DE202016008838U1 - Vorrichtungen zur Probencharakterisierung - Google Patents

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Abstract

Vorrichtung, umfassend:
a) eine Mikrofluidik-Vorrichtung, die ein Substrat umfasst, wobei das Substrat definiert:
i) einen Trennkanal, der konfiguriert ist, um Trennung eines Analytgemisches durchzuführen; und
ii) eine Öffnung in Flüssigkeitsverbindung mit einem Ende des Trennkanals, wobei die Öffnung konfiguriert ist, um Elektrospray-Ionisation von getrennten Analytfraktionen durchzuführen, die aus dem Trennkanal mobilisiert wurden, und sie in ein Massenspektrometer auszustoßen; und
b) eine Bildgebungsvorrichtung, die konfiguriert ist, um sowohl die Trennung als auch die Elution der getrennten Analytfraktionen in dem Trennkanal oder einem Teil davon abzubilden.

Description

  • Verweise auf verwandte Anmeldungen.
  • Diese Anmeldung ist eine nicht vorläufige Anmeldung und beansprucht den Nutzen der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 62/260,944 , eingereicht am 30. November 2015, und der vorläufigen US-Patentanmeldung Nr. 62/338,074 , eingereicht am 18. Mai 2016, jeweils mit dem Titel „Devices, Methods, and Kits for Sample Characterization“, deren jeweilige Offenbarung hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezug aufgenommen wird.
  • Manche hierin beschriebenen Ausführungsformen beziehen sich auf Vorrichtungen und Verfahren zur Probencharakterisierung und verschiedene Verwendungen davon.
  • Abtrennung von Analytbestandteilen aus einem komplexeren Analytgemisch auf der Basis von einer inhärenten Qualität der Analyten und die Bereitstellung von Sätzen von Fraktionen, die für Zustände dieser Qualität angereichert sind, ist ein wesentlicher Bestandteil der analytischen Chemie. Die Vereinfachung komplexer Gemische auf diese Weise reduziert die Komplexität der nachgeschalteten Analyse. Es kann vorteilhaft sein, zwei oder mehr Anreicherungsschritte durchzuführen, die orthogonal sind (z.B. basierend auf unterschiedlichen und/oder nicht verwandten Qualitäten). In vielen Fällen ist jedoch der Vorgang der Durchführung von orthogonalen Anreicherungsschritten unter Verwendung bekannter Verfahren und/oder Vorrichtungen umständlich und kann den Analyten unter die Empfindlichkeit der nachgeschalteten analytischen Geräte verdünnen. Außerdem können Komplikationen auftreten beim Versuch, bekannte Anreicherungsverfahren und/oder - vorrichtungen mit analytischen Geräten und/oder Techniken zu verknüpfen.
  • Es wurden Verfahren verwendet, um Techniken zur Vorbereitung von Proteinproben mit nachgeschalteten Detektionssystemen wie Massenspektrometern zu verknüpfen. Ein gängiges Verfahren ist die Probenvorbereitung mittels Flüssigkeitschromatographie und die Sammlung von Fraktionen für die Massenspektrometrie (LC-MS). Dies hat den Nachteil, dass Proteinproben zu Peptidfragmenten verdaut werden müssen, was zu einer großen Anzahl von zu analysierenden Probenfraktionen und einer komplexen Datenrekonstruktion nach der Messung führt. Während bestimmte Formen der Flüssigkeitschromatographie an ein Massenspektrometer gekoppelt werden können, z.B. die Peptid-Map-Umkehrphasenchromatographie, beschränken sich diese bekannten Techniken auf die Verwendung von Peptidfragmenten statt von intakten Proteinen, was ihren Nutzen einschränkt.
  • Ein weiteres Verfahren zur Einbringung von Proben in ein Massenspektrometer ist die Elektrospray-Ionisation (ESI). Bei ESI werden kleine Tröpfchen von Probe und Lösung am distalen Ende einer Kapillare oder einer Mikrofluidik-Vorrichtung ionisiert, um eine Anziehungskraft auf die geladene Platte eines Massenspektrometers zu erzeugen. In diesem induzierten elektrischen Feld dehnt sich der Tropfen dann zu einem Kegel („Taylor-Kegel“) aus, der dann kleine Tropfen zur Analyse in das Massenspektrometer abgibt. Typischerweise geschieht dies in einer Kapillare, die ein geeignetes Volumen und eine geeignete Größe für ESI bietet. Kapillaren bieten jedoch einen linearen Strömungspfad, der keine mehrstufige Prozessierung ermöglicht.
  • Weitere Arbeiten wurden mit Mikrofluidik-Vorrichtungen durchgeführt. Mikrofluidik-Vorrichtungen können durch verschiedene bekannte Techniken hergestellt werden und Strömungskanäle definierter Breite bereitstellen, die ein Kanalnetzwerk bilden können, das für die Durchführung verschiedener Flüssigkeitsmanipulationen ausgelegt ist. Diese Vorrichtungen bieten ein zusätzliches Maß an Kontrolle und Komplexität im Vergleich zu Kapillaren. In Verbindung mit ESI umfassen bekannte Vorrichtungen nach außen kegelförmig zulaufende Spitzen und leitfähige Kanten, um ESI in diesen Vorrichtungen zu verbessern. Der äußere Kegel bekannter Mikrofluidik-Vorrichtungen, die für ESI verwendet werden, setzt jedoch die zerbrechliche Taylor-Kegelstruktur möglichen Störungen durch turbulente Luftströmung aus und führt zu einer Kontaktflächengeometrie, die nur einen begrenzten Bereich von Kegelradien unterstützt, was die Kontrolle über das Volumen begrenzt, das über ESI in das Massenspektrometer eingebracht wird. Zusätzlich kann Elektrolyse von Wasser an der leitfähigen Kante zur Bildung von Gasblasen führen, die bei der Ausbildung des Kegels stören.
  • Eine Anwendung für die Protein-Massenspektrometrie ist die Charakterisierung bei der Entwicklung und Herstellung von biologischen und biosimilaren Pharmazeutika. Biologische Arzneimittel und Biosimilars sind eine Klasse von Wirkstoffen, die beispielsweise rekombinante Proteine, Antikörper, Lebendvirus-Impfstoffe, aus menschlichem Plasma gewonnene Proteine, zellbasierte Arzneimittel, Proteine aus natürlicher Quelle, Antikörper-Wirkstoff-Konjugate, Protein-Wirkstoff-Konjugate und andere Protein-Arzneimittel umfasst.
  • Die Einhaltung regulatorischer Bestimmungen verlangt, dass biologische Arzneimittel während der Entwicklung und Herstellung umfangreiche Tests erfordern, die für niedermolekulare Wirkstoffe nicht erforderlich sind. Dies liegt daran, dass die Herstellung von biologischen Arzneimitteln komplexer ist, beispielsweise wegen lebenden Materials zur Herstellung des biologischen Arzneimittels, höherer Komplexität des biologischen Moleküls und höherer Komplexität des Herstellungsprozesses. Zu den Eigenschaften, die definiert werden müssen, gehören beispielsweise Ladung, Wirksamkeit, hydrophobe Veränderungen, Masse und Glycosylierung. Gegenwärtig werden diese Tests unabhängig voneinander durchgeführt, was zu einem sehr zeitaufwendigen und teuren Verfahren zur Charakterisierung von biologischen Arzneimitteln führt.
  • Zusammenfassung
  • Einige hierin beschriebene Ausführungsformen beziehen sich auf Vorrichtungen und Verfahren, die die Analyse von Analyten in einem Analytgemisch ermöglichen können. Zum Beispiel verlangen die Regulierungsbehörden viele spezifische Charakterisierungen von biologischen Proteinen. Hier beschriebene Verfahren und Vorrichtungen können zur Charakterisierung von Proteinen und/oder anderen Analyten geeignet sein. In einigen Ausführungsformen können sich die hierin beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen auf das Charakterisieren eines Analytgemisches beziehen, das einen oder mehrere Anreicherungsschritte umfasst, die durchgeführt werden, um ein Analytgemisch in angereicherte Analytfraktionen aufzutrennen.
  • In einigen Fällen können diese Analyten beispielsweise Glycane, Kohlenhydrate, DNA, RNA, intakte Proteine, verdaute Proteine, Antikörper-Wirkstoff-Konjugate, Protein-Wirkstoff-Konjugate, Peptide, Metaboliten oder andere biologisch relevante Moleküle sein. In einigen Fällen können diese Analyten niedermolekulare Wirkstoffe sein. In einigen Fällen können diese Analyten Proteinmoleküle in einem Proteingemisch sein, wie z.B. ein biologisches Proteinpharmazeutikum und/oder ein Lysat, das aus Zellen gewonnen wurde, die aus Kultur oder in vivo isoliert wurden.
  • Einige hierin beschriebene Ausführungsformen können einen ersten Anreicherungsschritt umfassen, in dem Fraktionen, die eine Teilmenge der Analytmoleküle aus dem ursprünglichen Analytgemisch enthalten, eluiert werden, jede Fraktion einzeln; diese angereicherten Analytfraktionen werden dann einem weiteren Anreicherungsschritt unterzogen. Im letzten Anreicherungsschritt werden die angereicherten Analytfraktionen zur weiteren Analyse ausgestoßen.
  • In einigen Ausführungsformen sind einer oder mehrere der Anreicherungsschritte Festphasentrennungen. In einigen Ausführungsformen sind einer oder mehrere der Anreicherungsschritte Trennungen in der Lösungsphase.
  • In einigen Ausführungsformen konzentriert ein finaler Schritt die angereicherten Analytfraktionen vor dem Ausstoß.
  • In einigen Ausführungsformen werden im Wesentlichen alle angereicherten Analytfraktionen aus dem letzten Anreicherungsschritt in einem kontinuierlichen Strom ausgestoßen. In einigen Ausführungsformen wird ein Teil des Analytgemisches (z.B. eine Fraktion von Interesse) aus einer Mikrofluidik-Vorrichtung über einen Auslass ausgestoßen, der zur Verbindung mit einem analytischen Instrument konfiguriert ist, wie z.B. einem Massenspektrometer oder einer anderen Vorrichtung, die zur Fraktionierung und/oder Anreicherung mindestens eines Teils der Probe konfiguriert ist. Ein anderer Teil des Analytgemisches (der z.B. andere Fraktionen als die Fraktion von Interesse enthält) kann über einen Abfallkanal ausgestoßen werden.
  • In einigen Ausführungsformen wird der Ausstoß unter Verwendung von Druck, elektrischer Kraft oder Ionisation oder einer Kombination davon durchgeführt.
  • In einigen Ausführungsformen wird der Ausstoß unter Verwendung von ElektrosprayIonisation (ESI) in beispielsweise ein Massenspektrometer durchgeführt. In einigen Ausführungsformen wird eine Hüllflüssigkeit als Elektrolyt für eine elektrophoretische Trennung verwendet. In einigen Ausführungsformen wird ein Zerstäubungsgas bereitgestellt, um die Analytfraktion zu einem feinen Spray zu reduzieren. In einigen Ausführungsformen werden andere lonisationsverfahren verwendet, wie z.B. induktiv gekoppelte Laserionisation, schneller Atombeschuss, weiche Laserdesorption, chemische Ionisation bei Atmosphärendruck, Sekundärionen-Massenspektrometrie, Funkenionisation, thermische Ionisation und dergleichen.
  • In einigen Ausführungsformen werden die angereicherten Fraktionen zur weiteren Analyse durch matrixunterstützte Laserdesorption/-ionisation, oberflächenverstärkte Laserdesorption/-ionisation, Immunoblot und dergleichen auf einer Oberfläche abgelagert.
  • Einige hierin beschriebene Ausführungsformen beziehen sich auf Vorrichtungen und Verfahren zum Visualisieren eines Analyten in einer elektrophoretischen Trennung vor und während des Ausstoßes von angereicherten Fraktionen.
  • Einige hierin beschriebene Ausführungsformen betreffen Vorrichtungen und Verfahren zum Visualisieren eines Analyten während eines Anreicherungsschritts.
  • Einige hierin beschriebene Ausführungsformen betreffen Vorrichtungen und Verfahren zum Visualisieren eines Analyten in einem Kanal zwischen Anreicherungszonen.
  • In einigen Ausführungsformen kann die Visualisierung eines Analyten über optische Detektion, wie Ultraviolettlichtabsorption, Absorption von sichtbarem Licht, Fluoreszenz, Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie, Fourier-Transformations-Nahinfrarotspektroskopie, Raman-Spektroskopie, optische Spektroskopie und dergleichen durchgeführt werden.
  • Einige hierin beschriebene Ausführungsformen betreffen Vorrichtungen, die die Analyse von Analytgemischen ermöglichen können, indem sie eine oder mehrere Anreicherungszonen und eine Öffnung enthalten, um angereicherte Analytfraktionen auszustoßen. In einigen Ausführungsformen umfassen diese Vorrichtungen mindestens eine Schicht, die für Licht einer bestimmten Wellenlänge nicht durchlässig ist, und mindestens eine Schicht, die für diese bestimmte Wellenlänge durchlässig ist. Ein oder mehrere Teile der Schicht, die für Licht nicht durchlässig sind, können die eine oder mehreren Anreicherungszonen definieren, sodass die Anreicherungszonen als optische Spalte dienen.
  • In einigen Ausführungsformen kann ein Analytgemisch durch eine Röhre oder eine Kapillare, die eine Vorrichtung mit einem Autosampler verbindet, in die Vorrichtung geladen werden. In einigen Ausführungsformen kann ein Analytgemisch direkt in ein Reservoir an der Vorrichtung geladen werden.
  • In einigen Ausführungsformen ist eine Öffnung, durch die mindestens ein Teil einer Probe aus einer Vorrichtung ausgestoßen werden kann, versenkt und/oder vom Luftstrom abgeschirmt. In einigen Ausführungsformen ist diese Öffnung nicht elektrisch leitend. Wie hierin verwendet, sollte unter versenkt verstanden werden, dass ein Abschnitt eines Substrats eine Aussparung definiert, die die Öffnung enthält, unabhängig von der Geometrie der Seiten oder Abschrägungen der Aussparung. Ebenso versteht sich, dass versenkt Senkbohrungen, konische und/oder kegelstumpfförmige Senkbohrungen, halbkugelförmige Bohrungen und dergleichen umfasst.
  • Einige hierin beschriebene Ausführungsformen beziehen sich auf eine Vorrichtung, wie beispielsweise eine Mikrofluidik-Vorrichtung, die ein Substrat enthält, das aus einem undurchsichtigen Material (z.B. Kalknatronglas, das für ultraviolettes Licht undurchsichtig ist) konstruiert ist. Das Substrat kann einen Mikrofluidik-Trennkanal definieren. Ebenso kann der Mikrofluidik-Trennkanal innerhalb des Substrats geätzt oder auf andere Weise gebildet werden. Der Mikrofluidik-Trennkanal kann eine Tiefe aufweisen, die der Dicke des Substrats entspricht. Ebenso kann der Mikrofluidik-Trennkanal über die gesamte Tiefe des Substrats (z.B. von oben bis ganz nach unten) geätzt werden. Auf diese Weise kann der Mikrofluidik-Trennkanal einen optischen Spalt durch das Substrat definieren. Eine transparente Schicht (z.B. eine obere Schicht) kann auf einer oberen Oberfläche des Substrats angeordnet sein, zum Beispiel um die obere Oberfläche des Substrats abzudichten. Eine transparente Schicht (z.B. eine untere Schicht) kann auch auf einer unteren Oberfläche des Substrats angeordnet sein, sodass sowohl die Oberseite als auch die Unterseite des Mikrofluidik-Trennkanals versiegelt sind. In einigen Ausführungsformen kann nur ein Teil der oberen Schicht und/oder der unteren Schicht transparent sein. Beispielsweise können die obere Schicht und/oder die untere Schicht ein transparentes Fenster in einem ansonsten undurchsichtigen Material definieren; das Fenster kann beispielsweise einen optischen Zugang zum Mikrofluidik-Trennkanal bieten.
  • Einige hierin beschriebene Ausführungsformen beziehen sich auf eine Vorrichtung, wie beispielsweise eine Mikrofluidik-Vorrichtung, die ein Substrat enthält. Das Substrat kann eine oder mehrere Anreicherungszonen oder -kanäle definieren. Beispielsweise kann das Substrat eine erste Anreicherungszone definieren, die ein Medium enthält, das konfiguriert ist, um an einen Analyten zu binden. Eine solche erste Anreicherungszone kann geeignet sein, ein Analytgemisch chromatographisch zu trennen. Die Vorrichtung kann außerdem zwei Elektroden enthalten, die elektrisch mit gegenüberliegenden Endabschnitten einer zweiten Anreicherungszone gekoppelt sind. Eine solche zweite Anreicherungszone kann geeignet sein, ein Analytgemisch elektrophoretisch abzutrennen. Die zweite Anreicherungszone kann mit der ersten Anreicherungszone so zusammenlaufen, dass, nachdem eine Fraktion eines Analyten in der ersten Anreicherungszone abgetrennt, konzentriert und/oder angereichert wurde, sie in der zweiten Anreicherungszone weiter abgetrennt, konzentriert und/oder angereichert werden kann. Die Vorrichtung kann auch eine eingesenkte Öffnung enthalten. Die Öffnung kann ein Auslass des zweiten Anreicherungskanals sein und kann auf einer versenkten oder auf andere Weise eingesenkten Oberfläche des Substrats angeordnet sein. Die Vorrichtung kann konfiguriert sein, um einen Teil eines Analytgemisches aus der Öffnung über ESI auszustoßen. Die Aussparung kann eine stabile Umgebung für die Bildung eines mit ESI verbundenen Taylor-Kegels bereitstellen und/oder kann konfiguriert sein, um eine Einlassöffnung eines Massenspektrometers aufzunehmen.
  • Einige hierin beschriebene Ausführungsformen beziehen sich auf ein Verfahren, das das Einleiten eines Analytgemisches in eine Mikrofluidik-Vorrichtung umfasst, die einen Trennkanal enthält. Über den Trennkanal kann ein elektrisches Feld angelegt werden, um eine Trennung des Analytgemisches zu bewirken. Das Analytgemisch kann während der Trennung mittels eines transparenten Teils der Mikrofluidik-Vorrichtung abgebildet werden. Ebenso kann ein Fenster und/oder ein optischer Spalt einen optischen Zugang zu dem Trennkanal bereitstellen, sodass der gesamte Trennkanal oder ein Teil davon abgebildet werden kann, während die Trennung stattfindet. Ein Teil des Analytgemisches kann aus einer Öffnung ausgestoßen werden, die in Flüssigkeitsverbindung mit dem Trennkanal steht. Beispielsweise kann die Fraktion über ESI ausgestoßen werden. In einigen Ausführungsformen kann die Öffnung auf einer versenkten Oberfläche der Mikrofluidik-Vorrichtung angeordnet sein, sodass sich ein Taylor-Kegel in einer durch die versenkte Oberfläche definierten Aussparung bildet.
  • Einige hierin beschriebene Ausführungsformen beziehen sich auf ein Verfahren, das das Injizieren eines Analyten in eine Mikrofluidik-Vorrichtung umfasst, die einen ersten Trennkanal und einen zweiten Trennkanal enthält. Der erste Trennkanal kann ein Medium enthalten, das konfiguriert ist, um einen Analyten aus dem Analytgemisches zu binden. So kann, wenn das Analytgemisch in die Mikrofluidik-Vorrichtung injiziert wird, mindestens ein Teil des Analytgemisches an die Matrix gebunden werden und/oder dabei aufgehalten werden, durch den ersten Trennkanal zu fließen. Zum Beispiel kann das Injizieren des Analyten in die Mikrofluidik-Vorrichtung eine chromatographische Trennung in dem ersten Trennkanal bewirken. Ein Elutionsmittel kann in die Mikrofluidik-Vorrichtung injiziert werden, sodass mindestens eine Fraktion des Analyten aus dem Medium mobilisiert wird. Der erste Trennkanal kann abgebildet werden, während der Analyt mobilisiert wird. Die Bildgebung der ersten Trennung kann das Abbilden einer ganzen Säule (z.B. eines ganzen Kanals) und/oder das Abbilden eines Teils des Kanals umfassen. Ein elektrisches Feld kann an den zweiten Trennkanal angelegt werden, wenn die Bildgebung feststellt, dass sich die Fraktion an einem Schnittpunkt des ersten Trennkanals und des zweiten Trennkanals befindet, sodass die Fraktion in den zweiten Trennkanal mobilisiert wird. Beispielsweise kann in einigen Ausführungsformen der erste Trennkanal orthogonal zum zweiten Trennkanal sein. Ebenso können der erste Trennkanal und der erste Trennkanal eine T-Verbindungsstelle bilden. Die Bildgebung kann detektieren, wann sich ein Teil der Fraktion (z.B. ein Teil von Interesse) an der Verbindungsstelle befindet. Das Anlegen des elektrischen Feldes kann den Teil der Fraktion (und optional keine anderen Teile der Fraktion, die sich nicht an der Verbindungsstelle befinden) für eine zweite Trennstufe in den zweiten Trennkanal mobilisieren. Zumindest ein Teil der Fraktion kann aus der Mikrofluidik-Vorrichtung ausgestoßen werden.
  • Figurenliste
    • 1 ist eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur zweidimensionalen Trennung und ESI einer automatisch geladenen Probe gemäß einer Ausführungsform.
    • 2 ist eine schematische Explosionsansicht einer Vorrichtung mit drei Schichten gemäß einer Ausführungsform.
    • 3 ist eine schematische Darstellung eines Lichtwegs durch eine Mikrofluidik-Vorrichtung gemäß einer Ausführungsform.
    • 4 ist eine schematische Darstellung einer Vorrichtung für IEF und ESI einer automatisch geladenen Probe gemäß einer Ausführungsform.
    • 5 ist eine schematische Darstellung einer Mikrofluidik-Vorrichtung gemäß einer Ausführungsform.
    • 6 ist ein Flussdiagramm eines beispielhaften Verfahrens zur Analytcharakterisierung.
    • 7 ist eine schematische Darstellung einer Mikrofluidik-Vorrichtung gemäß einer Ausführungsform.
    • 8 ist eine schematische Darstellung einer Mikrofluidik-Vorrichtung gemäß einer Ausführungsform.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Es versteht sich, dass sowohl die vorstehende allgemeine Beschreibung als auch die folgende Beschreibung nur beispielhaft und erläuternd sind und die hier beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen nicht beschränken. In dieser Anmeldung schließt die Verwendung des Singulars den Plural ein, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben. Auch die Verwendung von „oder“ bedeutet „und/oder“, sofern nicht anders angegeben. Ebenso sollen „umfassen“, „umfasst“, „umfassend“, „einschließen“, „schließt ein“ und „einschließlich“ nicht einschränkend sein.
  • Vorrichtungen
  • 1 ist eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur zweidimensionalen Trennung und ESI einer automatisch geladenen Probe gemäß einer Ausführungsform. Ein Mikrofluidik-Netzwerk 100 ist durch ein Substrat 102 definiert. Das Substrat ist aus einem Material hergestellt, das mit den durchgeführten Anreicherungsschritten kompatibel ist. Beispielsweise werden chemische Verträglichkeit, pH-Stabilität, Temperatur, Transparenz bei verschiedenen Lichtwellenlängen, mechanische Festigkeit und dergleichen in Verbindung mit der Materialauswahl berücksichtigt.
  • Das Substrat 102 kann aus Glas, Quarz, Quarzglas, Kunststoff, Polycarbonat, PFTE, PDMS, Silicium, polyfluoriertem Polyethylen, Polymethacrylat, Cycloolefin-Co-Polymer, Cycloolefin-Polymer, Polyether-Etherketon und/oder irgendeinem anderen geeigneten Material hergestellt sein. Materialmischungen können verwendet werden, wenn unterschiedliche Eigenschaften in unterschiedlichen Schichten eines planaren Substrats und/oder eines anderen geeigneten Materials erwünscht sind. Materialmischungen können verwendet werden, wenn unterschiedliche Eigenschaften in unterschiedlichen Schichten eines planaren Substrats erwünscht sind.
  • Die Kanäle 106, 110, 114, 116, 118, 124, 122, 126, 132, 136 und 140 bilden das Mikrofluidik-Netzwerk 100 und werden in das Substrat 102 eingearbeitet. Ebenso definiert das Substrat 102 die Kanäle 106, 110, 114, 116, 118, 124, 122, 126, 132, 136 und/oder 140.
  • Kanäle können in das Substrat durch ein beliebiges Kanalherstellungsverfahren eingearbeitet werden, wie beispielsweise photolithographisches Ätzen, Formen, Bearbeiten, additives (3D) Drucken und dergleichen.
  • Analytgemische und externe Reagenzien können durch die Röhre/Leitung 112 geladen werden und überschüssiges Reagenz/Abfall kann durch die Röhre/Leitung 130 entfernt werden.
  • Die Röhren 112 und 130 können aus jedem Material hergestellt werden, das mit dem durchzuführenden Assay kompatibel ist, einschließlich beispielsweise Quarzglas, Quarzglas-Kapillarröhren, Silikonschläuchen und/oder PTFE-Schläuchen.
  • Die Kanäle 116 und 124 können verwendet werden, um einen Analyten und/oder einen Teil (z.B. eine Fraktion) eines Analyten abzutrennen und/oder anzureichern. Die Kanäle 116 und/oder 124 können verwendet werden, um chromatographische Trennungen (z.B. Umkehrphase, Immunpräzipitation, lonenaustausch, Größenausschluss, Ligandenaffinität, Farbstoffaffinität, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, hydrophile Wechselwirkungschromatographie, pH-Gradienten-lonenaustausch, Affinität, kapillare elektrokinetische Chromatographie, mizellare elektrokinetische Chromatographie, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), Aminosäureanalyse-HPLC, Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographie, Peptid-Mapping-HPLC, Feldflussfraktionierung-Mehrwinkel-Lichtstreuung) oder elektrophoretische Trennungen (z.B. isoelektrische Fokussierung, Kapillar-Gelelektrophorese, Kapillarzonen-Elektrophorese, Isotachophorese, kapillare elektrokinetische Chromatographie, mizellare elektrokinetische Chromatographie, Flow-counterbalanced Kapillarelektrophorese, elektrische Feldgradientenfokussierung, dynamische Feldgradientenfokussierung) durchzuführen. Zum Beispiel kann der Kanal 116 derivatisiert oder mit Material gepackt werden, um einen ersten Anreicherungsschritt durchzuführen.
  • Das in Kanal 116 und/oder 124 angeordnete Material kann ausgewählt werden, um Analyten auf der Grundlage von beispielsweise Hydrophobizität (Umkehrphase), Immunaffinität (Immunpräzipitation), Affinität (Wirksamkeit), Größe (Größenausschlusschromatographie) und Ladung (lonenaustausch) oder durch andere Formen der Flüssigkeitschromatographie einzufangen.
  • Es können viele verschiedene Verfahren angewendet werden, um das Anreicherungsmaterial in den Kanälen 116 und/oder 124 anzuordnen. Die Wände können direkt mit beispielsweise kovalent gebundenen oder adsorbierten Molekülen derivatisiert werden oder es können Kügelchen, Glaspartikeln, Sol-Gel oder dergleichen derivatisiert und in diese Kanäle geladen werden.
  • Nachdem die Probe in den Kanal 116 geladen wurde, können Waschlösung und dann Elutionsreagenz durch die Röhre 112 und den Kanal 114 eingeleitet werden.
  • Der Elutionsprozess hängt von dem Anreicherungsverfahren ab, das in Kanal 116 durchgeführt wird. Ein geeignetes Elutionsmittel kann ausgewählt werden, um eine Fraktion des gebundenen Analyten zu eluieren. Einige Anreicherungsoptionen erfordern möglicherweise keinen Elutionsschritt (z.B. Größenausschlusschromatographie, elektrophoretische Trennungen usw.).
  • Das Elutionsmittel oder der Durchfluss würde dann durch den Kanal 118 in den Kanal 124 fließen. Kanal 124 könnte verwendet werden, um entweder einen chromatographischen oder einen elektrophoretischen Anreicherungsschritt durchzuführen.
  • Elektrophoretische Trennungen können in Kanal 124 unter Verwendung einer Energieversorgung durchgeführt werden, um ein elektrisches Feld zwischen Reservoir 108 und Reservoir 120 anzulegen. Ebenso kann die Vorrichtung 100 Elektroden in elektrischem Kontakt mit Reservoir 108 und/oder Reservoir 120 enthalten. Die elektrische Masse der Stromversorgung kann mit der elektrischen Masse eines Massenspektrometers verbunden werden, um Kontinuität im elektrischen Feld vom Kanal 124 zum Massenspektrometer zu gewährleisten.
  • Jedes elektrophoretische CE-Verfahren kann in Kanal 124 durchgeführt werden - IEF, ITP, CGE, CZE und dergleichen. Alternativ können nicht-elektrophoretische Anreicherungsverfahren in dem Kanal 124 durchgeführt werden.
  • Im Fall von IEF oder ITP würden konzentrierte gereinigte Probenbänder zum Beispiel durch Druck oder elektrische Mittel in Richtung Zusammenfluss 126 mobilisiert. Die Hülllösung aus den Reservoiren 108 und 134 könnte als Hülle und Katholyt dienen.
  • Die Hülle/der Katholyt kann irgendeine basische Lösung sein, die mit der elektrophoretischen Trennung und der Massenspektrometrie kompatibel ist (zum Beispiel MeOH /NaOH/H20). Anolyt kann irgendeine saure Lösung sein (z.B. Phosphorsäure 10 mM).
  • Alternativ könnte das elektrische Feld umgekehrt werden und Katholyt (NaOH) könnte in das Reservoir 120 geladen werden, und Anolyt könnte als die Hülllösung in den Reservoiren 108 und 134 verwendet werden.
  • Am Zusammenfluss 126 mischt sich die angereicherte Analytfraktion mit der Hülllösung. Wenn die Analytfraktionen im Kanal 124 mobilisiert werden, wird die Lösung durch den Zusammenfluss 126 zur Öffnung 128 gedrückt.
  • Die Öffnung 128 kann in einer Aussparung angeordnet sein, die durch die Oberfläche 127 des Substrats 102 definiert ist. Beispielsweise kann die Oberfläche 127 eine versenkte ESI-Oberfläche sein. Zum Beispiel kann, wie in 1 gezeigt, die angereicherte Analytlösung, die durch die Bohrung 108 elektrisch geerdet ist, einen von der Öffnung 128 ausgehenden Taylor-Kegel bilden, der vollständig in einer durch die Oberfläche 127 definierten Aussparung angeordnet ist. Die Öffnung 128 und/oder Oberfläche 127 können in Richtung eines Massenspektrometer-Einlasses ausgerichtet sein, der eine Spannungspotentialdifferenz in Bezug auf die Bohrung 108 aufweisen kann. Wenn der Sprühnebel von der Kegelstruktur in Richtung des Massenspektrometers abreißt, kann er durch Zerstäubungsgas flankiert werden, das durch die Kanäle 106 und 140 bereitgestellt wird, bevor er das Substrat 102 verlässt. Das Zerstäubungsgas kann ein beliebiges inertes oder nicht reaktives Gas sein (z.B. Argon, Stickstoff und dergleichen).
  • Zusätzlich kann die Verwendung einer Hüllenflüssigkeit und/oder eines Zerstäubungsgases die Verwendung eines lonenverarmungsschritts als den letzten „vorrichtungsgebundenen“ Schritt erlauben. Die Hüllflüssigkeit ermöglicht die Auffüllung des lonenpotentials, das während eines IEF-Ladungsassay-Konzentrierungsschritts vor der ESI verloren gegangen ist, und die Zerstäubung liefert die Probe in einem feinen Nebel für die abgetrennte Analyse.
  • Durch Erzeugen des Taylor-Kegels auf der Oberfläche 127 wird der Kegel in einer stabilen Tasche oder Aussparung erzeugt und vor störenden Luftströmen geschützt. Zusätzlich hat die konische Geometrie, die die versenkte Öffnung umgibt, eine natürlich expandierende Kontaktfläche, die einen größeren Bereich von Taylor-Kegel-Radialquerschnitten aufnimmt, wodurch ein größerer Bereich von Strömungsraten in das Massenspektrometer ermöglicht wird.
  • Die Öffnung 128 kann in der Nähe einer Einlassöffnung eines Massenspektrometers positioniert sein. In einigen Fällen kann die Oberfläche 127 so konfiguriert sein, dass eine Einlassöffnung eines Massenspektrometers in einer durch die Oberfläche 127 definierten Aussparung angeordnet sein kann.
  • 2 ist eine schematische Explosionsansicht einer Vorrichtung 212 mit drei Schichten gemäß einer Ausführungsform. 2A zeigt eine obere Schicht 202 der Vorrichtung 212 gemäß einer Ausführungsform. 2B zeigt eine mittlere Schicht 206 der Vorrichtung 212 gemäß einer Ausführungsform. 2C zeigt eine untere Schicht 210 der Vorrichtung 212 gemäß einer Ausführungsform. 2D zeigt die Vorrichtung 212 in zusammengebautem Zustand gemäß einer Ausführungsform. Jede der drei Schichten 202, 206, 210 kann aus irgendeinem Material hergestellt sein, das mit den Assays kompatibel ist, die die Vorrichtung 212 durchführen soll.
  • In einigen Ausführungsformen wird die Schicht 202 aus einem Material hergestellt, das für eine bestimmte Wellenlänge oder einen bestimmten Wellenlängenbereich von Licht transparent ist. Wie hier verwendet, soll „transparent“ bedeuten, dass das Material eine ausreichende Durchlässigkeit aufweist, um zu ermöglichen, dass die Lichtmenge mit einer spezifischen Wellenlänge oder einem Wellenlängenbereich auf einer Seite des Materials durch einen Detektor auf der anderen Seite quantifiziert wird. In einigen Fällen ist Material mit einer Durchlässigkeit von 30%, 50%, 80%, 95% oder 100% transparent. In einigen Ausführungsformen umfasst ein Wellenlängenbereich von Interesse den mittleren Ultraviolettbereich (z.B. 200 nm - 300 nm) und Materialien wie z.B. Glas, Quarz, Quarzglas und UV-transparente Kunststoffe wie Polycarbonate, polyfluoriertes Polyethylen, Polymethacrylat , Cycloolefin-Polymer, Cycloolefin-Co-Polymer und andere UV-transparente Materialien können als transparente Materialien verwendet werden. In einigen Ausführungsformen wird das Lichtspektrum von Interesse über das sichtbare Spektrum hinaus erweitert (z.B. 200-900 nm).
  • Die durchgehenden Löcher 204 werden in der Schicht 202 hergestellt, um Druck und eine elektrische Schnittstelle zu einem Kanalnetz in einer unteren Schicht (z.B. Schicht 208) von außerhalb der Vorrichtung zu ermöglichen.
  • 2B zeigt die interne mittlere Schicht 206 der Vorrichtung 212, die das Kanalnetz 208 enthält. Das Kanalnetz ist so ausgelegt, dass es mit den in der oberen Schicht 202 hergestellten durchgehenden Löchern in Verbindung steht. Das Kanalnetz 208 enthält Einlass- und Auslassröhren/-leitungen 209 und eine Öffnung 205 zum Ausstoß angereicherter Analytfraktionen und eine einsehbare Anreicherungszone 207. Die Anreicherungszone 207 ist so hergestellt, dass ihre Tiefe der vollen Dicke der Schicht 206 entspricht. In anderen Ausführungsformen kann die Zone 207 geringer sein als die volle Dicke der Schicht 206.
  • In einigen Ausführungsformen wird die Schicht 206 aus einem Material hergestellt, das für eine bestimmte Wellenlänge oder einen bestimmten Wellenlängenbereich von Licht undurchsichtig und/oder nicht transparent ist. Wie hierin verwendet, soll „undurchsichtig“ bedeuten, dass das Material eine unzureichende Durchlässigkeit aufweist, um zu ermöglichen, dass die Lichtmenge auf einer Seite des Materials von einem Detektor auf der anderen Seite quantifiziert wird, und dieses Licht effektiv blockiert, mit Ausnahme der Bereiche wo die Zone im Kanalnetz so tief ist wie die gesamte Dicke der Schicht 206.
  • 2C zeigt eine untere Schicht 210 der Vorrichtung 212. Die untere Schicht 210 kann zum Beispiel ein festes Substrat sein. In einigen Ausführungsformen kann die untere Schicht 210 aus einem Material mit der gleichen Durchlässigkeit wie die Schicht 202 hergestellt werden.
  • 2D zeigt die Vorrichtung 212 mit der oberen Schicht 202, der mittleren Schicht 206 und der unteren Schicht 210 in zusammengesetztem Zustand gemäß einer Ausführungsform. Auf die Einlass- und Auslassröhren 209, die Reservoirs 204 und die Öffnung 205 kann immer noch zugegriffen werden, nachdem die Vorrichtung 210 zusammengebaut ist. In einigen Ausführungsformen können die gesamte obere Schicht 202 und/oder die gesamte untere Schicht 210 transparent sein. In anderen Ausführungsformen können ein Teil der oberen Schicht 202 und/oder ein Teil der unteren Schicht 210 undurchsichtig sein, wobei ein anderer Teil der oberen Schicht 202 und/oder der unteren Schicht 210 transparent ist. Beispielsweise können die obere Schicht 210 und/oder die untere Schicht 210 ein optisches Fenster definieren, das mit mindestens einem Teil der Anreicherungszone 207 ausgerichtet ist, wenn die Vorrichtung 212 zusammengebaut ist.
  • 3 ist eine schematische Darstellung eines Lichtwegs durch eine Mikrofluidik-Vorrichtung 302 gemäß einer Ausführungsform. 3A zeigt eine Draufsicht auf die Mikrofluidik-Vorrichtung 302. 3B zeigt die Mikrofluidik-Vorrichtung 302, die zwischen einer Lichtquelle 306 und einem Detektor 308 positioniert ist. Der Detektor 308 ist positioniert, um Licht zu messen, das durch die Vorrichtung 302 hindurchgeht. Auch wenn es in 3 nicht gezeigt ist, kann die Mikrofluidik-Vorrichtung 302 eine ähnliche Kanalstruktur wie in den 1 und 2 beschrieben aufweisen, die Kanalstruktur ist jedoch zur besseren Übersichtlichkeit nicht gezeigt. In einigen Ausführungsformen ist ein Teil der oberen Oberfläche der Mikrofluidik-Vorrichtung 302 undurchsichtig und hindert das von der Lichtquelle 306 projizierte Licht vollständig oder im Wesentlichen daran, den Detektor 308 zu erreichen. Der Teil der undurchsichtigen oberen Oberfläche verhindert im Wesentlichen die Übertragung von Licht durch die Vorrichtung an jenen Abschnitten, an denen die Detektion von Probeneigenschaften nicht erwünscht ist. Beispielsweise ist die Mikrofluidik-Vorrichtung 302 in einigen Ausführungsformen nicht undurchsichtig (z.B. lässt etwas Licht durch) über einen oder mehrere Kanalbereiche 304, da der Kanal 304 die gesamte Dicke einer nicht transparenten Schicht durchläuft.
  • In einigen Ausführungsformen kann (können) diese transparente Kanalregion(en) 304 eine Anreicherungszone sein, in der optische Detektion verwendet werden kann, um einen Analyten zu detektieren, den Fortschritt der Anreicherung zu überwachen und/oder angereicherte Analytfraktion(en) zu überwachen, wie sie sind aus der Vorrichtung ausgestoßen werden. In einigen Ausführungsformen werden Änderungen in der Lichtmenge, die durch den transparenten Kanal 304 hindurchtritt, verwendet, um die Absorption der Analytfraktionen zu messen, während sie sich in diesem Kanal befinden. Somit definieren in einigen Ausführungsformen die Kanalbereich(e) 304 einen optischen Spalt, sodass die Lichtquelle 306, die auf einer Seite der Mikrofluidik-Vorrichtung 302 positioniert ist, den Detektor 308 nur durch die transparenten Kanalbereich(e) 304 effektiv beleuchtet. Auf diese Weise kann Streulicht (z.B. Licht, das die transparenten Kanalbereich(e) und/oder eine Probe nicht passiert) effektiv vom Detektor 308 ferngehalten werden, was das Rauschen verringern und die Fähigkeit des Detektors 308 verbessern kann, eine Probe in den transparenten Kanalregion(en) 304 zu beobachten. In einigen Ausführungsformen befinden sich die transparenten Kanalregion(en) 304 zwischen zwei Anreicherungszonen und können verwendet werden, um Analytfraktionen zu detektieren, wenn sie aus der vorgeschalteten Anreicherungszone eluiert werden.
  • Verfahren
  • 6 veranschaulicht ein Verfahren zur Anreicherung von Analytgemischen gemäß einer Ausführungsform. Das Verfahren umfasst das Laden und/oder Einleiten eines Analytgemisches in eine Mikrofluidik-Vorrichtung bei 20. Die Mikrofluidik-Vorrichtung kann den oben mit Bezug auf die 1-3 beschriebenen Mikrofluidik-Vorrichtungen ähnlich sein. In einigen Ausführungsformen kann das Analytgemisch beispielsweise Glycane, Kohlenhydrate, DNA, RNA, intakte Proteine, verdaute Proteine, Peptide, Metaboliten, Impfstoffe, Viren und niedermolekulare Verbindungen sein. In einigen Ausführungsformen kann das Analytgemisch ein Gemisch von Proteinen sein, wie ein Lysat von kultivierten Zellen, zellbasierte Therapeutika oder von Tumoren oder anderem Gewebe abgeleitete Zellen, rekombinante Proteine, einschließlich biologischer Pharmazeutika, von Blut abgeleitete Zellen, Perfusion oder ein Proteingemisch aus einer anderen Quelle. Das Analytgemisch kann direkt in die Vorrichtung geladen werden oder kann zur seriellen Analyse mehrerer Gemische in einen Autosampler geladen werden.
  • Die Mikrofluidik-Vorrichtung kann einen ersten Trennkanal und/oder eine Anreicherungszone umfassen. In einigen Ausführungsformen können der erste Trennkanal und/oder Anreicherungszone für eine chromatographische Trennung konfiguriert sein. Beispielsweise können der erste Trennkanal und/oder Anreicherungszone ein Medium enthalten, das konfiguriert ist, um einen Analyten aus dem Analytgemisch zu binden und/oder auf andere Weise eine chromatographische Trennung zu bewirken. Bei 21 kann eine erste Anreicherung durchgeführt werden; beispielsweise kann eine chromatographische Trennung in dem ersten Trennkanal und/oder der Anreicherungszone durchgeführt werden. In einigen Ausführungsformen, wie beispielsweise Ausführungsformen, in denen das Analytgemisch ein Proteingemisch ist, kann die erste Anreicherung bei 21 das Proteingemisch vereinfachen. Die erste Anreicherung bei 21 kann auf jeder erkennbaren Qualität des Analyten basieren.
  • Diese angereicherte Analytfraktion wird dann bei 22 eluiert. Beispielsweise kann ein Elutionsmittel in die Mikrofluidik-Vorrichtung injiziert werden, um die angereicherte Analytfraktion aus Medien zu mobilisieren, die innerhalb des ersten Trennkanals und/oder der Anreicherungszone angeordnet sind. In einigen Ausführungsformen können die Anreicherung und/oder Mobilisierung der angereicherten Analytfraktion abgebildet werden. Zum Beispiel können, wie oben diskutiert, der erste Trennkanal und/oder Anreicherungszone einen optischen Spalt definieren. Licht kann auf die Mikrofluidik-Vorrichtung projiziert werden und ein Detektor kann Licht detektieren, das durch den ersten Trennkanal und/oder Anreicherungszone tritt. Die Probe oder ein Teil davon kann mittels Absorptions- und/oder Fluoreszenzbildgebungstechniken detektiert werden.
  • Die Mikrofluidik-Vorrichtung kann einen zweiten Trennkanal und/oder Anreicherungszone umfassen. In einigen Ausführungsformen kann der zweite Trennkanal und/oder Anreicherungszone für eine elektrophoretische Trennung konfiguriert sein. Bei 23 kann eine zweite Anreicherung beispielsweise beim Eluat durchgeführt werden. Beispielsweise kann ein elektrisches Feld und/oder ein elektrisches Potential über den zweiten Trennkanal und/oder Anreicherungszone angelegt werden.
  • In einigen Ausführungsformen kann die zweite Anreicherung bei 23 eingeleitet werden, wenn sich ein Teil des Analytgemisches an einem Schnittpunkt des ersten Trennkanals und/oder Anreicherungszone und des zweiten Trennkanals und/oder Anreicherungszone befindet. Beispielsweise können der erste Trennkanal und/oder Anreicherungszone überwacht (z.B. abgebildet) werden und ein elektrisches Potential und/oder ein elektrisches Feld angelegt werden, wenn eine Fraktion von Interesse den Schnittpunkt erreicht.
  • In einigen Ausführungsformen kann die zweite Anreicherung bei 23 Fraktionen bereitstellen, die basierend auf Ladungseigenschaften (Ladungsisoformen) angereichert sind. Solche Anreicherungen können beispielsweise isoelektrische Gel-Fokussierung, isoelektrische Fokussierung mit Mobilisierung, isoelektrische Fokussierung mit Ganzsäulenbildgebung, Ionenaustauschchromatographie, pH-Gradientenaustauschchromatographie, Isotachophorese, Kapillarzonenelektrophorese, Kapillar-Gelelektrophorese oder andere Anreicherungstechniken, die z B. auf Ladung basieren, umfassen.
  • Obwohl die erste Anreicherung bei 21 als chromatographische Anreicherung und die zweite Anreicherung bei 23 als elektrophoretische beschrieben wurde, versteht es sich, dass jede geeignete Anreicherung in jeder geeigneten Reihenfolge durchgeführt werden kann. Beispielsweise können die erste Anreicherung bei 21 und die zweite Anreicherung bei 23 beide chromatographisch oder beide elektrophoretisch sein. Als anderes Beispiel kann die erste Anreicherung bei 21 elektrophoretisch sein und die zweite Anreicherung bei 23 kann chromatographisch sein.
  • In einigen Ausführungsformen können eine oder mehrere Anreicherungen Fraktionen bereitstellen, die basierend auf hydrophoben Änderungen, wie Oxidation, angereichert sind. Solche Anreicherungen können zum Beispiel Umkehrphasenchromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, hydrophile Wechselwirkungschromatographie oder andere Anreicherungstechniken, die z.B. auf Hydrophobizität basieren, umfassen.
  • In einigen Ausführungsformen können eine oder mehrere Anreicherungen Fraktionen bereitstellen, die angereichert sind basierend auf posttranslationalen Modifikationen, Glycoformen, einschließlich Galactosylierung, Fucosylierung, Sialylierung, Mannose-Derivaten und anderen Glycosylierungen sowie Glycierung, Oxidation, Reduktion, Phosphorylierung, Sulfonierung, Disulfidbindungsbildung, Desamidierung, Acylierung, Pegylierung, Spaltung, Antikörper-Wirkstoff-Konjugation (ADC), Protein-Wirkstoff-Konjugation, C-terminale Lysin-Prozessierung, anderen natürlich und nicht natürlich vorkommenden posttranslationalen Modifikationen und anderen chemische und strukturellen Modifikationen, die nach der Translation des Proteins eingeführt werden, und dergleichen. Solche Anreicherungen können beispielsweise Bindungsassays und dergleichen umfassen.
  • In einigen Ausführungsformen können eine oder mehrere Anreicherungen Fraktionen bereitstellen, die basierend auf hydrophoben Änderungen wie Oxidation angereichert sind. Solche Anreicherungen können zum Beispiel Umkehrphasenchromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, hydrophile Wechselwirkungschromatographie oder andere Anreicherungstechniken, die auf Hydrophobizität basieren, umfassen.
  • In einigen Ausführungsformen können eine oder mehrere Anreicherungen Fraktionen bereitstellen, die basierend auf der primären Aminosäuresequenz angereichert sind, wie sie durch Mutation, Aminosäuresubstitution während der Herstellung und dergleichen verursacht werden. Solche Anreicherungen können zum Beispiel das Trennen durch Ladungsisoformen, hydrophobe Veränderungen oder andere Anreicherungstechniken umfassen, die zwischen Unterschieden der primären Aminosäuresequenz unterscheiden können.
  • In einigen Ausführungsformen können eine oder mehrere Anreicherungen Fraktionen bereitstellen, die basierend auf der Wirksamkeit angereichert sind. Solche Anreicherungen können zum Beispiel Bioassays, Enzyminhibierungsassays, Enzymaktivierungsassays, Kompetitionsassays, Fluoreszenzpolarisationsassays, Szintillations-Proximitätsassays oder andere Anreicherungsverfahren, die auf der Wirksamkeit beruhen, und dergleichen umfassen.
  • In einigen Ausführungsformen können eine oder mehrere Anreicherungen Fraktionen bereitstellen, die basierend auf der Affinität angereichert sind. Solche Anreicherungen können zum Beispiel eine Lösungsphasenbindung an ein Ziel, eine Bindung an Kügelchen-basierte Ziele, ein oberflächengebundenes Ziel, eine Immunpräzipitation, eine Protein A-Bindung, eine Protein G-Bindung und dergleichen umfassen.
  • In einigen Ausführungsformen können eine oder mehrere Anreicherungen Fraktionen bereitstellen, die basierend auf Masse oder Größe angereichert sind. Solche Anreicherungen können zum Beispiel Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Kapillar-Gelelektrophorese, Größenausschlusschromatographie, Gelpermeationschromatographie oder andere Anreicherungstechniken, die auf Masse basieren, umfassen.
  • In einigen Ausführungsformen wird das Analytgemisch mehr als zwei Anreicherungen durchlaufen, bevor es aus der Vorrichtung ausgestoßen wird.
  • Bei 24 kann eine angereicherte Analytfraktion aus der Vorrichtung ausgestoßen werden. In einigen Ausführungsformen kann die angereicherte Analytfraktion über IEF ausgestoßen werden. Das Ausstoßen der angereicherten Analytfraktion bei 24 kann die Analytfraktionen konzentrieren, bevor sie ausgestoßen werden.
  • In einigen Ausführungsformen werden die Analytfraktionen bei 24 unter Verwendung einer lonisationstechnik wie Elektrospray-Ionisation, chemischer Ionisation bei Atmosphärendruck und dergleichen ausgestoßen.
  • In einigen Ausführungsformen werden die Analytfraktionen bei 24 unter Verwendung von elektrokinetischen oder hydrodynamischen Kräften ausgestoßen.
  • In einigen Ausführungsformen werden die angereicherten Proteinfraktionen bei 24 in einer an ein Massenspektrometer gekoppelten Weise aus der Vorrichtung ausgestoßen.
  • Die Masse eines Analyten, der aus der Mikrofluidik-Vorrichtung ausgestoßen wird (z.B. ein biologischer Wirkstoffs oder ein Biosimilar), kann zum Beispiel durch Flugzeit-Massenspektrometrie, Quadrupol-Massenspektrometrie, lonenfallen- oder Orbitrap-Massenspektrometrie, Flugdistanz-Massenspektrometrie, Fourier-Transformationslonenzyklotronresonanz, Resonanzmassenmessung und nanomechanische Massenspektrometrie gemessen werden.
  • In einigen Ausführungsformen werden pl-Marker verwendet, um pl-Bereiche in dem visualisierten IEF-Kanal (z.B. dem ersten Trennkanal und/oder Anreicherungszone und/oder dem zweiten Trennkanal und/oder Anreicherungszone) abzubilden. In einigen Ausführungsformen können pl-Marker oder Ampholyte verwendet werden, um den pl des Analyten durch ihr Vorhandensein in nachgeschalteten Massenspektrometrie-Daten zu bestimmen.
  • In einigen Ausführungsformen kann die IEF während der Mobilisierung und der ESI überwacht werden. Auf diese Weise können Massenspektrometrie-Daten mit Peaks in der IEF korreliert werden, wodurch die Peak-Auflösung erhalten und/oder verbessert werden kann.
  • In einigen Ausführungsformen kann das Analytgemisch und/oder ein Teil davon in der Mikrofluidik-Vorrichtung unter Verwendung einer Druckquelle mobilisiert werden. In einigen Ausführungsformen erfolgt die Mobilisierung mit hydrostatischem Druck. In einigen Ausführungsformen ist die Mobilisierung eine chemische Immobilisierung. In einigen Ausführungsformen ist die Mobilisierung eine elektrokinetische Mobilisierung.
  • 7 ist eine schematische Darstellung einer Mikrofluidik-Vorrichtung gemäß einer Ausführungsform. Ein Mikrofluidik-Netzwerk 800 ist in einem Substrat 802 angeordnet und/oder durch dieses definiert. Das Substrat ist aus einem Material hergestellt, das kompatibel mit den durchgeführten Anreicherungsschritten ist. Beispielsweise können chemische Kompatibilität, pH-Stabilität, Temperatur, Transparenz bei verschiedenen Lichtwellenlängen, mechanische Stärke und dergleichen bei der Auswahl des Materials von Belang sein
  • Das Substrat 802 kann aus Glas, Quarz, Quarzglas, Kunststoff, Polycarbonat, PFTE, PDMS, Silizium, polyfluoriertem Polyethylen, Polymethacrylat, Cycloolefin-Co-Polymer, Cycloolefin-Polymer, Polyether-Etherketon und/oder irgendeinem anderen geeigneten Material hergestellt sein. Materialmischungen können verwendet werden, wenn unterschiedliche Eigenschaften in unterschiedlichen Schichten eines planaren Substrats erwünscht sind.
  • Die Kanäle 806, 808, 810, 811, 817, 814, 812 bilden ein Kanalnetz und werden in das Substrat 802 eingearbeitet (z.B. durch dieses definiert).
  • Kanäle können in das Substrat durch ein beliebiges Kanalherstellungsverfahren eingearbeitet werden, wie photolithographisches Ätzen, Formen, Bearbeiten, additives (3D) Drucken und dergleichen.
  • Analytgemische und externe Reagenzien können durch die Röhre 804 geladen werden und überschüssiges Reagenz/Abfall kann durch die Röhre 810 und 818 entfernt werden.
  • Die Röhren 804, 810 und/oder 818 können aus jedem Material hergestellt werden, das mit dem durchgeführten Assay kompatibel ist, einschließlich Quarzglas, Quarzglas-Kapillarröhren, Silikonschläuchen, PTFE-Schläuchen und dergleichen.
  • Die Kanäle 806 und 814 können als Trenn-/Anreicherungszonen bezeichnet werden. Jeder der Kanäle 806 und/oder 814 kann verwendet werden, um chromatographische Trennungen (Umkehrphase, Immunpräzipitation, lonenaustausch, Größenausschluss, Ligandenaffinität, Farbstoffaffinität, hydrophobe Wechselwirkung, Affinität, kapillare elektrokinetische Chromatographie, mizellare elektrokinetische Chromatographie und/oder dergleichen) oder elektrophoretische Trennungen (isoelektrische Fokussierung, Kapillar-Gelelektrophorese, Kapillarzonen-Elektrophorese, Isotachophorese, kapillare elektrokinetische Chromatographie, mizellare elektrokinetische Chromatographie, Flow-counterbalanced Kapillarelektrophorese, elektrische Feldgradientenfokussierung, dynamische Feldgradientenfokussierung und/oder dergleichen) durchzuführen. Beispielsweise kann Kanal 806 derivatisiert oder mit Material gepackt werden, um einen ersten Anreicherungsschritt durchzuführen, dargestellt durch dunklere Kreise in Kanal 806.
  • Das in Kanal 806 angeordnete Material kann ausgewählt werden, um Analyten basierend auf Hydrophobizität (Umkehrphase), Affinität (Wirksamkeit), Größe (Größenausschlusschromatographie), Ladung (lonenaustausch), Immunaffinität (Immunpräzipitation), Protein-Protein-Wechselwirkung, DNA-Protein-Wechselwirkung, Aptamer-Base-Capture, Small Molecule-Base-Capture oder durch andere Formen der Flüssigkeitschromatographie und dergleichen einzufangen.
  • Viele verschiedene Verfahren können verwendet werden, um das Anreicherungsmaterial innerhalb des Kanals 806 und/oder 814 anzuordnen. Die Wände können direkt mit kovalent gebundenen oder adsorbierten Molekülen derivatisiert werden oder Kügelchen, Glaspartikel, Sol-Gel oder dergleichen können derivatisiert werden und in diese Kanäle geladen werden oder Kanäle können mit einem Siebmaterial gepackt werden, wie z.B. linearen Polymerlösungen, wie z.B. linearem Polyacrylamid (LPA), Polyvinylpyrrolidon (PVP), Polyethylenoxid (PEO), Dextran und dergleichen, vernetzten Polymerlösungen wie z.B. Polyacrylamid und dergleichen, quervernetzte Matrices für die Flüssigkeitschromatographie oder andere Materialien.
  • Chemisch reaktive Lösungen können in Abhängigkeit von dem jeweiligen durchgeführten Assay hinzugefügt werden. In einigen Fällen kann eine Derivatisierung des Materials geschehen, nachdem es in Kanal 806 (oder Kanal 814) geladen wurde, indem Moleküle hinzugefügt werden, die an das geladene Material adsorbieren oder kovalent binden oder reaktive Elemente chemisch mit dem Material quervernetzen können. Beispielsweise könnte Material, das mit einem Antikörper-bindenden Molekül wie z.B. Protein A, Protein G, Epoxy oder dergleichen beschichtet ist, in Kanal 806 angeordnet werden. Ein anschließendes Spülen mit einer Antikörperlösung würde das mit Material beschichtet mit Antikörper zurücklassen und es könnte an Immunaffinität-Capture beteiligt sein. In einigen Fällen kann der Antikörper mit einem Zielanalyten oder Lysat gemischt werden, sodass der Antikörper sein Ziel in freier Lösung binden kann, bevor er auf das Material aufgetragen wird.
  • Nachdem Anreicherungsmaterialien auf die Vorrichtung geladen wurden, wird die Probe über die Röhre 804 in den Kanal 806 geladen. Anschließend können Waschlösungen und Elutionsreagenzien durch die Röhre 804 in den Kanal 806 eingeleitet werden.
  • In einigen Fällen werden Detektionsreagenzien hinzugefügt, um an eingefangenes Material zu binden. Zahlreiche Labeling-Reagenzien sind verfügbar, die Detektionseinheiten wie Fluorophore, Chromophore oder andere Detektionsmoleküle kovalent an die Zielproteine an den terminalen Enden des Polypeptids und durch Bindung an Aminosäureseitenketten wie Lysin, Cystein und andere Aminosäurereste binden können. Kovalent gebundene Detektionseinheiten ermöglichen die Detektion des Proteins durch Fluoreszenzanregung, chromophoren Assay oder andere indirekte Mittel. In einigen Fällen kann das Zielprotein unmarkiert bleiben und durch native Absorption bei 220 nm, 280 nm oder jeder anderen Wellenlänge, bei der das Protein Licht absorbiert, oder native Fluoreszenz detektiert werden. In einigen Fällen wird das Protein unter Verwendung von nicht-kovalent gebundenen fluorogenen, chromogenen, fluoreszierenden oder chromophoren Markierungen wie SYPRO® Ruby, Coomassie Blue und dergleichen detektiert.
  • In einigen Fällen werden Detektionsreagenzien direkt zu Kanal 814 hinzugefügt, um die Detektion zu unterstützen.
  • Der Elutionsprozess hängt von dem Anreicherungsverfahren ab, das in Kanal 806 durchgeführt wird. Es wird so ausgewählt, dass es mindestens eine Fraktion des gebundenen Analyten eluiert. In einigen Fällen kann dies mit einer Kombination aus Wärme und Natriumdodecylsulfat (SDS) oder anderen Detergenzien, Glycin, Harnstoff oder mit einem anderen Verfahren, das die Freisetzung des eingefangenen Analyten induziert, erreicht werden. Einige Anreicherungsoptionen erfordern möglicherweise keinen direkten Elutionsschritt (z.B. Größenausschlusschromatographie). In einigen Fällen folgt auf die Elution eine Denaturierung.
  • Das Elutionsmittel würde dann durch Kanal 808 in die nächste Trenn-/Anreicherungszone, Kanal 814, fließen. Kanal 814 könnte verwendet werden, um entweder einen chromatographischen oder einen elektrophoretischen Anreicherungsschritt durchzuführen.
  • Elektrophoretische Trennungen können in Kanal 814 unter Verwendung einer Energieversorgung durchgeführt werden, um ein elektrisches Feld zwischen Reservoir 812 und Reservoir 816 anzulegen. Wenn das Eluat von Kanal 806 durch den Schnittpunkt der Kanäle 808 und 814 fließt, kann das elektrische Feld aktiviert werden, was den Analyten in den Kanal 814 lädt. In einigen Fällen ist der Analyt negativ geladen, beispielsweise im Standard-Gelelektrophorese-Modus, bei dem der Proteinanalyt mit einem negativ geladenen Detergens wie SDS gesättigt ist. Die Polarität des Kanals 814 kann jedoch leicht umgekehrt werden, um sich an Systeme anzupassen, bei denen beispielsweise ein Proteinanalyt mit einem positiv geladenen Detergens wie Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) oder dergleichen gesättigt ist. In anderen Fällen kann ein Proteinanalyt mit einem neutralen Detergens beschichtet sein, oder ohne Detergens - wie bei der nativen Gelelektrophorese. In diesem Fall wird die Polarität basierend auf der erwarteten Ladung des Zielproteins in dem ausgewählten Puffersystem ausgewählt, sodass der Proteinanalyt in den Kanal 814 wandert.
  • Jedes elektrophoretische CE-Verfahren kann in Kanal 814 durchgeführt werden - IEF, ITP, CGE, CZE und dergleichen. Alternativ können nicht-elektrophoretische Anreicherungsverfahren in dem Kanal durchgeführt werden.
  • Der Analyt in Kanal 814 kann durch Ganzsäulenbildgebung, partielle Säulenbildgebung und/oder durch Einzelpunktdetektion beobachtet werden.
  • In einigen Fällen kann das Anreicherungsmaterial in den Kanälen 806, 814 oder beiden entfernt und mit frischem Material aufgefüllt werden, sodass die Vorrichtung bei einer anderen Analytprobe verwendet werden kann.
  • In einigen Fällen kann ein Kanaldesign wie in 7 mehrfach auf einer Vorrichtung wiederholt werden, sodass mehr als eine Analytprobe parallel analysiert werden kann.
  • Beispiele
  • Aspekte von Ausführungsformen können im Lichte der folgenden Beispiele näher verstanden werden, die in keiner Weise als einschränkend aufgefasst werden sollten.
  • Beispiel 1 - Charakterisierung von Proteinladung auf Chip vor Massenspektrometrie (MS)
  • Für dieses Beispiel wird das in 4 gezeigte Kanalnetzwerk aus einer Platte aus Natronkalkglas hergestellt, das eine sehr geringe Transmission von Licht mit 280 nm aufweist, unter Verwendung einer photolithographischen Standardätztechnik. Die Tiefe des Anreicherungskanals 418 ist die gleiche wie die Dicke der Glasschicht 402, d.h. der Anreicherungskanal 418 verläuft von oben ganz nach unten auf dieser Glasplatte 402. Die Vorrichtung 400 kann durch eine Lichtquelle beleuchtet werden, die auf einer Seite der Vorrichtung 400 angeordnet ist, und von einem Detektor, der auf einer gegenüberliegenden Seite der Vorrichtung 400 angeordnet ist, abgebildet werden. Da das Substrat 402 undurchsichtig ist, der Anreicherungskanal 418 jedoch einen optischen Spalt definiert, kann das Substrat 402 Licht blockieren, das nicht den Anreicherungskanal 418 durchläuft, es blockiert Streulicht und verbessert die Auflösung des Bildgebungsprozesses.
  • Die Glasschicht 402 ist sandwichartig zwischen zwei Quarzglasplatten angeordnet, die für Licht mit 280 nm durchlässig (z.B. transparent) sind. Wie in 2 enthält die obere Platte durchgehende Löcher für das Instrument und den Benutzer zur Interaktion mit dem Kanalnetzwerk, während die untere Platte massiv ist. Die 3 Platten werden 30 Minuten bei 520 °C miteinander verbunden. Der Einlass- und Auslassschlauch wird aus gespaltener Kapillare (100 µm, ID, Polymicro) hergestellt, die mit dem Kanalnetzwerk verbunden ist.
  • Die Vorrichtung ist an einem Instrument angebracht, das eine Stickstoffgasquelle, eine Heizung, eine Überdruckpumpe (z.B. Parker, T5-1IC-03-1EEP), eine Elektrophorese-Energieversorgung (Gamm High Voltage, MC30), die in zwei Platin-Iridiumelektroden endet (z.B. Sigma-Aldrich, 357383), eine UV-Lichtquelle (z.B. LED, qphotonics, UVTOP280), eine CCD-Kamera (z.B. ThorLabs, 340UV-GE) und einen Autosampler zum Laden von Proben auf die Vorrichtung enthält. Das Netzteil hat eine gemeinsame Erdung mit dem Massenspektrometer. Das Instrument wird durch Software gesteuert (z.B. labView).
  • Proteinproben werden mit Ampholyt-pH-Gradient und pl-Markern vorgemischt, bevor sie in Röhrchen gegeben und in den Autosampler geladen werden. Sie werden seriell aus einem Autosampler über den Einlass 412 durch den Anreicherungskanal 418 auf die Mikrofluidik-Vorrichtung 400 und aus der Vorrichtung zum Abfall 430 durch den Auslass 434 geladen.
  • Die Hüll-/Katholytflüssigkeit (50% MeOH, NaOH/H2O) wird auf die zwei Katholyt-Bohrungen 404, 436 geladen, der Anolyt (10 mM H3PO4) auf die Anolyt-Bohrung 426, und die Quelle des erhitzten Stickstoffgases wird an die zwei Gasbohrungen 408, 440 angeschlossen.
  • Nachdem alle Reagenzien geladen sind, wird ein elektrisches Feld von + 600 V/cm von der Anolyt-Bohrung 426 an die Katholyt-Bohrungen 404, 436 angelegt, indem die Elektroden mit der Anolyt-Bohrung 426 und den Katholyt-Bohrungen 404, 436 verbunden werden, um die isoelektrische Fokussierung einzuleiten. Die UV-Lichtquelle ist unter dem Anreicherungskanal 418 ausgerichtet und die Kamera ist über dem Anreicherungskanal 418 angeordnet, um das Licht zu messen, das durch den Anreicherungskanal 418 hindurchgeht, wodurch die fokussierenden Proteine anhand ihrer Absorption detektiert werden. Die Glasplatte 402, die aus Kalknatronglas hergestellt ist, hält jegliches Streulicht von der Kamera ab, sodass Licht, das nicht durch den Anreicherungskanal 418 gelangt, daran gehindert wird, die Kamera zu erreichen, was die Empfindlichkeit der Messung erhöht.
  • Bilder der fokussierenden Proteine können kontinuierlich und/oder periodisch während der IEF aufgenommen werden. Wenn die Fokussierung abgeschlossen ist, wird vom Einlass 412 ein niedriger Druck angelegt, wodurch der pH-Gradient in Richtung der Öffnung 424 mobilisiert wird. Das elektrische Feld kann zu diesem Zeitpunkt aufrechterhalten werden, um die hochauflösende IEF-Trennung aufrechtzuerhalten. Weiteres Abbilden des Anreicherungskanals 418 während des ESI-Prozesses kann verwendet werden, um den pl jedes Proteins zu bestimmen, wenn es aus der Öffnung 424 ausgestoßen wird.
  • Wenn sich die angereicherte Proteinfraktion vom Anreicherungskanal 418 in den Zusammenfluss 420 bewegt, vermischt sie sich mit der Hüllflüssigkeit, die über die Hüll-/Katholytflüssigkeitskanäle 406, 438 von den Katholyt-Bohrungen 404, 436 zum Zusammenfluss 420 fließen kann. Mischen von angereicherten Proteinfraktionen mit der Hüllflüssigkeit kann die Proteinfraktion in eine mit Massenspektrometrie-kompatible Lösung geben und die Ladung für das fokussierte Protein wiederherstellen (IEF versetzt Proteine in einen ungeladenen Zustand), wodurch die Ionisierung verbessert wird.
  • Die angereicherte Proteinfraktion bewegt sich dann zu der Öffnung 424 weiter, die durch eine versenkte Oberfläche 422 der Glasplatte 402 definiert werden kann. Die angereicherte Proteinfraktion kann einen Taylor-Kegel erzeugen, sobald sie einmal in dem elektrischen Feld zwischen der Hüllflüssigkeits-Bohrungen-Masse und dem Massenspektrometer-Minuspol gefangen ist.
  • Wenn die Lösung weiterhin auf den Taylor-Kegel aus dem Anreicherungskanal 418 drückt, werden kleine Flüssigkeitströpfchen aus dem Taylor-Kegel ausgestoßen und fliegen in Richtung des Massenspektrometer-Einlasses. Stickstoffgas (z.B. bei 150 °C) kann aus den Gasbohrungen 408, 440 entlang den Gaskanälen 410, 432 strömen und Stickstoffgasströme bilden, die den Taylor-Kegel flankieren, was die aus dem Taylor-Kegel austretenden Tröpfchen in feinen Nebel umwandeln kann, vor dem Verlassen der Mikrofluidik-Vorrichtung, was die Detektion im Massenspektrometer unterstützen kann. Das Einstellen des Drucks vom Einlass 412 kann die Taylor-Kegelgröße nach Bedarf anpassen, um die Detektion im Massenspektrometer zu verbessern.
  • Beispiel 2 - Umkehrphase -> IEF -> MS
  • Beispiel 2 kann ähnlich zu Beispiel 1 sein, wird jedoch unter Bezugnahme auf 1 beschrieben. Der Kanal 116 kann eine erste Anreicherungszone sein, die mit C18-derivatisiertem Sol-Gel beladen ist. Nach dem Laden des Proteins kann ein Volumen des Elutionsmittels (MeCN/H2O mit IEF-Ampholyten und Standards) in den Kanal 116 geladen werden, um die am wenigsten hydrophoben Proteine zu eluieren, die auf dem Sol-Gel gefangen sind. Das Eluat wird zu Kanal 124 geleitet, der eine zweite Anreicherungszone sein kann, in der IEF, UV-Absorptionsüberwachung und schließlich ESI wie in Beispiel 1 beschrieben stattfinden. Sobald einmal die ESI des ersten Eluats abgeschlossen ist, wird ein Volumen mit höherer MeCN-Konzentration verwendet, um die nächstwenig hydrophobe Proteinfraktion zu eluieren.
  • Beispiel 3 - Wirksamkeit -> IEF-> MS
  • Beispiel 3 kann ähnlich zu Beispiel 2 sein, jedoch können mit einem biologischen Zielwirkstoff derivatisierte Kügelchen in Kanal 116 geladen und zum Einfangen von Protein verwendet werden. Die Reaktionsaffinität ist durch Elution durch Ziel-Lösungsphase (kompetitiv), Salz, pH oder dergleichen gekennzeichnet.
  • Beispiel 4 - Umkehrphase -> Kapillarzonenelektrophorese -> MS
  • Beispiel 4 kann ähnlich zu Beispiel 2 sein, wird jedoch unter Bezugnahme auf 5 beschrieben. Ein Proteingemisch kann durch den Einlass 521 geladen und durch die Anreicherungszone 510 geleitet werden, die C18-derivatisierte Kügelchen für die Umkehrphasenchromatographie enthalten kann. Während des Ladens strömt Flüssigkeit durch die Zone 510, durch den Sichtbereich 511 und aus dem Auslass 522 zum Abfall. Der Sichtbereich 510 verläuft durch eine innere Schicht aus Kalknatronglas, die für UV-Licht mit 280 nm undurchlässig ist, während die obere und die untere Schicht, die für Licht mit 280 nm transparent sind, aus Quarzglas bestehen.
  • Eine 280-nm-Lichtquelle ist unter dem Sichtbereich 511 positioniert und ein CCD-Detektor ist über dem Sichtbereich 511 platziert.
  • Eine Lösung von 20% MeCN/H2O wird durch den Einlass 521 durch die Anreicherungszone 510 geladen. Diese Lösung wird eine Fraktion eluieren, die mit den am wenigsten hydrophoben Proteinen im Gemisch angereichert ist. Der Sichtbereich 511 wird in Bezug auf die Absorption der angereicherten Proteinfraktion bei 280 nm überwacht, wenn sie sich von der Anreicherungszone 510 zum Auslass 522 bewegt. Wenn die Fraktion am Schnittpunkt der Anreicherungszone 510 und der Anreicherungszone 515 positioniert ist, wird eine Stromversorgung eingeschaltet, was ein elektrisches Feld zwischen einer positiven Elektrode in Reservoir 514 und Masse bei Reservoir 504 erzeugt. Diese Polarität kann leicht umgekehrt werden, indem die Polarität der Stromversorgung umgeschaltet wird. Sobald das elektrische Feld einmal vorhanden ist, wandert die angereicherte Proteinfraktion die Anreicherungszone 515 hinunter und trennt Proteine durch Kapillarzonenelektrophorese. Die getrennten Proteine mischen sich am Zusammenfluss 516 mit der Hüll-Elektrolytlösung und bilden auf der Oberfläche 518 einen Taylor-Kegel. Die Stickstoff-Zerstäubungsgasleitung ist an den Anschlüssen 508 und 528 mit der Vorrichtung verbunden und bewegt sich durch die Kanäle 512 und 530, um Material vom Elektrospray zu flankieren, wenn es die Vorrichtung über die Öffnung 520 verlässt.
  • Alternativ könnte hydrodynamischer Druck verwendet werden, um die angereicherte Proteinfraktion in die Anreicherungszone 515 zu laden.
  • Beispiel 5 - Immunpräzipitation -> Kapillargelelektrophorese von Proteinlysaten
  • In diesem Beispiel wird eine Mikrofluidik-Kanalschicht, die durch das Layout in 7 dargestellt ist, aus einem Cycloolefin-Co-Polymer hergestellt. Ebenso definiert das Substrat 802 der Mikrofluidik-Vorrichtung 800 ein Kanalnetzwerk. Für viele Anwendungen, zum Beispiel wenn Fluoreszenzdetektion verwendet wird, könnte die Mikrofluidik-Vorrichtung 800 unter Verwendung eines einzigen Materials hergestellt werden, vorausgesetzt, dieses Material lässt den Wellenlängenbereich des Lichts durch, der zum Detektieren des Analyten benötigt wird.
  • Protein A-beschichtete Kügelchen werden in den Kanal 806 geladen. Diese Kügelchen werden mit einer Lösung von Antikörper, der gegen ein Ziel von Interesse gerichtet ist und der an die Protein A-Kügelchen bindet, gespült. Um das Ablösen von Antikörpern zu reduzieren, das die Detektion von Analyten stört, wird der Antikörper dann unter Verwendung von im Handel erhältlichen Vernetzungsreagenzien, wie Dimethylpimelimidat (DMP), Bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS3) und dergleichen, kovalent mit dem Antikörper mit dem Kügelchen vernetzt. Nachdem die Immunpräzipitationskügelchen hergestellt und in den Kanal 806 geladen wurden, kann die Lysatanalyt-Probe über die Röhre 804 geladen werden. Nachdem dem Analyten genügend Zeit gegeben wurde, um von dem immobilisierten Antikörper eingefangen zu werden, werden ungebundene Proteine weggewaschen und über die Röhre 822 zu Abfall entsorgt.
  • Als nächstes wird das Protein von den Antikörper-Kügelchen eluiert, sodass es analysiert werden kann. Die Elution erfolgt durch Beladen mit Natriumdodecylsulfat (SDS) und Erhitzen auf 50 °C für 10 Minuten. Sobald er einmal freigesetzt ist, fließt der eluierte Analyt durch den Kanal 808 zum Schnittpunkt von Kanal 808 und 814. Wenn der Analyt-Pfropf den Schnittpunkt von Kanal 808 und 814 erreicht, wird ein elektrisches Feld zwischen einem negativen Pol an Reservoir 812 und einem positiven Pol an Reservoir 816 eingeschaltet, wodurch das negativ geladene Protein durch eine lineare Dextran-Polymerlösung in Kanal 814 wandert, die mit dem fluorogenen Proteinfarbstoff SYPRO® Ruby beladen wurde.
  • Fluoreszenzmarkiertes Zielprotein kann während der CGE in Kanal 814 unter Verwendung von Ganzsäulenbildgebung sichtbar gemacht werden. Ebenso kann der gesamte Kanal 814 abgebildet werden, während der SYPRO®-Ruby-Farbstoff mit 280 nm-Licht angeregt wird und emittiertes Licht, mit 618 nm, von einem Detektor gemessen wird.
  • Beispiel 6 - Variationen des Mikrofluiddesigns ohne Massenspektrometer-Schnittstelle
  • In einigen Fällen ist es vorteilhaft, zwei Designs einer Mikrofluidik-Schicht zu haben, die sich durch die Anwesenheit oder Abwesenheit der Massenspektrometer-Schnittstelle unterscheiden. Sobald ein Analyt charakterisiert ist, kann eine bestätigende Charakterisierung in Abwesenheit der Massenspektrometrie-Daten durchgeführt werden. Durch Ausführen der bestätigenden Charakterisierung in nahezu demselben Mikrofluidik-Design ist es bei Identifizierung einer Anomalie einfach, den Assay zurück auf den Chip mit der Massenspektrometrie-Schnittstelle zur Massenidentifizierung zu übertragen. Dies kann die Arbeit ersparen, die sonst erforderlich ist, um zu zeigen, dass die Anomalie in den bestätigenden Daten in den Massenspektrometrie-Daten analysiert wird.
  • Als Beispiel zeigt 8 ein Mikrofluidik-Design, ähnlich der in 4 gezeigten Mikrofluidik-Vorrichtung 400, ohne die Öffnung 424 und die versenkte Oberfläche 422. Der Analyt wird immer noch durch einen Einlass 904 und einen Kanal 906 zu einem Anreicherungskanal 908 in den Chip eingeleitet, nach der Analyse wird die Probe jedoch durch einen Auslasskanal 910 herausgespült, anstatt eine Elektrospray-Ionisation an einer Öffnung durchzuführen. Diese Konstruktion könnte für den allgemeinen Betrieb verwendet werden und dann kann zu Zeitenpunkten, an denen eine Massenidentifizierung erforderlich ist, die gleiche Anreicherung an der in 4 gezeigten Mikrofluidik-Vorrichtung 400 durchgeführt werden, um die Identifizierung der Analytvarianten zu gewährleisten, die auf der Mikrofluidik-Vorrichtung 900 von 8 gesehen wurden.
  • Die vorstehenden Beschreibungen spezifischer Ausführungsformen der Erfindung wurden zum Zwecke der Veranschaulichung und Beschreibung vorgelegt. Sie sollen nicht erschöpfend sein oder die Erfindung auf die genauen offenbarten Formen beschränken und offensichtlich sind viele Modifikationen und Variationen im Lichte der obigen Lehre möglich. Obwohl verschiedene Ausführungsformen als bestimmte Merkmale und/oder Kombinationen von Komponenten aufweisend beschrieben wurden, sind andere Ausführungsformen möglich, die gegebenenfalls eine Kombination von beliebigen Merkmalen und/oder Komponenten aus beliebigen Ausführungsformen aufweisen. Die Ausführungsformen wurden ausgewählt und beschrieben, um die Prinzipien der Erfindung und ihre praktische Anwendung bestmöglich zu erläutern und es dadurch anderen Fachleuten zu ermöglichen, die Erfindung und verschiedene Ausführungsformen mit verschiedenen Modifikationen bestmöglich zu nutzen, wie sie für die jeweilige vorgesehene Verwendung geeignet sind. Es ist beabsichtigt, dass der Umfang der Erfindung durch die beigefügten Ansprüche und deren Äquivalente definiert wird.
  • Wenn oben beschriebene Verfahren und/oder Schemata bestimmte Ereignisse und/oder Fließmuster angeben, die in bestimmter Reihenfolge auftreten, kann die Reihenfolge bestimmter Ereignisse und/oder Fließmuster modifiziert werden. Darüber hinaus können bestimmte Ereignisse wenn möglich gleichzeitig in parallelen Prozessen ausgeführt werden sowie nacheinander ausgeführt werden. Während die Ausführungsformen speziell gezeigt und beschrieben wurden, versteht es sich, dass verschiedene Änderungen in Form und Details vorgenommen werden können.
  • Alle hier zitierten Patente, Patentanmeldungen, Veröffentlichungen und Referenzen werden ausdrücklich durch Bezugnahme in demselben Umfang aufgenommen, als ob jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und individuell als durch Bezugnahme aufgenommen angegeben wäre.
  • Offenbart sind die folgenden Punkte:
    • 1. Vorrichtung, umfassend:
      • ein Substrat, konstruiert aus einem undurchsichtigen Material, wobei das Substrat eine Dicke und eine obere Oberfläche aufweist, in der ein Mikrofluidik-Trennkanal mit einer Dicke definiert ist, die der Dicke des Substrats entspricht, sodass der Mikrofluidik-Trennkanal einen optischen Spalt durch das Substrat definiert; und
      • und eine Schicht, die auf einer oberen Oberfläche des Substrats angeordnet ist, wobei ein Teil der Schicht, der über dem Mikrofluidik-Trennkanal angeordnet ist, transparent ist.
    • 2. Vorrichtung nach Punkt 1, wobei die Schicht eine erste Schicht ist, wobei die Vorrichtung außerdem umfasst:
      • eine zweite Schicht, die auf einer unteren Oberfläche des Substrats angeordnet ist, wobei ein Teil der zweiten Schicht, der unter dem Mikrofluidik-Trennkanal angeordnet ist, transparent ist.
    • 3. Vorrichtung nach Punkt 1, außerdem umfassend Trennmedien, die in dem Mikrofluidik-Trennkanal angeordnet sind.
    • 4. Vorrichtung nach Punkt 1, außerdem umfassend eine Ampholytlösung, die in dem Mikrofluidik-Trennkanal angeordnet ist.
    • 5. Vorrichtung nach Punkt 1, wobei das Substrat, der Mikrofluidik-Trennkanal und die Schicht gemeinsam so konfiguriert sind, dass Licht nur durch den optischen Spalt durchgelassen wird, wenn die Vorrichtung abgebildet wird.
    • 6. Vorrichtung nach Punkt 1, wobei ein Teil der Schicht undurchsichtig ist.
    • 7. Vorrichtung nach Punkt 1, wobei sich der Teil der Schicht, der transparent ist, über eine gesamte Länge des Mikrofluidik-Trennkanals erstreckt.
    • 8. Vorrichtung nach Punkt 1, wobei:
      • eine Seitenfläche des Substrats eine versenkte Oberfläche mit einer Öffnung in Flüssigkeitsverbindung mit einem Endabschnitt des Mikrofluidik-Trennkanals definiert;
      • das Substrat ein Reservoir definiert, das fluidisch mit dem Endabschnitt des Mikrofluid-Trennkanals gekoppelt ist, sodass Flüssigkeit aus dem Reservoir eine Hülllösung um Flüssigkeit aus dem Mikrofluid-Trennkanal bildet, wenn Flüssigkeit aus der Öffnung ausgestoßen wird.
    • 9. Vorrichtung nach Punkt 1, wobei:
      • das Substrat außerdem einen Gaskanal definiert;
      • eine Seitenfläche des Substrats eine versenkte Oberfläche mit einer ersten Öffnung in Flüssigkeitsverbindung mit dem Substrat und einer zweiten Öffnung, die durch die versenkte Oberfläche definiert ist, definiert, wobei der Gaskanal konfiguriert ist, um Zerstäubungsgas zu transportieren, das aus der ersten Öffnung ausgestoßene Flüssigkeit flankiert.
    • 10. Vorrichtung nach Punkt 1, wobei das Substrat außerdem definiert:
      • ein erstes Reservoir, das fluidisch mit einem ersten Endabschnitt des Mikrofluid-Trennkanals gekoppelt ist;
      • ein zweites Reservoir, das fluidisch mit einem zweiten Endabschnitt des Mikrofluid-Trennkanals gegenüber dem ersten Endabschnitt gekoppelt ist, wobei die Vorrichtung außerdem umfasst:
        • einen ersten elektrischen Kontakt, der elektrisch mit dem ersten Reservoir gekoppelt ist; und
        • einen zweiten elektrischen Kontakt, der elektrisch mit dem zweiten Reservoir gekoppelt ist, sodass ein elektrisches Feld über das erste Reservoir und das zweite Reservoir an den Mikrofluidik-Trennkanal angelegt werden kann, um Elektrophorese innerhalb des Mikrofluidik-Trennkanals zu induzieren.
    • 11. Vorrichtung nach Punkt 1, wobei der Mikrofluidik-Trennkanal ein chromatographischer Trennkanal ist und das Substrat außerdem einen elektrophoretischen Trennkanal definiert, der fluidisch mit dem chromatographischen Trennkanal gekoppelt ist, sodass mindestens zwei Trennphasen innerhalb der Vorrichtung durchgeführt werden können.
    • 12. Vorrichtung nach Punkt 1, wobei das Substrat außerdem einen Elutionskanal definiert, der fluidisch mit dem Mikrofluidik-Trennkanal gekoppelt ist, wobei der Elutionskanal so konfiguriert ist, dass er ein Elutionsmittel zum Mikrofluidik-Trennkanal befördert, um einen Analyten zu eluieren, der an ein im Mikrofluidik-Trennkanal angeordnetes Medium gebunden ist.
    • 13. Vorrichtung nach Punkt 1, wobei eine Seitenfläche des Substrats eine versenkte Oberfläche mit einer Öffnung in Flüssigkeitsverbindung mit dem Mikrofluidik-Trennkanal definiert, wobei die Öffnung und die versenkte Oberfläche gemeinsam so konfiguriert sind, dass ein von der Öffnung ausgehender Taylor-Kegel vollständig innerhalb eines durch die versenkte Oberfläche definierten Volumens angeordnet ist.
    • 14. Verfahren, umfassend:
      • Einbringen eines Analytgemisches in eine Mikrofluidik-Vorrichtung, die einen Trennkanal enthält;
      • Anlegen eines elektrischen Feldes über den Trennkanal, um eine Trennung des Analytgemisches zu bewirken;
      • Abbilden der Trennung des Analytgemisches über einen transparenten Abschnitt der Mikrofluidik-Vorrichtung;
      • Ausstoßen eines Teils des Analytgemisches aus einer Öffnung in Flüssigkeitsverbindung mit dem Trennkanal.
    • 15. Verfahren nach Punkt 14, wobei die Fraktion des Analytgemisches durch ElektrosprayIonisation ausgestoßen wird.
    • 16. Verfahren nach Punkt 14, wobei die Fraktion des Analytgemisches durch ElektrosprayIonisation ausgestoßen wird und die Öffnung in einer durch die Mikrofluidik-Vorrichtung definierten Aussparung angeordnet ist, sodass sich der Taylor-Kegel an der Öffnung vollständig innerhalb der Aussparung bildet.
    • 17. Verfahren nach Punkt 14, wobei das Abbilden der Trennung des Analytgemisches das Abbilden des gesamten Trennkanals umfasst.
    • 18. Verfahren nach Punkt 14, außerdem umfassend:
      • Beleuchten einer Oberfläche einer Mikrofluidik-Vorrichtung, wobei der Trennkanal in einem undurchsichtigen Substrat der Mikrofluidik-Vorrichtung so ausgebildet ist, dass das Substrat nur Licht, das auf den Trennkanal fällt, zur Abbildung durchlässt.
    • 19. Verfahren nach Punkt 14, außerdem umfassend:
      • Beleuchten der Mikrofluidik-Vorrichtung mit ultraviolettem Licht;
      • Blocken von ultraviolettem Licht, das auf ein Substrat einfällt, das aus Natronkalkglas besteht, wobei das Substrat die Mikrofluidik-Vorrichtung so definiert, dass das Abbilden der Trennung des Analytgemisches nur das Abbilden von ultraviolettem Licht umfasst, das den Trennkanal durchläuft.
    • 20. Verfahren nach Punkt 14, wobei der Trennkanal ein erster Trennkanal ist, wobei das Verfahren außerdem umfasst:
      • Anreichern einer Fraktion des Analytgemisches in einem zweiten Trennkanal der Mikrofluidik-Vorrichtung.
    • 21. Verfahren nach Punkt 14, wobei:
      • der Trennkanal ein erster Trennkanal ist; und
      • das elektrische Feld eine Trennung einer Fraktion des Analytgemisches bewirkt, wobei das Verfahren außerdem umfasst:
        • chromatographisches Anreichern der Fraktion des Analytgemisches in einem zweiten Trennkanal vor dem Anlegen des elektrischen Feldes, um die Trennung der Fraktion des Analytgemisches zu bewirken.
    • 22. Verfahren, umfassend:
      • Injizieren eines Analytgemisches in eine Mikrofluidik-Vorrichtung, die einen ersten Trennkanal enthält, wobei der erste Trennkanal ein Medium enthält, das konfiguriert ist, um an einen Analyten aus dem Analytgemisch zu binden;
      • Injizieren eines Elutionsmittels in die Mikrofluidik-Vorrichtung, sodass mindestens ein Teil des Analyten aus dem Medium mobilisiert wird;
      • Abbilden des ersten Trennkanals, während der Analyt mobilisiert wird;
      • Anlegen eines elektrischen Feldes an einen zweiten Trennkanal, wenn die Bildgebung detektiert, dass die Fraktion an einem Schnittpunkt des ersten Trennkanals und des zweiten Trennkanals angeordnet ist, sodass die Fraktion in den zweiten Trennkanal mobilisiert wird; und Ausstoßen mindestens eines Teils der Fraktion.
    • 23. Verfahren nach Punkt 22, wobei mindestens der Teil der Fraktion durch ElektrosprayIonisation ausgestoßen wird.
    • 24. Verfahren nach Punkt 22, wobei mindestens der Teil der Fraktion durch ElektrosprayIonisation ausgestoßen wird, sodass sich an einer Öffnung, die in einer durch die Mikrofluidik-Vorrichtung definierten Aussparung angeordnet ist, ein Taylor-Kegel bildet.
    • 25. Verfahren nach Punkt 22, außerdem umfassend:
      • Trennen der Analytfraktion über Kapillarzonenelektrophorese im zweiten Trennkanal.
    • 26. Verfahren nach Punkt 22, außerdem umfassend:
      • Trennen der Analytfraktion durch Elektrophorese im zweiten Trennkanal; und
      • Abbilden des zweiten Trennkanals, während die Analytfraktion getrennt wird.
    • 27. Verfahren nach Punkt 22, wobei ein erster Endabschnitt des zweiten Trennkanals den ersten Trennkanal schneidet, wobei das Verfahren außerdem umfasst:
      • Injizieren einer Hülllösung in einen zweiten Endabschnitt des Trennkanals gegenüber dem ersten Endabschnitt des Trennkanals.
    • 28. Verfahren nach Punkt 22, wobei der erste Trennkanal und der zweite Trennkanal orthogonal sind.
    • 29. Vorrichtung, umfassend:
      • ein Substrat, das Folgendes definiert:
        • eine erste Anreicherungszone, die ein Medium enthält, das konfiguriert ist, um an einen Analyten zu binden;
        • eine zweite Anreicherungszone, die die erste Anreicherungszone schneidet;
        • eine eingesenkte Oberfläche; und
        • eine Öffnung, die durch die eingesenkte Oberfläche definiert ist, wobei die Öffnung ein Durchlass zu einem ersten Endabschnitt der zweiten Anreicherungszone ist;
        • eine erste Elektrode, die elektrisch mit dem ersten Endabschnitt der zweiten Anreicherungszone gekoppelt ist; und
        • eine zweite Elektrode, die elektrisch mit einem zweiten Endabschnitt der zweiten Anreicherungszone gegenüber dem ersten Endabschnitt gekoppelt ist.
    • 30. Vorrichtung nach Punkt 29, wobei die erste Anreicherungszone orthogonal zur zweiten Anreicherungszone ist.
    • 31. Vorrichtung nach Punkt 29, wobei die erste Anreicherungszone vor der zweiten Anreicherungszone angeordnet ist, sodass mindestens ein Teil einer Probe von der ersten Anreicherungszone zur zweiten Anreicherungszone fließt.
    • 32. Vorrichtung nach Punkt 29, außerdem umfassend:
      • eine Abdeckung, die über dem Substrat angeordnet ist, wobei mindestens ein Teil der Abdeckung transparent ist.
    • 33. Vorrichtung nach Punkt 29, wobei das Substrat aus Natronkalkglas konstruiert ist, sodass die erste Anreicherungszone einen optischen Spalt definiert, wenn die Vorrichtung mit ultraviolettem Licht beleuchtet wird.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
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Claims (25)

  1. Vorrichtung, umfassend: a) eine Mikrofluidik-Vorrichtung, die ein Substrat umfasst, wobei das Substrat definiert: i) einen Trennkanal, der konfiguriert ist, um Trennung eines Analytgemisches durchzuführen; und ii) eine Öffnung in Flüssigkeitsverbindung mit einem Ende des Trennkanals, wobei die Öffnung konfiguriert ist, um Elektrospray-Ionisation von getrennten Analytfraktionen durchzuführen, die aus dem Trennkanal mobilisiert wurden, und sie in ein Massenspektrometer auszustoßen; und b) eine Bildgebungsvorrichtung, die konfiguriert ist, um sowohl die Trennung als auch die Elution der getrennten Analytfraktionen in dem Trennkanal oder einem Teil davon abzubilden.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, außerdem umfassend ein Massenspektrometer.
  3. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung außerdem konfiguriert ist, um getrennte Analytpeaks, die in dem Trennkanal detektiert wurden, mit Massenspektrometer-Daten für die getrennten Analyten zu korrelieren.
  4. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Trennung eine chromatographische Trennung umfasst.
  5. Vorrichtung nach Anspruch 1, außerdem umfassend mindestens zwei Elektroden, wobei die mindestens zwei Elektroden konfiguriert sind, um ein elektrisches Feld über den Trennkanal anzulegen, um das Analytgemisch durch isoelektrische Fokussierung zu trennen.
  6. Vorrichtung nach Anspruch 1, außerdem umfassend mindestens zwei Elektroden, wobei die mindestens zwei Elektroden konfiguriert sind, um ein elektrisches Feld über den Trennkanal anzulegen, um das Analytgemisch durch Elektrophorese zu trennen.
  7. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei Peaks, die den getrennten Analytfraktionen entsprechen, durch Absorptionsbildgebung detektiert werden.
  8. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei Peaks, die den getrennten Analytfraktionen entsprechen, durch Fluoreszenzbildgebung detektiert werden.
  9. Vorrichtung nach Anspruch 8, wobei die Fluoreszenzbildgebung eine native Fluoreszenzbildgebung umfasst.
  10. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Öffnung in elektrischer Verbindung mit dem elektrischen Feld des Trennkanals steht.
  11. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Öffnung in einer Aussparung an der Mikrofluidik-Vorrichtung positioniert ist, sodass ein durch Elektrospray-Ionisation gebildeter Taylor-Kegel vollständig innerhalb der Aussparung angeordnet ist.
  12. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Mikrofluidik-Vorrichtung einen ersten Trennkanal und einen zweiten Trennkanal umfasst.
  13. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Mikrofluidik-Vorrichtung konfiguriert ist, um eine chromatographische Anreicherung des Analytgemisches im ersten Trennkanal durchzuführen, bevor ein elektrisches Feld angelegt wird, um isoelektrische Fokussierung des Analytgemisches im zweiten Trennkanal durchzuführen.
  14. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei die Mikrofluidik-Vorrichtung konfiguriert ist, um eine chromatographische Anreicherung des Analytgemisches im ersten Trennkanal durchzuführen, bevor ein elektrisches Feld angelegt wird, um elektrophoretische Trennung des Analytgemisches im zweiten Trennkanal durchzuführen.
  15. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei isoelektrischer-Punkt (pl)-Marker in den Trennkanal eingeleitet werden, bevor eine isoelektrische Fokussierungstrennung durchgeführt wird, und zum Abbilden von pl-Bereichen im Trennkanal verwendet werden.
  16. Vorrichtung nach Anspruch 15, wobei die Vorrichtung außerdem konfiguriert ist, um einen Wert für den isoelektrischen Punkt von mindestens einer getrennten Analytfraktion zu bestimmen.
  17. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Analytgemisch intakte Proteine umfasst.
  18. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei Mobilisierung durch Einleiten eines Elektrolyten in den Trennkanal unter Verwendung von Druck durchgeführt wird.
  19. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei Mobilisierung durch Einleiten eines Elektrolyten in den Trennkanal unter Verwendung von Elektrophorese durchgeführt wird.
  20. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Mikrofluidik-Vorrichtung außerdem einen Elektrolyteinleitungskanal umfasst, der den Trennkanal am Zusammenfluss des Trennkanals und der Öffnung schneidet, und wobei die Mobilisierung durch Einleiten eines Elektrolyten in den Trennkanal aus dem Elektrolyteinleitungskanal durchgeführt wird.
  21. Vorrichtung nach Anspruch 20, außerdem umfassend zwei Elektroden, die konfiguriert sind, um ein elektrisches Feld über den Elektrolyteinleitungskanal anzulegen, um einen Mobilisierungselektrolyten einzuleiten.
  22. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Mikrofluidik-Vorrichtung außerdem einen Anolyteinleitungskanal umfasst.
  23. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Mikrofluidik-Vorrichtung außerdem einen Gaszufuhrkanal zur Ionisation umfasst.
  24. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei Auffüllen des lonenpotentials auf der Mikrofluidik-Vorrichtung erfolgt.
  25. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Mikrofluidik-Vorrichtung außerdem einen optischen Spalt aufweist, der mit dem Trennkanal ausgerichtet ist, sodass Licht nur durch den optischen Spalt durchgelassen wird.
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