KR20220073837A - 순차적 pH 조절을 갖는 단일 채널 자유 유동 전기영동 방법 - Google Patents

순차적 pH 조절을 갖는 단일 채널 자유 유동 전기영동 방법 Download PDF

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Abstract

본원에 기술된 구현예는, 전해질 완충액의 pH 값을 순차적으로 조정하여 샘플로부터 관심 분석물을 분리 수집하고, 상응하는 분석물의 등전점에 따라 관심 분석물을 분리하기 위한, 단일 채널 자유 유동 전기영동 장치 또는 기구, 및 방법에 관한 것이다. 상기 방법은, 단일 중앙 채널을 통해 샘플을 유동시키는 단계, 중앙 채널에 평행한 양극액 채널 및 음극액 채널을 통해 샘플의 유동 방향에 수직인 전기장을 인가하는 단계, 이어서 각각의 등전점에 따라 관심 분석물의 분획을 수집하는 단계를 포함한다.

Description

순차적 pH 조절을 갖는 단일 채널 자유 유동 전기영동 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은, "순차적 pH 조정을 갖는 단일 채널 자유 유동 전기영동 방법"으로 명명된 2019년 10월 9일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/912,963호의 우선권을 주장하며, 그 전체 개시 내용은 본원에 참조로서 통합된다.
본원에 기술된 일부 구현예는 단백질 샘플의 분리 및 수집을 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.
등전점 집속(IEF)을 포함하는 전기영동은 단백질 분리를 위한 통상적인 기술이다. IEF는 그의 등전점(pI)에 따라 pH 구배에서 단백질 및 다른 양쪽성 용질을 분리하는 전기영동 기술이다. 합성 담체 양성전해질은 전기장을 인가한 후 pH 구배를 신속하게 확립하는 작은 양쪽성 분자이다. pH 구배가 확립되면, 느리게 움직이는 단백질 및 다른 양쪽성 분자가 이들의 pI에 집중되어 농축될 것이다. IEF는 제조 및 분석 규모 모두에서 수행될 수 있다. 제조 규모 IEF 장치는 일반적으로 제조 규모 장치가 줄(Joule) 열을 효과적으로 방출하고 대류 혼합을 최소한으로 유지하는 것이 불가능하기 때문에 그의 분석 장치에 뒤쳐진다. 또한, 질량 분광분석과 같은 통상적인 하류 분석을 사용하는 양쪽성 전해질의 부적합성으로 인해 후속 정제 단계가 필요할 수 있다. 결과적으로, 상업적으로 이용 가능한 제조 규모 IEF 장치는 낮은 처리량과 불량의 문제를 겪는다.
자유 유동 전기영동(FFE)은 모세관 전기영동과 유사한 기술이며, 분해능이 비슷하며, 샘플의 준-제조 및 제조 양을 생성할 수 있다. FFE에 대한 2가지 전형적인 분리 모드는 구역 전기영동(ZE) 및 IEF이다. FFE 시스템에서, 샘플 분리 및 수집은 연속적인 과정이다. FFE 시스템은 제조 규모의 모세관 IEF 장치에 비해 처리량 및 분해능의 일부 이점을 갖지만, 이러한 FFE 시스템은 작동 중에 양쪽성 전해질과 같은 엄청난 양의 시약을 소모하기 때문에 작동에 비용이 많이 든다. 또한, 공지된 FFE 기구는 설정하고 유지하기에 번거롭고, 기포는 재현불능의 원인이 된다.
현재의 상업적 제품의 심각한 단점을 고려하여, 본 개시는 샘플 분리 및 수집을 위한 연속 유동의 특징을 유지하는 단일 채널 자유 유동 전기영동을 위한 장치 및 방법을 기술한다. 본원에 기술된 장치는 특정 pI를 갖는 분석물을 단리하도록 작동 가능하고, 샘플 제조에 대해 중간 내지 높은 처리량을 갖는다. 본원에 기술된 단일 채널 장치는 일반적으로 공지된 FFE 장치에 비해 훨씬 더 낮은 시약 소비를 가능하게 하고 훨씬 더 간단한 설정 및 작동을 갖는다. 또한, 공지된 FFE 장치와 달리, 본원에 기술된 일부 구현예는 양쪽성 전해질을 필요로 하지 않는다.
본원에 기술된 일부 구현예는 단백질과 같은 생물학적 물질 또는 분석물을 함유하는 샘플의 수집 및 분리를 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.
본원에 기술된 일부 구현예는, 샘플이 중앙 채널을 통해 유체역학적으로 흐를 때 분석물의 혼합물을 함유하는 샘플을 전기영동적으로 분별하도록 구성된 장치에 관한 것이다. 장치는 유입구를 통해 샘플을 수용하고 유출구를 통해 샘플의 적어도 일부(예를 들어, 분획된 관심 분석물)를 방출하도록 구성될 수 있다. 장치는 샘플이 중앙 채널을 통해 유체역학적으로 이동하는 동안 샘플이 전기영동식으로 분별되도록 샘플의 연속적인 유동으로 작동되도록 구성될 수 있다. 양극액 및 음극액 채널은 중앙 채널에 대해 평행하고 중앙 채널의 반대측에 배치될 수 있다. 양극액 및 음극액 채널은 전해질로 채워지고 양극 및 음극에 각각 결합되도록 구성될 수 있다. 다공성 멤브레인과 같은 유체역학적 장벽은 중앙 채널과 양극액 채널 및 음극액 채널 중 적어도 하나 사이에 배치될 수 있다. 에너지가 공급될 때(즉, 전위가 양극 및 음극에 인가될 때), 양극액 및 음극액 채널은 중앙 채널에 수직으로 배향되는 전기장을 집합적으로 유도할 수 있다. 이하에서 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 샘플 완충액 및/또는 전해질 완충액의 pH와 상이한 pI를 갖는 분석물은 전기장의 방향(유체역학적 유동의 방향에 대해 수직임)으로, 유체역학적 장벽 내로 또는 이를 통해 중앙 채널 밖으로 이동할 수 있다. 따라서, 샘플 완충액 및/또는 전해질 완충액의 pH와 일치하는 pI를 갖지 않는 샘플의 분획은 샘플의 벌크 유동으로부터 제거될 수 있고, 샘플 완충액 및/또는 전해질 완충액의 pH와 일치하는 pI를 갖는 분석물(들)의 농축된 분획(일부 경우, 실질적으로 순수한 분획)을 함유하는 분획은 유출구를 통해 중앙 채널을 빠져나갈 수 있다. 본원에서 보다 상세히 논의되는 바와 같이, 특정 관심 분석물은 샘플 및/또는 전해질 완충액의 pH를 제어함으로써 정제될 수 있다.
일부 구현예에서, 장치의 몸체는 분석물의 혼합물을 함유하는 샘플을 수용하도록 구성된 유입구를 정의할 수 있다. 일부 구현예에서, 분석물의 혼합물은 단백질을 포함할 수 있다. 장치의 몸체는 샘플의 분획된 부분을 방출하도록 구성된 유출구를 정의할 수 있다(예를 들어, 풍부하거나 실질적으로 순수한 관심 분석물을 함유함). 장치의 몸체는 음극에 결합되도록 구성된 음극액 채널 및 양극에 결합되도록 구성된 양극액 채널을 정의할 수 있다. 장치는 커버 및 커버와 몸체 사이에 배치된 유체역학적 장벽(예를 들어, 셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리비닐리덴 디플루오라이드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 또는 임의의 다른 적절한 물질로 작제됨)을 포함할 수 있다. 유체역학적 장벽, 몸체, 및 커버는 음극액 채널 및 양극액 채널에 평행한 유입구와 유출구 사이에 집합적으로 중앙 채널을 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, 중앙 채널은 유체역학적 장벽의 중공형 공간 또는 절개부에 의해 부분적으로 정의될 수 있다.
일부 구현예에서, 음극액 채널 또는 양극액 채널 중 적어도 하나는 전해질 완충액을 보관하도록 구성된 저장조에 유체적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 저장조는 MES-BisTris 완충액을 보관할 수 있다. 일부 경우, 전해질 완충액은 메틸 셀룰로오스와 같은 하나 이상의 중합체를 함유할 수 있다(예를 들어, 0.1중량% 내지 0.5중량%). 이러한 저장조는 100 mL 내지 500 mL의 부피를 가질 수 있다. 펌프는 별도의 루프를 통해 음극액 채널 및/또는 양극액 채널을 통해 저장조로부터 전해질을 재순환시키도록 구성될 수 있다. 다른 구현예에서, 펌프는 먼저 양극액 채널을 통해 저장조로부터 전해질 완충액을 재순환시킨 다음, 저장조로 복귀하기 전에 음극액 채널을 재순환시키도록(또는 그 반대로) 구성될 수 있다.
일부 구현예에서, 장치는 양극 및 음극을 포함할 수 있다. 양극 및 음극은 양극액 채널 및 음극액 채널에 각각 전기적으로 결합될 수 있어서, 에너지가 공급될 때, 양극액 채널 및 음극액 채널은 집합적으로 중앙 채널을 가로질러 그리고 중앙 채널에 수직으로 전기장을 인가한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 장치의 몸체는 음극액 채널의 유입구 및 음극액 채널의 유출구를 정의할 수 있다. 일 구현예에서, 몸체는 플라스틱 및/또는 실질적으로 방수성일 수 있다.
일부 구현예에서, 분석물의 혼합물은 1 내지 11의 등전점(pI)을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 더 상세히 논의되는 바와 같이, 전해질 완충액 및/또는 샘플 완충액은 관심 분석물(들)이 그의 pI 포인트에 기초하여 선택적으로 농축되거나 정제되도록, 샘플의 분석물을 분획화하도록 구성될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 전해질 완충액은 0.1 내지 14의 pH 값을 가질 수 있어서, 해당 범위 내의 상응하는 pI 값을 갖는 분석물은 선택적으로 농축되거나 정제될 수 있다.
일부 구현예에서, 유체역학적 장벽의 기공은 25 nm 내지 800 nm의 중간 특성 길이(예를 들어, 직경)를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 유체역학적 장벽은 100 μm 내지 200 μm의 두께를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 중앙 채널은 1 mm 내지 10 mm의 폭을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 중앙 채널은 10 cm 내지 20 cm의 길이를 가질 수 있다.
본원에 기술된 일부 구현예는 분석물의 혼합물을 분획화하는 방법에 관한 것이다. 샘플은 단일 채널 자유 유동 전기영동 장치의 중앙 채널을 통해 흐를 수 있다. 전기장은 중앙 채널에 평행한 전해질 완충액을 보관하는 양극액 채널 및 음극액 채널을 통해 샘플의 유동 방향에 수직으로 인가될 수 있다. 중앙 채널은 전기적으로 및/또는 이온적으로 결합될 수 있지만, 유체역학적 장벽을 통해 양극액 채널 및 음극액 채널 중 적어도 하나로부터 유체적으로 단리될 수 있다. 관심 분석물은 관심 분석물의 등전점 및 전해질 완충액 및/또는 샘플 완충액의 pH 값에 따라 샘플로부터 분리될 수 있다. 관심 분석물을 함유하는 샘플의 분획을 분석물의 혼합물로부터 분리하고 수집할 수 있다. 분획은 풍부하거나 실질적으로 순수한 관심 분석물을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 저장조로부터, 그리고 양극액 채널 및/또는 음극액 채널을 통해 전해질 완충액을 순환시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 전기장을 생성하도록 양극액 채널 및 음극액 채널에 걸쳐 전압을 인가하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 전해질 완충액이 저장조로 복귀하기 전에 양극액 채널 및 음극액 채널을 통해 유동할 수 있도록 저장조로부터 전해질 완충액을 순환시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 전해질 완충액이 2개의 개별 루프에서 양극액 채널 및 음극액 채널을 통해 유동할 수 있도록 저장조로부터 전해질 완충액을 순환시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법에 사용된 샘플의 분획은 분당 5 μL 내지 분당 15 μL의 속도에서 수집된 관심 분석물을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 전해질 완충액의 pH 값은 순차적으로 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 전해질 완충액의 pH 값은 MES와 BisTris의 비율을 조정시킴으로써 순차적으로 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 전해질 완충액의 pH 값은 샘플에 함유된 샘플 완충액과 동일할 수 있다.
일부 구현예에서, 전해질 완충액 및/또는 샘플의 pH 값은, 예를 들어 계량된 펌프 또는 밸브를 통해 순차적으로 조정될 수 있다. 따라서, 상이한 등전점을 갖는 다수의 분석물은 그 분획이 중앙 채널을 통해 유동하고/하거나 수집되는 시간 동안 전해질 완충액 및/또는 샘플 완충액의 pH에 기초하여 순차적으로 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 분석물은 일정한 속도로 수집될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 일 구현예에 따른 단일 채널 자유 유동 전기영동 장치의 조립체를 도시한다. 도 1a는 조립된 장치를 도시한다. 도 1b는 다음의 3개의 부분을 나타내는 장치의 분해도를 도시한다: 통상적으로 플라스틱으로 만들어진 몸체, 다공성 멤브레인 물질로 만들어진 중간 부분, 및 통상적으로 유리 또는 금속으로 만들어진 장치의 하단에 위치된 커버.
도 2a 및 도 2b는 일 구현예에 따른 단일 채널 자유 유동 전기영동 장치를 위한 전해질 완충액의 재순환 방식을 도시한다. 도 2a는 단일 루프를 갖는 재순환을 사용하는 구현예를 도시한다. 도 2b는 2개의 개별 루프를 갖는 재순환을 사용하는 구현예를 도시한다.
도 3a 내지 도 3c는 3.4 내지 10.1 범위의 pI를 갖는 펩티드 혼합물의 분획화의 예를 도시한다. 이 예에서, 완충액 시스템은 MES-BisTris에 기초한다. 완충액 pH는 MES와 BisTris의 비율을 변화시킴으로써 조정된다. 도 3a는 5.8의 완충액 pH를 갖는 펩티드 혼합물의 분획화를 도시한다. 도 3b는 6.3의 완충액 pH를 갖는 펩티드 혼합물의 분획화를 도시한다. 도 3c는 6.7의 완충액 pH를 갖는 펩티드 혼합물의 분획화를 도시한다.
도 4a 및 도 4b는 산성 IgG 분자를 포함하는 펩티드의 혼합물의 분획화의 예를 도시한다. 이 예에서, 완충액 시스템은 MES-BisTris에 기초한다. 도 4a는 6.3의 완충액 pH를 갖는 펩티드 혼합물의 분획화를 도시한다. 도 4b는 6.5의 완충액 pH를 갖는 펩티드 혼합물의 분획화를 도시한다.
도 5는 염기성 단백질 헤르셉틴(Herceptin)의 분획화의 예를 도시한다. 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(AMPD)을 완충액으로 사용하였고, pH는 8.8 내지 9.4 범위였다.
도 6은 일 구현예에 따른, 관심 단백질(들)을 이들의 등전점에 따른 분석물의 혼합물로부터 순차적으로 분리하는 방법의 흐름도이다.
도 7은 일 구현예에 따른, 적어도 6개의 부분을 갖는 장치의 분해도를 도시한다: 상단 커버, 스페이서, 하단 커버, 2개의 완충액 탱크 및 전극, 및 2개의 멤브레인 부분.
본 개시의 다양한 구현예가 본원에 도시되고 설명되었지만, 이러한 구현예는 단지 예시로서 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본 개시를 벗어나지 않고, 당업자에게 수많은 변형, 변경 및 대체가 발생할 수 있다. 본원에 기술된 본 개시의 구현예에 대한 다양한 대안이 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
본 명세서에 사용되는 단수 형태, "일", "하나" 및 "그"는, 문맥상 명확하게 달리 표시되지 않는 한, 복수를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 용어 "부재"는 단일 부재 또는 부재들의 조합을 의미하도록 의도되고, "물질"은 하나 이상의 물질, 또는 이들의 조합을 의미하도록 의도된다.
본원에서 사용되는 용어 "단백질"은 비-자연 발생 아미노산 및 아미노산 유사체, 및 펩티드모방 구조를 함유하는 단백질을 포함하는, 단백질, 올리고펩티드, 펩티드 및 유사체를 지칭한다. 용어 "단백질"은 또한 다양한 등전점을 갖는 단백질, 올리고펩티드, 펩티드 및 유사체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "분석물"은 본원에 기술된 바와 같이, 검출되거나 분리될 임의의 분자 또는 화합물을 지칭한다. 적절한 분석물은, 예를 들어, 환경 분자, 임상 분자, 화학물질, 오염 물질, 및/또는 생체분자와 같은 작은 화학 분자를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 이러한 화학 분자는, 농약, 살충제, 독소, 치료 약물 및/또는 남용 약물, 호르몬, 항생제, 항체, 유기 물질, 단백질(예를 들어, 효소, 면역글로불린, 및/또는 당단백질), 핵산(예를 들어, DNA 및/또는 RNA), 지질, 렉틴, 탄수화물, 전세포(예를 들어, 병원성 박테리아같은 원핵 세포 및/또는 포유류 종양 세포와 같은 진핵 세포), 바이러스, 포자, 다당류, 당단백질, 대사물, 보조인자, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 전이 상태 유사체, 억제제, 영양소, 전해질, 성장 인자, 및 다른 생체분자 및/또는 비-생체분자뿐만 아니라 이들의 단편 및 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본원에 기술된 일부 분석물은 효소, 약물, 세포, 항체, 항원, 세포 멤브레인 항원, 및/또는 수용체 또는 이의 리간드(예를 들어, 신경 수용체 또는 이의 리간드, 호르몬 수용체 또는 이의 리간드, 영양 수용체 또는 이의 리간드, 및/또는 세포 표면 수용체 또는 이의 리간드)와 같은 단백질일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "음극액"은 전기영동 장치의 음극 측에 있는 전해질을 지칭할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "양극액"은 전기영동 장치의 양극 측에 있는 전해질을 지칭할 수 있다. 일부 구현예에서, 공통 전해질이 전기영동 장치의 양 측면에 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "샘플"은 검출되거나 분리될 분석물 또는 분석물들을 함유하는 조성물을 지칭한다. 샘플은 이종이거나, 다양한 성분(예를 들어, 상이한 단백질)을 함유하거나, 하나의 성분을 함유하는 균질한 것일 수 있다. 일부 경우, 샘플은 자연적으로 발생할 수 있고, 생물학적 물질, 및/또는 인공 물질일 수 있다. 또한, 샘플은 천연 형태 또는 변성된 형태일 수 있다. 일부 경우, 샘플은 단일 세포(또는 단일 세포의 함량) 또는 다수의 세포(또는 다수의 세포의 함량), 혈액 샘플, 조직 샘플, 피부 샘플, 소변 샘플, 물 샘플, 및/또는 토양 샘플일 수 있다. 일부 경우, 샘플은 진핵생물, 원핵생물, 포유동물, 인간, 효모 및/또는 박테리아와 같은 살아있는 유기체로부터 유래될 수 있거나, 바이러스로부터 유래될 수 있다. 일부 경우, 샘플은 하나 이상의 줄기 세포(예를 들어, 무기한 분열하여 특화된 세포를 생성할 수 있는 임의의 세포)일 수 있다. 줄기 세포의 적절한 예는, 배아 줄기 세포(예를 들어, 인간 배아 줄기 세포(hES)), 및 비배아 줄기 세포(예를 들어, 간엽, 조혈, 유도 만능 줄기 세포(iPS 세포), 또는 성체 줄기 세포(MSC))를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 개시의 장치 및 방법은 일반적으로 그의 등전점(pI)에 따라 샘플에 함유된 관심 분석물의 분리 및 수집에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 다양한 관심 분석물이 순차적으로 분리되고 수집될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 단일 채널 자유 유동 전기영동 시스템은, 단백질 샘플이 pH 제어 완충액과 혼합되고, 유동 방향에 평행하지 않게 전기장이 인가되는 동안 채널 내로 연속적으로 유동될 수 있게 한다. 전기장은 하전된 분석물이 전기장의 방향으로 또는 전기장의 방향에 대향하는 방향으로 이동하게 하여, 하전된 분석물이 유체역학적 유동의 방향으로부터 멀리 이동하고, 일부 경우, 중앙 채널로부터 이동되어, 하전되지 않은/않거나 덜 하전된 분석물로부터 하전된 분석물을 분리시킨다. 일부 구현예에서, 전기장은 유체역학적 유동의 방향에 수직으로 배향되어 비-표적 분석물이 채널로부터 수직으로 이동하게 한다. 다른 구현예에서, 전기장은 유체역학적 유동의 방향에 평행하지 않은 임의의 적절한 배향을 가질 수 있어서, 적어도 전기장의 성분(예를 들어, 벡터 성분)이 하전된 분석물을 유체역학적 유동의 방향에 수직인 방향으로 이동하게 한다. 본원에 기술된 바와 같이, 특징부(예를 들어, 전기장 및 중앙 채널)는 실질적으로 수직일 때, "수직"이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 실질적으로 수직이라는 것은 서로 90 +/- 5도 미만으로 배향된 특징부를 지칭한다.
일부 구현예에서, 다공성 멤브레인은 채널의 적어도 일부를 형성하도록 구성된다. 따라서, (예를 들어, 평행하지 않은 전기장에 의해 유도된) 채널의 방향에 평행하지 않은 속도 벡터를 갖는 비-표적 분석물은 채널 및 샘플의 벌크 유체역학적 유동을 빠져나가고 다공성 멤브레인에 진입할 수 있다. 이러한 일부 구현예에서, 채널은 부분적으로, 다공성 멤브레인의 중앙 내의 중공형 공간에 의해 정의된다. 일부 구현예에서, 채널의 측벽은, 완충액 이온 및 단백질이 이동할 수 있는 다공성 멤브레인 물질에 의해 정의될 수 있다.
본 개시는, 배경 완충액 pH에 따라 양전하 또는 음전하를 갖는 pI를 갖는 단백질이 본원에 기술된 바와 같은 장치 또는 기구에 인가된 전기장에 의해 채널 밖으로 유도될 것이라는 것을 제공한다. 이러한 장치 또는 기구는 중성 분자(예를 들어, 배경 완충액의 pH와 일치하는 pI를 갖는 분석물)를 이의 하전된 상대로부터 단리할 수 있다. 이러한 중성 분자는 채널 내에 남아 채널의 말단에 위치한 수집 용기 내로 유동할 수 있다. 본 개시는, 배경 완충액(예를 들어, 샘플 완충액 및/또는 전해질 완충액)의 pH를 순차적으로 변화시킴으로써, 상이한 pI 값의 단백질이 한 번에 하나씩 수집될 수 있고, 그 결과 이들 전하에 따라 단백질이 분획될 수 있다는 것을 제공한다.
도 1a 및 도 1b는 일 구현예에 따른 단일 채널 자유 유동 전기영동 장치 또는 기구를 도시한다. 장치는, (1) 몸체(150)(즉, 상단 커버), (2) 다공성 멤브레인(160)(스페이서로도 지칭됨), 및 (3) 하단 커버(170)를 포함한다. 몸체는 전해질 완충액으로 채워지도록 구성된 서로 평행한 2개의 완충액 채널(140)을 정의한다. 통상적으로, 하나의 채널은 양극액을 보관하도록 구성되고, 다른 하나의 채널은 음극액을 보관하도록 구성된다. 몸체(150), 다공성 멤브레인(160), 및 하단 커버(170)는 집합적으로, 2개의 완충액 채널(140)에 대해 그리고 그 사이에 평행한 중앙 채널을 정의한다. 유입구(120)는 샘플(일반적으로 분석물의 혼합물을 함유함)이 중앙 채널로 진입할 수 있게 하고, 유출구(130)는 샘플의 분획이 장치의 반대측에서 수집될 수 있게 한다. 본원에서 기술되는 바와 같이, 채널(또는 다른 특징부)은 이들이 실질적으로 평행할 때에 다른 채널(또는 다른 특징부)에 "평행"한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 실질적으로 평행이라는 것은 30도 미만, 10도 미만, 또는 0도만큼 오프셋된 특징부를 지칭하며, 이들 사이의 모든 범위 및 하위범위를 포함한다.
몸체(150)는 일반적으로 플라스틱(예를 들어, 아크릴, 폴리카보네이트, 환형 올레핀 공중합체(COC), 시클로 올레핀 중합체(COP), 폴리에틸렌, 또는 폴리스티렌)과 같은 방수 및 비전도성 물질로 작제되나, 임의의 적절한 물질로 작제될 수 있다.
다공성 멤브레인(160)은 몸체(150)와 하단 커버(170) 사이에 배치되고, 몸체(150) 및 하단 커버(170)는 중앙 채널을 정의한다. 몸체(150)는 중앙 채널의 상단을 정의하며, 하단 커버(170)는 중앙 채널의 하단을 정의한다. 다공성 멤브레인(160)은, 다공성 멤브레인의 두께가 중앙 채널의 높이를 정의하도록, 몸체(150)와 하단 커버(170) 사이의 스페이서로서 작용한다. 도 1a 및 도 1b에 도시된 바와 같이, 다공성 멤브레인(160)으로부터의 중공형 공간 또는 절개부는 중앙 채널의 길이 및 폭을 정의한다.
다공성 멤브레인(160)은 (중앙 채널을 통해 흐를 때) 샘플 및 (완충액 채널(140)을 통해 흐를 때) 전해질 완충액에 의해 대향 측면들 상에서 습윤되도록 구성된다. 다공성 멤브레인(160)은 유체역학적 유동이 중앙 채널로부터 완충액 채널(140)로 진입하는 것을 방지하거나 방해하면서 샘플이 전해질 완충액에 전기적으로 및/또는 이온적으로 결합하도록 구성된다.
다공성 멤브레인(160)은 셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루오라이드 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF), 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE), 또는 임의의 다른 적절한 물질로 제조될 수 있다. 다공성 멤브레인(160)은 일반적으로 유체역학적 유체 유동을 방지하면서 이온 및/또는 분석물이 다공성 멤브레인(160) 내로 또는 이를 가로질러 이동할 수 있도록 구성된다. 본원에 개시된 바와 같은, "유체역학적 유동을 방지 또는 방해하는" 또는 "유체적으로 단리된/단리하는"은 중앙 채널을 통한 유동에 대해 부피 기준으로, 중앙 채널에 대해 적어도 95%, 적어도 99%, 적어도 99.9% 또는 적어도 100%만큼 부피 유량을 감소시키는 것을 지칭하며, 이들 사이의 모든 범위 및 하위범위를 포함한다.
구현예는 일반적으로 다공성 멤브레인(160)을 포함하는 것으로 기술되지만, 임의의 적절한 물체 또는 구조체가 중앙 채널과 양극액 완충액 채널 및/또는 음극액 완충액 채널 중 적어도 하나 사이에 배치될 수 있음을 이해해야 한다. 예를 들어, 유체역학적 장애물은 유체역학적 유동이 중앙 채널로부터 완충액 채널(140)로 진입하는 것을 방지하거나 방해하면서 샘플이 전해질 완충액에 전기적으로 및/또는 이온적으로 결합하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 전기영동에 적합한 겔 또는 다른 물질, 마이크로 채널 네트워크, 나노 채널 네트워크, 다공성 멤브레인(160), 및/또는 임의의 다른 적절한 구조체 또는 물질은 유체역학적 장애물로서의 역할을 할 수 있고, 중앙 채널과 양극액 완충액 채널 및 음극액 완충액 채널 중 적어도 하나 사이에 배치될 수 있다.
하단 커버(170)는 비다공성 물질로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 비다공성 물질은 유리일 수 있다. 일부 구현예에서, 비다공성 물질은 알루미늄일 수 있다. 일부 구현예에서, 비다공성 물질은 전기적으로 절연된다. 일부 구현예에서, 비다공성 물질은 비전도성이다. 일부 구현예에서, 하단 커버(170) 내로의 단백질 흡착을 방지하고, (필요 시) 전기적 단리를 제공할 수 있도록, PTFE, Teflon®, PVDF, 또는 임의의 다른 적절한 절연성 및/또는 소수성 물질로 만들어진 박막이 하단 커버(170)에 도포될 수 있다. 일부 구현예에서, 절연성 물질의 박막은 전기삼투압 유동을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 절연성 물질의 박막은 하단 커버(170)의 제타 전위의 크기를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 절연성 및/또는 소수성 물질의 박막은 단백질 또는 다른 분석물이 하단 커버(170)에 부착하는 것을 감소시키거나 방지할 수 있다. 일부 구현예에서, 절연성 물질의 박막은 하단 커버(170)와 다공성 멤브레인(160) 사이에 위치될 수 있다. 일부 구현예에서, 절연 물질로 만들어진 박막은 몸체(150)의 하단과 다공성 멤브레인(160) 사이에 위치될 수 있다. 일부 구현예에서, 절연 물질로 만들어진 박막은, 약 50 μm, 약 55 μm, 약 60 μm, 약 65 μm, 약 70 μm, 약 75 μm, 약 80 μm, 약 85 μm의 두께를 가지며, 이들 사이의 모든 범위 및 하위범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 조립된 장치의 하단 커버(170)는 냉각된 냉각제의 재순환에 의해 온도 조절되는 열전 냉각기 또는 냉각 블록의 상단에 배치될 수 있다.
음극액 완충액 채널은 음극에 결합되도록 구성되고, 양극액 완충액 채널은 양극에 결합되도록 구성된다. 일부 구현예에서, 장치 또는 기구는 양극 및 음극을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전극(즉, 음극 및/또는 양극)은 백금으로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 전극은 구리로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 전극은 흑연으로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 전극은 티타늄으로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 전극은 황동으로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 전극은 은으로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 전극은 탄소 섬유 물질로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 전극은 금으로 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 전극은 스테인리스 스틸 또는 전기영동 방법에 적합한 임의의 물질로 제조될 수 있다.
도 1a 및 도 1b에 도시된 바와 같이, 전해질 완충액은 포트(110)를 통해 양극액 완충액 채널 및/또는 음극액 완충액 채널에 유체적으로 결합되는 전해질 완충액 탱크 내에 저장될 수 있다. 다른 구현예에서, 완충액 채널(140) 자체는 완충액 저장조일 수 있다. 완충액 저장조는, 10 mL 내지 1000 mL, 20 mL 내지 900 mL, 30 mL 내지 800 mL, 40 mL 내지 700 mL, 50 mL 내지 600 mL, 60 mL 내지 500 mL, 70 mL 내지 400 mL, 80 mL 내지 300 mL, 90 mL 내지 200 mL, 100 mL 내지 150 mL, 100 mL 내지 500 mL, 100 mL 내지 400 mL, 100 mL 내지 300 mL, 100 mL 내지 200 mL의 부피를 가질 수 있으며, 이들 사이의 모든 범위 및 하위범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액 저장조는, 100 mL 내지 500 mL, 100 mL 내지 400 mL, 100 mL 내지 300 mL, 100 mL 및 200 mL의 부피를 가질 수 있으며, 이들 사이의 모든 범위 및 하위범위를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 완충액 저장조는 100 mL 내지 500 mL의 부피를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 완충액(즉, 양극액 및 음극액) 채널(140)은 중앙 채널과 평행하게 몸체의 어느 한 측면에 위치될 수 있다. 샘플 분리를 위해 단일 채널(예를 들어, 단일 "중앙" 채널)을 갖는 구현예는, 이러한 설계를 사용하여, 샘플 분리를 위해 다수의 채널을 갖는 설계에 비해 시약 또는 완충액 소비가 낮은 경향이 있으며, 이는 공지된 장치와 비교하여 원하는 관심 분석물을 분리 및 수집하기 위한 전체 비용을 감소시킬 수 있다는 점에서 유리할 수 있다. 그러나, 샘플 분리를 위해 다수의 채널을 갖는 다른 설계가 가능할 수 있음을 이해해야 한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 장치 또는 기구는 단 하나의 유입구(120) 및 단 하나의 유출구(130)만을 포함할 수 있다. 단일 유입구(120) 및 단일 유출구(130)는, 일부 구현예에서, 다수의 유입구 및/또는 유출구가 사용될 때 발생할 수 있는 불균형한 유동이 갖는 잠재적 어려움을 회피하기 때문에 바람직할 수 있다. 그러나, 다른 구현예에서, 예를 들어 처리량을 증가시키기 위해 다수의 유입구 및/또는 유출구가 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 본원에 기술된 바와 같은 장치 또는 기구의 또 다른 장점은 채널 내부에 포획될 수 있는 기포 형성의 감소일 것이다. 본 장치 또는 기구에 포함된 유입구(120), 유출구(130), 및/또는 채널의 크기는 좁을 수 있으며, 이는 미세 유체 장치와 유사하게 액체 충진을 용이하게 하고 난류를 방지한다. 일부 구현예에서, 유입구(120) 및 유출구(130)는 완충액 채널(140) 및 중앙 채널에 수직으로 배향될 수 있다.
다공성 멤브레인(160)은 이온 및 분석물의 전기 동역학(및/또는 전기영동) 수송을 허용하면서 유체역학적 유동을 방지하거나 실질적으로 방해할 수 있다. 분석물의 전기 동역학 수송이 다공성 멤브레인(160)을 통과할 수 있게 하면서 유체역학적 유동을 방지하거나 실질적으로 방해함으로써, 본 장치 또는 기구는 중앙 채널로부터 유출구(130)로 유체역학적으로 수송되는 표적 분석물(즉, 관심 분석물)만을 실질적으로 허용하도록 구성된다.
예를 들어, 배경 pH 값(예를 들어, 중앙 채널 및/또는 완충액 채널(140)의 pH)이 6.0으로 설정될 경우, 6.0의 pI 값을 갖는 분석물은 중앙 채널을 통해 유출구(130)로 유체역학적으로 자유롭게 수송되는 반면, 6.0 이외의 pI 값을 갖는 분석물은 유체역학적 유동에 평행하지 않은 방향으로, 다공성 멤브레인(160) 내로 또는 이를 향해 이동한다. 다공성 멤브레인(160) 내로 이동하는 분석물은 유체역학적 유동을 빠져나가고, 유체역학적 유동과 함께 유출구(130)를 향해 이동하지 않는다. 따라서, 다공성 멤브레인(160)은 비표적 분석물을 걸러내도록 작동가능하다.
일부 구현예에서, 중앙 채널은, 약 1 mm 내지 약 10 mm, 약 1 mm 내지 약 9 mm, 약 1 mm 내지 약 8 mm, 약 1 mm 내지 약 7 mm, 약 1 mm 내지 약 6 mm, 약 1 mm 내지 약 5 mm, 약 1 mm 내지 약 4 mm, 약 1 mm 내지 약 3 mm의 폭을 가질 수 있으며, 이들 사이의 모든 범위 및 하위범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 중앙 채널은, 약 1 cm 내지 30 cm, 5 cm 내지 25 cm, 10 cm 내지 30 cm, 10 cm 내지 약 20 cm, 약 10 cm 내지 약 19 cm, 약 10 cm 내지 약 18 cm, 약 10 cm 내지 약 17 cm, 약 10 cm 내지 약 16 cm, 약 10 cm 내지 약 15 cm의 길이를 가질 수 있으며, 이들 사이의 모든 범위 및 하위범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 중앙 채널은 약 10 cm 내지 약 20 cm의 길이를 갖는다.
일부 구현예에서, 다공성 멤브레인(160)의 기공 크기는, 약 25 nm 내지 약 800 nm, 약 30 nm 내지 약 700 nm, 약 40 nm 내지 약 600 nm, 약 50 nm 내지 약 500 nm, 약 60 nm 내지 약 400 nm, 약 70 nm 내지 약 300 nm, 약 80 nm 내지 약 200 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 35 nm 내지 약 750 nm, 약 45 nm 내지 약 650 nm, 약 55 nm 내지 약 550 nm, 약 65 nm 내지 약 450 nm의 범위일 수 있으며. 이들 사이의 모든 범위 및 하위범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 다공성 멤브레인(160)의 기공 크기는, 본원에 개시된 장치 또는 기구와 호환될 수 있는 한, 또는 적어도 표적 분석물의 투과를 허용하는 한, 임의의 적절한 크기일 수 있다. 일부 구현예에서, 다공성 멤브레인(160)의 두께는, 약 100 μm 내지 약 200 μm, 약 110 μm 내지 약 190 μm, 약 120 μm 내지 약 180 μm, 약 130 μm 내지 약 170 μm, 약 140 μm 내지 약 150 μm의 범위일 수 있으며, 이들 사이의 모든 범위 및 하위범위를 포함한다. 일부 구현예에서, 다공성 멤브레인(160)의 두께는, 약 100 μm 내지 약 200 μm, 약 90 nm 내지 약 600 μm, 100 nm 내지 500 μm, 200 nm 내지 400 μm, 300 nm 내지 300 μm, 400 nm 내지 200 μm, 500 nm 내지 100 μm, 600 nm 내지 90 μm, 700 nm 내지 80 μm, 800 nm 내지 70 μm, 900 nm 내지 60 μm, 1 μm 내지 50 μm, 10 μm 내지 40 μm, 20 μm 내지 30 μm의 범위이며, 이들 사이의 모든 범위 및 하위범위를 포함한다.
도 7은 일 구현예에 따른 단일 채널 자유 유동 전기영동 장치 또는 기구를 도시하며, 이는 다음을 포함한다: (1) 유리, 또는 임의의 다른 적절한 물질로 제조될 수 있는 상부 커버(750), (2) 플라스틱 또는 임의의 다른 적절한 물질로 제조될 수 있는 하단 커버(770), (3) 상단 커버와 하단 커버 사이에 위치하는 스페이서(764), (4) 2개의 평행한 멤브레인(762 및 764), (5) 상단 커버(750)의 상단 상에 위치하는 유입구(720), (6) 하단 커버(770)의 하단에 위치되는 유출구(730), (7) 양극액 완충액 탱크(742), 및 (8) 음극액 완충액 탱크(744). 양극액 완충액 탱크(742) 및 음극액 완충액 탱크(744)는 전압이 양극액 완충액 탱크(742) 및 음극액 완충액 탱크(744) 내의 완충액에 인가될 수 있도록 하는 평행한 전극으로서 기능할 수 있다. 도 7의 구현예는, 중앙 채널을 2개의 전해질 완충액 채널(140) 모두에 전기적으로 및/또는 이온적으로 결합시키는 단일 다공성 멤브레인(160)을 갖는 것 보다는, 도 7의 구현예는 2개의 다공성 멤브레인(762 및 764)를 가지며, 하나는 중앙 채널을 완충액 탱크(742)에 전기적으로 및/또는 이온적으로 결합시키고, 다른 하나는 중앙 채널을 음극액 완충액 탱크(744)에 전기적으로 및/또는 이온적으로 결합시킨다는 점에서, 도 1의 구현예와 주로 상이하다. 도 7의 다양한 구성 요소는 도 1의 구성 요소에 대해 구조 및/또는 기능에 있어서 유사할 수 있다. 또한, 도 7의 장치의 전반적인 기능은 도 1의 전반적인 기능과 유사하다.
2개의 다공성 멤브레인(762 및 764)은 중앙 채널의 측면을 정의하도록 위치된다. 중앙 채널의 상단 및 하단은 상단 커버(750) 및 하단 커버(770)에 의해 각각 정의된다. 스페이서(765)는 중앙 채널의 높이를 정의한다. 2개의 다공성 멤브레인(762 및 764)은 각각 중앙 채널을 통해 유동하는 샘플에 의해 하나의 측면에서 습윤되고 완충액에 의해 다른 측면(예를 들어, 완충액 탱크(742 및 744)에서 습윤되도록 구성될 수 있다. 다공성 멤브레인(760)은 유체역학적 유동을 방지하면서 완충액 이온 및/또는 단백질이 멤브레인 내로/이를 통해 이동할 수 있도록 구성될 수 있다. 본원에서 더 상세히 논의되는 바와 같이, 관심 분석물(들)은 중앙 채널로부터 다공성 멤브레인(760) 내로/이를 통해 이동할 수 있는 비-표적 분석물로부터 분리될 수 있고, 그런 다음 분획된 표적 분석물(들)이 유출구(730)에서 수집될 수 있다.
도 2a는, 유입구(220)가 샘플로 하여금 단일 중앙 채널에 진입할 수 있게 하고, 유출구(230)가 샘플의 분획으로 하여금 장치의 대향 측면에서 수집될 수 있게 하는 구현예에 따른, 단일 채널 자유 유동 전기영동 장치를 위한 단일 루프 전해질 완충액 재순환 방식을 도시한다. 도 2b는, 유입구(220')가 샘플로 하여금 단일 중앙 채널에 진입할 수 있게 하고, 유출구(230')가 샘플의 분획으로 하여금 장치(200')의 대향 측면에서 수집될 수 있게 하는 구현예에 따른, 단일 채널 자유 유동 전기영동 장치를 위한 이중 루프 전해질 완충액 재순환 방식을 도시한다. 일부 구현예에서, 음극액 완충액 채널(244) 또는 양극액 완충액 채널(242) 중 적어도 하나는 전해질 완충액을 보관하는 저장조(290)에 유체적으로 연결된다. 도 2a 및 도 2b에 도시된 개략적인 예시는 도 1 및/또는 도 7의 장치와 같은 임의의 적절한 장치를 사용하여 구현될 수 있다.
일부 경우, 샘플이 유입구(220)를 통해 중앙 채널 내로 도입되기 전에, (예를 들어, 하단 플레이트에 결합된) 냉각기 또는 냉각 블록의 온도는, 5°C 내지 15°C까지 조정될 수 있으며, 이들 사이의 모든 범위 및 하위범위를 포함한다. 일단 온도가 안정화되면, 100 ml 내지 500 mL의 부피, 또는 본원에 개시된 바와 같은 다른 적절한 부피로 완충액 저장조에 저장될 수 있는 전해질 완충액은, 연동 펌프 또는 다른 적절한 펌프를 갖는 장치(280)의 완충액 채널을 통해 재순환될 수 있다. 각각의 완충액 채널을 통한 전해질 완충액의 재순환은 도 2a에 도시된 바와 같이, 단일 유체 루프로 달성될 수 있다. 예를 들어, 펌프(280)는 전해질 완충액을 완충액 저장조(290)로부터 하나의 완충액 채널을 따라 수송하고, 다른 완충액 채널을 통해 반대로 수송할 수 있다.
다른 경우, 전해질 완충액은 도 2b에 도시된 바와 같이, 2개의 유체 루프를 사용하여 2개의 완충액 채널을 통해 재순환될 수 있다. 예를 들어, 펌프(280')는, 전해질 완충액을 완충액 저장조(290')로부터 양극액 완충액 채널(242')과 음극액 완충액 채널(244') 각각의 일 단부 내로 수송하고, 양극액 완충액 채널과 음극액 완충액 채널의 대향 단부에 의해 (예를 들어, 다시 완충액 저장조 내로) 빠져나갈 수 있다.
또 다른 경우(도 2a 또는 도 2b에 도시되지 않음), 전해질 완충액은 완전히 분리된 루프를 통해, 완충액 채널을 통해 순환될 수 있다. 예를 들어, 펌프는 양극액 완충액 전용 저장조로부터 양극액 완충액 채널을 통해 양극액 완충액을 수송할 수 있고, 또 다른 별도의 펌프는 음극액 완충액 저장조로부터 음극액 완충액 채널을 통해 음극액 완충액을 수송할 수 있다.
전해질 완충액(예를 들어, 완충액 저장조(들)에 보관된 완충액)은 일반적으로 전해질 및 중합체를 함유한다. 일부 구현예에서, 전해질 완충액은 MES 완충액일 수 있다. 일부 구현예에서, 전해질 완충액은 BisTris 완충액일 수 있다. 일부 구현예에서, 전해질 완충액은 Tris/보레이트/EDTA, Tris/아세테이트/EDTA 등과 같은 전기영동 방법에 적합한 임의의 완충액을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 전해질 완충액은 메틸 셀룰로오스를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 저장조는, 0.01% 내지 1%, 0.05% 내지 1%, 0.5% 내지 1%, 0.1% 및 0.5%, 0.1% 내지 0.4%, 0.1% 내지 0.3%, 0.1% 내지 0.2%의 메틸 셀룰로오스(이들 사이의 모든 범위 및 하위범위를 포함함)를 갖는 전해질 완충액을 보관할 수 있다.
일부 구현예에서, 음극액 및 양극액은 완충액 탱크 또는 저장조에서 재혼합되어, 사용 중 및 완충액의 용량을 보존하는 동안 일정한 pH를 유지한다. 재순환을 위한 채널의 전기 저항은 중앙 채널 및 다공성 멤브레인(들)에 걸친 장치의 저항에 비해 적어도 50배, 40배, 30배, 20배, 10배(이들 사이의 모든 범위 및 하위범위를 포함함) 더 높을 수 있다. 이는 도 2a에 도시된 바와 같이 재순환 저장조를 통해 또는 채널 루프를 통해 "단락"을 효과적으로 방지한다.
일부 구현예에서, 샘플 완충액은 관심 분석물을 함유하는 샘플을 제조하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 전해질 완충액은 샘플 완충액과 동일한 일치하는 pH를 갖기 때문에, 샘플은 전기-삼투압 유동의 존재 시 일정한 pH로 유지될 수 있다. 전기-삼투압 유동을 느리게 하고 분획 공정의 보다 효과적인 제어를 허용하기 위해, 0.1% 내지 0.5% 농도의 메틸 셀룰로오스와 같은 중합체가 전해질 완충액에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 소정의 샘플 완충액으로 완충 교환될 수 있고, 장치에 진입하기 전 실시간으로 pH 조절 완충액에서 추가로 희석될 수 있다.
본 개시는 단일 채널 자유 유동 전기영동을 사용하여 분석물의 pI 값에 따라 샘플로부터 관심 분석물을 분리하는 방법을 제공한다. 도 6은 일 구현예에 따른, 관심 분석물을 분리하는 방법의 흐름도이다. 단계(610)에서, 샘플 완충액은 분석물의 혼합물과 조합되어 샘플을 형성할 수 있다. 단계(620)에서, 샘플은 유입구를 통해 단일 채널 자유 유동 전기영동 장치의 중앙 채널 내로 도입되고 이를 통해 유동할 수 있다. 샘플이 중앙 채널의 유입구로부터 중앙 채널의 유출구까지 유체역학적으로 유동하도록, 샘플은 중앙 채널을 통해 펌핑될 수 있다. 단계(625)에서, 완충액 펌프는, 중앙 채널의 어느 한 측면에 평행하게 이어지고 그 측면 상에 배치되는 전해질 채널을 통해, 완충액 저장조로부터 전해질 완충액을 재순환시킬 수 있다. 단계(640)에서, 전기장이 중앙 채널 및 샘플의 유동 방향에 수직으로 인가되도록, 전해질 채널에 결합된 전극에 전력이 공급될 수 있다. 일부 구현예에서, 양극액 채널, 중앙 채널, 및 음극액 채널은 다공성 멤브레인을 통해 전기적으로 및/또는 이온적으로 결합될 수 있으나, 유체적으로는 단리될 수 있다.
단계(640)에서, 중앙 채널에 수직인 전기장을 인가함으로써, 관심 분석물의 값 pI 값 이외의 값을 갖는 분석물은 중앙 채널의 방향으로부터 다공성 멤브레인(들)을 향해, 그 내부로, 및/또는 그를 가로질러 이동할 것이다. 중앙 채널을 통한 샘플의 유속 및/또는 전기장의 강도는 중앙 채널의 출구를 빠져나가는 분획된 샘플의 순도를 제어할 수 있다. 단계(630)에서, 관심 분석물은, 완충액(들)의 pH 값과 상이한 pI 값을 갖는 분석물이 다공성 멤브레인(들) 내로/그를 가로질러 선택적으로 거부되도록, 전해질 완충액 및/또는 샘플 완충액의 pH를 제어함으로써 선택적으로 단리될 수 있다. 그러나, 중앙 채널에 평행하지 않은 임의의 전기장은 중앙 채널에 수직인 벡터 성분을 가지게 되어, 관심 분석물의 pI 값 이외의 값을 갖는 분석물은 유체역학적 유동의 방향에 대해 평행하지 않는 방향으로 이동하고, 다공성 멤브레인(들)을 향해, 그 내로/또는 그를 가로질러 이동하게 된다는 것을 이해해야 한다.
단계(650)에서, 단계(630)에서의 전해질 완충액 및/또는 샘플 완충액의 pH를 조절하는 단계에 의해, 다수의 관심 분석물 및/또는 다수의 정제된 샘플의 분획을 수집할 수 있다. 일부 경우, 샘플은 다수의 분취물로 분할될 수 있고, 각각은 상이한 pH를 갖는 샘플 완충액과 혼합된다. 각 분취물에 대한 실행 후, 전해질 완충액의 pH를 다음 분취물의 pH와 일치하도록 조정할 수 있다. 블랭크액이 분취물 사이에서 실행될 수 있다. 다른 경우, 샘플은 연속적으로 실행될 수 있고, 샘플의 각 분획의 충분한 부피가 수집될 경우, 샘플 완충액 및/또는 전해질 완충액은 실행 동안 (예를 들어, 계량된 펌프 또는 밸브로) 조정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 샘플 내의 분석물의 혼합물은 1 내지 11, 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3 사이의(이들 사이의 모든 범위 및 하위범위를 포함함) 상이한 등전력을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 저장조는 0.1 내지 14, 0.5 내지 13, 1 내지 14, 2 내지 13, 3 내지 12, 4 내지 11, 5 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 8 사이의(이들 사이의 모든 범위 및 하위범위를 포함함) pH 값을 갖는 전해질 완충액을 보관할 수 있다. 일부 구현예에서, 전해질 완충액의 pH 값은 MES와 BisTris의 비율을 조정시킴으로써 순차적으로 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 전해질 완충액의 pH 값은 전해질 완충액의 온도를 변화시킴으로써 순차적으로 조정될 수 있다. 임의의 하나의 이론에 구속되지 않고, 완충액의 pKa 값은 온도 변화에 반응하여 변화하여 pH 값을 변화시킬 것이다.
실시예로서, 전해질 완충액 및 샘플 완충액의 pH 값은, pH 3.5에 상응하는 pI 값을 갖는 샘플의 충분한 분획(예를 들어, 관심 분석물)이 수집될 때, pH 3.5에서 pH 5.5까지 증가될 수 있다. 다른 실시예에서, 전해질 완충액 및 샘플 완충액의 pH 값은, pH 6.0에 상응하는 pI 값을 갖는 샘플의 충분한 분획(예를 들어, 관심 분석물)이 수집될 때, pH 6.0에서 pH 7.5까지 증가될 수 있다. 다른 실시예에서, 전해질 완충액 및 샘플 완충액의 pH 값은, pH 11.0에 상응하는 pI 값을 갖는 샘플의 충분한 분획(예를 들어, 관심 분석물)이 수집될 때, pH 11.0에서 pH 10.5까지 감소될 수 있다. 본 개시의 다른 양태에서, 전해질 완충액의 pH 값은 샘플로부터 분획화된 관심 분석물을 수집하기 위해 수정될 필요가 없다. 예를 들어, 샘플로부터 분획화된 관심 분석물의 수집은 제어된 방식으로 중앙 채널에 압력 또는 진공을 인가하고 원치 않는 pI 단편(즉, 관심 pI 값을 갖지 않는 단편)을 채널 밖으로 밀어내, 표적 단편을 수집 용기 내로 안내함으로써 달성될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 샘플로부터 분획화된 관심 분석물의 수집은 유체역학적 장애물을 통한 전기삼투압 흐름을 인가하여 원치 않는 pI 단편(즉, 관심 pI 값을 갖지 않는 단편)을 채널 밖으로 밀어내, 표적 단편을 수집 용기 내로 안내함으로써 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 분획화된 관심 분석물은 장치 또는 기구의 유출구를 통해 단일 채널 전기영동 장치를 빠져나간다. 일부 구현예에서, 샘플은 단계(650)에서, 장치의 유출구로부터 수집될 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 장치의 유출구로부터 연속적으로 수집될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 장치 또는 기구는 연속 분리 및 수집의 특징을 유지할 수 있으며, 이는 관심 분석물을 함유하는 샘플의 분획의 처리량에 대해 탁월한 유연성을 부여한다. 일부 구현예에서, 샘플의 분획은, 분당 1 μL 내지 분당 50 μL, 분당 5 μL 내지 분당 15 μL, 분당 2 μL 내지 분당 40 μL, 분당 3 μL 내지 분당 30 μL, 분당 15 μL 내지 분당 45 μL의 속도로(이들 사이의 모든 범위 및 하위범위를 포함함) 장치의 유출구로부터 수집될 수 있다.
도 6에 도시되지 않았지만, 일부 구현예에서, 블랭크 샘플은 샘플을 도입하고 새롭게 조정된 pH와 동일한 pI를 갖는 단백질에 상응하는 후속 샘플(예를 들어, 관심 분석물)을 수집하는 단계 이전에 실행될 수 있다. 이 공정은 수집물의 정확성을 보장하기 위해 임의의 수의 pH 값에 대해 반복될 수 있다. 단계(630)에서의 완충액 pH 조정은 계량된 펌프 또는 계량된 밸브로 자동으로 수행될 수 있다.
도 6에 도시되지 않았지만, 일부 구현예에서, 전기영동의 시작 전, 장치는 25% 에탄올 용액을 중앙 채널 내로 유동시킴으로써 먼저 사전 습윤될 수 있다. 일부 구현예에서, 장치는 임의의 적절한 농도를 갖는 에탄올 용액을 중앙 채널 내로 유동시킴으로써 사전 습윤된다. 일부 구현예에서, 장치는 0.1% Tween 20 용액을 중앙 채널 내로 유동시킴으로써 사전 습윤된다. 일부 구현예에서, 장치는 임의의 적절한 농도를 갖는 Tween 20 용액을 중앙 채널 내로 유동시킴으로써 사전 습윤된다. 에탄올 용액 또는 Tween 20 용액을 중앙 채널 또는 멤브레인 내로 유동시키는 것은 채널 내의 기포 형성을 최소화할 수 있다. 일부 구현예에서, 5분 내지 10분 동안의 에탄올 용액 또는 Tween 20 용액의 인큐베이션은 멤브레인(들)이 완전한 습윤을 보장할 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플의 분획은, 분당 1 μL 내지 분당 50 μL, 분당 5 μL 내지 분당 15 μL, 분당 2 μL 내지 분당 40 μL, 분당 3 μL 내지 분당 30 μL, 분당 15 μL 내지 분당 45 μL의 속도에서(이들 사이의 모든 범위 및 하위범위를 포함함) 수집된 관심 분석물을 함유할 수 있다.
실시예로서, 도 3a 내지 도 3c는 ProteinSimple®으로부터 상업적으로 이용 가능한 Maurice® IEF(즉, 등전점 포커싱 시스템 또는 기술)에 의해 측정했을 때, MES-BisTris 완충액을 사용함으로써 3.4 내지 10.1 범위의 pI 값을 갖는 펩티드의 혼합물을 분획화하는 것을 나타낸다. 일부 구현예에서, pH 값은 MES 대 BisTris의 비율을 조정함으로써 변경될 수 있다. 샘플은 pI 값이 3.4, 5.85, 6.15, 9.9 및 10.1인 5개의 펩티드의 혼합물이다. 완충액 pH를 5.8에서 6.7로 순차적으로 변화시킴으로써, pI 값의 이 범위 내에 있지 않은 pI 값을 갖는 펩티드(예를 들어, 3.4, 9.9, 및 10.1의 pI 값)는 분획화 후에 거의 검출할 수 없었다. 5.85 및 6.15의 pI 값에서 펩티드의 상대량은 완충액 pH가 5.8에서 6.7로 증가할 때 변화한다. 도 3c는, pH 6.7에서, 5.85의 pI 값을 갖는 펩티드가 검출 불가능해지고 6.15의 pI 값을 갖는 단일 펩티드만이 수집될 수 있음을 나타낸다.
다른 실시예로서, 도 4b는, MES-BisTris 완충액을 사용하는 본원에 기술된 바와 같은 장치 또는 기구의 사용에 의한 5.6 내지 5.9 범위의 pI 값을 갖는 IgG의 분획화을 나타낸다. 일부 구현예에서, pH 값은 MES 대 BisTris의 비율을 조정함으로써 변경될 수 있다. 샘플은 5.65, 5.72, 5.8, 및 5.9의 pI 값을 갖는 이러한 IgG의 4개의 단편의 혼합물이다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, 완충액 pH가 6.3일 때, 5.65의 pI 값의 단편은 분획화 후 검출할 수 없는 반면, pI 값이 더 높은 단편은 이들의 상대적 존재비를 증가시킨다. 도 4b는, 완충액 pH가 6.5까지 증가함에 따라, pI 5.65 및 5.72의 두 단편 모두가 분획화 공정 후에 검출되지 않는 반면, 5.9의 pI 값의 단편의 상대량은 3.5%에서 약 50%로 증가함을 나타낸다.
도 5는 본원에 기술된 바와 같은 장치 또는 기구의 사용에 의한 염기성 단백질의 분획화의 예를 도시한다. 실시예로서, 8.62, 8.73, 8.85, 및 8.95의 pI 값을 갖는 4개의 주요 단편을 갖는 헤르셉틴 단클론 항체는 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(AMPD)을 완충액으로 사용하여 분획화될 수 있다. 일부 구현예에서, 헤르셉틴 단클론 항체의 분획화는 임의의 다른 적절한 완충액을 사용하여 처리될 수 있다. 임의의 하나의 이론에 구속되지 않고, AMPD는 7.8 내지 9.7의 유효 pH 범위를 갖는다. 8.8의 완충액 pH에서, pI 8.63에서의 비교적 작은 피크가 가장 큰 양의 피크가 될 수 있으며, 이는 이 피크에 대한 총 피크 면적의 백분율이 약 13.4%에서 약 83.5%로 증가한 것을 나타낸다.
도 5는 또한, 완충액 pH가 9.0까지 증가될 때, 8.73의 pI 값의 제2 피크는 34.9%에서 83.7%로 농축될 수 있는 반면, 다른 피크의 양은 상당히 감소될 수 있음을 나타낸다. pH 9.2에서, 분획화 전의 주요 피크인 제3 피크는 36.1%에서 68.3%로 농축될 수 있는 반면, 8.63의 pI 값의 제1 피크는 더 이상 검출되지 않는다. pH 9.4에서, 8.95의 pI 단편은, 분획화 공정 전의 14.7%와 비교하여 70.2%이다. pH 9.4에서, 8.63 및 8.73의 pI 값을 갖는 단편은 검출되지 않는다. 수집된 단편의 pI 값과 완충액의 pH 값 간의 약간의 불일치가 관찰되었는데, 이는 EOF의 존재로 인한 것일 수 있다(EOF가 분획화된 관심 분석물의 수집을 왜곡할 수 있기 때문임). 또 다른 타당한 설명은 pH 완충액으로 인한 측정 오차이다.
전술한 장치 및/또는 방법이 특정 순서로 발생하는 특정 이벤트 및/또는 절차를 나타내는 경우, 특정 이벤트 및/또는 절차의 순서는 변경될 수 있다. 또한, 특정 이벤트 및/또는 절차는 가능한 경우 병렬 공정에서 동시에 수행될 수 있을 뿐만 아니라, 전술한 바와 같이 순차적으로 수행될 수 있다.

Claims (42)

  1. 장치로서,
    분석물의 혼합물을 함유하는 샘플을 수용하도록 구성된 유입구,
    상기 샘플의 분획된 부분을 방출하도록 구성된 유출구,
    음극에 결합되도록 구성된 음극액 채널, 및
    양극에 결합되도록 구성된 양극액 채널을 정의하는 몸체;
    커버; 및
    상기 커버와 상기 몸체 사이에 배치된 유체역학적 장애물을 포함하되, 상기 유체역학적 장애물, 및 상기 몸체는 상기 음극액 채널과 상기 양극액 채널에 평행한 상기 유입구와 상기 유출구 사이에 중앙 채널을 형성하도록 집합적으로 구성되는, 장치.
  2. 장치로서,
    제1 전해질 완충액을 보관하도록 구성되고 음극에 결합되는 음극액 채널;
    제2 전해질 완충액을 보관하도록 구성되고 양극에 결합되는 양극액 채널;
    유입구 및 유출구를 갖는 중앙 채널로서, 상기 중앙 채널은 샘플이 상기 유출구를 향한 유동 방향으로 유체역학적으로 유동하고 샘플의 적어도 일부는 상기 유출구를 통해 배출되도록, 상기 유입구를 통해 분석물의 혼합물을 포함하는 샘플을 수용하도록 구성되며, 상기 중앙 채널은 상기 음극액 채널과 상기 양극액 채널 사이에 평행하게 위치하는, 중앙 채널; 및
    상기 중앙 채널 및 상기 제1 전해질 완충액 또는 상기 제2 전해질 완충액 중 적어도 하나와 직접적으로 유체 접촉하도록 구성된 유체역학적 장애물을 추가로 포함하되, 에너지가 공급될 때, 상기 분석물의 혼합물로부터의 적어도 하나의 분석물은 상기 유동 방향에 수직인 방향으로 상기 음극액 채널 또는 상기 양극액 채널 중 하나를 향해서 이동하는, 장치.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중앙 채널은, 부분적으로, 유체역학적 장애물의 중앙에 있는 중공형 공간에 의해 정의되는, 장치.
  4. 제2항의 장치로서, 유체역학적 장애물은 중앙 채널 및 제1 전해질 완충액과 직접적으로 유체 접촉하도록 구성되는 제1 유체역학적 장애물이고,
    중앙 채널 및 제2 전해질 완충액과 직접 유체 접촉하도록 구성되는 제2 유체역학적 장애물을 추가로 포함하는, 장치.
  5. 제2항 또는 제4항에 있어서, 제1 전해질 완충액 및 제2 전해질 완충액은 공통 전해질 완충액인, 장치.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 음극액 채널 또는 양극액 채널 중 적어도 하나는 전해질 완충액을 보관하는 저장조에 유체 연결되는, 장치.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 음극액 채널 또는 양극액 채널 중 적어도 하나에 유체 연결되는, 100 mL 내지 500 mL 사이의 부피를 갖는 저장조를 추가로 포함하는, 장치.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    음극액 채널 또는 양극액 채널 중 적어도 하나에 유체 연결된 저장조; 및
    음극액 채널 또는 양극액 채널 중 적어도 하나를 통해 상기 저장조로부터 전해질 완충액을 재순환시키도록 구성된 펌프를 추가로 포함하는, 장치.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    전해질 완충액을 보관하도록 구성되고, 양극액 채널 및 음극액 채널에 유체 결합되는 저장조; 및
    단일 루프에서 양극액 채널 및 음극액 채널을 통해 상기 저장조로부터 전해질 완충액을 재순환시키도록 구성된 펌프를 추가로 포함하는, 장치.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    전해질 완충액을 보관하도록 구성되고, 양극액 채널 및 음극액 채널에 유체 결합되는 저장조; 및
    2개의 루프에서, 개별적으로 양극액 채널 및 음극액 채널을 통해 상기 저장조로부터 전해질 완충액을 재순환시키도록 구성된 펌프를 추가로 포함하는, 장치.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    양극; 및
    음극을 추가로 포함하는, 장치.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 음극액 채널 또는 양극액 채널 중 적어도 하나에 유체 연결되는, MES-BisTris를 보관하는 저장조를 추가로 포함하는, 장치.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 음극액 채널 또는 양극액 채널 중 적어도 하나에 유체 연결되는, 전해질 완충액 및 중합체를 보관하는 저장조를 추가로 포함하는, 장치.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 음극액 채널 또는 양극액 채널, 전해질 완충액 및 메틸 셀룰로오스를 보관하는 저장조 중 적어도 하나에 유체 연결되는 저장조를 추가로 포함하는, 장치.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 음극액 채널 또는 양극액 채널, 0.1% 내지 0.5%의 메틸 셀룰로오스를 갖는 전해질 완충액을 보관하는 저장조 중 적어도 하나에 유체 연결되는 저장조를 추가로 포함하는, 장치.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 양극액 채널 및 음극액 채널은 중앙 채널을 가로질러 그리고 이에 대해 수직으로 전기장을 인가하도록 집합적으로 구성되는, 장치.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분석물의 혼합물은 1 내지 11 사이의 상이한 등전성을 갖는 펩티드를 포함하는, 장치.
  18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 음극액 채널 또는 양극액 채널, 0.1 내지 14 사이의 pH 값을 갖는 전해질 완충액을 보관하는 저장조 중 적어도 하나에 유체 연결되는 저장조를 추가로 포함하는, 장치.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 샘플은 샘플 완충액을 함유하되, 장치는 음극액 채널 또는 양극액 채널 중 적어도 하나에 유체 결합된 저장조를 추가로 포함하며, 여기에서 저장조는 전해질 완충액을 함유하되, 상기 전해질 완충액은 상기 샘플 완충액의 pH와 일치하는 pH를 갖는, 장치.
  20. 제1항에 있어서, 몸체는 플라스틱인, 장치.
  21. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유체역학적 장애물은 셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리비닐리덴 디플루오라이드, 또는 폴리테트라플루오로에틸렌 중 적어도 하나로 작제되는, 장치.
  22. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유체역학적 장애물의 기공은 25 nm 내지 800 nm의 중간 특성 길이를 갖는, 장치.
  23. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유체역학적 장애물은 100 μm 내지 200 μm의 폭을 갖는, 장치.
  24. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중앙 채널은 1 mm 내지 10 mm의 폭 및 10 cm 내지 20 cm의 길이를 갖는, 장치.
  25. 제1항에 있어서, 커버는 비다공성인, 장치.
  26. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유체역학적 장애물은 양극액 채널 또는 음극액 채널 중 적어도 하나에 중앙 채널을 유체적으로 단리시키지만 전기적으로 결합시키는, 장치.
  27. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유체역학적 장애물은 다공성 멤브레인인, 장치.
  28. 방법으로서,
    단일 채널 자유 유동 전기영동 장치의 중앙 채널을 통해 샘플을 유동시키는 단계;
    중앙 채널에 대해 평행인 양극액 채널 및 음극액 채널을 통해 상기 샘플의 유동 방향에 대해 평행하지 않은 전기장을 인가하는 단계로서, 상기 양극액 채널, 상기 중앙 채널, 및 상기 음극액 채널은 유체역학적 장애물을 통해 이온적으로 결합되지만 유체적으로 단리되는, 단계;
    관심 분석물의 등전점 및 상기 전해질 완충액의 pH 값에 따라 상기 샘플로부터 관심 분석물을 분리하는 단계; 및
    분석물의 혼합물로부터 분리된 상기 관심 분석물을 함유하는 샘플의 분획을 수집하는 단계를 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 샘플을 중앙 채널을 통해 유동시키는 단계 이전, 상기 샘플을 샘플 완충액과 혼합하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 샘플 완충액은 상기 전해질 완충액의 pH 값과 일치하는 pH를 갖는, 방법.
  30. 제28항에 있어서, 저장조로부터, 그리고 양극액 채널 및 음극액 채널을 통해 전해질 완충액을 순환시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  31. 제28항에 있어서, 전기장을 생성하기 위해 양극액 채널 및 음극액 채널에 전압을 인가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  32. 제28항에 있어서, 저장조로 복귀하기 전, 전해질 완충액이 양극액 채널 및 음극액 채널을 통해 유동하도록 상기 저장조로부터 전해질 완충액을 순환시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  33. 제28항에 있어서, 2개의 루프를 통해 전해질 완충액이 양극액 채널 및 음극액 채널을 통해 유동하도록 상기 저장조로부터 전해질 완충액을 순환시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  34. 제29항에 있어서, 샘플 완충액은 MES-BisTris를 포함하는, 방법.
  35. 제28항에 있어서, 관심 분석물을 함유하는 샘플의 분획은 분당 5 μL 내지 분당 15 μL의 속도로 수집되는, 방법.
  36. 제28항에 있어서, 관심 분석물을 함유하는 샘플의 분획은 분당 1 μL 내지 분당 50 μL의 속도로 수집되는, 방법.
  37. 제28항에 있어서,
    관심 분석물은 제1 분석물이고;
    pH 값은 제1 pH 값이고;
    상기 제1 분석물은 상기 제1 pH 값에 상응하는 제1 등전점을 가지고;
    분획은 제1 분획인 방법으로서, 상기 방법은,
    상기 제1 분획이 수집된 후 상기 전해질 완충액의 제1 pH 값을 제2 pH 값으로 조정하는 단계; 및
    상기 제2 pH 값에 상응하는 제2 등전점을 갖는 제2 분석물을 함유하는 샘플의 제2 분획을 수집하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  38. 제28항에 있어서,
    전해질 완충액의 pH 값을 순차적으로 조정하는 단계; 및
    샘플의 복수의 분획을 수집하는 단계를 추가로 포함하되, 상기 샘플의 복수의 분획으로부터의 샘플의 각각의 분획은, 상기 분획의 수집 동안 전해질 완충액의 pH 값에 상응하는 등전점을 갖는 분석물의 농축된 부분을 함유하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 전해질 완충액의 pH 값은 상기 전해질 완충액 중 MES 및 BisTris의 비율을 변화시킴으로써 순차적으로 조정되는, 방법.
  40. 제38항에 있어서, 전해질 완충액의 pH 값은 계량된 펌프 또는 밸브를 통해 순차적으로 조정되는, 방법.
  41. 제38항에 있어서, 샘플의 복수의 분획으로부터 샘플의 각각의 분획은 일정한 속도로 수집되는, 방법.
  42. 제37항에 있어서, 전해질 완충액의 pH는 상기 전해질 완충액의 온도를 변화시킴으로써 조정되는, 방법.


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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3412008A (en) * 1965-08-23 1968-11-19 Beckman Instruments Inc Electrophoresis apparatus
US6143152A (en) * 1997-11-07 2000-11-07 The Regents Of The University Of California Microfabricated capillary array electrophoresis device and method
AUPP576598A0 (en) * 1998-09-07 1998-10-01 Life Therapeutics Limited Cassette for macromolecule purification
US7141152B2 (en) * 2000-03-16 2006-11-28 Le Febre David A Analyte species separation system
GB0010957D0 (en) * 2000-05-05 2000-06-28 Novartis Ag Compound & method
DE102005020134A1 (de) * 2005-04-29 2006-11-02 Becton, Dickinson And Co. Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung eines parallelen und simultanen Mehrfachprozesses der trägerfreien isoelektrischen Fokussierung
CA2661268C (en) * 2006-08-29 2016-09-13 Becton, Dickinson & Company Method and apparatus for carrier-free deflection electrophoresis
WO2009062967A1 (en) * 2007-11-12 2009-05-22 Becton, Dickinson & Company Ms-compatible nonionic or zwitterionic surfactants in free-flow electrophoresis
US10107782B2 (en) * 2008-01-25 2018-10-23 ProteinSimple Method to perform limited two dimensional separation of proteins and other biologicals
CN102688692A (zh) * 2012-05-28 2012-09-26 上海交通大学 用于制备型自由流电泳的分离室装置
EP2821781A1 (en) * 2013-07-04 2015-01-07 FFE Service GmbH Free-flow electrophoresis method for separating analytes
AU2016365121B2 (en) * 2015-11-30 2022-03-03 Intabio, Inc. Devices and methods for sample characterization

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