trennkanal
in einen weiteren Kanal bzw. in eine weitere analytische Vorrichtung.
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Planare, miniaturisierte Analysensysteme bestehen
aus Bauteilen mit eingearbeiteten Kanälen, in denen der Transport
und/oder die Auftrennung gelöster
Analyte beispielsweise mittels Kapillarelektrophorese oder Isotachophorese
erfolgt. Ein derartiges Kanalsystem kann Y-förmige Verzweigungen und/oder
X-förmige
Kreuzungen (siehe 1)
aufweisen. Dabei sind die Winkel zwischen den Kanälen frei
wählbar.
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Für
das Einschleusen von Probenmaterial wird üblicherweise eine X-förmige Anordnung der Kanäle benutzt,
zum Ausschleusen eine Y-Verzweigung.
Die Probenbestandteile werden dazu durch Anlegen einer Spannung
an den Enden der Kanäle elektrokinetisch
transportiert. Bei Y-verzweigten
Kanälen
kann beispielsweise der elektrokinetische Transport umgelenkt werden,
wenn die elektrischen Potentiale von dem einen Kanal auf den anderen
abzweigenden Kanal geschaltet werden. Auf diese Weise kann eine
Fraktion einer Probe durch den abzweigenden Kanal ausgeschleust
werden.
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Die Steuerung derartiger Ausschleusevorgänge erfolgt
entweder zeitlich definiert oder aktiv gesteuert bei vorheriger
Durchgangsanalyse. Bei der zeitgesteuerten Ausschleusung wird sowohl
die exakte Kenntnis des Elektropherogramms als auch eine exakte
Reproduzierbarkeit des Trennvorgangs vorausgesetzt. Der zu isolierende
Analyt kann also nur aus einer bekannten Probe nach vorhergehender experimenteller
Bestimmung seiner Trennzeit ausgeschleust werden. Besonders für die Kapillarelektrophorese
ist dieses Verfahren ungeeignet, da es durch Anlagerung von oberflächenaktiven
Substanzen zu einer Veränderung
des Zeta-Potentials an den Kanalwänden kommt. Dadurch tritt eine
Modulation der elektroosmotischen Kraft und somit auch eine Modulation
des zeitlichen Musters des Elektropherogramms auf. Aus diesem Grund
wird eine zeitgesteuerte Ausschleusung meist nur zur Kontrolle oder
Bestätigung
durchgeführt.
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Wesentlich genauer ist eine Ausschleusung der
Analyte nach vorangegangener direkter Analyse. Von F. von Heeren
et al. (Anal. Chem 68(13) (1996), 2044–2053) wird die aktiv gesteuerte
Ausschleusung von Natrium-Fluoreszein
beschrieben. Die Position des Fluoreszeins während des Trennprozesses kann kontinuierlich
von einem Beobachter mit einer geeigneten optischen Vorrichtung
verfolgt werden. Sobald sich die Fluoreszein-Bande an der Ausschleusungsstelle
befindet, wird manuell ein Schaltvorgang ausgelöst, der zum Ausschleusen führt. Jedoch
könnten selbst
bei Automatisierung dieses Systems lediglich farbige oder fluoreszierende
Substanzen detektiert und gezielt ausgeschleust werden. Dies bedeutet eine
starke Einschränkung.
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Andere Detektorsysteme für Ausschleusevorrichtungen
konnten bislang nicht direkt in miniaturisierte, planare Analysensysteme
integriert werden, so daß die
Detektion und Separierung von Substanzen meist nach deren Austritt
aus dem Analysensystem erfolgt.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist es deshalb, für
miniaturisierte planare Analysensysteme eine Vorrichtung zum Ausschleusen
von Substanzen bereitzustellen, die direkt in die Analysensysteme
integriert ist und aktiv gesteuert werden kann. Bevorzugterweise
sollte die Vorrichtung zum Ausschleusen mit Detektionsvorrichtungen
kombinierbar sein, die auf unterschiedlichen Prinzipien beruhen;
somit wäre das
Ausschleusen von Analyten vielseitig anwendbar.
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Für
planare Vorrichtungen für
elektrophoretische Trennverfahren wurde eine Anordnung umfassend
zumindestens drei Transportelektroden, eine Detektionsvorrichtung
und eine Schaltvorrichtung gefunden, die es erlaubt, gezielt Fraktionen
während des
Trennvorgangs auszuschleusen. In bevorzugten Ausführungsformen
ist die Detektionsvorrichtung als elektrische Leitfähigkeits-
Impedanz- oder Potentialmeßvorrichtung
ausgebildet.
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Gegenstand der Erfindung ist daher
eine Vorrichtung zum Ausschleusen von Fraktionen einer Probe für planare
mikrostrukturierte Analysensysteme, die im wesentlichen aus einem
Kanalsystem mit mindestens einer Y-Verzweigung , mindestens drei Transportelektroden
und mindestens einer Detektionsvorrichtung vor besagter Verzweigungsstelle
des Kanalsystems und einer elektrischen Schaltvorrichtung bestehen.
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Bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist
eine Vorrichtung zum Ausschleusen, in der die Detektionsvorrichtung
ein elektrochemischer Detektor ist.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung
ist weiterhin die Verwendung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung in einem planaren
mikrostrukturierten Analysensystem.
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1 zeigt
beispielhaft eine X-Kreuzung (X) und eine Y-Verzweigung (Y) eines
Kanalsystems entsprechend dem Stand der Technik.
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2 veranschaulicht
das Prinzip der Ausschleusung mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
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3 und 4 zeigen schematisch Analysensysteme,
in die eine erfindungsgemäße Vorrichtung zum
Ausschleusen von Substanzen integriert ist.
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Analysensysteme, in die eine erfindungsgemäße Vorrichtung
zum Ausschleusen von Substanzen integriert werden kann, sind planare
mikrostrukturierte Systeme, die zur Auftrennung von Substanzen dienen.
Derartige überwiegend
zweidimensionale Analysensysteme, bieten durch ihre geringe Größe und einfache
Herstellung viele Vorteile gegenüber makrospkopischen
Analysensystemen. Die Analysensysteme können zusätzliche Analysevorrichtungen
oder Vorrichtungen zur mikropräparativen
Derivatisierung beinhalten. Durch die Möglichkeit, Detektoren bzw.
eine erfindungsgemäße Vorrichtung
zum Ausschleusen schon bei der Herstellung von Analysensystemen
direkt in diese Systeme zu integrieren, können Substanzen schon während oder
nach der Trennung in dem Analysensystem analysiert und separiert
werden. Beispielsweise in Analysensysteme, in denen Substanzen nicht
nur getrennt und analysiert werden, sondern auch weiteren z.B. Derivatisierungsschritten
unterzogen werden, können
auch mehr als eine erfindungsgemäße Vorrichtung
zum Ausschleusen integriert werden.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Ausschleusen
besteht aus einem Detektorsystem, das ein Kanalsegment direkt vor
dem Ausschleusungskanal analysiert, und einem verzweigten Kanalsystem
mit entsprechenden Transportelektroden. Sobald der Detektor anzeigt,
daß sich
der gewünschte
Analyt kurz vor der Abzweigung befindet, werden die Transportelektroden
an den Enden der Kanäle umgeschaltet.
Der weitere Transport erfolgt nicht mehr entlang des Trennkanals
sondern in den abzweigenden Ausschleusungskanal. Dieser Vorgang wird
beendet, wenn der Detektor anzeigt, daß die Analytbande die Ausschleusungsstelle
passiert hat. Auf diese Weise lassen sich definierte Teile einer Probe
präzise
vom Rest der Probe trennen.
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Der Vorgang des Ausschleusens umfaßt demnach
folgende Schritte:
- – Die räumlich aufgetrennte Probe wird
durch entsprechende elektrische Spannung zu einer Verzweigungsstelle
transportiert.
- – Ein
Detektor, der dicht vor der Verzweigungsstelle sitzt, mißt die vorbeiströmenden Komponenten
oder eine Markersubstanz, die jeweils den Anfang und das Ende eines
auszuschleusenden Bereichs kennzeichnet.
- – Sobald
die gewünschte
Komponente detektiert wird, werden die Spannungen so umgeschaltet, daß der Fluß in den
abzweigenden Kanal gelenkt wird.
- – Nachdem
die gewünschte
Komponente den Detektor passiert hat, wird die Spannung zurückgeschaltet.
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Auf diese Weise ist nun ein Teil
der Probe räumlich
vom Rest der Probe getrennt.
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Die Steuerung des gesamten Vorgangs,
besonders das Umschalten der Potentiale zwischen den Elektroden,
erfolgt bevorzugt mittels einer elektronischen Schaltvorrichtung.
Derartige Vorrichtungen und deren Anwendung sind dem Fachmann bekannt.
Die abgetrennten Substanzen können
anschließend
innerhalb des Analysensystems weiterführenden Schritten, wie gesonderten
Analysen, Derivatisierungen etc. unterzogen werden. Weiterhin können sie
auch gezielt aus dem Kanalsystem des Analysensystems entnommen werden.
Dazu wird das Kanalsystem mit zusätzlichen Ausgängen versehen.
Diese Ausgänge
befinden sich vorzugsweise in den Ausschleusungskanälen und
werden mittels eines Fluidikanschlusses, wie einer dichtschließenden Pumpe
oder Pumpen und Ventilen, abgeschlossen. Typischerweise schließt sich
direkt eine Kapillare an, über
die die abgetrennte Fraktion in weitere Behältnisse oder Geräte außerhalb
des Analysensystems überführt werden
kann. Befindet sich demnach eine separierte Fraktion in einem Ausschleusungskanal, so
kann sie hydromechanisch, beispielsweise elektroosmotisch oder mittels
Mikropumpen, aus einem Ausgang heraus aus dem Analysensystem entfernt werden.
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Bei der ausgeschleusten Fraktion
kann es sich sowohl um einen störenden
Bestandteil handeln, der abgesondert werden soll, damit der Rest
der Probe weiter untersucht werden kann, als auch um eine Fraktion,
die von dem Rest der Probe getrennt weiteren Analyse- oder Derivatisierungsschritten
unterzogen werden soll. Die so zu analysierenden und separierenden
Probenbestandteile können
ionisch gelöst, emulgiert,
suspendiert, kolloidal oder biologisch zellulär in vorwiegend wässriger
Lösung
vorliegen.
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Basis der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist
ein auf dem zweidimensionalen Analysensystem befindlicher Detektor.
Da miniaturiserte Analysensyteme je nach ihrer konkreten Anwendung
sehr unterschiedlich strukturiert sein können, muß der Detektor an beliebigen
Stellen des Analysensystems positionierbar sein. Für die erfindungsgemäße Vorrichtung können sowohl
Detektoren eingesetzt werden, deren maßgeblichste Teile integriert
werden können,
wie
- – Leitfähigkeitsdetektoren
( kapazitive, induktive, ohmsche Messung),
- – elektrochemische
Detektoren (z.B. Amperometrie, ISFET),
- - elektrische Temperaturmessung,
aber auch externe
Detektoren, bei denen nur Teile, z.B. Linsen oder Faseroptik, in
das Analysensystem integriert werden, wie - – optische
Detektoren ( z.B. Brechungsindex, Temperatur, Absorption, Fluoreszenz,
Raman, Lumineszenz)
- - NMR
- - radioaktives Labeling
- - magnetisches Labeling
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Als Detektorvorrichtung werden erfindungsgemäß bevorzugt
Leitfähigkeitsdetektoren
und optische Detektoren eingesetzt. Für optische Detektoren kann
beispielsweise eine Aufnahmevorrichtung für Lichtleitfaseroptik integriert
werden.
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Für
Analysensysteme, in denen Substanzen elektrophoretisch aufgetrennt
werden, wird die Forderung einer universellen Detektionsmethode
besonders gut von elektrischen Detektionsmethoden wie der Leitfähigkeitsmessung
erfüllt.
Die Charakterisierung der Analyte erfolgt dabei über deren spezielle elektrische
Leitfähigkeit.
Eine bestimmte Substanz generiert in einem gegebenen Elektrolytsystem
immer die gleiche relative Leitfähigkeit.
Dies gilt für
aufeinander folgende Messungen in einem miniaturisiertem Analysensysten
und auch für
Messungen, die in mehreren miniaturisierten Analysensystemen eines Bautyps
erfolgen.
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Bevorzugt wird in der erfindungsgemäßen Vorrichtung
daher eine elektrische Leitfähigkeitsmessung
verwendet, die im Falle von direkt kontaktierenden Elektroden den
elektrischen Strom oder den elektrischen Spannungsabfall erfaßt oder
aber im Falle von galvanisch entkoppelten Elektroden über die
Messung des dielektrischen Widerstandes erfolgt.
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Zur Integration eines Leitfähigkeitsdetektors in
einem zweidimensionalen Analysensytem müssen Leitfähigkeitselektroden an beliebigen
Stellen des Systems, vor allem kurz vor Abzweigungen entlang des
Kanalsystems, integriert werden. Dies ist nur durch eine besondere
Art des Aufbaus eines solchen Systems möglich. Zum einen muß das Kanalsystem gas-
und flüssigkeitsdicht
verschlossen sein, zum anderen muß gewährleistet werden, daß chemisch
inerte Elektroden präzise
und reproduzierbar an den gewünschten
Positionen angebracht werden können.
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Nur durch spezielle Techniken zur
Herstellung zweidimensionaler Analysensysteme können die obengenannten Anforderungen
erfüllt
werden. Die erfindungsgemäßen Systeme
bestehen typischerweise aus mindestens zwei Bauteilen, einem Deckel,
der mit den Elektroden versehen ist, und einem mikrostrukturierten
Substrat. Nach Produktion der Bauteile werden diese durch ein spezielles
Bonding-Verfahren zusammengefügt.
Auf diese Weise ist es möglich,
die erfindungsgemäße Ausschleusevorrichtung
in planare Analysensysteme zu integrieren.
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Die Bauteile der Systeme bestehen
bevorzugt aus kommerziell erhältlichen
thermoplastischen Kunststoffen, wie PMMA (Polymethylmethacrylat), PC
(Polycarbonat) oder PMP (Polymethylpenten), cycloolefinischen Copolymeren
oder duroplastischen Kunststoffen, wie beispielsweise Epoxidharzen.
Bevorzugterweise bestehen alle Bauteile eines Systems aus demselben
Material.
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Die Bauteile können nach dem Fachmann bekannten
Methoden hergestellt werden. Bauteile, die Mikrostrukturen enthalten,
können
beispielsweise durch etablierte Verfahren, wie Heißprägen, Spritzguß oder Reaktionsguß, produziert
werden. Besonders bevorzugt werden Bauteile eingesetzt, die nach bekannten
Techniken zur Massenproduktion vervielfältigt werden können. Mikrostrukturierte
Bauteile können
Kanalstrukturen mit Querschnittsflächen zwischen 10 und 250000 μm2 besitzen. Für die erfindungsgemäße Ausschleusevorrichtung
muß das
Kanalsystem neben Bereichen zur Probenaufgabe und einem Trennkanal
mindestens eine von einem Trennkanal ausgehende X- oder Y-Verzweigung
aufweisen. Zur Integration mehrerer Ausschleusungsvorrichtungen
können
an beliebigen Stellen des Kanalsystems weitere Verzweigungen eingeführt werden.
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Die Elektroden, die für die endungsgemäße Ausschleusevorrichtung
benötigt
werden, sind Transportelektroden, die sich an den Enden der verzweigten
Kanäle
befinden und ein Umschalten des Potentials zwischen den beiden Kanälen ermöglichen,
sowie Detektionselektroden, die bevorzugt zwischen 40 mm und 0,1 μm vor der
Abzweigung positioniert sind.
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Zur Integration der Elektroden in
das Analysensystem bzw. die erfindungsgemäße Vorrichtung, werden die
Elektroden bevorzugt an einem Bauteil des Systems, dem Deckel angebracht.
Sie müssen dazu
eine hinreichende Haftfestigkeit auf dem Kunststoffbauteil aufweisen.
Dies ist sowohl für
das Zusammenfügen
der einzelnen Bauteile als auch für die späteren Einsatz der Analysensysteme
von Bedeutung. Werden bei der Verbindung der Bauteile z.B. Klebstoffe
eingesetzt, darf der Klebstoff die Elektrode nicht von der Kunststoffoberfläche ablösen. Weiterhin
sollten die Elektroden aus chemisch inerten Materialien, wie z.B.
Edelmetallen (Platin, Gold) bestehen.
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Die Metallisierung von Kunststoffoberflächen erfolgt
typischerweise durch elektrochemisches Abscheiden von Metallen aus
Metallsalzlösungen.
Hierfür
ist es allgemein üblich,
in einem mehrstufigen Prozeß zunächst die
Kunststoffoberfläche
chemisch oder mechanisch vorzubehandeln, einen diskontinuierlichen
Primer aufzubringen und abschließend die elektrochemische Abscheidung
durchzuführen.
Beschreibungen dieser Metallisierungstechniken finden sich z.B.
in
US 4,590,115 ,
EP 0 414 097 ,
EP 0 417 037 und bei Wolf und Gieseke
(G.D. Wolf, H. Gieseke, „Neues
Verfahren zur ganzflächigen
und partiellen Metallisierung von Kunststoffen," Galvanotechnik 84, 2218–2226, 1993).
Den naßchemischen
Verfahren gemeinsam ist, daß relativ
aufwendige Vorbehandlungsprozesse notwendig sind, um ausreichende
Haftfestigkeiten zu erreichen.
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In
DE
196 02 659 wird das haftfeste Aufbringen von Kupfer auf
mehrphasige Polymermischungen mittels Aufdampfen oder Sputtern beschrieben. Als
Ursache der guten Haftung wird die Zusammensetzung der Polymermischungen
genannt. Demnach müssen
die Mischungen Polyarylensulfide, Polyimide oder einen aromatischen
Polyester enthalten.
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Der Einfluß von Plasmavorbehandlungen
zur Erzielung besserer Hafteigenschaften von Metallen auf Kunststoffoberflächen wird
von Friedrich (J. Friedrich, „Plasmabehandlung
von Polymeren",
kleben & dichten
41, 28–33,
1997) am Beispiel verschiedener kommerziell erhältlicher Thermoplaste zusammengefaßt.
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Besonders bevorzugt werden die Elektrodenstrukturen
auf den Kunststoffbauteilen mittels einer neuartigen Zwei-Schicht-Technik
erzeugt. Dazu wird zunächst
eine haftvermittelnde Schicht aus Chromoxid erzeugt. Im Gegensatz
zu Edelmetallen zeigt Chromoxid hervorragende Hafteigenschaften auf
Kunststoffoberflächen.
Zudem ist Chromoxid im Gegensatz zu elementarem Chrom und anderen Übergangsmetallen
wesentlich beständiger
gegenüber
Redoxprozessen. Auf die Haftschicht aus Chromoxid wird dann das
Edelmetall, wie beispielsweise Platin oder dessen Legierungen oder
Gold, aufgetragen.
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Das selektive Aufbringen von Chromoxid und
der darauf abzuscheidenden Edelmetallschicht auf Kunststoffsubstraten
erfolgt bevorzugt im lift-off-Verfahren
oder mittels der Schattenmaskentechnik oder der Strukturierung von
zunächst
ganzflächig
aufgebrachten metallischen Schichten. Diese Verfahrenstechniken
sind Standardprozesse der Mikrostrukturtechnik. Im folgenden werden
die für
die Zwei-Schicht-Technik erforderlichen Arbeitsschritte für die genannten
Verfahren kurz beschrieben.
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Lift-off-Verfahren: Das selektiv
zu metallisierende Kunststoffbauteil wird mit einem Photolack beschichtet.
Dieser Photolack darf dabei das zu metallisierende Kunststoffteil
nicht bzw. nur leicht anlösen. Für PMMA hat
sich z.B. ein Photolack der Firma Allresist, Berlin (AR 5300/8)
als geeignet erwiesen. Nach Belichtung und Entwicklung der zu metallisierenden
Strukturen erfolgt das Aufbringen der metallischen Schichten in
einer Sputteranlage. Das Aufbringen der Chromoxidschicht erfolgt
während
des Sputterprozesses durch das Einleiten von Sauerstoff in das typischerweise
verwendete Argon-Plasma der Sputteranlage. Als Sputtertarget wird
ein konventionelles Chrom-Target verwendet. Typische Chromoxid- Schichtdicken sind
20–50
nm. Alternativ kann direkt ein Chromoxid-Target eingesetzt werden.
Das Sputtern von Platin bzw. dessen Legierungen oder von Gold wird
direkt anschließend
unter Standardbedingungen, d.h. im Argon-Plasma, durchgeführt. In dem
eigentlichen lift-off-Prozeß wird
der noch vorhandene Photolack und mit diesem die auf dem Lack befindliche
Metallschicht in einem Entwickler der Firma Allresist (AR 300–26) von
dem Kunststoffbauteil abgelöst.
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Schattenmaskentechnik: Das selektiv
zu metallisierende Kunststoffteil wird mit einer sogenannten Schattenmaske
abgedeckt. Diese hat an den zu metallisierenden Bereichen Aussparungen.
Durch diese hindurch werden die Metallschichten in Analogie zum lift-oft-Verfahren
aufgesputtert.
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Strukturierung flächiger metallischer Schichten:
Auf einem selektiv zu metallisierenden Kunststoffteil wird zunächst ganzflächig eine
Metallschicht in Analogie zum bereits beschriebenen Sputterprozeß aufgebracht.
Diese wird in nachfolgenden Prozeßschritten, entweder durch
selektiven Abtrag mittels z.B. Laserablation (Gold und Platin) oder
z.B. durch selektives naßchemisches Ätzen, strukturiert. Zur
Strukturierung mittels naßchemischem Ätzen wird
auf die Metallschicht zunächst
ein Photolack (Hoechst AG, Deutschland; AZ 5214) aufgebracht, belichtet
und entwickelt. Gold wird dann in Cyanid-Lösung in den belichteten Bereichen
abgelöst.
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Die Haftfestigkeit von mit Chrom
als auch mit Chromoxid als Haftschicht mittels Sputtertechnik hergestellten
Elektroden wurde mit Hilfe von Abreißtests überprüft. Die Haftfestigkeit der
Chromoxidschichten ist deutlich größer. Auch bei Ultraschallbehandlung
in alkalischer Lösung
sind die Metallschichten, welche mit Chromoxid als Haftschicht hergestellt
wurden, verglichen mit Metallschichten, die mit Chrom als Haftschicht
hergestellten wurden, deutlich beständiger.
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Nach Produktion und Vorbereitung
der einzelnen Bauteile werden diese zusammengefügt. Bevorzugterweise ist ein
Bauteil, das Substrat, mikrostrukturiert und mit rückseitigen
Bohrungen zum Befüllen
der Kanäle
und/oder Kontaktieren der Elektroden versehen. Desweiteren hat sich
auch die Verwendung einer sogenannten Dichtlippe, d.h. einer die Kanalstrukturen
vollständig
umschließenden
Erhebung auf den Substraten mit Höhen zwischen typischerweise
0,5 bis 5 μm,
hinsichtlich des Verklebeprozesses als sehr vorteilhaft erwiesen.
Das andere Bauteil, der Deckel, dient zur Abdeckung und ist z.B. bei
elektrophoretischen Analysensystemen mit den Elektroden versehen.
In diesem Fall wird der Deckel erfindungsgemäß als Elektrodendeckel bezeichnet. Zum
Zusammenfügen
der Bauteile wird bevorzugt zunächst
auf das mikrostrukturierte Bauteil an den Stellen, an denen keine
Strukturierung vorliegt, ein Klebstoff aufgebracht. Die Schichtdicke
beträgt
bevorzugterweise nicht mehr als 0,5 bis 10 μm. Typischerweise erfolgt die
Auftragung mittels einem aus der Drucktechnik bekannten flächigen Walzenautrag. Der
verwendete Klebstoff darf die Oberfläche der Bauteile nicht oder
nur sehr schwach anlösen,
damit die Elektroden beim Verklebungsprozeß nicht vom Klebstoff abgelöst oder
unterbrochen werden. Bevorzugterweise wird daher als Klebstoff das
Produkt NOA 72, Thiolacrylat der Firma Norland, New Brunswick,
NJ 08902 USA, verwendet. Dieser Kleber wird photochemisch ausgehärtet. Es
können
jedoch für das
Verfahren auch andere Arten von Klebern verwendet werden, die die
oben genannten Voraussetzungen erfüllen.
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Nach dem Aufbringen des Klebstoffs
wird das zweite Bauteil mit den Dünnschichtelektroden beispielsweise
auf einer Belichtungsmaschine zu dem Substrat geeignet positioniert
und aufgepreßt. Bevorzugt
ist die Verwendung von starken Glasplatten als Preßfläche, so
daß direkt
die photochemische Härtung
des Klebers durch Bestrahlung mit einer Hg-Lampe (Emissionswellenlänge 366
nm) durchgeführt
werden kann.
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Die Positionierung des Deckels auf
dem Substrat kann für
den Klebevorgang typischerweise visuell unter manueller Kontrolle,
passiv mechanisch mit Hilfe ein Einrastvorrichtung, optisch mechanisch unter
Zuhilfenahme von optischen Justagemarken oder elektrisch mechanisch
mit Hilfe von elektrischen Marken (Kontakten) erfolgen.
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In einer anderen bevorzugten Ausführungsform
wird das mit den Elektroden versehene Bauteil auf den Bereichen,
die beim Zusammensetzen der beiden Bauteile nicht über einem
Kanal liegen oder elektrisch kontaktiert werden müssen, mit
dem Kleber benetzt. Hierfür
wird beispielsweise ein in der Drucktechnik bekanntes Verfahren
(Tampon-Druck) verwendet.
Das Bauteil mit den Kanalstrukturen wird anschließend geeignet
zu seinem Gegenstück
positioniert und aufgepreßt.
Die Aushärtung
erfolgt wie oben beschrieben.
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Kontaktierung der Transport- und
Detektionselektroden sowie die automatische Regelung und das Umschalten
des elektrischen Flusses erfolgen nach dem Fachmann bekannten Methoden.
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Auf diese Weise können Transport- und Detektionselektroden
derart in die mikrostrukturierten Analysensysteme integriert werden,
daß eine
oder mehrere endungsgemäße Ausschleusevorrichtungen
erzeugt werden. Die Integration der Ausschleusevorrichtungen erfordert
weder zusätzlichen
Aufwand noch wird die Qualität
(Stabilität,
Größe etc.) der
Analysensysteme beeinflußt.
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Somit stellt die erfindungsgemäße Vorrichtung
eine wichtige zusätzliche
Funktionalität
für planare
mikrostrukurierte Analysensysteme dar. Sie ermöglicht erstmals das Design
multifunktioneller mikrostrukturierter Analysensysteme. Die Systeme
sind nicht nur in der Lage, Proben aufzutrennen, sie können vielmehr
Proben trennen, identifizieren und selektieren, ohne daß die Probe
das Analysensystem verläßt. Dies
eröffnet auch
die Möglichkeit,
lediglich bestimmte Probenbestandteile nach der Ausschleusung aus
dem Analysensystem auszuführen,
oder diese im System weiteren Derivatisierungs- oder Analyseschritten
zu unterwerfen.
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Durch die beschriebenen Herstellverfahren der
Elektroden und Bondingverfahren können erstmals geschlossenen
Mikrokanalstrukturen erzeugt werden, in denen Elektroden an beliebigen
Stellen innerhalb der Kanäle
positioniert werden können. Strukturierte
Bauteile (Substrate) können
flüssigkeits-
und gasdicht mit beispielsweise Elektrodendeckeln versehen werden.
Durch die Verwendung zumeist kommerziell erhältlicher Kunststoffe und einfacher
Verarbeitungsschritte können
derartige Analysensysteme kostengünstig und in großen Zahlen
produziert werden. Sie erfüllen
alle Anforderungen, die an ein variabel einsetzbares, geanu arbeitendes Analysensystem
gestellt werden müssen:
- – Sie
zeigen hohe Dimensions- und Volumenstabilität der Kanäle.
- – Durch
die Festigkeit der Klebeverbindungen sind sie im Inneren der Kanäle druckstabil.
- – Es
besteht eine große
Variabilität
bezüglich
der verwendbaren Kunststoffe.
- – Es
können
chemisch inerte Materialien für
Bauteile und Elektroden verwendet werden.
- – Alle
vier Kanalwände
bestehen bevorzugt aus dem gleichen Material.
- – Die
Elektroden sind auf ±10 μm genau an
beliebigen Stellen der Kanäle
positionierbar.
- – Die
Kontaktflächen
der Elektroden sind frei von Verunreinigungen durch Klebstoff.
- – Die
Elektroden können
leicht angeschlossen werden.
- – Die
Systeme zeigen geringen Innenwiderstand und erlauben potentiell
hohe Stromdichten.
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2 veranschaulicht
das Ausschleusen einer Substanz mithilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung.
Es werden drei verschiedene Stadien des Ausschleusens in den Bildern
A, B und C gezeigt. Die schematisierte Ausschleusungsvorrichtung
besteht aus einem Y-verzweigten Kanalsystem mit den Transportelektroden 1, 2 und 3 an
den Enden der Kanäle.
Das Kanalstück
zwischen Elektrode 1 und 2 dient als Trennkanal,
der zu Elektrode 3 abzweigende Kanal ist der Ausschleusungskanal.
Kurz vor Abzweigung des Ausschleusungskanals befindet sich im Trennkanal
eine Detektorelektrode 4. In Bild A wandern die zu trennenden
Substanzen 5 und 6 aufgrund eines Potentials zwischen
den Elektroden 1 und 2 entlang des Trennkanals.
Bild B zeigt den Moment, in dem die gesuchte Substanz 5 die
Detektorelektrode passiert. Das detektierte Signal, beispielsweise
die spezifische relative Leitfähigkeit,
bewirkt ein Umschalten des Potentials, so daß nun ein Potential zwischen
Elektrode 1 und 3 besteht. Dadurch wandert, wie
in Bild C gezeigt, Substanz 5 in den Ausschleusekanal und
wird so von Substanz 6, die sich im Trennkanal befindet,
separiert. Nachdem Substanz 5 den Detektorbereich passiert
hat und in den Ausschleusungskanal gewandert ist, kann das Potential
erneut umgeschaltet werden, damit keine weiteren Substanzen in den
Ausschleusungskanal gelangen.
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3 zeigt
schematisch ein Beispiel eines miniaturisierten planaren Analysensystems
mit integrierter erfindungsgemäßer Vorrichtung
zum Ausschleusen von Proben. Das System enthält einen Trennkanal T1 mit
zwei Transport- bzw. Leistungselektroden E3 und E5 an den Enden
und zwei Detektionselektroden E1 und E2 kurz vor der Verzweigungsstelle
V des Kanalsystems. An der Verzweigungsstelle V zweigt ein Kanal
ab, der sich wiederum dreifach verzweigt. An den Enden befinden
sich ein Reservoir P, ein Mischungsreaktor R und ein weiteres Reservoir
mit einer Leistungselektrode E4. Wird nun ein Substanzgemisch entlang
des Trennkanals T1 aufgetrennt, kann mithilfe der Detektionselektroden E1
und E2 festgestellt werden, wann die gewünschte Probensubstanz an die Verzweigungsstelle
V des Kanalsystems gelangt. In diesem Moment wird das Potential
umgeschaltet, so daß nun
eine Potentialdifferenz zwischen E5 und E4 besteht. Dadurch wandert
die ausgewählte
Substanz in die Abzweigung des Kanalsystems. Nachdem die Detektionselektroden
E1 und E2 anzeigen, daß die
Substanz die Verzweigungsstelle passiert hat, kann das Potential
erneut umgeschaltet werden. Die in die Abzweigung abgesonderte Substanz
kann nun mechanisch durch einen Flüssigkeitsstrom aus dem Reservoir
bei E4 in den Mischungsreaktor R transportiert werden. Zusätzlich können durch
einen ähnlichen
Flüssigkeitsstrom
ausgehend von dem Reservoir P parallel weitere Substanzen, z.B.
Reaktanden zur Derivatisierung, in den Mischungsreaktor geleitet
werden, wo sie sich mit der Probensubstanz mischen und gegebenenfalls
mit dieser reagieren.
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4 zeigt
schematisch ein Beispiel eines miniaturisierten planaren Analysensystems
mit integrierter erfindungsgemäßer Vorrichtung
zum Ausschleusen von Proben, einer Vorrichtung zur Aufgabe definierter
Probenvolumina und einem Trennkanal. Ein solchen Analysensystem
bietet die Möglichkeit,
ein definiertes großes
Probenvolumen aufzugeben, dieses beispielsweise mittels ITP aufzutrennen, durch
die endungsgemäße Ausschleusevorrichtung eine
bestimmte Fraktion der Probe zu separieren und optional die abgetrennte
Fraktion oder den Rest der Probe erneut aufzutrennen und zu analysieren
oder aus dem System zu entfernen. Die Vorrichtung zur Probenaufgabe
besteht aus den Kanalabschnitten K1 und K2, die von den Fluidikanschlüssen F1
und F2 bzw. F2 und F3 begrenzt werden. Als Fluidikanschlüsse dienen
typischerweise dichtschließende
Mikropumpen oder Mikropumpen und Ventile. Das Volumen des Kanalabschnitts
K1 beträgt
typischerweise 5 oder 10 μl,
das des Kanalabschnitts K2 0,5 oder 1 μl. Durch Öffnen des Fluidikanschlusses
F2 und gleichzeitiges Befüllen
des Kanalabschnitts K1 mit der Probenlösung über den Fluidikanschluß F1 wird ein
durch das Volumen von K1 bestimmtes definiertes Volumen der Probe
in das Kanalsystem gefüllt. Ein
größeres Volumen
kann aufgegeben werden, wenn statt des Fluidikanschlusses F2 der
Fluidikanschluß F3
geöffnet
wird. Dann ergibt sich das aufgegebene Volumen der Probe aus der
Summe der Volumina der Kanalabschnitte K1 und K2. Soll das Volumen
der aufgegebenen Probe dagegen kleiner sein, wird durch Öffnen der
Fluidikanschlüsse
F2 und F3 lediglich der Kanalabschnitt K2 befüllt. Durch Variation der Größe der Kanalabschnitte
K1 und K2 oder auch durch Hinzufügen
weiterer mit Fluidikanschlüssen
begrenzter Kanalabschnitte kann so das Aufgabevolumen variiert und
an die entsprechenden Anforderungen der Probe angepasst werden.
Die Auftrennung der Probe erfolgt in dem sich anschließenden Kanalsystem
(K3, K4, K5). Dazu befinden sich an den Enden des gesamten Kanalsystems,
d.h. anschließend
an K1, K4 und K5 jeweils Flüssigkeits- oder
Pufferreservoire R1, R2 und R3 sowie Leistungselektroden L1, L2
und L3. Die Pufferreservoire können über die
Fluidikanschlüsse
F1, F4 bzw. F5 befüllt
werden. Falls ediglich Kanalabschnitt K1 zur Probenaufgabe verwendet
wird, kann zusätzlich
Kanalabschnitt K2 zur Verlängerung
der Trennstrecke eingesetzt werden. Die Trennung der Probe kann z.B.
bei rein analytischen Fragestellungen über Kanalabschnitt K3 bis zu
Kanalabschnitt K5 ausgedehrt werden. Die Detektion erfolgt dann
mittels der kurz vor R3 angebrachten Detektionselektroden D3 und D4.
Soll eine Fraktion der Probe von dem Rest getrennt werden, wird
die erfindungsgemäße Vorrichtung
zum Ausschleusen verwendet. Diese wird gebildet durch den Trennkanalabschnitt
K3, die Verzweigungsstelle Vz, die beiden abzweigenden Kanalabschnitte
K4 und K5, die vor der Verzweigunsstelle Vz befindlichen Detektionselektroden
D1 und D2 sowie durch eine nicht in der Abbildung dargestellte Schaltvorrichtung
zur Steuerung der Leistungselektroden. Sobald die gewünschte Fraktion
während
der Trennung die Detektionselektroden D1 und D2 passiert, kann das
Potential der Leistungselektroden L1, L2 und L3 entsprechend modifiziert
werden. Falls zunächst
der Transport von L3 zu L2 erfolgte, kann die Fraktion durch Umschalten
auf eine Potentialdifferenz zwischen L3 und L1 an der Verzweigungsstelle Vz
in den Kanal K4 ausgeschleust werden. Nachdem die Fraktion Vz passiert
hat, wird durch erneutes Umschalten der Rest der Probe wieder in
K5 transportiert. Die ausgeschleuste Fraktion kann dann über den
Fluidikanschluß F4
aus dem Analysensystem entnommen werden. Der in K5 verbliebene Rest
der Probe kann über
die Detektionselektroden D3 und D4 erneut analysiert werden. Genauso
kann die auszuschleusende Fraktion durch andere Schaltung der Leistungselektroden
an Vz in Kanalabschnitt K5 ausgeschleust werden, während der
Rest der Probe in Kanalabschnitt 4 transportiert wird.
In diesem Fall kann die ausgeschleuste Fraktion an D3/D4 erneut detektiert
werden. Weiterhin besteht die Möglichkeit, das
Kanalsystem mit zwei unterschiedlichen Puffersystemen zu befüllen und
so zwei unterschiedliche Trennungen direkt hintereinander durchzuführen. Dazu
werden die Kanalabschnitte K3 und optional zusätzlich K2 mit dem ersten Puffersystem
gefüllt.
Ab der Verzweigungsstelle Vz werden die Kananlabschnitte K4 und
K5 mit dem zweiten Puffersystem befüllt. Die erste Trennung erfolgt
entlang K2/K3. An Vz kann dann eine Fraktion der Probe in Kanalabschnitt K5
ausgeschleust werden oder auch die gesamt Probe in diesen Kanalabschnitt überführt werden.
Sobald die Probe diesen Kanalabschnitt mit dem anderen Puffersystem
erreicht, erfolgt dann die zweite Trennung. Die Kontrolle der beiden
Trennungen erfolgt über
die Detektionselektroden D1 und D2 für die erste Trennung und das
optionale Ausschleusen, sowie mit D1/D2 für die Kontrolle der zweiten
Trennung. Auf diese Weise können
z.B. eine isotachophoretische Trennung und eine elektrophoretische
Trennung oder auch zwei isotachophoretische Trennungen kombiniert
werden.
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Auch ohne weitere Ausführungen
wird davon ausgegangen, daß ein
Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann.
Die bevorzugten Ausführungsformen
und Beispiele sind deswegen lediglich als beschreibende, keineswegs als
in irgendeiner Weise limitierende Offenbarung aufzufassen.
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Die vollständige Offenbarung aller vor-
und nachstehend aufgeführten
Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen
sind durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.