JP2007524069A

JP2007524069A - フレームを使用した分子の抽出

Info

Publication number: JP2007524069A
Application number: JP2005508996A
Authority: JP
Inventors: ハドバウニク，デトレフ; ヴェンツ，クリスチアン
Original assignee: Agilent Technologies Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 2003-09-24
Filing date: 2003-09-24
Publication date: 2007-08-23
Also published as: WO2005029061A1; EP1668351A1; AU2003304479A1; US20060160127A1

Abstract

本発明は、担体（１５）上の少なくとも１つの分離媒体（２）から分子を抽出する方法であって、異なる区画（１Ａ）を有するフレーム（１）を分離媒体（２）と接触させ、それによって前記分離媒体を異なる区画へと分割する方法を開示する。その後、この異なる区画に少なくとも１つの溶媒を適用する。
【選択図】図１

Description

本発明は、分離媒体からの分子の抽出に関する。

核酸、ポリペプチドまたは小さな非ポリマー性有機分子等の分子に対し、多種多様な異なる分離技術が知られている。このような分離技術、例えば、等電点電気泳動、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ネイティブゲル電気泳動または濾紙電気泳動では、分離の実行後、分離された分子をそれぞれの分離媒体から回収することが必ず必要となる。回収は、通常、例えば種々の染色技術を用いて分離媒体中の分子または分子バンドを検出し、次いで手動でまたは自動式に分子バンドを切り出し、その後、切り出されたバンドに溶媒を適用して液体相中の分子を回収するといった、いくつかの異なるステップを含む。

さらなる分離のために、液体相中の分子には、１次元もしくは多次元の液体クロマトグラフィーまたはその他の分離技術をさらに施すことができる。分離された分子の分析は、質量分析を用いて行うことができる。

本発明は、改善された抽出技術を提供することを課題とする。

上記課題は、独立請求項に記載の手段によって解決される。本発明の好ましい実施形態は、従属請求項の対象となっている。本発明の実施形態は、迅速かつ容易に使用でき、１ステップで分離媒体から異なる分子バンドを抽出することを可能にする抽出技術を提供する。

本発明によれば、少なくとも１つの分離媒体から分子を抽出する方法は、
Ａ）異なる区画を有するフレームを分離媒体と接触させ、それによって前記分離媒体を異なる区画へと分割するステップと
Ｂ）この異なる区画に、少なくとも１つの溶媒を適用し、分子を抽出するステップと
を含む。

好ましい実施形態の方法は、１ステップで、少なくとも１つの分離媒体の異なる領域に位置する多量の異なる分子を抽出する、迅速でかつ操作が容易な方法を提供する。異なる分子を含む異なる区画へと分離媒体を分割するフレームの（好ましくは多くの）区画数があることによって、分離媒体中の異なる分子バンドを別々に処理する必要はなく、異なる区画に溶媒を適用することによって１ステップで抽出することができる。さらに、異なる分子バンドを、それぞれの分離媒体から切り出す必要もない。

通常、まず分子を分離媒体中で分離し、次いでステップＡ）を施す。上述のように、等電点電気泳動、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動または濾紙電気泳動等のような異なる最先端の分離技術を用いることができる。

他の変化形においては、分かれた区画を有する底のないマイクロタイタープレートを使用する。マイクロタイタープレートは、製造が容易で、また現在の最先端の器具であるので、分離媒体を異なる区画へと分離するための安価な器具を提供する。

好ましい実施形態では、ステップＡ）の前に、担体上に配置された複数の分離媒体中で分子を分離する。その後、ステップＡ）で、フレームを前記複数の分離媒体と接触させ、この複数の分離媒体を異なる区画へと分離する。

これにより、異なる区画を有するフレームを使用することにより、異なる分離媒体中の分離された分子を１ステップで抽出することによって、多量の分子を含む多くの分離媒体を、分子の分離後に１ステップで処理するための手段が得られる。したがって、これにより、異なる分離媒体中に存在する分子バンドを、１ステップで容易に抽出することができる。

本発明の方法では、ゲルをベースとした分離媒体を使用することもできる。ゲルをベースとした分離媒体は、ポリアクリルアミド、アガロース、デキストランまたはでんぷんから選択することができる。これらの分離媒体は、ポリペプチド、核酸または他の小さな有機分子の分離のために有用である。紙をベースとした分離媒体を、例えば、分子の濾紙電気泳動分離を行う場合に用いることもできる。

好ましい実施形態では、少なくとも１つの分離媒体に、さらにステップＢ）で動きを与える。ステップＢ）での分子抽出中の動きは、例えば、分子が局所的に高濃度とならないように、液体相中の既に抽出された分子を均一に分布させることによって、抽出プロセスを助成しうるものである。したがって、振盪等の動き、または抽出媒体を動かし続けさせる、例えば撹拌もしくは回転し続けさせる手段により、分離媒体から溶媒への分子の連続的な拡散を可能にする。この動きが分離媒体の完全性を失わせ得るので、分子の抽出を単純化させることができる。

その他の変化形においては、ステップＢ）で、少なくとも１つの分離媒体に電圧をかける。電圧によっても、良好な抽出プロセスが保証され得る。

有利には、ステップＡ）で、フレームを少なくとも１つの分離媒体上へとシールしかつ配置させるための手段を適用する。この手段は、例えば、フレームを分離媒体の上に押し付けて、抽出プロセス中、分離媒体上でのフレームの安定な配置を保証し、フレームが分離媒体に対して相対的に移動することのない、適用可能な力を含む。したがって、異なる区画からの分子の混入を招く滑りが起こることはない。

少なくとも１つの分離媒体から分子を分離し抽出するための装置は、
少なくとも１つの分離媒体、および
この分離媒体を異なる区画へと分離するための区画を有するフレームを含む。

このような装置は、例えばポリペプチド、核酸またはその他の小さな有機分子等の分離を、多種多様な異なる分離技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、アガロースゲル電気泳動またはその他の電気泳動的な技術を用いて実行するために有用である。分離後、分子は、通常、好ましくはストリップ状の分離媒体の異なる領域中に存在している。次いで、異なる区画を有するフレームを使用して、該フレームを分離媒体と接触させ、それによって該分離媒体を異なる区画へと分割することによって、異なる分子を分離媒体の異なる領域に分離する。

この装置は、例えば、等電点電気泳動またはポリアクリルアミドゲル電気泳動により多量のポリペプチドを分離および抽出するために、特に有用となり得る。また、この装置を、例えばアガロースゲルをベースとした分離媒体における核酸の分離のために使用することもできる。分離プロセス後、分離媒体中での対象分子の位置が分かると直ぐに、極めて単純かつ迅速な方法で、異なる種類の分子を互いに分離し、分離媒体から抽出することができる。

好ましくは、装置は、１ステップで同時に分子を分離するために、担体上に配置された複数のストリップ状の分離媒体を含む。このような装置によって、単一のステップで多量の分子を同時に分離するための迅速かつ操作が容易なプロセスが可能となる。異なる区画を備えたフレームによって、このような装置によって、複数のストリップ状の分離媒体から分離された分子の迅速な抽出プロセスも可能となる。複数の分離媒体は、例えば、ポリペプチドの等電点電気泳動プロセスのための、固定化された両性電解質を有するポリアクリルアミドをベースとしたゲルストリップ、核酸の分離のためのアガロースゲルストリップ、またはポリペプチドの分離のためのポリアクリルアミドをベースとした分離媒体を含む。

有利には、フレームは、異なる区画をシールするための手段をさらに含む。異なる区画をシールするための手段は、例えば、分離媒体と接触するフレームの領域内に設けられる、ゴム製のバンドのような可撓性のシールバンドを含み得る（例えば、図４参照）。シールバンドまたはシールリングは、異なる区画の、極めて信頼性の高い互いの分離を提供することができ、これによって、抽出プロセス中に異なる区画からの分子の混入が起こらないことが保証される。

装置は、分離媒体上にフレームを配置するための手段をさらに含み得る。この手段は、例えば、分離媒体上にフレームを固定し、かつ抽出プロセス中、フレームが分離媒体に対して滑ることを防止するクランプを含む（例えば、図３参照）。

以下に、本発明を、図面および実施形態によってより詳細に説明する。全ての図は、説明のみの目的で示された単に単純化された概略図である。

図１は、本発明の方法の実施のステップＡ）中の、担体１５上に配置された複数のストリップ状の分離媒体２、および異なる区画１Ａを有するフレーム１の平面図である。担体１５は、例えば、プラスチック、セラミックスまたは任意のその他の適切な担体材料で作られた平面状のシートを含み得る。各分離媒体が異なる別々の区画へと分割されるように、異なる区画１Ａを有するフレーム１を複数の分離媒体２と接触させる。

図２は、本発明の方法のステップＢ）中の、フレーム１、および担体１５上に配置されたストリップ状の分離媒体２の断面図である。

異なる区画１Ａを有するフレーム１は、分離媒体２と接触している。異なる区画１Ａは、好ましくは、その中に異なる分子１０が存在しているストリップ状の分離媒体２の異なる領域を密に分離する。異なる区画に溶媒５を適用することによって、分離媒体２から容易に１ステップで、異なる分子１０を抽出することができる。

図３は、本発明の方法のステップＢ）中の、ストリップ状の分離媒体２上のフレーム１の異なる構成である。このステップＢ）の変化形では、異なる区画１Ａを有するフレームが、好ましくはゲルをベースとした分離媒体２へと深く切り込み、それにより前記分離媒体が、各区画に対する別々の部分に切り分けられる。フレーム１は、分離媒体２が配置されている担体１５とフレーム１とが接触するように、ゲルをベースとした分離媒体を完全に切断してもよい。また、分離媒体がフレーム１により部分的にのみ切断されていてもよい。図３に示すように分離媒体を異なる区画へ完全に分離することによって、分離媒体の異なる領域中に存在する異なる分子１０の完全かつ厳密な分離が保証される。好ましくは、担体１５上にフレームを位置付けるためのクランプ３０が設けられる。このクランプ３０は、担体１５上にフレーム１を固く固定することができ、それにより滑りを防止する。このクランプは、グリッド、クランプおよび分離媒体の構成全体に本発明の方法のステップＢ）中に振盪を施す場合に、特に有用である。溶媒５を異なる区画へと適用し、ゲルをベースとした分離媒体から分子１０を抽出する。

図４は再び、本発明の方法のステップＢ）の別の変化形を示す。異なる区画１Ａを有するフレーム１が分離媒体２上に配置されている。フレーム１の領域にはシールバンド２０が設けられており、このシールバンド２０が、分離媒体２と直接接触している。このシールバンド２０によって、異なる区画が互いに密にシールされ、抽出プロセス中に異なる区画からの分子の混入が防止される。シールバンドは、例えば、濾紙電気泳動等で用いられる紙をベースとした分離媒体が使用される場合に、特に有用である。

実施例：等電点電気泳動ゲルからの大腸菌タンパク質の抽出
凍結乾燥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ細胞（菌株Ｂ−ＡＴＣＣ１１３０３、Ｓｉｇｍａ）を緩衝液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、１％ＤＴＴ）中に懸濁し、ＢＥＡＤ−ＢＥＡＴＥＲ（ＢＩＯＳＰＥＣＰＲＯＤＵＣＴＳ）中で供給元の推奨に従って破砕した。不溶性物質を遠心分離により除去した。細胞抽出物のタンパク質濃度をブラッドフォード法により測定し、緩衝液を用いて１ｍｇ／ｍｌに調節した。０．２５ｍｌの抽出物を、長さ１３ｃｍのＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅｄｒｙｓｔｒｉｐｐＨ４−７（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に載せ、室温で一晩再水和した。ＩＰＧｐｈｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて、ｃｕｐｌｏａｄｉｎｇｓｔｒｉｐｈｏｌｄｅｒｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中、ストリップあたり５０μＡの電流制限で２０℃で等電点電気泳動（ＩＥＦ）を行った。

５００Ｖでの１時間の泳動、および１０００Ｖでの１時間の泳動後、合計２０ｋＶｈに達するまで電圧を８０００Ｖに設定した。次いで、それぞれが０．６×０．６ｍｍの大きさを有する１５の区画を有するフレームをストリップ上に配置し、１５μｌの緩衝液を各区画に加えた。液体中での回収を、少なくとも１時間、２０℃で電圧（８０００Ｖ）をかける、または電圧をかけずに室温で振盪させて行った。全ての画分のタンパク濃度をブラッドフォード法により測定した（図６参照）。タンパク質の等電点（ｐＩ）の分布を、標準的な１次元の等電点電気泳動により測定した（図５参照）。１次元の等電点電気泳動プロセスのために、全ての画分を緩衝液で容量０．２５ｍｌに調節した。０．５％ＩＰＧ緩衝液（ｐＨ４−７）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加し、サンプル全量を、１３ｃｍのＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅｄｒｙｓｔｒｉｐ（ｐＨ４−７）上に載せ、室温で一晩再水和した。等電点電気泳動の条件は上述のものと同一であった。

図５は、本発明によるタンパク質の抽出が役立つことを検証するために行った１次元等電点電気泳動のゲルを示す。別々の区画を有するフレームを使用した本発明の抽出プロセスが、画分当たり０．１ｐＨ単位の分離性能で異なるタンパク質バンドの抽出をもたらすことが明らかとなった。図５の上部の番号は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞抽出物のタンパク質をそれらの等電点により分離するために先に行った等電点電気泳動のゲルから本発明の方法により抽出した１５種類の異なる画分を標識している。画分１および２は共に、同じゲルストリップ上に適用した。図５の左側のスケールは、異なるｐＨ単位を示す。タンパク質はＰｈａｓｔＧｅｌＢｌｕｅＲ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で染色した。

図６は、本発明の方法により等電点電気泳動ゲルから抽出した、異なる画分１〜１５におけるタンパク質の量を示す図である。これらの画分は、図５に示すものと同一である。図６の縦座標は、本発明の方法のステップＢ）で回収されたμｇ単位でのタンパク量を表す。

本発明の範囲は、図示の実施形態に限定されるものではない。実際、特に、異なる分離媒体を使用する実施形態が可能である。

本発明は、それぞれの新規な特徴、および特性のそれぞれの組み合わせにおいて実施され、この特徴の組み合わせが請求項中において明示的に記載されていない場合であっても、請求項中に記載された任意の特徴のあらゆる組み合わせを含む。

ストリップ状の分離媒体が配置された担体と接触するフレームの上面図である。異なる分離媒体上に配置された、異なる区画を有するフレームの断面図である。異なる分離媒体上に配置された、異なる区画を有するフレームの断面図である。異なる分離媒体上に配置された、異なる区画を有するフレームの断面図である。本発明の１つの実施形態により抽出されたポリペプチド画分を用いた、染色された等電点電気泳動ゲルを示す図である。ブラッドフォード法により測定された、図５に示す画分からのポリペプチドの量の分布を示す図である。

Claims

少なくとも１つの分離媒体から分子を抽出する方法であって、
Ａ）異なる区画を有するフレームを分離媒体と接触させ、それによって前記分離媒体を異なる区画へと分割するステップと、
Ｂ）前記異なる区画に、少なくとも１つの溶媒を適用するステップと
を含む、方法。
別々の区画を有する底のないマイクロタイタープレートを使用する、請求項１に記載の方法。
ステップＡ）の前に、担体上に配置された複数の分離媒体中で分子を分離し、
ステップＡ）で、前記フレームを前記複数の分離媒体と接触させ、複数の分離媒体を異なる区画へと分離する、請求項１または２に記載の方法。
少なくとも１つのゲルをベースとした分離媒体が用いられる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
分離媒体を使用し、
前記分離媒体が、ポリアクリルアミド、アガロースおよびデキストランから選択される、請求項４に記載の方法。
少なくとも１つの紙をベースとした分離媒体が用いられる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
ステップＢ）で、少なくとも１つの分離媒体にさらに動きが与えられる、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
ステップＢ）で、少なくとも１つの分離媒体に電圧がかけられる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
ステップＡ）で、フレームを少なくとも１つの媒体上へシールし配置する手段を適用する、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
分子が抽出され、
前記分子が、核酸、ポリペプチドおよび小さな有機分子の群から選択される、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも１つの分離媒体から分子を分離し抽出するための装置であって、
少なくとも１つの分離媒体と、
前記分離媒体を異なる区画へと分離するための区画を有するフレームとを具備する、装置。
前記分離媒体が、ゲルをベースとしたストリップ状の分離媒体である、請求項１１に記載の装置。
１ステップで同時に分子を分離するための、担体上に配置された複数のストリップ状の分離媒体をさらに含む、請求項１から１２のいずれか１項に記載の装置。
前記フレームが、異なる区画をシールする手段をさらに含む、請求項１から１３のいずれか１項に記載の装置。
前記分離媒体と接触する前記フレームの領域に、可撓性のシールバンドが設けられている、請求項１４に記載の装置。
前記フレームを分離媒体上に配置する手段をさらに有する、請求項１から１５のいずれか１項に記載の装置。
前記配置する手段が、クランプを含む、請求項１６に記載の装置。
少なくとも１つの分離媒体から分子を抽出する方法であって、
Ａ）異なる区画を有するフレームを分離媒体と接触させ、それによって前記分離媒体を異なる区画へと分割するステップと、
Ｂ）少なくとも１つの溶媒を、分子を抽出するために異なる区画へと適用するステップと
を含む、方法。