DE3600214C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum elektrophore­ tischen Überführen von elektrophoretisch getrenntem Material mit einem flüssigkeitsdichten Behälter, der eine Grundplatte, einen Deckel und Seitenwände aufweist, die sich zwischen der Grundplatte und dem Deckel erstrecken, um eine Kammer zu um­ schließen, mit einer Trägereinrichtung, welche in der Kammer zum Aufnehmen des Materials angeordnet ist, welches elek­ trisch überführt wird, mit einer unter der Trägereinrichtung vorgesehenen ersten Elektrode (26) und einer über der Trägereinrichtung vorgesehenen zweiten Elektrode.

Elektrophorese ist allgemein gesehen das Phänomen der Wande­ rung von geladenen Teilchen der Ionen in einem flüssigen Trägermedium unter dem Einfluß eines elektrischen Feldes. Dieses Phänomen kann benutzt werden, um kleine Teilchen abzu­ sondern, welche, aufgrund unterschiedlicher chemischer Ober­ flächeneigenschaften, unterschiediche Konzentrationen einer Oberflächenladung in dem gegebenen Medium aufzeigen. Unter dem Einfluß des elektrischen Feldes werden die elektrophore­ tischen Beweglichkeiten der verschiedenen Arten von gelade­ nen Teilchen in dem Trägermedium unterschiedlich sein. Eine Probe, welche an irgendeinem Punkt in eine dünne Schicht von flüssigem Trägermedium (Puffer) eingegeben wird, breitet sich langsam in einem engen Band aus in Abwesenheit eines Spannungsgradienten. Wenn jedoch ein Spannungsgradient an die Pufferschicht angelegt wird, werden die Probenteilchen unter dem Einfluß des elektrischen Feldes in verschiedenartigen Teilchengruppen oder Komponenten abgesondert, was von der elektrophoretischen Beweglichkeit der jeweiligen Partikel, der Stärke des Feldes und der Länge der Zeit abhängt, in der die Teilchen in dem Feld verbleiben. Teilchen von ähnlicher Beweglichkeit werden in charakteristischen Zonen oder Bändern in einer bestimmten Entfernung vom Punkt der (ursprünglichen) Probeneingabe konzentriert.

Überführen oder Umsetzen von elektrophoretisch getrenntem Material, wie beispielsweise Desoxyribonuklein-, Ribonuklein­ säure (DNS, RNS) und anderen Proteinen, ist ein Standardverfah­ ren geworden, wenn eine sensitive und spezifische Erfassung von biologisch interessierenden Makromolekülen gefordert wird.

Das elektrophoretische Überführen bietet signifikante Vortei­ le gegenüber dem kapillaren Überführen, indem das elektro­ phoretische Verfahren viel schneller ist. Das kapillare Um­ setzen und das elektrophoretische Überführen erfordern beide, daß das Gel in Kontakt mit dem Papier oder einer anderen Membran gebracht wird, zu welchem die Proteine oder Nuklein­ säuren übergeleitet werden. Der Unterschied zwischen den Methoden liegt in der Überleitungstriebkraft. Bei der kapil­ laren Überleitung ist das absorptive Potential des Filter­ papiers oder eines anderen Materials die Triebkraft. Das Überleitungsmaterial, beispielsweise Nitrozellulose oder Nylon, wird zwischen dem Gel und dem absorptiven Papier ein­ gelegt. Beim elektrophoretischen Überführen, wie es gegen­ wärtig praktiziert wird, werden das Gel und das Übertragungs­ material vertikal in einen Puffertank zwischen zwei Elektroden gehängt. Die Proteine oder Nukleinsäuren werden so aus dem Gel auf das Überleitungsmaterial herausgetrieben, wo­ bei ein elektrisches Potential benutzt wird. Ein typisches System umfaßt beispielsweise das Plazieren einer Nylonmembra­ ne gegen eine Gelatinetafel, ein Eintauchen der Gel-Nylonein­ richtung vertikal in eine Pufferlösung, dann das Anlegen eines elektrischen Potentials quer durch die Einrichtung hindurchlaufend, wobei die Pufferlösung als leitendes Medium benutzt wird. Dieses System benutzt typischerweise zwei Elek­ troden aus Platindrähten, einer an jeder Seite der Gel-Nylon- Kombination, und errichtet einen Spannungsgradienten in der Pufferlösung. Die Elektroden sind in Gitterform ausgelegt und räumlich getrennt in einem Abstand von dem Gel und Nylon angeordnet, um ein ziemlich einheitliches elektrisches Feld zu erhalten, wobei die geringste Menge von Platin verwendet wird.

Das Überführverfahren bietet signifikante Vorteile. Erstens sind Moleküle in der Matrix eines Gels relativ unzugänglich für Untersuchungen wie beispielsweise auf Antikörper. Die Übertragung auf die Oberfläche einer Membran gestattet Analysen, welche in dem Gel schwierig oder unmöglich sind. Wenn also die übertragenen Moleküle an oder nahe der Oberfläche der Membran lokalisiert sind, wird die Analysezeit wesentlich reduziert. Weiterhin sind die Membranen relativ haltbar und leicht zu handhaben im Gegensatz zu den Gels, welche leicht zu Bruch gehen. Weiter­ hin sind die übertragenen Moleküle an die Membran gebunden, so daß kein Auflösungsverlust stattfindet, solange eine bio­ logische Aktivität gewöhnlich aufgehalten wird. Somit ist die Lagerung einer Membran vor einer Benutzung in der Regel durchführbar.

Wie oben erwähnt, wird beim elektrophoretischen Überführen, wie gegenwärtig praktiziert, das Gel und das Übertragungs­ material vertikal in einen Puffertank zwischen zwei Elektroden eingehängt. Eine Anzahl von Nachteilen ist mit dem senkrechten elektrophoretischen Überführen verbunden. Bei­ spielsweise begrenzt ein Satz standgefäßartiger Behälter die Größe der möglichen Gelflecken, obwohl Überführungstanks zum Überführen großer Elektrophoresegels übermäßige Mengen von Puffer erfordern, und sind sehr teuer herzustellen. Weiterhin müssen Halter für vertikale Überführungssysteme sehr fest sein, um eine enge Nähe des Gels und der Überfüh­ rungsmembran beizubehalten. Dies erfordert ein geräumiges Trägersystem, welches dazu neigt, die elektrische Ladung zu blockieren, was zu unscharfen Flecken führt. Die Größe des Trägersystems begrenzt auch die Größe der möglichen Gelflecken. Schließlich können weiche Agarose-Gele, wie sie beispielsweise für eine Genom-Identifikation gefordert werden, nicht in einem vertikalen Überführungssystem infol­ ge des Gleitens, Rutschens und Zusammenfallens des Gels in dem Trägerhalter aufgesaugt werden.

Versuche an horizontal angeordneten Gelen, wie dies beispielsweise in "Elektrophoresis ′84", 1984, S. 387 ff, beschrieben ist und welche einige der oben im Hinblick auf ein vertikales System genannten Probleme vermeiden würden, sind weitgehend nicht erfolgreich gewesen. Während dem elektrophoretischen Überführen in horizontalen Aufsaugsyste­ men sind an der Kathode bzw. Anode während der Elektrolyse Sauerstoff- und Wassrstoffblasen erzeugt worden. Die Blasen, welche von der Elektrode unterhalb der horizontal angeordneten Gelmembran abgegeben werden, sammeln sich an der unteren Oberfläche der Membran an, wobei sie teilweise die elektrischen Ladungen blockieren, was zu einem ungleichmäßi­ gen Aufsaugen führt.

Natürlich würde es höchst wünschenswert sein, ein horizonta­ les Überführungssystem zu schaffen, welches für die Benutz­ ung im Zusammenhang mit weichen Agarosegelen geeignet ist, in welchem Blasen, welche an den Elektroden während der Elektrolyse erzeugt werden, in einer Weise zer­ streut werden, daß die Ansammlung von Blasen an der Unterfläche einer sich horizontal erstreckenden Gelmembran vermieden wird.

Demgemäß ist die wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Schaffung einer Vorrichtung zur Überführung von elektrophoretisch getrenntem Material auf eine horizontal angeordnete Membran, bei welcher die Ansammlung von Blasen an der Unterfläche der Membran verhindert wird. Diese Vorrichtung soll einfach konstruiert, ökonomisch herzustellen und leicht zu handhaben sein. Ferner soll sie besonders für die Anwendung mit weichen Gelen, wie beispielsweise Agarosegelen geeignet sein.

Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine vorgenannte Vorrichtung zu schaffen, welche besonders für die Anwendung mit weichen Gelen, wie beispielsweise Agarosegelen geeignet ist.

Zur Lösung dieser Aufgabe führt eine Vorrichtung der o. g. Art, bei welcher in der Kammer zwischen der ersten Elektrode und der Trägereinrichtung eine membranartige Einrichtungen zum Ableiten von Blasen, welche von der ersten Elektrode erzeugt werden, angeordnet ist.

Die Elektroden sind typischerweise aus Platin; jedoch können auch Elektroden aus Kohlenstoff oder anderem leitenden Material Anwendung finden. Zwischen der ersten Elektrode und der Trägereinrichtung ist diese Blasenableitbarriere vorge­ sehen und zwar zum Ableiten von Blasen, welche von der ersten Elektrode erzeugt werden, so daß die Blasen von einer Ansamm­ lung an der Unterfläche der Trägereinrichtung abgehalten werden, welche zu einem ungleichmäßigen Aufsaugen führen würde. Die Trägereinrichtung umfaßt erste und zweite Trag­ flächen, welche zusammengeklammert sind, um das Gel und die aufsaugende Rezeptormembran zusammenzuhalten. Als ein Folge der horizontalen Anordnung der Trägerflächen ist nur eine geringe Kompression erforderlich, um das Gel und die Membrane in Berührung zu halten, was die Verwendung von sehr schwachen weichen Gelen erlaubt.

Die Vorrichtung nach der vorliegenden Erfindung bietet signi­ fikante Vorteile gegenüber den vorher erwähnten Verfahren. Erstens sind Arten von horizontal angeordneten Überführungs­ systemen von Natur aus leichter zu benutzen als vertikale Systeme. Bezeichnenderweise erlaubt die Vorrichtung nach der vorliegenden Erfindung den Gebrauch von weichen, dünnen Gelen ohne die Besorgnis des Gleitens, welche in vertikalen Über­ führungssystemen gegeben ist. Schließlich gewährleistet die vorliegende Erfindung ein gleichmäßiges Aufsaugen durch die Verhinderung von Blasenansammlungen an der Unterfläche der Gel­ trägereinrichtung während des Überführungsverfahrens. Somit kann ohne weiteres gesehen werden, daß die Vorrichtung nach der vorliegenden Erfindung signifikante Vorteile bietet, welche bei den Vorrichtungen früherer Art nicht erhalten wer­ den.

Weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden im folgenden beschrieben:

Fig. 1 ist eine perspektivische, teilweise aufgelöst darge­ stellte Ansicht einer Elektrophoresevorrichtung gemäß den Grundsätzen der vorliegenden Erfindung;

Fig. 2 ist eine Draufsicht auf die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung;

Fig. 3 ist eine Vorderansicht der Vorrichtung nach Fig. 2;

Fig. 4 ist eine Aufrißansicht der rechten Seite von Fig. 2;

Fig. 5 ist eine teilweise Aufrißansicht der rechten Seite von Fig. 2, dargestellt mit dem Deckel in seiner geöffneten Stellung; und

Fig. 5 ist eine perspektivische Explosionsdarstellung der unteren Trägeroberfläche der Trägereinrichtung, welche in der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung verwendet wird.

Im einzelnen bezugnehmend auf die Zeichnungen umfaßt eine Elektrophoresevorrichtung 10 einen flüssigkeitsdichten Be­ hälter mit einem Deckel 12, Seitenwänden 14, 16, 18 bzw. 20 und einer Grundplatte 22, welche eine Kammer 24 umschließen. Die Grundplatte 24 ist mit einer Elektrode 26 belegt, welche sich in die Seitenwände 20 erstreckt, wo sie mit einem elektrischen Anschluß 28 verbunden ist. Die Seitenwand 16 weist ein Paar Halterungen 30 auf, welche einen Stab 32 zwischen sich auf­ nehmen, der von U-förmigen Laschen 34 aufgenommen ist, die an der Unterseite des Deckels 12 angeordnet sind. Die Seitenwand 18 ist mit einem schwenkbaren Drehhebel 36 versehen, welcher in einer Stellung so angepaßt ist, daß er von einer Vertie­ fung 38 aufgenommen wird, welche in dem Deckel 12 vorgesehen ist, so daß der Deckel in der in Fig. 5 gezeigten offenen Position gehalten wird.

Eine Trägereinrichtung, insgesamt durch die Bezugszahl 40 in Fig. 5 gekennzeichnet, wird vom Deckel 12 in die Kammer 24 herunterhängen gelassen, wenn der Deckel 12 in seiner in den Fig. 3 und 4 gezeigten geschlossenen Stellung ist. Die Trägereinrichtung umfaßt eine erste obere Tragflächenanord­ nung 42 und eine zweite untere Tragflächenanordnung 44, welche durch Klammern 46 zusammengehalten sind, die an der unteren Tragflächenanordnung 44 vorgesehen sind. Wie am besten in Fig. 6 zu sehen ist, umfaßt jede der Tragflächenanordnungen 42 und 44 einen Rahmen 48 mit einer Matte 50, welche in den Rahmen eingebaut und an ihrem Ort durch eine Aufspannplatte 52 mittels Schrauben 54 gehalten ist. Wie oben bemerkt ist die untere Tragflächenanordnung mit Klammern 46 versehen, welche an dem Rahmen 48 durch geeignete Schrauben und Muttern befestigt sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung besteht die Matte 50 aus porösem (schwammartigem) Material (Scotch-Brite - Vlies für allgemeine Zwecke Nr. 7447). Die Aufspannplatte 52 besteht vorzugsweise aus einer Gitterrostan­ ordnung, welcher der Pufferlösung ein Durchdringen und Eindringen in die Matte 50 erlaubt. Die Aufspannplatte muß eine ausreichende Steifigkeit haben, um eine gleichmäßige Pressung der Matte innerhalb des Rahmens 48 zu gewährleisten.

Die Trägereinrichtung 40 ist vom Deckel 12 mittels kurzer Pfeiler 58 abgehängt, welche Schraubenbolzen 60 schraubbar aufnehmen. Die Schraubenbolzen 60 sind auf einer Hitzesperr­ platte 62 aufgeklebt, welche frei hängend mittels Abstandhal­ ter 64 von dem Deckel 12 räumlich getrennt angeordnet ist. Zwischen der Hitzesperrplatte 62 und der Trägereinrichtung 40 ist eine Wabenplatte 66 vorgesehen, welche Löcher 68 in sich aufweist. Die Schraubenbolzen 60 durchdringen die Löcher 68 und sind zum Halten der Wabenplatte 66 an ihrem Platz mit den Pfeilern 58 gesichert. Eine zweite Elektrode 70 ist an der Wabenplatte 66 vorgesehen und führt hoch zu einer Ringklemme 72, welche auf dem Deckel 12 angeordnet ist, wo sie einen Kontakt mit einem elektrischen Kontakt herstellt, der so angepaßt ist, daß ein elektrischer Kontakt mit einem Anschluß 74 hergestellt wird, wenn der Deckel in seiner geschlossenen Position ist.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist in der Kammer zwischen der ersten Elektrode 26 in der Grundplatte 24 und der Träger­ einrichtung 40 ein Nylonschirm 76 vorgesehen, welcher vom Deckel 12 abgehängt ist, um in der Pufferlösung erzeugte Blasen zwischen der ersten Elektrode 26 zu den Seiten der Kammer abzuleiten, um Blasenansammlungen an der Unterfläche der Trägereinrichtung 40 während des Überführens von elek­ trophoretisch getrenntem Material zu vermeiden. Gemäß der vorliegenden Erfindung sollte der Nylonschirm 76 (oder ein Schirm aus einem anderen geeigneten Material) eine Größe und Form aufweisen, welche wenigstens im wesentlichen dieselbe ist, wie diejenige der Trägereinrichtung 40, so daß gewährleistet ist, daß die Blasen zu den Seiten der Kammer derart abgeleitet werden, daß eine Ansammlung an der Trägereinrichtung 40 vermieden wird. Der Schirm 76 ist an einem Paar von V-förmigen Stangen 78 befestigt derart, daß der Schirm 76 einen leichten Winkel in bezug auf die Grund­ platte 24 des Behälters bildet, um die Führung der Blasen weg zu der Seite des Behälters hin zu unterstützen. Es wurde herausgefunden, daß ein Winkel von ungefähr 5 bis 6° der horizontalen Exposition ideal ist, um die Blasen wegzuleiten. Der Schirm 76 ist an seinem Platz innerhalb der Kammer durch Befestigung der Stangen 78 in Sacklöchern 80 gehalten, welche in den Wänden 16 bzw. 20 des Behältes vorgesehen sind.

Die Vorrichtung zum Überführen von elektrophoretisch getrenn­ tem Material arbeitet in folgender Weise. Der Deckel 12 der horizontalen Einheit, welche die Trägereinrichtung 40 und die an der Wabenplatte 66 befestigte Elektrode 70 beinhaltet, ist abgehoben von der Vorrichtung und am Arbeitsbereich auf den Kopf gelegt. Die Trägerflächenanordnung 44 ist durch Wegbiegen der Klammern 46 abgenommen. Das verwendete Gel wird auf der Matte 50 der Trägerflächenanordnung 42 plaziert. Die Träger­ flächenanordnung 44 wird dann zurück an ihren Platz geklammert, um das Gel als Zwischenschicht zwischen den Trägerflächenanordnungen 42 und 44 aufzunehmen. Der Deckel wird dann um die Stange 32 geschwenkt und geschlossen, damit die Trägereinrichtung 40 in die in der Kammer 24 vorhandene Pufferlösung eintaucht. Der elektrische Kontakt zwischen den Elektroden 26 und 70 wird über die elektrischen Anschlüsse 28 und 74 hergestellt und ein Gleichstrom von ungefähr 50 bis 150 Volt für eine Zeitspanne von 3 bis 5 Stunden angelegt. Nach Vollendung des Durchganges wird die Sandwicheinheit ge­ öffnet und die Nylontransfermembran weggenommen.

Claims (5)

1. Vorrichtung zum elektrophoretischen Überführen von elek­ trophoretisch getrenntem Material mit einem flüssigkeits­ dichten Behälter, der eine Grundplatte (22), einen Deckel (12) und Seitenwände (14, 16, 18, 20) aufweist, die sich zwischen der Grundplatte (22) und dem Deckel (12) erstrecken, um eine Kammer (24) zu umschließen, mit einer Trägereinrich­ tung (40), welche in der Kammer (24) zum Aufnehmen des Materials angeordnet ist, welches elektrisch überführt wird, mit einer unter der Trägereinrichtung (40) vorgese­ henen ersten Elektrode (26) und einer über der Trägerein­ richtung (40) vorgesehenen zweiten Elektrode (70), da­ durch gekennzeichnet, daß in der Kammer (24) zwischen der ersten Elektrode (26) und der Trägereinrichtung (40) eine membranartige Einrichtung (76) zum Ableiten von Blasen, welche von der ersten Elektrode erzeugt werden, angeordnet ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung (76) zum Ableiten der Blasen eine Form und einen Oberflächenbereich aufweist, der im wesentlichen identisch ist mit der Form und dem Oberflächenbereich der Trägereinrichtung (40).

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeich­ net, daß die membranartige Einrichtung (76) zwischen V- förmigen Stangen (78) aufgespannt ist, wobei die Schenkel des V eine Steigung von 5 bis 6° aufweisen.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Stangen (78) in Sacklöcher (80) in den Wänden (16, 20) eingesetzt sind.

5. Vorrichtung nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung (76) zum Ab­ leiten der Blasen aus Kunststoff, insbesondere aus Nylon, besteht.