DE3876273T2

DE3876273T2 - Isoelektrisches fokussierverfahren sowie einrichtung zur durchfuehrung dieses verfahrens.

Info

Publication number: DE3876273T2
Application number: DE8888810226T
Authority: DE
Inventors: Daniel Michel Faupel; Pier Giorgio Prof Righetti
Original assignee: Ciba Geigy AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1987-04-11
Filing date: 1988-04-07
Publication date: 1993-05-27
Anticipated expiration: 2008-04-08
Also published as: DK191388D0; FI881652A; DE3876273D1; US5082548A; FI97893C; US4971670A; PT87210B; DK191388A; EP0287513A2; HK192495A; EP0287513A3; ES2037273T3; CA1335805C; IE881067L; IE62803B1; FI97893B; JPH0781987B2; EP0287513B1; GR3007124T3; JPS63263457A

Description

Isoelektrisches Fokussierverfahren sowie Einrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues und erfinderliches Verfahren zur Trennung von chemischen Verbindungen z.B. Peptide und Proteine, die unter den benutzten experimentellen Bedingungen eine elektrische Netto-Null-Ladung haben oder neutral sind, von anderen amphoteren oder nicht-amphoteren chemischen Verbindungen z.B. andere Peptide, Proteine und/oder Salze, die unter den selben genannten experimentellen Bedingungen der Elektrophorese, eine elektrische Netto-Ladung besitzen, besonders auf präparatives isoelektrisches Fokussieren und eine neue Einrichtung, um das genannten Verfahren durchzuführen.
Die präparative Elektrophorese ist eine bekannte Technik wobei verschiedene Arten von Elektrophoresevorrichtungen vorgeschlagen worden sind sowohl für analytische als auch für präparative Zwecke. Im wesentlichen können die Instrumente und Prinzipien der präparativen Elektrophorese in vier Hauptklassen eingeteilt werden, entsprechend den angewandten elektrophoretischen Grundsätzen [vgl. A. T. Andrews, Electrophoresis: Theory, Techniques, and Biochemical and Clinical Applications, Clarendon Press, Oxford 1986]:
a) Scheiben-Elektrophorese
b) Freie Vorhang- Elektrophorese
c) Isotachophorese und
d) Isoelektrische Fokussierung [vgl. P.G. Righetti, Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications, Elsevier, Amsterdam, pp. 204-207 (1983) ].
Im Allgemeinen werden die Scheiben-Elektrophorese und Isotachophorese entweder kontinuierlich (Agarose und Polyacrylamid) oder diskontinuierlich (granuliertes Bett, z.B. Sephadex ) in hydrophiler Matrix durchgeführt. Sie sind gekennzeichnet durch hohes Auflösungsvermögen jedoch bei niedrig zulässiger Probenbeladung. Die "Freie Vorhang-Elektrophorese" nutzt im Allgemeinen einen kontinuierlichen Puffer, wird durchgeführt in einer freien flüssigen Phase und ist gekennzeichnet durch einen kontinuierlich fließenden dünnen Pufferfilm mit einer kontinuierlichen Porbenzugabe.
Grundsäztlich bietet diese Technik eine große Kapazität an Probenbearbeitung aber eine niedrige Auflösung. Dazu, bedingt durch höhere Diffusionskoeffizient der Proteine, ist diese Methode zumeist auf die Reinigung von intakten Zellen oder subzellulare Organelle beschränkt.
Die isoelektrische Fokussierung (IEF) kann kontinuierlich oder granuliert entweder in flüssigen Trägern (Dichtegradienten) oder in Gelmedien durchgeführt werden. Tatsächlich wird die IEF-Technik als präparative Methodik eingeführt unter Verwendung von senkrechten Glassäulen, gefüllt mit einem Sacharose-Dichtegradienten. Eine mäßig hohe Probenbeladung konnte mit einem hohen Auflösungsvermögen gehandhabt werden, (Δ pI=0,02 einer pH-Einheit; pI= isoelektrischer Punkt) welches verloren ging, sobald die Säule über einen Bodensammeltrichter entleert wurde. Diese Technik ist bis heute gänzlich aufgegeben worden zu Gunsten einer IEF in gelatinösen Träger-Medien (meistens Agarose und Polyacrylamidmatrices). Letztere ermöglicht ein hohes Auflösungsvermögen aber nur eine mäßige Proteinbeladung. Dazu kommt noch, daß bei allen präparativen Techniken, welche die hydrophilen Gele als anticonvektive Medien benutzen, die Wiedergewinnung des gereinigten Proteins aus der Matrix ein Problem darstellt. Dies erfordert zusätzliche Behandlungsschritte, z.B. Detektion der interessierenden Zone, herausschneiden der Bande und Elution mittels Diffusion oder elektrophoretischer Rückgewinnung. Dies beinhaltet zwei große Nachteile: a) niedrige Ausbeute, da jede Matrix zur irreversiblen Adsorbtion des Proteins tendiert und b) die Möglichkeit der Verschmutzung von Gelmaterial (speziell im Falle von synthetischen Trägern, wie bei Polyacrylamid, wo eine Verschmutzung durch unreagiertes Monomer und durch kurze oligomere Polyacrylamidknäuel vorliegt, die nichtkovalent auf die Hauptmatrix aufgepfropft sind).
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Aufgabenstellung ein Verfahren zur Reinigung von chemischen Verbindungen zu schaffen, die wie Peptide einen isoelektrischen Punkt haben oder unter den bei der Elektrophorese angewandten Bedingungen ungeladen sind, wobei im Gegensatz zum gewünschten Produkt nur die unerwünschten Nebenprodukte und Verunreinigungen in Kontakt mit der Matrix kommen und das Verfahren eine excellente Ausbeute des gewünschten Produktes in einer sehr reinen Form ermöglicht.
Sowohl die Konzeption der genannten Aufgabe als auch ihre Lösung beinhalten erfinderliche Schritte.
Im Folgenden wird die Erfindung mit Verweis auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben wovon:
Fig. 1 ) eine schematische Gesamtansicht einer Apparatur darstellt, die benutzt werden kann, um das elektrophoretische Verfahren entsprechend der vorliegenden Erfindung durchzuführen,
Fig. 2 ) eine schematische, auseinandergezogene Darstellung ist von der in Bild 1 genannten Apparatur,
Fig. 3 ) eine schematische, auseinandergezogene Darstellung einer alternativen Ausführung einer Apparatur ist, entsprechend vorliegender Erfindung,
Fig. 4) ein schematische Ansicht der wesentlichen Teile einer anderen alternativen Ausführung einer Apparatur ist, die dazu benutzt werden kann, das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung durchzuführen.
Fig. 5, Fig. 6 und Fig. 7 Diagramme sind, die den Erfolg der elektrophoretischen Trennung entsprechend dem Verfahren der vorliegenden Erfindung illustrieren,
Fig. 8 ) eine Schnittansicht einer dritten alternativen Ausführung einer Apparatur gemäß vorliegender Erfindung darstellt.
Fig. 9 ) eine Ansicht von unten auf eine perferierte Scheibe ist, welche ein Teil der Apparatur, dargestellt in Bild 12 ist.
Fig. 10 ) eine Ansicht auf selbige Scheibe von Oben ist,
Fig. 11 ) ein Querschnitt entlang der Linie XI-XI in Bild 9 ist und
Fig. 12) ein Querschnitt einer vierten Alternative einer Apparatur gemäß vorliegender Erfindung ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein isoelektrisches elektrophoretisches Fokussierverfahren zur Trennung und Reinigung einer amphoteren oder neutralen chemischen Verbindung, welche in einem für das besagte Verfahren geeignetem Lösungsmittel gelöst ist, von einer oder mehreren elektrisch geladenen chemischen Verbindungen, welche in dem besagten Lösungsmittel löslich sind, wobei besagtes Verfahren unter Anwendung einer elektrophoretischen Apparatur durchgeführt wird, worin der elektrische Fluß, d.h. das elektrische Feld, das die elektrophoretische Matrix durchsetzt, an einen hydraulischen Fluß 7, 8 und 11 (vgl. die Figuren) gekoppelt ist und die Richtung des besagten elektrischen Flusses unterschiedlich von dem des besagten hydraulischen Flusses ist und besagter hydraulischer Fluß aus einer Lösung benannter Verbindung im besagten Lösungsmittel besteht und die benannte Matrix in zwei Teile teilt, wobei ein Teil, 5 oder 25 sich auf der Kathodenseite und der andere, 12 oder 26, sich an der Anodenseite des besagten elektrischen Flusses befindet, dadurch gekennzeichnet, daß besagte amphotere oder neutrale chemische Verbindung in einem isoelektrischen oder ungeladenen Zustand innerhalb des hydraulischen Flusses gehalten wird und die besagte geladene chemische Verbindung(en) mittels des elektrischen Flusses aus dem hydraulischen Fluß in wenigstens eine der besagten Teile der Matrix entfernt wird (werden) oder mittels wenigstens eines der benannten Teile in wenigstens eines der Elektrolylösung-Reservoirs 3 und 14, wobei besagte Teile, unabhängig voneinander immobilisierte pH-Gradienten (5) und (12) repräsentieren, wovon jeder eine Leitfähigkeit und sowohl eine Pufferungs- als auch eine Titrations- Kapazität in seinem pH-Intervall besitzt, oder amphotere isoelektrische immobilisierte pH-Membran (25) und (26), wobei jede eine Leitfähigkeit und beides, Pufferungs- und Titrationskapazität, bei einem bestimmten pH-Wert besitzt.
Die amphotere oder neutrale Verbindung, die in einem isoelektrischen oder ungeladenen Zustand gehalten wird, ist eine chemische Verbindung, die keine elektrische Nettoladung hat oder neutral ist unter der Bedingung des Reinigungsprozesses und zum Zeitpunkt, wenn die Trennung von der (den) unerwünschten begleitenden Verbindung(en) tatsächlich stattfindet. Es ist vorzugsweise ein Protein, Enzym oder kleineres Peptid mit mindestens zwei Aminosäuren oder eine Verbindung, die einen Peptid- oder Proteinanteil enthält, z.B. ein Glykoprotein, aber auch eine Nucleinsäure, komplexe Lipide oder komplexe Carbohydrate.
Im Gegensatz dazu, ist eine elektrisch geladene chemische Verbindung eine chemische Spezies, die unter der Bedingungen des Reinigungsprozesses und zu der Zeit, wenn die Trennung von der gewünschten chemischen Verbindung tatsächlich passiert, eine elektrische Ladung besitzt, z.B. ein Protein, Enzym oder kleineres Peptid, welche geladen sind, d.h. nicht isoelektrisch sind, ebenso ein Salz, z.B. ein Alkalimetallsalz, z.B. Natriumchlorid.
Ein geeignetes Lösungsmittel für das Verfahren, gemäß der vorliegenden Erfindung, ist jedes Lösungsmittel, daß die gewünschte chemische Komponente löst und den erforderlichen elektrischen Fluß zuläßt, z.B. Wasser oder eine Mischung bestehend aus Wasser mit einem geeigneten Alkohol z.B. ein niederes Alkanol, zum Beispiel Methanol oder Ethanol, oder eine wässrige Lösung, enthaltend Harnstoff, Detergentien oder beliebig andere mit Wasser mischbare organische oder protische Lösungsmittel.
Der elektrosche Strom wird von dem Netzteil 1 erzeugt. Jede Spannung die das System verträgt, kann benutzt werden, z.B.: 100 bis 10000 Volt, insbesondere 500 bis 10000 Volt, vorzugsweise 500 bis 5000 Volt, z.B. 500, 1000, 5000 oder sogar 10.000 Volt, vorausgesetzt, daß die entstehende Wärme mittels ausreichender Kühlung abgeführt werden kann. Im Gleichgewicht sind die typischen Werte z.B. : 1000 Volt, 3mA und 3W oder 500 Volt, 10mA und 5W.
Die elektrophoretische Matrix ist der Träger für die elektrophoretische Trennung.
Der hydraulische Fluß wird z.B. mittels einer Pumpe durch Rühren oder Rotieren der Strömungskammer 8 um eine geeignete Achse erzeugt und beinhaltet als flüssige Phase eine Lösung, die die zu separierende Mischung enthält.
Die Richtung des hydraulischen Flusses stellt jeden geeigneten Winkel dar, z.B. 5º bis 90º, besonders 30º bis 90º vorzugsweise nahezu senkrecht (orhtogonal) zu der Richtung des elektrischen Flusses.
Ein festgelegter pH-Gradient, wie er z.B. in den Zylindern 5 oder 12, enthalten, beinhaltet eine stabile pH-Funktion innerhalb einer elektrophoretischen Matrix z.B. einem Gel. Festgelegte pH-Gradienten bestehen aus einem pH-Interval, welche durch eine bekannte Art und Weise erzeugt werden, z.B. mittels eines überlagerten Dichtegradienten und einer Polymerisation (vgl. Application Note 321, dated August 1982, of LKB-Produkter AB, Box 305, S-16126 Bromma, Sweden), z.B. durch Mischen gleicher Volumina zweier Ausgangslösungen A und B in einem Gradienten-Mischer, wie unten beschrieben, z.B. "MicroGrad Gradient Maker" geliefert von LKB-Produkter AB, wobei der Ausgang dieses besagten Mischers mit Zylinder 5 oder 12 verbunden wird. Die Ausgangslösung A ist eine saure, dichte Lösung und beinhaltet Puffernde "Immobiline" (registriertes Markenzeichen, im folgenden angewendet, ohne Angabe) oder ein Äquivalent davon, nicht puffernde "Immobiline" oder ein Äqivalent davon, "Ampholin" (registriertes Markenzeichen, im weiteren ohne Angabe verwendet) oder ein Äquivalent davon, Acrylamid, N,N'-methylen-bis-acrylamid, Glycerin, Wasser und geeignete Polymerisationskatalysatoren. Die Ausgangslösung B ist eine basische leichte Lösung und enthält pufferende "Immobiline", nicht puffernde "Immobiline", "Ampholin", Acrylamid, N,N'-Methylen-bis-acrylamid, Wasser und geeignete Polymerisationskatalysatoren, aber kein Glycerin.
Amphotere isoelektrisch festgelegte pH-Membrane unterscheiden sich von den festgelegten pH-Gradienten dadurch, daß sie kein pH-Intervall beinhalten sondern durch die gesamte. Membran hindurch den gleichen pH-Wert haben. Die Herstellung der Membrane ist ähnlich, aber nach einfacher als die Herstellung des pH-Gradienten, weil kein Gradientenmischer erforderlich ist und kein Glycerin zur Herstellung eines Dichtegradienten erforderlich ist.
Die Membranen werden über Polymerisation einer Lösung von Monomeren ( Im Allgemeinen 10-15% T und 3-4% C) hergestellt, vorzugsweise bei etwa neutralem pH und bei 50 ºC in einem zwangsbelüfteten Ofen während 1 Stunde, welche variable Mengen an puffernden und titrierenden "Immobiline" in einem Verhältnis enthalten, welches notwendig ist, um den gewünschten isoelektrischen Punkt einzustellen zusammen mit Ampholin, geeigneten Polymerisationskatalysatoren und Wasser. Es ist von besonderer Wichtigkeit, daß die Membranen eine gute Pufferungskapazität an deren isoelektrischen Punkt besitzen, um Elektroendosmose, einen Begriff der einen mengenmäßigen Flüssigkeitsstrom durch die Membrane, verursacht durch die Gegenwart oder den Zugewinn einer elektrischen Nettoladung, bezeichnet, vorzubeugen. Jedoch sollte die Molarität der "Immobiline" vorzugsweise nicht 50mM einer jeden "Immobiline" in der Membran überschreiten.
Ampholine sind amphotere Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht, d.h. sie sind Ampholyte, welche im Gegensatz zu "Immobiline" nicht an Acrylamid/ N,N'-Methylen-bis-acrylamid-Polymer gebunden sind und demzufolge in der Lage sind zur elektrischen Leitfähigkeit beizutragen. Mischungen vieler amophoterer Substanzen, wie Aminosäuren und Peptide und einige amphotere und nichtamphotere Pufferkomponenten können als geeignete Ampholyte agieren. Jedoch die überwiegende Anzahl von Experimenten der isoelektrischen Fokussierung werden mit Hilfe der kommerziellen Ampholyt-Mischungen ausgeführt. Die meist gebrauchte von denen wird von der LKB Produkter AB, unter dem Handelsnamen "Ampholin" vertrieben. Sie bestehen aus synthetischen Mischungen von Polyaminopolycarboxylsäuren mit Molekulargewichten meist im Bereich von 300-600. Andere Produkte können angewendet werden, welche zusätzlich Sulfon- oder Phosphonsäure-Gruppierungen zu dem Amino- und Carboxylsäuregruppen beinhalten. Diese Produkte (Servalyts , Serva-Feinbiochemica GmbH; Biolytes , Bio-Rad Laboratories; Pharmalytes , Pharmacia AB) sind kürzlich mit dem Ampholine verglichen worden und zeigen ein ähnliches Leistungsvermögen.
"Immobiline" sind Derivate des Acrylamids mit der allgemeinen Struktur CH&sub2;=CH- - -R, wobei R entweder eine Carboxylsäure- oder eine tertiäre Aminogruppe enthält. "Immobiline" sind für die Copolymerisation mit Acrylamid und N,N'-Methylen-bis-acrylamid bestimmt, um festgelegte pH-Gradienten herzustellen. Jedes Derivat hat einen definierten und bekannten pK-Wert. Acrylamid kann ersetzt werden z.B. durch Methacrylamid und N,N-Methylen-bis-acrylamid kann durch jeden anderen geeigneten Vernetzer, z.B. passende andere Acrylamidderivate, ersetzt werden. Als Analog zu einer "Immobiline" sei N-(3-dimethylamino-propyl)-methacrylamid mit einem pK-Wert von 9.5 als ein Beispiel eines Methacrylamidderivates erwähnt. Nach der Copolymerisation sind die "Immobiline" kovalent gebunden, d.h. unbeweglich und tragen nicht zur Leitfähigkeit des pH-Gradienten oder pH-Membran bei. Wie auch immer die "Immobiline" tragen zur Pufferungs- und Titrationskapazität bei.
Vorzugsweise sind die pH-Gradienten und pH-Membranen irgendwo innerhalb des pH-Bereiches von etwa 3 bis etwa 10 eingestellt abhängig von den verfügbaren "Immobilinen" und "Ampholinen". Wenn die interessierende Verbindung amphoter ist, muß der pH-Wert an den beiden Gelenden gegenüber der Strömungskammer 8 gerade über bzw. gerade unter oder gleich dem isoelektrischen Punkt der genannten amphoteren Substanz mit der erforderlichen Präzision sein, um sie die ganze Zeit über im isoelektrischen Zustand zu halten. Die genannte Genauigkeit und die Differenz zwischen den pH-Werten in den besagten Gelenden, d.h. die Weite im Sinne von pH-Einheiten des Zwischenraumes zwischen den genannten Gelenden, hängt von dem benötigten Auflösungsvermögen, d.h. von den isoelektrischen Punkten der Schmutzstoffe ab, welche in das Gel eintreten, d.h. letztendlich das Gel durchlaufen. Um das höchstmögliche Auflösungsvermögen zu erlangen, kann der pH-Wert der genannten Gelenden derselbe und gleich dem isoelektrischen Punkt der erwünschten Verbindung sein. In diesem Fall ist es vorteilhaft, die Verluste des erwünschten Produktes, die durch Diffusion auftreten könnten, durch Anbringen von passenden mechanischen Einrichtungen, z.B. ein geeigneter Millipore-Filter, zwischen dem Gel und dem hydraulischen Fluß, zu verhindern. Im Falle, daß die interessierende Verbindung neutral ist, ist der pH-Wert der genannten Gelenden so zu wählen, daß die Verschmutzungen in das Gel eintreten. Die besagten Verschmutzungen mögen in dem Gel bleiben oder es wieder verlassen und sich in der Anoden- oder Kathodenkammer 14 und 3 ansammeln.
Geeignete Polymerisationskatalysatoren sind z.B. N,N,N,',N'-tetramethylethylendiamin (TEMED) und Ammoniumpersulfat. Die genannten Katalysatoren werden kurz vor Mischungsbeginn der oben erwähnten dichten und leichten Lösungsen zugegeben. Andere Mittel für die Polymerisation sind z.B. Riboflavin mit Ultraviolettlicht oder Gamma-Strahlen.
In dem Gradientenmischer, wird die basische leichte Lösung in eine saure dichte Lösung gemischt, welche gleichzeitig durch den Ausgang des Gradientenmischers, der mit dem Behälter 5 oder 12 gekoppelt ist, abgezogen wird. Auf diese Weise geht der erhaltene Dichtegradient mit dem pH-Gradient konform. Das untere Ende des Behälters 5 und 12 wird provisorisch mit z.B. Parafilm versiegelt. Nach dem der Polymerisationsprozeß beendet ist, wird der Parafilm entfernt. Falls der Innendurchmesser des genannten Behälters zu lang ist, kann die Installation von einigen Unterstützungen wie z.B. einer perforierten Platte, die nicht mehr entfernt wird, an dem untersten Ende des Behälters notwendig sein. Wenigstens müssen die Teile des Behälters, die mit dem Polymer in Kontakt kommen, aus einem Material sein, an dem das Polymer gut anhaftet, z.B. aus Glas, um das Durchlaufen von Flüssigkeit zwischen der Behälterwand und dem Polymer zu verhindern. Die Behälter 5 und 12 die den festgelegten pH-Gradienten beinhalten, sind, wie gezeigt in der Figur 1 und 2, in einer Apparatur gemäß der vorliegenden Erfindung eingebaut. Nachher werden die Gradienten gründlich gewaschen um die unerwünschten Substanzen zu entfernen, z.B. ungebundene "Immobiline- Chemikalien", Katalysatoren und nichtgepropfte Monomere. Ansonsten werden wegen der sehr niedrigen Leitfähigkeit des mittleren Teils des Gels, da die schwachen ungebundenen Anionen und Kationen, elektrophoretisch erschöpft sind, die zwei Salzfronten, welche in Richtung des anodischen und katodischen Bereiches des Gels angehäuft sind, nicht das Gelverlassen können. Um eine gute Fokussierung zu erlangen, ist der primäre "Immobilin-Gradient" von einem sekundären pH-Gradient überlagert, der durch den Ampholytträger bedingt ist. Die Apparatur, gemäß der vorliegenden Erfindung wird normalerweise einige Stunden, z.B. fünf Stunden bis zum Erreichen des Strömungsgleichgewichtes bei mit Flüssigkeit voller Strömungskammer gefahren, ehe die Probe eingespeist wird. Danach werden die Strömungskammer 8 und wenn nötig alle anderen Behälter, die in Berührung mit dem hydraulischen Fluß kommen, z.B. der Probenbehälter 11, geleert, um das dem Polymer ausgelaugte schädliche Material wie nicht gepfropftes Monomer zu entfernen und mit der zu reinigenden Probe gefüllt.
Während des gesamten Prozesses gemäß der vorliegenden Erfindung, wird die Probelösung stark gerührt, um eine Elektrodekantation zu verhindern und bei konstanter Temperatur zu halten. Die pH-Gradienten in den Behältern 5 und 12 werden ebenfalls unter konstanter Temperatur gehalten. Die gewählte Temperatur ist u.a. abhänging von dem Lösungsmittel, der Stabilität und der Löslichkeit der gewünschten Substanz. Im Wasser wird sie normalerweise in bestimmter Höhe zwischen etwa 1 und 20ºC , z.B. bei 2 ºC gehalten.
Das Hauptkonzept der vorliegenden Erfindung ist eine gemischte Präparativetechnik, welche ein Flüssigkeitbett benutzt, das ein kurzes sein kann und mit den es begranzenden beiden Gelphasen verbunden ist und wird in dem folgenden Beispiel der Reinigung eines Proteins dargestellt. Das interessierende Protein wird in einem isoelektrischen Zustand in der flüssigen Phase gehalten z.B. in einer kleineren Umpumpkammer, während die es begleitenden Verunreinigungen entweder gegen Kathode 2 oder Anode 13 abgeführt werden und schließlich (aber nicht notwendigerweise) in den Gelphasen 5 und 12, die den pH-Gradienten repräsentieren, fokussiert werden (für die Nummerns. die Figuren). Der pH-Gradient kann durch pH-Membranen ersetzt werden. Somit wird in dieser modifizerten isoelektrischen Fokussierungstechnik das Protein nicht elektrophoretisch in die Gelmatrix überführt (von welcher es durch einen zusätzlichen Reinigungsschritt entfernt werden müßte ), sondern wird in einem isoelektrischen Zustand in der flüssigen Strömung (hydraulischer Fluß) 7, 8, und 11 gehalten, die die Probenzufuhr darstellt, nur die (elektrisch geladenen) Verunreinigungen sind gezwungen sich in den Gelphasen 5 und 12 zu fokussieren, die den Flüssigprobeneingang abgrenzen oder sich in einem oder beiden Elektrolyt-Reservoirs 3 und 14 zu sammeln. Vorzugsweise entspricht der pH-Wert des hydraulischen Flusses dem isoelektrischen Punkt der gewünschten Verbindung. Weil die elektrophoretische Trennung in einem pH-Gradienten ausgeführt wird (isoelektrische Fokussierung), werden alle Spezies die einen isoelektrischen Punkt innerhalb des pH-Gradienten 5 oder 12 haben, durch den Spannungsgradienten die besondere Zone, wo sie eine Nettoladung von Null zeigen, getrieben und bleiben stationär dort, solange das elektrische Feld anliegt.
Der Unterschied im Vergleich zu den vorhergehenden Techniken besteht u.a. darin, daß die Ausgangsbedingungen in einer solchen Art und Weise eingestellt sind, daß die interessierende Komponente schon in der Strömungskammer 8, welche die Probenzufuhr zu dem System bildet, isoelektrisch ist. Aus diesem Grund ist die interessierende Komponente nicht gezwungen, durch den elektrischen Fluß zu wandern. Statt der Anwendung von konventionellem iso-elektrischen Fokussiersystem (IEF), das auf amphoteren Puffern basiert [vgl. P.G. Righetti, Isoelektric Focusing: Theory, Methodology and Applications, Elsevier, Amsterdam, pp. 204-207 (1983)], wird in dem Prozeß gemäß der vorliegenden Erfindung, eine fortschrittlichere Version davon, eine festgelegte pH-Gradiententechnik (IPG) [vgl. P. G. Righetti, J. Chromatogr. 300, 165-223 (1984)] benutzt.
Ein konventionelles isoelektrisches Fokussiersystem (IEF) würde aus folgenden Gründen für den Prozeß gemäß der vorliegenden Erfindung nicht geeignet sein: a) IEF ist über die Zeit nicht stabil. Tatsächlich nimmt der pH-Gradient ab und ist einer fortschreitenden Versäuerung (kathodischer Drift) [vgl. P.G. Righetti und J.W. Drysdale, Ann. N.Y. Acad. Sci. 209, 163-186 (1973) ] unterworfen, sodaß das interessierende Protein nicht in der flüssigen Phase gehalten sondern sich letztendlich in die Gelmatrix bewegen würde. b) Aufgrund der Tatsache, daß in dem konventionellen IEF-System die pH-Gradienten nur in einer angenäherten Weise erzeugt werden, würde es unmöglich sein, die Randbedingungen in den zwei Gelenden, welche der Strömungskammer 8 gegenüberliegen, mit der Präzision, die erforderlich ist, um die interessierende chemische Verbindung, welche einen isoelektrischen Punkt besitzt, gerade in einem isoelektrischen Zustand über die ganze Zeit zu halten, wodurch sie davon abgehalten wird, die flüssige Phase zu verlassen [hydraulischer Fluß: 7, 8, 11]. Im Gegensatz dazu, ist es in den meisten Fällen bei festgelegten pH-Gradienten (IPGs) und pH-Membranen möglich, die Randbedingungen so einzustellen, daß das anodische Gelende, welches der Proben-Strömung gegenüberliegt, einen pH-Wert gerade unter dem isoelektrischen Punkt (pI) der interessierenden Verbindung hat, während das entsprechende kathodische Gelende auf einen pH- Wert gerade über den pI der gewünschten Verbindung eingestellt ist. Natürlich mag die Herstellung von geeigneten IPGs in verhältnismässig seltenen Fällen, wo die gewünschte Substanz einen extrem hohen oder niedrigen pI hat, schwierig sein. Die genannte chemische Verbindung, die einen isoelektrischen Punkt hat, wird demzufolge in diesem schmalen pH-Band, das durch zwei festgelegte pH-Gradienten oder pH-Membranen begrenzt ist, isoelektrisch sein. Wenn die interessierende Verbindung amphoter ist, besteht dieses schmale Band normalerweise uas 0,05 bis 0,2 pH-Einheiten, wie auch immer können Bänder bestehend aus bis herab zu 0,001 pH-Einheiten erreicht werden. Es ist ebenfalls möglich, daß die Bänder aus Null pH-Einheiten bestehen, d.h. die pH-Werte in den genannten Gelenden entsprechen dem isoelektrischen Punkt der gewünschten Verbindung. Dies bedeutet, daß es dort kein Band gibt, sondern nur ein flüssiges Band zwischen zwei Gelphasen. Falls die interessierende Verbindung neutral ist, werden die pH-Werte der Gelenden nicht entsprechend der gewünschten Verbindung, sondern hinsichtlich der unerwünschten amphoteren oder geladenen Verbindungen gewählt, in dem Sinne, daß die besagten unerwünschten Verbindungen innerhalb des genannten pH-Bandes keinen isoelektrischen Punkt haben sollten. Die neutrale Verbindung wird ungeachtet der Randbedingungen in den Gelenden, welche der Strömungskammer 8 gegenüberliegen, niemals in die pH-Gradienten eintreten. Zusätzlich zu dieser Präzision bei der Einstellung der Randbedingungen, auf Grund der unbegrenzten Stabilität der IPGs mit der Zeit, ist es automatisch sicher gestellt, daß der pH-Gradient nie driftet, so daß die isoelektrischen Bedingungen für die der Reinigung unterworfenen chemischen Verbindungen stets konstant im hydraulischem Fluß vorgefunden werden, insbesondere in der Strömungskammer 8 aber nicht anderswo, z.B. innerhalb der anodischen oder kathodischen Gelphasen 12 und 5.
Der Prozeß gemäß der vorliegenden Erfindung besitzt zumindest folgende große Vorteile: a) extrem hohe Probenrückgewinnung, annähernd 100 %, weil die Reinigung unterzogene chemische Verbindung (z.B. das Protein) niemals in die Gelphase eintritt, sondern während des gesammten Reinigungsvorganges in der flüssigen Phase ungeladen gehalten wird, z.B. in einem isoelektrischen Zustand; b) große Probenmengen, da die zu reinigende Verbindung, z.B. die Protein-Zufuhr, zwischen einen getrenntenn Speicher 11 und der Stömungskammer 8 zirkulierend gehalten werden kann und nur die geringe benötigte Menge ist zu jeder Zeit in dem elektrischen Feld vorhanden; c) ein hohes Auflösungsvermögen, abhängig davon, wie schmal das pH-Intervall über dem isoelektrischen Punkt pI, der erwünschten Verbindung, z.B. Protein, gewählt ist; d) automatisches Entfernen von jeglichen Salzen oder Puffern, die die interessierende Verbindung (z.B. das Peptid oder Protein) begleiten, was bedeutet, daß das vorliegende Verfahren auch für die Elektrodialyse (Entsalzungsverfahren) benutzt werden kann. Insbesondere ist das Entfernen von einwertigen Ionen der starken Säuren oder Basen, z.B. Na&spplus; und Cl&supmin; sehr einfach. Für das Entfernen von einwertigen Ionen der schwachen Säuren und Basen z.B. Ammonium und Acetat, ist es vorteilhaft, die unten beschriebenen amphoteren, isoelektrischen, Immobiline-Membranen oder ziemlich kurze pH-Gradienten zu benutzen, d.h. Gradienten, bestehend aus nur einem vergleichsweise schmalen pH-Bereich z.B. 0,5 bis 1,0 pH-Einheiten, welche deutlich von den pK-Werten der jeweiligen schwachen Säuren und Basen entfernt sind. Das Entfernen von mehrwertigen Ionen, z.B. Sulfate, Phosphate und Citrate nimmt möglicherweise auf Grund der Wechselwirkung dieser Spezies mit der Immobiline-Matrix, mehr Zeit in Anspruch und wird am besten mittels pH-Überwachung außerhalb, z.B. mit einem pH- Stat, durchgeführt, weil sonst wegen dem schnelleren Entfernen der monovalenten Gegenionen, die Lösung in Kammer 8 sauer oder alkalisch werden kann. Die schnelle Entsalzung der Proteinproben für ein breites Anwendungsspektrum z.B. Enzymreaktionen oder Ligandenbindungsstudien ist eine von den Problemen, die gegenwärtig in der Biochemie angegangen werden.
Jeder Salzinhalt in der Probenaufgabe (bereits in 1 mM-Konzentration) hemmt den Transport von den nichtisoelektrischen Proteinen, vielleicht wegen des gegenüber den Proteinen viel höheren Stromanteils, der durch Ionen selbst getragen wird. Zusätzlich könnten hohe Salzgehalte in dem Probenspeicher kathodische oder anodische Ionengrenzen bilden, basische bzw. saure, welche Proteinwanderung hemmen und sogar eine Denaturation induzieren können. In den segmentierten (ebenso wie in konventionallen) IPG-Gelen behindert praktisch jeder Salzgehalt in der Probenzone den elektrophoretischen Transport der Probe. Daher ist der beste Weg zur effektiven Elimierung der Proteinverunreinigung von einer isoelektrischen Verbindung das Einleiten einer schon entsalzten Probenzufuhr in die segmentierte IPG-Apparatur. Wie auch immer kann ein Entfernen von Proteinverunreinigungen auch bei langsamerer Geschwindigkeit, sogar in Gegenwert von Salzen in der Probe, erreicht werden. In letzterem Fall, sollten die Salzgehalte im Einklang mit der Proteinlöslichkeit bei einem Minimum (z.B. 5 mM oder niedriger) gehalten und eine externe pH-Überwachung durchgeführt werden (z.B. mit einem pH- Stat) um drastische pH-Schwankungen in der Probenzufuhr, bedingt durch Entstehung von Grenzen bzw. Zonen, welche von den Salzbestandteilen aufgebaut werden, zu verhindert. In sehr wenigen Fällen mag eine minimale Salzkonzentration in der Proben-Phase während der Elektrophorese zur Vermeidung von Proteinaggregation und Precipitation wegen zu geringer Ionenstärke am oder in der Nachbarschaft des isoelektrischen Punktes gebraucht werden. Zu diesem Zweck wird eine externe hydraulische Strömung verwendet, um den Salzverlust, verursacht durch kombinierte elektrische und diffusorische Massentransporte zu kompensieren ( ähnlich wie das Konzept von Rilbes, steady-state rheoelectrolysis, H. Rilbe, J. Chromatography 159, 193-205 [1978]).
Das oben erwähnte Verfahren kann mit einer von folgenden Elektrophoresapparaturen, welche ebenfalls zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung gehören, durchgeführt werden.
Alle die genannten elektrophoretischen Apparaturen umfassen grundsätzlich eine Strömungskammer 8, gekoppelt mit zwei Behältern 5 und 12, wovon jeder unabhängig voneinander gefüllt ist, mit einem festgelegten pH-Gradienten, oder ersetzt durch eine festgelegte pH- Membran, wobei einer der Gradienten oder Membranen, der (die) an seinem (ihrem) Ende mit der Strömungskammer 8 gekoppelt ist, einen isoelektrischen Punkt hat, der gerade unter oder gleich dem isoelektrischen Punkt der zu reinigenden chemischen Verbindung ist, und mit seinem (ihrem) anderen Ende mit der anodischen Kammer 14 verbunden ist und der verbleibende pH-Gradient oder die pH-Membran der (die) an seinem (ihrem) Ende mit der Strömungskammer 8 verbunden ist, einen isoelektrischen Punkt gerade über oder gleich dem isoelektrischen Punkt der zu reinigenden benannten chemischen Verbindung hat, während sein (ihr) anderes Ende mit der Kathodenkammer 3 verbunden ist.
Fig. 1 gibt eine schematische Darstellung einer von mehreren möglichen Modifikationen dieser neuen elektrophoretischen Apparatur wiedier. Eine Strömungskammer 8 ist mit einem Probenbehälter 11 verbunden, welcher im Prinzip jedes Volumen zur Bearbeitung fassen kann, das durch die Pumpe 9 durch das elektrische Feld rezirkuliert wird. Im Allgemeinen wird die Pumpe 9 mit der Höchstgeschwindigkeit betrieben, z.B. 5 ml/min. Senkrecht zum hydraulischen Fluß 7, wird zwischen zwei Platten 2 und 13, die vorzugsweise aus Platin hergestellt sind, ein elektrisches Feld aktiviert, welches zum elektrophoretischen Entfernen jeglichen Ions oder nichtisoelektrischer amphoterer Spezies aus der Strömungskammer 8 dient. Die Strömungskammer 8 ist über z.B. obere und untere O-Ring-Verschlüse 6 und 10 mit zwei Polyarcrylamidgel-Zylindern 5 und 12 gekoppelt, welche in kurzen Glasröhren gehalten werden, die mit der Ummantelung 19 für die Kühlflüssigkeit 18 bestückt sind [19 und 18 sind nicht im Fig. 1, aber in Fig. 2 gezeigt]. Das obere Rohr ist über z.B. einen wasserdickten O-Ring-Verschluß 4 mit der Kathodenkammer 3 gekoppelt, welche im Allgemeinen eine verdünnte Base (z.B. 50 mM NaOH oder Ethanolamin, Ethylendiamin, isoionisches Lysin oder Arginin) beinhaltet, wie es bei der konventionellen isoelektrischen Fokussierung (IEF) gebräuchlich ist. Das untere Rohr 12 taucht mit seinem Ende direkt in die Anodenkammer 14 ein, die im Allgemeinen eine verdünnte (starke oder schwache) Säure wie Essigsäure-, Phosphorsäure- oder Schwefelsäurelösung oder isoionische Asparaginsäure- oder Glutaminsäurelösungen beinhaltet, genau wie es routinemässig in der Standard-IEF angewendet wird. Es liegt nahe, daß der O- Ring-Verschluß durch jede andere Einrichtung ersetzt werden kann, die für das Verbinden von verschiedenen Teilen der Apparatur geeignet ist.
Die Neuheit der vorliegenden Fraktionierungstechnik liegt in der Strömungskammer 8, die von den Enden eines oberen und eines unteren Polyamidgels begrenzt ist, welche festgelegte pH-Gradienten oder pH-Membranen repräsentieren. Die besagten pH-Gradienten sind in den Zylindern 12 und 5 enthalten, welche vorzugsweise aus Glas oder anderem geeigneten Material, zu welchem das Gel fähig ist mittels adhäsiver Kräfte anzuhaften, hergestellt sind. Durch das Anpassen der Enden dieser zwei Gelsegmente, die die Strömungskammer 8 begrenzen, dahingehend, daß sie isoelektrische Punkte (pI) gerade unterhalb (auf der Anodenseite) oder gleich und gerade oberhalb (auf der Kathodenseite) oder gleich dem isoelektrischen Punkt der unter Reinigung stehenden erwünschten Verbindung, z.B. Protein, haben, wird diese Verbindung in der Praxis bis zu ihrem pI titriert und als solche ist sie nicht fähig, den hydraulischen Fluß 8, 7, und 11 zu verlassen. Umgekehrt, werden alle Verunreinigungen mit einem unterschiedlichen pI, z.B. proteinische Verunreinigungen, die die unter Reinigung stehende Verbindung begleiten, automatisch [ bei dem in der Strömungskammer 8 vorherrschenden pH-Wert] entweder über oder unter ihren jeweiligen pIs sein und damit gezwungen sein, die Kammer 8 zu verlassen und entweder in die unteren oder oberen Segmente des festgelegten Polyacrylamidgels 12 oder 5 fokussieren oder sich in den anodischen oder kathodischen Kammern 14 oder 3 sammeln. Wenn ausreichend Recyclisierungszeit unter einem Spannungsgradient gegeben ist, verlassen alle Verunreinigungen die Strömungskammer 8 und die reine Verbindung, z.B. isoelektrisches Protein, wird aus der Strömungskammer 8 und Probenbehälter 11 der ursprünglich die Probenzufuhr beinhaltete, zurückgewonnen. Keine weiteren Bearbeitungen oder Probenextraktionen sind nötig, weil die interessierende Verbindung, z.B. Protein, die ganze Zeit über in der flüssigen Phase verbleibt und nicht in das Gel eintritt.
Die Apparatur, welche z.B. vertikal oder vorzugsweise horizontal montiert ist, beinhaltet die anodischen und kathodischen Kammern 14 und 3, die Gelzylinder 12 und 5, die Verschlüsse 10, 6 und 4 und die Strömungskammer 8, und ist an ein Netzteil 1 angeschlossen. Die typischen Werte im Gleichgewicht sind 1000 V, 3mA und 3W und unter Voraussetzung, daß die entstandene Hitze durch geeignete Kühlung abgeführt werden kann, ist jeder andere Wert für die Trennung geeignet. Die Probenströmungskammer 8 ist mit einer Einrichtung zur Konstanthaltung ihrer Temperatur versorgt und/oder die Probenzufuhr wird in einem großen ummanteltem Behälter 11 gehalten, welcher über eine bestimmte Art von Rohrleitung 15 mit einem Thermostat 17 gekoppelt ist. Es ist vorteilhaft, den Probenkessel 11 unter kontinuierlicher und leichter Rührung zu halten, andernfalls, könnte sich über die Zeit eine dichte Schicht von einer leichteren abrennen. Jede Pumpeneinrichtung 9, z.B. eine Peristaltikpumpe ist zum Umpumpen geeignet, welches im Allgemeinen bei Höchstgeschwindigkeit (z.B. 5ml/min) durchgeführt wird, so daß die Probe sich für eine möglichst kurze Zeit in der Strömungskammer 8 aufhält, um jedes Risiko der thermischen Denaturation zu vermeiden. Das ist einer von den einfachsten Aufbauten für den Betrieb. Grundsätzlich kann jede andere Probe oder Messeinrichtung bei Bedarf um dieses Gerät gebaut werden: z.B. ein Biosensordetektionssystem, eine immunoelektrophoretische Ausrüstung, eine durch Laser angeregte Fluoreszenzdetektionsausrüstung, jedes gewünschte automatischkoppelbares System, ein Gerät, z.B. eine Strömungselektrode, zur Messung und Kontrolle des pH, ein Gerät zur Radioisotopenüberwachung und/oder wenn nötig ein Gerät z.B. eine Strömungszelle zur Leitfähigkeitsüberwachung. Es ist naheliegend, daß für die speziellen Zwecke, der Probenfluß 7 mittels UV oder sichtbarer oder fluoreszierender Beobachtung durchgeführt werden kann, indem die Standardausrüstung an chromatographische Säulen gekoppelt wird, um die Geschwindigkeit des Entfernens von einigen Verbindungen in der Mischung zu verfolgen.
Fig. 2 zeigt eine schematisch auseinandergezogene Darstellung nahe zu derselben Apparatur, wie sie in Fig. 1 veranschaulicht ist, wobei das Netzteil 1, der Rührer 16 und der Thermostat 17 nicht gezeigt werden, welche in Fig. 1 abgebildet sind. Allerdings werden, zusätzlich zu Fig. 1, sowohl die Ummantelung 19 für den Kühlerfluß 18, die sich rund um die Gelzylinder 5 und 12 befinden, als auch verschiedene Komponenten 3, 5, 6, 8, 10, 12 und 14 in der richtigen Montageposition gezeigt, die aber noch nicht zusammengebaut sind. Der Kühlerfluß 18 ist mit einem Thermostaten, z.B. 17, der in Fig.2 nicht gezeigt wird, gekoppelt. Obwohl nicht in Fig. 2 gezeigt (vgl. gegebenfalls Fig. 1) sollte der Probenbehälter 11 ebenfalls bei einer konstanten Themperatur, z.B. 2 ºC, gehalten werden, da ja die isoelektrischen Punkte temperaturabhängig sind. Falls gewünscht, kann die Strömungskammer 8 ebenfalls mit Manteln für einen Kühlflüssigkeitsstrom versehen werden. Zusätzlich zu Fig. 1 zeigt Fig. 2 noch eine bevorzugte Form der Strömungskammer 8: der Eingang und der Ausgang des hydraulischen Flußes 7 sind gebeugt, davon einer in Richtung Zylinder 12 und der andere in Richtung Zylinder 5. Obwohl der Behälter 12 mit zwei Überschraubverbindungen dargestellt ist, kann er direkt in die Anolytlösung, die sich in der Elektrodenkammer 14 befindet, eingetaucht werden.
Fig. 3 zeigt eine Apparatur, die nach Zusammenbau ihrer Komponenten zur Reinigung zweier amophoterer Verbindungen z.B. zweier Proteine, die unterschiedliche isoelektrische Punkte in derselben Apparatur zur gleichen Zeit haben, geeignet ist. Die Probenbehälter 11a und 11b enthalten die Ausgangszufuhren, welche gleich oder verschieden sein können. Der Probenbehälter 11a ist über eine bestimmte Art von Rohrverbindung 7a mit einer von zwei Strömungskammern 8a verbunden. Der Probenbehälter 11b ist über eine andere Rohrverbindung 7b mit der zweiten Strömungskammer 8b gekoppelt. Die Strömungskammern 8a und 8b sind durch einen dazwischenliegenden Zylinder 20, welcher einen festgelegten pH-Gradienten enthält, von einander getrennt. Das Ende des besagten dazwischenliegenden pH-Gradienten, welches zur Strömunskammer 8b gereichtet ist, hat einen pH-Wert, der gerade höher, z.B. +0,05 pH-Einheiten, als der isoelektrische Punkt der gewünschten Verbindung in der Strömungskammer 8b, oder gleich dem pH-Wert der gewünschten Verbindung ist. Das Ende des besagten dazwischenliegenden pH-Gradienten, welcher zur Strömungskammer 8a gereichtet ist, hat einen pH-Wert, der gerade niedriger, z.B. -0,05 pH-Einheiten, als der isoelektrische Punkt der gewünschten Verbindung in der Strömunskammer 8a, oder gleich dem pH-Wert der gewünschten Verbindung ist. Am Ende des IEF-Verfahrens werden die erwünschten gereinigten Spezies, z.B. proteine in dem Behältern 8a/11a und 8b/11b gesammelt, wobei jede zugeführte Verunreinigung entfernt worden ist.
Für analytische Zwecke kann eine Apparatur gemäß Fig. 1 benutzt werden, worin jedoch die Strömungskammer 8 in dem Maße geschlossen ist, solange sie nicht mit dem Probebehälter 11 verbunden ist. In diesem Fall kann die Apparatur in eine horizontale Stellung versetzt werden, eingetaucht in die gleiche Kühlflüssigkeit und rotierend um seine Achse. Anstatt den gesamten Apparat rotieren zu lassen, kann die Probe in der Strömungskammer gerührt werden, z.B. mit einem Magnetstab. Es ist nicht nur in dem obenerwähnten Spezialfall einer geschlossenen Strömungskammer, sondern auch in dem üblichen Fall einer "offenen" Strömungskammer mit Ein- und Ausgang für den hydraulischen Fluß vorteilhaft, die elektrofokussierende Apparatur in der horizontalen Position zu benutzen, mit besagten Ein- bzw. Ausgängen in vertikaler Position, wobei der Ausgang oberhalb des Eingangs liegt. In der vertikalen Anordnung neigen die Luftblasen dazu, sich in dem oberen Teil der Strömungskammer anzusammeln. Dies hat einen ungleichmäßigen Transport von Verunreinigungen und Hinderung des elektrischen Stromflusses zur Folge. Zum Entfernen der Luftblasen muß die Apparatur auseinander genommen und horizontal aufgestellt werden, um die Luftblasen vollständig mit Hilfe der Ausgangsströmung zu entfernen. Ferner neigt das untere IPG-Segment, welches in dem unteren Elektrolytbehälter (im allgemeinen die Anode) eingetaucht ist, aufzuschwellen. Dies zwingt das Gel aus dem tragenden Rohr herauszuragen und sich schließlich von den Glaswänden loszulösen und aus seinem Behältnis rauszufallen. Diese Probleme werden durch eine horizontale Apparatur, z.B. wie in Fig. 8 dargestellt, ausgeschaltet, wobei sie mit Filtern 21 an allen Enden des IPG-Segmentes ausgestattet ist, um die "Immobiline"- Gelphasen in situ zu blockieren. Die Filter 21 sind in situ mittels eines O-Rings, welcher auf einer ringförmigen Kante, der in dem äußeren Rohr sitzt, eingespannt.
In den Fig. 1 bis 3 sind die festgelegten Gelbehälter 5 und 12 gegenüberliegend plaziert. Es ist jedoch auch möglich, sie parallel zueinander anzuordnen wie in Fig. 4 gezeigt wird. Solche eine Anordnung ist besonders für Reinigungen im großen Maßstab geeignet, wobei mehr als zwei Behälter 5 und 12, z.B. 4, 6 etc., in der Strömungskammer 8 eingetaucht werden können.
Für die meisten Zwecke können das Verfahren und die Apparatur durch den Ersatz wenigstens eines der pH-Gradienten durch amphotere isoelektrische festgelegte pH-Membranen verbessert werden. Die besagten Membranen können als sehr kurze pH-Gradienten betrachtet werden, welche nur ein sehr schmales pH-Intervall abdekken. Idealerweise umfaßt das besagte pH-Intervall Null- pH-Einheiten. Ferner kann der Unterschied zwischen den pH-Werten an den Enden der pH-Gradienten oder pH-Membranen, welche die Strömungskammer 8 abgrenzen, auch auf Null reduziert werden, d.h. die Strömungskammer sollte z.B. durch zwei Membranen, die denselben pH-Wert, welcher identisch zum isoelektrischen Punkt der erwünschten Verbindung ist, abgegrenzt sein. Diese Tatsache ist überraschend und erleichtert die Methode in sofern, daß zwei identische Membranen anstatt zwei voneinander unterschiedliche Membranen hergestellt werden können. Die Anwendung von pH-Membranen statt pH-Gradienten hat einen zusätzlichen Vorteil, daß sie preiswerter sind. Weiterhin kann die erzeugte Wärme leichter abgeführt werden. Deshalb werden pH-Membranen 25 und 26 in den meisten Fällen bevorzugt, wenn Reinigungen in großem Maßstab durchgeführt werden müssen.
Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf eine Apparatur, welche geeignet ist, in einem isoelektrischen elektrophoretischen Fokussierungsverfahren wie hier geschildert, eingesetzt zu werden, wobei die besagte Apparatur aus einer Strömungskammer 8 besteht, die direkt oder indirekt gekoppelt ist, entweder
a) mit zwei Behältern 5 und 12, wobei jeder für die Aufnahme eines festgelegten pH-Gradienten geeignet ist, oder
b) mit zwei Einrichtungen für die Aufnahme von festgelegten pH- Membranen 25 und 26, oder
c) mit einem Behälter gemäß oberem a und mit einer Einrichtung gemäß oberem b, wobei einer der Behälter oder Einrichtungen an seinem (ihrem) Ende an die Anodenkammer 14 angeschlossen ist und der (die) verbleibenden Behälter oder Einrichtung an seinem (ihrem) Ende an die Kathodenkammer 3 angeschlossen ist.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung, ohne sie dabei in irgendeiner Art und Weise einzuschränken..

Abkürzungen:

A : Ampere
C : (wenn für die Beschreibung der Gelzusammensetzung gebraucht) Prozent (auf Gewicht) des Gesamtmonomers T (vgl. unten), zurückführen auf das Vernetzungsmittel N,N'-Methylen-bis-acrylamid mit der Formel CH&sub2;=CH-CO-NH-CH&sub2;-CO-CH=CH&sub2;
IPG : Festgelegter pH-Gradient
pI : isoelektrischer Punkt
T : Gesamtkonzentration [g/100 ml, d.h. Gewicht pro Volumenprozent] an Acrylamid und N,N'-Methylen-bis-acrylamid
TEMED : N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
V : Volt
W : Watt

Beispiel 1: Reinigung einer Proteinmischung

Der experimentelle Aufbau ist wie in Fig. 1 und 2. Das untere IPG- Segment 12 mit einem Gesamtvolumen von 26 ml enthält einen pH-Bereich von 3,5 - 7,2, (7% T, 4% C)-Matrix und 1 % Trägerampholyte in nahezu demselben pH-Intervall und wurde aus einer sauren, dichten Lösung und einer basischen, leichten Lösung durch einen geeigneten Gradientenmischer wie folgt hergestellt.
Die saure dichte Lösung wurde aus einer Mischung aus 685 ul von pK 3,6, 223 ul von pK 4,6, 226 ul von pK 6,2, 118 ul von pK 7,0, 154 ul von pK 8,5 "Immobiline" (aus 0,2 M Lösungsansätzen), 0,6 ml Ampholin pH 3,5-7,0, 3,1 ml (30 % T, 4 % C)- Acrylamid-Ansatz und 3,6 ml Glycerin durch Zugabe von Wasser auf 13 ml hergestellt.
Die basische leichte Lösung wurde aus einer Mischung von 124 ul von pK 3,6, 511 ul von pK 4,6, 347 ul von pK 6,2, 139 ul von pK 7,0, 310 ul von pK 8,5 und 238 ul von pK 9,3 "Immobiline", 0,6 ml Ampholin pH 3,5-7,0 und 3,1 ml (30% T, 4% C)-Acrylamid-Ansatz durch Zugabe von Wasser auf 13 ml hergestellt.
Nachdem es in einen geeigneten Zweikammer-Gradientenmischer transferiert wurde, wurden 10 ul TEMED und 13 ul 40%-igen Ammoniumpersulfates in jeder der oben erwähnten Lösungen hinzugegeben. Der Ausgang des Gradientenmischers ist mit der Kammer 12 gekoppelt, wovon das untere Ende provisorisch durch z.B. Parafilm bis zum Ende des Polymerisationsprozesses geschlossen ist. Die Polymerisation schreitet für etwa 1 Stunde bei 50 ºC (oder für 2 Stunden bei 37 ºC) fort.
Das obere IPG-Segment 5 (26 ml Gesamtvolumen) enthält einen pH- Bereich von 7,4-10,0, (7% T, 4% C)-Matrix und 1% Trägerampholyte in der selben pH-Spanne und wurde aus unten beschriebenen Lösungen a) und b) wie folgt hergestellt.
a) Die saure dichte Lösung (pH 7.4) wird aus einer Mischung von 506 ul von pK 3,6, 387 ul von pK 7,0, 361 ul von pK 8,5 und 4,6 ul der pK 9,3 "Immobiline" (aus einer 0,2 M-Lösung), 0,6 ml Ampholin pH 7-10, 3,1 ml (30% T, 4% C)-Acrylamid und 3,6 ml Glycerin durch Zugabe von Wasser auf 13 ml hergestellt.
b) Die basische leichte Lösung (pH 10) wurde aus einer Mischung von 93 ul von pK 3,6, 335 ul von pK 7,0, 362 ul von pK 8,5, 289 ul von pK 9,3 "Immobiline", 0,6 ml Ampholin pH 7-10 (alle Ampholine aus einer 40%-igen Lösung) und 3.1 ml von einem (30% T, 4% C)-Acrylamid- Ansatz durch Zugabe von Wasser auf 13 ml hergestellt.
Nachdem es in einen Gradientenmischer transferiert wurde, wurden zu jeder der Lösungen a und b, die Katalysatoren (TEMED und Ammoniumpersulfat, in dieser Reihenfolge) wie oben zugegeben.
Der Ausgang dieses Gradientenmischers ist mit der Kammer 5 gekoppelt, wovon das untere Ende provisorisch geschlossen ist. Nach vollständiger Polymerisation wurden die benutzten Einrichtungen zum provisorischen Schließen der Kammern 5 und 12 entfernt und die besagten Kammern, welche die somit hergestellten IPG-Gele beinhalten, wurden in die Elektrophoresapparatur , wie dargestellt in Fig. 1, eingebaut. Alle nichtamphoteren Ionen (nicht aufgepfropfte "Immobiline", Katalysatoren, Puffer, etc.) werden vor der Probenzugabe durch Vorlauf für 5 Stunden bei 5W/1000 Volt auf dem Gel entfernt. Somit ist die Strömungskammer 8 auf einen schmalen pH- Interval (pH 7,2-7,4) beschränkt und auf den pl (7,30) des Human- Erwachsenen-Hämoglobin (typischer pI Human-Erwachsenem-Hämoglobin A [HbA] in einem IPG-Gel bei 10 ºC ) zentriert. 70 mg Gesamtlysat aus einem Heterozygot von Human-Erwachsenen-Hämoglobin C [HbC] (enthält ca. 60 % HbA und 40 % HbC), gelöst in 25 ml 0,5 %-igen Trägerampholyten pH 6-8, wurden unter 1000 Volt konstant in den vorfokussierten Apparat umgepumpt. In 30 Minuten-Intervallen wurden 30 ul Proben entnommen und für anschließende Analysen bei 4 ºC gehalten. Das Experiment wurde mit der letzten Probeentnahme nach 23 Stunden abgeschlossen. Die Teilmengen wurden in einem (5% T, 4% C)-IPG-Gel mit pH 6.5-8.5- Spanne analysiert. Die Ergebnisse, die durch densiometrische Abtastung der HbA und HbC Peaks mittels eines Laserdensiometers (geliefert von LKB) erhalten wurden, sind in Fig. 5, worin entlang der x-Achse die Zeit [Stunden] und entlang der y-Achse der Betrag [mg] der HbA und HbC dargestellt ist, repräsentiert. Die Kurve I (Dreiecke) bezieht sich auf HbA und die Kurve II bezieht sich auf HbC. Man kann erkennen, daß während HbA über die Dauer des Experimentes konstant bleibt, HbC zunehmend entfernt wird, bis es nach 23 Stunden nicht mehr festgestellt werden kann. Nach 12 Stunden des Umpumpens hat HbA einen Reinheitsgrad von wenigstens 95%, während nach 23 Stunden der Reinheitsgrad höher als 99,5% ist.

Beispiel 2: Entfernen von Farbstoffen von einem Protein

Um die Anwendung der in Fig. 1 dargestellten Apparatur als eine Elektrodialyseeinheit zu bewerten, wurde die Abtrennungskinetik des Farbstoffes (in Form von Salzen) von Proteinmischungen ausgewertet. In dem anodischen Arm 12 wurde ein IPG-Gel pH 3,5-7,2 und in dem kathodischen Arm 5 ein IPG-Gel pH 7,4-10 polymerisiert. Somit wurde die Probenzufuhr in einem pH zwischen 7,2 und 7,4 gehalten. Die Probenzufuhr enthält eine Lösung von 40 mg gereinigtem Human-Erwachsenen-Hämoglobin A, welches sich in 0,5 %- igem Ampholin pH 6.8, versetzt mit 10 mg eines sauren Farbstoffes (Bromphenolblau) und mit 10 mg eines basischen Farbstoffes (Toluidinblau) (Gesamtvolumen 25 ml), befand. Die Abtrennung des besagten Farbstoffes, welcher 1000 V konstant ausgesetzt war, wird gefolgt von 30 ul-Probenahme in festgesetzten Zeitintervallen aus dem Probebehälter und Bewertung der Restmengen durch spektrophotometrische Ablesungen bei 600 nm. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt, worin entlang der x-Achse die Zeit [Stunden] und entland der y-Achse die Beträge [mg] der zwei Farbstoffe dargestellt sind. Die Kurve I (Dreiecke) zeigt die kathodische Wanderung des Toluidinblaus und die Kurve II weist auf die anodische Wanderung des Bromphenolblaus hin. Wie in Fig. 6 gezeigt wird, sind nach 2 Stunden die Farbstoffe unter Hinterlassen einer entsalzten Hömoglobinprobe wirklich vollständig aus der Strömungskammer entfernt worden. Die Abnahmerate scheint einer Reaktionskinetik erster Ordnung zu folgen, eine Auftragung (nicht gezeigt) vom Logarithmus der Konzentration gegen die Zeit linear ist. Die Form der Toluidinblau-Kurve I ist anfänglich steiler als die das Bromphenolblaus, aber die Messungen sind durch die Tatsache, daß dieser Farbstoff sich scheinbar aus einer Dreikomponentenfamilie zusammensetzt, kompliziert, weil in dem oberen Gel die Wanderung dreier Blauzonen gesehen wurde.

Beispiel 3: Proteinentsalzung

30 ml einer Lösung von Human-Erwachsenen-Hämoglobin A (HbA) wurden 50 mM in NaCl eingestellt und in die Apparatur, dargestellt in Fig. 1, konstant bei 10 W und 2 ºC umgepumpt. Die Umwälzkammer war durch einen Boden von pH 7,2 und eine Decke von pH 7,4 begrenzt. Die Umwälzgeschwindigkeit war 10 ml/min. Zu festgesetzten Zeitintervallen wurden 2 ml Teilmengen entnommen, auf 25 ºC temperiert, und mit einem "Analytical Control" Leitfähigkeitmeßgerät "101", welches mit einer "Orion" Leitfähigkeitszelle ausgestattet ist, überwacht. Die Leitfähigkeitsmessungen wurden in die noch vorhandenen NaCl-Millimole konvertiert. Die Entsalzung war im wesentlichen in zwei Stunden abgeschlossen. Die Entsalzungskinetik der HbA wird in Fig. 7, worin entlang der x-Achse die Zeit [Stunden] und entlang der y-Achse die Menge [Millimol] von NaCl dargestellt ist, gezeigt.

Beispiel 4: Reinigung von N-Acetyl-Eglin C

a) Der isoelektrische Punkt von N-Acetyl-Eglin (pI = 5,5) wurde festgelegt durch Ampholin PAG-Platten pH 3.5-9.5, 5% T, 3% C und durch eine 2.2 % Ampholinkonzentration. Ca 350 ug Gesamtprotein wurden in jede Tasche (in Volumina bis 20 ul) aufgegeben und anschließend wurde die Fokussierung bei einem 10 W-Limit, 10 mA und 1000 V am Gleichgewicht durchgeführt. Die analytischen Durchläufe wurden im Allgemeinen innerhalb von 2 Stunden beendet, anschließend wurden die Gele fixiert und mit Agalmablau (Coomassie Blue) markiert.
Die Fixierlösung wurde hergestellt, indem 15 g Trichloressigsäure in zweifach destilliertem Wasser gelöst und doppelt destilliertes Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 100ml zugegeben wurde.
Die markierende Lösung wurde hergestellt, indem 0,46 g von Agalmablau R 250 in 400 ml der unten erwähnten demarkierenden Lösung gelöst wurden. Die erhaltene Lösung wurde auf 60 ºC erhitzt und vor dem Gebrauch gefiltert. Die obenerwähnte Lösung wurde durch Zugabe von zweifach destilliertem Wasser zu 500 ml Ethanol bis zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml (Lösung I), sowie durch Zugabe von destilliertem Wassser zu 80 ml Essigsäure bis zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml (Lösung II) und das Mischen der Lösungen I und II in einem Verhältnis 1:1 (V:V) vor der Anwendung hergestellt.
b) Für die Herstellung zweier amphoterer isoelektrischer "Immobiline"-Membranen, pH 5,5, wurden 10,512 ml einer 0,2 M Lösung des "Immobiline" pK 4,6 und 9,664 ml einer 0,2 M Lösung des "Immobiline" pK 9,3 gemischt und mit zweifach destilliertem Wasser zu einem Gesamtvolumen von 30,0 ml verdünnt. Der pH-Wert der dadurch erhaltenen Lösung wurde mittels eines pH-Meters zu 5,5 bestimmt. Zu der genannten Lösung wurden 40 ml der Lösung A (vgl. unten), 1,5 ml Ampholin pH 5-7, 96 ul TEMED, 120 ul der Lösung B (vgl. unten) und zweifach destilliertes Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 120 ml zugegeben. Die oben erwähnte Lösung A wurde durch Lösen von 28,8 g Acrylamid und 1,2 g N,N'-Methylen-bis-acrylamid in zweifach destilliertem Wasser und Zugabe von Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml hergestellt. Die oben erwähnte Lösung B wurde durch Lösen von 400 mg Ammoniumpersulfat in 880 ul zweifach destilliertem Wasser hergestellt.
60,0 ml der erhaltenen Lösung wurden in jede der beiden Apparaturen, wie unten beschrieben, gefüllt (vgl. c) und bei 50 ºC für eine Stunde polymerisiert.
c) Die oben erwähnte Apparatur zur Herstellung von Membranen beinhaltet eine Platte, hergestellt aus einem inerten Material, z.B. Polytetrafluorethylen (Teflon ) , welche nicht oder nur zu einem vernachlässigbaren Grad an dem Polymer anhaftet. Auf besagter Platte ist eine runde perforierte Scheibe (22) angebracht, welche von besagter Platte durch eine ringförmige Dichtung (23), die einen Durchmesser von 9 cm und eine Höhe von 1 mm hat, getrennt. Fig. 9 zeigt die Ansicht unterhalb der besagten Scheibe, Fig. 10 die Ansicht oberhalb und Fig. 11 den Querschnitt entlag der Ansichtslinie XI-XI, dargestellt in Fig. 9. Die zu polymerisierende Lösung wird durch Löcher (24) der perforierten Scheibe eingeführt.
d) Die Membranen, die nach dem oben beschreibenen Verfahren erhalten wurden, wurden zusammen mit den perforierten Trägerplatten 22 in einen Zylinder mit einem inneren Durchmesser von ungefähr 9,5 cm und einer Höhe zwischen den Membranen von ungefähr 3 cm eingebaut. Besagter Zylinder wird mit einem Einlaß 31 und einem Auslaß 30 entgegengesetzt voneinander für den hydraulischen Fluß 7 bestückt und wurde als Strömungskammer 8 benutzt. Falls gewünscht kann ein Millipore-Filter (8 um), hergestellt aus Celluloseacetat oder 6,6 Polyamid (Nylon) oder ähnlichem, z.B. ein Polypropylen-Filter, zwischen den pH-Membranen 25 und 26 und dem hydraulischen Fluß 7 plaziert werden, um die zu reinigende Substanz (z.B. N-Acetyl-Eglin C ) von dem direkten Kontakt mit den isoelektrischen Membranen abzuhalten. Die gesamte elektrofokussierende Apparatur wurde zusammengesetzt, wobei der oben erwähnte Zylinder mit den eingebauten Membranen die Strömungskammer 8, sowie die festgelegten pH-Gradienten 5 und 12 ersetzt. Vorzugsweise wurde besagter Zylinder in horizontaler Position, mit dem Ein- und Ausgang für den hydraulischen Fluß 7 in vertikaler Position benutzt, wobei der Auslaß oberhalb des Einlasses angebracht war. Der Vorteil der genannten horizontalen Anordnung im Vergleich zur vertikalen Anordnung besteht darin, daß die Luftblasen spontan entfernt werden.
Fig. 12 zeigt eine Querschnittansicht der zusammenmontierten Apparatur. Ein zylindrisches Rohr ist durch die unterstützten pH- Membranen 22 in der Kathodenkammer 3, die Strömungskammer 8 und die Anodenkammer 14 unterteilt. Die Kathode 2 und die Anode 13 sind über Stecker 32 mit dem Netzteil 1 (nicht gezeigt) verbunden. Der hydraulische Fluß 7 tritt in die Stömungskammer 8 über den Einlaß 31 ein und verläßt sie über dem Auslaß 30. Die Elektrolytlösung in den Kathoden- und Anodenkammern kann über die Ein- und Auslässer 27 und 28 erneuert werden. Die verschiedenen Teile der Apparatur werden mittels 4 Gewindestangen 29 zusammengehalten, welche durch die Löcher 33 gesteckt werden.
e) Die zusammengesetzte Elektrofokussierungspparatur wurde für eine Stunde bei 500 V, 25 mA und 10 W in einem kalten Raum (+5 ºC) mit der Strömungskammer, gefüllt mit Flüssigkeit aber ohne die die zu reinigende N-Acetyl-Eglin C-Probe im Vorlauf betrieben. Dann wurde die Strömungskammer entleert und mit der zu reinigenden Flüssigkeit gefüllt.
f) 1 g einer Probe, die das rekombinierte DNA-N-acetyl-Eglin C (Reinheit: 80 %, hergestellt nach der Europäischen Patentanmeldung Nr. 146 785) enthält, wurde in 100 ml eines 0,2 %-igen Trägerampholyten pH 5-7 gelöst und in der vorfokussierten Apparatur bei konstanten 500 V und 10 mA/5W in einem kalten Raum (+5 ºC) umgepum (20 ml/min). 100 ul Proben werden in 30 Minuten-Intervallen gesammelt und bei 4 ºC für nachfolgende Analysen gehalten. Das Experiment wurde mit der letzten Probennahme nach 5 Stunden beendet. Die Teilmengen wurden in einer Ampholin PAG- Platte pH 3,5 -9,5 , 5 % T, 3 % C und 2,2 % Ampholinkonzentration analysiert. Es stellte sich heraus, daß alle Verunreinigungen nach 3 Stunden Umpumpen entfernt werden.
Falls gewünscht, können die Lösungen in den Kathoden (3)- und Anoden (14)-kammern in einer Abfalleitung bei einer Geschwindigkeit, z.B. 5 ml/min gepumpt und von größern Vorratsbehältern erneuert werden.

Beispiel 5: Membranen, die unterschiedliche Pufferungskapazitäten besitzen

Analoge von den pI= 5.50 Membranen, beschreiben in Beispiel 4, wurden hergestellt, um 10 mM, 40 mM oder 100 mM Konzentrationen der "Immolinine" aufzunehmen.
Während die 10 und 40 mM "Membranen" korrekte elektroosmotische Eigenschaften besaßen und genau experimentell pI-Werte erreichten, zeigte die 100 mM Oberfläche eine viel größere Dispersion und anormale Strömungsprofile in dem pH-Bereich um den pI. Es scheint deshalb angebracht ein oberes Molaritätslimit von ungefähr 50 mM für jedes "Immobiline" in der "Membran" festzusetzen.

Claims

1. Isoelektrisches elektrophoretisches Fokussierverfahren zur Trennung und Reinigung einer amphoteren oder neutralen chemischen Verbindung, die in einem für das besagte Verfahren geeigneten Lösungsmittel löslich ist, von einer oder mehreren elektrisch geladenen chemischen Verbindung (en), die in besagtem Lösungsmittel löslich sind, wobei das besagte Verfahren mittels einer elektrophoretischen Apparatur durchgeführt wird, worin der elektrische Fluß, welcher durch eine elektrophoretische Matrix passiert, an einen hydraulischen Fluß gekoppelt ist, die Richtung des genannten elektrischen Flusses unterschiedlich zu der des genannten hydraulischen Flusses ist, dieser hydraulische Fluß eine Lösung besagter Verbindung in besagtem Lösungsmittel enthält und genannte Matrix in zwei Teile teilt, ein Teil, (5) oder (25), befindet sich auf der Kathodenseite und der andere, (12) oder (26), auf der Anodenseite, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte amphotere oder neutrale chemsiche Verbindung in einem isoelektrischen oder ungeladenen Zustand innerhalb des hydraulischen Flusses (7), (8) und (11) gehalten wird und besagte geladene chemische Verbindung(en) mittels des elektrischen Flusses aus dem hydraulischen Fluß in wenigstens eine der beiden bezeichneten Teile besagter Matrix oder mittels wenistens einem der bezeichneten Teile in wenigstens eine der Elektrolytlösungsreservoirs (3) und (4) entfernt wird (werden).

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin besagte Teile, unabhängig voneinander immobilisierte pH-Gradienten (5) und (12), wobei jeder eine Leitfähigkeit und sowohl eine Pufferungs- als auch eine Titrationskapazität in seinem pH-Intervall bestizt, oder amphotere isoelektrische immobilisierte pH-Membranen (25) und (26), wobei jede eine Leitfähigkeit und sowohl Pufferungs- als auch Titrationskapazität bei einem bestimmten pH-Wert besitzt, repräsentieren.

3. Isoelektrisches, elektrophoretisches Fokussierungsverfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Trennung und Reinigung einer amphoteren oder neutralen chemischen Verbindung, die in einem für besagtes- Verfahren geeigneten Lösungsmittel löslich ist, von einer oder mehreren elektrisch geladenen chemischen Verbindung(en), löslich in besagtem Lösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß der elektrische Fluß an einen hydraulischen Fluß gekoppelt ist, dessen Richtung unterschiedlich von dem des elektrischen Flusses ist, und daß die gewünschte amphotere oder neutrale chemische Verbindung isoelektrisch oder ungeladen innerhalb des hydraulischen Flusses (7), (8) und (11) gehalten wird, wohingegen die geladenen chemischen Verbindungen mittels des elektrischen Flusses aus dem hydraulischen Fluß in wenigstens einen der immobilisierten pH-Gradienten (5) und (12) oder über besagte pH- Gradienten in wenigstens einen der Elektrolytlösungsreservoirs (3) und (14) entfernt werden.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3 zur Trennung und Reinigung einer amphoteren chemischen Verbindung von einer oder mehreren amphoteren chemischen Verbindungen, deren isoelektrischer Punkt sich ausreichend von dem isoelektrischen Punkt der gewünschten Verbindung unterscheidet, welche innerhalb des hydraulischen Flusses isoelektrisch gehalten wird.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4 zur Trennung und Reinigung einer amphoteren chemischen Verbindung von einem oder mehreren Salzen.

6. Verfahen nach Anspruch 5, worin die Salze Salze von einwertigen Säuren oder Basen sind.

7. Verfahren nach Anspruch 5, worin die Salze Salze von zwei- oder mehrwertigen Säuren oder Basen oder Salze von zwei oder mehrwertigen Säuren oder Basen sind.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, worin die zu reinigende chemsiche Verbindung ein Peptid, ein Protein oder eine Verbindung, welche einen Peptid- oder Proteinteil esitzt, ist, wovon jedes einen isoelektrischen Punkt zwischen pH 3 und 10 hat.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die zu reinigende chemische Verbindung ein Peptid, ein Protein oder eine Verbindung, welche einen Peptid- oder Proteinteil besitzt, ist, wovon jedes einen isoelektrischen Punkt zwischen pH 5 und 9 hat.

10. Verfahren nach Anspruch 4, 8 oder 9, worin die isoelektrischen Punkte der zu reinigenden amphoteren Verbindung und der unerwünschten zu entfernenden amphoteren Verbindung sich in mindestens 0,001 pH-Einheiten unterscheiden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin benannte isoelektrische Punkte sich in wenigsten 0,05 pH-Einheiten voneinander unterscheiden.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, worin besagte isoelektrische Punkte sich in nicht mehr als 0,2 pH-Einheiten voneinander unterscheiden.

13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, worin die Richtung des hydraulischen Flusses senkrecht zur Richtung des elektrischen Flusses ist.

14. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 13, worin die Richtung des hydraulischen Flusses (7) dergestalt ist, daß Luftblasen aus der Strömungskammer (8) entfernt werden.

15. Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 14, worin die immobiliserten pH-Gradienten sowohl Pufferungs- als auch Titrationskapazität in ihrem pH-Intervall haben und wird eine Menge an Ampholyten im gleichen pH-Intervall zur Sicherstellung einer ausreichenden Leitfähigkeit enthalten.

16. Verfahren nach den Ansprüchen 2 bis 15, worin die immobiliserten pH-Gradienten und pH-Membranen kontrollierte Pufferungs- und Titrationskapazität, Leitfähigkeit und kontrollierten pH-Wert besitzen und in einer reproduzierbaren Weise hergestellt werden können.

17. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 16, worin die gewünschte Verbindung in einer wässrigen Lösung vorliegt.

18. Verfahren nach den Ansprüchen 4 bis 17, worin die isoelektrischen Punkte in den Enden der pH-Gradienten oder Membranen angrenzend zur Strömungskammer (8) gleich oder gerade unterhalb des isoelektrischen Punktes der amphoteren zu reinigenden chemischen Verbindung (Anodenseite) und gleich oder gerade oberhalb des isoelektrischen Punktes der bezeichneten amphoteren zu reinigenden chemischen Verbindung (Kathodenseite) sind.

19. Verfahren nach den Ansprüchen 4 bis 18, worin der pH-Wert innerhalb des hydraulischen Flusses dem isoelektrischen Punkt der gewünschten Verbindung entspricht.

20. Isoelektrischer elektrophoretischer Fokussierapparat, welcher geeignet für ein Verfahren nach den Ansprüchen 4 bis 19 ist, enthaltend eine Strömungskammer (8), welche direkt oder indirekt verbunden ist entweder

a) mit zwei Behältern (5) und (12), von denen jeder geeignet ist, einen immobilisierten pH-Gradienten aufzunehmen

oder

b) mit zwei Vorrichtungen, um die immobiliserten pH-Membranen (25) und (26) aufzunehmen

oder

c) mit einem Behälter entsprechend oberem a und mit einer Vorrichtung entsprechend oberem b, wobei einer der Behälter oder Vorrichtungen mit seinem (ihrem) anderen Ende mit der Anodenkammer (14) und der andere Behälter oder Vorrichtung mit seinem (ihrem) anderen Ende mit der Kathodenkammer (3) verbunden ist.

21. Isoelektrischer elektrophoretischer Fokussierapparat nach Anspruch 20, der geeignet ist, um ein Verfahren nach den Ansprüchen 4 bis 19 durchzuführen und eine Strömungskammer (8) einschließt, welche direkt oder indirekt verbunden ist entweder

a) mit zwei Behältern (5) und (12) von denen jeder mit einem immobiliserten pH- Gradienten gefüllt ist, welcher eine Leitfähigkeit und sowohl eine Pufferungs- als auch eine Titrationskapazität in seinem pH- Intervall besitzt,

oder

b) mit zwei amphoteren, isoelektrischen, immobiliserten pH-Membranen (25) und (26) die eine Leitfähigkeit und sowohl eine Pufferungs- als auch eine Titrationskapazität bei einem spezifischen pH- Wert besitzen,

oder

c) mit einem pH-Gradienten entsprechend oberen a und mit einer pH-Membran entsprechend oberen b, wobei die isoelektrischen Punkte in den Enden der pH-Gradienten oder Membranen, benachbart zu der Strömungskammer (8) gleich oder gerade unter dem isoelektrischen Punkt der zu reinigenden amphoteren chemischen Verbindung (Anodenseite) und gleich oder gerade oberhalb dem isoelektrischen Punkt der besagten zu reinigenden amphoteren chemischen Verbindung (Kathodenseite) sind, wobei einer der pH-Gradienten oder die pH-Membranen an seinem (ihrem) anderen Ende mit der Anodenkammer (14) verbunden ist und der andere pH-Gradient oder die andere pH-Membran mit seinem (ihrem) anderen Ende mit der Kathodenkammer (3) verbunden ist.

22. Isoelektrische elektrophoretische Fokussierapparatur nach Anspruch 20, welche geeignet ist, um ein Verfahren, entsprechend einem der Ansprüche 4 bis 19 durchzuführen, enthaltend eine Strömungskammer (8), welche mit zwei Behältern (5) und (12) verbunden ist, wovon jeder mit einem immobiliserten pH-Gradienten gefüllt ist, wobei einer der Gradienten an seinem mit der Strömungskammer (8) verbundenen Ende einen isoelektrischen Punkt besitzt, der gerade unterhalb des isoelektrischen Punktes der zu reinigenden amphoteren chemischen Verbindung liegt, an seinem anderen Ende mit der Anodenkammer (14) verbunden ist, und der andere pH-Gradient an seinem mit der Stömungskammer (8) verbundenen Ende einen isoelektrischen Punkt gerade oberhalb des isoelektrischen Punktes der besagten zu reinigenden amphoteren chemischen Verbindung besitzt und mit seinem anderen Ende mit der Kathodenkammer (3) verbunden ist.

23. Apparatur nach Anspruch 20, 21 oder 22, worin die Strömungskammer (8) über eine Pumpe (9) mit dem Probenreservoir (11) verbunden ist.

24. Apparatur nach den Ansprüchen 20 bis 23, ausgestattet mit einer Vorrichtung, welche die pH-Gradienten und die Probe bei konstanter Temperatur hält.

25. Apparatur nach den Ansprüchen 20 bis 24 ausgestattet mit mindestens einer der folgenden Vorrichtungen: eine Vorrichtung zu pH-Messungen und Kontrolle, eine Einrichtung zur Leitfähigkeitsüberwachung, ein Biosensordetektionssystem, eine immunoelektrophoretische Ausrüstung, eine durch Laser angeregte Fluoreszenz-Detektionsausrüstung, ein vollautomatisch koppelbares System, eine Vorrichtung zur Radioisotopüberwachung oder eine Vorrichtung zur Überwachung der Probenlösung mittels UV oder sichtbarer oder fluoreszierender Beobachtung.

26. Apparatur nach den Ansprüchen 20 bis 25, ausgestattet mit einer Vorrichtung zur mechanischen Unterstützung des pH-Gradienten-Gels in den Behältern (5) und (12) oder des Gels in den pH-Membranen.

27. Apparatur nach den Ansprüchen 20 bis 26, welche 2 und nicht mehr als 2 pH-Membranen beinhaltet.

28. Apparatur nach den Ansprüchen 20 bis 26, geeignet für die simultane Reinigung von zwei amphoteren oder neutralen Verbindungen, beinhaltend zwei getrennte Strömungskammern (8a) und (8b), welche voneinander mittels eines dazwischenliegenden immobiliserten pH-Gradienten (20) oder einer oder zwei pH-Membranen getrennt sind.

29. Apparatur nach den Ansprüchen 20 bis 28, welche in einer solchen Position angeordnet ist, daß Luftblasen aus der Strömungskammer (8) mittels des hydraulischen Flusses (7) entfernt werden können.

30. Apparatur nach den Ansprüchen 21 bis 29, worin die immobiliserten pH-Gradienten und pH-Menbranen eine kontrollierte Pufferungs- und Titrationskapazität, pH-Wert und Leitfähigkeit haben und in einer reproduzierbaren Weise hergestellt werden können.

31. Apparatur nach den Ansrpüchen 21 bis 30, worin die immobiliserten pH-Gradienten und pH-Membranen eine kontrollierte Pufferungs- und Titrationskapazität haben und Ampholyte beinhalten, sodaß eine ausreichende Leitfähigkeit gewährleistet ist.

32. Apparatur nach den Ansprüchen 20 bis 31, ausgestattet mit Ein- und Ausgängen (27) und (28) zur Erneuerung der Elektrolytlösungen in den Kathoden- und Anodenkammern (3) und (14).