JP3477918B2 - キャピラリ電気泳動チップ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、キャピラリ電気泳動チ
ップに関する。 【０００２】 【従来の技術】キャピラリ電気泳動法（ＣＥ）は、ペプ
チド、タンパク質、核酸、糖等の生体成分の分析の他、
光学分割、同位体の分離等、極めて近い成分を高速で分
離するに適した方法であり、臨床診断や医薬品、環境物
質のモニタリング等に広く利用される。 【０００３】細管を利用したキャピラリ電気泳動法は分
離度が高く、しかも、溶媒や試料の消費量が極めて少な
いという利点がある一方、このように試料の量が微量で
あるため、濃度感度が高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬ
Ｃ）の１／１０〜１／１００程度と低く、検出感度がキ
ャピラリの内径に依存するという欠点がある。また、キ
ャピラリの内表面の状態は泳動液によって敏感に変化す
るため、泳動液を交換する際には十分なコンディショニ
ング作業が必要である。このコンディショニング作業を
簡略化するために泳動液毎にキャピラリを準備しておく
ことも可能であるが、この場合にはキャピラリ毎にその
履歴を管理しておく必要がある。 【０００４】このような問題点を解決するため、キャピ
ラリ電気泳動チップが開発された。これは図７に示すよ
うに、１対の透明平板（ガラス板、石英板等）５１、５
２から成り、一方の透明平板５２の表面に泳動用のキャ
ピラリ溝５４、５５を形成し、他方の透明平板５１のそ
の溝５４、５５の端に対応する位置にリザーバ５３を設
けたものである。その使用法は次の通りである。両透明
平板５１、５２を図７（ｃ）に示すように重ね、いずれ
かのリザーバ５３から泳動液を溝５４、５５の中に注入
する。そして、短い方の溝５４の一方の端のリザーバ５
３に試料を注入し、その溝５４の両端のリザーバ５３に
電極を差し込んで所定時間だけ高電圧を印加する。これ
により、試料は溝５４の中に分散される。次に、長い方
の溝５５の両端のリザーバに電極を差し込み、泳動電圧
を印加する。これにより、両溝５４、５５の交差部分５
６に存在する試料が溝５５内を電気泳動する。従って、
溝５５の適当な位置に紫外可視光分光光度計、蛍光光度
計、電気化学検出器等の検出器を配置しておき（この部
分が検出セルとなる）、分離成分の検出を行なうことに
より、試料の分析を行なうことができる。 【０００５】このように、キャピラリ電気泳動チップ
は、２枚のガラス板にマイクロマシニングで溝や孔を形
成するのみで、電極、検出セル、リザーバ等が一体化さ
れた電気泳動装置が構成されるため、大量生産が可能で
あり、非常に低コストで製造することができる。このた
め、各泳動液、或いは各試料・各分析条件毎にチップを
用意しておくことができ、分析条件の変更等が極めて簡
単に且つ短時間で行なえるという特長を有する。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】細管を使用する電気泳
動或いは上記チップによる電気泳動のいずれの場合も、
血漿、血清、尿などの生体試料中に存在する薬物をキャ
ピラリ分析しようとすると、タンパク質、脂質等の複雑
なマトリックスがキャピラリ内面に吸着され、流路内壁
の物理的・化学的状態が変化して、分離に影響を及ぼ
す。また、タンパク質のピークは一般に広がり易いた
め、分析目的成分のピークと干渉し、分析を妨害する。 【０００７】このような問題を避けるため、従来、生体
試料のキャピラリ分析を行なう場合は予め、溶媒抽出な
どによる多段階のクリーンアップ操作を行なう必要があ
ったが、これは非常に時間のかかる、面倒な作業であっ
た。 【０００８】本発明はこのような課題を解決するために
成されたものであり、その目的とするところは、生体試
料に対しても溶媒抽出等による多段階のクリーンアップ
操作を必要とせず、短時間で分析を行なうことのできる
キャピラリ電気泳動チップを提供することにある。 【０００９】 【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に成された本発明に係るキャピラリ電気泳動チップは、
１対の略同形の平板を備え、少なくとも一方の平板の表
面に泳動溝が形成され、他方の平板の該泳動溝の端に略
対応する位置にそれぞれ貫通孔が設けられ、両平板が泳
動溝を内側にして張り合わされて成るキャピラリ電気泳
動チップにおいて、泳動溝の中間部に前処理用充填剤を
充填した幅広の保持部を設けるとともに、該保持部の前
段の泳動溝に試料導入用の分岐溝を、後段の泳動溝に不
要夾雑成分除去用の分岐溝を設けたことを特徴とするも
のである。 【００１０】 【作用】保持部には、サイズ排除用充填剤等の機能性充
填剤を充填しておく。泳動溝、保持部、及び試料導入用
と不要夾雑成分除去用の分岐溝に泳動液を満たし、保持
部の前に設けられた試料導入用の分岐溝の一端に試料を
入れる。そして、分岐溝の両端に電圧を印加することに
より、試料を保持部に流入させる。試料中の低分子量で
ある分析目的成分は保持部の充填剤により保持され、高
分子量のマトリックス成分はそこを通過して保持部の後
に設けられた不要夾雑成分除去用の分岐溝へ流出する。
所定の時間が経過した後、分岐溝両端への電圧印加を停
止し、泳動溝の両端に泳動電圧を印加する。これによ
り、保持部の充填剤に保持された分析目的成分が泳動溝
に流出し、泳動溝において電気泳動分離が行なわれる。 【００１１】なお、電気泳動分離はチップ内の泳動溝で
行なってもよいし、チップに接続した細管を泳動路とす
るようにしてもよい。この場合はチップ外で検出を行な
うため、平板は透明でなくてもよく、例えばエッチング
加工の容易なシリコン板を使用して、溝等の泳動液が接
触する面に酸化絶縁加工を行なうようにしてもよい。た
だし、後述する実施例のようにチップ内で検出を行なう
場合は、少なくとも一方の平板は透明であることが望ま
しい。 【００１２】 【発明の効果】本発明に係るキャピラリ電気泳動チップ
では、泳動溝の中間に充填剤を充填した保持部を設け、
これにより試料から分析目的成分以外の不要夾雑成分を
予め排除できるようにしている。このため、従来のよう
な溶媒抽出等による多段階のクリーンアップ操作が不要
となり、分析時間が大幅に短縮され、また、操作も簡単
となる。 【００１３】 【実施例】本発明の一実施例であるキャピラリ電気泳動
チップを図１〜図６により説明する。図７に示した通常
のキャピラリ電気泳動チップと同様、本実施例のキャピ
ラリ電気泳動チップ１０も図２に示すように２枚のガラ
ス板（石英板でもよい）１１、１２で構成される。 【００１４】図１及び図２に示すように、下側のガラス
板１２には泳動溝１３が形成され、その中間やや一方の
端に近い方には幅広の保持部１４が形成されている。ま
た、保持部１４の両端からはそれぞれ分岐溝１５、１６
が設けられている。これら泳動溝１３、分岐溝１５、１
６及び保持部１４は、ガラス板１２の表面にエッチング
により形成され、溝部分１３、１５、１６の幅が１０〜
１００μｍ程度、深さが５〜５０μｍ程度となるように
形成される。また、エッチング加工により形成する場
合、保持部１４の深さは溝部分１３、１５、１６と同じ
とし、幅を広く（数ｍｍ程度）する。なお、これらはも
ちろんエッチングではなく、機械加工で形成してもよ
い。この場合、保持部１４の深さを深くすることも可能
である。 【００１５】上側のガラス板１１の、上記泳動溝１３の
両端及び両分岐溝１５、１６の非接続端にはそれぞれリ
ザーバ用の貫通孔２１、２２、２３、２４を穿孔する。 【００１６】下側のガラス板１２又は上側のガラス板の
表面には、これら貫通孔２１、２２、２３、２４を穿孔
した箇所とそれに最も近い端面とを接続する薄膜電極２
５、２６、２７、２８を設ける。薄膜電極２５、２６、
２７、２８は、金属の蒸着等により形成することによ
り、両ガラス板１１、１２の間に隙間を作らないように
する。 【００１７】下側のガラス板１２の表面に形成した保持
部１４には、図３に示すように、充填剤３０を充填す
る。充填剤３０としては、目的に応じて例えば、（１）
ＯＤＳシリカ表面にタンパク質を非可逆的に吸着させた
タンパク質コートＯＤＳ、（２）サイズ排除メカニズム
でタンパク質が分配結合相と接触するのを防ぐために考
えられたＩＳＲＰ（Internal Surface Reversed Phas
e）やＳＨＰ（Shielded Hydrophobic Phase）、（３）
免疫反応により抗原（又は抗体）だけに特異的に結合
し、ｐＨを変えて溶融させる抗体固定化カラム充填剤
（又は抗原固定化カラム充填剤）、等を使用することが
できる。なお、T.C.Pinkerton, "High-performance liq
uid chromatography packing materials for the analy
sis of small molecules in biological matrices by d
irect injection", J. Chromatogr., 544, 13(1991)に
このような機能性充填剤についての詳しい解説がある。 【００１８】泳動溝１３と保持部１４の境界部分には、
充填剤３０の流出を防止するため、ガラス粉末を焼結し
たフリット３１、或いは図５に示すようなエッチング形
成による障害物３８を設ける。 【００１９】各ガラス板１１、１２について上記の加工
を行ない、保持部１４に充填剤３０を充填した後、溝１
３、１５、１６を形成した面が内側となるように両ガラ
ス板１１、１２を貼り合わせ、熱又は陽極接合により固
定する。これにより、上側のガラス板１１の貫通孔２１
〜２４はリザーバとなる。 【００２０】こうしてキャピラリ電気泳動チップ１０を
形成した後、図４に示すように、各薄膜電極２５〜２８
をスイッチボックス３５の各スイッチＳ1〜Ｓ4を介して
高圧電源（ＨＶ）３６及びアースに接続する。 【００２１】 本実施例のキャピラリ電気泳動チップを
用いた分析の手順は次の通りである。まず、いずれかの
リザーバから泳動液を加圧注入し、泳動溝１３、保持部
１４及び両分岐溝１５、１６に泳動液を満たす。そして
シリンジにより、保持部１４の前に設けた分岐溝１５の
端部のリザーバ（試料注入点）２３から所定量の微量の
試料を注入し、スイッチボックス３５のスイッチＳ２及
びＳ３を閉じる。これにより、高圧電源３６からの高電
圧が分岐溝１５、保持部１４及び分岐溝１６の間に印加
され、リザーバ２３に注入された試料がこれらの流路を
流れて行く。この間、試料中の不要夾雑成分は保持部１
４を通過して他方の分岐溝１６からリザーバ２４へ流れ
て、そこからドレイン（図示せず）へ廃棄される一方、
分析目的である低分子量成分は保持部１４の充填剤３０
に保持される。 【００２２】血清試料の場合、充填剤３０として例えば
上記（１）のタンパク質コートＯＤＳを用いると、血清
タンパク質は保持部１４をそのまま通過し、分析目的成
分である血清中の薬物や代謝物などは細孔内のＯＤＳシ
リカに分配され、そこで保持される。 【００２３】次に、泳動溝１３の端部のリザーバ（溶離
バッファ注入点）２１より有機溶媒（上記例の場合、７
０％程度のアセトニトリル）を含む溶離液をシリンジ等
で注入し、スイッチボックス３５のスイッチＳ2、Ｓ3を
開いてスイッチＳ1、Ｓ4を閉じる。これにより、保持部
１４の充填剤３０に保持された成分が泳動溝１３に溶出
し、泳動溝１３において電気泳動による成分分離が行な
われる。溶離成分は検出点Ｄ（図１）において検出され
る。なお検出は各種方法を採用することができるが、例
えば図６に示すように、検出点Ｄの泳動溝１３にレーザ
光を照射し、励起された溶離液から発生する蛍光を観測
するという方法をとることができる。このとき、レーザ
照射効率の点から、光源４０から検出点Ｄまでは光ファ
イバ４１で導光することが望ましく、また、蛍光検出の
感度を上昇させるため、蛍光検出器（図６の場合はフォ
トマル４２）の前に空間フィルタ及び干渉フィルタを設
けることが望ましい。 【００２４】別の例として、上記（３）の抗体固定化カ
ラム充填剤を用いる場合は、第１段階において、注入し
た試料成分のうち抗体と特異的に相互作用するもののみ
が保持部１４において充填剤３０に保持され、それ以外
はドレインに排出される。第２段階では、酸性のバッフ
ァ液を溶離バッファ注入点２１から導入することによ
り、保持されていた分析目的成分が保持部１４から泳動
溝１３に溶出し、泳動溝１３において分離、検出され
る。

【図面の簡単な説明】 【図１】 本発明の一実施例であるキャピラリ電気泳動
チップの平面図。 【図２】 実施例のキャピラリ電気泳動チップの端部の
拡大断面図。 【図３】 実施例のキャピラリ電気泳動チップの保持部
の拡大平面図。 【図４】 実施例のキャピラリ電気泳動チップの周辺の
回路図。 【図５】 保持部における充填剤保持のための機構を示
す拡大斜視図。 【図６】 検出機構の説明図。 【図７】 保持部を持たないのキャピラリ電気泳動チッ
プの構成を示す平面図（ａ）、（ｂ）及び断面図
（ｃ）。 【符号の説明】 １０…キャピラリ電気泳動チップ １１、１２…ガラス板 １３…泳動溝 １４…保持部 １５、１６…分岐溝 ２１、２２、２３、２４…リザーバ（貫通孔） ２５、２６、２７、２８…薄膜電極 ３０…充填剤 ３１…フリット ３８…障害物

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】 １対の略同形の平板を備え、少なくとも
   一方の平板の表面に泳動溝が形成され、他方の平板の該
   泳動溝の端に略対応する位置にそれぞれ貫通孔が設けら
   れ、両平板が泳動溝を内側にして張り合わされて成るキ
   ャピラリ電気泳動チップにおいて、 泳動溝の中間部に前処理用充填剤を充填した幅広の保持
   部を設けるとともに、該保持部の前段の泳動溝に試料導
   入用の分岐溝を、後段の泳動溝に不要夾雑成分除去用の
   分岐溝を設けたことを特徴とするキャピラリ電気泳動チ
   ップ。