JP5022208B2 - ヘモグロビン類の測定システム - Google Patents

Description

本発明は、糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃを高精度に測定することができる簡便で安価なヘモグロビン類の測定システムに関する。

ヘモグロビン（Ｈｂ）類、特に糖化ヘモグロビン類の一種であるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）は、過去１〜２カ月間の血液中の平均的な糖濃度を反映しているため、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための検査項目として広く利用されている。
従来、ＨｂＡ１ｃの測定方法としては、ＨＰＬＣ法、免疫法、電気泳動法等が用いられている。このうち、臨床検査分野で多く用いられているＨＰＬＣ法では、１試料当たり１〜２分での測定が可能であり、また、同時再現性試験のＣＶ値が１．０％程度の測定精度が実現されている。糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための測定方法としては、このレベルの性能が必要とされている。

一方、電気泳動法は、装置構成が簡便なため、マイクロチップ電気泳動のような安価で小型なシステムを作製することが可能な技術であり、電気泳動法におけるＨｂＡ１ｃの高精度測定技術の臨床検査への適用は、コスト面において非常に有益な効果が期待できる。
電気泳動法によるＨｂ類の測定は、通常とは異なるアミノ酸配列を有する異常Ｈｂ類の分離方法として古くから用いられているが、ＨｂＡ１ｃの分離は非常に困難であり、ゲル電気泳動の手法では３０分以上の時間が必要であった。このように電気泳動法は、臨床検査分野に応用した場合、測定時間及び測定精度の点で問題があるため、現在では糖尿病診断への応用はほとんど行われていなかった。

これに対して、１９９０年頃に登場したキャピラリー電気泳動法は、一般的に高分離・高精度測定が可能とされており、例えば、特許文献１には、キャピラリー電気泳動法によってＨｂＡ１ｃを分離する方法が開示されている。
しかしながら、特許文献１に開示された方法を用いた場合、測定時間が長いという問題点は解消されず、加えて、使用する緩衝液のｐＨが９〜１２と高く、Ｈｂが変性してしまう可能性があることから、この方法を臨床検査に適用することは困難であった。

また、特許文献２には、キャピラリー電気泳動法において、キャピラリーにカチオン性ポリマーを通液することによって、キャピラリー内表面にカチオン性ポリマーを動的にコーティングし、硫酸化多糖類を含む緩衝液を用いる方法が開示されている。この方法によれば、ゲル電気泳動法と比較して短時間で測定することが可能であるとされている。

しかしながら、糖尿病診断を行う場合は、ＨｂＡ１ｃのなかでも糖尿病の指標となる安定型ＨｂＡ１ｃを分離して、不安定型ＨｂＡ１ｃ、カルバミル化Ｈｂ等の修飾Ｈｂ類の影響を排除しなければならない。特許文献１及び２に開示された方法によって得られるエレクトロフェログラムでは、分離性能及び測定精度が不充分であり、これらの方法の技術範囲では安定型ＨｂＡ１ｃを分離することは困難であった。

また、このような緩衝液や、電圧負荷等の条件は、大型で高価なキャピラリー電気泳動装置にのみ適用することが可能である。例えば、特許文献２に記載の測定条件に必須要件である動的コーティングは、測定の直前に実施しなければならず、泳動路へのコーティング剤の充填機構が装置に必要である。そのため、小型で安価な測定システムを得ることができていない。
特表平９−５１０７９２号公報 特開平９−１０５７３９号公報

本発明は、糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃを高精度に測定することができる簡便で安価なヘモグロビン類の測定システムを提供することを目的とする。

本発明１は、電気泳動法を用いて安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定するための測定システムであって、エンドプロテアーゼ処理された血液試料を導入するための試料導入部、前記試料導入部に連通するクロマトグラフィー用流路、及び、前記クロマトグラフィー流路に連通する分画部、前記分画部に連通する電気泳動用流路を有するマイクロデバイスと、前記マイクロデバイスに接続された電源部と、前記マイクロデバイスにおいて目的成分を検出するための検出部とを備えるヘモグロビン類の測定システム（以下、本発明１のヘモグロビン類の測定方法ともいう）である。

本発明２は、電気泳動法を用いて安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定するための測定システムであって、血液試料を導入するための試料導入部、エンドプロテアーゼを含む試薬を供給するための試薬部、前記試料導入部及び前記試薬部と連通し前記試薬と前記血液試料とを反応させる反応部、前記反応部と連通するクロマトグラフィー用流路、前記クロマトグラフィー流路に連通する分画部、並びに、前記分画部に連通する電気泳動用流路を有するマイクロデバイスと、前記マイクロデバイスに接続された電源部と、前記マイクロデバイスにおいて目的成分を検出するための検出部とを備えるヘモグロビン類の測定システム（以下、本発明２のヘモグロビン類の測定方法ともいう）である。

本発明者らは、鋭意検討した結果、電気泳動法により安定型ＨｂＡ１ｃを測定するための測定システムにおいて、エンドプロテアーゼ処理された血液試料を、クロマトグラフィーにより分画した後に、得られる特定の分画のみを電気泳動法により分離するマイクロデバイスを作製することによって、安定型ＨｂＡ１ｃを高精度に測定することができるとともに、簡便で安価なヘモグロビン類の測定システムを構築することができることを見出し、本発明１を完成させるに至った。
以下に本発明を詳述する。

本発明１のヘモグロビン類の測定システムは、電気泳動法により安定型ＨｂＡ１ｃを測定するための測定システムであって、少なくとも試料導入部、クロマトグラフィー用流路、分画部及び電気泳動用流路を有するマイクロデバイス、電源部、並びに、検出部より構成される。本発明１のヘモグロビン類の測定システムの構成例を図１に示す。以下、図１の構成例に基づき、本発明１を詳述するが、本発明のヘモグロビン類の測定システムは、図１の仕様に限定されない。

図１は、本発明のヘモグロビン類の測定システムの構成を模式的に示す斜視図である。図１に示すように本発明１のヘモグロビン類の測定システム１００は、マイクロデバイス３０１、電源部及び検出部より構成される。マイクロデバイス３０１には、エンドプロテアーゼ処理された血液試料の導入部３０４があり、該試料導入部３０４に添加された試料は、まずクロマトグラフィー流路３０２に導かれる。更に、クロマトグラフィー流路で分画された成分の内の目的成分は、電気泳動流路３０３に導かれて分離される。

電源部は電源装置１０１を有し、該電源装置１０１はケーブルにより、マイクロデバイス３０１上の電気泳動流路３０３中の緩衝液に接触できる電極１０２に接続されている。また、検出部は光源２０４を有し、該光源２０４からの測定光が電気泳動流路３０３に入光素子２０３を介して照射される。電気泳動流路３０３内において分離された成分を通過した測定光は、入光素子２０３と該流路３０３を挟んで反対側にある受光素子２０２により検知され、検出器２０１により検出される。

上記マイクロデバイスは、エンドプロテアーゼ処理された血液試料を導入するための試料導入部、該試料導入部に連通するクロマトグラフィー用流路、及び、該クロマトグラフィー流路に連通する分画部、該分画部に連通する電気泳動用流路を有する。
図２は、本発明１のヘモグロビン類の測定システムに用いられるマイクロデバイスの構成を示す模式図である。本発明１に用いられるマイクロデバイス１は試料導入部２を有し、該導入部２に、エンドプロテアーゼ処理された血液試料が添加される。添加された血液試料は、まず試料導入部２に連通しているクロマトグラフィー流路３に導かれる。上記クロマトグラフィー流路３には充填剤４が充填されており、試料中の成分は、充填剤４との相互作用により分画される。分画された成分の内、電気泳動に供される目的成分が、クロマトグラフィー流路３と電気泳動流路６が合流する分画部９に来た時に、該目的成分のみが電気泳動流路６に導かれて電気泳動が実施され分離される。電気泳動流路６内において分離された各成分は、検出位置１２において順次検出される。

上記マイクロデバイス１は、該マイクロデバイス１内に、試料導入部２、クロマトグラフィー流路３、分画部９及び電気泳動流路６を有していれば特に限定されず、公知の素材、形状、大きさのものを使用できる。
上記マイクロデバイス１を構成する素材としては特に限定されず、従来公知の素材を用いることができるが、例えば、ホウケイ酸ガラス、石英等のガラス系、フューズドシリカ、ポリジメチルシロキサン等のシリカ系、ポリアクリル系樹脂、ポリスチレン系樹脂、ポリ乳酸系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、オレフィン系樹脂等の樹脂系等の素材が好ましい。なかでも、ガラス系、シリカ系、アクリル樹脂系の素材が好ましい。
上記マイクロデバイスとしては、例えば、数ｃｍ〜数十ｃｍ角以下程度の大きさを有した基板状あるいはその他の形状からなる公知のマイクロデバイス等が挙げられ、μ−ＴＡＳ、Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐと呼ばれる技術に用いられる従来公知のマイクロチップ等を用いることができる。
上記マイクロデバイス１を製造する方法としては特に限定されず、公知の方法を用いることができる。

上記マイクロデバイスは、エンドプロテアーゼ処理された血液試料を導入する試料導入部を有する。
上記試料導入部２の位置、形状、数等は特に限定されず、エンドプロテアーゼ処理された血液試料が添加され得るものであればよいが、一定量の血液試料を溜めておくことができるリザーバ状の試料導入部であることが好ましい。
上記試料導入部は、血液試料をろ過することができるフィルタ装置等を付属していてもよい。
なお、試料導入部は、後述するクロマトグラフィー用流路３に、直接的あるいは間接的に連通している必要がある。

上記マイクロデバイス１において、上記試料導入部２には、エンドプロテアーゼ処理された血液試料が添加される。
上記血液試料を得るための血液を得る方法としては特に限定されず、公知の方法、すなわち、例えばＥＤＴＡ、フッ化ナトリウム、ヘパリン等の抗凝固剤存在下での採血、等の方法により採血される。
上記血液試料を調整する方法としては特に限定されず、例えば、得られた血液をそのまま、又は、遠心処理して血球分画を採取し、生理食塩水や緩衝液等の塩溶液に溶解する方法等が挙げられる。必要に応じて、不安定型ＨｂＡ１ｃを除去する操作；すなわち３７℃で加温する方法、公知の不安定型ＨｂＡ１ｃ除去試薬を添加する方法等を行ってもよい。

上記エンドプロテアーゼ処理を行う方法としては特に限定されず、上記血液溶液にエンドプロテアーゼ処理を行い、エンドプロテアーゼ処理済み試料を得る方法等が挙げられる。
上記エンドプロテアーゼ処理の方法は、一般に行なわれる酵素処理の方法が用いられ、上記エンドプロテアーゼを含む緩衝液を上記血液溶液に添加して加温等をすることにより行なうことができる。
上記エンドプロテアーゼとしては、ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡｏのβ鎖Ｎ末端の同じアミノ酸配列の位置で切断できるプロテアーゼであれば特に限定されないが、特にβ鎖Ｎ末端のアミノ鎖における、Ｎ末端より６つめのグルタミン酸と７つめのグルタミン酸の間を切断する、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ（ＥＣ３．４．２１．１９）が好ましい。
得られたエンドプロテアーゼ処理済み血液試料は、上記マイクロデバイス１において、試料導入部２に添加される。

上記マイクロデバイスは、クロマトグラフィー流路を有し、上記試料導入部は、該クロマトグラフィー流路に連通している。試料導入部２に添加されたエンドプロテアーゼ処理された血液試料は、クロマトグラフィー流路に導かれる。
上記クロマトグラフィー流路３の素材、形状、大きさは特に限定されないが、充填剤を内包し、目的成分を充分分画できるものが好ましい。
上記流路の素材としては、上記マイクロデバイス１の素材として用いられる素材と同一の群から選ばれる素材であってよく、また、上記素材からなる流路の内表面に、各種の表面改質処理をしたものであってもよい。
ここでいう表面改質処理とは、紫外線処理、プラズマ処理等の光学的処理；各種化学物質の反応、オゾン水処理等による化学処理、各種ポリマー等のコーティングによる被覆処理等が挙げられる。最終的に内表面は、血液試料の成分が非特異的な吸着を起さないよう、親水性を示すものであることが好ましい。

上記クロマトグラフィー流路３の長さ方向の形状は特に限定されないが、直線状であることが好ましい。充填剤量を増やし、かつ、マイクロデバイスの大きさを小さくしたい場合には、曲線状とすることもできる。また、断面の形状も特に限定されず、円状、矩形状であってもよい。
上記クロマトグラフィー流路３の長さは、好ましい下限が１ｍｍ、好ましい上限が１００ｍｍである。１ｍｍ未満であると、試料を分画するための充填剤量が充分内包できず、１００ｍｍを超えると、充填剤による圧力損失が増大しやすくなる。
上記クロマトグラフィー流路３の口径は、好ましい下限が０．０１ｍｍ、好ましい上限が１０ｍｍである。口径が０．０１ｍｍ未満であると充填剤による圧力損失が増大する可能性がある。また、１０ｍｍ以上であると、試料が拡散し、分離性能が劣化する可能性がある。
あお、上記クロマトグラフィー流路３の素材、内表面の性情、長さ方向及び断面の形状、長さ、口径等は、マイクロデバイス１に形成された他の部分の流路と同一であってもよいし、異なっていてもよい。

上記クロマトグラフィー流路は、その内部に充填剤を内包することが好ましい。
上記充填剤４は、エンドプロテアーゼ処理された血液試料中の、ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡｏ由来のβ鎖Ｎ末端の各断片又は両者の混合物を、他の成分より分離することができるものであれば特に限定されず、公知の液体クロマトグラフィー用充填剤を用いることができる。

上記充填剤としては特に限定されず、例えば、アミノ基、シアノ基を有する順相系充填剤；カルボキシル基、スルホン酸基、各種アミノ基を有するイオン交換系充填剤、アルキル基、フェニル基等を有する逆相系充填剤等；シリカ系、ジルコニア系等の無機系充填剤；有機合成高分子、多糖類やポリアミノ酸系充填剤等の有機系充填剤等が用いられる。なかでも、アルキル基、オクタデシル基、フェノール基等の疎水性基が結合されたシリカ系充填剤；スチレン、ジビニルベンゼン、メチルメタクリレート等の疎水性単量体を含む重合体からなる有機合成高分子充填剤等、逆相モードで用いられる高分子系充填剤が好ましい。

上記クロマトグラフィー流路は、内部に、上記充填剤を固定するための固定機構を有することが好ましい。
上記固定機構５を有することによって、上記充填剤４を、クロマトグラフィー流路３内の所定の位置に設置しておくことができる。上記固定機構５は、上記クロマトグラフィー流路３における上記充填剤４の出口側（電気泳動流路６側）のみでもよく、両側に設置されてもよい。
上記充填剤４を固定するための固定機構５としては、充填剤４が当初充填された位置から移動しないように固定することができる機構であれば特に限定されず、例えば、血液試料や緩衝液は通過できるが、充填剤粒子は通過できない孔径を有するフィルタを用いること；充填剤４の出口側のクロマトグラフィー流路３の断面積を、測定試料や緩衝液は通過できるが、充填剤粒子は通過できない大きさに小さくした堰を設けること等が挙げられる。

上記クロマトグラフィー流路３におけるクロマトグラフィーに用いられる溶離液は、エンドプロテアーゼ処理された血液試料中の、ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡｏ由来のβ鎖Ｎ末端の各断片もしくは両者の混合物を、他の成分より分離することができるものであれば特に限定されず、公知の液体クロマトグラフィー用溶離液を用いることができる。

上記溶離液としては特に限定されず、例えば、従来公知の溶離液を構成する成分であるクエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸及びその塩類；グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸等の無機酸及びその塩類；ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のグッドの緩衝液類；水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水酸化物；アセトニトリル、メチルアルコール、エチルアルコール、イソプロピルアルコール等の有機溶媒類、あるいはこれらの誘導体類等を含有する水溶液又は溶液が挙げられる。これらの緩衝能成分は、単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
上記緩衝液のｐＨは、好ましい下限が１、好ましい上限が８、より好ましい下限が２より好ましい上限が６である。

上記溶離液は、マイクロデバイスに付属する送液機構により送液されて、クロマトグラフィーによる分離が行なわれることが好ましい。上記溶離液の送液の機構としては特に限定されず、送液の駆動は公知の送液ポンプにより行われてもよく、電気浸透流により行なわれてもよい。

図４は、本発明のヘモグロビン類の測定システムにおいて、送液ポンプを有する場合を説明するための模式図である。図４に示すように、送液ポンプ３１を設置することによって、試料導入部２に添加された試料をクロマトグラフィー流路３に導くことができる。送液ポンプ３１は、図４のようにマイクロデバイス３０上に設置してもよいし、マイクロデバイス３０の外に設置して試料導入部２に接続してもよい。また、送液ポンプ３１の仕様によっては、試料導入部２とクロマトグラフィー流路３の間に設置してもよい。

図５は、本発明のヘモグロビン類の測定システムにおいて、電気浸透流により送液を行なう場合を説明するための模式図である。
図５に示すように、試料導入部２と排出部１１に電極３２を設置し、試料導入部２と排出部１１の間に電気浸透流を発生させることによって、試料導入部２内の試料をクロマトグラフィー流路３及び分画部９に導くことができる。

図６は、本発明のヘモグロビン類の測定システムにおいて、電気浸透流により送液を行なう場合を説明するための模式図である。
図６に示すように、試料導入部２よりも上流側に、電気浸透流発生流路３５を設置し、同流路の両端部に電極３２を設置して、同流路３５内に電気浸透流を発生させ、該電気浸透流の駆動力を試料導入部２に導くことで、試料導入部２内の試料をクロマトグラフィー流路３及び分画部９まで移動させることができる。
電気浸透流を発生させる方法としては特に限定されず、公知の方法に基づき行なわれ、例えば、上記電極３２を電源装置３４に接続することにより実施できる。該電源装置３４は、後述する電気泳動を実施する際に用いられる電源装置と共有化してもよい。
上記電気浸透流発生流路３５の形状、大きさは特に限定されず、試料を充分に移動できる駆動力を発生させうる形状、大きさであればよい。

上記マイクロデバイスは、分画部を有し、上記クロマトグラフィー流路は、分画部を介して、電気泳動流路に連通している。
上記分画部９の仕様、すなわちクロマトグラフィー流路３及び電気泳動流路６の接続機構は特に限定されないが、クロマトグラフィー流路３におけるクロマトグラフィーにより分画された成分の内の電気泳動に供すべき目的成分のみを、電気泳動流路６に導きうる構造である必要がある。例えば、図２に示すように、クロマトグラフィー流路３と電気泳動流路６が十字型に交わる構成とした場合、クロマトグラフィー流路３におけるクロマトグラフィーにより分画された成分は、上記送液機構により排出部１１に向かって順次導かれる。電気泳動に供すべき成分が分画部９に移動してきた時に、該成分を電気泳動流路９に導いて電気泳動を行なう。

上記成分を電気泳動流路６に導く方法としては、例えば、電気泳動法によって導く方法等が挙げられる。
図７は、目的成分を電気泳動流路に導く方法を説明するための模式図である。図７に示すように、電気泳動流路６の両端のリザーバに７及び１０に電源装置４１に接続された電極４２を設置する。クロマトグラフィー流路３におけるクロマトグラフィーにより分画された成分（図７中ａ、ｂ、ｃ及びｄ）が順次、分画部９に導かれる（図７中、点線矢印）。電気泳動に供される目的成分、すなわち、エンドプロテーゼ処理された血液試料成分のうち、ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡｏ由来のβ鎖Ｎ末端の各断片又は両者の混合物を成分ｃとすると、成分ｃが分画部９の位置に移動してきた時に、上記電極４２に電圧を印加する。電気泳動により成分ｃのみが電気泳動流路６に導かれる。その際、上述の送液機構による駆動力は停止してもよい。

上記電気泳動流路６において行われる電気泳動法は、微細流路による公知の電気泳動法；すなわちキャピラリー電気泳動法又はマイクロチップ電気泳動法と同様の方法に基づいて行なわれる。例えば、電解質を含む泳動用緩衝液が満たされた電気泳動流路６において、該緩衝液に接する電極を流路上の任意の位置に設置し、電圧を印加して検出位置１２の方向に電気泳動を行うことにより実施される。

上記電気泳動流路６の素材、形状、大きさは特に限定されず、流路６の素材としては、上記マイクロデバイスの素材として用いられる素材と同一の群から選ばれる素材であってよく、また、上記素材からなる流路６の内表面に、各種の表面改質処理をしたものであってもよい。ここでいう表面改質処理とは、紫外線処理、プラズマ処理等の光学的処理；各種化学物質の反応、オゾン水処理等による化学処理、各種ポリマー等のコーティングによる被覆処理等が挙げられる。最終的に内表面は、血液試料の成分が非特異的な吸着を起さないよう、親水性を示すものであることが好ましい。
上記電気泳動流路６の長さ方向の形状は特に限定されないが、直線状であることが好ましい。上記電気泳動流路６の断面の形状は特に限定されないが、円状、矩形状であってもよい。

上記電気泳動流路６の長さは、好ましい下限が１ｍｍ、好ましい上限が１００ｍｍである。１ｍｍ未満であると、試料を充分分離することが困難となる場合があり、１００ｍｍを超えると、分離に時間がかかり測定時間が延長する場合がある。
上記電気泳動流路６の口径は、好ましい下限が１μｍ、好ましい上限が１００μｍである。口径が１μｍ未満であると充填剤による圧力損失が増大する可能性がある。１００μｍを超えると、試料が拡散し、分離性能が劣化する可能性がある。
なお、上記電気泳動流路６の素材、内表面の性情、長さ方向及び断面の形状、長さ、口径等は、マイクロデバイスに形成された他の部分の流路と同一であってもよいし、異なっていてもよい。

上記電気泳動流路６内の緩衝液に接触する電極の設置位置としては、上記分画部９及び検出位置１２を挟み、電気泳動流路６内の緩衝液に接触できる位置であれば特に限定されず、例えば、リザーバ７及びリザーバ１０内の緩衝液に接触できる位置等が挙げられる。
上記電極の大きさ、形状、材質等は特に限定されず、公知の大きさ、形状、材質の電極を用いることができ、例えば、緩衝液に接触する面積が１０μｍ２以上の大きさ；円柱状、板状等の形状；白金、チタン、ガラス、カーボン、樹脂等の材質等、公知の電極を挙げることができる。

上記電極によって印加される電圧は、好ましい下限が１００Ｖ、好ましい上限が５０００Ｖである。１００Ｖ未満であると、電気泳動が充分行なわれず、目的とする成分が分離できない可能性がある。５０００Ｖを超えると、ピークの変形等が発生しやすく、正確な測定ができなくなることがある。より好ましい下限は２００Ｖ、より好ましい上限は４０００Ｖである。

上記電気泳動流路６に満たされる緩衝液としては、緩衝能を有する従来公知の緩衝能成分を含有する溶液であれば特に限定されず、例えば、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸等の有機酸、及び、その塩類；グリシン、タウリン、アルギニン等のアミノ酸類；塩酸、硝酸、硫酸、リン酸、ホウ酸、酢酸等の無機酸、及びこれらの塩類；あるいは緩衝能を有するこれらの誘導体類等の緩衝能成分を含有する溶液が挙げられる。これらの緩衝能成分は、単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。
上記緩衝液のｐＨは、好ましい下限が１、好ましい上限が８、より好ましい下限が２、より好ましい上限が６である。
また、上記緩衝液は、上記クロマトグラフィー流路におけるクロマトグラフィーに用いられる溶離液と同一の緩衝液であってもよいし、異なっていてもよい。

本発明１のヘモグロビン類の測定システムは、上記マイクロデバイスにおいて目的成分を検出するための検出部を有する。
上記検出部は、例えば、図１に示すように、光源２０４、検出器２０１を有する。光源２０４から発せられた測定光が入光素子２０３を介して、マイクロデバイス１の電気泳動流路６の任意の位置に設置された検出位置に照射され、電気泳動流路６内の分離された各成分を透過した測定光が受光素子２０２に検知されて検出器２０１により検出される。

上記電気泳動流路６における電気泳動により分離された成分；すなわち、ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡｏ由来のβ鎖Ｎ末端の各断片は、電気泳動流路６上の検出位置１２において検出される。
上記検出原理としては特に限定されず、測定対象であるＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡｏ由来のβ鎖Ｎ末端の各断片が検出できる方法であればよく、公知の光学的検出方法、電気化学的検出方法等が挙げられる。なかでも、光学的検出方法が簡便であることから好ましい。

上記光学的検出方法としては特に限定されず、例えば、では、紫外領域又は可視領域の波長を有する測定光を、電気泳動流路６の検出位置１２において、電気泳動により分離された各成分に照射し吸光度を測定する方法が挙げられる。
上記光学的検出方法において、照射する測定光は、特定波長の測定光のみを照射してもよいし、電気泳動流路６の検出位置１２を通過する前後において分光してもよい。
また、例えば、図１における入光素子２０３及び受光素子２０２に、レンズ等の装置を具備させる公知の技術を用いてもよい。
上記光学的検出方法において、測定波長としては特に限定されないが、好ましい下限が１９０ｎｍ、好ましい上限が５００ｎｍの紫外領域又は可視領域の波長である。

本発明１のヘモグロビン類の測定システムは上記マイクロデバイスに接続された電源部を有する。
上記電源部は、例えば、図１に示すように、電源装置１０１を有する。外電源装置１０１は、ケーブルによりマイクロデバイス１００内に設置された電極１０２に接続され、電気泳動を行なう際の電圧の印加に用いられる。
また、上記電源装置１０１は、上記に記載の送液機構のために用いられてもよい。

本発明２のシステムは、電気泳動法を用いて安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定するための測定システムであって、血液試料を導入するための試料導入部、エンドプロテアーゼを含む試薬を供給するための試薬部、前記試料導入部及び前記試薬部と連通し前記試薬と前記血液試料とを反応させる反応部、前記反応部と連通するクロマトグラフィー用流路、前記クロマトグラフィー流路に連通する分画部、並びに、前記分画部に連通する電気泳動用流路を有するマイクロデバイスと、前記マイクロデバイスに接続された電源部と、前記マイクロデバイスにおいて目的成分を検出するための検出部とを備えるヘモグロビン類の測定システムである。

本発明２のヘモグロビン類のシステムは、マイクロデバイスに導入される試料、及び、マイクロデバイスの構成について本発明１のヘモグロビン類の測定システムと異なる。
本発明１のヘモグロビン類のシステムでは、エンドプロテアーゼ処理された血液試料をマイクロデバイスに添加したが、本発明２のヘモグロビン類のシステムでは、エンドプロテアーゼ処理されていない血液試料をマイクロデバイスに添加する。
本発明１のヘモグロビン類のシステムに用いられるマイクロデバイスでは、マイクロデバイスに添加された試料はクロマトグラフィー流路に導かれるが、本発明２のヘモグロビン類のシステムに用いられるマイクロデバイスでは、マイクロデバイスに添加された試料は、まずエンドプロテアーゼを含む試薬と反応させられ、その後クロマトグラフィー流路に導かれる。すなわち、本発明２のシステムは、本発明１のヘモグロビン類のシステムは、測定試料のエンドプロテアーゼ処理をシステムに導入する前に行っていたが、本発明２のヘモグロビン類のシステムは、エンドプロテアーゼ処理をマイクロデバイス内で行なうものである。

図３は、本発明２のヘモグロビン類のシステムに用いられるマイクロデバイスの構成例を示す模式図である。図２に示すように、マイクロデバイス２０は、試料導入部２を有し、血液試料が添加される。血液試料は、まず試料導入部２に連通している反応部２２に導かれる。反応部２２は試薬部２１と連通しており、血液試料と該試薬部２１が有する試薬が反応部２２において混合される。反応部２２における反応が終了した後、反応物試料は反応部２２に連通するクロマトグラフィー流路３に導かれる。クロマトグラフィー流路３には充填剤が充填されており、試料中の各成分に分画される。分画された成分の内、電気泳動に供されるべき目的成分が、クロマトグラフィー流路３と電気泳動流路６が合流する分画部９に来た場合、該成分のみが電気泳動流路６に導かれ、電気泳動流路６において電気泳動が実施される。電気泳動流路６内において分離された各成分は、検出位置１２において順次検出される。
上記マイクロデバイス２０と、本発明１のヘモグロビン類の測定システムに用いられるマイクロデバイスとは、上記マイクロデバイス２０がエンドプロテアーゼ処理機構、すなわち、試薬部２１及び反応部２２を有している点で相違する。相違点である試薬部２１及び反応部２２以外の部分は、本発明１のシステムに用いられるマイクロデバイスと同様の仕様のものを用いることができる。

本発明２のヘモグロビン類の測定システムに用いられるマイクロデバイスに添加される試料は、血液試料である。本発明２のヘモグロビン類の測定システムでは、本発明１のヘモグロビン類の測定システムと異なり、エンドプロテアーゼ処理されている必要はない。
上記血液試料を得るための血液は公知の方法、すなわち、例えばＥＤＴＡ、フッ化ナトリウム、ヘパリン等の抗凝固剤存在下での採血、等の方法により採血される。上記血液試料を調整する方法としては特に限定されず、例えば、得られた血液をそのまま、又は、遠心処理して血球分画を採取し、生理食塩水や緩衝液等の塩溶液に溶解する方法等が挙げられる。必要に応じて、不安定型ＨｂＡ１ｃを除去する操作；すなわち３０〜４０℃で加温する方法、公知の不安定型ＨｂＡ１ｃ除去試薬を添加する方法等を行なってもよい。
図３に示すように、得られた血液溶液は、本発明２のシステムの試料導入部２に添加される。上記試料導入部２は反応部２２に連通している。

上記試料導入部２に添加された血液試料は、連通する反応部２２に導かれる。試料導入部２から反応部２２への導入方法は、本発明１のヘモグロビン類の測定システムにおける送液機構と同様の方法によって行うことができる。上記反応部２２内において、血液試料はエンドプロテアーゼを含む試薬と混合され、酵素処理が行なわれる。反応終了後、反応物は反応部２２と連通するクロマトグラフィー流路３に導かれる。

上記反応部２２内における血液試料と試薬の混合は、両者充分に混合され、酵素反応が行なわれる状況が作り出される状態とすることができれば特に限定されず、例えば、反応部２２に導かれた血液試料に、反応部２２とは別に設けられた試薬部２１内に保持された試薬が、反応部２２に導かれて混合される機構；試薬部２１の試薬が事前に反応部２２内に移動され、そこに血液試料が導かれて混合される機構等であってよい。
混合された血液試料及び試薬は、一定時間加温されて反応が行なわれることが好ましい。その際、送液機構は停止されていてもよいし送液されながら反応が行なわれてもよい。

上記反応部２２の形状、大きさは特に限定されず、上記酵素反応が行なわれうる環境を提供できる形状、大きさであればよく、例えば、一定の空間を有する反応室であってもよいし、流路状の反応部で、曲線を有する流路であってもよい。
上記反応部２２は、恒温槽２３内に設置されること、すなわち、少なくともエンドプロテアーゼ処理の反応を行なう際に、温度制御が行なわれるための機構が付属することが好ましい。

上記酵素反応に供される試薬は、本発明１のヘモグロビン類の測定システムにおいて、マイクロデバイスの試料導入部に導入する血液試料を処理したエンドプロテアーゼ（エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ（ＥＣ３．４．２１．１９））を含む。
上記エンドプロテアーゼとの反応により、血液試料中に含まれるヘモグロビンから、ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡｏ由来のβ鎖Ｎ末端の各断片が作られる。

上記エンドプロテアーゼは、緩衝液溶液とされていることが好ましい。
上記緩衝液としては、公知の緩衝液類が用いれられ、上記本発明１のシステムにおける電気泳動時に用いられる緩衝液類等で挙げられる。緩衝液のｐＨは、好ましい下限が２、好ましい上限が８、より好ましい下限が３、より好ましい上限が７である。

図３に示すように、試薬部２１は上記反応部２２に連通している。試薬部２１の設置位置は特に限定されず、図３に示すように、マイクロデバイス２０上に設置されてもよいし、マイクロデバイス２０外から試薬を供給する構成としてもよい。
上記試薬部２１内の試薬を反応部２２に供給する機構は特に限定されず、本発明１のヘモグロビン類の測定システムと同様の送液機構等を用いることができる。
また、予め反応部２２内に試薬を予め必要量のみ保持していてもよい。その場合、上記反応部２２は試薬部２１を兼ねることができ、試薬部２１は別途設ける必要はない。

図３に示すように、マイクロデバイス２０内の反応部２２にてエンドプロテアーゼ処理された試料は、連通するクロマトグラフィー流路３に導かれる。クロマトグラフィー流路３におけるクロマトグラフィー工程以降は、本発明１のヘモグロビン類の測定システムと同様に処理され、電気泳動を経て検出される。

本発明２のヘモグロビン類の測定システムは、上記マイクロデバイスと接続された電源部と、上記マイクロデバイスにおいて目的成分を検出するための検出部とを備える。
本発明２のヘモグロビン類の測定システムにおける上記電源部及び検出部は、本発明１のヘモグロビン類の測定システムと同様のものを用いることができる。

本発明のヘモグロビン類の測定システムにおいて、上記マイクロデバイスは、一つのマイクロデバイス上に複数の各流路が設けられていてもよい。
また、上記マイクロデバイスは繰り返し使用してもよいし、１回限りの使用であってもよい。

本発明のヘモグロビン類の測定システムは、更に、上記マイクロデバイス、電源部及び検出部を制御するための制御部、取得したデータの処理等を行なうデータ処理部等、公知の分析機器に用いられる付属部品を備えていてもよい。これらの公知部品を付属することにより、本発明１及び本発明２のシステムを自動化することもできる。

本発明のヘモグロビン類の測定システムを用いることによって、ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡｏ由来のβ鎖Ｎ末端の各断片の存在量を電気泳動によるエレクトロフェログラム上のシグナル量として検知することができる。
ＨｂＡ１ｃ由来のβ鎖Ｎ末端の断片の量をＸ、ＨｂＡ１ｃ及びＨｂＡｏ由来のβ鎖Ｎ末端の断片の量をＹとした場合、下記式（１）により、安定型ＨｂＡ１ｃ量（％）を算出する。
安定型ＨｂＡ１ｃ（％）＝Ｘ／（Ｘ＋Ｙ）×１００ （１）
本発明１のヘモグロビン類の測定システムを用いることによって、上記式（１）により算出された安定型ＨｂＡ１ｃ（％）は、修飾Ｈｂ類や異常Ｈｂ等の影響を受けることなく、測定することができる。

本発明１によれば、エンドプロテアーゼ処理された血液試料を、マイクロデバイス上でクロマトグラフィー及び電気泳動法により分離し、安定型ＨｂＡ１ｃを高精度に測定することができる。クロマトグラフィー及び電気泳動を一つのマイクロデバイス上で処理できるため、小型で簡単な構成のシステムで測定を行なうことができる。
本発明２によれば、エンドプロテアーゼ処理をマイクロデバイス上で行なうことができるため、更に簡便な操作で測定を行なうことができる。
本発明によれば、安定型ＨｂＡ１ｃを１試料当たり数分という短時間で、同時再現性を示すＣＶ値が１．０％程度という高精度で測定することが可能となることから、従来技術では困難であった糖尿病患者の電気泳動法によるＨｂＡ１ｃ値の管理を好適に行うことができる。

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。

（実施例１）
（本発明１のヘモグロビン類の測定システムの作製）
図１の構成図に基づき本発明１のヘモグロビン類の測定システムを作製した。電源装置１０１は多チャンネルハイボルテージシーケンサ電源装置（ラボスミス社製：ＨＶＳ４４８）、光源２０４は３０Ｗ重水素光源装置（オーシャンオプティクス社製：Ｄ２０００）を用い、検出器２０１はＣＣＤ分光器（Ｂ＆Ｗテック社製：ＢＴＣ１１２）とし、分光された２１４ｎｍの吸光度を、自作プログラムによりデータ処理した。

（マイクロデバイスの作製）
フューズドシリカ製の基板を用い、図２に示したマイクロデバイス１（外観寸法：５０ｍｍ×１００ｍｍ）を作製した。該デバイス内の流路幅は、クロマトグラフィー流路３の内、充填剤が充填されている部分のみ内径５ｍｍとし、他の部分は、電気泳動流路６も含めて１００μとした。また、クロマトグラフィー流路３の内、充填剤が充填されている部分の長さを３０ｍｍ、電気泳動流路６の内、分画部９から検出位置１２までの長さを３０ｍｍとした。

送液機構は図６に示した機構、すなわち、電気浸透流を駆動力とする送液機構を採用し、電極３２及び電気浸透流発生流路３５を内蔵したチップ搭載型リザーバ付ポンプ（ナノフュージョン社製：ＲＰ−３）を用いた。全流路は、使用前に、０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、蒸留水、０．５Ｎ塩酸水溶液及び蒸留水を順次通液して洗浄した。
図６における電極３２は、白金電極（直径１ｍｍ×長さ２０ｍｍ）を用い、上記電源装置１０１に電源ケーブルにて接続した。

（充填剤及びクロマトグラフィー流路の作製）
トリエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製：ＮＫエステル３Ｇ）２００ｇに、テトラメチロールメタントリアクリレート（新中村化学社製：ＮＫエステルＡ−ＴＭＭ−３）３００ｇ及び過酸化ベンゾイル（ナカライテスク社製）１．２ｇを溶解し、攪拌しながら窒素雰囲気下にて昇温し、８０℃で１２時間重合した。得られた重合体をイオン交換水及びアセトンにて洗浄して乾燥させた後、分級機（日鉄鉱業社製：エルボージェットＥＪ−３）にて分級した。得られた重合体粒子（充填剤）の平均粒子径は、３．５μｍであった。この充填剤を、上記のマイクロデバイス内のクロマトグラフィー用流路３（図２）に、充填した。

（健常人試料の調製）
健常人よりＥＤＴＡ採血した血液１．５mＬを遠心分離（３０００ｇ×１０分間）し、血漿と血球を分離した。血漿を除去した後、生理食塩水１０ｍＬを添加して２回洗浄した。更に、１０ｍＬの生理食塩水を血球に添加して３７℃で４時間加温し、不安定型ＨｂＡ１ｃを除去した。上清を除去した後、リン酸緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解した。

（エンドプロテアーゼ処理）
得られた血液溶液２００μＬに、２００μｇ／ｍＬのエンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ（ロッシュ社製）水溶液５０μＬ及び５０ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ４．５）２５０μＬを添加した。ゆるやかに攪拌しながら、３７℃で１８時間反応させた。得られた反応物１００μＬを、上記で作製したシステムの試料導入部に添加した。

（測定）
予め、０．０１重量％のテトラフルオロ酢酸を含むリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）をクロマトグラフィー流路に満たしておき、クロマトグラフィーを行なった。添加してから５分後、予め、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３．０）を満たした電気泳動流路６の両端に設置した電極４２（図７）に１２００Ｖの電圧を印加して、電気泳動を実施した。２１４ｎｍの吸光度を測定したところ、図８に示すエレクトロフェログラムが得られた。
図８中、ピーク１はＨｂＡｏ由来のβ鎖Ｎ末端の断片、ピーク２はＨｂＡ１ｃ由来のβ鎖Ｎ末端の断片を示す。各ピーク面積値から、上記式（１）からＨｂＡ１ｃ（％）を算出したところ、４．０％であった。
また、同一の健常人試料を１０回連続して測定（同時再現性試験）した際の、安定型ＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値は、０．８４％と良好な再現性を示した。

（実施例２）
（本発明２のヘモグロビン類の測定システムの作製）
図１の構成図に基づき本発明２のシステムを作製した。電源装置１０１、光源２０４、検出器２０１は、実施例１と同様のものを用いた。

（マイクロデバイスの作製）
ポリジメチルシロキサン製の基板を用い、実施例１と同世のマイクロデバイスを作製した。但し、図３に示す試薬部２１及び反応部２２を、試薬導入部２とクロマトグラフィー流路３の間に設けた。反応部２２は恒温槽内に設置した。他の構成は実施例１のマイクロデバイスと同様とした。

実施例１と同様の方法により健常人試料を調製し、得られた血液溶液１００μＬを、上記で得られたマイクロデバイスの試料導入部に添加した。また、試薬部２１に、２００μｇ／ｍＬのエンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃを含む、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）３００μＬを添加した。
健常人試料を添加し、上記実施例１と同様の方法により送液して反応部に導いた。一方試薬部２１のエンドプロテアーゼを含む緩衝液も反応部２２に導き、反応させた。反応部２２を３７℃として３０分間反応させた。その後、反応液を、実施例１と同様の充填剤を充填したクロマトグラフィー流路３に送液した。更に、上記反応終了後から６分後に、電気泳動流路６の両対に設置した電極４２（図７）に９００Ｖの電圧を印加し、電気泳動を実施した。２１４ｎｍの吸光度を測定したところ、図８と同様のエレクトロフェログラムが得られた。
各ピーク面積値から、上記式（１）を用いてＨｂＡ１ｃ（％）を算出したところ、４．０％であった。
また、実施例１と同様の同時再現性試験のおける、安定型ＨｂＡ１ｃ値のＣＶ値は、０．７９％と良好な再現性を示した。

本発明によれば、糖尿病の診断指標となる安定型ヘモグロビンＡ１ｃを高精度に測定することができる簡便で安価なヘモグロビン類の測定システムを提供することができる。

本発明のヘモグロビン類の測定システムの構成を模式的に示す斜視図である。 本発明１のヘモグロビン類の測定システムに用いられるマイクロデバイスの構成を示す模式図である。 本発明２のヘモグロビン類のシステムに用いられるマイクロデバイスの構成例を示す模式図である。 本発明のヘモグロビン類の測定システムにおいて、送液ポンプを有する場合を説明するための模式図である。 本発明のヘモグロビン類の測定システムにおいて、電気浸透流により送液を行なう場合を説明するための模式図である。 本発明のヘモグロビン類の測定システムにおいて、電気浸透流により送液を行なう場合を説明するための模式図である。 目的成分を電気泳動流路に導く方法を説明するための模式図である。 実施例１等の測定条件により得られたエレクトロフェログラムを示す。

Claims (2)

1. 電気泳動法を用いて安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定するための測定システムであって、
   エンドプロテアーゼ処理された血液試料を導入するための試料導入部、前記試料導入部に連通し、逆相系充填剤又はイオン交換系充填剤を充填したクロマトグラフィー用流路、及び、前記クロマトグラフィー流路に連通し、前記クロマトグラフィー流路におけるクロマトグラフィーにより分画された成分の内の電気泳動に供すべき目的成分のみを電気泳動流路に導く構造を有する分画部、前記分画部に連通し、前記目的成分を更に分離する電気泳動用流路を有するマイクロデバイスと、
   前記マイクロデバイスに接続された電源部と、
   前記マイクロデバイスにおいて目的成分を検出するための検出部とを備える
   ことを特徴とするヘモグロビン類の測定システム。
2. 電気泳動法を用いて安定型ヘモグロビンＡ１ｃを測定するための測定システムであって、
   血液試料を導入するための試料導入部、エンドプロテアーゼを含む試薬を供給するための試薬部、前記試料導入部及び前記試薬部と連通し前記試薬と前記血液試料とを反応させる反応部、前記反応部と連通し、逆相系充填剤又はイオン交換系充填剤を充填したクロマトグラフィー用流路、前記クロマトグラフィー流路に連通し、前記クロマトグラフィー流路におけるクロマトグラフィーにより分画された成分の内の電気泳動に供すべき目的成分のみを電気泳動流路に導く構造を有する分画部、並びに、前記分画部に連通し、前記目的成分を更に分離する電気泳動用流路を有するマイクロデバイスと、
   前記マイクロデバイスに接続された電源部と、
   前記マイクロデバイスにおいて目的成分を検出するための検出部とを備える
   ことを特徴とするヘモグロビン類の測定システム。

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