JP2003532894A - 化合物の電気泳動分離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 分析物溶液中の荷電及び中性化合物の電気泳動分離及び精製のための装置、方法及びキット。装置には、少なくとも１つの壁が化学的緩衝システム（４）で構成された１つのチャンバ（１）が含まれる。電位差がこの緩衝システムを横断して適用され、結果として荷電と中性化合物は、緩衝システム内への荷電化合物の抽出によって示差的に分離される。該装置は同様に、好ましくは両性電解質を含まないか又は緩衝液を含まない溶液の中で分離した化合物を収集するための手段、及び任意には分離された画分を再循環させるための手段を含んで成る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の技術分野 本発明は、溶液からの化合物の電気泳動分離、精製及び回収に関する。

【０００２】 背景技術 生体標本といったような複合混合物は、さらなる分析のために分離され同定さ
れる必要のある最高３万もの異なるタンパク質を含有する可能性がある。プロテ
オーム分析において、複合タンパク質混合物の高分解能分離には、分離時間を最
小限にし、使用が容易で、高い純度を結果としてもたらし、かつ不要な付加的な
精製段階なく標本から抽出された問題の化合物（単複）のさらなる分析を可能に
する新規の技術を開発することが必要とされる。

【０００３】 ２次元ゲル電気泳動は、かかる複合生体標本を分離する能力をもつ１つの技術
である（Wilkins, M.R. et al., プロテオーム研究：機能的ゲノミクスにおける
新たな開拓領域；Springer, １９９７）。２次元ゲル電気泳動では、タンパク質
はまず最初に、それらの等電点に従って等電点電気泳動（ＩＥＦ）段階により分
離される。第２に、タンパク質はポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
段階によりその分子質量の関数として分離される。その結果は、各々の可視スポ
ットが特定のタンパク質に対応する２次元画像である。タンパク質のさらなる分
析、例えばペプチド組成物又は生物活性の分析が必要とされる場合には、タンパ
ク質は、所望の情報を得るために適切な方法で分析されうるようになる前に、ま
ずゲルマトリクスから抽出されなくてはならない。

【０００４】 ポリアクリルアミド２次元ゲルからタンパク質を抽出するための方法が開発さ
れてきたが、かかる方法の１つは、タンパク質スポットのまわりでゲルを切断す
ること及び湿式化学段階でそれを抽出することから成る。この技術では、タンパ
ク質がその取出し中に変性、修飾さらには喪失を受ける確率が高い、もう１つの
技術は、ひじょうに時間のかかる電気ブロッティングである。

【０００５】 タンパク質がひとたびゲルから抽出された時点で、最も強力な分析技術は、質
量分光測定法である。この技術を用いると、タンパク質のペプチド組成を分析す
ることが可能であるばかりでなく、得られたペプチドマップを、複数の生物情報
科学機関によりデータバンク内にコンバイルされたその他のタンパク質データと
比較することも可能である。質量分析測定法（ＭＳ）においては、標本の純度が
非常に重要である。標本が塩といったような不純物を含有する場合、これをＭＳ
分析に基づいて直接吟味することはできない。かかる標本は、透析手順といった
ような手段によりＭＳ分析の前に脱塩する必要がある。標本中の望ましくない化
合物を回避するもう１つの方法は、２次元ゲル（Ogorzalek Loo, R.R.,et al.,
分析化学、１９９６、６８、１９１０−１９１７）か又は電気ブロッティングを
受けた２次元ゲル（Eckerskorn, C., et al., 分析化学、１９９７、６９、２８
８８−２８９２；Strupat, K. et al. 分析化学、１９９４、６６、４６４−４
７０）からの直接レーザー脱着技術を用いることにある。これらの付加的な精製
段階の全てが、分析手順を複雑かつ時間のかかるものにしている。

【０００６】 複合混合物内の化合物の分離は２次元ゲル電気泳動で可能であるが、分析のた
めに望まれる化合物と共にとどまる数多くの不純物が存在しこれらの除去が面倒
な作業であるという問題がある。２次元ゲル電気泳動に付随する大きな問題は、
問題の化合物がゲルの内部に捕捉され、分析を可能とするためにはそれを抽出し
さらに精製する必要があるという点にある。

【０００７】 複合生体標本を分離するもう１つの方法は、例えば等電点電気泳動（ＩＥＦ）
を介した等電点分離によるものである（Righetti, P.G., J. Biochem Biophys M
ethods, １９８８ １６；９９−１０８）。ＩＥＦは、ｐＨ勾配内での電荷に基
づいて化合物を分離できるようにする電気泳動技術である。一般に、等電点電気
泳動システムには、（ｉ）フリーフロー型緩衝システム及び（ｉｉ）固定化緩衝
システムという２つの主要なタイプがある。 （ｉ） フリーフロー型緩衝システム 全てのフリーフロー型システムは、通常アミノ酸といったような等電点緩衝液
又は両性担体である緩衝液の使用に基づいている。例えば、連続フリーフロー装
置がSoulet, N et al により実証された（電気泳動、１９９８、１９、１２９４
−１２９９）。この装置においては、両性担体を用いて平坦なチャンバ内にｐＨ
勾配が作り出され、電位勾配が担体流れ方向に作り出される。標本は、離散的画
分の形で装置の終りで連続的に注入され分割される。ｐＨ勾配は数時間にわたり
安定しているものの、ウシ血清アルブミン及びアルファラクタルブミンの完全な
分離を達成することはできない。このシステムのいくかの主要な欠点は、近接し
たｐＩ値をもつ化合物を分離できないこと、分離が起こるのに数時間を要するこ
とそして、所望の化合物のさらなる分析を可能にするためには除去する必要のあ
る両性担体も使用すること、といった点にある。

【０００８】 等電点分割流薄型（ＳＰＬＩＴＴ）分画においては、いかなるｐＨ勾配も確立
されず、分離の原理は、異なるｐＨの緩衝液中のその等電点（ｐＩ）に応じてタ
ンパク質が示す電荷に基づいている。タンパク質画分を分離するため適切な出口
及び／又は入口スプリッタを用いてフローセルに電位が適用される。２成分タン
パク質混合物がうまく分離されてきた（Fuh, C.B. 及び Giddings, J.C., 分離
の科学と技術、１９９７年、３２、２９４５−２９６７）が、このシステムは、
複合タンパク質標本を分析しなくてはならない場合及びタンパク質の等電点（ｐ
Ｉ）が非常に近い場合幾分かの欠点を示す。（０.１ｐＨ単位より小さいｐＩ差
は、この方法を用いて分離することができない）。

【０００９】 数多くの再循環等電点システムが、膜又はスクリーンを用いた異なるｐＨをも
つ区画の物理的分離に基づいている。そのうちのいくつかが、文献中で再考され
ている（Bier, M.電気泳動、１９９８年、１９、１０５７〜１０１３；Krivanko
va, L. et al., EP,１９９８年１９、１０６４−１０７４）。再循環フリーフロ
ー電気泳動に対する最も一般的な調製アプローチは、Bio Rad によって市販され
ているRotofor器具である。スクリーニング材料によって区画が構成されている
管状の器具の中で、いわゆるRotolytesという特殊な両性電解質を用いてｐＨ勾
配が確立される。フリーフロー電気泳動における重力の問題は、分離区画の回転
によって克服される。この装置は、調製規模でうまく応用されてきた。このアプ
ローチの１つの改良案が、Bierによる接線電気泳動器具である（ＵＳ５５４０８
２６）。ここでは、１つの多流路アレイが、単一のスクリーンを通してわずかに
移動された第２の多流路アレイから分離されるような形で、異なる区画が配置さ
れている。流路を通して電気泳動蛇行経路を有効化する電界が、流路に対し垂直
に適用される。流路内のｐＨは、両性電解質により固定され、再循環は、全ての
流路にある独立した入口及び出口ポートを用いて可能である。このシステムの主
要な欠点は、溶液がそれを通って流れなくてはならない複雑な多流路構造を装置
が備えていること、そして、問題の化合物（単複）が、所望の化合物（単複）の
さらなる分析を可能とするためには除去する必要のある両性電解質溶液の中にと
どまっていること、にある。

【００１０】 大部分の溶液緩衝型システムにおいて、分析物は、走行する緩衝液と混合され
、標本を分画又は脱塩するため又は非対流及び／又は低水拡散媒質の中で作業す
るため、いくつかの流体取扱い戦略が紹介されている。これらの等電点電気泳動
装置は全て、化合物のさらなる分析という点で、主要な欠点を有している。これ
らは全て、最終的に分離された画分の中に、望ましくない緩衝種又は両性電解質
を一定量含有している。 （ｉｉ） 固定化緩衝システム 大部分の固定化緩衝システムにおいて、分離された画分がゲル又は膜の中に捕
捉されていることからさらなる化合物分析に関する主たる欠点が存在している。

【００１１】 「セグメント型固定化ｐＨ勾配」として知られている技術に基づくRighetti及
びFaupel（Righetti, P.G et al. Journal of Chromatography, １９８９年、４
７５、２９３−３０９）により開発された装置が存在する。この装置は、イモビ
リン等電点膜によって分離された陽極及び陰極タンクの間にはさまれた多数の区
画で構成されており、両性電解質を含まない溶液の中でのタンパク質の回収を可
能にしている。この装置は、膜によって安定化されたイモビリンゲルにより分離
された複数の区画で構成されていてもよい。画分の分離は、２つのイモビリン膜
の間の電界の中でタンパク質が泳動を止めるような形で達成され、ここで１つの
膜は、タンパク質のｐＩよりも高いｐＨを確立し、もう１方の膜はそれより低い
ｐＨを確立している。この器具には、多数の区画の使用、多数の固定化された膜
及びセグメント化されたｐＨ勾配といったいくつかの欠点がある。

【００１２】 発明の要約 本発明は、荷電及び中性化合物を分離するため及び、両性電解質を含まない又
は緩衝液を含まない溶液の中での前記中性化合物の回収のための装置、方法及び
キットを提供しようとするものである。当該技術分野においては、先行技術で存
在する抽出及び精製という時間のかかる付加的な段階無く、例えば質量分光測定
法によりさらに分析されうるような形で、問題の化合物を回収する効率の良い方
法と組合わせて複合混合物の中の化合物を分離するための装置、方法及びキット
に対する必要性が存在している。本書で記述された発明は、複合混合物内で生物
学的又は化学的化合物を分離するために使用することができる。

【００１３】 １つの態様においては、本発明は、分析物溶液内の荷電及び中性化合物の電気
泳動による分離及び精製用の装置において： （ａ） 壁の少なくとも一部分が化学的緩衝システムから成るチャンバ； （ｂ） 前記化学的緩衝システム内への前記荷電化合物の抽出により、前記荷
電化合物と中性化合物を示差的に分離することができるように、前記化学的緩衝
システムを横断して電位差を生成するための手段； （ｃ） 望ましくは、両性電解質を含まない又は緩衝液を含まない溶液といっ
たような溶液中で、分離された画分を収集するための手段；及び （ｄ） 任意には、分離された画分を再循環させるための手段、 を含んで成る装置を提供している。

【００１４】 もう1つの態様において本発明は、本発明の装置を用いた、分析物溶液中の荷
電及び中性化合物の電気泳動分離及び精製及び分離された画分の収集方法を提供
している。本発明のさらなる利点は、問題の化合物が、溶液中、さらには両性電
解質を含まない又は緩衝液を含まない溶液の中で回収可能であるということにあ
る。

【００１５】 本発明は、電位差が分析物溶液内でも分析物溶液と化学的緩衝システムの間で
も適用されないことから、先行技術の電気泳動技術とは根本的に異なる分離及び
精製方法に関する。本発明においては、電位差は、電界の一部が精製すべき溶液
を含有するチャンバに進入するような形で、化学的緩衝システム（又はその一部
分）を通してのみ適用される。この新しい方法及びその器具は、先行技術の方法
に比べて、分離の分解能を増大させ、ゲル又は膜内ではなく溶液中で泳動するこ
とに起因して精製速度を加速し、さらなる分析のための直接的分画を可能にする
という利点をもつ。分析物溶液中のｐＨ勾配を作り出すために一般的に使用され
る両性担体又は等電点緩衝液を用いるその他の先行技術の電気泳動装置において
使用される付加的な精製段階の使用は、不要である。

【００１６】 本発明では、化学的緩衝システムは、分析物溶液と接触するその部分の中のｐ
Ｈに関して、有利にも制御することができる。問題の単数又は複数の化合物が制
御されたｐＨで包括的に中性である場合、混合物から問題の単数又は複数の所望
の化合物を分離することができる。好ましくは分析物溶液に垂直に化学的緩衝シ
ステムを通して電界を適用した時点で、このｐＨにおいて包括的に中性である化
合物と荷電化合物の弁別を行なうことが可能である。実際、緩衝システムと接触
状態にある中性化合物は、分析物溶液内に維持され、一方荷電化合物は化学的緩
衝システム内へと泳動する。この要領で、化合物は、化学的緩衝システムのｐＨ
を制御することでｐＩにより分離され得る。

【００１７】 従って、本発明は、緩衝される必要のない分析物溶液の中で直接荷電された種
から包括的に中性の化合物を電気泳動により分離し精製することを可能にする。
本発明の一部の実施形態においては、装置は、流体流システムに連結された入口
及び出口をもつチャンバを有しており、ここで分析物溶液は前記チャンバを通っ
て流れることができる。その他の実施形態においては、装置は、中で入口及び出
口が併合されかくして、精製すべき混合物が中に被着され得、そこから精製済み
溶液で取出され得るような単純なタンクを構成する１つのチャンバを有している
。さらなる実施形態においては、本発明に従った装置は、同時の及び／又は並行
した精製のための複数のチャンバを収納することができる。好ましくは、電流の
方向は、分析物溶液の流れの方向に対し垂直である。

【００１８】 好ましい実施形態においては、化学的緩衝システムは規定のｐＨ値又は規定の
ｐＨ範囲を有し、これは例えば、共有結合された緩衝用分子、両性等電点膜又は
それらの何らかの組合せを使用することによって選択され得る。従って、化学的
緩衝システムは固定ｐＨで又はｐＨ勾配内で等電点により問題の化合物を分離す
る能力をもつ。これは、０.１未満のｐＩ差をもつ化合物、０.０１未満のｐＩ差
をもつ化合物、及び最高０.００１のｐＩ差をもつ化合物といったような、異な
るｐＩをもつ化合物を分離する能力をもち、かくして異なる所望の精製度を可能
にする。

【００１９】 化学的緩衝システムは、例えば、イモビリンゲル、重合体マトリクス中で凝固
された流体、フリットガラス、多孔質膜、フィルタ又はそれらの何らかの組合せ
であり得る。この化学的緩衝システムは、分析物溶液と接触するその部分におい
てｐＨを制御するのに役立ち、かくして荷電化合物とこのｐＨで包括的に中性で
ある化合物の間の弁別を可能にする。前記化学的緩衝システムはかくして、荷電
化合物を含有する混合物から問題の単数又は複数の中性化合物を分離するために
使用することができる。

【００２０】 前記化学的緩衝システムを横断して電流が印加され、チャンバの形状は、電流
がこのチャンバの内部に進入しかくして溶液中に存在する荷電化合物の泳動流束
を生成するような形で設計されている。精製効率及び速度は、チャンバの幅及び
長さ又は直径によって左右され、その幾何形状はかくして実施すべき実験及び利
用目的との関係において選択可能である。

【００２１】 本発明の１つの利点は、荷電化合物の泳動により誘発される分離が、問題の化
合物を分析物溶液内で直接分画させることができるという点にある。このように
して、高い抵抗が泳動速度をひどく減少させるゲル又は多孔質膜といったような
先行技術において一般に用いられるその他の種類の媒質中に比べ、泳動速度がは
るかに速いことから、分離は先行技術の方法よりもはるかに速い。

【００２２】 一部のケースでは、泳動する荷電分子は、化学的緩衝システム内に進入してそ
の中でさらに泳動することができる。しかしながら、この泳動は、分析物溶液中
の分離に影響を及ぼさず、化学的緩衝システムは、廃棄物タンクとみなすことが
できる。一部の利用分野では、化学的緩衝システムの壁上への中性化合物の吸着
を防止することが有利であり得る。本発明の一部の実施形態においては、（例え
ば）多孔性が非常に低い材料でありうる微細膜といったものを含む直接的吸収を
停止させるための手段を提供することができる。

【００２３】 一部の例においては、化学的緩衝システム内を泳動する荷電分子を回収するこ
とも同じく有利でありうる。この目的で、本発明の装置は、有利には、複数のサ
ブチャンバを含むことができる。

【００２４】 本発明のいくつかの実施形態においては、チャンバ内で入口から出口まで、分
析物溶液を流動させることができる。コンピュータシミュレーション実験から、
化学的緩衝システムを通して適用された電界がフローチャンバ内に進入し、これ
が分析物溶液中の荷電種の泳動を誘発する（例参照）ということが示されている
。コンピュータシミュレーションは、電界が分析物溶液を収納するチャンバの端
部間に直接適用された場合、電流ラインのきわめてわずかな部分だけが化学的緩
衝システム内に進入し、荷電種を強制的に分析物溶液内で泳動させるということ
を実証している。この分極モードは、先行技術の方法において（セグメント型ゲ
ル電気泳動の場合と同様）使用されてきたが、これらの欠点を回避するため、化
学的緩衝システム内の電流は、そのとき溶液区画網を分離するフィルタ又はセプ
タムとして用いられる化学的緩衝システムを横断してイオンが強制されるような
形で溶液を分極することによって増大させられる。先行技術とは対照的に、本発
明は、電界の一部分が精製すべき溶液を収納するチャンバに進入するような形で
化学的緩衝システムの両方の端部に電位差が適用されることから、根本的に異な
る分離原理を実施している。

【００２５】 本発明は、必要な分離を実施するのに単一のチャンバで充分であるものの、望
ましい場合には、化学的緩衝システム内でさまざまな所望のｐＨでの同時分離又
は同じ所望のｐＨでの並行分離を実施するために、複数のチャンバ（又はサブチ
ャンバ）を使用することができる。その上、チャンバの数、寸法又は形状には全
く制限はなく、サイズ、容積又は数量の制限なく特定の必要な利用分野にそれを
適合させることが可能である。従って、本発明の装置及び方法の規模を容易拡大
又は縮小することができる。例えば、分析レベルでならびに調製及びパイロット
スケールで又は下流側プロセス内でそれを運用することが可能である。

【００２６】 一部の実施形態においては、特に高い電位差が利用される場合、本発明の装置
は、装置及び分析物溶液の温度を制御する手段を有していてよい。

【００２７】 いくつかの好ましい実施形態においては、本発明に従った装置には、問題の中
性化合物（単複）の沈殿を防ぐ手段が具備されている。精製の時点で、分析物溶
液はイオンが貧化された状態となり、かくしてその可溶性は低下する。かかる状
況では、非水性分析物溶液を使用すること又は、本発明の装置内に超音波処理装
置を一体化することが有利でありうる。

【００２８】 本発明に従った装置の作動中、化学的緩衝システムにより確立されたｐＨで荷
電された全ての化合物は、電極の位置、装置全体の幾何形状及び分析物溶液及び
化学的緩衝システムの両方の性質によって左右される電流ラインに従って、チャ
ンバの端部に向かって泳動する。分析物溶液内には、化学的緩衝システムにより
規定されたｐＨで中性である化合物のみが残る。

【００２９】 本発明は、溶液からの、塩、荷電された酸又は塩基、緩衝液成分又は両性電解
質を内含する全ての望ましくないイオンの迅速な除去を可能にする。例えば、タ
ンパク質を自由に流れる溶液中で精製し、同時にさらなる分析のためにこれを準
備することができる。同様にして、本発明は、余剰の荷電された副産物又は塩か
ら中性化合物を分離するために使用することができる。

【００３０】 中性種の隔離に加えて、本発明の装置及び方法は同様に、作動中に化学的緩衝
システム内に装入される荷電種の抽出を容易にする。例えばプロテオーム分析に
おける１つの重要な問題は、濃度の高いタンパク質の存在によってその同定が往
々にして阻害される低存在量のタンパク質へのアクセス可能性にある。例えば、
数多くの細胞抽出物におけるアルブミンの存在は、低濃度で存在するタンパク質
の検出を妨げる。かかる利用分野では、本発明は例えば、固定化ｐＨ勾配（ＩＰ
Ｇ）ゲルを装入することにより、分析物溶液の残りの部分からアルブミンを分離
するために使用することができる。この目的のため、分析物溶液と接触した状態
にある化学的緩衝システムの一部分は、アルブミン又は残りの分析物溶液から分
離する必要のあるその他のあらゆる化合物のｐＨを包含するｐＨ範囲を有してい
なくてはならない。このようにして、このｐＨ範囲内で荷電される分析物溶液の
全ての化合物は、ＩＰＧゲル内への電界の適用時点で抽出され、それが荷電され
た状態にとどまるかぎり、又はゲルのｐＨがそのそれぞれのｐＩに対応する点ま
でこのゲル内で泳動しやすくなる。このような場合、問題の化合物は、電気泳動
精製の後に分析物溶液中に残っている中性化合物（単複）のみならず、時として
主に、抽出され化学的緩衝システム内を泳動した荷電化合物でもあるが、これは
、後者が先行技術に比べ優れた決定及び同定のために吟味できるものだからであ
る。

【００３１】 １つの使用モードでは、本発明は、化学的緩衝システム内で化合物を蓄積する
ために使用できる。かかる利用分野においては、分析物溶液は、新鮮な溶液が電
気泳動分離及び精製に付されるような形で、チャンバ内で更新される。この要領
で、分析物溶液内の低濃度の化合物は、化学的緩衝システム内で蓄積され得、か
くしてその検出及び同定を容易にする。同定を目的として、化学的緩衝システム
に化合物又は一クラスの化合物を特定的に同定するための手段を結びつけること
も有利である。かかる手段は、例えば光の発出、光の吸収（ブロッティングの場
合のように）、電気活性生成物、検出可能な生成物を生成する（例えば抗原−抗
体複合体の形成又は酵素反応の場合における）特異的分子認識によって１つの化
合物又は１クラスの化合物を検出するべく作動してもよい。

【００３２】 一部の実施形態においては、装置を改良して、分析物溶液から化学的緩衝シス
テム内に抽出された荷電化合物の回収を容易にすることができる。この目的のた
め、チャンバを、少なくともその１つに分析物溶液が入った複数のサブチャンバ
に分割することができる。化学的緩衝システム内を泳動し好ましくは、ｐＨを固
定するように緩衝液溶液を含む化合物を収集するために、その他のサブチャンバ
を使用することができる。荷電化合物が電界の方向に沿って泳動しこの電界の一
部分が各サブチャンバ内に進入するにつれて、荷電化合物は、化学的緩衝システ
ムからサブチャンバ内へ戻るように抽出され得る。この泳動は、泳動する化合物
が包括的に中性であるサブチャンバ又は化学的緩衝システムのｐＨ領域にこれら
の化合物が到達するまで続行する。かかる構成は、本発明のもう１つの利点、す
なわちそれが化学的緩衝システム内での泳動の後でさえ溶液中のあらゆる化合物
の回収を可能にするという利点を例示している。これは、かかる回収された化合
物のさらなる分析を大幅に容易にすることから、大きな利点をもつことである。

【００３３】 本発明に従った装置及び方法は、主として以下のような主要な利点をもつ：（
ｉ）直接溶液中での問題の化合物の高い標本回収、（ｉｉ）所望の化合物の等電
点（ｐＩ）をはさんだｐＨ間隔に依存する高い分解能、（ｉｉｉ）ゲルといった
ようなより密度の高い材料ではなく溶液中を泳動する荷電分子に起因する速い分
離速度及び （ｉＶ）問題の所望の化合物の分離は、両性電解質を含まない又は
緩衝液を含まない溶液内に直接起こり、このため脱塩といったような広範な付加
的精製段階の必要性なくさらなる分析が適切に容易になる。

【００３４】 問題の単数又は複数の化合物は好ましくは、生体化合物、より好ましくは有機
化合物そして最も好ましくは、タンパク質、タンパク質誘導体、タンパク質イソ
形、酵素、抗原、抗体、ペプチド又は核酸、脂質又は炭水化物である。

【００３５】 さらにもう１つの態様では、本発明は、分析物溶液内での荷電及び中性化合物
の電気泳動分離及び精製のための説明書、そして任意には所望の化合物（単複）
の精製を改善するため分析物溶液と共に使用するか又は混合すべき化学物質を伴
う、本発明の装置を含むキットを提供している。かかるキットは、単数又は複数
の問題の化合物を溶液中で回収できるようにする。

【００３６】 問題の化合物は、分析物溶液と接触している化学的緩衝システムにより規定さ
れるｐＨで又はｐＨ間隔内で中性であるあらゆる生物学的又は化学的化合物であ
りうる。好ましくは、問題の化合物は、タンパク質、ペプチド、又は糖タンパク
質といったようなペプチド又はタンパク質部分を含有する化合物といったような
イオン化可能な生体化合物であるが、核酸、複合脂質又は複合炭水化物でもあり
うる。これはモノクローナル抗体といったような抗体又はタンパク質のさまざま
なイソ形のいずれかであってもよい。

【００３７】 荷電化合物は、分析物溶液と接触している化学的緩衝システムにより規定され
るｐＨで又はｐＨ間隔内で荷電されているあらゆる化合物であってもよい。かく
して荷電化合物は、イオン化可能な又は荷電された化合物、好ましくは酸、塩基
、両性電解質又は例えば解離塩といったような永久荷電された化合物のいずれか
でありうる。荷電化合物は、本発明に従った電気泳動分離に基づいてチャンバか
ら化学的緩衝システム内に抽出される。これはさらに、ゲルから溶液中に抽出さ
れ得、実験者にとっての問題の化合物であってよい。

【００３８】 分析物溶液は、所望の問題の化合物（単複）を可溶化する本発明に従ったあら
ゆる溶液であってよい。これは好ましくは、両性電解質を含まないか又は緩衝液
を含まない溶液である。

【００３９】 外部電源により生成された電極を用いて、電流を印加することができる。本発
明の装置が許容できる任意の電圧を用いることができる（例えば１０〜１０００
０ボルト、好ましくは１００〜５０００ボルト）。生成された熱を適切な冷却に
より散逸させることができるということを条件として、これより高い電圧を使用
することができる。さらに、交流及び方形波を含め、任意の電圧波形の適用を可
能にするように電圧をプログラミングすることができる。

【００４０】 チャンバはそのサブチャンバ数、寸法又は形状に制限はなく、これらはその特
定の利用分野によって要求されるとおりに変動可能である。チャンバは又、その
他の分離、精製又は検出コンポーネントと合わせた１つのモジュールとして使用
することもできる。チャンバを構成する部品は、プレキシグラスといった固体プ
ラスチックから機械加工されてもよいし、熱可塑性樹脂から成形されてもよいし
、又は他のあらゆる適切な製造プロセスによって作られてもよい。材料は、分析
物溶液、電流、弱酸及び塩基、酸化剤などに対する化学的耐性をもっているべき
である。さらに、光学的透明度又は少なくとも幾分かの透明度を有することも望
ましいかもしれない。チャンバは、多孔質膜、多孔質鉱物層、非導電性重合体（
例えばプレキシグラス）又は絶縁繊維網といったような絶縁材料によって作られ
た絶縁基板により支持されていてもよい。チャンバは同様に、例えば、分析物溶
液の漏れを防ぐべく流出密封性となるようにＯリングを使用すること又は例えば
、装置の壁を締め合わせるべくネジを使用することといったような、チャンバ内
のコンポーネントの適切なはめ込み及び位置づけを確保するための手段を有して
いてもよい。さらにチャンバは、例えばプレキシガラスといったような、電圧に
耐えることのできるあらゆる材料で作られている。

【００４１】 化学的緩衝システムは、問題の化合物（単複）からの荷電化合物の分離を容易
にすることができるあらゆるシステムでありうる。例えば、化学的緩衝システム
はゲル、最も好ましくはイモビリンゲル、重合体マトリクス中で凝固された流体
、フリットガラス、多孔質膜、フィルタ又はそのあらゆる組合せであり得る。化
学的緩衝システムは同様に、低い吸着材料といったような前記チャンバ内の荷電
及び中性化合物の直接的進入を停止させるための手段を有することもできる。化
学的緩衝システムは最も好ましくは、薄く電気浸透が無く流出密封性を有するも
のである。

【００４２】 ｐＨは、固定ｐＨ又はｐＨ勾配でありうる。例えば、チオモルフィン誘導体又
はアクリルアミド誘導体といったような共有結合によりリングされた緩衝用分子
を用いて生み出すことができる。ｐＨの勾配は、両性等電点固定化ｐＨ膜によっ
て作ることができ、これらの膜は、非常に狭いｐＨ間隔のみを網羅するひじょう
に短かいｐＨ勾配を有する可能性がある。理想的には、このｐＨ間隔は、分離さ
れ精製されるべき問題の化合物の究極的ｐＨに達することができる。本発明の方
法によると、０.００１に至るｐＩの最大分解能までのｐＩ差をもつ化合物を分
離することが可能でありうる。

【００４３】 流体流は、圧力、吸引、遠心力又は電気的手段といった手段により生成され得
る。流体流の方向は、電流の方向との関係において任意の適切な角度にあり、最
も好ましくは垂直である。流れは、単一透過であってもよいし又は流体再循環ル
ープを用いて再循環され得る。その上、複数のチャンバ内に流れを分布させるこ
ともでき、これらのチャンバの一方の端部を単一の入口又は出口に相互連結させ
ることができる。外部流路内に、熱交換器、各再循環ループの体積容量を拡大す
るタンク、例えばｐＨセンサー、温度センサー及び／又は吸光度センサーといっ
たセンサーなどのその他のコンポーネントを内含させることもできる。

【００４４】 次に本発明について、以下で簡単に説明する添付図面も参考にしながら、例示
のみを目的として、より詳しく記述する。

【００４５】 詳細な説明 例１： 発明の装置内部の泳動電流の分布の数値的シミュレーション 本発明の装置内の泳動電流の分布を理解するために、数値的シミュレーション
を有限要素計算を用いて実施することができる。かかる実験は、精製装置を通し
た電流の流れを予測することを可能にする。この目的で、図１は、分離装置の一
例の概略的表現を示し、精製の概念を例示している。この例では、装置は、その
各端部に１つの入口２と１つの出口３を伴う精製すべき溶液の入ったチャンバ１
、チャンバの一部分と接触状態にある化学的緩衝システム４及び唯一化学的緩衝
システムと接触状態にありチャンバに対し平行に設置された２つの電極（陰極５
及び陽極６）で構成されている。黒色矢印は、２つの電極間の電界の適用時点で
の、化学的緩衝システム内への正（対陰極）又は負（対陽極）に荷電された化合
物の進入を表わし、一方白色矢印は、チャンバ内で溶液の流れが誘発されうると
いうことを示している。

【００４６】 流路のカバーとしての化学的緩衝システムから成る装置の横断面がシミュレー
トされており、泳動電流は、この断面の各箇所において計算される。例えば、（
ｉ）伝導率σがゲル内と溶液内で同一である（σ_gel＝σ_solution）場合及び（
ｉｉ）ゲル内の伝導率が溶液中よりも１０分の１低い（１０_gel＝σ_solution）
場合という２つの異なるケースが、装置の中でシミュレートされた。両方のケー
スについて、計算は、

【００４７】

【数１】

【００４８】 というラプラスの等式に従い、２次元システム内での適切な条件を用いて：すな
わち − 第１の電極 ： Ｕ＝０で − 第２の電極 ： Ｕ＝１で − 絶縁壁 ：（∂Ｕ／∂Ｎ）_wall＝０で （２） （なお式中Ｕは電位（Ｖ）でありσは電気伝導率である（． ^-1、ｍ^-1）） 構造の各箇所において解かれる。

【００４９】 電位分布については定常アルゴリズムが使用される。シミュレーションは、Un
ixワークステーション（６４０ＭｂのＲＡＭを伴うSilicon Graphics Indigo ２
Solid Impact １００００）上で動作する市販の有限要素ソフトウェアFlux Exp
ert（登録商標） （Simulog, フランス）を用いて実施可能である。

【００５０】 これらのシミュレーション実験は、化学的緩衝システム内に荷電化合物が泳動
するか否か、及び泳動に対する伝導率σの影響又は換言すると精製すべき溶液内
の緩衝液組成の効果を実証することを目的としている。得られた結果は、図２に
紹介されている。

【００５１】 第１のケース（図２Ａ）では、σは、化学的緩衝システム内及び分析物溶液内
で等しいものとみなされている（σ_gel＝σ_solution）。２つの電極間に電位差
が適用され、こうして電位分布の予測が可能となる。図２ＡＩは、ゲル下のセグ
メントに対応する溶液中の電位分布が、化学的緩衝システム内のものと密に類似
していることを示している。化学的緩衝システムに同じく電位勾配が作り出され
、これは、その電荷に応じての溶液中のタンパク質の予備泳動を導くことができ
る。図２ＡＩＩに示されているように、電流ベクトルは、電流が同様に溶液中に
輸送されるということを表わしている。ベクトルは、構造の中央で類似しており
、等しい電流の流れを導く。化学的緩衝システムと溶液の間の界面においては、
電流の流れが溶液から化学的緩衝システムへと起こることが明確に実証されてい
る。

【００５２】 第２のケース（図２Ｂ）では、溶液の伝導率は増強される。それはゲル内より
も分析物溶液内で１０倍高いとみなされている（１０σ_gel＝σ_solution）。こ
の実験の結果は、溶液中の電位勾配が、化学的緩衝システム内よりも効果が低い
（図２ＢＩＩＩ参照）ものの、より多くの電流が溶液内で運ばれる（図２ＢＩＶ
参照）ということにある。第１のケースと同様、電流の流れが溶液から化学的緩
衝システムへと起こり、これによりタンパク質は泳動により溶液から化学的緩衝
システム内に入ることができるようになる。

【００５３】 これら２つの実験から、本発明の分離及び精製装置の概念を実証することがで
きる。電位が、化学的緩衝システムのみに適用される場合でも、それに隣接する
分析物溶液はこの電位により影響され、荷電化合物（例えばタンパク質）の泳動
が誘発される。２つのケースは、その有効性においてのみ異なっている。第２の
ケースでは、例えば、緩衝タンパク質溶液に対応するより高い伝導率が考慮され
る。これは確かに、タンパク質の安定性にとってそしていくつかのタンパク質の
電荷を等電点分離実験のために予め選択しなければならない場合に、より望まし
いことである。一方で、例えば非緩衝溶液（水中で希釈された標本）内で電流の
ほぼ１００％がタンパク質によって運ばれることから、第１のケースがタンパク
質の泳動ひいては精製装置の有効性にも有利に作用するということは明白である
。

【００５４】 例２：非緩衝溶液中の電気泳動分離及び精製 さまざまな溶液の電気泳動分離及び精製を実証するために、以下の実験条件が
利用された。

【００５５】 試薬 ＩＥＦタンパク質マーカー標準は、Bio Rad（Herkules, US）から入手可能で
ある。ウマ シトクロムＣ，β−ラクトグロブリンＡ及びＢ、トリプシン阻害物
質及びウマミオグロビンは、Sigmaから購入可能である。イモビリンDry Plates
ｐＨ範囲（４.５〜５.４及び４〜７、１１cm）は、Pharmacia Amershamから入手
可能である。キャピラリ等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）のための試薬は全てBio Ra
dから入手可能である。

【００５６】 実験用装備 精製すべき溶液を、（当該ケースではイモブリンゲルである）化学的緩衝シス
テムと接触するチャンバを収納する装置を通して圧送できるような形で、プラス
チックホルダを構築することができる。図２は、かかる配置をもつ分離及び精製
装置のプロトタイプの写真を示している。チャンバ１は、装置を通って分析物溶
液を流すためテフロン（登録商標）管とぜん動ポンプ（図示せず）に連結されて
いる１つの入口２と１つの出口３を有している。化学的緩衝システム４は、チャ
ンバより上に設置された固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲルである。装置全体は、ネ
ジ込み式のプラスチック支持体８の中に保持され、その水密性は、密封を可能に
するＯリング７によって確保される。陰極５及び陽極６は、Ｏリングの近くでＩ
ＰＧゲルのみと接触する状態で設置される。これらの電極は、薄い白金ワイヤで
作られ、そのため装置内にいかなる漏出も発生せずにＯリングより上で一体化さ
れ得る。ゲルが装置内で再び膨潤した時点で、それは、電極を完全に閉じ込め、
分析物溶液が電極に触れるのを防ぐ。ケルの再膨潤は、１時間から最高一晩の間
、精製実験を実施できる緩衝液システムの中か又は水の中で達成されうる。

【００５７】 精製 異なるタンパク質溶液（１ｍｌの合計体積）を、ぜん動ポンプを用いて装置に
適用することができる。実験の前に、溶液を少なくとも２分間循環させ、ＣＩＥ
Ｆのために１００μｌの標本を取り上げることができる。実験に応じて３０〜１
００Ｖまで変動する恒常な電圧を次に、高圧電源（Spellmann, ＣＺＥ１００，N
ewYork, ＵＳ）を用いて印加できる。デジタルＰＣ及びデータ収集ボードＣ Lab
ＰＣｔ，National Instruments, ＵＳ）上で動作するＬab ＶＩＥＷ５プログラ
ムを用いて、電圧及び電流を記録することができる。

【００５８】 キャピラリ等電点電気泳動（ＣＩＥＦ） Bio Cap ＸＥでコーティングされた毛管（内径５０μｍ，BioRad）を用いてＣ
ＩＥＦ析のために、Biofocus３０００器具（BioRad, Hercules, ＵＳ）を使用す
ることができる。タンパク質標本を両性電解質（Bio-Lyte, BioRad）内で希釈さ
せ、BioRadのＩＥＦ陰極液、陽極液及び可動化剤を用いて分析することができる
。必要な場合、ＣＩＥＦ分析のために充分なタンパク質濃度を保証するため、両
性電解質中での希釈に先立ち、Biomax ５ｋＤａフィルタ（Millipore, Bedford,
Massachusetts, ＵＳ）で標本を限外ろ過することができる。

【００５９】 写真 デジタルカメラ（フジＭＸ−７００、フジフィルム、東京、日本）を用いて、
実験後の装置及び乾燥したイモビリンゲルのデジタル写真を撮影し、Adobe Phot
oshop ソフトウェアで処理することができる。

【００６０】 例２．１： ｐＨ７でのタンパク質マーカーの分離 ゲルと溶液が同一の伝導率をもつ例１の第１のケースのシミュレーションにお
いて予測されたようにタンパク質の泳動を実証するために、６.９〜７.１の間の
ｐＨ範囲のイモビリンゲルを、本発明によって請求されている通りの装置のプロ
トタイプ内に一体化することができる（図３参照）。

【００６１】

【表１】

【００６２】 水中のタンパク質ＩＥＦマーカー溶液（約１５０mg／mlの濃度、タンパク質組
成は表１参照）を適用し、恒常なポンプ速度１０.６ml／分）でぜん動ポンプを
用いて、図３の装置を通して連続的に循環させることができる。１００Ｖの電位
の適用時点での１時間の精製後のイモビリンゲルの写真が図４に示されている。
この実験のためには、分析物溶液と接触状態にあるＩＰＧゲルの部分は、７±０
.１４のｐＨを有している。この図は、陽極に向かっての青色のタンパク質フィ
コシアニンの泳動を表わす青色バンド９、及び陰極に向かって泳動するシトクロ
ームＣ、ミオグロビン及びヘモグロビンを表わす褐色バンド１０を示している。

【００６３】 タンパク質は、電気泳動による集束メカニズムを実証するバンドの形で濃縮さ
れている。このことは、電位がゲルと接触している電極のみから適用されたにも
かかわらず、タンパク質の泳動が溶液からゲルまで誘発されていることを明らか
に表わしている。このことは又経験的に、上述のシミュレーションデータが実験
と一致することをも確認している。

【００６４】 例２．２： ＩＥＦマーカー溶液からのベータ−ラクトグロブリンＢ及びフィ
コシアニンの精製 さらなる実験において、表１のＩＥＦマーカータンパク質から成る溶液の精製
が、白金電極に平行なｐＨ勾配でｐＨ範囲４−５.５のゲルについて実証されて
いる。ＣＩＥＦ分析は精製実験の前後に行なわれる（ポンプ速度０.６ml／分、
恒常電圧＝５０Ｖ）。図５で提示されているように、２つのエレクトロフェログ
ラムの比較から５.５以上のｐＩ値をもつもとの分析物溶液のタンパク質がゲル
内へと泳動し、一方ベータラクトグロブリンＢ及びフィコシアニン（ピーク１１
及び１２）は、電気泳動精製の後もなお溶液中に含有されている、ということが
実証されている。

【００６５】 目視による単純な比較も同様に実施可能である。実験前の溶液は緑色（ＩＥＦ
マーカーの複合溶液の色）であるのに対し、精製後溶液は青色である（フィコシ
アニンの色に対応）。さらに、ゲルは、陰極側で褐色を示しているだけであり、
これは、それに向かって泳動する正に荷電されたタンパク質に対応する。

【００６６】 この実験は、問題の化合物を含む分析物溶液を、本発明の装置及び方法を用い
た荷電化合物の抽出によって精製できるということを実証している。

【００６７】 例２．３： ベータ−ラグロブリンＡ及びＢの精製 等電点がわかっている５つのタンパク質（トリプシン阻害物質（ｐＩ＝４.６
）、ベータ−ラクトグロブリンＡ（ｐＩ＝５.３）、ベータ−ラクトグロブリン
Ｂ（ｐＩ＝５.２）、ウマミオグロビン（ｐＩ＝７.０））、シトクロームＣ（ｐ
Ｉ＝９.６）、水中５０μｇ／mlのトリプシン阻害物質を除き濃度２００μｇ／m
l）から成るタンパク質溶液を、水中で再水和した５〜５.４のｐＨ範囲のイモビ
リンゲルを含有する図３の装置に適用する。図６Ｂの分離プロセスのスキームで
例示されているように、この実験の目的は、溶液中でベータラクトグロブリンＡ
及びＢを回収することにある。この目的のため、精製は、以下の原理に基づいて
いる：すなわち、５.０＜ｐＩ＜５.４のタンパク質は、図６Ｂ内にＡ型のタンパ
ク質によって例示されるように陰極近くでゲル内で負に荷電されはね返される（
ゲル中のｐＨ＞ｐＩ）。陽極に近いもう１方のより酸性のゲル端部では、Ａ型の
これらのタンパク質は正に荷電され（ゲル中のｐＨ＜ｐＩ）、再びはね返される
。このようにして、これらのタンパク質を分析物溶液から抽出することはできな
い。ｐＩ＞５.４のその他の全てのタンパク質は正に荷電され陰極に引きつけら
れ（図６Ｂ中のＢ型のタンパク質）、一方ｐＩ＜５.０をもつ全てのタンパク質
は陰極により引きつけられた（図６ＢのＣ型のタンパク質）。これらの最後２つ
のタイプの化合物は、かくして分析物溶液の電気泳動精製時点でＩＰＧゲル内に
抽出される。

【００６８】 ５つの上述のタンパク質の溶液のエレクトロフェログラムは精製の前後に検討
され、図６ＡＩ及びＩＩに報告された結果は、トリプシン阻害物質、ウマミオグ
ロビン及びウマシトクロームＣといったタンパク質が精製後にほぼ完全に削減し
、一方２つのベータラクトグロブリンが溶液中にとどまっていることを示してい
る。これは、本発明に従った等電点分離に基づく精製原理にとっての明白な証拠
である。

【００６９】 本発明で請求されているような装置の１つの利点は、精製すべきタンパク質が
、イモビリンマトリクスと最小限の接触しかしておらず、このため、タンパク質
に対しポリアクリルアミドマトリクスが及ぼし得ると考えられる影響は低減され
ることになる、という点にある。さらなる分析のため、これらを容易に溶液中で
回収することが可能である。化学物質での抽出は全く実施する必要がなく、問題
のタンパク質に対する化学物質の効果は最小限におさえられる。この事実は同様
に、精製時間を削減する。ここで我々は、マイクログラム量の精製を１時間で実
施できる、ということを示すことができる。冷却装置を使用したり装置を通る電
流量を確実に少なくする異なる幾何形状を用いたりすることでこれを増強するこ
とさえ可能である。こうして、より高い電位の適用が可能になる。

【００７０】 例３： 緩衝溶液中の電気泳動分離 ゲルの伝導率が溶液のものの１０分の１である例１のシミュレーション実験の
第２のケースのシミュレーションをテストするために、表１のタンパク質マーカ
ーの溶液を一定の与えられたｐＨに調整する。この目的で４.６のｐＨをもつア
セテート緩衝液（０.０１Ｍ）を使用する。このｐＨは、ＩＥＦマーカー標準の
中に含まれたフィコシアニンのｐＩに対応する（表１参照）。ゲルのｐＨ範囲は
、４.５〜４.５８及び４.５８〜４.６６の間で変動した。これらの実験において
、電流は、電源の上限である３００μＡに恒常的に設定される。検出された電圧
は決して３０Ｖを超えることがない。電位を数時間適用した後、ゲル内には非常
にわずかなタンパク質しか見えない（結果は図示せず）。これらのタンパク質は
非常に拡散的であり、以上の実験のように１つのバンドの中に集束されていない
。同様に気泡形成が増強され、かくして装置内のゲルの幾分かの破壊がひき起こ
される。

【００７１】 これらの実施形態は、標本溶液が緩衝された場合、タンパク質の泳動効率が劇
的に低下することを明らかに示している。タンパク質混合物の濃度に比べその濃
度が高い場合に、緩衝用イオンによってより多くの電流が運ばれるということは
明白である。反対に、タンパク質が水のみの中に含まれている場合、電流はタン
パク質自体によって輸送される。これは、タンパク質の泳動ひいては装置の分離
効率に有利に作用する。水はタンパク質のための最も好まれる分析物溶媒ではな
いが、上述の方法は、等電点分離の増強のための緩衝液イオン又は両性電解質の
添加を全く必要としない。実用的観点からみると、このことは分離プロセスを大
幅に容易にする。

【００７２】 例４： オンライン質量分光測定検出と結合させた電気泳動精製 図３に示されたものと類似の装置を、問題の単数又は複数の化合物のオンライ
ン検出のために質量分光器（ＬＣＱ−ＤＵＯ、Finnigen）に結合することができ
る。この目的のため、（Ismatecからのぜん動ポンプを用いて）１ｍＬ／分の速
度で電気泳動分離装置を通して、８０μＭのカテキン及び２０μＭのメチレンブ
ルーの混合物を圧送することができる。装置は、ｐＨ５.５〜６.５のＩＰＧゲル
から作られた化学的緩衝システムを収納しており、かくして、チャンバと接触状
態にあるゲルの一部分は、６〜６.５のｐＨ範囲を示す。チャンバの出口端部は
、溶液のオンライン分析のため、細管によりＬＣＱ−ＤＵＯ質量分光計の注入シ
ステムに連結されている。

【００７３】 カテキンは、ｐＨ６〜６.１５の間で中性である周知の質量マーカーであり、
一方メチレンブルーは、永久陽イオンである。この混合物が本発明の装置の中を
流れるとき、メチレンブルーは分析物溶液から外へ抽出され、電位（例えば３０
０Ｖ）を加えた時点でＩＰＧゲル内に進入する。このようにして、メチレンブル
ーが溶液から除去され、カテキンは精製される。このことは、それぞれ電気泳動
精製の前後の分析物溶液の質量分光写真を示す図７及び８で明らかにされている
。この目的で、図７の結果は、（電圧源：３.８２ｋｖ；電流源：５.４ｍＡ；蒸
発器温度；４５０℃；シースガス質量；７９.９psi；毛管電圧及び毛管温度；２
００℃という作業条件でシースガスとして窒素を用いて、大気圧化学イオン化（
ＡＰＣＩ）モードで）質量分光器内に注射器からエレクトロスプレーされた出発
分析物溶液／μＬで得られたものである。得られたスぺクトルは、それぞれメチ
レンブルー及びカテキンに対応する２８６.３及び２９１の質量／電荷（ｍ/ｚ）
比で２つの非常に強いピークを主として示している。ｍ/ｚ＝２９１でのピーク
の強度は、分析物溶液内のメチレンブルーのより大きい濃度と合致して、ｍ/ｚ
＝２８６.３でのピークの強度の約６０％にすぎない。分析物溶液の電気泳動精
製の後、図８の質量スペクトルは、類似の形状を示すが、ピークの相対的存在量
は、ほぼ同じになる（ｍ/ｚ＝２９１におけるピークの強度は、ｍ/ｚ＝２８６.
３におけるピークの強度の９４％である）。実験は、さらに実施でき、経時的な
２つのピークの相対的存在量の推移は、ｍ/ｚ＝２９１におけるピークの強度が
ほぼ恒常にとどまり、一方がｍ/ｚ＝２８６.３でのピークの強度は２分未満以内
で１００％から４０％未満まで移行することを示している。

【００７４】 これらの結果は明らかに、陰極に近いゲル内で観察されたメチレンブルーの青
色バンドと一致して、分析物溶液が精製されたことを示している。チャンバの長
さ（約３cm）は、分析物溶液からメチレンブルーを完全に除去するのに充分では
ないが、チャンバの寸法、分析溶液の流速ならびに電界の値は、完全な精製を可
能にするように最適化することができる。

【００７５】 この実験は明らかに、精製された溶液のオンライン検出のために質量分光器に
本発明の装置を結合できるということを実証している。このようにして、精製さ
れた溶液のさらなる分離又は検出を容易に行なうことができる。一部の利用分野
では、例えばＭＡＬＤＩ（マトリクス援用レーザー脱着イオン化）プレートとい
ったように、さらなる分析の前にもう１つの支持体の中で精製済み画分を収集す
ることもできる。

【００７６】 例５： イソ形の電気泳動精製 タンパク質イソ形の分離及び精製を実証するために、２つのイソ形（１つは塩
基性ｐＨ、もう１つは酸性ｐＨ範囲）を含む組換え型ＤＮＡ技術により、Ｎ−ア
セチルEglin Ｃを得ることができる。

【００７７】 １mg／１ｍＬのＮ−アセチルEglinＣ水溶液を、本発明の装置内で再循環させ
、ｐＨ５.５（Ｎ−アセチルEglinＣのＰＩ）での固定化ｐＨ勾配ゲル上を１時間
、恒常的に１０００ボルトで走らせることができる。

【００７８】 従来のキャピラリ等電点電気泳動器具（Biofocus, Bio-Rad）を用いて得るこ
とのできる結果は、精製すべき分析物溶液が２６.８６分後に１つのピーク（塩
基性イソ形ｐＩ６.２；４.８６％に対応する）、２９.５６分後に主要ピーク（E
glinＣ：９０.１８％に対応する）及び３１.５２分後に１つのピーク（酸性イソ
形ｐＩ ５.２；４.９４％に対応する）を提示することを示している。本発明の
方法に従った分離及び精製の後、精製済み溶液は、２６.３８分で微量の塩基性
イソ形に対応する非常に小さいピーク、及びＮ−アセチルEglinの主成分に対応
する２９.５７分でのピーク（９７.８８％）を示す。酸性イソ形に対応するピー
クは全く存在せず、イソ形の分離及び精製ならびに主成分の富化を実証している
。

【００７９】 例６： 静的モードでの電気泳動精製 いくつかの利用分野については、流体流無く分析物溶液を精製することが有利
でありうる。かかるケースでは、本発明の装置は、入口及び出口端部を伴うチャ
ンバを必要とせず、分析物溶液を導入しそれを取出すためのタンクのみを必要と
する。

【００８０】 このことは、精製の前に分析物溶液が導入され精製の後に取出されるタンクと
してチャンバ３１が使用されるように入口及び出口端部が併合されている装置の
中で静的モードで電気泳動分離のために使用される装備の概略表現を示す図９の
中で例示されている。分析物溶液は、化学的緩衝システム３２とのみ接触状態に
あり、電位は２つのタンク３５及び３６の中に導入される陽極３３及び陰極３４
を通して適用される。黒色矢印は、化学的緩衝システム内に導入されるｐＨ勾配
の方向を示す。

【００８１】 本発明のかかる装置での分離を実証するために、化学的緩衝システムとして役
立つ固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲルならびにｐＨ勾配の方向に沿って配置されＩ
ＰＧゲルの上部に設置されている小型プラスチック管から成る３つのサブチャン
バを収納するチャンバを内含する、図９に示されたものと類似した電気泳動分離
装置を製造することができる。図９に概略的に例示されているように、分析物溶
液は、中央サブチャンバ内に導入され得、一方、２つの他のサブチャンバは水が
満たされ、各々それぞれ陰極及び陽極タンクとして役立つべく１つの電極を収納
している。このようにして、電極は、分析物溶液と直接接触状態にない。電界は
、ＩＰＧゲルの中を通過しなければならず、電界の一部は、精製すべき分析物を
収納するサブチャンバ内に進入する。

【００８２】 このような構成の電気泳動装置での分析物溶液の分離及び精製を実証するため
、室温で一晩水中でイモビリンゲル（ｐＨ範囲４.７）を再膨潤させることがで
きる。底面に助けられた穴（直径０.８cm）を伴う３つのプラスチックウェル（
直径１cm）を、それぞれｐＨ４.５、ｐＨ５.５及びｐＨ６のライン上で、ＩＰＧ
ゲルの上面に設置することができる。その後、ｐＨ６のゲルと接触した状態で、
中央ウェル内に、３００μＭのメチレンブルー及び１０ｍＭのフェノールレッド
水溶液１００μＬを被着させることができる。２つの白金電極をそれぞれ、水が
充てんされた左右の側方ウェル内に設置することができる。

【００８３】 これらの条件下で、両方の化合物は、メチレンブルーが永久陽イオンでありフ
ェノールレッドが、７.８１の値をもつそのｐＫａより下で負に荷電されること
から、ＩＰＧゲルによって課せられた全ｐＨ範囲にわたって荷電される。メチレ
ンブルーは、青色を呈し、一方フェノール赤は、その陰イオン形態で黄色であり
、そのため、電位の適用時点での分析物サブチャンバからＩＰＧゲル内への両方
の分析物の抽出を容易に同定することができるようになっている。実際、高圧電
源を用いた２つの白金電極間に恒常電圧（５００Ｖ）を印加した時点で（Landis
& Gyr）、メチレンブルーは陰極に向かって泳動し、一方フェノールレッドは陽
極に向かって泳動することがわかる。１時間の精製後、ゲルのデジタル写真をデ
ジタルカメラ（Camedia Ｃ−２０２０−Ｚ−オリンパス）で撮影し、オリンパス
Camediaソフトウェアで処理する。図１０に提示されたＩＰＧゲルのこの写真は
、精製が完全であることを示しており、このことは、中央タンクが無色であり（
分析物タンクと接触状態にあったゲルの部分３７における色の不在）、一方陽極
タンクより下のゲルの部分が黄色であり（図１０のスポット３９）、陰極タンク
より下の部分が青色である（図１０中のスポット３９）という事実によって実証
されている。

【００８４】 これらの結果は、精製すべき分析物溶液に対しいかなる流れも誘発されない場
合でさえ、本発明の方法の効率の高さを明らかに実証している。しかしながら、
対流を増大させるために、サブチャンバ又は装置全体のいずれにでも撹拌を誘発
させることができる。分離の効率及び速度は、分析物溶液内の荷電された化合物
の泳動によって左右される。濃度勾配の形成を回避しかくして分析物溶液の均質
性を確保することが有利でありうる。タンパク質精製といったようないくつかの
利用分野のためには、サブチャンバの温度を制御し、（例えばサブチャンバを音
波処理することによって）沈殿を回避する手段を付加することが有利でありうる
。

【００８５】 ここで、陽極及び陰極タンク内の溶液が精製の終りにわずかに着色される可能
性があるが、これはとるに足らないことである。このような場合、これは、メチ
レンブルーの一部分及びフェノールレッドの一部分がＩＰＧゲルからそれぞれ陽
極又は陰極タンク内に抽出され、かくして、分析物溶液から化学的緩衝システム
内に抽出された化合物を溶液中で回収することが可能となっている、ということ
を表わしている。これは、数多くの利用分野で有用であり得、本発明のいくつか
の実施形態において規定されているように、さまざまな精製済み画分を収集する
べく分離装置内に複数のサブチャンバを配置することの１つの利点を実証してい
る。

【００８６】 複数のサブチャンバを収納する精製装置の１例は、さらなる分離段階へのオン
ライン検出又は連結を伴う静的モードでの電気泳動分離のために使用可能な装備
の概略的表現である図１１の中で示されている。この例示においては、装置は、
化学的緩衝システム４２と接触状態にあるチャンバ４１を収納するプラスチック
支持体４０の中に支持されている。チャンバは、入口及び出口端部が併合されて
いる一連のサブチャンバ４１で作られており、分析物溶液が精製の前に導入され
精製の後に取出され得るタンクとしてこのサブチャンバが使用されるようになっ
ている。ここでは３つのサブチャンバしか表示されていないが、これらのサブチ
ャンバの数、配置及び形状に制限はない。電気泳動精製を実施するのに必要な電
界を適用するのに役立つ電極を導入するために、２つの補足的タンク４３及び４
４が使用される。サブチャンバは同様に、補足的分離段階として又は検出器とし
て役立つもう１つの器具４７に対する結合のための補足的連結システム４５（１
つのみ図示）を収納している。図は、精製された分析溶液中に存在する問題の化
合物を検出できるようにするべく、精製された溶液の流体力学的流れを制御しか
つ／又はエレクトロスプレー４６を生成する目的で、サブチャンバ（又は連結シ
ステム内の一定の与えられた位置）と器具４７の入口の間に電位差を加えること
ができる、ということを示している。

【００８７】 最後に、溶液中の単数又は複数の問題の化合物の回収は、さらなる分離、精製
及び／又は検出を大幅に容易にする。このため、当該実験において記述されてい
る装置のサブチャンバは、もう１つの検出システム内への精製済み溶液のオンラ
イン導入又は注入を可能にする１つの連結部分（例えば、アパーチャ、溝、密封
された管、毛管、密封された微細流路又はその他のあらゆる結合システムのよう
なもの）を収納することができる（例えば図１１を参照のこと）。かかるシステ
ムは、例えば、本発明の電気泳動方法によって精製され、個別に同定される必要
のあるいくかの問題の化合物を含有する細胞抽出物をさらに分離するために使用
される従来の液体クロマトグラフで実証することができる。同様にして、当該デ
バイスのサブチャンバは質量分光器（吸引、機械的又は動電圧送を用いた直接サ
ンプリングを伴う）に直接結合することができ、かくして単数又は複数の問題の
化合物のオンライン同定が可能になっている。

【００８８】 本明細書に引用された全ての刊行物及び特許出願は、本書に参考として内含さ
れている。以上の発明は、理解を明確にするため例示図及び例を用いて幾分か詳
細に記述されてきたが、当業者にとっては、本発明の教示に照らして、添付のク
レームの精神又は範囲から逸脱することなくいくつかの変更及び修正を加えるこ
とができる、ということが容易に明らかとなることだろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 精製の概念を例示する分離装置の概略的表示。精製すべき溶液の入ったチャン
バ１は、相対する端部にある１つの入口２及び出口３を有し、これは化学的緩衝
システム４により覆われている。陰極５及び陽極６はチャンバに対し平行に置か
れ、唯一化学的緩衝システムと接触している。黒色矢印は、正（対陰極）又は負
（対陽極）に荷電された化合物の化学的緩衝システム内への進入を表わし、一方
白色矢印は、溶液流がチャンバ内に誘電されうるということを示している。

【図２】 ゲルマトリクスに適用された電界についてのシミュレーション結果及びゲル及
び溶液伝導率σの２つの値についての溶液に対するその効果。 Ａ） Ｉ： σ（gel）＝σ（solution）である場合の装置内の電位分布 ＩＩ： σ（gel）＝σ（solution）の場合の電流ベクトル、 Ｂ） ＩＩＩ： １０σ（gel）＝σ（solution）の場合の装置内の電位分布、 ＩＶ： １０σ（gel）＝σ（solution）の場合の電流ベクトル。

【図３】 図１に表わされているものと類似した配置を示す分離装置のプロトタイプの写
真。チャンバ１は、装置内の分析物溶液の流れを可能にするため細管に連結され
ている１つの入口２と１つの出口３を有している。化学的緩衝システム４は、チ
ャンバより上に設置された固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ゲルである。装置全体は、
ネジ込み式プレキシグラス支持体８内に保持され、その無欠性は、密閉を可能に
するＯリングによって確保されている。陰極５及び陽極６は、Ｏリングの近くで
、ＩＰＧゲルとのみ接触した状態で設置される。これらの電極は、薄い白金ワイ
ヤで作られ、そのため装置内にいかなる漏出も発生させずにＯリングより上に進
むことができる。ゲルが装置内で再び膨潤した時点で、それは、電極を完全に閉
じ込め、分析物溶液が電極に触れるのを防ぐ。

【図４】 Ａ） １時間１００Ｖの電界を適用した時点でのＩＥＦマーカー水溶液の図３
の分離装置内での精製後のｐＨ＝７±０.１４ｐＨ単位でのイモビリンゲルの写
真。負の荷電を受けたタンパク質フィコシアニンの陽極への泳動（バンド９）及
びシトクロームＣ、ミオグロビン及びヘモグロビンといった正の荷電を受けたタ
ンパク質の陰極への泳動（バンド１０）は、この実験において目に見える。 Ｂ）固定化ｐＨ勾配ゲル内での分離プロセスを示す概略図。矢印は、ｐＨ勾配
の方向を表わす（ゲルの陽極側における低いｐＨ値及びゲルの陰極側における高
いｐＨ値）。分離の間、分析物溶液と接触しているゲルの部分のｐＨに対応する
ｐＩをもつ化合物Ｘは、包括的に中性であり、泳動しない。ｐＩ（Ｙ）＞ｐＩ（
Ｘ）の化合物Ｙは、このｐＨ範囲内で負に荷電されており、陽極に向かって泳動
し、一方ｐＩ（Ｚ）＜ｐＩ（Ｘ）の化合物Ｚは、このｐＨ範囲内で正に荷電され
、陽極に向かって泳動する。点線矢印は、これらのさまざまな化合物の泳動の方
向を表わしている。

【図５】 イモビリンDry Plate からのｐＨ４−５.５からのセグメントを用いた精製実
験。 Ａ） 実験のために適用された通りのＩＥＦ標準のＣＩＥＦ分析から得られたエ
レクトロフェログラム。ピーク１１〜２１は、表１のタンパク質に対応する。 Ｃ） ピーク１１及び１２のみが精製後に大きい強度のものであり続けることを
示す。実験後に得られた溶液のエレクトロフェログラム。

【図６】 ５つの異なるタンパク質、すなわち、トリプシン阻害物質（ｐＩ＝４.６、ピ
ーク番号２５１、β−ラクトグロブリンＢ（ｐＩ＝５.２、ピーク番号２６）、
β−ラクトグロブリンＡ（ｐＩ＝５.３、ピーク番号２７）、ウマミオグロビン
（ｐＩ＝７.０、ピーク番号２８）及びウマシトクロームＣ（ｐＩ＝９.６、ピー
ク番号２９）を含有する混合物の精製。 Ａ） Ｉ）精製すべき塗布されたタンパク質混合物；及び ＩＩ）５.０６〜５.
３４の間のｐＨ範囲のイモビリンセクションを用いた分離実験の後のタンパク質
溶液のＣＩＥＦ分析。 Ｂ） ｐＨ勾配を伴うイモビリンゲルを用いた場合の、分離装置内の当該実験の
分離原理についてのスキーム。問題のタンパク質（スキーム中Ａと記されている
もの）は、ｐＨ勾配の極値間すなわち当該ケースではｐＨ５と５.４の間のｐＩ
をもつ。スキーム中Ｂ及びＣで象徴されているタンパク質は、それぞれ５.４以
上５.０以下のｐＩを有し、そのためこれらは固定化ｐＨ勾配ゲル内でそれぞれ
正及び負に荷電されている。点線矢印は、これらのさまざまなタンパク質の泳動
の方向を示し、一方実線矢印は（それぞれ正及び負の符号で記されている）ゲル
の陽極端と陰極端の間のｐＨ勾配の方向を示す。電界を加えた時点で、Ｂ型及び
Ｃ型のタンパク質はイモビリンゲル内へと泳動し、かくしてＡ型のタンパク質か
ら分離される。

【図７】 質量ピーク２９０.５〜２９１.５（上部グラフ）、質量ピーク２８５.５〜２
８６.５（中央グラフ）の相対的存在量及びこれら２つのピークの合計存在量（
下部グラフ）の経時的推移を（図の左側に）含め、８０μＭのカテキン及び２０
μＭのメチレンブルーの溶液２μＬを一回注射器で注入することによって得られ
た質量スペクトル（図の右側）。

【図８】 質量ピーク２９０.５〜２９１.５（上部グラフ）、質量ピーク２８５.５〜２
８６.５（中央グラフ）の相対的存在量及びこれら２つのピークの合計存在量（
下部グラフ）の経時的推移を（図の左側に）含め、８０μＭのカテキン及び２０
μＭのメチレンブルーの精製された溶液を連続的に注入することによって得られ
た質量スペクトル（図の右側）。これらの結果は、電気泳動分離装置のチャンバ
全体を通して以前に（再循環なく）流れた分析物溶液のオンライン検出によって
得られたものである（化学的緩衝システム：分析物溶液と接触状態にあるｐＨ範
囲６−６.１５のＩＰＧゲル：適用された電位：３００Ｖ、圧送速度１ｍＬ／分
）。

【図９】 精製の前に分析物溶液を導入し精製後に取出すことができるタンクとしてチャ
ンバ３１が使用されるような形で、入口及び出口端部が併合されている装置の中
の静的モードでの電気泳動の分離のために使用される装備の概略的表現。分析物
溶液は、化学的緩衝システム３２と唯一接触状態にあり、電位は２つのタンク３
５及び３６内に導入される陽極３３及び陰極３４を通して適用される。黒色矢印
は、化学的緩衝システム内に導入されるｐＨ勾配の方向を表わす。

【図１０】 図９のものと類似の装置を用いた３００ｍＭのメチレンブルー及び１０ｍＭの
フェノールレッドの精製及びそれぞれ陰極タンク及び陽極タンクへ泳動したメチ
レンブルー（スポット番号３９）及びフェノールレッド（スポット番号３８）の
その後の決定の後のＩＰＧゲルの写真。この図は同様に、精製中分析物溶液と接
触状態にあったゲルの部分３７の中には電気泳動分離の後にいかなる色も存在し
ないことを示している。

【図１１】 例えば、エレクトロスプレー質量分光器を用いたオンライン検出と共に定常モ
ードで電気泳動分離のために使用できる装備の概略的表現である。この例では、
装置は、化学的緩衝システム４２と接触状態にあるチャンバ４１を収納するプラ
スチック支持体４０の中に支持されている。チャンバは、入口及び出口端部が併
合されている一連の３つのサブチャンバ４０で作られており、こうして前記チャ
ンバは、精製の前に中に分析物溶液を導入できるタンクとして使用されるように
なっている。電気泳動精製を実施するのに必要な電界を適用するのに役立つ電極
を導入するために、２つの補足的タンク４３及び４４が用いられる。サブチャン
バは同様に、補足的分離段階として又は検出器として役立つもう１つの器具４７
に対する結合のための補足的連結システム４５（１つのみ図示）を収納している
。図は、精製された分析溶液中に存在する問題の化合物を検出できるようにする
べく、精製された溶液の流体力学的流れを制御しかつ／又はエレクトロスプレー
４６を生成する目的で、サブチャンバ（又は連結システム内の一定の与えられた
位置）と器具４７の入口の間に電位差を加えることができる、ということを示し
ている。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１４年６月１７日（２００２．６．１７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 レイモン，フレデリク スイス国，セアッシュ−1093 ラ コンベ ルスィヨン，ルトゥ ドゥ コルジー 23 (72)発明者 ロス，アレクサンドラ ドイツ連邦共和国，33824 ベルター，ベ ストシュトラーセ ９ (72)発明者 ロスィエ，ジョエル ステファーヌ スイス国，セアッシュ−1913 サイロン， アブニュ デ コント ドゥ サボワ Ｆターム(参考） 2G052 AA28 AB16 AB18 AD26 AD46 CA03 CA04 DA09 EA02 ED04 FD02 GA11 GA29 GA30 JA07

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 分析物溶液内の荷電及び中性化合物の電気泳動による分離及
   び精製用の装置において： （ａ） 少なくとも１つの壁の一部分が化学的緩衝システムから成るチャンバ
   ； （ｂ） 前記化学的緩衝システム内への前記荷電化合物の抽出により前記荷電
   化合物と中性化合物を示差的に分離することができるように、前記化学的緩衝シ
   ステムを横断して電位差を生成するための手段； （ｃ） 望ましくは、両性電解質を含まない又は緩衝液を含まない溶液といっ
   たような溶液中で、分離された画分を収集するための手段；及び （ｄ） 任意には、分離された画分を再循環させるための手段、 を含んで成る装置。
2. 【請求項２】 前記チャンバが、流体流システムに連結された入口及び出口
   を有し、ここで分析物溶液が前記チャンバを通って流れる能力をもつ、請求項１
   に記載の装置。
3. 【請求項３】 前記チャンバが、唯一の入口と複数の出口をもち、かくして
   、化学的緩衝システムの異なる部分での画分の収集が可能となっている、請求項
   １又は２に記載の装置。
4. 【請求項４】 電流の方向が最も好ましくは、分析物溶液の流れの方向に対
   し垂直である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の装置。
5. 【請求項５】 チャンバが、併合した入口及び出口を有し、かくして該チャ
   ンバは、分離及び精製前に中に分析物溶液を導入し精製済溶液をそこから取出す
   ことができるタンクを構成するようになっている、請求項１に記載の装置。
6. 【請求項６】 前記チャンバが複数のサブチャンバで構成されている、請求
   項１〜５のいずれか１項に記載の装置。
7. 【請求項７】 前記サブチャンバが相互連結されている、請求項６に記載の
   装置。
8. 【請求項８】 少なくとも１つのサブチャンバが精製すべき分析物溶液を収
   納していない、請求項６又は７に記載の装置。
9. 【請求項９】 少なくとも１つのサブチャンバが、分析物溶液から抽出され
   化学的緩衝システムの内部を泳動してきた溶液化合物（単複）を回収するために
   使用される、請求項８に記載の装置。
10. 【請求項１０】 前記化学的緩衝システムを横断して前記電流を生成するた
    めの前記手段が化学的緩衝システムの内部に一体化されている、請求項１〜９の
    いずれか１項に記載の装置。
11. 【請求項１１】 化学的緩衝システムが使い捨てである、請求項１〜１０の
    いずれか１項に記載の装置。
12. 【請求項１２】 前記化学的緩衝システムが固定ｐＨ値又はｐＨ勾配を有す
    る、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の装置。
13. 【請求項１３】 前記化学的緩衝システム内に固定ｐＨ又はｐＨ勾配が、共
    有結合された緩衝分子を用いて生成される、請求項１２に記載の装置。
14. 【請求項１４】 前記化学的緩衝システムが、規定のｐＨ値で又は規定のｐ
    Ｈ範囲内で問題の単数又は複数の化合物を等電点分離する能力をもつ、請求項１
    〜１３のいずれか１項に記載の装置。
15. 【請求項１５】 化学的緩衝システムが、０.１未満のｐＩ差をもつ化合物
    、０.０１未満のｐＩ及び最高０.００１のｐＩ差をもつ化合物といったような、
    異なるｐＩをもつ化合物を分離する能力をもち、かくして前記化学的緩衝システ
    ムが異なる所望の精製度を獲得できる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の
    装置。
16. 【請求項１６】 化学的緩衝システムが、チャンバ外で分析物溶液から抽出
    された化合物又は１クラスの化合物を直接同定しかつ／又は定量するための手段
    を収納している、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の装置。
17. 【請求項１７】 前記同定及び／又は定量化手段が、光の生成、光の吸収、
    吸取り剤又は標識との反応、電気的活性種の生成、又は抗原／抗体複合体の形成
    又は酵素反応といったような化合物の特異的分子認識に基づいている、請求項１
    ６に記載の装置。
18. 【請求項１８】 化学的緩衝システムの壁上への中性化合物の直接的吸着を
    停止させるための手段をさらに含み、この手段が微細膜分離装置を含んで成る、
    請求項１〜１７のいずれか１項に記載の装置。
19. 【請求項１９】 前記装置及び分析物溶液の温度を制御するための手段をさ
    らに含んで成る、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の装置。
20. 【請求項２０】 精製済みの分析物溶液及び／又は回収された荷電化合物が
    装置からその他の分離及び／又は検出システム内へと移行できるようにする結合
    用手段をさらに含んで成る請求項１〜１９のいずれか１項に記載の装置。
21. 【請求項２１】 荷電及び中性化合物の同時及び／又は並行電気泳動分離及
    び精製を実施するために多重化されている、請求項１〜２０のいずれか１項に記
    載の装置。
22. 【請求項２２】 請求項１〜２１のいずれか１項に記載の装置を用いた、分
    析物溶液中の荷電及び中性化合物の電気泳動分離及び精製及び分離された画分の
    収集方法。
23. 【請求項２３】 前記化合物が、溶液中、任意には両性電解質を含まない又
    は緩衝液を含まない溶液中で回収可能であるようにする、請求項２２に記載の方
    法。
24. 【請求項２４】 化合物が、例えばタンパク質又はタンパク質誘導体又はイ
    ソ形のような有機化合物といった生体化合物であるようにする、請求項２２又は
    ２３に記載の方法。
25. 【請求項２５】 分析物溶液が有機溶媒を含有するか又は非水性である、請
    求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 【請求項２６】 装置が、問題の化合物を化学的緩衝システムに装填するた
    めに用いられる、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
27. 【請求項２７】 分析物溶液が、化学的緩衝システム内に問題の化合物を蓄
    積するためにチャンバ内で更新される、請求項２６に記載の方法。
28. 【請求項２８】 分析物溶液中の荷電及び中性化合物の電気泳動分離及び精
    製のための説明書を伴う、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の装置を含むキ
    ット。
29. 【請求項２９】 前記化合物が、両性電解質を含まない又は緩衝液を含まな
    い溶液といったような溶液中で回収可能である請求項２８に記載のキット。
30. 【請求項３０】 電気泳動分離及び精製のため分析物溶液と混合する必要の
    ある特定の化学物質を含む、請求項２８又は２９に記載のキット。
31. 【請求項３１】 電気泳動分離及び精製の前に分析物溶液を調製するために
    必要である特定の化学物質及び／又は分離システムを含んで成る、請求項２８〜
    ３０のいずれか１項に記載のキット。
32. 【請求項３２】 前記分離システムが、遮断膜及び／又は脱塩システムであ
    る、請求項３１に記載のキット。