JPH02272353A - 分析装置とキャピラリ・ゾーン電気泳動システム - Google Patents

分析装置とキャピラリ・ゾーン電気泳動システム

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JPH02272353A
JPH02272353A JP2056304A JP5630490A JPH02272353A JP H02272353 A JPH02272353 A JP H02272353A JP 2056304 A JP2056304 A JP 2056304A JP 5630490 A JP5630490 A JP 5630490A JP H02272353 A JPH02272353 A JP H02272353A
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    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416Systems
    • G01N27/447Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704Details; Accessories
    • G01N27/44717Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
    • G01N27/44721Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones by optical means

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は未知の物質を同定するための装置及び方法に関
する。特に、本発明は小さいボアのキャピラリ中におい
て電気泳動法で分離され、そのキャピラリ内に設けられ
た(reside)新規なセルを通る時、未知物質によ
って吸収された紫外線量の測定をすることにより検出さ
れる大きい生体物質の識別(recognition 
of large biological mater
iaIs)に関連するものである。
〔従来技術とその問題点〕
バイオテクノロジーにおける最近の進歩は、研究開発所
、健康管理施設、製薬製造業において、微量の無機物質
及び有機物質を正確かつ迅速に同定することのできる装
置の要求を加速させている。
ガスクロマトグライー及び液体クロマトグラフィーを含
む従来の技術は、分子構造が比較的小さいサンプルの分
析に用いられている。クロマトグラフィーは、金属、無
機混合物、小さい有機イオン等の分析に有効に用いるこ
とができるが、アミノ酸、たんばく質、ペプチド、DN
A等の非常に大きく、極めて複雑な分子を未知組成物の
サンプル中で単離し、発見することはより困難なもので
ある。
クロマトグラフィーにおけるも1つの重大な欠陥は、未
知サンプルが特に希薄である場合に困難な事態に直面す
ることである。これは、クロマトグラフィーが分析に必
要な物質を多量に使用するからである。液体クロマトグ
ラフィーを用いた場合に直面する他の欠点としては、流
体のバルク移動(bulk movement of 
the fluicl)の妨げをする「デッドゾーン」
と呼ばれる不均一な流れや望ましくない層流の混合を生
じる、液体クロマトグラフ・システムを通る溶質の不均
一な移動パターン(inconsistent pat
terns of solutemovement)が
あげられる。
電気泳動法は、研究者、科学者による未確認の物質の評
価が可能な他の周知の方法である。未知サンプルと緩衝
液(buffer 5olution)と呼ばれる非反
応性液体の混合物を含むある長さの管またはキャピラリ
に電場を印加する。電場の印加により、電気的吸引力が
生じ、未知サンプルの成分がキャピラリ中を泳動する。
ただし、サンプル中の異なる成分は、異なる分子抵抗(
嗣1ecular drag)及び正味電荷(net 
electrical charges)が異なるため
、異なる速度で吸引(attract)される。異なる
物質は、抵抗及び電気的吸引力に同様に反応しないこと
から、キャピラリ中を進行するにつれて、明確なゾーン
またはグループにますます分離される。
未知物質からなるものと分離されていない混合物を形成
する成分物質の各バンド(band)は、単独でキャピ
ラリを通過する。このキャピラリ中のある点で各バンド
を検出器で試験し、同定する。電気泳動による分離に関
するあるタイプの検出器は、キャピラリ中のバンドの導
電率を測定する。代わりに、レーザー誘発蛍光発光(l
aser 1nduced fluoresce)と呼
ばれる方法が用いられることもある。
この方法は感度が高いが、費用もかかり、蛍光を発光す
るあるいは蛍光を発光するように誘発可能な化合物の検
出に限定される。従来のもう1つのシステムでは、物質
に光を照射し、さらにその物質が吸収する光の量を測定
することによって未知物質の識別をおこなっている。残
念ながら、キャピラリを横切る光の経路は短く、狭いた
め、未知サンプルが光子を十分に吸収することができな
い。
キャピラリは、極めて細くなければならない。これによ
り、その中の全ての物質は、大きい径の管では、不均一
な半径方向の加熱によって生じる可能性のある乱流また
は渦流を伴わずに容易に泳動される。このようなサイズ
の制限により、検出感度が低いことが大きな問題となっ
ている。
遺伝工学テクノロジーの発展が続くことで、より正確で
、信頼性があり、感度の高い診断及び測定技術の価値が
さらに上がっている。医師、臨床研究者、研究技師は、
複雑な遺伝子コードを調べ、急激に増加する世界人口に
対する食料供給のため、耐寒性で有用な植物の改良をお
こない、動物の寿命を延ばし、最終的には遺伝性焼戻や
恐ろしい病気に対する治療方法を考察するためのより強
力なツールを必要としている。従来の装置及び技術の障
害となっていた制限を克服する感度と精度の高い生物学
的検出、分析をおこなえるようにするという問題は、生
化学技術における設計者、革新者に対して重大な目標を
提示することになっている。
未特定の生体サンプル成分を感知するための有効で、感
度が高く、入手可能で、正確さを備えたシステムの開発
は生化学及びバイオテクノロジー産業における重要な技
術革新をもたらすことになる。
こうした革新的な装置を用いて得られる性能の向上は、
長期にわたって感じられてきた必要が満たされることに
なり、また、薬物、医薬品、生物学的製品の製造業者に
とって時間と費用の消費を大幅に節約することが可能に
なる。
〔発明の目的〕
本発明の目的は上述の問題点を解消し、乱流や渦流を起
こさず、微量のサンプルの高精度な分離及び測定を可能
とするキャピラリ・ゾーン電気泳動システムを提供する
ことにある。
〔発明の概要〕
本発明に係るキャピラリ・ゾーン電気泳動システムは、
従来の分析方法では達成できなかった感度レベルとコス
ト制約下で、未知の生体サンプルを正確に検出すること
が可能である。本発明より得られる性能向上の鍵となる
のは小さいボアのキャピラリの検出回路内に設置された
セルである。
キャピラリ・ゾーン電気泳動システムはlppm濃度の
スレッシュホールドを有する感度で注入された物質を感
知することが可能である。経済的で、使用しやすく、信
頼性の高いシステムによって、この革命的な成果が得ら
れた。
内径がほぼ髪の毛はどの細さの小さなキャピラリは注入
端部から出力端部ヘキャリア流体を運搬する。キャピラ
リのどちらの端部も緩衝液と通常呼ばれるキャリア流体
を貯える貯蔵器内に配置される。分離の開始自、μg単
位の未知物質がキャピラリの注入端部に送り込まれる。
次に、電場をキャピラリ間に印加する。電場が生じるこ
とにより、未知サンプルの荷電成分がキャピラリの一方
の端部から他方の端部へ移動する。その移動の最終段階
では、サンプルの未特性成分が卵型の形状をしているセ
ルに導入される。セルの中では、紫外線の光線が向けら
れ、セルを通り抜ける。この光の一部は、生体サンプル
によって吸収される。
吸収レベルは、検出器によって測定され、様々な光の吸
収の量に基づいて各成分物質を特定し、サンプルの分析
をおこなう。
本発明のキャピラリ・ゾーン電気泳動システムは、微細
サンプルの成分を検出する上で、従来にない感度をもた
らす診断及び測定を可能とするものである。
〔発明の実施例〕
第1図に本発明の一実施例であるキャピラリ・ゾーン電
気泳動(CZE)セル・システムを示す。CZEセル・
システムは、ボアの小さいキャビ91月0を含み、キャ
ビ91月0は注入貯蔵器14内に配置された注入端部1
2を備えている。様々なサイズのマイクロポア・キャピ
ラリが考えられるが、キャビ91月0はフユーズド・シ
リカより作られ、その内径は約50μmであることが好
ましい。注入貯蔵器14は、単純な塩または緩衝液15
等の水溶性電解液媒体である一定のアイソクラティック
(constantisocratic 5oluti
on)をキャビ91月0へ供給する。
未知成分17を含むサンプル16は、注入端部12をサ
ンプル・バイアル(図示せず)へ瞬間的に浸し、電圧ま
たは圧力の印加により少量のサンプル16を吸引しキャ
ピラリIOへ送り込まれるので、注入端部12に挿入さ
れる。高圧の電源22は、注入貯蔵器14に設置された
陽極18と接続している。接地リード線により、電源2
2は同様に出口貯蔵器28に接地された陰極26と接続
する。キャピラリ10の出力端部30は、出力所蔵器2
8内に配置される。
セル32はキャピラリ内に形成され、紫外線(UV)源
38より照射される。本願明細書に記した[格納手段(
containment means) J、「拡張ゾ
ーン(diafated zone) J、「セル状(
cellular)格納手段」という用語は図面と共に
以下に詳述するセルを意味するものである。光源38か
ら光がセル32を通り、緩衝液15に運搬されている溶
質16の成分17に吸収された後、検出器42はその光
を受光する。検出器42はリード線40を介して紫外線
吸光度回路34に接続する。測定結果は、吸光度回路3
4から信号を受信するコンピュータ44またはストリッ
プチャート・レコーダ(図示せず)によって計算され、
表示される。
第2図に本発明の一実施例であるセル32の詳細を示す
。セル32の最小直径は、「46」で示されるれる一組
の矢印間の距離である。本発明の好適な実施例において
は、この寸法は50μmで、小さいボアのキャピラリ団
の内径と一致し、キャピラリ10の一部を形成する。セ
ル32の最大直径はキャビ91月0よりわずかに太き(
、−組の矢印で「48」と示されている。本実施例では
、セル32の最大直径48は150 μmである。セル
32の湾曲部分は、50で示されている。セル32の湾
曲部分50の終了点は52.54で示されている。第2
図の上方左側部分に示す距離56はセル32の湾曲部分
50の縦方向における突出部(longitudina
l projectton)を表している。セル32の
全長は、第2図の下部に位置する「57」で示されてい
る。水平線58は、電源22と電極18.26の影響に
よって生じる電界線を表す。垂直線60は、等電位線を
表す。ここでは、セル32の容積は、長さl、6mmの
キャピラリの容積と等しい。
この容積はnlの単位で測定される。本願発明のキャピ
ラリ・ゾーン電気泳動システムでは、この著しく小さい
容積を用いるので、液体クロマトグラフィーのためのセ
ルに比べ、小型化が完全に3桁は向上する。
第3図に他の実施例を示す。CZEセル32は狭い部分
74までどちらの方向にも延びる中心部分61を有する
。キャビ91月0の外径は「62」で示す。紫外線ビー
ム64はセル32の中心に指向されており、紫外線放射
線64の軸はキャビ91月0の縦軸に対して垂直である
。使用する紫外線の波長は、通常、200〜400nm
の範囲である。セル32の中心から右側のバンドは、左
から右へ移動する溶質または分析対象物16の第1の明
確なグループを表し、通常、「ピーク」と呼ばれる1/
10の容積単位である。66と68で表示されるこれら
のバンドは、しばしば「ピーク・フラクション」と呼ば
れる。なぜなら、検出器の電圧でスケーリングされてい
る横座標に沿って時間単位で示される縦座標を横切るU
v光の吸収レベルの上昇を表す電気泳動チャート(el
ectropherogram)上のグラフィック・ピ
ークまたはスパイクと集合的に対応する。未知サンプル
16の各成分17がセル32を通ると、成分17によっ
て吸収される光が増加し、検出器(sensor)42
を照射する放射線の量が減少する。結果得られるチャー
トはキャピラリ10中の物質を同定する一連のガウス分
布である。ここでは、第3図に示す各バンドは典型的な
狭いピークの1/10の幅である。
第4A図、第4B図、第4C図は外側キャピラリと緩衝
液15と溶質16を通すために用いられる、次第に大き
くなる直径を有する包囲されたセルとの3種類の組合せ
を示す。キャピラリの外径76.78.80はそれぞれ
50μ■のセル82.150μmのセル84.200μ
mのセル86に相当する。各セル82.84.86内に
示す斜線(cross−hatching)は吸収に用
いられ、セルと衝突する光子の光束密度を表す。より大
きいボアによって光路長が伸長され、直接、感度の向上
およびこれに伴うノイズ・レベルの低下に役立つことに
なる。放射線の光束がより大きくなるため、感度は延長
された光路長と光路の断面積の平方根との倍数だけ向上
する。第4A図のセル82を基準とすると、セル84は
3B倍すなわちほぼ5倍感度が向上する。200μmの
セル86は光路長の延長が4倍で、放射線密度の増加は
5bため、感度能力は基準セル82に比べると8倍とな
る。本発明では、より小さい従来のセルを不相応に不利
にしている迷光(セルの側部に散乱(spill)する
光束)の問題が回避されるので、このような改善は実際
にはこの値よりも大きくなる。
第5図に示す3つの曲線88.90.92は第4A、 
4B。
4C図′に示すセル82.84.86を用いた結果に対
応する。3つの曲線を信号ノイズの著しい減少を示すた
め正規化している。200μmのセル86を用いた結果
の曲線92は、直径50μmの基準セルの結果を示す曲
線88に比べてノイズレベルがかなり低下していること
がわかる。セルのサイズが増加することによって直面す
る問題の1つはピークがブロードになることである。第
5図では、ピーク92の幅はピーク88に比べわずかに
広がっている。本実施例において、ブロードの程度は約
10′Xである。C7E検出器の分解能はビーク間の離
隔距離によって測定されるので、ピークがブロードにな
るとシステムの性能が劣化する。ただし、ここで見られ
る10%の劣化は光路長及び光束を拡大する新規なCZ
Eセルを用いることによって10倍の感度を得ることに
比べればそれほど重要ではない。
第6図に本発明によって得られた線形特性を示す。曲線
94と96はサンプル吸収体(sample abso
rber)DMSOの検出器の°応答をmVで表したグ
ラフである。曲線94は対数増幅器を用いることによっ
て得たものである。対数増幅器を用いると、システムに
ノイズが導入されるが、グラフにより高濃度においてよ
り直線性を示すことがわかる。曲線96は線形増幅器を
用いて得たものである。この測定モードではより低いノ
イズで高い感度が得られる。
回路のノイズ・レベルを超えるように信号を増幅した後
、対数演算を行い、曲線96の感度と曲線94の直線性
を結合することができる。曲線94と96の両方の拡張
された直線性は、本発明に係るセルが設けられていない
従来のキャピラリによって検出をおこなう従来の方法で
得られるものに比べてはるかに大きい。なぜなら、セル
32は、はるかに小さいターゲットの側部を囲み、溶質
16中へ通らない迷光を除去するために役立つことから
である。
第7図に緩衝液のippm以下の平均タンパク質(le
ss than one part of avera
ge protein equivalent in 
a m1llion parts of buffer
 5olution)を配置させ、その混合物を検出器
に通すことによって得られた結果を示す。曲線98の左
側部分は純粋な緩衝液の吸光度の第ルベルを表した検出
器の出力である。ippmのタンパク質当量がCIEセ
ルに送り込まれると曲線の右側部分100で示される検
出器の出力が減少し、吸光度は急激に増加する。
これより、低濃度で、複雑な生体物質が感知可能である
ことがわかる。
第8図は本発明に係るCZEセル32の製造に用いられ
るセル旋盤102を示す。旋盤102はモータ106を
固定するベース104を含み、モータ106はベアリン
グ110に支持されて、ギヤ108を駆動する駆動シャ
フト107と接続する。そして、駆動ギヤ108はベア
リング116で支持された回転中空シャフト113に取
りつけられた被駆動ギヤ112.114と連結する。中
空のシャフト113にはチャック118が取りつけられ
ており、二点でキャピラリ120を支持する。キャピラ
リ120は支持体122によって支えられ、1組のチャ
ック118によって保持される。旋盤102を操作する
場合、顕微鏡124で小さい炎で加熱されるキャピラリ
の中心部分126を観ながらおこなう。ガラス加工技術
の周知の方法であるスケールダウン・バージョンである
マイクロブローイング(micro−blowing)
技術を用い、CZEセル32を製造する。まず、キャピ
ラリ120の一方の端部を密封し、次に他方の端部にシ
リンジ128を用いてその内部容積に対して圧力を加え
、1020%の過剰圧力を与える。1/16” (1n
ches)のガス炎中に3−4秒間キャピラリを回転さ
せることによって高品質のセル32を得ることができる
ZEシスームの 本発明において、分析対象物を分離させる原動力はキャ
ピラリに印加された電場である。3O−50kVの電位
差はキャピラリの一方の端部からもう一方の端部ヘキャ
リアを移動させることにより物質は分離されるが、この
移動は2つの要素から成り立っている。このうち、明確
で、より理解しやすい要素は電気泳動による移動である
。電気泳動は異なる電荷の単純な電気的吸引力によって
荷電分子が逆の荷電電極へ移動するプロセスである。C
ZEシステムを物質が移動する第2の理由は電気浸透流
(electro−osmotic flow)と呼ば
れる現象である。ガラス管に液体が注入される毎に負の
電荷を有する液体内の分子はガラス管の壁に付着しよう
とする。正の電荷の場合にはこのような現象は起きない
。負の荷電分子に関するこの差別的な付着または吸着に
よって正の荷電分子が全て引きつけられ、キャピラリの
内壁に沿って移動する。電場はこれら正の分子またはイ
オンがキャピラリの端部の陰極へ引き寄せられていく。
この結果、電荷の異なる全ての溶質がキャピラリの出力
端部へ向かう流れが生じる。電気浸透流は、全ての荷電
分子をシステムの一方の端部へ移動させるポンプ力を与
えることとなる。
キャピラリ内にバルク流を発生させる電気浸透力の強度
は印加された電場に正比例する。CZEセル内における
電場の強度は、セル中の導電性流体の断面が大きいため
、キャピラリ中の電場の強さに比べると小さい。電場は
流体面積に反比例するので、キャピラリの4倍を越す直
径を有するセルにおいては電場の強度はl/16 L、
かない。このセルの場合、キャピラリの壁部のセルの範
囲内における浸透力はキャピラリの壁部の残りの部分の
浸透力に比べ、16倍も弱いことになる。流れが一定で
あれば、この力は極めて小さくなり、結果としてセルの
縁部に存在する溶質がセルの中心にある溶質より遅れる
ような層流が起きる。この不均一な移送によって望まし
くないピークの広がりが生じ、CZEシステムの性能が
劣化する。このような問題は本発明では生じない。この
バルク流を生じさせる浸透力がセル内で低下してゆくに
つれて、セル内での流速もセルの断面積に比例して減少
する。
セル内でのバルク流の速度が減少すると、それを推進す
る力もこれに伴って減少する。極めて有益な結果として
、分析対象物のバンドにかかる力とそのバンドをひずま
てブロードなピークを生じさせる力の欠落とのバランス
がとれるという点である。
い      ベ (1)乱流 セル32の設計及び製造において、考慮しなければなら
ないことの一つに乱流を最小化することがある。本発明
の重要な特徴はセルの勾配のある湾曲部(gradua
l curvature)である。液体クロマトグラフ
・システムと共通のキャピラリ回路中の鋭い縁部、取り
つけ具、ガスケットまたはジヨイントも検出器の性能を
損なうこととなるので、ゆるやかな傾斜を備える曲線及
び変化の形状を与えることによって回避することができ
る。こうした設計上の制約を慎重に守ることによって、
スムーズな流れが得られ、乱流を回避することができる
(2)キャピラリの寸法 キャピラリ中の物質の分離の性能に貢献する2つの特性
は、同様の溶質を確実に分離する能力である選択性、及
び、少量の溶質をどの程度まで検出可能であるかを表す
感度である。CZEシステムは、キャピラリの直径を大
きくすることによりより感度を高めることができる。ボ
アの大きいキャピラリはさらに感度が向上する。なぜな
ら、光が通過する光路長が長くなるからである。この結
果、溶質が紫外線放射線を吸収する機会がふえることに
なる。キャピラリの直径を小さくすれば、同じシステム
の選択性を向上させることができる。直径が50μm未
満の、小さいボアのキャピラリの場合では、より大型の
システムで起こる過剰の熱によって生じる半径方向温度
勾配はない。このような半径方向温度勾配によって、キ
ャピラリの中心部の分析対象物が縁部の分析対象物に比
べて速く移動し、この結果ピークが広がり、分解能が劣
化してしまう。溶質分子はキャピラリ内で形成される溶
質のバンドの境界の精鋭度を減少させながら分離される
ので、望ましくない温度勾配が分子に影響を及ぼしてし
まう。これらのバンドの規定について妥協すると、溶質
の「ピーク」がブロードになり、分離の選択性が劣化す
る。本発明では、このような相反する作用を解決し、選
択性と感度の両方の優れた性能を得ることができる。
本発明により、従来の液体クロマトグラフのセル・シス
テムの製造に対していくつかの重要な改善がなされる。
液体クロマトグラフ(LC)は、CZEの1000倍の
セルのサイズと、[掃引されない容積(unswept
 volume)」として知られる鋭角な角部が生成さ
れるセルの幾何学的構造によって制限されている。この
ようなポケットはセル中に溶質を停滞させ、検出ピーク
がブロードになり、選択性が劣化する。LCセルのもう
1つの欠点は、それを通る流れが層流を形成してしまう
ことである。セルの中心部の緩衝液が最も速く移動し、
縁部における緩衝液はセルの縁部に付着する。理論的に
は、放物線速度プロファイルの流れかをその中へ流れ込
む管に生じる。この非直線性のプロファイルはセルの性
能を劣化させる。これは、溶質のバンドの形がこの不均
一な流れによってひずむからである。よって、LCセル
を最小のLCピーク容積よりほぼ一桁小さくしなければ
ならない。これにより、ピークがブロードにならず、選
択性も劣化されない。
本願発明に係る キャピラリ・ゾーン電気泳動システム
によって、医療及び製造分野のアプリケーションにおい
てより広範囲な診断及び測定のための正確で、強力な、
信頼性のあるツールを得ることができる。本発明は、特
にバイオテクノロジー及び化学分野に大きく貢献する。
〔発明の効果〕
以上説明したように、本願発明により安価で構成が簡単
なセルを得、細径のキャピラリを用いた場合でも紫外線
放射に対する感度と検出の選択性を向上させ、微量の未
知成分の解析を可能とするキャピラリ・ゾーン電気泳動
システムを得ることができる。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明の一実施例であるキャピラリ・ゾーン電
気泳動システムの概略図。 第2図及び第3図は第1図の部分詳細側面図。 第4A図から第4C図はキャピラリの断面図。 第5図は第4A図から第4C図の検出出力を示した図。 第6図は本発明に係るキャピラリ・ゾーン電気泳動シス
テムの動作説明図。 第7図は本発明に係るキャピラリ・ゾーン電気泳動シス
テムの感度を示す図。 第8図は第1図のセルを製造するためのガラス旋盤装置
の概略図。 10:キャピラリ、14:注入貯蔵器、18:陽極、 
26:陰極、 22:電源、32:セル、42:検出器、38:光源、
34:紫外線吸光度回路、44: コンプユータ、10
2:セル旋盤。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)注入端部と出口端部を有する細径のキャピラリと
    、 前記キャピラリは緩衝液と分析対象物で満たされ、 前記注入端部と接続する注入貯蔵器と、 前記出口端部と接続する出口貯蔵器と、 前記注入貯蔵器内に設けられた第1の電極と、前記出口
    貯蔵器内に設けられた第2の電極と、前記第1と第2電
    極間に接続する電源と、 前記キャピラリ内に形成されるセルと、 光源とセンサを含む紫外線吸光度検出器とから構成する
    ことを特徴とするキャピラリ・ゾーン電気泳動システム
JP2056304A 1989-03-06 1990-03-06 キャピラリ・ゾーン電気泳動システム Expired - Fee Related JP3028825B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
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