JP2002525191A - 巨大分子の分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、好ましくは、両性巨大分子、例えば、タンパク質またはペプチドの分取、分離に関しての自動化に適当な方法およびシステムに関し、ここで、当該方法は、（ａ）巨大分子の当該混合物を液状媒体中で等電点集点化法にかけ；（ｂ）試料を工程（ａ）から収集し、巨大分子を含む当該試料を等電点に基づき分離して、各々の試料を、複合体（１４）の一部である、電気泳動用媒体の入ったチャンネル（１３）に移し；（ｃ）当該複合体（１４）においてチャンネル（１３）に含まれる当該試料を電気泳動にかけ；そして（ｄ）巨大分子が当該電気泳動用媒体から溶出されるまで電気泳動を続けて、巨大分子を含む試料の画分を収集する；という工程を含んでなる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 技術分野 本発明は、液状媒体中での等電点集点化法(isoelectric focusing)を電気泳動
と組合わせ、その後、液状媒体に電気泳動溶出させるという二次元電気泳動によ
る、両性巨大分子の分離、特に、分取分離方法に関する、本発明はさらに、等電
点集点化装置、電気泳動媒体の入ったチャンネルを有する複合体、および当該方
法において使用するための溶出プレートを含んでなる、両性巨大分子の分離シス
テムに関する。

【０００２】 背景技術 二次元電気泳動の原理は、当業界で知られている。この技術は、通常、まず最
初に、ある分子混合物をpＨグラジエントが確立されたゲルでの等電点集点化法
にかけることを必要とする。その分子がpＨグラジエントをトラバースすると、
それらは、ある時点で、それらの各々の等電点に対応するpＨに達して、移動し
なくなる。慣例的には、この分離をキャピラリーゲルにおいて行った後、その試
料を、分子をそれらの分子量によって分離するＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけるために
、スラブゲルの上部に配置する。分離した分子をさらに処理するために、さらな
る操作工程、例えば、スポットを検出すること、スラブゲルからゲル片を切断す
ること、およびゲルからの物質の抽出が必要とされる。この方法が抱える問題は
、低い回収率である。この方法が抱える別の問題は、それが、主として、それを
行うための技能を必要とする手動処理であって、行うのに時間がかかる手動処理
であることである。

【０００３】 等電点集点化法はまた、ＵＳ ４,９７１,６７０に開示されているように、液
状媒体中で行うこともできる。多チャンバー式等電点集点化装置（ＩsoＰrime(
商標)装置）は、商業上入手可能である。この装置では、pＨを漸次変化させた一
組の緩衝化ポリアクリルアミド膜が、試料が循環する一連のチャンバーを区切る
。各々の膜は、pＨグラジエントにおける特定の工程を限定する。各々のチャン
バーは、それを結合する膜のpＨ値で決められたpＨ（またはpl）範囲を包含する
。電気泳動の間、あるタンパク質は、そのplを包含するチャンバーに達するまで
、連続チャンバーへと膜を通過する。タンパク質は、このチャンバーに集点化さ
れたままであり、その後、そのチャンバーから回収することができる。この処理
は、ある両性化合物を化合物の流れから分離して清浄しようとするものではない
。分析すべき複数の化合物であって、同じチャンバーにおいて終わる同じ等電点
を有する全ての化合物と同じ等電点を有する複数の化合物を分離するのには適当
ではない。次いで、それらをチャンバーから抽出して、幾つかの他の方法により
さらに分離しなければならない。

【０００４】 電気泳動用ゲルを入れるのに適当なチャンネルを有する複合体は、ＷＯ ９７
／３７２１６に開示されている。当該複合体は、チャンネルそのもの(in situ)
において試験、分析または反応処理を行うのに適当な化学媒体の入った、複数の
平行に長さを伸ばしたチャンネルを有する、完全に形成されたエレメントから作
られた壁構造を含んでなる。

【０００５】 しかしながら、両性巨大分子の混合物を分離することに関して現在知られてい
る方法は、しばしば、複雑な手動工程を必要とし、自動化するのは困難である。
加えて、既知の方法は、例えば、質量分析のような下流適用において直接使用す
るのに適当な試料を作製するために最適化されない。

【０００６】 図面の簡単な説明 図１は、一次元等電点集点化工程に適当な装置の上部概略図である。 図２は、二次元電気泳動に適当な複合体および収集プレートの概略図である。 図３は、収集プレートの下部緩衝液貯蔵所の側面図である。 図４は、上部緩衝液容器および収集プレートと一緒に、電気泳動媒体で満たし
たチャンネルの側面図である。

【０００７】 発明の開示 本発明は、上述の欠点を避けて、自動化を企図する、両性巨大分子の混合物を
分離する方法を提供する。本発明による方法の使用では、試料を、例えば、質量
分析または他の特性決定方法による下流処理に便利な溶液で得る。

【０００８】 その結果、第一態様において、本発明は、両性巨大分子、例えば、タンパク質
またはペプチドを分離する方法であって、 （ａ）巨大分子の当該混合物を液状媒体中で等電点集点化法にかけ； （ｂ）試料を工程（ａ）から収集し、巨大分子を含む当該試料を等電点に基づき
分離して、各々の試料を、複合体の一部である、電気泳動用媒体の入ったチャン
ネルに移し； （ｃ）当該複合体においてチャンネルに含まれる当該試料を電気泳動にかけ；そ
して （ｄ）巨大分子が当該電気泳動用媒体から溶出されるまで電気泳動を続けて、巨
大分子を含む試料の画分を収集する； という工程を含んでなる方法を提供する。

【０００９】 本発明による方法を、上述の工程（ａ）〜（ｄ）に関して、次の節にさらに記
載する。

【００１０】 （ａ）等電点集点化工程 等電点集点化工程は、便利には、膜で区切られた一連のチャンバーを有し、各
々のチャンバーが、当該膜で決められたpＨ範囲を包含する装置において行うこ
とができる。そのような装置は、例えば、ＵＳ ４,９７１,６７０から当業界で
知られている。しかしながら、本発明により、当該装置および分離チャンバーは
、当業界で知られているものより随分と小さくすることができることが理解され
るであろう。本発明による方法において、分離チャンバーは、例えば、便利には
、約５０〜約５００μl、好ましくは、約１００μlの容積を有する。

【００１１】 本発明の好ましい態様において、等電点集点化装置は、図１に図示する通りで
あり得る。それ自体が本発明のさらなる態様である、そのような装置は、普通の
マイクロタイタープレート（１）の形状およびサイズを有する（通常、約１５×
８５×１２５mm）。プレート（１）は、各々の短い端に緩衝液チャンバー（２）
を含んでなり、その緩衝液チャンバーには、陽極（＋）および陰極（−）を配置
し、または合体させることができる。そのプレートは、分離チャンバー（４）の
８つの横列および１２の縦列を有し、緩衝液チャンバー（２）とは、分離すべき
巨大分子に対して非透過性とするのに適当なカットオフポイント（例えば、２０
００Ｄa）を有する半透膜（６）で区切られている。

【００１２】 等電点集点化法に関しては、通常、約０.１〜５mgのタンパク質を含む生物学
的試料を、膜（８）、好ましくは、緩衝化ポリアクリルアミド膜で隔てられた、
１つ以上の分離チャンバー（４）に適用し、これらは各々、横列の分離チャンバ
ーに沿って、規定されたpＨを有し、従って、pＨ ３−１０または４−７といっ
たように、pＨグラジエントを限定する。分離チャンバー（４）を、通常、尿素
、非イオン性界面活性剤、両性担体および還元剤を含む緩衝液で満たす。適当な
緩衝液は、例えば、８Ｍ 尿素；４％ ＣＨＡＰＳまたは２％ Ｔriton−Ｘ１００
；０.５〜２％ Ｐharmalyte(商標)（Ａmersham Ｐharmacia Ｂiotech，Ｕppsala
，Ｓweden）；および６０mＭ ジチオトレイトール(ＤＴＴ)を含み得る。

【００１３】 ８列の分離チャンバー（４）は、電流方向に、すなわち、pＨが規定された膜
（８）に対して垂直に走り、分離すべき生物学的巨大分子に対しては非透過性で
ある壁（１０）で隔てられている。

【００１４】 その結果、分子がある列から別の列へとクロスオーバーする危険を全くなしに
して、幾つかの異なった試料を１つのシングルプレートで等電点集点化法にかけ
ることができる。

【００１５】 等電点集点化法は、通常、充填試料およびpＨ間隔により、５.０００〜５０.
０００ボルト時間続ける。等電点集点化工程の間、生物学的試料中の巨大分子は
各々、そのplを包含するチャンバー（４）に達するまで、分離チャンバー（４）
の横列における膜（８）全体を移動する。その分子は、このチャンバー（４）に
集点化されたままである。

【００１６】 （ｂ）電気泳動工程への移行 等電点集点化法の後、液体を各々の分離チャンバー（４）から順次抽出し、そ
れを電気泳動のための複合体（１４）におけるチャンネル（１３）に移すことに
より、試料を、手動で、または好ましくは、コンピューター制御マルチチャンネ
ルピペットを使用して、自動的に収集する。図２に説明するように、例えば、分
離チャンバー（４）の１つの横列から収集した１２の試料は、便利には、複合電
気泳動装置（１４）において対応する１２のチャンネル（１３）に移すことがで
きる。あるいはまた、縦列の８つの分離チャンバーから得られた８つの試料は、
複合電気泳動装置（１４）における８つのチャンネルに移すことができる。必要
ならば、ＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリウム)、着色料（例えば、ブロムフェノール
ブルー、ＢＦＢ）および／またはグリセロールといったような、適当な添加剤を
試料に加えることができる。

【００１７】 （ｃ）電気泳動工程 電気泳動に使用する複合体（１４）は、電気泳動媒体を入れるのに適当な、複
数の平行に長さを伸ばしたチャンネル（１３）を含んでなる。本明細書に関して
、「チャンネル」という用語は、キャピラリー、さらにはまた、より大きなディ
メンションのチャンネルが含まれることを意図する。図２に示す例において、複
合体（１４）は、好ましくは、プレート（１）における横列の分離チャンバーで
の分離チャンバー（４）の数と同じ数のチャンネル（１３）を有し、すなわち、
複合体（１４）は、１２のチャンネル（１３）を有する。しかしながら、複合体
（１４）は、考えられるところでは、幾つの数のチャンネルをも有し得る。

【００１８】 複合体（１４）は、例えば、一列で規則的に間隔をあけて一緒に結合した平行
キャピラリー（１３）を含んでなり得る。あるいはまた、複合体（１４）は、長
さを伸ばしたチャンネル（１３）を一列でもつ壁構造を含んでなり得る。そのチ
ャンネルは、円形、正方形または長方形の断面を有し得るが、他の断面形状も可
能である。

【００１９】 当該壁構造は、好ましくは、ガラス、またはポリプロピレンのようなプラスチ
ック物質といったような合成物質から押出成形する。適当な物質は、Ｃorrex(商
標)として知られている、半剛性シートの形状での、商業上入手可能なポリプロ
ピレン物質である。

【００２０】 電気泳動用化学媒体は、チャンネル（１３）の至る所で均一であり得るか、ま
たはチャンネルの配列を超えると、強度もしくは濃度が規則的な様式または他の
予め決められた様式で様々であり得る。様々な媒体が様々なチャンネルに入り得
る。そしてまた、化学媒体は、チャンネルの長さに沿って、例えば、濃度を変え
るようにすることができる。電気泳動媒体は、例えば、アガロース、ポリアクリ
ルアミド、または別のマトリックス形成媒体であり得る。

【００２１】 電気泳動の間、複合体（１４）は、陰極（３０）を配置し、または合体させ、
そして上部電気泳動緩衝液を含む容器（２６）と接触させて配置する。そのよう
な容器（２６）は、例えば、カラー（２６）の形状を有し得、これは、複合体（
１４）の上の部分にしっかりと取り付けられている（図４）。電気泳動工程にお
いて使用すべき緩衝液は、例えば、Ｌaemmli（１９７０）Ｎature（Ｌondon）２
２７，６８０で；またはＧarfin，Ｄ. Ｒ.，Ｍethods Ｅnzymol. １８２巻，４
２５で記載されているように、周知の方法により得ることができる。

【００２２】 電気泳動工程は、試料および／または緩衝液へのＳＤＳ(ドデシル硫酸ナトリ
ウム)の添加で、またはその添加なしに行うことができる。ＳＤＳを加えて、分
子量に基づいた巨大分子の分離のための、標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける変
性条件を得るが、例えば、タンパク質高次構造、タンパク質相互作用またはタン
パク質−核酸相互作用の研究のためには、ＳＤＳの添加を避けなければならない
。

【００２３】 （ｄ）収集工程 電場を電気泳動設備に適用する場合、負に帯電した分子は、陽極（２２）の方
に移動し、その結果、試料がゲルの端に達するまで電気泳動を続けることにより
、電気泳動チャンネル（１３）から溶出させて、収集することができる。この段
階では、例えば、分子量に基づいて、電気泳動にかけた巨大分子をさらに分離す
る。

【００２４】 本発明の好ましい形態において、複合電気泳動装置は、チャンネル（１３）か
ら普通のマイクロタイタープレートの形状およびサイズを有し得る収集プレート
（１８）のウェル（１６）への直接的な試料の溶出を可能とするディメンション
をとる。その収集プレートは、多数列のウェル（１６）を有し、ここで、各々の
列におけるウェル（１６）の数は、複合体（１４）におけるチャンネル（１３）
の数と同じである。このことを目的として、各々の電気泳動チャンネル（１３）
は、収集プレート（１８）上の個別ウェル（１６）への試料の送達を可能とする
突出部分（３２）を有することが理解されるであろう。

【００２５】 普通のマイクロタイタープレートでのように、固い底を有するというよりはむ
しろ、収集プレート（１８）には、好ましくは、各々のウェル（１６）の開いた
底を覆い、そして分離すべき巨大分子に対して非透過性とするのに適当なカット
オフポイント（例えば、２０００Ｄa）を有する、フィルターまたは半透過性膜
（２０）が取り付けられている。これを、陽極（１１）を配置し、または合体さ
せた下部緩衝液チャンバー（２４）の部分的側面図である図３に図説する。

【００２６】 図４はさらに、複合電気泳動装置（１４）に合体させたチャンネル（１３）お
よび収容する電気泳動媒体を含め、電気泳動および試料収集に適当な設備を図説
する。複合装置を、陰極（３０）を配置し、または合体させ、そして上部電気泳
動緩衝液を含む容器（２６）と接触させる。電気泳動にかけるべき試料を、電気
泳動ゲルの上部とチャンネルの上部との間のスペース（２８）に充填する。チャ
ンネル（１３）の下の部分（３２）は、収集プレート（１８）上のウェル（１６
）へと突出している。そのウェル（１６）は、上部と下部の電気泳動緩衝液の間
での連続的な接触を引き起こすために、下部電気泳動緩衝液を含むので、電場を
陽極（２２）と陰極（３０）との間に適用することができる。

【００２７】 分離した巨大分子の溶出の間、多数の画分を収集プレート全体に集めて、良好
な分離を得る必要があることから、電気泳動チャンネル（１３）を含んでなる複
合体（１４）を、便利には、手動で、または好ましくは、自動的に、（図２に矢
印で説明するように）段階的に動かすことができるので、チャンネル（１３）の
下の部分（３２）は、新たな列のウェル（１６）へと突出する。段階的な動きの
間、複合体を、例えば、ロボット（示していない）により、収集プレート（１８
）持ち上げ、それによって、溶出を一時的に中断する。その溶出は、チャンネル
（１３）の下の部分（３２）を再び降ろして電気泳動媒体と接触させると、自動
的に再開する。その結果、試料が各々のチャンネル（１３）から収集プレート（
１８）上の対応するウェル（１６）へと溶出されるよう、溶出は、収集プレート
（１８）全体に配置した複合体（１４）で一定時間行う。規定された時間の後、
複合体（１４）を持ち上げ、ウェル（１６）の次の列に動かした後、溶出が続け
られるよう、降ろす。分離した巨大分子の溶出が完了するまで、この手順を繰り
返す。勿論、複合体に関しては、そのままとして、代わりに、収集プレートを動
かすことも可能である。

【００２８】 試料の電気泳動および収集が完了したら、液状試料を、保存するために、また
は質量分析等のような下流適用において直接使用するために、手動、または好ま
しくは、自動処理により、ウェル（１６）から移すことができる。

【００２９】 別の重要な態様において、本発明は、両性巨大分子を分離するためのシステム
であって、（ａ）膜で区切られた一連のチャンバー（４）を有し、各々のチャン
バーが、当該膜（８）で決められたpＨ範囲を包含する装置を含んでなる、等電
点集点化方法；（ｂ）電気泳動用ゲルの入ったチャンネルを有する複合体；およ
び（ｃ）収集プレートを含んでなるシステムを提供する。当該システムは、本発
明による方法を自動的に行うのに適していること、そしてその結果、当該システ
ムの様々な部分は、上記の好ましい特徴を有することが理解されるであろう。

【００３０】 その結果、当該等電点集点化装置は、好ましくは、少なくとも一連の、膜で区
切られたチャンバーを有し、各々のチャンバーは、当該膜で決められたpＨ範囲
を包含し、そして本質的には、マイクロタイタープレートのディメンションを有
する。好ましくは、それは、分離すべき巨大分子に対しては非透過性である壁で
隔てられた、複数列の分離チャンバーを含んでなる。

【００３１】 好ましくは、当該収集プレートは、本質的には、マイクロタイタープレートの
ディメンションを有し、そして当該複合体は、チャンネルからそのような収集プ
レートのウェルへの直接的な溶出を可能とするディメンションを有する。

【００３２】 収集プレートは、好ましくは、収集すべき巨大分子に対しては非透過性である
、各々のウェルの底を覆う半透膜を含んでなる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、一次元等電点集点化工程に適当な装置の上部概略図であ
る。

【図２】 図２は、二次元電気泳動に適当な複合体および収集プレートの概
略図である。

【図３】 図３は、収集プレートの下部緩衝液貯蔵所の側面図である。

【図４】 図４は、上部緩衝液容器および収集プレートと一緒に、電気泳動
媒体で満たしたチャンネルの側面図である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１０月１４日（２０００．１０．１４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4D006 GA06 JA41Z JA71 KA16 KA17 KB01 KD30 MA03 MB05 PA05 PB52 PC38 4D054 FA10 FB20 4H045 AA40 EA50 GA32 GA33

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 両性巨大分子の分離、とりわけ、分取分離方法であって、 （ａ）巨大分子の当該混合物を液状媒体中で等電点集点化法にかけ； （ｂ）試料を工程（ａ）から収集し、巨大分子を含む当該試料を等電点に基づき
   分離して、各々の試料を、複合体（１４）の一部である、電気泳動用媒体の入っ
   たチャンネル（１３）に移し； （ｃ）当該複合体（１４）においてチャンネル（１３）に含まれる当該試料を電
   気泳動にかけ；そして （ｄ）巨大分子が当該電気泳動用媒体から溶出されるまで電気泳動を続けて、巨
   大分子を含む試料の画分を収集する； という工程を含んでなる方法。
2. 【請求項２】 等電点集点化工程を、少なくとも一連の、膜（８）で区切ら
   れた分離チャンバー（４）を有する装置（１）において行い、各々のチャンバー
   が、当該膜（８）で決められたpＨ範囲を包含する、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 当該装置（１）が、本質的には、マイクロタイタープレート
   のディメンションを有する、請求項２に記載の方法。
4. 【請求項４】 当該装置（１）が、分離すべき巨大分子に対しては非透過性
   である壁（１０）で隔てられた、複数列の分離チャンバー（４）を含んでなる、
   請求項２または３に記載の方法。
5. 【請求項５】 当該複合体（１４）を陰極（３０）および電気泳動緩衝液の
   入った容器（２６）と接触させる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】 電気泳動チャンネル（１３）から得られた試料を収集プレー
   ト（１８）上のウェル（１６）へと直接溶出させる、請求項１〜５のいずれかに
   記載の方法。
7. 【請求項７】 当該収集プレート（１８）が、本質的には、マイクロタイタ
   ープレートのディメンションを有し、そして当該複合体（１４）が、チャンネル
   （１３）から当該収集プレート（１８）のウェル（１６）への直接的な溶出を可
   能とするディメンションを有する、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 当該収集プレート（１８）が、収集すべき巨大分子に対して
   は非透過性である、各々のウェル（１６）の底を覆う半透膜（２０）を含んでな
   る、請求項６または７に記載の方法。
9. 【請求項９】 少なくとも一連の、膜（８）で区切られた分離チャンバー（
   ４）を有し、各々の分離チャンバー（４）が、当該膜（８）で決められたpＨ範
   囲を包含する、請求項１−８のいずれかに記載の方法において使用するための等
   電点集点化装置であって、本質的には、マイクロタイタープレートのディメンシ
   ョンを有することを特徴とする等電点集点化装置。
10. 【請求項１０】 分離すべき巨大分子に対しては非透過性である壁（６）で
    隔てられた、複数列の当該連続分離チャンバー（４）を含んでなる、請求項９に
    記載の等電点集点化装置。
11. 【請求項１１】 請求項１−８のいずれかに記載の方法に従い、両性巨大分
    子を分離するためのシステムであって、 （ａ）膜（８）で区切られた一連の分離チャンバー（４）を有し、各々の分離チ
    ャンバー（４）が、当該膜（８）で決められたpＨ範囲を包含する装置を含んで
    なる、等電点集点化方法； （ｂ）電気泳動用ゲルの入ったチャンネル（１３）を有する複合体（１４）；お
    よび （ｃ）収集プレート（１８）； を含んでなるシステム。
12. 【請求項１２】 当該複合体（１４）を陰極（３０）および電気泳動緩衝液
    の入った容器（２６）と接触させる、請求項１１に記載のシステム。
13. 【請求項１３】 当該収集プレート（１８）が、本質的には、マイクロタイ
    タープレートのディメンションを有し、そして当該複合体（１４）が、チャンネ
    ル（１３）から当該収集プレート（１８）のウェル（１６）への直接的な溶出を
    可能とするディメンションを有する、請求項１１または１２に記載のシステム。
14. 【請求項１４】 当該収集プレート（１８）が、収集すべき巨大分子に対し
    ては非透過性である、各々のウェル（１６）の底を覆う半透膜（２０）を含んで
    なる、請求項１３に記載のシステム。