WO2000002039A1 - Verfahren und vorrichtung zur trennung von biomolekülen - Google Patents

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WO2000002039A1
WO2000002039A1 PCT/EP1999/004411 EP9904411W WO0002039A1 WO 2000002039 A1 WO2000002039 A1 WO 2000002039A1 EP 9904411 W EP9904411 W EP 9904411W WO 0002039 A1 WO0002039 A1 WO 0002039A1
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electrophoresis
gels
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buffer
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PCT/EP1999/004411
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Brigitte Wittmann-Liebold
Christian Wurzel
Christian Scheler
Andreas Reuter
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Wita Proteomics Ag
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44773—Multi-stage electrophoresis, e.g. two-dimensional electrophoresis

Definitions

  • the present invention relates to methods and devices for one- or two-dimensional separation of biomolecules in gels by electrophoresis in an electrophoresis apparatus and is used in particular to separate proteins, glycoproteins, lipoproteins, nucleic acids or cell complexes in gels (e.g. in polyacrylamide gels, Urea gels or agarose gels) in two dimensions.
  • Proteins and peptides are biopolymers that are found in thousands in every cell; they are the immediate gene products that catalyze, stimulate and regulate all cell processes. Their structure and functional analysis form the basis for the elucidation of all important cell processes and are the basis for understanding disease processes on the molecular level and in molecular medicine, e.g. in the development of tumors and for the development of early diagnostics and new therapeutic agents in the pharmaceutical industry. Because of the often very low concentrations in which the peptides and proteins occur in the cell, it is necessary to develop highly sensitive detection methods and separation techniques for their characterization. Proteins are made up of long chains of amino acids and have a spatial structure that is specific to each protein.
  • Each protein has an individual amino acid sequence, the primary sequence, which unfolds into a specific spatial structure (3D structure), which is the carrier of the physiological function in cell activity.
  • 3D structure 3D structure
  • proteins play a central role in all life processes. They catalyze the biosynthetic processes as enzymes, build up the organism as structural proteins, manage mass transport and signal transduction and play an essential role in the translation of genetic information (protein biosynthesis) and in all regulatory processes.
  • a single cell contains over 5000 different proteins. The biosynthesis and expression of each protein are precisely regulated. Different expression patterns occur in different tissues.
  • One- and two-dimensional gel electrophoresis of proteins, nucleic acids, or other biomolecules have long been in biochemistry, pharmaceutical techniques introduced in the pharmaceutical industry, medical research and laboratory practice to perform rapid separations, comparisons of separation patterns or quality controls of isolates and products.
  • the electrophoresis chambers and their accessories have long become indispensable inventory in every scientific, pharmaceutical or laboratory-oriented laboratory.
  • electrophoresis systems and separation methods are available for the separation of biomolecules in a separation direction (one-dimensional electrophoresis, IDE), which are adapted to the special applications depending on the separation problem.
  • Separation of individual samples is usually carried out in capillary tubes or gel strips and separation of multiple samples is usually carried out in flat gels (slab gels), in which application pockets at the upper end of a thin polymerized gel layer are left out. These gel pockets are made by pouring sogn. Comb prepared during the polymerization. After polymerization of the gel and removal of the combs, the samples are placed in these pockets.
  • There are far fewer chamber systems available for separating complex protein and peptide mixtures in long gels (> 10 cm).
  • IDE separations of proteins and peptides are usually carried out in small chambers in 5-11 cm long polymerized polyacrylamide gels of different cross-linking and different thicknesses (eg 0.7 to 1.5 mm) and width (in so-called slab gels).
  • the samples are applied to the gel poured in liquid form between two glass plates after polymerization and separated in an electrophoresis apparatus for several hours at 500 to 2000 volts / 20 cm.
  • the gel is then removed and immersed in a coloring solution to stain the substances; then decolorized in a decolorizing solution to remove the excess dye and the substances become visible. They can be documented in their position on the gel by photography or by scanning in the computer, for example for comparisons with other samples.
  • Carrier-free electrophoresis are carried out, in which the substances to be separated are separated electrophoretically in a thin buffer film without any support.
  • biomolecules such as nucleic acids or high molecular complexes
  • agarose gels for example, are also used for separation.
  • the separation in the first dimension has also been made in fine glass capillaries
  • the capillaries are first mixed with gel in a gel casting stand, then polymerized there and only after they have entered the
  • Electrophoresis chamber have been filled with the sample substance.
  • the gels which are very soft and flexible, must be carefully ejected from the capillaries for introduction into the staining / decolorization solution, which can result in mechanical defects on the gels.
  • narrow flat gels (2 x 5-10 cm thin strip gels), which are commercially available as dried finished gels, are increasingly being used for the IDE (e.g. from Pharmacia Biotech, Freiburg).
  • the gels from the first dimension have to be separated by manual manipulation onto a suitably prepared flat gel (slab gel) that is already prepolymerizing is embedded and polymerized onto this flat gel. Only then can the separation in the second dimension be carried out in the corresponding electrophoresis chamber for the second dimension. After separation, the usual staining and decolorization technique and documentation of the results are carried out.
  • Various gels and buffer systems for performing gel electrophoretic protein separations in two dimensions are known In the version described first, mixtures of ribosomal proteins in urea gels are separated, for example, in which the pH conditions are varied in both dimensions.
  • Processes for the separation of highly complex protein mixtures eg from intact cells, cell lines or tissues, use separations in the first dimension due to the different charge of the proteins by isoelectrofocusing (IEF) and in the second dimension separations by molecule size in SDS sodium dodecyl sulfate.
  • Gels. Either immobilons or ampholins are used to carry out the isoelectrofocusing, which are introduced into the gel.
  • No. 4,666,581 describes a device for two-dimensional electrophoresis, in which, however, both gels are only brought into close proximity. Instead of manual handling, which is difficult and error-prone, a mechanism, a complicated rotating mechanism, is used to transfer the gel from the first dimension to the second dimension.
  • the buffer vessels are not integrated. The current must flow can be ensured in a complicated manner using filter strips.
  • US 4,874,490 also describes a system for two-dimensional electrophoresis, the patent not disclosing a fully integrated system and requiring a gel casting frame.
  • the buffer vessels for the cathodic and anodic buffer solutions are also not integral parts of the chamber. Furthermore, no cooling is integrated in this system.
  • the first dimension is separated horizontally and in the second dimension vertically.
  • the second dimension must first be cast in a conventional casting stand outside the electrophoresis chamber. After casting, sealing / insulating strips must be inserted over the second dimension gel by mechanical manipulation. Only then can the gel be poured for the first dimension. The spacer is then removed again.
  • the sample application in large quantities is unsolved. Only the impregnation of a membrane is described. The feed quantity and its concentration is limited.
  • DE 4244082 AI and US 5,407,546 describe a method and a device for high-resolution two-dimensional electrophoresis. Selective rehydration is essential. A coherent gel ("one molecule") is expressly used. Only dried gels can be used as starting material and these must be rehydrated and re-equilibrated. This happens before and after the first dimension and the gel of the second dimension is rehydrated separately. A fully automatic process is not possible because the gel of the first dimension in a heated Aquilibratorgefäß must be transferred and buffered. This means there is no complete integration.
  • the invention is therefore based on the object of providing methods and devices with which effective gel electrophoresis of the first and second dimensions can be carried out manually or fully automatically using simple means in a single apparatus with self-cast gels and / or dried finished gels. It is also an object of the invention to provide specific finished gels.
  • a particular advantage of the invention is that full automation of the entire 2DE can be carried out simply by arranging the gels for the separation in the first dimension and the gels for the separation in the second dimension one after the other or simultaneously vertically, as pouring gels or ready gels introduced into an electrophoresis combination chamber and, in the case of the cast gels, polymerized in isolation from one another, then buffer solutions are filled in, for example a protein extract is applied to the gels of the first dimension and the electrophoretic separation of the first dimension at constant temperature or with a fixed temperature gradient with, for example, increasing electrical voltage carried out, then sucked off the buffer solution, the insulation removed, in the resulting spaces between the first and second Dimension contact gel filled in and polymerized out, buffer solutions filled in and the electrophoretic separation of the second dimension is carried out at precisely set temperature and constant electrical power or increasing current strength and finally the gels are developed, for example, with a staining solution and the proteins are made visible on the gels using conventional methods.
  • a further advantage of the invention is that the two-dimensional separation in the electrophoresis combination chamber according to the invention is accomplished only with a single device which is set up for carrying out both electrophoresis dimensions and the electrophoresis combination chamber has a core with cooling elements , wherein the cooling elements are arranged on both sides of the core by gel chambers and buffer vessels formed from inner plates and outer plates in cooperation with removable or switchable insulating elements.
  • An additional advantage of the invention is that the gels are poured before the substances are applied in the new chamber system in the same room in which the separations themselves are carried out in the two dimensions of electrophoresis. It does not apply therefore two separate gel casting stands (one for the first and one for the second dimension).
  • the gels for the two electrophoresis dimensions are prepared in the electrophoresis combination chamber before the substance separation begins and are available at the start of the respective electrophoresis. All manipulations for pouring the gels are done in one operation before the start of the sample application.
  • Optimal cooling which is ensured both in the electrophoresis chamber (for both dimensions) and in the buffer chambers for both dimensions, is also advantageous.
  • the gels and the buffer solutions of the first dimension were mostly not cooled at all, and the previously implemented cooling systems for the second dimension had shortcomings (temperature differences within the gels; insufficient cooling of the buffers).
  • Variable programming of the electrophoresis process can be carried out.
  • the gels and buffer vessels may be cooled via the cooled buffer in the lower buffer vessel of the second dimension or by integrated cooling devices in the rear plate of the chamber. Buffer vessels are not used for the first dimension.
  • the gel is in direct contact with the electrodes on the right and left end of the gel.
  • the electrophoresis combination chamber can also be used for one-dimensional separating gels of variable length (eg 10 to 30 cm) for the separation of multiple samples.
  • the separations can be reproduced in the combination chamber be carried out under precisely defined standard conditions.
  • electrophoresis chambers for the separation of several samples, e.g. 20 samples to be used in a one-dimensional SDS gel, the samples being applied to the 2nd dimension gel using an application comb. A corresponding insert with sample bags is inserted where the gel for the 1st dimension is otherwise contained.
  • the electrophoresis combi chamber according to the invention preferably contains two times two gels, the number of which can be expanded as required.
  • the chamber preferably contains only the two gels for the first and the second dimension per unit.
  • any number of chambers can be developed electrophoretically in parallel.
  • the gel pairs for the separation in the first dimension are developed in parallel electrophoretically and are initially separated from the gels for the implementation of the second dimension by a non-conductive insulation, which is then removed, for example, mechanically from the outside without screwing the chamber through and through replacing a conductive medium that contacts the gels for performing the second dimension.
  • the gels for the first and second dimensions are developed in pairs in succession under different conditions without the gel having to be mechanically transferred from the first dimension to the second.
  • the electrophoresis combination chamber has an integrated cooling device and integrated filling and buffer vessels for both dimensions.
  • the lid attachment of the electrophoresis combination chamber contains the electrical safety connections for the connection to the Powersupply, the connections to the cooling unit and all necessary filler necks for pouring the gels, pouring in the electrolysis buffer and introducing the sample.
  • the inventive IDE / 2DE electrophoresis combination chamber is used, for example, to separate complex protein mixtures for the separation of proteins from tissues, cell lines or microorganisms which can contain more than 5000 proteins.
  • Both analytical and preparative electrophoresis can be carried out in the electrophoresis combi chamber, depending on the class of material, for example, isoelectric focusing and SDS electrophoresis or separations in agarose, urea or other separation media can be used.
  • the chamber can be thermostatted, contains all buffer vessels for carrying out the first and second dimensions and an attachment that allows electrophoresis to be carried out under high voltages, for example up to 5000 volts.
  • the electrophoresis combination chamber is used, for example, to identify disease-associated proteins, to develop marker proteins when making early diagnoses of diseases and to develop new types of pharmaceuticals.
  • Cell processes such as embryonic development, transport and signal transduction processes and regulatory and expression patterns can be studied using the electrophoresis combination chamber. It is suitable for the dissolution of> 5000 proteins and is therefore an excellent instrument for the investigation in protome research, a new research and development area in basic medical and pharmaceutical research and for industrial applications, eg for the examination of entire cell contents and their changes or to investigate the influence of pharmaceuticals on cell processes.
  • a particular advantage of a second embodiment of the invention is that full automation of the entire 2DE can be carried out simply by arranging the gels for the separation in the first dimension and the gels for the separation in the second dimension horizontally to one another, that is to say one above the other.
  • This horizontal arrangement is made possible by the fact that the insulating elements between the gels of the first dimension and the gels of the second dimension also run horizontally in a defined area, but can nevertheless be pulled out of the combination chamber via guide elements for guidance upwards.
  • Another advantage of the second embodiment of the invention is that with the same combination chamber also the one-dimensional separation can be carried out by using a comb with sample pockets for different samples in the instead of the gel for the separation in the first dimension and the insulating element SDS gel is used and this is polymerized, the comb is removed after the polymerisation, the samples in the The resulting recesses are introduced and the one-dimensional electrophoresis is subsequently carried out.
  • the use of the insulating element is dispensed with, and instead a comb with sample pockets is used when the SDS gel is polymerized, which is removed after the gel has been polymerized, so that multiple ports for applying different samples are now contained in the gel. These can all be separated in parallel in one-dimensional electrophoresis.
  • the construction of the combination chamber is therefore preserved and both one-dimensional and two-dimensional gels can be carried out in the same chamber system. It is also advantageous that long running distances, e.g. 32 cm long one-dimensional gels.
  • FIG. 1 is an exploded view of the essential construction parts of the electrophoresis combination chamber
  • FIG. 2 shows the structure of the inner core
  • Fig. 5 shows the electrophoresis combination chamber, completely assembled on one side with a pressure frame.
  • Fig. 6 to 10 is a schematic diagram of the combination chamber in a design variant in the individual
  • the electrophoresis combination chamber 1 for separating complex protein mixtures for example, enables electrophoretic separation in succession in two different dimensions, ie under different conditions.
  • the electrophoresis combination chamber 1 consists of several parts which are assembled together by screwing: the inner core 2 for effective cooling, connected on both sides to the inner plates 4 and the outer plates 5, between which there is there is a free space on each side for a flat gel (1st and 2nd dimension). With the help of a seal 19, these plates 4, 5 are sealed against one another and at the same time the thickness of the gel is determined (e.g. 0.75 mm or 1.5 mm). While the inner plate 4 is made of a material which is a good conductor of temperature (e.g. a special highly conductive ceramic, thin plastic), the outer plate 5 is preferably made of a transparent material
  • the outer plates 5 are held by screwing on both sides of a printing frame 13; Parentheses are not used as usual.
  • the lower limit of the electrophoresis combination chamber 1 is given by an adjustable and rotatable table on which the electrophoresis combination chamber 1 is fixed in the middle.
  • the introductions for the buffer vessels 8 and 21 initially serve as fillers for pouring the gel liquids.
  • the inner one Core 2 and the printing frame 13 are made, for example, of polymer material (for example acrylic glass, plexiglass), and windows in the size of the gels are cut out in the printing frame 13, so that the pouring processes of the gels and the implementation of the electrophoresis can be easily observed from the outside.
  • polymer material for example acrylic glass, plexiglass
  • the inner core 2 (Fig. 2) and the two inner plates 4 are glued by the manufacturer (Fig. 3). Furthermore, buffer vessels 8 and 21, which are partly simultaneously filling chambers for the gels, are arranged.
  • the inner plates 4 close the cooling labyrinth 10 (cooling meander) tightly, but have openings to the buffer vessels 8 of the first dimension (buffer, 1st dimension) and buffer vessels 21 of the second dimension (buffer 2nd dimension), as in 2 and 3 are shown.
  • the cooling elements 3, 10 are located under the gels and not only cool the gels of the first (gel 1) and second dimension (gel 2), but also the buffer vessels (buffer 1st dim. And buffer 2nd dim.).
  • the filling chamber 17b with filling tube for the 2nd dimension gel and at the same time the buffer vessels 21 for the 2nd dimension (barrel 2nd dimension) are shown at the top left.
  • the left filling chamber 17b ends in the center at the bottom in order to enable the gel liquid to be poured in uniformly from the bottom upwards, a vent opening 18 with an obliquely designed upper boundary ensuring uniform, slow and air bubble-free pouring.
  • the electrophoresis combination chamber 1 is surface-coated. It is a surface coating of the parts in contact with the media gel, gel solutions and buffer solutions with amorphous carbon layers.
  • the coating is a hard material layer and thus high scratch resistance has and is thermally stable.
  • these surfaces can also be silanized.
  • a two-part seal 19 is placed on the complete core structure (Fig. 4).
  • insulating sleeves 9 e.g. 0.75-1.5 mm round sleeves or square material, e.g. silicone
  • Fig. 4 specified recesses
  • the outer glass plate 5 is placed.
  • the two gels are poured into the gel chambers 6 formed between the insulating tubes 9 for the first dimension, then the two gels in the gel chambers 7 for the second dimension. 7.
  • the lid 14 is put on and the polymerization is carried out overnight, for example.
  • the buffer solutions are then filled in and then the protein extract can be applied to the 1st dim. Gels after high-speed centrifugation.
  • the 1st dimension electrophoresis buffer is aspirated and the two insulating tubes 9, which separate the 1st gels from the 2nd gels, are pulled out from the outside, which is very easy to do, and the resulting free capillaries between the gels by filling in Filled stacking gel liquid so that after the polymerization of these liquids there is contact between the first and second gel. 11. Then electrophoresis is carried out in the second dimension.
  • the screw connections are loosened, the gels are removed together with the outer glass plates 5 and placed in a staining and decolorizing bath. Then the gels are ready for documentation.
  • the gels When pouring the gels of the first dimension, the gels are cast and polymerized as flat gels in the U-tube formed by filling tube 17a and gel chamber 6 out there.
  • a stop gel with high cross-linking is first poured, which should fill the lower area of the U-tube.
  • the gel solution which is still liquid after the addition of a polymerization initiator, is placed in the outer buffer reservoir of the first dimension, the gel only filling the lower region of the U-tube. It extends about 10 mm beyond the lower end of the two insulating elements designed as insulating tubes.
  • the separation gel for the first dimension is poured. In this gel, protein separation is carried out, for example, by isoelectrofocusing.
  • the still liquid separation gel solution is poured into the second (further inside) buffer reservoir of the first dimension via the filling chambers 8 until the area of the first dimension between the two insulating elements 9 is completely filled.
  • the gels are poured at constant temperature (eg at 20 ° C, for which the cooling is switched on) until the gel has polymerized.
  • the gel of the second dimension is poured between the two insulating elements 9 into the apparatus from below, in that the gel solution is poured in via the pouring reservoir of the second dimension. From there, the gel solution flows down through the filling tube 17b and emerges in the middle of the gel chamber 7. The air is automatically displaced upwards by the pouring process and can escape through the ventilation opening until the gel solution has completely filled the area of the second dimension.
  • the gel polymerizes at a constant temperature (e.g. by cooling to 20 ° C).
  • the implementation of the first dimension is described below.
  • the two buffer reservoirs (8) of the first dimension are filled once with an alkaline and an acidic buffer solution (eg 0.1N NaOH; 7% v / v H3P04).
  • an acidic buffer solution eg 0.1N NaOH; 7% v / v H3P04.
  • One buffer solution flows into the U-tube up to the stop gel, while the other overlays the separation gel.
  • the separation gel is then overlaid with a protective solution of higher density than the buffer (eg 6% (w / v) glycerol, 4 M urea, 1.5% (w / v) ampholyte in H20).
  • the samples can be applied to the separation gel of the 1st dimension via filler opening 20 by sub-layers under the protective solution.
  • the electrophoretic separation then takes place, for example, at constant temperature (for example cooling to 18 ° C.) with a voltage gradient of initially, for example, 100V to, for example, 3000V over several hours.
  • a voltage gradient of initially for example, 100V to, for example, 3000V over several hours.
  • the sample When performing a 2DE, the sample must always be applied to the gel of the first dimension; the separated bands after the first dimension are then further separated in the second dimension.
  • the three insulating elements 9 are removed by pulling them outwards.
  • the cavity between the gels of the first and second dimensions is filled with a contact gel (eg agarose) that polymerizes quickly.
  • the two buffer vessels 21 of the second dimension are filled with running buffer (eg SDS running buffer: 192 mM glycine, 25 mM Tris base, 5 ⁇ M bromophenol blue in H20).
  • running buffer eg SDS running buffer: 192 mM glycine, 25 mM Tris base, 5 ⁇ M bromophenol blue in H20.
  • the separation takes place at a temperature of, for example, 15 ° C., for example at constant power or with a current of, for example, 40 mA per gel in the first 20 minutes and then with 75 mA per gel.
  • the separation ended when the marker dye bromophenol blue was reached at the end of the gel.
  • the elec- The combined trophorese chamber is unscrewed and the gel is removed for
  • the electrophoresis gel is now treated according to the prior art and e.g. placed in a tub of fixative.
  • the proteins can be visualized in ng amounts by silver staining for analytical purposes or by means of e.g. Coomassie Brilliant Blue can be treated for micro-preparative purposes (e.g. subsequent enzymatic cleavage and sequencing).
  • the gel can be developed after blotting for immunostaining with appropriate antibodies.
  • the gels are designed as flat gels (no longer as round gels), but narrower than in the previous flat gel systems.
  • the width of the gel can be kept variable by choosing sealing strips of different widths, tubes, etc.), so that both analytical and micro-preparative gels can be made.
  • Ready-made gels of certain widths and thicknesses are used in the usual commercially available flat gel-electrophoresis combination chambers.
  • ampholines soluble hermaphrodite molecules
  • immobilons immobilized hermaphrodite ions
  • immobilons could also be used in the device according to the invention; however, the separation properties of these gels have so far been less good than those produced with ampholines.
  • Advantages of the electrophoresis combination chambers described are: - variable widths of the gels;
  • stop gel serving for the mechanical but not electrical separation of the gel of the first dimension into an associated buffer vessel
  • the separation takes place horizontally, not vertically, without tilting processes being necessary.
  • the position of the chamber does not change during gel pouring and electrophoresis. After assembly, the apparatus stands upright, ie saves space.
  • the first dimension has been carried out, it is new that the insulating tubes 9 or insulating strips 9 are removed after the first dimension without opening the chamber. Full automation is possible when using a stepper motor to remove the insulating elements 9.
  • Another new feature is the introduction of a conductive contact liquid (e.g. based on agarose) into the resulting cavity between the gel of the 1st and 2nd dimensions, so that the electrical transition to the 2nd dimension is guaranteed without the need for buffering.
  • a conductive contact liquid e.g. based on agarose
  • the buffering can take place by rinsing the resulting space with buffer solution after removing the insulating tubes 9.
  • vent opening 18 of the 2nd dim which is bevelled upwards, so that all air can escape. This is possible because the gel in the gel chamber 7 is vertical, but the proteins are separated horizontally (from right to left or from left to right, depending on the choice of electrode connections).
  • pre-gels i.e. dehydrated gels can be used in the electrophoresis combination chamber.
  • a strip-shaped gel (1st dimension) is applied to a carrier film.
  • a flat gel (2nd dimension) is applied at a certain distance.
  • the gels on the carrier film are placed on plate 4 over the cooling elements 3.
  • the glass plate 5 is placed on and the printing frame 13 is attached.
  • Rehydration solutions for both gels are filled into the buffer vessels 8 and 21.
  • the gels are rehydrated. They swell in the same chamber in which the subsequent electrophoresis is carried out. After rehydration, excess buffer is removed and the sample is applied.
  • the running buffer for the first dimension is then filled into the filling openings 8 and 20 and the electrophoresis is carried out in the first dimension.
  • re-equilibration buffer for re-equilibration to the buffer conditions of the second dimension is filled into openings 8 and 20, and after re-buffering, the re-equilibration buffer is removed and the insulating element 9 designed as a sealing tube is pulled out.
  • the resulting space is filled with a collecting egg solution that polymerises quickly.
  • the buffer solution for the second dimension is filled in and the second separation is started.
  • the present invention also uses combinations of both IEF gel types; eg ready-made ampholin gels, the ends of which were made with immobilines, so that the separation area on the acidic and basic separating side of the IEF gels can still be expanded considerably.
  • IEF gel types eg ready-made ampholin gels, the ends of which were made with immobilines, so that the separation area on the acidic and basic separating side of the IEF gels can still be expanded considerably.
  • hose that is U-shaped (possibly in a groove provided in one of the plates) or by two
  • Hoses that are closed at one end.
  • the seal is made by filling the hose with a fluid (liquid or gas). With sufficient internal pressure, the sealing against the inner and outer plates 4 and 5 takes place
  • pouring the stop gel can be the gel of the first dimension be poured.
  • the gel of the second dimension is limited analogously with a U-shaped tube or a tube which is closed at the end.
  • the hose is evacuated but not removed from the system. Agarose solution is filled into the resulting space between the first and second dimensions in order to establish an electrically conductive connection between the gels.
  • An advantageous embodiment consists in that this hose is fixed with an adhesive only on one of the plates 4 or 5 or is fixed on one of the plates 4 or 5 in a groove, so that it is ensured that the hose only after evacuation located on a plate 4 or 5.
  • a variant of this construction or method is to remove the hose after the first dimension has been separated. The evacuation considerably simplifies the removal.
  • the combination chamber according to the second embodiment consists of two parts which are arranged one above the other, the upper IEF part for carrying out IEF electrophoresis in the first dimension and the lower part for carrying out SDS electrophoresis in the second dimension.
  • the combination chamber consists of several components that are assembled, for example, by screwing or clamping.
  • the rear wall plate 28A forms a unit with the upper buffer reservoir 29 of the second dimension and the casting vessels 30 for casting the second dimension, the buffer vessel 31 for filling in the buffer of the second dimension.
  • the cover plate 28B which is designed as a glass plate, is connected to the rear wall plate 28A and the upper buffer reservoir 29 eg connected by screwing.
  • Flat seals 23 on the right and left seal outwards and define the thickness of the gels between the plates 28A and 28B.
  • the plate 28B has a height which results from the height of the plate 28A and the height of the upper buffer reservoir 29.
  • the plates 28A, 28B can be transparent.
  • the top cover plate 28B should be transparent so that the individual process steps can be observed.
  • an U-shaped insulating element 24 designed as a hose seal in the present exemplary embodiment, which separates the gel 25 of the first dimension from the gel 36 of the second dimension.
  • the electrodes 26 and 27 for the electrophoresis of the first dimension.
  • the composite construction of plates 28A, 28B and the upper reservoirs is placed in the lower buffer tank 32 of the second dimension.
  • a seal 33 which e.g. can be pneumatically raised (condition 33a) to seal down the void between plates 28A and 28B so that the second dimension gel 36 can be poured out of the pouring vessel 30 via a connection (e.g., a tube).
  • the buffer filling vessel 31 serves to fill the lower buffer tank 32.
  • the electrodes 38 and 39 of the second dimension are located in the buffer vessel 29 and the buffer tank 32.
  • an IEF finished gel strip 25 is positioned between the deflecting elements 22 (white horizontal surface) and brought into direct contact with the two electrodes 26, 27 which protrude through the glass plate 28B in the deflecting elements 22 and enable electrophoresis in the first dimension .
  • the upper glass plate 28B is then placed on top (FIG. 7) and, in the present exemplary embodiment, is held together with the lower rear wall plate 28A and the upper buffer reservoir 29 by means of clips.
  • the glass plate sandwich is then placed in the buffer tank 32 (Fig. 8).
  • the pouring vessel 30 serves for pouring the SDS-PAGE gel and the reservoir 29 and the buffer tank 32 as a buffer reservoir for the SDS-PAGE, the buffer tank 32 being filled from a buffer filling vessel 31 via a connecting line.
  • a seal 33 which, when sealing, can close the slot between the two glass panes 28A, 28B on the underside.
  • Fig. 8 it is shown in the non-sealing state.
  • the IEF gel 25 is used for rehydration
  • Rehydration buffer overlaid between glass plates 28A, 28B in room 34 and rehydrated. After rehydration (> 2h) the excess becomes Buffer removed. The sample is then introduced into a recess 35, the space of which was saved by introducing a spacer insert during the rehydration. Then electrophoresis is carried out by applying a voltage between the electrodes 26, 27. After the IEF electrophoresis has been carried out, the IEF gel 25 is buffered by adding reequilibration buffer which is introduced into room 34 (for example 30 min, at pH 6.9).
  • the SDS gel 36 for the second dimension is poured before, after or during the implementation of the first dimension by pouring the gel solution through the pouring vessel 30 and passing it down through a line between the glass plates 28A, 28B (Fig. 9) .
  • the seal 33A seals the glass plate sandwich downward so that the gel solution cannot leak.
  • the gel 36 is polymerized between the glass plates 28A, 28B for at least two hours. The seal is then broken again by the seal 33A so that the SDS gel comes into contact with the electrophoresis buffer in the buffer tank 32.
  • the reequilibration buffer is removed from the space 34, the plastic tube 24 is pulled out of the apparatus from the side upwards, for example with a stepper motor, and the resulting space 37 between the first and second dimensions with contact gel (for example agarose - Collection gel) filled (Fig. 5). Then buffer is filled into the buffer reservoir 29 and the buffer tank 32 and the SDS electrophoresis in the second dimension is carried out via an electric field between the electrodes 38, 39 of the second dimension in the buffer vessels 29, 32 filled with buffer.
  • contact gel for example agarose - Collection gel
  • the gel is lifted off and developed according to known methods, for example stained with silver nitrate solution or Coomassie solution. Both electrophoresis dimensions are cooled - by immersing the gel sandwiches in thermostatted buffer solution of the second dimension, which is located in the buffer tank 32, or the chamber sandwiches are cooled by cooling chambers applied to the glass plates 28A, 28B.
  • the invention also relates to new IEF gels (isoelectric focusing gels) according to claims 24 to 29, which offer an excellent separation effect for biomolecules, in particular for proteins, and an expanded separation area on the acidic and basic separation side. Selected recipes of gels are documented below.
  • Lateral immobilization gels 10% acrylamide gel with the addition of 50 mM to 100 mM immobilines
  • Buffer A 4% (v / v) phosphoric acid
  • Buffer B 5% (v / v) ethylenediamine
  • SDS running buffer 192mM glycine, 25mM Tris base, 0.1% SDS Running conditions:
  • Coolant inlet 24 insulating elements
  • Seal (can e.g. be lifted pneumatically
  • a seal e.g. pneumatically raised

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Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren und Vorrichtungen zur ein- und zwei-dimensionalen Trennung von Biomolekülen in Gelen durch Elektrophorese in einer Elektrophoreseapparatur und dient insbesondere der Auftrennung von beispielsweise Proteinen, Glycoproteinen, Lipoproteinen, Nukleinsäuren oder Zellkomplexen. Eine erste erfindungsgemäße Vorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, daß eine Elektrophorese-Kombikammer (1) einen Kern (2) mit Kühlelementen (3) aufweist, wobei die Kühlelemente (3) unter den beidseitig des Kerns (2) durch innere Platten (4) und äußere Platten (5) im Zusammenwirken mit entfernbaren oder schaltbaren Isolierelementen (9) gebildeten Gelkammern (6, 7) und Puffergefäßen (8 und 21) angeordnet sind. Eine zweite Kombinationskammer zur ein- oder zwei-dimensionalen Trennung von Biomolekülen oder anderen Stoffgemischen in waagerecht übereinander angeordneten Gelen durch Elektrophorese weist eine Rückwandplatte und eine Deckplatte auf, wobei zwischen Rückwandplatte und Deckplatte mindestens zwei Umlenkelemente zur Führung von Isolierelementen angeordnet sind. Es wird weiterhin das Verfahren zur ein-dimensionalen sowie zwei-dimensionalen Trennung und die Rezeptur spezifischer Gele beschrieben.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Trennung von Biomolekülen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur ein- oder zwei-dimensionalen Trennung von Biomolekülen in Gelen durch Elektrophorese in einer Elektrophoreseapparatur und dient insbesondere der Auftrennung von beispielsweise Proteinen, Glycoproteinen, Lipoproteinen, Nukleinsäuren oder Zellkomplexen in Gelen (z. B. in Polyacrylamidgelen, Harnstoffgelen oder Agarosegelen) in zwei Dimensionen.
Proteine und Peptide sind Biopolymere, die zu Tausenden in jeder Zelle vorkommen; sie sind die unmittelbaren Genprodukte, die alle Zellprozesse katalysieren, stimulieren und regulieren. Ihre Struktur und Funktionsanalyse bildet die Basis für die Aufklärung aller wichtigen Zellvorgänge und ist die Grundlage zum Verständnis von Krankheitsprozessen auf der molekularen Ebene und in der molekularen Medizin, z.B. bei der Tumorentstehung und zur Entwicklung von Frühdiagnostika und neuen Therapeutika in der Pharmaindustrie. Wegen der oft sehr geringen Konzentrationen, in denen die Peptide und Proteine in der Zelle vorkommen, ist es notwendig, hochempfindliche Nachweismethoden und Trenntechniken für ihre Charakterisierung zu entwickeln. Proteine sind aus langen Ketten von Aminosäuren aufgebaut und weisen eine für jedes Protein spezifische räumliche Struktur auf. Jedes Protein hat eine individuelle Aminosäurefolge, die Primärsequenz, die sich zu einer jeweils spezifischen Raumstruktur (3D-Struktur) auffaltet, die Träger der physiologischen Funktion im Zellgeschehen ist . Proteine nehmen als direkte Genprodukte eine zentrale Stellung bei allen Lebensprozessen ein. Sie katalysieren die biosynthetischen Vorgänge als Enzyme, bauen den Organismus als Strukturproteine auf, bewerkstelligen Stofftransport und Signaltransduktion und spielen eine wesentliche Rolle bei der Translation der Erbinformation (Proteinbiosynthese) und bei allen Regulationsvorgängen. Eine einzelne Zelle enthält über 5000 unterschiedliche Proteine. Biosynthese und Expression jedes Proteins sind genauestens reguliert. In unterschiedlichen Geweben kommen verschiedene Expressionsmuster zustande. Außerdem können posttranslatio- nale Veränderungen in den Proteinen auftreten, wie z.B. Phosphorylierungen beim Hitzeschockprotein 27, die von physiologischer Bedeutung sind und in der zwei-dimensionalen Elektrophorese ein charakteristisches Muster nach immunchemischer Anfärbung im Western-Blot ergeben. Daher ist es wichtig, die Expression nicht nur auf der Gen- und Botennukleinsäure (mRNA) -Ebene zu studieren, sondern auch die Proteine, ihre Zusammensetzung und Konzentration in den unterschiedlichen Zellen und Geweben, besonders beim Menschen, genauestens zu kennen. Nach der Totalsequenzierung ganzer Genome, wie z.B. dem aus Hefe oder wie im Humangenomprojekt konzipiert, kommt daher der Erforschung der Proteine und ihren Zellfunktionen eine zentrale Bedeutung zu. Wenn in einigen Jahren das menschliche Genom mit ca. 100.000 Ge- nen bekannt sein wird, werden sich die Wissenschaftler mehr und mehr der Erforschung der durch die Gene ko- dierten Proteine zuwenden müssen, was unter dem Begriff Proteomforschung zusammengefaßt wird. Nur ein Bruchteil dieser wichtigen Biomoleküle ist bisher auf der molekularen Ebene bekannt. Ohne die Strukturinfor- mationen können jedoch die Vorgänge des Zellstoffwechsels und seiner regulatorischen Zusammenhänge nicht verstanden werden. Dies ist besonders bei der Aufklärung der Entstehung von Krankheiten unumgänglich. Viele der über 5000 Zellproteine sind weder in ihrer Struktur noch in ihrer Funktion bekannt. Um ihre biologische Bedeutung und physiologische Rolle zu verstehen, werden in modernen Forschungsprojekten Totalzellextrakte oder die Gesamtproteine aus Einzelzellinien in hochauflösenden zwei-dimensionalen Gelelektrophoresen (2DE) getrennt und sichtbar gemacht. Zellextrakte aus verschiedenen Gewebeproben, z.B. aus Tumorgewebe, können so miteinander und mit gesunden Gewebeproben verglichen und die Proteine durch proteinchemische und massenspektrometrische Analysen identifiziert und charakterisiert werden. Auf diese Weise lassen sich krankheits-assoziierte Proteine nachweisen, die als Marker zur Früherkennung der Krankheiten dienen oder den jeweiligen Grad der Krankheit, z.B. bei der Tumorentstehung, präzise charakterisieren können.
Da die Proteine oft nur in kleinsten Mengen exprimiert werden, ist es wichtig, hochsensitive Verfahren zur Trennung und Identifikation zu entwickeln. Um die ehrgeizigen, in die Zukunft weisenden Forschungsprojekte in Zusammenhang mit der Genomfunktionsanalyse bewerkstelligen zu können, sind neue, innovative Trenn- und Analyse-Techniken vonnöten.
Ein- und zwei-dimensional durchgeführte Gelelektropho- resen von Proteinen, Nukleinsäuren, oder anderen Biomolekülen sind seit langem in der Biochemie, der pharma- zeutischen Industrie, Medizinforschung und Laborpraxis eingeführte Techniken, um schnelle Auftrennungen, Vergleiche von Trennmustern oder Qualitätskontrollen von Isolaten und Produkten durchzuführen. Die Elektrophore- sekammern und ihr Zubehör (Powersupply, Kühlsysteme, Detektoren) sind längst zu unumgänglichem Inventar in jedem naturwissenschaftlichen, pharmazeutisch oder labormedizinisch ausgerichteten Laboratorium geworden.
Für die Trennung von Biomolekülen in einer Trennrichtung (ein-dimensionale Elektrophorese, IDE) stehen zahlreiche Elektrophoresekaπunersysteme und Trennmethoden zur Verfügung, die je nach anstehendem Trennproblem auf die speziellen Anwendungen adaptiert sind. Die Trennung einzelner Proben erfolgt zumeist in Kapillarröhrchen oder Gelstreifen und die Trennung multipler Proben wird zumeist in Flachgelen (Slabgelen) durchgeführt, bei denen Auftragstaschen am oberen Ende einer dünnen auspolymerisierten Gelschicht ausgespart sind. Diese Geltaschen werden beim Gießen durch Einbringung von sogn. Kämmen während der Polymerisation vorbereitet . In diese Taschen werden nach Polymerisation des Geles und Entfernung der Kämme die Proben eingebracht . Für Trennungen komplexer Protein- und Peptidmischungen in langen Gelen (>10 cm) stehen weit weniger Kammersysteme zur Verfügung.
Die Auftrennung in zwei verschiedenen Dimensionen (2DE) , bei denen unterschiedliche Bedingungen für die Auftrennung in den beiden Dimensionen gewählt werden (z.B. erste Dimension: Trennung nach Ladung, zweite Dimension: Trennung nach Molekülgröße) stehen keine einfach handbaren KomplettSysteme zur Verfügung, die sich zur Vollautomatisierung eignen. Gewöhnlich muß bei diesen Elektrophoresen jede Dimension in einer anderen Kammer durchgeführt und das nach der ersten Dimension gewonnene Trenngel auf das vorbereitete Gel der zweiten Dimension manuell aufgebracht und dort einpolymerisiert werden. Erst dann kann die elektrophoretische Trennung der Probe in der zweiten Dimension erfolgen. Die manuell durchgeführten Teilschritte sind zeitaufwendig, erfordern viel Geschicklichkeit und erlauben eine Perfektion und Reproduzierbarkeit nur bis zu einem gewissen Grad, in Abhängigkeit von der Person, die die Handhabung durchführt .
IDE Trennnungen von Proteinen und Peptiden werden zumeist in kleinen Kammern in 5-11 cm langen polymerisierten Polyacrylamidgelen unterschiedlicher Quervernetzung und unterschiedlicher Dicke (z.B. 0.7 bis 1.5 mm) und Breite durchgeführt (in sogn. Slabgele) . Hierzu werden auf das in flüssiger Form zwischen zwei Glasplatten gegossene Gel nach Polymerisierung die Proben aufgetragen und in einer Elektrophoreseapparatur für mehrere Stunden bei 500 bis 2000 Volt/20 cm aufgetrennt. Danach wird das Gel entnommen und zur Anfärbung der Substanzen in eine Färbelösung getaucht; danach zur Entfernung des Überschusses an Farbstoff in einer Entfärbelösung entfärbt und dabei werden die Substanzen sichtbar. Sie können durch Photographie oder durch Einscannen im Computer in ihrer Lage auf dem Gel dokumentiert werden, z.B. für Vergleiche mit anderen Proben. Es können zwischen dünnen Glasplatten auch sogn. trägerfreie Elektrophoresen durchgeführt werden, bei denen die zu trennenden Substanzen in einem dünnen Pufferfilm ohne jedweden Träger elektrophoretisch aufgetrennt werden. Für andere Biomoleküle, wie Nukleinsäuren oder hochmolekulare Komplexe werden z.B. auch Agarosegele zur Trennung verwandt . Alternativ zu den Slabgelen hat sich die Trennung in der ersten Dimension auch in feinen Glaskapillaren
(i.D. 0.7 bis 1.5 mm) bewährt, in die die zunächst flüssige Gelmischung zur Polymerisation eingebracht wird und die Substanzmischung danach von oben eingespritzt wird. Die Kapillaren werden zunächst in einem Gelgießständer mit Gel versetzt, dann dort polymerisiert und erst nachdem sie in die
Elektrophoresekammer verbracht worden sind, mit der Probensubstanz befüllt .
Nach der Durchführung der unter Hochspannung aufgetrennten Proben müssen die Gele, die sehr weich und flexibel sind, vorsichtig aus den Kapillaren zur Einbringung in die Färbe- /Entfärbelösung ausgestoßen werden, wobei mechanische Defekte an den Gelen entstehen können. Wegen der schwierigen Handhabung werden zunehmend auch schmale Flachgele (2 x 5-10 cm dünne Streifengele) , die als getrocknete Fertiggele kommerziell zur Verfügung stehen, für die IDE verwandt (z.B. von der Fa. Pharmacia Biotech, Freiburg) .
Zur Trennung in der zwei-dimensionalen Technik (2DE) müssen die Gele aus der ersten Dimension (die Gele aus den Kapillaren oder die Gelstreifen) für die Auftrennung in der zweiten Dimension durch manuelle Manipulation auf ein entsprechend vorbereitetes Flachgel (Slabgel) , das bereits vorpolymerisiert ist, aufgebettet und auf dieses Flachgel aufpolymerisiert werden. Erst danach kann die Trennung in der zweiten Dimension in der entsprechenden Elektrophoresekammer für die 2. Dimension durchgeführt werden. Nach der Trennung erfolgt die übliche Färbungs- und Entfärbungstechnik und Dokumentation der Ergebnisse. Verschiedene Gele und Puffersysteme für die Durchführung von gelelektrophore- tischen Proteintrennungen in zwei Dimensionen sind be- schrieben worden: In der zuerst beschriebenen Version werden z.B. Gemische von ribosomalen Proteinen in Harnstoffgelen getrennt, bei denen die pH-Bedingungen in den beiden Dimensionen variiert werden. Verfahren zur Auftrennung von hoch komplexen Proteinmischungen, z.B. aus intakten Zellen, Zellinien oder Geweben nutzen in der ersten Dimension Trennungen auf Grund verschiedener Ladung der Proteine durch Isoelektrofokussierung (IEF) und in der zweiten Dimension Trennungen nach Molekül- große in SDS-Natrium-dodecylsulfat-Gelen. Für die Durchführung der Isoelektrofokussierung werden entweder Immobilone oder Ampholine benutzt, die in das Gel eingebracht werden. Mit der letzteren Technik gelingt es mehr als 10000 Proteine eines Zelllysates aufzutrennen; die erstere Technik mit ImmobiIonen ist für Trennungen von etwa 2000 Proteinen konzipiert. Bei Verwendung von Ampholingradienten sind Trennungen von mehr als 10000 Proteinen beschrieben worden (Klose und Kobalz, 1995) Diese hochauflösenden Proteingelelektrophorese-Techni- ken werden für die moderne Proteomforschung, die Ermittlung der exprimierten Proteine einer Zelle und ihrer krankhaften Veränderungen, z.B. bei der Untersuchung der Tumorentstehung, genutzt. Die Krankheits-assoziierten Proteine können nach Auftrennung in der hochauflösenden zwei-dimensionalen Gelelektrophorese mittels proteinchemischer und massenspektrometrischer Verfahren identifiziert werden.
Die US 4,666,581 beschreibt eine Vorrichtung zur zwei- dimensionalen Elektrophorese, bei welcher jedoch beide Gele nur in räumliche Nähe gebracht werden. Statt manueller Handhabung, die schwierig und fehlerbehaftet ist, wird hier eine Mechanik, ein komplizierter Drehmechanismus , zum Übertragen des Geles von der ersten Dimension zur zweiten Dimension eingesetzt. Die Puffergefäße sind nicht integriert. Der Stromfluß muß auf komplizierte Art und Weise über Filterstreifen sichergestellt werden.
Mit der US 4,874,490 wird ebenfalls ein System zur zwei-dimensionalen Elektrophorese beschrieben, wobei das Patent kein vollständig integriertes System offenbart und ein Gelgießgestell benötigt . Auch sind die Puffergefäße für die kathodischen und anodischen Pufferlösungen nicht integrale Bestandteile der Kammer. Weiterhin ist in diesem System keine Kühlung integriert. Es erfolgt die Trennung der ersten Dimension horizontal und in der zweiten Dimension vertikal. Die Gele müssen in der beschriebenen Konstruktion zwingend nacheinander in mehreren Schritten gegossen werden. Es muß zuerst die zweite Dimension in einem konventionellen Gießständer außerhalb der Elektrophoresekammer gegossen werden. Nach dem Gießen müssen über das Gel der zweiten Dimension Dicht-/lsolierstreifen durch mechanische Manipulation eingefügt werden. Danach erst kann das Gel für die erste Dimension gegossen werden. Anschließend wird der Spacer wieder entfernt. Die Probenaufgabe in größeren Mengen ist ungelöst. Beschrieben ist nur das Tränken einer Membran. Die Aufgabemenge und deren Aufkonzentrierung ist beschränkt .
Weiterhin beschreibt die DE 4244082 AI sowie die US 5,407,546 ein Verfahren und eine Vorrichtung zur hochauflösenden zwei-dimensionalen Elektrophorese. Wesentlich hierbei ist die selektive Rehydratisierung. Es wird ausdrücklich ein zusammenhängendes Gel ("EinMolekül") verwendet. Als Ausgangsmaterial können nur getrocknete Gele verwendet werden und diese müssen re- hydratisiert und reäquilibiriert werden. Das geschieht vor und nach der ersten Dimension und gesondert wird das Gel der zweiten Dimension rehydratisiert . Es ist kein vollautomatischer Ablauf möglich, da das Gel der ersten Dimension in ein geheiztes Aquilibratorgefäß transferiert und umgepuffert werden muß. Damit liegt keine vollständige Integration vor.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Verfahren und Vorrichtungen zu schaffen, mit welchen mit einfachen Mitteln in einer einzigen Apparatur mit selbstgegossenen Gelen und/oder getrockneten Fertiggelen effektive Gelelektrophoresen der ersten und zwei- ten Dimension manuell oder vollautomatisch durchgeführt werden können. Es ist weiterhin Aufgabe der Erfindung, spezifische Fertiggele anzugeben.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Merkmale in den Ansprüchen 1, 9, 16, 19, 23 und 24.
Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen enthalten.
Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß eine Vollautomatisierung der gesamten 2DE einfach durchgeführt werden kann, indem die Gele für die Trennung in der ersten Dimension und die Gele für die Trennung in der zweiten Dimension nacheinander oder gleichzeitig vertikal zueinander angeordnet, als Gießgele oder Fertiggele in eine Elektrophorese- Kombikammer eingebracht und im Falle der gegossenen Gele voneinander isoliert polymerisiert werden, nachfolgend Pufferlösungen eingefüllt, z.B. ein Proteinextrakt auf die Gele der ersten Dimension aufgetragen und die elektrophoretische Auftrennung der ersten Dimension bei konstanter Temperatur oder bei fixiertem Temperaturgradienten mit z.B. ansteigender elektrischer Spannung durchgeführt, anschließend die Pufferlösung abgesaugt, die Isolierung aufgehoben, in die entstehenden Räume zwischen erster und zweiter Dimension Kontaktgel eingefüllt und auspolymerisiert , Pufferlösungen eingefüllt und die elektrophoretische Trennung der zweiten Dimension bei präzise eingestellter Temperatur und konstanter elektrischer Leistung oder steigender Stromstärke durchgeführt wird und abschließend die Gele z.B. mit Färbelösung entwickelt und die Proteine mit herkömmlichen Methoden auf den Gelen sichtbar gemacht werden.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß die zwei-dimensionale Trennung in der erfindungsgemäßen Elektrophorese-Kombikammer nur mit einer einzigen Vorrichtung bewerkstelligt wird, die für die Durchführung beider Elektrophorese-Dimensionen einge- richtet ist und die Elektrophorese-Kombikammer einen Kern mit Kühlelementen aufweist, wobei die Kühlelemente beidseitig des Kerns durch aus inneren Platten und äußeren Platten im Zusammenwirken mit entfernbaren oder schaltbaren Isolierelementen gebildeten Gelkammern und Puffergefäßen angeordnet sind.
In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung ist es möglich, daß die Elektrophorese in einer Kombinationskammer durchgeführt wird, jedoch muß kein Kühlelement im Kern integriert sein. Es kann eine externe Kühlung über den Puffer im unteren Puffergefäß der zweiten Dimension erfolgen. Eine spätere Integration der Kühlung in die rückwärtige Platte der Kammer ist jedoch ebenso möglich.
Ein zusätzlicher Vorteil der Erfindung besteht darin, daß das Gießen der Gele vor dem Auftrag der Substanzen im neuen Kammersystem in demselben Raum erfolgt, in dem auch die Trennungen selber in den beiden Dimensionen der Elektrophorese durchgeführt werden. Es entfallen daher zwei separate Gelgießständer (jeweils einer für die erste und für die zweite Dimension) . Die Gele für die beiden Elektrophorese-Dimensionen werden vor Beginn der Substanztrennung in der Elektrophorese-Kombikammer vorbereitet und stehen beim Start der jeweiligen Elektrophoresen bereit . Alle Manipulationen zum Gießen der Gele werden in einem Arbeitsgang vor Beginn des Probenauftrags gemacht .
Ebenfalls vorteilhaft ist eine optimale Kühlung, die sowohl in der Elektrophoresekammer (für beide Dimensionen) als auch in den Pufferkammern für beide Dimensionen sichergestellt wird. In bisherigen Techniken werden die Gele und die Puffer- lösungen der ersten Dimension zumeist gar nicht gekühlt und die bisher realisierten Kühlungen für die 2. Dimension weisen Mängel auf (Temperaturdifferenzen innerhalb der Gele; ungenügende Kühlung der Puffer) . Variable Programmierungen des Elektrophoreseablaufes (Stufenprogramme, Gradientenprogramme, Temperaturpro- gra me etc.) lassen sich ausführen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist es möglich, daß die Kühlung der Gele und Puffergefäße über den gekühlten Puffer im unteren Puffergefäß der zweiten Dimension oder durch integrierte Kühlvorrichtungen in der rückwärtigen Platte der Kammer erfolgt . Für die erste Dimension wird auf Puffergefäße verzichtet. Das Gel ist in direktem Kontakt mit den Elektroden am rechten und linken Gelende .
Die Elektrophorese-Kombikammer läßt sich auch für eindimensionale Trenngele variabler Länge (z.B. 10 bis 30 cm) für die Auftrennung multipler Proben verwenden. Die Trennungen können in der Kombikammer reproduzierbar unter genau festgelegten Standardbedingungen durchgeführt werden.
Ebenso ist es auch möglich, die Elektrophorese-Kombi- kammern für die Auftrennung mehrerer Proben, z.B. 20 Proben, in einem ein-dimensionalen SDS-Gel zu benutzen, wobei die Proben mit Hilfe eines Auftragskammes auf dem Gel der 2. Dimension aufgebracht werden. Ein entsprechender Einsatz mit Probentaschen wird eingebracht, wo sonst das Gel für die 1. Dimension enthalten ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist es möglich, daß auch nur eine ein-dimensionale Trennung von oben nach unten mit einer großen Anzahl an Proben erfolgt, indem anstelle des Gels der ersten Dimension und des Isolierelementes ein Probenkamm bei der Herstellung der 2. Dimension eingesetzt wird, um Taschen für den Probenauftrag zu erhalten. Nach Herstellung des Gels wird der Kamm entfernt. In die einzelnen Kammpositionen können dann verschiedene Proben eingebracht und ein-dimensional getrennt werden.
Die erfindungsgemäße Elektrophoresekombikammer enthält vorzugsweise zwei mal zwei Gele, deren Zahl sich belie- big erweitern läßt . In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist es möglich, daß pro Einheit die Kammer vorzugsweise nur die beiden Gele für die erste und die zweite Dimension enthält. Es lassen sich jedoch beliebig viele Kammern parallel elektrophoretisch entwickeln.
Die Gelpaare für die Trennung in der ersten Dimension werden parallel elektrophoretisch entwickelt und sind zunächst von den Gelen für die Durchführung der zweiten Dimension durch eine nicht-leitende Isolierung getrennt, die danach beispielsweise mechanisch von außen ohne Aufschrauben der Kammer entfernt und durch ein leitendes Medium ersetzt wird, das die Kontakte zu den Gelen für die Durchführung der zweiten Dimension herbeiführt. Die Gele für die erste und zweite Dimension werden jeweils paarweise nacheinander unter verschiedenen Bedingungen entwickelt, ohne daß das Gel von der ersten Dimension auf die zweite mechanisch transferiert werden muß. Die Elektrophorese-Kombikammer hat für beide Dimensionen eine integrierte Kühlvorrichtung und integrierte Füll- und Puffergefäße. Der Deckelaufsatz der Elektrophorese-Kombikammer enthält die elektrischen Sicherheitsverbindungen für die Verbindung mit dem Powersupply, die Verbindungen zum Kühlaggregat und alle notwendigen Einfüllstutzen für das Gießen der Gele, für das Eingießen der Elektrolysepuffer und die Einführung der Probe.
Die erfindungsgemäße lDE/2DE-Elektrophorese-Kombikammer dient z.B. der Trennung von komplexen Proteinmischungen für die Auftrennung von Proteinen aus Geweben, Zell- linien oder Mikroorganismen, die mehr als 5000 Proteine enthalten können. In der Elektrophorese-Kombikammer können sowohl analytische als auch präparative Elektrophoresen durchgeführt werden, wobei je nach Stoffklasse z.B. isoelektrische Fokussierung und SDS-Elektrophorese oder Trennungen in Agarose, Harnstoff oder anderen Trennmedien Verwendung finden können. Die Kammer ist thermostatisierbar, enthält alle Puffergefäße für die Durchführung der ersten und zweiten Dimension und einen Aufsatz, der es erlaubt die Elektrophoresen unter hohen Spannungen z.B. bis 5000 Volt durchzuführen. Die Elektrophorese-Kombikammer dient z.B. der Identifizierung von krankheitsassoziierten Proteinen, zur Entwicklung von Markerproteinen bei der Erstellung von Frühdiagnosen von Krankheiten und zur Entwicklung neuartiger Pharmaka. Zellprozesse wie Embryonalentwicklung, Transport- und Signaltransduktionsprozesse und Regulations- und Expressionsmuster können mit Hilfe der Elektrophorese-Kombikammer studiert werden. Sie eignet sich zur Auflösung von >5000 Proteinen und ist damit ein vorzügliches Instrument für die Untersuchung in der Pro- teomforschung, einem neuen Forschungs- und Entwicklungsgebiet in der medizinischen und pharmazeutischen Grundlagenforschung und für industrielle Anwendungen, z.B. bei der Untersuchung ganzer Zellinhalte und ihrer Veränderungen oder zur Untersuchung des Einflusses von Pharmaka auf die Zellprozesse.
Ein besonderer Vorteil einer zweiten Ausführungsform der Erfindung besteht darin, daß eine Vollautomatisierung der gesamten 2DE einfach durchgeführt werden kann, indem die Gele für die Trennung in der ersten Dimension und die Gele für die Trennung in der zweiten Dimension waagerecht zueinander, also übereinander angeordnet werden.
Diese waagerechte Anordnung wird dadurch ermöglicht, daß die Isolierelemente zwischen den Gelen der ersten Dimension und den Gelen der zweiten Dimension ebenfalls in einem definierten Bereich waagerecht verlaufen, gleichwohl jedoch über Umlenkelemente zur Führung nach obenhin aus der Kombinationskämmer herausgezogen werden können .
Ein weiterer Vorteil der zweiten Ausführungsform der Erfindung besteht darin, daß mit der gleichen Kombinationskammer auch die ein-di ensionale Trennung durchgeführt werden kann, indem anstelle des Gels für die Trennung in der ersten Dimension sowie des Isolierelementes ein Kamm mit Probentaschen für verschiedene Proben in das SDS-Gel eingesetzt und dieses auspolymerisiert wird, der Kamm nach dem Auspolymerisieren entfernt, die Proben in die entstandenen Aussparungen eingebracht und nachfolgend die ein-dimensionale Elektrophorese durchgeführt wird.
Hierzu wird auf den Einsatz des Isolierelementes verzichtet und statt dessen ein Kamm mit Probentaschen beim Auspolymerisieren des SDS-Geles mit eingesetzt, der nach Auspolymerisierung des Geles herausgenommen wird, so daß nunmehr multiple Ports für das Auftragen verschiedener Proben im Gel enthalten sind. Diese können alle parallel zueinander in der eindimensionalen Elektrophorese getrennt werden. Die Konstruktion der Kombinationskammer bleibt also erhalten und es können sowohl ein-dimensionale wie zwei-dimensionale Gele im gleichen Kammersystem durchgeführt werden. Vorteilhaft ist auch, daß lange Laufstrecken, z.B. 32 cm lange ein-dimensionale Gele, durchgeführt werden können.
Die Erfindung soll nachstehend anhand von in den Figuren dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Es zeigen:
Fig. 1 eine Explosivdarstellung der wesentlichen Kon- struktionsteile der Elektrophorese-Kombikammer, Fig. 2 den Aufbau des inneren Kernes,
Fig. 3 den inneren Kern mit angeordneter innerer Platte,
Fig. 4 die Elektrophorese-Kombikammer mit eingelegten Dichtungen und angeordneten Isolierungen,
Fig. 5 die Elektrophorese-Kombikammer, einseitig komplett montiert mit Druckrahmen.
Fig. 6 bis 10 eine Prinzipdarstellung der Kombinationskammer in einer Konstruktionsvariante in den einzelnen
Komplettierungsstufen Die Elektrophorese-Kombikammer 1 zur Trennung von beispielsweise komplexen Proteinmischungen ermöglicht die elektrophoretische Trennung nacheinander in zwei verschiedenen Dimensionen, d.h. unter verschiedenen Bedin- gungen .
Wie in Fig. 1 zu ersehen ist, besteht die Elektrophorese-Kombikammer 1 aus mehreren Teilen, die miteinander durch Verschraubung zusammengesetzt werden: den inneren Kern 2 zur effektiven Kühlung, beidseitig damit verbunden die inneren Platten 4 und die äußeren Platten 5, zwischen denen sich beiseitig je ein freier Raum für ein Flachgel (1. und 2. Dimension) befindet. Mit Hilfe einer Dichtung 19 werden diese Platten 4,5 gegeneinan- der gedichtet und gleichzeitig die Dicke des Geles festgelegt (z.B. 0.75 mm oder 1.5 mm) . Während die innere Platte 4 aus einem gut die Temperatur leitenden Material gefertigt ist (z.B. einer speziellen gut leitenden Keramik, dünner Kunststoff) , ist die äußere Platte 5 vorzugsweise aus einem transparenten Material
(z.B. Glas), um maximale Durchsicht zu gewähren. Die äußeren Platten 5 werden durch beidseitiges Anschrauben je eines Druckrahmens 13 gehalten; Klammern werden nicht, wie sonst üblich, verwandt. Die untere Begren- zung der Elektrophorese-Kombikammer 1 ist durch einen justier- und drehbaren Tisch gegeben, auf dem die Elektrophorese-Kombikammer 1 mittenfixiert ist. Auf der Elektrophorese-Kombikammer 1 befindet sich ein Aufsatz in Form eines Deckels 14, in den Zulauf 11 und Ablauf 12 für das thermostatisierte Kühlwasser und Einleitungen für die Puffergefäße 8 und 21 der ersten und zweiten Dimension (jeweils für den Anoden- und Kathodenpuffer) , für Einfüllstutzen und die Zuführungen der Elektroden eingearbeitet sind. Die Einleitungen für die Puffergefäße 8 und 21 dienen zunächst als Einfüllstutzen für das Eingießen der Gelflüssigkeiten. Der innere Kern 2 und die Druckrahmen 13 sind z.B. aus Polymermaterial (z.B. Acrylglas, Plexiglas) gefertigt und im Druckrahmen 13 sind Fenster in der Größe der Gele ausgespart, damit die Gießvorgänge der Gele und die Durch- führung der Elektrophoresen leicht von außen beobachtet werden können .
Der innere Kern 2 (Fig. 2) und die zwei inneren Platten 4 werden vom Hersteller verklebt (Fig. 3) . Weiterhin sind Puffergefäße 8 und 21, die teilweise gleichzeitig Füllkammern für die Gele sind, angeordnet. Die inneren Platten 4 schließen das Kühllabyrinth 10 (Kühlmäander) dicht ab, haben aber Öffnungen zu den Puffergefäßen 8 der ersten Dimension (Puffer, 1. Dim.) und Puffergefä- ßen 21 der zweiten Dimension (Puffer 2. Dim.), wie in Fig. 2 und 3 dargestellt. Die Kühlelemente 3, 10 sind unter den Gelen lokalisiert und kühlen nicht nur die Gele der ersten (Gel 1) und zweiten Dimension (Gel 2) , sondern auch die Puffergefäße (Puffer 1. Dim und Puffer 2. Dim. ) .
In der Figur 3 (Kern komplett verklebt; muß nach den Elektrophoresen nicht demontiert werden) ist rechts oben die Füllkammer 8 für das 1. Dim. Gel mit Füllröhre 17a für Gel 1 und gleichzeitig die Pufferkammer 8 für die erste Dimension (Lauf 1. Dimension) wiedergegeben.
Außerdem sind links oben die Füllkammer 17b mit Füllrohr für das 2. Dim. Gel und gleichzeitig die Puffergefäße 21 für die 2. Dimension (Lauf 2. Dim.) dargestellt. Die linke Füllkammer 17b endet unten mittig, um ein gleichmäßiges Eingießen der Gelflüssigkeit von unten nach oben zu ermöglichen, wobei eine Entlüftungsöffnung 18 mit einer schräg ausgebildeten oberen Begrenzung für ein gleichmäßiges, langsames und Luftblasen-freies Eingießen sorgt. In einer speziellen Ausführungsform ist die Elektrophorese-Kombikammer 1 oberflächenbeschichtet. Es handelt sich dabei um eine Oberflächenbeschichtung der die Medien Gel, Gellösungen und Pufferlösungen berührenden Teile mit amorphen Kohlenstoffschichten. Vorteile der Beschichtung sind, daß durch niedrige Oberflachen- energie ein Anhaften von Medienbestandteilen verhindert (analog zu Teflon) und somit die Entnahme des Gels nach der Trennung sowie die Reinigung des Gerätes erleich- tert wird, die Schicht eine Hartstoffschicht ist und somit eine hohe Kratzfestigkeit aufweist und thermisch stabil ist. Alternativ können diese Oberflächen auch silanisiert werden.
Zur Durchführung der Elektrophorese werden folgende Arbeitsschritte absolviert:
1. Im ersten Arbeitsschritt wird auf den kompletten Kernaufbau eine zweiteilige Dichtung 19 aufgelegt (Fig. 4) .
2. Dann werden im zweiten Arbeitsschritt Isolier- schläuche 9 (z.B. 0.75-1.5 mm Rundschläuche oder viereckiges Material, z.B. Silikon), in vorgegebene Vertiefungen eingezogen (Fig. 4) . Diese dienen der seitlichen Abgrenzung des l.Gels von dem 2. Gel und der seitlichen Begrenzung des 2. Gels nach außen.
3. Als dritter Arbeitsschritt wird die äußere Glasplatte 5 aufgelegt.
4. Im vierten Schritt wird der Druckrahmen 13 aufge- legt und mit den Schrauben festgespannt (Fig. 5) .
5. Im fünften Schritt wird der bisher entstandene Körper umgedreht und Schritt 1-4 für die Vorbereitung der Parallelgele analog wiederholt.
6. Im sechsten Schritt werden die zwei Gele in die zwischen den Isolierschläuchen 9 gebildete Gelkammern 6 für die erste Dimension gegossen, danach so- gleich die zwei Gele in die Gelkammern 7 für die zweite Dimension. 7. Der Deckel 14 wird aufgesetzt und die Polymerisie- rung wird z.B. über Nacht vorgenommen. 8. Danach werden die Pufferlösungen eingefüllt und dann kann der Proteinextrakt nach hochtourigem Zen- trifugieren auf die 1. Dim. Gele aufgetragen werden.
9. Dann erfolgt die elektrophoretische Auftrennung in der ersten Dimension.
10. Danach wird der 1. Dimension-Elektrophoresepuffer abgesaugt und die beiden Isolierschläuche 9, die die 1. Gele von den 2. Gelen trennen, von außen herausgezogen, was sehr leicht vonstatten geht, und die entstehenden freien Kapillaren zwischen den Gelen durch Einfüllen von Stackinggelflüssigkeit befüllt, so daß nach Polymerisierung dieser Flüssigkeiten der Kontakt zwischen dem jeweils ersten und zweiten Gel gegeben ist . 11. Dann wird die Elektrophorese in der zweiten Dimension durchgeführt.
12. Nach Durchführung der Elektrophorese in der zweiten Dimension werden die Verschraubungen gelöst, die Gele zusammen mit den äußeren Glasplatten 5 abge- löst und in ein Färbe- und Entfärbebad gegeben. Danach sind die Gele für die Dokumentation bereit .
13. Die Durchführung neuer Gele ist nach Säuberung der Gelplatten und der Füll- und Puffergefäße sofort wieder möglich.
Durch Montage mehrerer Einheiten können bis zu 10 2DE- Gele in einem Arbeitsgang durchgeführt werden.
Beim Gießen der Gele der ersten Dimension werden die Gele als Flachgele in dem durch Füllrohr 17a und Gelkammer 6 gebildeten U-Rohr gegossen und polymerisieren dort aus . Dazu wird zuerst ein Stopgel mit hoher Quervernetzung gegossen, das den unteren Bereich des U- Rohrs ausfüllen soll. Die nach Zugabe eines Polymerisationsstarters noch flüssige Gellösung wird hierfür in das äußere Pufferreservoir der ersten Dimension gegeben, wobei das Gel nur den unteren Bereich des U-Rohres ausfüllt. Es reicht etwa 10 mm über das untere Ende der beiden als Isolierschläuche ausgebildeten Isolierelemente hinaus . Nach dem Auspolymerisieren wird das Separationsgel für die erste Dimension gegossen. In diesem Gel wird die Proteintrennung z.B. durch Isoelektrofokussierung durchgeführt. Zum Gießen wird die noch flüssige Separationsgellösung in das zweite (weiter innen gelegene) Pufferreservoir der ersten Dimension über die Füllkammern 8 eingegossen, bis der Bereich der ersten Dimension zwischen den beiden Isolierelementen 9 vollständig gefüllt ist . Das Gießen der Gele erfolgt unter konstanter Temperatur, (z.B. bei 20 °C, wozu die Kühlung ange- schaltet ist) bis das Gel auspolymerisiert ist.
Das Gel der zweiten Dimension wird zwischen den beiden Isolierelementen 9 von unten in die Apparatur eingegossen, indem die Gellösung über das Gießreservoir der zweiten Dimension eingefüllt wird. Die Gellösung fließt von dort über das Füllrohr 17b nach unten und tritt in der Mitte der Gelkammer 7 aus. Die Luft wird durch den Gießvorgang automatisch nach oben verdrängt und kann über die Entlüftungsöffnung entweichen, bis die Gellö- sung den Bereich der zweiten Dimension vollständig gefüllt hat.
Das Gel polymerisiert bei konstanter Temperatur (z.B. durch Kühlung auf 20°C) aus.
Im folgenden wird die Durchführung der ersten Dimension beschrieben. Die beiden Pufferreservoire (8) der ersten Dimension werden einmal mit einer alkalischen und einer sauren Pufferlösung gefüllt (z.B. 0,1N NaOH; 7% v/v H3P04). Die eine Pufferlösung fließt dabei in das U-Rohr bis zum Stopgel hinein, während die andere das Separationsgel überschichtet . Das Separationsgel wird dann mit einer Schutzlösung höherer Dichte als der Puffer überschichtet (z.B. 6% (w/v) Glycerin, 4 M Harnstoff, 1,5% (w/v) Ampholyte in H20) . Die Proben können durch Unter- schichten unter die Schutzlösung auf das Separationsgel der 1. Dimension über Einfüllöffnung 20 aufgetragen werden. Die elektrophoretische Trennung erfolgt dann z.B. unter konstanter Temperatur (z.B. Kühlung auf 18 °C) mit einem Spannungsgradienten von anfänglich z.B. 100V bis z.B. 3000V über mehrerer Stunden. Nach dem Ende der Trennung werden die Pufferlösungen abgesaugt.
Bei der Durchführung einer 2DE muß die Probe immer auf das Gel der ersten Dimension aufgetragen werden; die aufgetrennten Banden nach der ersten Dimension werden dann in der zweiten Dimension weiter aufgetrennt.
Vor Beginn der elektrophoretischen Trennung in der zweiten Dimension werden die drei Isolierelemente 9 durch Herausziehen nach außen entfernt. Der Hohlraum zwischen den Gelen der ersten und zweiten Dimension wird mit einem Kontaktgel (z.B. Agarose) gefüllt, das schnell auspolymerisiert . Dann werden die beiden Puffergefäße 21 der zweiten Dimension mit Laufpuffer (z.B. SDS-Laufpuffer : 192 mM Glycin, 25 mM Tris-Base, 5 μM Bromphenolblau in H20) gefüllt . Die Trennung erfolgt unter Temperierung auf z.B. 15 °C, z.B. bei konstanter Leistung oder mit einer Stromstärke von z.B. 40 mA pro Gel in den ersten 20 Minuten und dann mit 75 mA pro Gel. Die Trennung ist mit Erreichen des Markerfarbstof- fes Bromphenolblau am Ende des Geles beendet. Die Elek- trophorese-Kombikammer wird auseinandergeschraubt und das Gel zur Entwicklung und Färbung entfernt.
Das Elektrophoresegel wird nun nach Stand der Technik weiterbehandelt und z.B. in eine Wanne mit Fixierlösung gegeben. Durch Silberfärbung können die Proteine in ng- Mengen für analytische Zwecke sichtbar gemacht werden oder mittels z.B. Coomassie Brilliant Blue für mikro- präparative Zwecke (z.B. anschließender enzymatischer Spaltung und Sequenzierung) behandelt werden. Alternativ kann das Gel nach Blotten für Immunofärbungen mit entsprechenden Antikörpern entwickelt werden. Diese Schritte sind nicht Bestandteil der Erfindung, aber unerläßlich, um die Proteine nach erfolgter Trennung sichtbar zu machen.
Die Gele werden im vorliegenden Ausführungsbeispiel als Flachgele (nicht mehr als Rundgele) , aber schmaler als in den bisherigen Flachgel-Systemen ausgeführt. Die Breite des Geles kann durch Wahl verschieden breiter Dichtstreifen, Schläuche etc.) variabel gehalten werden, so daß sowohl analytische als auch mikropräpara- tive Gele gemacht werden können. In den üblichen käuflichen Flachgel-Elektrophorese-Kombikammern werden Fer- tiggele bestimmter Breiten und Dicken verwandt . Außerdem werden bei dem vorliegenden Verfahren Ampholine (lösliche Zwittermoleküle) anstelle von immobilisierten Zwitterionen (Immobilone) benutzt, um den pH-Gradienten im Gel aufzubauen. Prinzipiell ließen sich in der er- findungsgemäßen Vorrichtung aber auch Immobilone verwenden; jedoch sind die Trenneigenschaften dieser Gele bisher weniger gut als die mit Ampholinen erzeugten. Vorteile der beschriebenen Elektrophorese-Kombikammern sind: - Variable Breiten der Gele;
- längere Trennstrecken, ohne daß die Gele beschädigt werden können;
- Einsatz variabler Proteinmengen in der gleichen Appa- ratur;
- kein Transfer des Geles von der ersten auf die zweite Dimension nötig;
- keine Rehydratisierung wie bei Fertiggelen notwendig;
- bei Verwendung von Fertiggelen keine Anwendung erhöh- ter Temperatur wie dies bei Rehydratisierungsschrit- ten angewandt wird;
- sowohl Fertiggelstreifen als auch selbst-gegossene Gele können verwendet werden.
- präzise Fixierung des Geles relativ zur 2. Dimension; - Pufferreservoire mit im KammerSystem eingebunden;
- Kühlung beider Gele routinemäßig durchführbar;
- die Kühlung ermöglicht identische Temperaturprofile für beide Parallelgele durch meanderförmige Zwangs- führung des Kühlmediums; keine unterschiedlichen Strömungsverhältnisse;
- Kühlung aller Puffergefäße (für die 1. und 2. Dim);
- Einführung des sog. Stoppgels (dient zur mechanischen nicht aber elektrischen Abtrennung des Geles der ersten Dimension zu einem dazugehörigen Puffergefäß) ; - gleichzeitiges Gießen beider Dimensionen möglich; daher Zeitersparnis, da die Gele vor Gebrauch erst polymerisieren müssen; d.h. beide Gele können gleichzeitig auspolymerisieren (z.B. über Nacht) und sind dann frühmorgens gebrauchsfertig; - die Trennung erfolgt horizontal, nicht vertikal, ohne daß Kippvorgänge notwendig sind. Die Stellung der Kammer ändert sich nicht während des Gelgießens und bei der Elektrophorese . Die Apparatur steht nach der Montage aufrecht, d.h. platzsparend. Nach Durchführung der ersten Dimension ist neu, daß die Isolierschläuche 9 oder Isolierstreifen 9 ohne Öffnen der Kammer nach der ersten Dimension entfernt werden. Volle Automatisierung ist möglich bei Einsatz eines Schrittmotors zum Entfernen der Isolierelemente 9.
Neu ist ebenfalls die Einführung einer leitenden Kontaktflüssigkeit (z.B. auf Agarose-Basis) in den entstehenden Hohlraum zwischen dem Gel der 1. und der 2 Dim., damit der elektrische Übergang zur 2. Dimension gewähr- leistet ist ohne daß eine Umpufferung notwendig wird. Die Umpufferung kann aber durchaus stattfinden, indem der entstehende Zwischenraum nach Entfernen der Isolierschläuche 9 mit Pufferlösung gespült wird.
In der zweiten Dimension ist neu, daß das Füllen der Gellösung für die zweite Dimension von unten bei aufrechter Stellung der Elektrophorese-Kombikammer erolgt . Die Lösung wird automatisch langsam eingefüllt (wegen des Durchmessers der Füllkammer), so daß jegli- ehe Blasenbildung vermieden wird, womit man sonst bei den meisten Kammern zu kämpfen hat.
Neu ist ebenfalls die nach oben angeschrägte Entlüf- tungsöffnung 18 der 2. Dim., so daß alle Luft entweichen kann. Dies ist möglich, weil das Gel in der Gelkammer 7 zwar vertikal steht, aber die Proteine horizontal (von rechts nach links oder von links nach rechts, je nach Wahl der Elektrodenanschlüsse) getrennt werden.
Es können in dem System auch sog. Fertiggele, d.h. de- hydratisierte Gele in der Elektrophorese-Kombikammer verwendet werden.
Dabei ist auf einer Trägerfolie ein streifenförmiges Gel (1. Dimension) aufgebracht. Neben diesem Streifen ist ein flächiges Gel (2. Dimension) in einem gewissen Abstand aufgebracht . Die Gele auf der Trägerfolie werden auf Platte 4 über den Kühlementen 3 gelegt.
Anschließend wird die äußere Dichtung 19 sowie die Isolierelemente 9 (je eine links und rechts vom Gel der ersten Dimension) eingesetzt.
Die Glasplatte 5 wird aufgelegt und der Druckrahmen 13 befestigt .
Rehydratisierungslösungen für beide Gele werden in die Puffergefäße 8 und 21 eingefüllt. Die Gele werden rehydratisiert . Sie quellen in derselben Kammer, in der die anschließende Elektrophorese durchgeführt wird. Nach der Rehydratisierung wird überschüssiger Puffer entfernt und die Probe aufgetragen. Danach wird der Laufpuffer für die 1. Dimension in die Einfüllöffnungen 8 und 20 eingefüllt und die Elektrophorese in der ersten Dimension ausgeführt. Danach wird anstelle des Laufpuffers Reequilibrierungspuffer zur Reequilibrierung auf die Pufferbedingungen der zweiten Dimension in die Öffnungen 8 und 20 eingefüllt und nach erfolgter Umpufferung der Reequilibrierungspuffer entfernt und das als Dichtungsschlauch ausgebildete Isolierelement 9 herausgezogen. Der entstehende Raum wird durch Sammeigellösung befüllt, die schnell auspolymeri- siert .
Die Pufferlösung für die zweite Dimension wird eingefüllt und die die zweite Auftrennung wird gestartet .
Die Verwendung speziell entwickelter getrockneter Gele hat den Vorteil, das diese Gele in Folie eingeschweißt, leicht verpackt und verschickt werden können. Es wurden IEF-Fertiggele, in denen Ampholine als Zwitterionen Verwendung finden entwickelt, die weltweit noch nicht beschrieben wurden und daher auch nicht kommerziell verfügbar sind. Aber es können in der Elektrophorese- Kombikammer auch immobilisierte Immobilon-Fertiggele verwendet werden, die z.B. von der Fa. Pharmacia vertrieben werden. Im Gegensatz zu den Kammern, die Pharmacia vertreibt, können gemäß der vorliegenden Lösung diese Fertiggele auch in der erfindungsgemäßen Elektrophorese-Kombikammer rehydratisiert werden, während bei Pharmacia die Rehydratisierung in extra Schälchen gemacht wird, so daß die rehydratisierten Gele in die IEF-Kammer transferiert werden müssen. Als Innovation verwendet die vorliegende Erfindung außerdem auch Kombinationen aus beiden IEF-Geltypen; z.B. Ampholin-Fertiggele, deren Enden mit Immobilinen hergestellt wurden, so daß sich der Auftrennungsbereich auf der sauren und basischen Trennseite der IEF-Gele noch beträchtlich ausdehnen läßt.
Um die Trenntechnik in den erfindungsgemäßen Trennkammern zu dokumentieren, werden nachfolgend die wichtigsten Rezepte zur Auftrennung von Gelen unter speziellen Standardbedingungen wiedergegeben. Natürlich müssen je nach Proteingemisch neben den Standardbedingungen auch spezielle Bedingungen adaptiert werden.
Eine alternative Konstruktionsvariante ist die Verwendung von dünnwandigen, hochelastischen Schläuchen als Isolierelemente 9. Die Abtrennung des freibleibenden Raumes zur Aufnahme des Geles der ersten
Dimension wird entweder durch einen Schlauch, der U- förmig (eventuell in einer vorgesehenen Rille in einer der Platten) eingelegt ist, realisiert oder durch zwei
Schläuche, die jeweils an einem Ende verschlossen sind.
Die Abdichtung erfolgt dadurch, daß der Schlauch mit einem Fluid (Flüssigkeit oder Gas) gefüllt wird. Durch ausreichenden Innendruck erfolgt die Abdichtung gegen die inneren und äußeren Platten 4 und 5. Nach dem
Gießen des Stopgeles kann das Gel der ersten Dimension gegossen werden. Die Begrenzung des Geles der zweiten Dimension erfolgt analog mit einem U-förmigen Schlauch oder einem am Ende verschlossenen Schlauch. Nach der Trennung der ersten Dimension wird der Schlauch evakuiert aber nicht aus dem System entfernt. In den entstehenden Raum zwischen erster und zweiter Dimension wird Agaroselösung zur Herstellung einer elektrisch leitenden Verbindung zwischen den Gelen eingefüllt. Die anderen Abläufe erfolgen wie oben beschrieben. Eine vorteilshafte Ausbildung besteht darin, daß dieser Schlauch mit einem Adhäsiv nur auf einer der Platten 4 oder 5 fixiert ist oder auf einer der Platten 4 oder 5 festsitzend in einer Nut geführt ist, so daß sichergestellt wird, daß sich der Schlauch nach der Evakuierung nur auf einer Platte 4 oder 5 befindet.
Eine Variante dieser Konstruktion bzw. der Methode ist es, den Schlauch nach abgelaufener Trennung der ersten Dimension zu entfernen. Durch das Evakuieren wird die Entfernung wesentlich vereinfacht.
Die Kombinationskammer gemäß der zweiten Ausführungsform besteht aus zwei Teilen, die übereinander angeordnet sind, dem oberen IEF-Teil für die Durchführung der IEF-Elektrophorese in der ersten Dimension und dem unteren Teil für die Durchführung der SDS-Elektrophorese in der zweiten Dimension.
Die Kombinationskammer besteht aus mehreren Bestandteilen, die beispielsweise durch Verschraubung oder Klemmen zusammengesetzt werden. Die Rückwandplatte 28A bildet mit dem oberen Pufferreservoir 29 der zweiten Dimension sowie den Gießgefäßen 30 zum Gießen der zweiten Dimension, dem Puffergefäß 31 zum Einfüllen des Puffers der zweiten Dimension eine Einheit . Die als Glasplatte ausgebildete Deckplatte 28B wird mit der Rückwandplatte 28A und dem oberen Pufferreservoir 29 z.B. durch Verschraubung verbunden. Flache Dichtungen 23 rechts und links dichten nach außen ab und legen die Dicke der Gele zwischen den Platten 28A und 28B fest. Die Platte 28B hat eine Höhe, die sich aus der Höhe der Platte 28A und der Höhe des oberen Pufferreservoirs 29 ergibt. Die Platten 28A, 28B können transparent sein. Insbesondere die obere Deckplatte 28B sollte durchsichtig sein, um die einzelnen Verfahrensschritte beobachten zu können. Zwischen den Umlenkelementen 22 befindet sich U-förmig ein im vorliegenden Ausführungsbeispiel als Schlauchdichtung ausgebildetes Isolierelement 24, daß das Gel 25 der ersten Dimension vom Gel 36 der zweiten Dimension trennt. Neben den Umlenkelementen 22 befinden sich die Elektroden 26 und 27 für die Elektrophorese der ersten Dimension.
Die zusammengesetzte Konstruktion aus den Platten 28A, 28B und den oberen Reservoirs wird in den unteren Puffertank 32 der zweiten Dimension gestellt. Dort befindet sich eine Dichtung 33, die z.B. pneumatisch angehoben werden kann (Zustand 33a) , um den Leerraum zwischen den Platten 28A und 28B nach unten abzudichten, damit das Gel 36 der zweiten Dimension über eine Verbindung (z.B. einen Schlauch) aus dem Gießgefäß 30 gegossen werden kann. Das Pufferfüllgefäß 31 dient dem Füllen des unteren Puffertanks 32. In dem Puffergefäß 29 und dem Puffertank 32 befinden sich die Elektroden 38 und 39 der zweiten Dimension.
Nachfolgend soll das Zusammensetzen der Kombinationskammer beschrieben werden.
Zur Vorbereitung der 2DE werden auf eine Glasplatte 28B, aus der zwei Umlenkelemente 22, z.B. Bolzen, herausragen, rechts und links jeweils Flachdichtungen 23 als Spacer aus Kunststoff gelegt (vgl. Fig. 6) . Die Bereiche der ersten und zweiten Dimension sind lediglich durch ein Isolierelement 24, hier einen dehnbaren Kunststoffschlauch voneinander getrennt, der U-förmig zwischen den zwei Umlenkelementen 22 so angeordnet ist, daß sich eine gerade Abgrenzung nach unten ergibt . Er ragt an beiden Enden der oberen Kammer heraus und läßt sich leicht herausziehen. Zwischen den Umlenkelementen 22 wird im vorliegenden Ausführungsbeispiel ein IEF-Fertiggelstreifen 25 positioniert (weiße waagerechte Fläche) und in direkten Kontakt mit den beiden Elektroden 26, 27 gebracht, die bei den Umlenkelementen 22 durch die Glasplatte 28B ragen und die Elektrophorese in der ersten Dimension ermöglichen. Dann wird die obere Glasplatte 28B aufgelegt (Fig. 7) und im vorliegenden Ausführungsbeispiel mittels Klammern mit der unteren Rückwandplatte 28A und dem oberen Pufferreservoirs 29 zusammengehalten. Das Glasplattensandwich wird darauf in den Puffertank 32 gestellt (Fig. 8) . Das Gießgefäß 30 dient zum Gießen des SDS-PAGE-Geles und das Reservoir 29 und der Puffertank 32 als Pufferreservoir für die SDS-PAGE, wobei der Puffertank 32 über eine Verbindungsleitung aus Pufferfüllgefäß 31 gefüllt wird.
Im Puffertank 32 befindet sich eine Dichtung 33, die beim Abdichten den Schlitz zwischen den beiden Glasscheiben 28A, 28B an der Unterseite verschließen kann. In Fig. 8 ist sie im nicht-abdichtenden Zustand dargestellt .
Die Vorbereitung und Durchführung der Elektrophorese verläuft im vorliegenden Ausführungsbeispiel wie folgt:
Das IEF-Gel 25 wird zur Rehydratisierung mit
Rehydratisierungspuffer zwischen den Glasplatten 28A, 28B im Raum 34 überschichtet und rehydratisiert . Nach der Rehydratisierung (>2h) wird der überschüssige Puffer entfernt. Dann wird die Probe in eine Aussparung 35 eingebracht, deren Platz durch Einbringung eines Spacer-Einsatzes während der Rehydratisierung ausgespart blieb. Dann wird die Elektrophorese durch Anlegen einer Spannung zwischen den Elektroden 26, 27 durchgeführt. Nach der Durchführung der IEF- Elektrophorese wird das IEF-Gel 25 durch Zusatz von Reequilibrierungspuffer, der in Raum 34 eingebracht wird, umgepuffert (z.B. 30 min, bei pH 6,9) .
Das SDS-Gel 36 für die zweite Dimension wird vor, nach oder während der Durchführung der ersten Dimension gegossen, indem die Gellösung über das Gießgefäß 30 eingefüllt wird und durch eine Leitung nach unten zwischen die Glasplatten 28A, 28B geleitet wird (Fig. 9) . In diesem Zustand dichtet die Dichtung 33A das Glasplatten-Sandwich nach unten ab, so daß die Gellösung nicht auslaufen kann. Das Gel 36 wird zwischen den Glasplatten 28A, 28B für mindestens zwei Stunden polymerisiert . Danach wird die Abdichtung durch die Dichtung 33A wieder aufgehoben, so daß das SDS-Gel mit dem Elektrophoresepuffer im Puffertank 32 in Verbindung tritt . Nach Beendigung der IEF-Elektrophorese und erfolgter Umpufferung des Gelstreifens 25 wird der Reequilibrierungspuffer aus dem Raum 34 entfernt, der Kunststoffschlauch 24 aus der Apparatur seitlich nach oben z.B. mit einem Schrittmotor herausgezogen und der entstehende Zwischenraum 37 zwischen erster und zweiter Dimension mit Kontaktgel (z.B. Agarose-Sammelgel) befüllt (Fig. 5) . Dann wird Puffer in das Pufferreservoir 29 und den Puffertank 32 eingefüllt und über ein elektrisches Feld zwischen den Elektroden 38, 39 der zweiten Dimension in den mit Puffer gefüllten Puffergefäßen 29, 32 die SDS-Elektrophorese in der zweiten Dimension durchgeführt. Nach Ende der Elektrophorese wird das Platten-Sandwich herausgenommen, das Gel abgehoben und nach bekannten Methoden entwickelt, z.B. mit Silbernitratlösung oder Coomassielösung angefärbt . Die Kühlung beider Elektrophorese-Dimensionen erfolgt - durch Eintauchen der Gelsandwiche in thermostatisierte Pufferlösung der zweiten Dimension, die sich in dem Puffertank 32 befindet, oder es werden die Kammersandwiche durch an die Glasplatten 28A, 28B angelegte Kühlkammern gekühlt.
Gegenstand der Erfindung sind auch neue IEF-Gele (isoelektrische Fokussierungsgele) gemäß der Ansprüche 24 bis 29, die einen hervorragenden Trenneffekt für Biomoleküle bieten, insbesondere für Proteine, und einen erweiterten Auftrennungsbereich auf der sauren und basischen Trennseite. Nachfolgend werden ausgewählte Rezepte von Gelen dokumentiert.
Standard-Rezepte
Ampholin-Fertigcrele (hvdratisiertes Gel)
3.5 - 4% Acrylamidgel mit 9 M Harnstoff mit minimal 2% Ampholinen (WITA Ampholyte) , pH-Bereich pH 2.0 bis 11.0
(mit oder ohne Zusatz von Detergenzien und Thioharnstoff)
Ampholin-Immobilon-Fertiggele (hydratisiertes Gel)
3.5 - 4% Acrylamidgel mit 9 M Urea mit minimal 2% Ampholinen (WITA Ampholyte), pH-Bereich pH 2.0 bis 11.0
(mit oder ohne Zusatz von Detergenzien und Thioharnstoff ) seitliche Immobilingele : 10% Acrylamidgel unter Zusatz von 50 mM bis 100 mM Immobilinen
SDS-Gel, 2. Dimension:
SDS-PAGE mit 15% Acrylamid, 0,1% SDS, Tris/HCl-Puffer, pH 8,8
Rehydratisierungspuffer
9M Harnstoff, 2-4% Ampholine, pH Bereich 2-11 (mit oder ohne Zusatz von Detergenzien und Thioharnstoff)
Reequilibrierungspuffer
3% SDS, 70 mM DTT, Tris/Phosphat , pH 6,8
Acrarose Sammelgel
0,1% SDS, 1% Agarose, Tris/Phosphat , pH 6,8
Elektrophorese-Puffer 1. Dimension
Puffer A: 4% (v/v) Phosphorsäure Puffer B: 5% (v/v) Ethylendiamin
Elektrophoresepuffer 2. Dimension
SDS-Laufpuffer: 192mM Glycin, 25 mM Tris-Base, 0,1% SDS Laufbedingungen:
Dimension: lh 100V 1 h 200 V
17, 5 h 400 V 1 h 600 V 0.5 h 800 V 10 min 1500 V 5 min 2000 V
2. Dimension:
30 min 40 mM 6 h 80 mM
Die Erfindung ist nicht beschränkt auf die hier dargestellten Ausführungsbeispiele. Vielmehr ist es möglich, durch Kombination und Modifikation der genannten Mittel und Merkmale weitere Ausführungsvarianten zu realisieren, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.
Bezugszeichenliste
Elektrophorese-Kombi15 Spannelemente kammer
16 Sichtfenster Kern
17a Füllkammern für die 1 Kühlelemente Dimension
innere Platte 17b Füllkammer mit Einlaß für die 2. Dimension äußere Platte
18 Entlüftungsöffnungen Gelkämmer
19 Flächendichtung Gelkammer
20. Einfüllöffnung für Puffergefäße und Probe und 1. Dim. Gel Füllkammer für die 1. Dimension samt 21. Puffergefäße samt Einlasse Einlassen für 2. Dimension
Isolierelemente 22 Umlenkelement
Kühllabyrinth 23 Dichtung
Zulauf Kühlflüssigkeit 24 Isolierelemente
Ablauf Kühlflüssigkeit 25 Gel der ersten Dimension
Druckrahmen 26 Elektrode der ersten Dimension Deckel Elektrode der 35 Aussparung im Gel der ersten ersten Dimension Dimension für Probenauftrag
A Rückwandplatte 36 Gel der zweiten Dimension
B Deckplatte 37 Zwischenraum zwischen
Platten (28A, 28B) , der mit oberes Pufferreservoir Kontaktgel gefüllt wird der zweiten Dimension
Gießgefäß der zweiten 38 Elektrode im oberen PufferDimension gefäß für Elektrophorese der zweiten Dimension Pufferfüllgefäß der zweiten Dimension 39 Elektrode im unteren Puffer gefäß für Elektrophorese unterer Puffertank der der zweiten Dimension zweiten Dimension
Dichtung (kann z.B. pneumatisch angehoben werden
A Dichtung (ist z.B. pneumatisch angehoben
Raum zwischen Platten (28A, 28B)über der Schiauchdichtung (24) , der zur Rehydratisierung und Umpufferung des Gels der ersten Dimension mit Puffer gefüllt wird

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur zwei-dimensionalen Trennung von Biomolekülen oder anderen Stoffgemischen in Gelen, Polymerträgern durch Elektrophorese in einer Elektrophoreseapparatur, wobei
-die Gele für die Trennung in der ersten Dimension und die Gele für die Trennung in der zweiten
Dimension nacheinander oder gleichzeitig vertikal zueinander angeordnet als Gießgele oder Fertiggele in eine Elektrophorese-Kombikammer eingebracht und voneinander isoliert polymerisiert bzw. rehydratisiert werden,
-nachfolgend Pufferlösungen eingefüllt, ein
Biomolekülgemisch auf die Gele der ersten Dimension aufgetragen und die elektrophoretische Auftrennung der ersten Dimension bei konstanter Temperatur oder bei fixiertem Temperturgradienten durchgeführt,
-anschließend die Pufferlösung abgesaugt, die Isolierung aufgehoben, in die entstehenden Räume zwischen erster und zweiter Dimension Kontaktgel eingefüllt und auspolymerisiert , Pufferlösungen eingefüllt und die elektrophoretische Trennung der zweiten Dimension bei präzise eingestellter Temperatur und konstanter elektrischer Leistung oder steigender Stromstärke durchgeführt wird und
-abschließend die Gele entwickelt und die Proteine mit herkömmlichen Methoden sichtbar gemacht werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Trennung die Gele in der Elektrophorese- Kombikammer vertikal stehen und die Trennung der Proteine in der ersten Dimension vertikal und in der zweiten Dimension horizontal erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gele der ersten Dimension als Flachgele in einem U-förmigen Rohr gegossen werden, wobei zuerst ein Stoppgel und nachfolgend das Separationsgel gegossen wird und sowohl Gießvorgänge als auch Polymerisationsvorgänge bei konstanter Temperatur mit aktivierter Kühlung erfolgen.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gele der zweiten Dimension in zwei Schritten gegossen werden derart, daß in einem ersten Schritt ein Dichtgel und nach dessen Polymerisation in einem zweiten Schritt die Gellösung von unten aufsteigend gegossen wird derart, daß die Luft nach oben verdrängt und das Gel anschließend bei konstanter Temperatur mit aktivierter Kühlung polymerisiert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Gele in variabler Breite und Dicke erzeugt werden.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufhebung der Isolierungen durch körperliches Entfernen von Dichtungen oder Schalten mittels Volumen- oder Durchmesserverringerungen von Dich- tungsschläuchen realisiert wird.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Ablauf der zweidimensionalen Elektrophorese automatisiert durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 3 , dadurch gekennzeichnet, daß die Gele und die Pufferlösungen von der gleichen
Kühlung temperiert werden.
9. Vorrichtung zur zwei-dimensionalen Trennung von Biomolekülen oder anderen Substanzgemischen in Gelen durch Elektrophorese in einer Elektroden aufweisenden Elektrophoreseapparatur , dadurch gekennzeichnet, daß eine Elektrophorese-Kombikammer (1) einen Kern (2) mit Kühlelementen (3) aufweist, wobei die Kühlelemente (3) zwischen den beidseitig des Kerns
(2) durch innere Platten (4) und äußere Platten (5) im Zusammenwirken mit entfernbaren oder schaltbaren Isolierelementen (9) gebildeten Gelkammern (6,7) und Puffergefäßen (8) angeordnet sind.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Kühlelemente (3) durch ein mäanderförmiges Kühllabyrinth (10) mit Zulauf (11) und Ablauf (12) gebildet sind und das Kühllabyrinth (10) die Puffergefäße (8) und (21) umschließt, wobei die inneren Platten (4) aus einem gut temperaturleitenden Material und die äußeren Platten (5) aus einem transparenten Material bestehen.
11. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die inneren Platten (4) aus Keramik oder Kunststoff und die äußeren Platten (5) aus Glas oder transparentem Kunststoff bestehen und die äußeren
Platten (5) durch einen Druckrahmen (13) gehalten werden und ein Deckel (14) die Elektrophorese- Kombikammer (1) nach oben abschließt.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Druckrahmen (13) über Spannelemente (15) beidseitig befestigt wird und Sichtfenster (16) zur
Prozeßkontrolle aufweist.
13. Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß die untere Begrenzung der Elektrophorese- Kombikammer (1) durch einen justier- und drehbaren Tisch realisiert ist, auf welchem die Elektrophorese-Kombikammer (1) fixiert ist und der Deckel (14) Ein- und Ausleitungen für das Kühlmedium sowie zu den Puffergefäßen (8, 21) und Gelkammern (6,7) und die Anschlüsse für die Elektroden der erste und zweite Dimension aufweist .
14. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Kern (2) aus Polymermaterial wie Acrylglas, Keramik oder Plexiglas besteht und die Gelkammern (6,7) mit Füllrohren (17) verbunden sind und
Entlüftungsöffnungen (18) angeordnet sind und zwischen inneren Platten (4) und äußeren Platten (5) Dichtungen (19) angeordnet sind und die Isolierelemente (9) mit Vertiefungen zusammenwirken und die die Medien Gele und/oder Gellösungen und/oder Pufferlösungen berührenden Teile der Elektrophorese-Kombikammer (1) oberflächenbeschichtet sind, wobei die Oberflächenbeschichtung aus amorphen Kohlenstoffschichten bestehen kann.
15. Vorrichtung zur zwei-dimensionalen Trennung von Biomolekülen oder anderen Substanzgemischen in Gelen, Polymeren oder trägerfreien Medien durch Elektrophorese in einer Elektrophoreseapparatur, dadurch gekennzeichnet, daß alle für die Durchführung einer zwei- dimensionalen Trennung notwendigen Baugruppen in einer Elektrophorese-Kombikammer (1) , bestehend aus einem Kern (2) mit Kühlelementen (3) , wobei die Kühlelemente (3) zwischen den beidseitig des Kerns durch innere Platten (4) und äußere Platten (5) im Zusammenwirken mit entfernbaren oder schaltbaren Isolierelementen (9) gebildeten Trennkammern (6, 7) , Puffergefäße (8, 21) und Aufnahmen für Elektroden angeordnet sind, vollständig integriert sind und die Durchführung der zwei-dimensionalen Auftrennung vollständig automatisiert werden kann, ohne daß im Ablauf der zwei-dimensionalen Trennung eine Manipulation an den Gelen selber erfolgt.
16. Kombinationskammer zur zweidimensionalen Trennung von Biomolekülen oder anderen Stoffgemischen in waagerecht übereinander angeordneten Gelen durch Elektrophorese mit einer Rückwandplatte (28A) und einer Deckplatte (28B) , wobei zwischen Rückwandplatte (28A) und Deckplatte (28B) mindestens zwei Umlenkelemente (22) zur Führung von
Isolierelementen (24) angeordnet sind.
17. Kombinationskammer nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Kammeranordnung aus einem oberen IEF-Teil für die Durchführung der IEF-Elektrophorese in der ersten Dimension und einem unteren Teil für die Durchführung der SDS-Elektrophorese in der zweiten Dimension besteht und die Gele (25) und (36) waagerecht übereinander angeordnet sind und die
Platten (28A, 28B) nach außen durch Dichtungen (23) abgedichtet werden und die Gestaltung der Dichtungen (23) die Dicke der Gele (25, 36) festlegt und neben den Umlenkelementen (22) Elektroden (26, 27) für die Elektrophorese der ersten Dimension eingelassen sind, wobei die Platte (28A) aus Keramik oder Glas besteht und die Platte (28B) eine transparente Platte ist.
18. Kombinationskammer nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Rückwandplatte (28A) mit dem oberen Pufferreservoir (29) der zweiten Dimension sowie dem Gießgefäß (30) und dem Pufferfüllgefäß (31) eine Einheit bildet und die zusammengesetzte Konstruktion aus den Platten (28A, 28B) und dem oberen Pufferreservoir (29) , dem Gießgefäß (30) und dem Pufferfüllgefäß (31) in den unteren Puffertank (32) gestellt angeordnet ist und eine Dichtung (33) angeordnet ist, welche anhebbar ausgebildet ist und in dem oberen Pufferreservoir (29) und in dem unteren Puffertank (32) Elektroden (38, 39) für die Elektrophorese der zweiten Dimension angeordnet sind.
19. Verfahren zur zwei-dimensionalen Trennung von Biomolekülen oder anderen Stoffgemischen in Gelen oder Polymerträgern durch Elektrophorese in einer Elektrophorese-Kombinationskammer, wobei
- ein IEF-Gel in der Kombinationskammer waagerecht angeordnet und zur Rehydratisierung mit Rehydratisierungspuffer überschichtet wird,
- nachfolgend eine Biomolekül- oder Stoffgemischprobe am IEF-Gel eingebracht oder am
IEF-Gel angebracht und die Elektrophorese der ersten Dimension durchgeführt wird,
- vor, nach oder während der Durchführung der ersten Dimension ein SDS-Gel für die Durchführung der zweiten Dimension waagerecht zu dem IEF-Gel und von diesem isoliert in die Kombinationskammer eingebracht und das SDS-Gel polymerisiert wird, - nach Beendigung der IEF-Elektrophorese die Isolierung aufgehoben, in die hierdurch entstehenden Räumen Kontaktgel eingeführt, Pufferlösung zugeführt und die SDS-Elektrophorese in der zweiten Dimension durchgeführt wird und anschließend die Gele nach bekannten Methoden entwickelt und angefärbt werden.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß nach der Rehydratisierung des IEF-Gels überschüssige Pufferlösung entfernt wird und die Aussparung im IEF-Gel durch Einbringen eines Spacer-Einsatzes während der Rehydratisierung erzeugt wird und das IEF-Gel nach der
Elektrophorese durch Zusatz von Reequilibrierungspuffer umgepuffert wird und die Isolierung durch Entfernen eines KunststoffSchlauches durch Herausziehen mittels eines Schrittmotors aufgehoben wird.
21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Kühlung beider Elektrophorese-Dimensionen durch Eintauchen der Gelsandwiche in thermostatierte
Pufferlösung der zweiten Dimension erfolgt oder die Kühlung beider Elektrophorese-Dimensionen durch in der Kombinationskammer angeordnete Kühlkammern realisiert wird.
22. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Biomolekül- oder Stoffgemischprobe in eine Aussparung im IEF-Gel eingebracht wird.
23. Verfahren zur ein-dimensionalen Trennung von Biomolekülen oder anderen Stoffgemischen durch Elekrophorese , dadurch gekennzeichnet, daß - anstelle des Gels für die Trennung in der ersten
Dimension sowie des Isolierelementes ein Kamm mit Probentaschen für verschiedene Proben in das SDS-Gel eingesetzt und dieses auspolymerisiert wird, - der Kamm nach dem Auspolymerisieren entfernt , die Proben in die entstandenen Aussparungen eingebracht und nachfolgend die ein-dimensionale Elektrophorese durchgeführt wird.
24. Hydratisiertes IEF-Gel hergestellt durch Gießen eines Immobilin-Gels mit niedrigem pK auf einer Gelpolymerisationsfolie und dessen Polymerisation, Gießen eines Acrylamidgels auf dem Immobilin-Gel und dessen Anpolymerisation, Gießen eines
Immobilin-Gels mit hohem pK auf dem Acrylamidgel und dessen Anpolymerisation und nachfolgendes Rehydratisieren mittels eines Rehydratisierungspuffers, der 1-4% von solchen Ampholinen enthält, die einen pH-Bereich innerhalb von 2-11, ermöglichen.
25. IEF-Gel nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Immobilin-Gele aus 6-10%, vorzugsweise 10%, Acrylamid unter Zusatz von 50-200 mM, vorzugsweise 50-100 mM, Immobilin hergestellt sind.
26. IEF-Gel nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das Acrylamidgel aus 3,5-4,5%, vorzugsweise 3,5-4%, Acrylamid hergestellt ist.
27. IEF-Gel nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Rehydratisierungspuffer von 5-9,5 M, vorzugsweise 9 M, Harnstoff und gegebenenfalls
Detergenzien, vorzugsweise Tween 20, Chaps oder Triton X-100 enthält.
28. IEF-Gel nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Rehydratisierung gegebenenfalls Waschschritte durchgeführt werden und getrocknet wird.
29. Trockengel hergestellt durch Gießen eines Immobilin-Gels mit niedrigem pK auf einer Gelpolymerisationsfolie und dessen Polymerisation, Gießen eines Acrylamidgels auf dem Immobilin-Gel und dessen Anpolymerisation, Gießen eines Immobilin-Gels mit hohem pK auf dem Acrylamidgel und dessen Anpolymerisation.
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