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Technisches
Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft die elektrophoretische Trennung, Reinigung und
Gewinnung von Verbindungen aus Lösung.
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Allgemeiner
Stand der Technik
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Komplexe
Gemische wie biologische Proben können bis zu 30.000 unterschiedliche
Proteine enthalten, die für
die weitere Analyse getrennt und identifiziert werden müssen. Bei
der Proteomanalytik ist für
die hochauflösende
Trennung von komplexen Proteingemischen die Entwicklung von neuen
Techniken erforderlich, die die Trennzeiten auf ein Minimum reduzieren,
leicht handzuhaben sind, zu hoher Reinheit führen und die weitere Analyse
der interessierenden Verbindung(en), die aus der Probe extrahiert
wird/werden, ohne überflüssige zusätzliche
Aufreinigungsschritte gestatten.
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Bei
der 2D-Gelelektrophorese handelt es sich um eine der Techniken,
mittels welcher solche komplexen biologischen Proben getrennt werden
können
(Wilkins, M. R. et al., Proteome Research: New Frontiers in Functional
Genomics; Springer, 1997). Bei der 2D-Gelelektrophorese werden die Proteine
erst entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt durch eine isoelektrischen
Fokussierung (IEF) getrennt. In einem zweiten Schritt werden die
Proteine in Abhängigkeit
ihres Molekulargewichts mittels einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
getrennt. Als Ergebnis erhält
man ein Bild, in dem jeder sichtbare Fleck einem bestimmten Protein
entspricht. Ist die weitere Analyse eines Proteins erwünscht, zum
Beispiel die Analyse der Peptidzusammensetzung oder der biologischen
Wirksamkeit, so muß das
Protein erst aus der Gelmatrix extrahiert werden und kann erst dann
mit der entsprechenden Methode analysiert werden, um zu der erwünschten
Information zu gelangen.
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Für die Extraktion
von Proteinen aus einem Polyacrylamid-2D-Gel sind Methoden entwickelt
worden, wobei eine solche Methode darin besteht, daß man den
Proteinfleck aus dem Gel herausschneidet und in einem nasschemischen
Schritt extrahiert. Bei dieser Technik ist es sehr wahrscheinlich,
daß das
Protein während
seiner Gewinnung denaturiert wird, modifiziert wird oder sogar verloren
geht. Eine andere Technik ist das Elektroblotting, das sehr zeitaufwendig
ist.
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Sobald
ein Protein aus dem Gel extrahiert ist, ist die effizienteste Analysetechnik
die Massenspektrometrie. Mit dieser Technik kann man nicht nur die
Peptidzusammensetzung von Proteinen analysieren, sondern auch die
erhaltene Peptidkarte mit anderen Proteindaten, die von verschiedenen
Bioinformatik-Institutionen
in Datenbanken zusammengestellt werden, vergleichen. Bei der Massenspektroskopie
(MS) ist die Reinheit einer Probe kritisch. Enthält eine Probe Verunreinigungen
wie Salz, kann sie nicht direkt einer MS-Analyse unterzogen werden.
Solch eine Probe müsste
vor der MS-Analyse zum Beispiel durch Dialyse entsalzt werden. Eine
weitere Möglichkeit,
unerwünschte
Verbindungen in der Probe zu vermeiden, besteht in der Verwendung der
direkten Laser-Desorptionstechnik aus dem 2D-Gel (Ogorzalek Loo
R. R., et al., Analytical Chemistry, 1996, 68, 1910–1917) oder
eines Elektroblot-2D-Gel
(Eckerskorn, C. et al., Analytical Chemistry, 1997, 69, 2888–2892; Strupat,
K. et al., Analytical Chemistry, 1994, 66, 464–470). Alle diese zusätzlichen
Aufreinigungsschritte verkomplizieren den Analysegang und sind zeitaufwendig.
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Obwohl
eine Trennung von Verbindungen in komplexen Gemischen mittels 2D-Gelelektrophorese möglich ist,
besteht noch immer das Problem der zahlreichen Verunreinigungen,
die mit den für
die Analyse erwünschten
Verbindungen verbleiben und deren Entfernung arbeitsaufwendig ist.
Das Hauptproblem bei der 2D-Gelelektrophorese besteht darin, daß die interessierende
Verbindung in einem Gel festgelegt ist und vor ihrer Analyse extrahiert
und weiter aufgereinigt werden muß.
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Ein
weiteres Verfahren zur Trennung von komplexen biologischen Proben
ist die isoelektrische Trennung, zum Beispiel mittels isoelektrischer
Fokussierung (IEF) (Righetti, P. G., J. Biochem Biophys Methods, 1988,
16: 99–108).
Bei der IEF handelt es sich um eine Elektrophoresetechnik, mit der
Verbindungen innerhalb eines pH-Gradienten aufgrund ihrer Ladung
getrennt werden können.
Im allgemeinen gibt es zwei Haupttypen von Systemen der isoelektrischen
Fokussierung: (i) trägerfreie
gepufferte Systeme sowie (ii) immobilisierte gepufferte Systeme.
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(i) trägerfreie gepufferte Systeme
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Alle
trägerfreien
Systeme beruhen auf der Verwendung eines Puffers, üblicherweise
Trägerampholyte oder
isoelektrische Puffer wie Aminosäuren.
So wurde zum Beispiel ein kontinuierliches trägerfreies Gerät von Soulet,
N. et al. (Electrophoresis, 1998, 19, 1294–1299) gezeigt. Bei diesem
Gerät wird
in einer flachen Kammer ein pH-Gradient mit Trägerampholyten und im rechten
Winkel zur Richtung des Trägerflusses
ein Potentialgradient geschaffen. Die Probe wird kontinuierlich
eingespritzt und am Ende des Geräts
in Trennfraktionen aufgeteilt. Obwohl der pH-Gradient über mehrere
Stunden stabil war, ließ sich
keine vollständige
Trennung von Rinderserumalbumin und alpha-Lactalbuminerzielen. Einige Hauptnachteile
dieses Systems bestehen darin, daß es nicht zur Trennung von
Verbindungen mit nahe beieinander liegenden pI-Werten fähig ist,
dass für
die Trennung mehrere Stunden benötigt
werden, sowie darin, daß Trägerampholyte verwendet
werden, die entfernt werden müssen,
bevor eine weitere Analyse der gewünschten Verbindungen möglich ist.
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Bei
der isoelektrischen Split-Flow Thin (SPLITT) Fraktionierung wird
kein pH-Gradient geschaffen, sondern das Trennungsprinzip beruht
auf der Ladung, die Proteine je nach ihrem isoelektrischen Punkt
(pI) in Puffern mit unterschiedlichen pH-Werten aufweisen. An eine
Durchflußzelle
wird ein Potential angelegt, wobei man entsprechende Eingangs- und/oder
Ausgangs-Splitter verwendet, um die Proteinfraktionen zu trennen. Zwei-Komponenten-Proteinmischungen
sind erfolgreich getrennt worden (Fuh, C. B. und Giddings, J. C.,
Separation Science and Technology, 1997, 32, 2945–2967),
dieses System weist jedoch einige Nachteile auf, wenn komplexe Proteinmischungen
zu analysieren sind und wenn die isoelektrischen Punkte (pI) der
Proteine sehr nahe beieinander liegen (pI-Unterschiede von weniger
als 0,1 pH können
mit diesem Verfahren nicht getrennt werden).
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Viele
umwälzende
isoelektrische Systeme beruhen auf der physikalischen Trennung von
Kompartimenten mit unterschiedlichen pH-Werten mittels Membranen
oder Abschirmungen. Einige davon sind in der Literatur in einem Übersichtsartikel
beschrieben (Bier, M. Electrophoresis, 1998, 19, 1057–1063; Krivankova, L.
et al., Electrophoresis, 1998, 19, 1064–1074). Einer der häufigsten
präparativen
Ansätze
für die
umwälzende
trägerfreie
Elektrophorese ist das Rotofor-Gerät, das von BioRad vertrieben
wird. In einem röhrenförmigen Gerät, wo Kompartimente
durch ein Abtrennungsmaterial definiert sind, wird der pH-Gradient
mit speziellen Ampholyten, den sogenannten Rotolyten, geschaffen.
Schwerkraftprobleme bei der trägerfreien
Elektrophorese werden durch ein Rotieren der Trennkompartimente
gelöst.
Dieses Gerät
wurde erfolgreich im präparativen Maßstab angewandt.
Eine Modifikation dieses Ansatzes ist das tangential arbeitende
Elektrophoresegerät
von Bier (
US 5540826 ).
Hier werden die unterschiedlichen Kompartimente so angeordnet, daß eine Multi-Kanal-Anordnung von einer
zweiten Multi-Kanal-Anordnung, die ein wenig durch eine einzelne
Abtrennung verdrängt
ist, getrennt ist. Ein elektrisches Feld wird im rechten Winkel
zu den Kanälen
angelegt, wodurch ein elektrophoretischer serpentinenartiger Pfad
durch die Kanäle
ermöglicht
wird. Der pH-Wert in den Kanälen
ist durch Ampholyte fixiert, und ein Umwälzen ist mit unabhängigen Eingangs-
und Ausgangsöffnungen
bei jedem Kanal möglich.
Die Hauptnachteile dieses Systems sind, daß das Gerät eine komplizierte Multi-Kanal-Konstruktion aufweist,
durch die die Lösung
fließen
muß, und
daß die
interessierende(n) Verbindung(en) in einer Ampholytenlösung verbleibt/verbleiben,
die entfernt werden muß,
bevor eine weitere Analyse der gewünschten Verbindung(en) möglich ist.
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Bei
den meisten Systemen mit gepufferter Lösung wird der Analyt mit einem
Laufpuffer vermischt, und die Handhabung der Flüssigkeit erfolgt nach mehreren
Strategien, um entweder die Lösung
zu fraktionieren oder zu entsalzen oder um in einem nichtkonvektiven
Medium und/oder einem Medium mit geringer Wasserdiffusion zu arbeiten.
Alle diese Geräte
für die
isoelektrische Fokussierung weisen in Bezug auf die weitere Analyse
der Verbindungen einen wesentlichen Nachteil auf. Sie enthalten
alle eine gewisse Menge an unerwünschten
Puffersubstanzen oder Ampholyten in der abgetrennten Endfraktion.
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(ii) immobilisiertes Puffersystem
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Bei
den meisten immobilisierten Puffersystemen besteht ein wesentlicher
Nachteil bei der weiteren Analyse der Verbindungen, da die abgetrennte
Endfraktion in einem Gel oder einer Membran gefangen ist.
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Es
existiert ein von Righetti und Faupel (Righetti, P. G. et al. Journal
of Chromatography, 1989, 475, 293–309) entwickeltes Gerät, das auf
der unter der Bezeichung „segmentierte
immobilisierte pH-Gradienten" bekannten
Technik beruht. Das Gerät
besteht aus Mehrfachkompartimenten, die durch isoelektrische Immobilin-Membranen
abgetrennt, zwischen einem anodischen und einem kathodischen Reservoir
eingeschlossen sind, wodurch die Proteine in einer ampholytenfreien
Lösung
gewonnen werden können.
Dieses Gerät
kann aus mehreren Kompartimenten, die durch mittels Membranen stabilisierte
Immobilin-Gele getrennt sind, bestehen. Die Trennung von Fraktionen
erfolgt dadurch, daß das
Protein aufhört,
in einem elektrischen Feld zwischen zwei Immobilin-Membranen zu
wandern, wobei eine Membran einen pH-Wert, der höher als der pI-Wert des Proteins
ist, und die andere einen pH-Wert, der darunter liegt, generiert.
Dieses Gerät
weist weitere Nachteile auf: die Verwendung von Mehrfachkompartimenten,
multiplen immobilisierten Membranen und segmentierten pH-Gradienten.
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Darstellung
der Erfindung
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Das
Ziel der Erfindung besteht darin, ein Gerät, ein Verfahren und ein Kit
für die
Trennung von geladenen und neutralen Verbindungen sowie für die Gewinnung
dieser neutralen Verbindungen in einer Lösung, bei der es sich um eine
ampholytenfreie Lösung
oder eine pufferfreie Lösung
handeln kann, bereitzustellen. In diesem Fachgebiet besteht ein
Bedarf an einem Gerät,
einem Verfahren und einem Kit für
die Trennung von Verbindungen in komplexen Mischungen in Kombination
mit einem effizienten Verfahren für die Gewinnung von interessierenden
Verbindungen, so daß diese
ohne die zusätzlichen
zeitaufwendigen Schritte der Extraktion und Aufreinigung, die im
Stand der Technik existieren, analysiert werden können, zum
Beispiel mittels Massenspektrometrie. Die hier beschriebene Erfindung kann
für die
Trennung von biologischen oder chemischen Verbindungen in komplexen
Mischungen verwendet werden.
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In
einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Gerät für die elektrophoretische
Trennung und Aufreinigung von geladenen und neutralen Verbindungen
in einer Analytenlösung
gemäß Anspruch
1 bereit.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
für die
elektrophoretische Trennung und Aufreinigung von geladenen und neutralen
Verbindungen in einer Analytenlösung,
sowie die Gewinnung von abgetrennten Fraktionen mittels des erfindungsgemäßen Geräts bereit.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß interessierende
Verbindungen in Lösung,
sogar in ampholytenfreier oder pufferfreier Lösung, gewonnen werden können.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Trennungs- und Aufreinigungsverfahren,
das sich von den Elektrophoresetechniken des Stands der Technik
grundlegend unterscheidet, da die Potentialdifferenz nicht in der Analytenlösung und
auch nicht zwischen der Analytenlösung und dem chemischen Puffersystem
angelegt wird. Bei der vorliegenden Erfindung wird die Potentialdifferenz
nur durch das chemische Puffersystem (oder einen Teil davon) angelegt,
und zwar so, daß ein
Teil des elektrischen Felds in die Kammer, die die aufzueinigende
Lösung
enthält,
eindringt. Der Vorteil dieses neuen Verfahrens und seines Geräts im Vergleich
zu den Methoden des Stands der Technik besteht darin, daß die Auflösung der
Trennung erhöht
wird, die Reinigungsgeschwindigkeit aufgrund der Wanderung in Lösung anstelle
eines Gels oder einer Membran erhöht wird, und eine direkte Fraktionierung
für die
weitere Analyse ermöglicht
wird. Die Verwendung von zusätzlichen
Reinigungsschritten, die bei anderen Elektrophoresegeräten und
-verfahren des Stands der Technik verwendet werden, bei denen üblicherweise
Trägerampholyte
oder isoelektrische Puffer für
die Erzeugung eines pH-Gradienten in der Analytenlösung verwendet
werden, ist nicht erforderlich.
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Bei
der vorliegenden Erfindung kann das chemische Puffersystem in Bezug
auf den pH-Wert in seinem Teil, der mit der Analytenlösung in
Kontakt steht, vorteilhaft kontrolliert werden. Wenn die interessierende(n) Verbindung(en)
global bei dem kontrollierten pH-Wert neutral ist/sind, kann man
die gewünschte(n)
Verbindung(en) von der Mischung abtrennen. Wird ein elektrisches
Feld durch das chemische Puffersystem angelegt, und zwar vorzugsweise
im rechten Winkel zu der Analytenlösung, so kann man zwischen
geladenen Verbindungen und Verbindungen, die bei diesem pH-Wert
global neutral sind, unterscheiden. Es werden nämlich die neutralen Verbindungen
in Kontakt mit dem Puffersystem in der Analytenlösung zurückgehalten, während die
geladenen Verbindungen in das chemische Puffersystem wandern. Auf
diese Weise können
Verbindungen über
den pI-Wert getrennt werden, und zwar dadurch, daß man den
pH-Wert des chemischen Puffersystems kontrolliert.
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Die
vorliegende Erfindung gestattet daher die elektrophoretische Trennung
und Aufreinigung von Verbindungen, die global neutral sind, von
geladenen Substanzen direkt in einer Analytenlösung, die nicht gepuffert sein
muß. In
manchen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung weist das Gerät eine Kammer mit einem Zufluß und einem
Abfluß,
die mit einem hydraulischen Fließsystem in Verbindung sind,
wobei die Analytenlösung
durch diese Kammer fließen
kann, auf. In weiteren Ausführungsformen
weist das Gerät
eine Kammer auf, bei der Zufluß und
Abfluß miteinander
vereinigt sind, so daß ein
einfacher Vorratsbehälter
entsteht, der mit der zu reinigenden Mischung beschickt werden kann
und von dem die gereinigte Lösung
abgezogen werden kann. In weiteren Ausführungsformen können erfindungsgemäße Geräte eine
Mehrzahl von Kammern für
die gleichzeitige und/oder parallel durchgeführte Reinigung enthalten. Vorzugsweise
fließt
der elektrische Strom im rechten Winkel zu der Flußrichtung
der Analytenlösung.
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Bei
bevorzugten Ausführungsformen
weist das chemische Puffersystem einen definierten pH-Wert und einen
definierten pH-Bereich auf, der sich zum Beispiel dadurch erzeugen
läßt, daß man kovalent
gebundene Puffermoleküle,
amphotere isoelektrische Membranen oder eine beliebige Kombination
von diesen verwendet. Das chemische Puffersystem gewährleistet
daher die Trennung von interessierenden Verbindungen aufgrund des
isoelektrischen Punkts bei einem fixen pH-Wert oder einem pH-Gradienten.
Es erlaubt die Trennung von Verbindungen mit unterschiedlichen pI-Werten,
zum Beispiel von Verbindungen mit pI-Unterschieden von weniger als
0,1, Verbindungen mit pI-Unterschieden von weniger als 0,01 und
Verbindungen mit pI-Unterschieden von bis zu 0,001, was je nach
Wunsch unterschiedliche Reinigungsgrade gestattet.
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Bei
dem chemischen Puffersystem kann es sich zum Beispiel um ein Immobilingel,
eine Flüssigkeit, die
in einer Polymermatrix, einer Glasfritte, einer porösen Membran,
einem Filter oder einer beliebigen Kombination davon verfestigt
ist, handeln. Dieses chemische Puffersystem dient zur Kontrolle
des pH-Werts in seinem Teil, der mit der Analytenlösung in
Kontakt steht, wodurch zwischen geladenen Verbindungen und Verbindungen,
die bei diesem pH-Wert global neutral sind, unterschieden werden
kann. Dieses chemische Puffersystem läßt sich daher für die Abtrennung
von einer oder mehreren interessierenden neutralen Verbindungen von
einem Gemisch, das geladene Verbindungen enthält, verwenden.
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Quer
zu diesem chemischen Puffersystem wird ein elektrischer Strom angelegt,
und die Form der Kammer ist derart, daß der elektrische Strom bis
in diese Kammer hinein eindringt und so einen Wanderstrom der geladenen
Verbindungen, die in der Lösung
vorliegen, erzeugt. Die Reinigungsleistung und -geschwindigkeit
hängen
von der Tiefe, der Breite und Länge
oder dem Durchmesser der Kammer ab, und deren Geometrie kann daher
entsprechend den Anwendungen und durchzuführenden Versuchen gewählt werden.
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Ein
Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß aufgrund
der durch die Wanderung der geladenen Verbindungen hervorgerufenen
Trennung die interessierende Verbindung direkt innerhalb der Analytenlösung fraktioniert
werden kann. Auf diese Weise verläuft die Trennung wesentlich
rascher als bei fachbekannten Methoden, da die Wanderungsgeschwindigkeit
in Lösung
wesentlich rascher ist als in anderen üblicherweise im Stand der Technik
verwendeten Medien, wie Gelen oder porösen Membranen, wo der hohe
Widerstand die Wanderungsgeschwindigkeit drastisch reduziert.
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In
manchen Fällen
können
die wandernden geladenen Moleküle
in das chemische Puffersystem eindringen und innerhalb dieses Systems
weiter wandern. Diese Wanderung hat jedoch keinen Einfluß auf die Trennung
innerhalb der Analytenlösung,
und das chemische Puffersystem kann als Abfalltank angesehen werden.
Bei manchen Anwendungen kann es vorteilhaft sein, das Adsorbieren
der neutralen Verbindungen an die Wand des chemischen Puffersystems
zu verhindern. Bei manchen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung könnten
Mittel vorgesehen werden, die eine direkte Adsorption verhindern,
darunter zum Beispiel eine feine Membran, bei der es sich (zum Beispiel)
um ein sehr wenig poröses
Material handeln kann.
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In
manchen Fällen
kann es auch von Vorteil sein, die geladenen Moleküle, die
innerhalb des chemischen Puffersystems wandern, zu gewinnen. Zu
diesem Zweck kann das erfindungsgemäße Gerät vorteilhaft mehrere Unterkammern
enthalten.
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Bei
manchen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung kann man eine Analytenlösung innerhalb
der Kammer von einem Zufluß zu
einem Abfluß fließen lassen.
Computersimulationsversuche zeigen, daß das durch das chemische Puffersystem
angelegte elektrische Feld in die Durchflußkammer eindringt, wodurch
eine Wanderung der geladenen Substanzen in der Analytenlösung stattfindet
(siehe Beispiele). Die Computersimulation weist nach, daß, wenn
das elektrische Feld direkt zwischen den Enden der die Analytenlösung enthaltenden
Kammer angelegt wird, nur ein sehr kleiner Teil der Feldlinien in
das chemische Puffersystem eindringt und so die geladenen Substanzen
zur Wanderung innerhalb der Analytenlösung zwingt. Diese Art der
Polarisierung ist in Verfahren des Stands der Technik verwendet
worden (wie in der segmentierten Gelelektrophorese), um jedoch diese
Defekte zu vermeiden, wird der Strom innerhalb des elektrischen
Puffersystems dadurch verstärkt,
daß man
die Lösung
so polarisiert, daß die
Ionen durch das chemische Puffersystem hindurch gezwungen werden,
welches dann als Septum oder Filter, das ein Netzwerk von Lösungskompartimenten
trennt, verwendet wird. Bei der vorliegenden Erfindung wird ein
Trennungsprinzip verwendet, das sich vom Stand der Technik grundsätzlich unterscheidet,
da die Potentialdifferenz an beiden Enden des chemischen Puffersystems
angelegt wird, und zwar so, daß ein
Teil des elektrischen Felds in die Kammer, die die zu reinigende
Lösung
enthält,
eindringt.
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Die
vorliegende Erfindung weist den Vorteil auf, daß eine einzige Kammer für die Durchführung der erforderlichen
Trennung ausreicht, obwohl mehrere Kammern (oder Unterkammern) gewünschtenfalls
verwendet werden können,
um gleichzeitige Trennungen bei verschiedenen gewünschten
pH-Werten oder parallele Trennungen bei dem gleichen gewünschten
pH-Wert in dem chemischen Puffersystem durchzuführen. Weiterhin besteht bezüglich der
Anzahl, den Abmessungen oder der Form der Kammern, die für den jeweiligen Anwendungszweck
ohne Beschränkung
der Größe, des
Volumens oder der Menge angepaßt
werden können, keine
Einschränkung.
Die erfindungsgemäßen Geräte und Verfahren
können
daher leicht nach oben oder unten abgeändert werden. So ist es zum
Beispiel möglich,
im Analysemaßstab,
jedoch auch im präparativen
und Pilotmaßstab
oder im Downstream-Verfahren zu arbeiten.
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Bei
manchen Ausführungsformen
können
die erfindungsgemäßen Geräte auch
Mittel für
die Steuerung der Temperatur des Geräts und der Analytenlösung aufweisen,
insbesondere dort, wo grosse Potentialunterschiede verwendet werden.
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Bei
manchen bevorzugten Ausführungsformen
können
erfindungsgemäße Geräte Mittel
zur Verhinderung des Ausfallens der interessierenden neutralen Verbindung(en)
aufweisen. Bei der Reinigung verarmt die Analytenlösung an
Ionen, wodurch ihre Löslichkeit
absinkt. Unter diesen Bedingungen kann die Verwendung einer nichtwäßrigen Analytenlösung oder
des Einbaus eines Ultraschallgeräts
in das erfindungsgemäße Gerät von Vorteil
sein.
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Beim
Betrieb von erfindungsgemäßen Geräten wandern
alle Verbindungen, die bei dem von dem chemischen Puffersystem etablierten
pH-Wert geladen sind, zu den Enden der Kammer, und zwar entsprechend den
Feldlinien, die von der Stellung der Elektroden, der Geometrie des
gesamten Geräts
und der Art der Analytenlösung
und des chemischen Puffersystems abhängen. Es verbleiben nur diejenigen
Verbindungen in der Analytenlösung,
die bei dem von dem chemischen Puffersystem definierten pH-Wert neutral
sind.
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Mit
der vorliegenden Erfindung können
alle unerwünschten
Ionen, darunter Salze, geladene Säuren oder Basen, Pufferbestandteile
oder Ampholyte, rasch aus einer Lösung entfernt werden. So können zum
Beispiel Proteine in einer trägerfreien
Lösung
gereinigt und zugleich für
die weitere Analyse vorbereitet werden. Ähnlich kann die vorliegende
Erfindung dazu verwendet werden, um eine neutrale Verbindung aus
einem Überschuß von geladenen
Nebenprodukten oder Salzen zu isolieren.
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Außer der
Isolation von neutralen Substanzen erleichtern die erfindungsgemäßen Geräte und Verfahren
auch die Gewinnung von geladenen Substanzen, die im Betrieb in das
chemische Puffersystem abgeladen werden. Ein wichtiger Aspekt in
der Proteomanalytik besteht zum Beispiel darin, Zugang zu selten
vorkommenden Proteinen zu haben, deren Identifikation häufig durch
das Vorhandensein von hochkonzentrierten Proteinen gehemmt wird.
So zum Beispiel verhindert das Vorhandensein von Albumin in vielen
Zellextrakten den Nachweis von Proteinen, die in niedriger Konzentration
vorliegen. Bei solchen Anwendungen kann die vorliegende Erfindung
zum Beispiel dazu verwendet werden, um Albumin vom Rest der Analytenlösung abzutrennen,
und zwar dadurch, daß man
es in ein Gel mit einem immobilisierten pH-Gradienten (IPG-Gel) ablädt. Zu diesem
Zweck muß der
Teil des chemischen Puffersystems, der mit der Analytenlösung in
Kontakt steht, einen pH-Bereich aufweisen, der denjenigen von Albumin
oder einer beliebigen sonstigen Verbindung, die vom Rest der Analytenlösung abgetrennt
werden muß,
umfaßt.
Auf diese Weise werden alle Verbindungen der Analytenlösung, die
in diesem pH-Bereich geladen sind, bei Anlegen des elektrischen
Felds in das IPG-Gel extrahiert und können innerhalb dieses Gels
so lange wandern, wie sie geladen bleiben, oder bis zu dem Punkt,
an dem der pH-Wert des Gels ihrem pI-Wert entspricht. In solchen
Fällen
sind die interessierenden Verbindungen nicht nur die neutralen Verbindung(en),
die nach der elektrophoretischen Reinigung in der Analytenlösung verbleiben,
sondern auch – manchmal
sogar hauptsächlich – die geladenen
Verbindungen, die extrahiert worden sind und die innerhalb des chemischen
Puffersystems gewandert sind, da diese besser als im Stand der Technik
bestimmt und identifiziert werden können.
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Bei
einer Art der Verwendung kann die vorliegende Erfindung dazu verwendet
werden, um Verbindungen in dem chemischen Puffersystem anzureichern.
Bei solchen Anwendungen wird die Analytenlösung in der Kammer so erneuert,
daß frische
Lösung
der elektrophoretischen Trennung und Reinigung zugeführt wird.
Auf diese Weise lassen sich Verbindungen, die in der Analytenlösung in
niedriger Konzentration vorliegen, in dem chemischen Puffersystem
anreichern, wodurch sie leichter nachgewiesen und identifiziert
werden können.
Für Identifikationszwecke
kann es auch vorteilhaft sein, wenn das chemische Puffersystem mit
Mitteln für
die spezifische Identifikation einer Verbindung oder Verbindungsklasse
kombiniert wird. Beim Betrieb solcher Mittel kann eine Verbindung
oder eine Verbindungsklasse nachgewiesen werden, und zwar zum Beispiel
durch die Emission von Licht, die Absorption von Licht (wie zum
Beispiel beim Blotting), der Erzeugung eines elektrisch aktiven
Produkts, spezifische Erkennung von Molekülen (wie zum Beispiel bei der
Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes
oder bei einer Enzymreaktion), bei der ein nachweisbares Produkt
erzeugt wird.
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Bei
manchen Ausführungsformen
kann das Gerät
so modifiziert werden, daß die
Gewinnung von geladenen Verbindungen, die von der Analytenlösung in
das chemische Puffersystem extrahiert worden sind, erleichtert wird.
Für diesen
Zweck kann die Kammer in Unterkammern geteilt sein, von denen mindestens
eine die Analytenlösung
enthält.
Die anderen Unterkammern können
für die
Gewinnung der Verbindungen, die innerhalb des chemischen Puffersystems
wandern, verwendet werden und enthalten vorzugsweise eine Pufferlösung zur
Festlegung des pH-Werts. Da die geladenen Verbindungen in der Richtung
des elektrischen Felds wandern und ein Teil dieses elektrischen
Felds in jede Unterkammer eindringt, können die geladenen Verbindungen
aus dem chemischen Puffersystem in die Unterkammern zurückextrahiert
werden. Diese Wanderung dauert so lange, bis die wandernden Verbindungen
einen pH-Bereich des chemischen Puffersystems oder einer Unterkammer
erreichen, wo sie global neutral sind. Solch eine Anordnung zeigt
einen weiteren Vorteil der vorliegenden Erfindung, nämlich die
Möglichkeit,
eine beliebige in Lösung
befindliche Verbindung zu gewinnen, sogar nach der Wanderung innerhalb
des chemischen Puffersystems. Dies ist in Bezug auf den Stand der Technik äußerst vorteilhaft,
da es die weitere Analyse solcher gewonnenen Verbindungen wesentlich
erleichtert.
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Die
erfindungsgemäßen Geräte und Verfahren
weisen zumindest die folgenden Hauptvorteile auf: (i) hohe Wiederfindungsrate
von interessierenden Verbindungen direkt in Lösung, (ii) hohes Auflösungsvermögen, je
nach dem pH-Intervall über
den isoelektrischen Punkt (pI) der erwünschten Verbindung, (iii) rasche Trennungsgeschwindigkeit
dadurch, daß die
geladenen Moleküle
in Lösung
und nicht durch dichtere Materialien wie Gele wandern, sowie (iv)
die Trennung der gewünschten
interessierenden Verbindung erfolgt direkt in eine ampholytenfreie
oder pufferfreie Lösung,
die bequem die weitere Analyse erleichtert, ohne daß weitreichende
zusätzliche
Aufreinigungsschritte wie Entsalzen erforderlich sind.
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Die
interessierende(n) Verbindung(en) ist bzw. sind vorzugsweise biologische
Verbindungen, stärker bevorzugt
organische Verbindungen und am stärksten bevorzugt Proteine,
Proteinderivate, Proteinisoformen, Enzyme, Antigene, Antikörper, Peptide
oder Nukleinsäuren,
Lipide oder Kohlenhydrate.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Kit bereit, das das
erfindungsgemäße Gerät mit Anweisungen
für die
elektrophoretische Trennung und Aufreinigung von geladenen und neutralen
Verbindungen in einer Analytenlösung
sowie gegebenenfalls die Chemikalien, die mit der Analytenlösung zu
vermischen oder zu verwenden sind, um die Aufreinigung der gewünschten
Verbindung(en) zu verbessern, umfaßt. Mit solch einem Kit läßt sich
die interessierende Verbindung bzw. lassen sich die interessierenden
Verbindungen in Lösung
gewinnen.
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Bei
der interessierenden Verbindung kann es sich um eine beliebige biologische
oder chemische Verbindung handeln, die bei dem von dem chemischen
Puffersystem, das mit der Analytenlösung in Kontakt steht, definierten
pH-Wert bzw. pH-Intervall neutral ist. Vorzugsweise handelt es sich
bei der interessierenden Verbindung um eine ionisierbare biologische
Verbindung wie ein Protein, ein Enzym, ein Peptid oder eine Verbindung,
die einen Peptid- oder Proteinrest enthält, wie ein Glycoprotein, es
kann sich jedoch auch um eine Nukleinsäure, ein komplexes Lipid oder
ein komplexes Kohlenhydrat handeln. Es kann sich auch um eine beliebige
Isoform eines Proteins oder um einen Antikörper wie einen monoklonalen
Antikörper
handeln.
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Bei
der geladenen Verbindung kann es sich um eine beliebige Verbindung
handeln, die bei dem von dem chemischen Puffersystem, das mit der
Analytenlösung
in Kontakt steht, definierten pH-Wert bzw. pH-Intervall geladen
ist. Bei der geladenen Verbindung kann es sich daher entweder um
eine ionisierbare oder geladene Verbindung, vorzugsweise eine Säure, eine
Base, einen Ampholyten oder eine dauerhaft geladene Verbindung wie zum
Beispiel ein dissoziiertes Salz handeln. Die geladene Verbindung
wird bei der erfindungsgemäßen elektrophoretischen
Trennung von der Kammer in das chemische Puffersystem extrahiert.
Sie kann jedoch wiederum aus dem Gel in eine Lösung extrahiert werden und
kann die für
den Versuchseinsteller interessante Verbindung sein.
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Bei
der Analytenlösung
kann es sich um eine beliebige erfindungsgemäße Lösung handeln, die die interessierende(n)
Verbindung(en) solubilisiert. Vorzugsweise handelt es sich um eine
ampholytenfreie oder pufferfreie Lösung.
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Der
elektrische Strom kann mittels Elektroden, die von einer externen
Stromquelle erzeugt werden, angelegt werden. Es kann jede Spannung,
die von dem erfindungsgemäßen Gerät toleriert
wird, verwendet werden (z.B. 10 bis 10000 Volt, vorzugsweise 100
bis 5000 Volt). Vorausgesetzt, daß die erzeugte Wärme durch
entsprechende Kühlung
abgeführt
werden kann, können
auch höhere
Spannungen verwendet werden. Zusätzlich
kann die Spannung so programmiert werden, daß eine beliebige Spannungssignalform,
darunter Wechselstrom und Rechtecksignal, angelegt werden kann.
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Die
Kammer ist in Bezug auf die Anzahl der Unterkammern, Abmessungen
oder Formen, die je nach dem Anwendungszweck des Geräts variiert
werden können,
nicht eingeschränkt.
Die Kammer kann auch als Modul zusammen mit anderen Trennungs-,
Aufreinigungs- oder Nachweiskomponenten verwendet werden. Die die
Kammer umfassenden Teile können
aus festen Kunststoffen wie Plexiglas durch maschinelle Bearbeitung
hergestellt werden, aus einem thermoplastischen Harz geformt werden
oder nach einem beliebigen anderen geeigneten Herstellungsverfahren
produziert werden. Das Material sollte eine chemische Resistenz
gegenüber
der Analytenlösung,
dem elektrischen Strom, schwachen Säuren und Basen, Oxidantien
und so weiter aufweisen. Weiterhin kann es erwünscht sein, daß es visuell
ganz oder zumindest teilweise durchsichtig ist. Die Kammer kann
durch ein elektrisch isolierendes Substrat, das aus einem elektrisch
isolierenden Material wie einer porösen Membran, einer porösen anorganischen
Schicht, einem nichtleitenden Polymer (wie zum Beispiel Plexiglas)
oder einem Netzwerk von elektrisch isolierenden Fasern besteht,
gestützt
werden. Die Kammer kann auch ein Mittel aufweisen, das eine korrekte
Installation und Positionierung der Komponenten in der Kammer gewährleistet,
wie zum Beispiel die Verwendung eines O-Rings, um zu gewährleisten,
daß die Kammer
strömungsdicht
ist, um ein Aussickern der Analytenlösung zu verhindern, oder zum
Beispiel Schrauben, um die Wände
des Geräts
zusammenzumontieren. Weiterhin besteht die Kammer aus einem beliebigen Material,
das Spannungen aushält,
wie beispielsweise Plexiglas.
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Bei
dem chemischen Puffersystem kann es sich um ein beliebiges System,
durch das die Trennung der geladenen Verbindungen von der interessierenden
Verbindung bzw. den interessierenden Verbindungen erleichtert werden
kann, handeln. So kann es sich zum Beispiel bei dem chemischen Puffersystem
um ein Gel, am besten ein Immobilin-Gel, ein in einer Polymermatrix
verfestigtes Fluid, eine Glasfritte, eine poröse Membran, ein Filter oder
eine beliebige Kombination davon handeln. Das chemische Puffersystem
kann auch ein Mittel aufweisen, das das direkte Eindringen von geladenen
und neutralen Verbindungen in diese Kammer stoppt, wie ein schwach
adsorbierendes Material. Das chemische Puffersystem ist im besten
Fall dünn,
elektroosmosefrei und strömungsdicht.
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Bei
dem pH-Wert kann es sich um einen fixen pH-Wert oder einen pH-Gradienten
handeln. Dies kann zum Beispiel mittels kovalent gebundenen Puffermolekülen, wie
zum Beispiel Thiomorpholinderivaten oder Acrylamidderivaten, erzeugt
werden. pH-Gradienten können
durch amphotere isoelektrische immobilisierte pH-Membranen erzeugt
werden, wobei diese Membranen sehr kurze pH-Gradienten aufweisen können, die nur
ein sehr enges pH-Intervall
abdecken. Idealerweise kann dieses pH-Intervall den Grenz-pH-Wert der zu trennenden
und aufzureinigenden interessierenden Verbindung erreichen. Mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren
kann es möglich
sein, Verbindungen mit einem pI-Unterschied von bis zu einer maximalen
pI-Auflösung von
0,001 zu trennen.
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Die
hydraulische Strömung
kann durch Mittel wie Druck, Ansaugen, Zentrifugalkräfte oder
elektrische Mittel erzeugt werden. Die Richtung der hydraulischen
Strömung
befindet sich in beliebigem geeigneten Winkel in Bezug auf die Richtung
des elektrischen Stroms, am besten rechtwinklig dazu. Die Strömung kann
auf einmal erfolgen oder mittels Fluidumwälzungsschleifen umgewälzt werden.
Außerdem
kann die Strömung
auf eine Mehrzahl von Kammern verteilt sein, von denen ein Ende
mit einem einzelnen Zufluß oder
Abfluß verbunden
sein kann. Die außen
befindlichen Stromkanäle
können
noch andere Komponenten beinhalten, wie Wärmeaustauscher, Tanks, die
die Volumenkapazität
jeder Umwälzungsschleife
erweitern, sowie Meßfühler wie zum
Beispiel einen pH-Fühler,
einen Temperaturfühler
und/oder einen Lichtabsorptionsfühler.
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Die
Erfindung wird im folgenden beispielhaft mit Bezug auf die beigelegten
Abbildungen, die unten kurz beschrieben werden, genauer beschrieben.
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Kurze Beschreibung
der Abbildungen
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1.
Schematische Darstellung eines Trenngeräts, die das Aufreinigungskonzept
veranschaulicht. Kammer 1, die die aufzureinigende Lösung enthält, weist
einen Zufluß 2 und
einen Abfluß 3,
die an entgegen gesetzten Enden liegen, auf und wird von dem chemischen
Puffersystem 4 bedeckt. Die Kathode 5 und die Anode 6 werden
parallel in die Kammer eingeführt
und stehen nur mit dem chemischen Puffersystem in Kontakt. Die schwarzen
Pfeile zeigen das Eindringen von positiv geladenen Verbindungen
(zur Kathode) oder von negativ geladenen Verbindungen (zur Anode)
in das chemische Puffersystem, während
die weißen
Pfeile angeben, daß ein
Lösungsstrom
in der Kammer geführt
werden kann.
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2.
Simulationsergebnisse für
ein an die Gelmatrix angelegtes elektrisches Feld und seine Auswirkungen
auf die Lösung
für zwei
Werte für
die Leitfähigkeit σ des Gels
und der Lösung.
- A) I: Potentialverteilung in dem Gerät wenn
σ(Gel) = σ(Lösung)
II:
Stromvektoren wenn
σ(Gel)
= σ(Lösung)
- B) III: Potentialverteilung in dem Gerät wenn
10 σ(Gel) = σ(Lösung)
IV:
Stromvektoren wenn
10 σ(Gel)
= 10 σ(Lösung)
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3.
Photographie eines Prototyps des Trennungsgeräts, die eine Anordnung ähnlich wie
in 1 zeigt. Die Kammer 1 weist einen Zufluß 2 und
einen Abfluß 3 auf,
die mit Schläuchen
verbunden sind, so daß die
Analytenlösung
durch das Gerät
strömen
kann. Bei dem chemischen Puffersystem 4 handelt es sich
um ein IPG-Gel (IPG = immobilisierter pH-Gradient), das oberhalb
der Kammer angeordnet ist. Das ganze Gerät befindet sich in einem zusammengeschraubten
Plexiglasträger 8 und
seine Funktionsfähigkeit
wird durch einen O-Ring 7, der für eine dichte Abdichtung sorgt,
gewährleistet.
Die Kathode 5 und die Anode 6 werden nur mit dem
IPG-Gel in Kontakt gebracht und zwar nahe des O-Rings. Diese Elektroden
bestehen aus dünnen Platindrähten, so
daß sie über den
O-Ring geführt werden
können,
ohne daß dies
zu irgendeiner Undichtigkeit in dem Gerät führt. Quillt das Gel im Gerät erneut
an, so umgibt es die Elektroden vollständig und verhindert somit,
daß die
Analytenlösung
die Elektroden berührt.
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4.
A) Photographie eines Immobilingels bei pH = 7 ± 0,14 pH-Einheiten nach Aufreinigung
einer Lösung
von IEF-Markern in Wasser in dem Trenngerät gemäß 3 bei einstündigem Anlegen
eines elektrischen Felds mit 100 V. Die Wanderung des negativ geladenen
Proteins Phycocyanin (Bande 9) zr Anode und der positiv
geladenen Proteine wie Cytochrom c, Myoglobin und Hämoglobin
(Bande 10) zr Kathode ist in diesem Versuch mit bloßem Auge
sichtbar. B) Schematische Darstellung, die das Trennverfahren in
dem IPG-Gel beschreibt. Der Pfeil gibt die Richtung des pH-Gradienten
an (niedriger pH-Wert an der Anodenseite des Gels und hoher pH-Wert
an der Kathodenseite des Gels). Während der Trennung ist eine
Verbindung X mit einem pI-Wert, der dem pH-Wert des Teils des Gels, der in Kontakt
mit der Analytenlösung
steht, global neutral und wandert nicht. Eine Verbindung Y mit pI(Y) > pI(X) ist in dem pH-Bereich
negativ geladen und wandert zur Anode, während eine Verbindung Z mit
pI(Z) < pI(X) in
diesem pH-Bereich positiv geladen ist und zur Kathode wandert. Die
gepunkteten Pfeile geben die Wanderungs-richtung dieser verschiedenen
Verbindungen an.
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5.
Aufreinigungsversuch mit einem Abschnitt von pH 4–5,5 einer
Immobilin-„DryPlate"-Platte.
- A) Elektropherogramm einer CIEF-Analyse von IEF-Standards, wie sie
für den
Versuch verwendet werden. Die Peaks 11 bis 21 entsprechen
den Proteinen von Tabelle 1 unten.
- C) Elektropherogramm der nach dem Versuch erhaltenen Lösung, das
zeigt, daß nur
die Peaks 11 und 12 nach der Reinigung stark intensiv
bleiben.
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6.
Aufreinigung einer Mischung, die 5 unterschiedliche Proteine enthält, nämlich Trypsinhemmer (pI
= 4,6, Peak Nummer 25), β-Lactoglobulin
B (pI = 5,2, Peak Nummer 26), β-Lactoglobulin
A (pI = 5,3, Peak Nummer 27), Pferde-Myoglobin (pI = 7,0, Peak Nummer
28) sowie Pferde-Cytochrom c (pI = 9,6, Peak Nummer 29).
- A) CIEF-Analyse I) der zu reinigenden aufgetragenen
Proteinmischung; II) der Proteinlösung nach dem Trennversuch
mit einem Immobilin-Abschnitt mit einem pH-Bereich zwischen 5,06
bis 5,34.
- B) Schema für
das Trennprinzip des vorliegenden Versuchs in einem Trenngerät bei Verwendung
eines Immobilin-Gels mit einem pH-Gradienten. Das interessierende
Protein (im Schema mit A bezeichnet) weist einen pI-Wert zwischen
den Extremwerten des pH-Gradienten, also im vorliegenden Fall zwischen
pH 5 und 5,4, auf. Die in dem Schema mit B und C bezeichneten Proteine
weisen einen pI-Wert von über
5,4 bzw. unter 5,0 auf, so daß sie
in dem IPG-Gel positiv bzw. negativ geladen sind. Die gepunkteten
Pfeile zeigen die Wanderungsrichtung dieser verschiedenen Proteine,
während
die durchgezogenen Pfeile die Richtung des pH-Gradienten zwischen
dem Anodenende und dem Kathodenende des Gels (die jeweils durch
ein positiv-Zeichen bzw. ein negativ-Zeichen angegeben sind) angeben.
Bei Anlegen des elektrischen Felds wandern die Proteine des B- und
des C-Typs in das Immobilin-Gel und werden so von den Proteinen
des A-Typs getrennt.
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7.
Massenspektrum (auf der rechten Seite der Abbildung), das durch
eine einmalige Einspritzung von 2 μl einer Lösung auf 80 μM Catechin
und 20 μM
Methylenblau erhalten wurde, unter gleichzeitiger Angabe (auf der
linken Seite der Abbildung) der Entwicklung der relativen Häufigkeit
der Massen-Peaks 290,5–291,5 (Kurve
oben), des Massen-Peaks 285,5–286,5
(Kurve in der Mitte) sowie der Gesamthäufigkeit dieser beiden Peaks
(Kurve unten) im Verlauf der Zeit.
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8.
Massenspektrum (auf der rechten Seite der Abbildung), das durch
kontinuierliche Einspritzung einer gereinigten Lösung aus 80 μM Catechin
und 20 μM
Methylenblau erhalten wurde, unter gleichzeitiger Angabe (auf der
linken Seite der Abbildung) der relativen Häufigkeit der Massen-Peaks 290,5–291-5 (Kurve oben),
des Massen-Peaks 285,5–286,5
(Kurve in der Mitte) sowie der Gesamthäufigkeit dieser beiden Peaks (Kurve
unten) im Verlauf der Zeit. Diese Ergebnisse werden durch On-Line-Nachweis
der Analytenlösung,
die zuvor (ohne Rückführung) durch
die Kammer des elektrophoretischen Trenngeräts geströmt ist, erhalten (chemisches
Puffersystem: IPG-Gel mit einem pH-Wert im Bereich von 6–6,15 in
Kontakt mit der Analytenlösung; angelegtes
elektrisches Potential: 300 V, Pumpleistung 1 ml/min).
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9.
Schematische Darstellung der Anlage für die elektrophoretische Trennung
im statischen Betrieb in einem Gerät, bei dem die Zufluß- und Abflußenden vereinigt
sind, so daß die
Kammer 31 als Vorratsbehälter, der mit der Analytenlösung vor
der Reinigung beschickt bzw. von dem diese nach der Reinigung abgezogen
werden kann, verwendet wird. Die Analytenlösung steht nur mit dem chemischen
Puffersystem 32 in Kontakt, und das elektrische Potential
wird durch die Anode 33 und die Kathode 34, die
in zwei Vorratsbehälter 35 und 36 eingeführt werden,
angelegt. Der schwarze Pfeil bezeichnet die Richtung des in dem
chemischen Puffersystem erzeugten pH-Gradienten.
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10.
Photographie eines IPG-Gels nach Aufreinigung einer wäßrigen Lösung, die
300 mM Methylenblau und 10 mM Phenolrot enthält, mit einem Gerät ähnlich wie
in 9 dargestellt, sowie anschließende Bestimmung des zum Kathoden-
bzw. Anodenvorratsbehälter
gewanderten Methylenblaus (Fleck Nummer 39) und Phenolrots
(Fleck Nummer 38). Die Abbildung zeigt außerdem,
daß nach
der elektrophoretischen Trennung in dem Gelabschnitt 37,
der während
der Aufreinigung mit der Analytenlösung in Kontakt gestanden ist, keine
Farbe vorhanden ist.
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11.
Schematische Darstellung der Anlage, die für die elektrophoretische Trennung
im statischen Betrieb mit On-Line-Nachweis unter Verwendung von
zum Beispiel einem Elektrospray-Massenspektrometer verwendet werden
kann. In diesem Beispiel sitzt das Gerät in einem Plastikträger 40,
der die Kammer 41 in Kontakt mit dem chemischen Puffersystem 42 enthält. Die
Kammer besteht aus einer Reihe von drei Unterkammern 40,
bei denen die Zufluß-
und Abflußenden
vereinigt sind, so daß diese
Unterkammern als Vorratsbehälter,
die mit der Analytenlösung
vor der Reinigung beschickt werden können, verwendet werden. Zwei
zusätzliche
Vorratsbehälter 43 und 44 werden
zum Einführen
der Elektroden, die dazu dienen, das für die Durchführung der
elektrophoretischen Reinigung erforderliche elektrische Feld anzulegen,
verwendet. Die Unterkammern enthalten weiterhin ein zusätzliches
Verbindungssystem 45 (von denen nur eines dargestellt ist)
für die
Kopplung mit einem weiteren Gerät 47,
das als zusätzlicher
Trennschritt oder als Detektor dient. Die Abbildung zeigt, daß ein elektrisches
Potential zwischen die Unterkammern (oder einer vorgegebenen Position
in dem Verbindungssystem) und den Zufluß des Geräts 47 angelegt werden
kann, um den hydrodynamischen Strom der gereinigten Lösungen zu
kontrollieren und/oder um einen Elektrospray 46 zu erzeugen,
wodurch die in der gereinigten Analyselösung vorliegenden interessierenden
Verbindungen nachgewiesen werden können.
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Genaue Beschreibung
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Beispiel 1: Numerische
Simulation der Verteilung des Wanderungsstroms innerhalb des erfindungsgemäßen Geräts
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Um
die Verteilung des Wanderungsstroms in dem erfindungsgemäßen Gerät zu verstehen,
kann eine numerische Simulation mit Berechnung der finiten Elemente
durchgeführt
werden. Mit solchen Versuchen kann der Stromfluß durch das Reinigungsgerät vorhergesagt
werden. Zu diesem Zweck zeigt 1 eine schematische
Darstellung eines Beispiels eines Trennungsgeräts und erläutert das Reinigungskonzept.
In diesem Beispiel besteht das Gerät aus einer Kammer 1,
die die zu reinigende Lösung
enthält,
mit einem Zufluß 2 und
einem Abfluß 3 an
jedem Ende der Kammer, aus einem chemischen Puffersystem 4,
das mit einem Teil der Kammer in Kontakt steht, sowie aus zwei Elektroden
(einer Kathode 5 und einer Anode 6), die nur mit
dem chemischen Puffersystem in Kontakt stehen und parallel zu der
Kammer angeordnet sind. Die schwarzen Pfeile zeigen das Eindringen
von positiv geladenen Verbindungen (zur Kathode) bzw. negativ geladenen
Verbindungen (zur Anode) in das chemische Puffersystem, wenn ein
elektrisches Feld zwischen den beiden Elektroden angelegt wird,
während
die weißen
Pfeile zeigen, daß ein
Lösungsstrom
in der Kammer induziert werden kann.
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Es
wird ein Querschnitt des Geräts
bestehend aus einem chemischen Puffersystem als Abdeckung eines
Kanals simuliert, und der Wanderungsstrom wird an jedem Punkt dieses
Schnitts berechnet. Es wurden zum Beispiel zwei verschiedene Fälle in dem
Gerät simuliert,
bei denen (i) die Leitfähigkeit σ in dem Gel
und in der Lösung
identisch ist (σ
Gel = σ
Lösung)
sowie (ii) die Leitfähigkeit
in dem Gel zehnmal niedriger als in der Lösung ist (10 σ
Gel = σ
Lösung).
In beiden Fällen
wird eine Berechnung an jedem Punkt der Struktur nach der Laplace'schen Gleichung:
∇(–σ∇U) = 0 (1)unter Verwendung
der entsprechenden Bedingungen in einem zweidimensionalen System
durchgeführt:
an
der ersten Elektrode: U = 0,
an der zweiten Elektrode: U =
1,
sowie an der Isolierwand:
wobei U die Spannung (V)
und σ die
elektrische Leitfähigkeit
(ohm
–1·m
–1)
bedeuten.
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Für die Potentialverteilung
wird ein stationärer
Algorithmus verwendet. Die Simulationen können mit einer im Handel erhältlichen
Finite-Elemente-Software, nämlich
Flux Expert® (Simulog,
Frankreich) auf einer Unix-Workstation (Silicon Graphics Indigo
2 Solid Impact 10000 mit 640 Mb RAM) durchgeführt werden.
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Das
Ziel dieser Simulationsversuche besteht darin, anzuzeigen, ob die
geladenen Verbindungen in das chemische Puffersystem wandern oder
nicht, sowie darin, den Einfluß der
Leitfähigkeit σ auf die
Wanderung bzw. anders ausgedrückt
die Auswirkung der Pufferzusammensetzung in der zu reinigenden Lösung nachzuweisen.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
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Im
ersten Fall (2A) soll σ im chemischen
Puffersystem und in der Analytenlösung gleich sein (σGel = σLösung).
Zwischen den beiden Elektroden wird eine Potentialdifferenz angelegt,
wodurch die Potentialverteilung vorhergesagt werden kann. Abbildung
2AI zeigt, daß die
Potentialverteilung in der Lösung, die
dem Abschnitt unter dem Gel entspricht, der Potentialverteilung
in dem chemischen Puffersystem sehr ähnlich ist. In dem chemischen
Puffersystem wird auch ein Potentialgradient erzeugt, der zu einer
Vorwanderung der Proteine in der Lösung, und zwar in Abhängigkeit
von ihrer Ladung, führen
kann. Wie in Abbildung 2AII dargestellt, zeigen die Stromvektoren,
daß der
Strom ebenfalls durch die Lösung
transportiert wird. Die Vektoren sind in der Mitte der Struktur ähnlich und
führen
zu einem gleichen Stromfluß.
An der Grenzfläche
zwischen dem chemischen Puffersystem und der Lösung wird deutlich gezeigt,
daß ein
Stromfluß von
der Lösung
zu dem chemischen Puffersystem stattfindet.
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Im
zweiten Fall (2B) ist die Leitfähigkeit
der Lösung
verstärkt.
Sie wird als 10mal höher
in der Analytenlösung
als in dem Gel angenommen (10 σGel = σLösung).
Das Ergebnis dieses Versuchs lautet, daß der Potentialgradient in
der Lösung
weniger wirksam ist (siehe Abbildung 2BIII), daß jedoch mehr Strom in der
Lösung
als in dem chemischen Puffersystem transportiert wird (siehe Abbildung
2BIV). Wie in dem ersten Fall kann auch nachgewiesen werden, daß ein Stromfluß von der
Lösung
zum chemischen Puffersystem stattfindet, wodurch die Proteine durch
Migration von der Lösung
in das chemische Puffersystem eindringen können.
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Anhand
dieser beiden Versuche läßt sich
das Prinzip des erfindungsgemäßen Trennungs-
und Reinigungsgeräts
nachweisen. Auch dann, wenn das Potential nur an das chemische Puffersystem
angelegt wird, wird durch dieses Potential auch die angrenzende
Analytenlösung
beeinflußt,
und eine Wanderung der geladenen Verbindungen (zum Beispiel der
Proteine) wird induziert. Die beiden Fälle unterscheiden sich nur
aufgrund ihrer Wirksamkeit. In dem zweiten Fall wird eine höhere Leitfähigkeit,
die zum Beispiel einer gepufferten Proteinlösung entspricht, betrachtet,
was sicherlich für
die Proteinstabilität
und dann, wenn die Ladung mancher Proteine für einen isoelektrischen Trennungsversuch
vorgewählt
werden müssen,
wünschenswerter
ist. Andererseits ist es klar, daß in dem ersten Fall die Proteinwanderung
und damit auch die Wirksamkeit des Reinigungsgeräts begünstigt wird, da beinahe 100%
des Stroms von Proteinen in zum Beispiel einer nichtgepufferten
Lösung
(mit Wasser verdünnte
Probe) getragen wird.
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Beispiel 2: Elektrophoretische
Trennung und Reinigung in einer ungepufferten Lösung
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Für den Nachweis
einer elektrophoretischen Trennung und Reinigung von verschiedenen
Lösungen wurden
die folgenden Versuchsbedingungen angewandt:
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Reagenzien
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Ein
IEF-Proteinmarker-Standard ist von BioRad (Herkules, USA) erhältlich.
Pferde-Cytochrom c, β-Lactoglobulin
A und B, Trypsinhemmer und Pferde-Myoglobin sind von Sigma erhältlich.
Immobilin-DryPlates,
pH-Bereich (4,4–5,4
und 4–7,
11 cm) sind von Pharmacia Amersham erhältlich. Alle Reagenzien für die kapillar-isoelektrische
Fokussierung (CIEF) sind von BioRad erhältlich.
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Versuchsanordnung
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Ein
Plastikhalter kann so konstruiert werden, daß die zu reinigende Lösung durch
das Gerät,
das die Kammer, die mit dem chemischen Puffersystem (das im vorliegenden
Fall ein Immobilin-Gel ist) in Kontakt ist, enthält, gepumpt werden kann. 2 zeigt
ein Photo eines Prototyps des Trennungs- und Reinigungsgeräts mit solch
einer Anordnung. Die Kammer 1 weist einen Zufluß 2 und
einen Abfluß 3 auf,
die mit Teflonschläuchen
und einer Schlauchquetschpumpe (nicht gezeigt) verbunden sind, um
die Analytenlösung
durch das Gerät
fließen
zu lassen. Bei dem chemischen Puffersystem 4 handelt es
sich um ein Gel mit immoblisiertem pH-Gradienten (IPG-Gel), das
oberhalb der Kammer angeordnet ist. Das gesamte Gerät wird in
einem zusammengeschraubten Plastikträger 8 gehalten; ein
O-Ring 7, der dicht abschließt, sorgt dafür, daß es wasserdicht ist.
Die Kathode 5 und die Anode 6 werden so angeordnet,
daß sie
nur mit dem IPG-Gel in Kontakt stehen, und zwar nahe bei dem O-Ring.
Diese Elektroden bestehen aus dünnen
Platindrähten,
so daß sie
oberhalb des O-Rings so eingebaut werden können, daß es zu keiner Undichtigkeit
in dem Gerät
kommt. Beim erneuten Quellen des Gels in dem Gerät umschließt das Gel die Elektroden vollständig und
verhindert, daß die
Analytenlösung
die Elektroden berührt.
Das erneute Quellen des Gels kann in 1 Stunde bis über Nacht
in Wasser oder in dem Puffersystem, in dem der Reinigungsversuch
durchgeführt
werden kann, erreicht werden.
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Reinigung
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Die
unterschiedlichen Proteinlösungen
(Gesamtvolumen 1 ml) können
dem Gerät
mit der Membranquetschpumpe zugeführt werden. Vor dem Versuch
kann die Lösung
mindestens 2 Minuten lang umgewälzt werden
und eine 100-μl-Probe
kann für
die CIEF entnommen werden. Dann kann mit einem Hochspannungs-Netzgerät (Spellmann,
CZE1000, New York, USA) je nach Versuch eine konstante Spannung
von 30–100
V angelegt werden. Stromstärke
und Spannung können
mit einem mittels Digital-PC betriebenen LabVIEW-5-Programm und
einer Datenerfassungs-Schaltplatte (Lab PC+, National Instruments,
USA) erfaßt
werden.
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Kapillar-isoelektrische
Fokussierung (CIEF)
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Für die CIEF-Analyse,
bei der Kapillaren mit BioCap-XL-Beschichtung
(ID 50 μm,
BioRad) verwendet werden, kann ein Gerät des Typs Biofocus 3000 (BioRad,
Hercules, USA) verwendet werden. Die Proteinproben können in
Ampholyten (Bio-Lyte, BioRad) verdünnt und mit BioRad-IEF-Katholyt, -Anolyt
und -Mobilisator untersucht werden. Falls erforderlich können die
Proben vor der Verdünnung
mit den Ampholyten mit 5-kDa-Filtern der Fa. Biomax (Millipore,
Bedford, Massachusetts, USA) ultrazentrifugiert werden, um eine
ausreichende Proteinkonzentration für die CIEF-Analyse sicherzustellen.
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Photographie
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Digitalphotos
der getrockneten Immobilin-Gele und des Geräts nach den Versuchen können mit
einer Digitalkamera (Fuji MX-700, Fuji Photo Film, Tokio, Japan)
aufgenommen und mit Adobe-Photoshop-Software behandelt werden.
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Beispiel 2.1: Trennung
von Proteinmarkern bei pH 7
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Um
die Proteinwanderung, wie sie bei der Simulation des ersten Falls
von Beispiel 1, wo die Leitfähigkeit
des Gels und der Lösung
identisch sind, vorhergesagt wurde, nachzuweisen, kann ein Immobilin-Gel
mit einem pH-Bereich zwischen 6,9–7,1 in einen Prototyp des
erfindungsgemäßen Geräts eingebaut
werden (siehe 3).
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Tabelle
1. Proteine in der IEF-Marker-Standardlösung von BioRad mit ihrem entsprechenden
pI-Wert und ihrer entsprechenden Farbe.
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Eine
Lösung
der Protein-IEF-Marker in Wasser (Konzentration ungefähr 150 mg/ml,
Proteinzusammensetzung siehe Tabelle 1) kann auf das Gerät gemäß 3 aufgetragen
und mit einer Schlauchquetschpumpe bei einer konstanten Pumpenleistung
(0,6 ml/min) durch dieses Gerät
umgewälzt
werden. Eine Photographie des Immobilin-Gels nach einstündiger Reinigung
bei Anlegung eines elektrischen Potentials von 100 V ist in 4 dargestellt.
Für diesen
Versuch weist derjenige Teil des IPG-Gels, der mit der Analytenlösung in
Kontakt steht, einen pH von 7 ± 0,14
auf. Diese Abbildung zeigt eine blaue Bande 9, die die
Wanderung des blaugefärbten
Proteins Phycocyanin zur Anode anzeigt, sowie eine braune Bande 10,
die das zu der Kathode wandernde Cytochrom c, Myoglobin bzw. Hämoglobin
anzeigt.
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Die
Proteine sind zu Banden, die einen elektrophoretischen Fokussierungsmechanismus
nachweisen, konzentriert. Dies zeigt deutlich, daß eine Wanderung
der Proteine von der Lösung
in das Gel induziert wird, obwohl das elektrische Potential von
Elektroden, die nur mit dem Gel in Kontakt stehen, angelegt wird.
Dies bestätigt
auch empirisch, daß die
zuvor genannten Simulationsdaten mit dem Versuch übereinstimmen.
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Beispiel 2.2: Aufreinigung
von beta-Lactoglobulin B und Phycocyanin aus einer IEF-Markerlösung
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In
einem weiteren Versuch wird die Aufreinigung einer Lösung, die
aus den IEF-Markerproteinen gemäß Tabelle
1 besteht, mit einem Gel im pH-Bereich 4–5,5, wobei der pH-Gradient
parallel zu den Platinelektroden verläuft, gezeigt. Eine CIEF-Analyse
wird vor und nach dem Aufreinigungsversuch (Pumpenleistung 0,6 ml/min,
konstante Spannung = 50 V) durchgeführt. Wie in 5 dargestellt,
ergibt der Vergleich der beiden Elektropherogramme, daß die Proteine
der ursprünglichen
Analytenlösung
mit pI-Werten höher
als 5,5 in das Gel gewandert sind, während beta-Lactoglobulin B und Phycocyanin (Peak 11 bzw. 12)
noch nach der elektrophoretischen Reinigung in der Lösung verbleiben.
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Ein
einfacher Vergleich kann auch visuell durchgeführt werden. Die Lösung vor
dem Versuch ist grün (Farbe
der komplexen Lösung
der IEF-Marker), während
die Lösung
nach der Reinigung blau ist (was der Farbe von Phycocyanin entspricht).
Außerdem
zeigt das Gel nur auf der Kathodenseite eine braune Färbung, was den
positiv geladenen Proteinen, die zu dieser Seite wandern, entspricht.
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In
diesem Versuch wird nachgewiesen, daß eine Analytenlösung, die
interessierende Verbindungen enthält, dadurch gereinigt werden
kann, daß man
mit einem erfindungsgemäßen Gerät und Verfahren
geladene Verbindungen daraus entfernt.
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Beispiel 2.3: Aufreinigung
von beta-Lactoglobulinen A und B
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Eine
Proteinlösung,
die aus fünf
Proteinen mit bekannten isoelektrischen Punkten besteht (Trypsininhibitor
(pI = 4,6), beta-Lactoglobulin A (pI = 5,3), beta-Lactoglobulin
B (pI = 5,2), Pferde-Myoglobin
(pI = 7,0), Cytochrom c (pI = 9,6), bei einer Konzentration von
200 μg/ml
in Wasser, mit Ausnahme des Trypsinhemmers, der in einer Konzentration
von 50 μg/ml
in Wasser vorliegt), wird auf das Gerät gemäß 3 aufgetragen, welches
ein mit Wasser rehydratisiertes Immobilin-Gel im pH-Bereich von
5 bis 5,4 enthält.
Wie in dem Schema des Trennungsverfahrens gemäß 6B dargestellt,
besteht das Ziel dieses Versuchs darin, die in Lösung befindlichen beta-Lactoglobuline
A und B zu gewinnen. Zu diesem Zweck beruht die Reinigung auf dem folgenden
Prinzip: Proteine mit 5,0 < pI < 5,4 sind entweder
in dem Gel in der Nähe
der Kathode negativ geladen und werden abgestoßen (pH im Gel > pI), wie dies durch
die Proteine des Typs A in 6B veranschaulicht
wird. An dem stärker
sauren Gelende in der Nähe
der Anode sind diese Proteine des Typs A positiv geladen (pH im
Gel < pI) und werden
wiederum abgestoßen.
Auf diese Weise können
sie nicht aus der Analytenlösung
entfernt werden. Alle anderen Proteine mit pI > 5,4 sind positiv geladen und werden von
der Kathode angezogen (Proteine des Typs B in 6B),
während
alle Proteine mit pI < 5,0
von der Anode angezogen werden (Proteine des Typs C in 6B). Diese letztgenannten beiden Verbindungstypen
werden also bei der elektrophoretischen Trennung der Analytenlösung in
das IPG-Gel extrahiert.
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Die
Elektropherogramme der Lösung
der fünf
oben genannten Proteine werden vor und nach der Reinigung untersucht,
und die in den 6A I und II dargestellten
Ergebnisse zeigen, daß die
Proteine Trypsinhemmer, Pferde-Myoglobin und Pferde-Cytochrom c
nach der Reinigung beinahe vollständig verschwunden sind, während die
beiden beta-Lactoglobuline in der Lösung verbleiben. Dies ist ein
eindeutiger Beweis für
das auf der erfindungsgemäßen isoelektrischen
Trennung beruhende Reinigungsprinzip.
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Ein
Vorteil des gemäß der vorliegenden
Erfindung beanspruchten Geräts
besteht darin, daß die
aufzureinigenden Proteine in geringstmöglichem Kontakt mit der Immobilin-Matrix
stehen, was mögliche
Auswirkungen, die die Polyacrylamidmatrix auf die Proteine ausüben könnte, reduziert.
Sie können
für die
weitere Analyse leicht in Lösung
gewonnen werden. Es muß keine
Extraktion mit Chemikalien durchgeführt werden, was die Einwirkung
der Chemikalien auf das interessierende Protein auf ein Minimum
beschränkt.
Diese Tatsache führt
auch zu einer kürzeren
Aufreinigungszeit. Es konnte hier gezeigt werden, daß die Aufreinigung
von Mengen im Mikrogrammbereich in 1 Stunde durchgeführt werden
kann. Bei Verwendung eines Kühlgeräts oder
einer unterschiedlichen Geometrie, die einen geringeren Stromfluß durch
das Gerät
gewährleistet,
kann dies weiter verbessert werden. Somit wäre ein Anlegen eines höheren elektrischen
Potentials möglich.
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Beispiel 3: Elektrophoretische
Trennung in gepufferter Lösung
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Um
die Simulation des zweiten Falls des Simulationsversuchs gemäß Beispiel
1, wo die Leitfähigkeit des
Gels zehnmal niedriger ist als die Leitfähigkeit der Lösung, zu
prüfen,
wird die Proteinmarkerlösung
gemäß Tabelle
1 auf einen gegebenen pH-Wert eingestellt. Für diesen Zweck wird ein Acetatpuffer
(0,01 M) mit einem pH-Wert von 4,6 verwendet. Dieser pH-Wert entspricht
dem pI-Wert von Phycocyanin, das in dem IEF-Marker-Standard vorliegt
(siehe Tabelle 1). Der pH-Bereich des Gels schwankt zwischen 4,5–4,58 und
4,58–4,66. Bei
diesen Versuchen wird die Stromstärke konstant auf 300 μA eingestellt,
was die Obergrenze des Netzgeräts
darstellt. Es wurde nachgewiesen, daß die Spannung nie 30 V übersteigt.
Nachdem das elektrische Potential mehrere Stunden lang angelegt
worden ist, ist nur sehr wenig Protein in dem Gel sichtbar (Ergebnisse nicht
dargestellt). Diese Proteine sind sehr diffus und nicht wie bei
oben genannten Versuchen zu einer Bande fokussiert. Außerdem findet
eine verstärkte
Blasenbildung statt, wodurch das Gel in dem Gerät etwas zerstört wird.
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Aus
diesen Versuchen geht eindeutig hervor, daß die Proteine wesentlich schlechter
wandern, wenn die Probenlösung
gepuffert ist. Es ist klar, daß durch
die puffernden Ionen mehr Strom übertragen
wird, wenn deren Konzentration im Vergleich zur Konzentration der
Proteinmischung hoch ist. Im Gegensatz dazu wird der Strom hauptsächlich von
den Proteinen selbst transportiert, wenn diese nur in Wasser vorliegen.
Dies begünstigt
die Proteinwanderung und daher die Trennleistung des Geräts. Obwohl
Wasser nicht das günstigste Analytenlösungsmittel
für Proteine
darstellt, ist bei dem oben genannten Verfahren keine Zugabe von
Pufferionen oder Ampholyten für
die Verbesserung der isoelektrischen Trennung erforderlich. Aus
praktischer Sicht erleichtert dies den Trennungsvorgang wesentlich.
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Beispiel 4: Mit online-massenspektrometrischem
Nachweis gekoppelte elektrophoretische Aufreinigung
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Um
die interessierende(n) Verbindung(en) online nachzuweisen, kann
ein Gerät ähnlich wie
in 3 dargestellt mit einem Massenspektrometer (LCQ-DUO,
Finnigan) gekoppelt werden. Zu diesem Zweck kann eine Mischung von
80 μM Catechin
und 20 μM
Methylenblau mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min (mit einer Schlauchquetschpumpe
der Fa. Ismatec) durch das Elektrophoresetrenngerät gepumpt
werden. Das Gerät enthält ein chemisches
Puffersystem, das aus einem IPG-Gel mit einem pH-Wert von 5,5 bis
6,5 besteht, so daß derjenige
Teil des Gels, der mit der Kammer in Verbindung steht, einen pH-Bereich
von 6–6,15
aufweist. Das Abflußende
der Kammer ist über
Schläuche
mit dem Einspritzsystem eines LCQ-DUO-Massenspektrometers verbunden,
um die Lösung
online zu analysieren.
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Catechin
ist ein gut bekannter Massenmarker, der zwischen pH 6 und 6,15 neutral
ist, während
Methylenblau immer als Kation vorliegt. Fließt diese Mischung in das erfindungsgemäße Gerät, so wird
beim Anlegen eines elektrischen Potentials (zum Beispiel 300 V)
das Methylenblau aus der Analytenlösung extrahiert und dringt
in das IPG-Gel ein. Auf diese Weise wird das Methylenblau aus der
Lösung
entfernt und das Catechin aufgereinigt. Dies geht aus den 7 und 8 hervor,
die das Massenspektrum der Analytenlösung vor bzw. nach der elektrophoretischen
Aufreinigung zeigen. Zu diesem Zweck wurden die Ergebnisse von 7 mit
1 μl der
Ausgangs-Analytenlösung
erzielt, die von einer Spritze in das Massenspektrometer im APCI-Modus
(APCI = atmospheric pressure chemical ionisation) mit Stickstoff
als Mantelgas unter den folgenden Arbeitsbedingungen mittels Elektrospray
eingespritzt wurde: Spannungsquelle: 3,82 kV; Stromquelle: 5,4 mA; Verdampfertemperatur:
450°C; Mantelgas-Durchflußmenge:
79,9 psi; Kapillarspannung: 4,6 V und Kapillartemperatur: 200°C. Das erhaltene
Spektrum weist zwei sehr stark ausgeprägte Peaks bei einem Masse/Ladungs-Verhältnis (m/z-Verhältnis) von
286,3 bzw. 291 auf, was Methylenblau bzw. Catechin entspricht. Die
Intensität
des Peaks bei m/z = 291 beträgt
nur ungefähr
60% der Peak-Intensität
bei m/z = 286,3, was der höheren
Methylenblaukonzentration in der Analytenlösung entspricht. Nach der elektrophoretischen
Reinigung der Analytenlösung
weist das Massenspektrum gemäß 8 eine ähnliche
Form auf, die relative Größe der Peaks
wird jedoch beinahe gleich (die Intensität des Peaks bei m/z = 291 beträgt 94% der
Peakintensität
bei m/z = 286,3). Der Versuch kann weitergeführt werden, und die Entwicklung
der relativen Größe der beiden Peaks
im Verlauf der Zeit zeigt, daß die
Intensität
des Peaks bei m/z = 291 ungefähr konstant
bleibt, während die
Peak-Intensität
bei m/z = 286,3 innerhalb von weniger als zwei Minuten von 100%
auf weniger als 40% abnimmt.
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Diese
Ergebnisse zeigen deutlich, daß die
Analytenlösung
entsprechend der blauen Methylenblaubande, die in dem Gel in der
Nähe der
Kathode beobachtet werden kann, gereinigt worden ist. Die Länge der Kammer
(ungefähr
3 cm) reicht nicht aus, um das Methylenblau vollständig aus
der Analytenlösung
zu entfernen, die Abmessung der Kammer, die Durchflußmenge der
Analytenlösung,
sowie der Wert des elektrischen Felds kann jedoch dahingehend optimiert
werden, daß eine
vollständige
Aufreinigung erzielt werden kann.
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Dieser
Versuch zeigt deutlich, daß das
erfindungsgemäße Gerät für einen
Online-Nachweis der aufgereinigten Lösung mit einem Massenspektrometer
gekoppelt werden kann. Auf diese Weise kann leicht eine weitere
Auftrennung bzw. ein weiterer Nachweis der gereinigten Lösung durchgeführt werden.
Bei gewissen Anwendungen können
die aufgereinigten Fraktionen auch in einem anderen Träger für die weitere
Analyse aufgefangen werden, wie zum Beispiel einer MALDI (matrix
assisted laser desorption ionisation)-Platte.
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Beispiel 5: Elektrophoretische
Reinigung von Isoformen
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Um
zu zeigen, daß Proteinisoformen
getrennt und aufgereinigt werden können, ist N-Acetyl-Eglin C mittels
DNA-Rekombinationstechniken erhältlich
und enthält
zwei Isoformen (eine im basischen pH-Bereich und eine im sauren
pH-Bereich).
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Eine
wässrige
Lösung
von 1 mg/ml N-Acetyl-Eglin C kann in dem erfindungsgemäßen Gerät umgewälzt und
1 Stunde konstant bei 1000 Volt an einem Gel mit immobilisiertem
pH-Gradienten bei pH 5,5 (dem pI-Wert von N-Acetyl Eglin C) laufengelassen
werden.
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Resultate,
welche mit einem traditionellen CIF-Gerät (CIF = capillary isoelectric
focusing, kapillare isoelektrische Fokussierung) (Biofocus, Bio-Rad)
erzielt werden können,
zeigen, daß die
aufzureinigende Analytenlösung
einen Peak nach 26,86 Min. (der der basischen Isoform mit pI 6,2
entspricht: 4,86%), einen Hauptpeak nach 29,56 Min. (der Eglin C
entspricht: 90,18%) sowie einen Peak nach 31,52 Min. (der der sauren
Isoform mit pI 5,2 entspricht: 4,94%) aufweist. Nach Trennung und
Reinigung gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
weist die gereinigte Lösung
einen sehr kleinen Peak, der einer Spur der basischen Isoform bei
26,38 Min. entspricht und einen Peak bei 29,57 Min. (97,88%), der
der Hauptkomponente N-Acetyl-Eglin C entspricht, auf. Es liegt kein
Peak, der der sauren Isoform entspricht, vor, was die Abtrennung
und Reinigung von der Isoform und die Anreicherung der Hauptkomponente
belegt.
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Beispiel 6: Elektrophoretische
Aufreinigung in statischer Fahrweise
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Für gewisse
Anwendungen kann es vorteilhaft sein, die Analytenlösung ohne
hydraulischen Fluß aufzureinigen.
In diesen Fällen
erfordert das erfindungsgemäße Gerät keine
Kammer mit Zufluß-
und Abflußenden,
sondern nur einen Vorratsbehälter
zum Beschicken mit der bzw. zum Abziehen der Analytenlösung.
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Dies
ist in 9 dargestellt, die eine schematische Darstellung
der für
die elektrophoretische Trennung in statischer Fahrweise verwendeten
Anlage zeigt, wobei der Zufluß und
der Abfluß vereinigt
sind, sodaß die
Kammer 31 als Vorratsbehälter dient, welcher vor der
Reinigung mit der Analytenlösung
beschickt bzw. aus dem die Analytenlösung nach der Reinigung abgezogen
werden kann.
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Die
Analytenlösung
steht nur mit dem chemischen Puffersystem 32 in Kontakt,
und das elektrische Potential wird durch die Anode 33 und
die Kathode 34, die in die zwei Vorratsbehälter 35 bzw. 36 eintauchen, angelegt.
Der schwarze Pfeil gibt die Richtung des in dem chemischen Puffersystem
erzeugten pH-Gradienten an.
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Zum
Nachweis der Trennung mit solch einem erfindungsgemäßen Gerät kann man
ein Elektrophoresetrenngerät ähnlich wie
in 9 dargestellt herstellen, das ein als chemisches
Puffersystem dienendes IPG-Gel (IPG = immobilisierter pH-Gradient)
sowie eine Kammer, welche drei Unterkammern beinhaltet, die aus
kleinen Plastikschläuchen
bestehen, welche oben auf dem IPG-Gel angebracht und in Richtung
des pH-Gradienten angeordnet sind. Wie schematisch in 9 dargestellt
kann die mittlere Unterkammer mit der Analytenlösung beschickt werden, während die
beiden anderen Unterkammern mit Wasser gefüllt werden und jeweils eine
Elektrode enthalten um so als Kathoden- bzw. Anodenvorratsbehälter zu
dienen. Auf diese Weise stehen die Elektroden nicht direkt in Kontakt
mit der Analytenlösung.
Das elektrische Feld muß das
IPG-Gel durchtrennen und ein Teil des elektrischen Felds dringt
in die Unterkammer, die die zu reinigende Analytenlösung enthält, ein.
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Um
die Trennung und Aufreinigung einer Analytenlösung mittels solch einer Anordnung
eines Elektrophoresegeräts
zu beweisen, kann ein Immobilin-Gel
(pH-Bereich 4–7) über Nacht
bei Raumtemperatur in Wasser erneut quellen gelassen werden. Drei
Plastiknäpfchen
(Durchmesser 1 cm) mit Ausnehmungen (Durchmesser 0,8 cm), die unten
offen sind, können
auf das IPG-Gel auf die Linie mit pH 4,5, pH 5,5 bzw. pH 6 gelegt werden.
Dann können
einhundert μl
einer wäßrigen Lösung mit
einer Konzentration von 300 μM
Methylenblau und 10 mM Phenolrot in das mittlere Näpfchen,
das mit dem Gel bei pH 6 in Kontakt steht, gegeben werden. In das
rechte und linke Näpfchen,
die jeweils mit Wasser gefüllt
sind, können
zwei Platinelektroden gesteckt werden.
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Unter
diesen Bedingungen sind beide Verbindungen über den gesamten von dem IPG-Gel
vorgegebenen pH-Bereich geladen, da Methylenblau ein permanentes
Kation ist und Phenolrot unter seinem pKa, der einen Wert von 7,81
aufweist, negativ geladen ist. Methylenblau weist eine blaue Färbung auf,
während
Phenolrot in seiner anionischen Form gelb ist, so daß die Extraktion
von beiden Analyten aus der Analyten-Unterkammer in das IGP-Gel
beim Anlegen eines elektrischen Potentials leicht identifiziert
werden kann. Beim Anlegen einer konstanten Spannung (500 V) zwischen
den beiden Platinelektroden mit einem Hochspannungs-Netzgerät (Landis & Gyr) sieht man
nämlich,
daß das
Methylenblau zur Kathode wandert, während Phenolrot zur Anode wandert.
Nachdem eine Stunde lang aufgereinigt wurde, wird mit einer numerischen
Kamera (Camedia C-2020 Z – Olympus)
ein Digitalphoto des Gels aufgenommen und mit Camedia-Software von Olympus
entwickelt. Dieses Photo des IPG-Gels,
das in 10 dargestellt ist, zeigt, daß die Reinigung
vollständig ist,
und zwar aufgrund der Tatsache, daß der Vorratsbehälter in
der Mitte farblos ist (keine Farbe im Abschnitt 37 des
Gels, der mit dem Analytenvorratsbehälter in Kontakt gestanden ist),
während
der Abschnitt des Gels unter dem Anodenvorratsbehälter gelb
(Fleck 39 in 10) und derjenige unter dem
Kathodenvorratsbehälter
blau ist (Fleck 39 in 10).
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Diese
Ergebnisse zeigen deutlich die Effizient des erfindungsgemäßen Verfahrens,
auch dann, wenn in der aufzureinigenden Analytenlösung keine
Strömung
induziert wird. Es kann jedoch eine Schüttelbewegung in den Unterkammern
oder im gesamten Gerät
induziert werden, um die Konvektion zu verstärken. Da die Trennungseffizienz
und -geschwindigkeit von der Wanderung der geladenen Verbindung
in der Analytenlösung
abhängt,
kann es vorteilhaft sein, die Bildung von Konzentrationsgradienten
zu vermeiden und so die Homogenität der Analytenlösung sicherzustellen.
Für gewisse
Anwendungen, wie die Proteinaufreinigung, kann es auch vorteilhaft
sein, die Temperatur der Unterkammern zu steuern und Mittel zur
Vermeidung von Niederschlagsbildung hinzuzufügen (zum Beispiel durch Behandeln
der Unterkammern mit Ultraschall).
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An
dieser Stelle ist zu erwähnen,
daß die
Lösungen
im Anoden- und Kathodenvorratsbehälter am Ende der Reinigung
leicht gefärbt
sein können.
Dies zeigt an, daß ein
Teil des Methylenblaus und ein Teil des Phenolrots aus dem IPG-Gel
in den Anoden- bzw. Kathodenvorratsbehälter extrahiert worden sind,
wodurch die Verbindungen, die aus der Analytenlösung in das chemische Puffersystem
extrahiert worden sind, in Lösung
gewonnen werden können.
Dies kann für
verschiedene Anwendungen nützlich
sein und zeigt einen Grund, mehrere Unterkammern in dem Trenngerät anzuordnen,
um verschiedene gereinigte Fraktionen auffangen zu können, wie
dies in gewissen Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung angegeben ist.
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Ein
Beispiel für
ein Aufreinigungsgerät,
das mehrere Unterkammern enthält,
ist in 11 dargestellt, bei der es sich
um eine schematische Darstellung der Anordnung, die für die elektrophoretische
Trennung bei statischer Fahrweise mit Online-Nachweis oder Kopplung
mit einem weiteren Trennungsschritt verwendet werden kann, handelt.
In dieser Darstellung wird das Gerät in einem Plastikträger 40,
der die Kammer 41 in Kontakt mit dem chemischen Puffersystem 42 enthält, gehalten.
Die Kammer besteht aus mehreren Unterkammern 41, bei denen
Zufluß-
und Abflußenden
vereinigt sind, so daß diese
Unterkammern als Vorratsbehälter, welche
vor der Aufreinigung mit der Analytenlösung beschickt bzw. aus welchen
die Analytenlösung
nach der Aufreinigung abgezogen werden kann, verwendet werden. Es
sind hier nur drei Unterkammern dargestellt, die Anzahl, Anordnung
und Form dieser Unterkammern ist jedoch nicht beschränkt. Für das Einführen der
Elektroden, die zum Anlegen des für die Durchführung der
elektrophoretischen Reinigung erforderlichen elektrischen Felds
dienen, werden zwei zusätzliche
Vorratsbehälter 43 und 44 verwendet.
Die Unterkammern enthalten auch ein zusätzliches Verbindungssystem 45 (nur
eines gezeigt) zur Kopplung mit einem weiteren Gerät 47,
das als zusätzlicher
Reinigungsschritt oder als Detektor dient. Die Abbildung zeigt,
daß zwischen
den Unterkammern (oder einer vorgegebenen Position im Verbindungssystem)
und dem Zufluß des
Geräts 47 ein elektrisches
Potential angelegt werden kann, um den hydrodynamischen Fluß der gereinigten
Lösungen
zu steuern und/oder um ein Elektrospray 46 zu erzeugen,
wodurch interessierende Verbindungen, die in der gereinigten Analyselösung vorliegen,
nachgewiesen werden können.
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Schließlich erleichtert
die Gewinnung der interessierenden Verbindung(en) in Lösung weitere
Trennungs-, Reinigungs- und/oder Nachweisschritte wesentlich. Zu
diesem Zweck können
die Unterkammern der in den vorliegenden Versuchen beschriebenen
Geräte
eine Verbindung (wie zum Beispiel eine Öffnung, eine Rille, einen dichten
Schlauch, eine Kapillare, einen dichten Mikrokanal oder ein beliebiges
sonstiges Kopplungssystem) enthalten, mit dem die gereinigte Lösung online
in ein anderes Nachweissystem eingebracht oder eingespritzt werden
kann (siehe zum Beispiel 11). Solch
ein System läßt sich
mit einem traditionellen Flüssigkeitschromatographen
veranschaulichen, der zum Beispiel dazu verwendet wird, um einen
Zellextrakt, der nach dem erfindungsgemäßen Elektrophoreseverfahren
gereinigt worden ist und der verschiedene interessierende Verbindungen,
die einzeln identifiziert werden müssen, enthält, weiter aufzutrennen. Auf ähnliche
Weise können
Unterkammern des vorliegenden Geräts zum Beispiel direkt mit
einem Massenspektrometer gekoppelt werden (wobei eine direkte Probenahme
mittels Ansaugen oder mechanischem oder elektrokinetischem Pumpen
erfolgt), wobei die interessierende(n) Verbindung(en) online identifiziert
werden kann bzw. können.
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Obwohl
die obige Erfindung zum besseren Verständnis einigermaßen genau
durch Abbildungen und Beispiele beschrieben worden ist, wird dem
Fachmann angesichts der Lehren der vorliegenden Erfindung leicht
klar werden, daß gewisse
Veränderungen
und Modifikationen durchgeführt
werden können,
ohne vom Umfang der beigelegten Ansprüche abzuweichen.
