CH666418A5

CH666418A5 - Vorrichtung zum horizontalen, elektrischen ansaugen von elektrophoretisch transferiertem material.

Info

Publication number: CH666418A5
Application number: CH85/86A
Authority: CH
Inventors: John H Kreisher; Thomas L Mccarthy
Original assignee: Int Biotechnologies
Priority date: 1985-01-11
Filing date: 1986-01-10
Publication date: 1988-07-29
Also published as: JPS61210936A; FR2578326B1; DE3600214A1; GB2169703B; DE3600214C2; GB2169703A; FR2578326A1; US4622124A; GB8600563D0

Description

BESCHREIBUNG Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum horizontalen, elektrischen Ansaugen von elektrophoretisch transferiertem Material.

Elektrophorese ist allgemein gesehen das Phänomen der Wanderung von geladenen Teilchen oder Ionen in einem flüssigen Trägermedium unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes. Dieses Phänomen kann benutzt werden, um kleine Teilchen abzusondern, welche, aufgrund unterschiedlicher chemischer Oberflächeneigenschaften, unterschiedliche Konzentrationen einer Oberflächenladung in dem gegebenen Medium aufzeigen. Unter dem Einfluss des elektrischen Feldes werden die elektrophoretischen Beweglichkeiten der verschiedenen Arten von geladenen Teilchen in dem Trägermedium unterschiedlich sein. Eine Probe, welche an irgendeinem Punkt in eine dünne Schicht von flüssigem Trägermedium (Puffer) eingegeben wird, breitet sich langsam in einem engen Band aus in Abwesenheit eines Spannungsgradienten. Wenn jedoch ein Spannungsgradient an die Pufferschicht angelegt wird, werden die Probenteilchen unter dem Einfluss des elektrischen Feldes in verschiedenartigen Teilchengruppen oder Komponenten abgesondert, was von der elektrophoretischen Beweglichkeit der jeweiligen Partikel, der Stärke des Feldes und der Länge der Zeit abhängt, in der die Teilchen in dem Feld verbleiben. Teilchen von ähnlicher Beweglichkeit werden in charakteristischen Zonen oder Bändern in einer bestimmten Entfernung vom Punkt der (ursprünglichen) Probeneingabe konzentriert.

Ansaugen oder Umsetzen von elektrophoretisch aufgelöstem Material, wie beispielsweise Desoxyribonuklein-, Ribonukleinsäure (DNS, RNS) und anderen Proteinen, ist ein Standardverfahren geworden, wenn eine sensitive und spezifische Erfassung von biologisch interessierenden Makromolekülen gefordert wird.

Das Elektroansaugen bietet signifikante Vorteile gegenüber dem kapillaren Ansaugen, indem das elektroansaugen-de Verfahren viel schneller ist. Das kapillare Umsetzen und das Elektroansaugen erfordern beide, dass das Gel in Kontakt mit dem Papier oder einer anderen Membran gebracht wird, zu welchem die Proteine oder Nukleinsäuren übergeleitet werden. Der Unterschied zwischen den Methoden liegt in der Überleitungstriebkraft. Bei der kapillaren Überleitung ist das absorptive Potential des Filterpapiers oder eines anderen Materials die Triebkraft. Das Überleitungsmaterial, beispielsweise Nitrozellulose oder Nylon, wird zwischen dem Gel und dem absorptiven Papier eingelegt. Beim Elektroansaugen, wie es gegenwärtig praktiziert wird, werden das Gel und das Übertragungsmaterial vertikal in einen Puffertank zwischen zwei Elektroden gehängt. Die Proteine oder Nukleinsäuren werden so aus dem Gel auf das Überleitungsmaterial herausgetrieben, wobei ein elektrisches Potential benutzt wird. Ein typisches System umfasst beispielsweise das Plazieren einer Nylonmembrane gegen eine Gelatinetafel, ein Eintauchen der Gel-Nyloneinrichtung vertikal in eine Pufferlösung, dann das Anlegen eines elektrischen Potentials quer durch die Einrichtung hindurchlaufend, wobei die Pufferlösung als leitendes Medium benutzt wird. Dieses System benutzt typischerweise zwei Elektroden aus Platindrähten, einer an jeder Seite der Gel-Nylon-Kombination, und errichtet einen Spannungsgradienten in der Pufferlösung. Die Elektroden sind in Gitterform ausgelegt und räumlich getrennt in einem Abstand von dem Gel und Nylon angeordnet, um ein ziemlich einheitliches elektrisches Feld zu erhalten, wobei die geringste Menge von Platin verwendet wird.

Das Aufsaugverfahren bietet signifikante Vorteile. Erstens sind Moleküle in der Matrix eines Gels relativ unzugänglich für Untersuchungen wie beispielsweise Antikörper. Die Übertragung auf die Oberfläche einer Membran gestattet Analysen, welche in dem Gel schwierig oder unmöglich sind. Wenn also die übertragenen Moleküle an oder nahe der Oberfläche der Membran lokalisiert sind, wird die Analysenzeit wesentlich reduziert. Weiterhin sind die Membranen re5

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lativ haltbar und leicht zu handhaben im Gegensatz zu den Gels, welche leicht zu Bruch gehen. Weiterhin sind die übertragenen Moleküle an die Membran gebunden, so dass kein Auflösungsverlust stattfindet, solange eine biologische Aktivität gewöhnlich aufgehalten wird. Somit ist die Lagerung einer Membran vor einer Benutzung in der Regel durchführbar.

Wie oben erwähnt, wird beim Elektroaufsaugen, wie gegenwärtig praktiziert, das Gel und das Übertragungsmaterial vertikal in einen Puffertank zwischen zwei Elektroden eingehängt. Eine Anzahl von Nachteilen ist mit dem senkrechten Elektroaufsaugen verbunden. Beispielsweise begrenzt ein Satz standgefässertiger Behälter die Grösse der möglichen Gelflecken, obwohl Aufsaugtanks zum Aufsaugen grosser Elektrophoresegels übermässige Mengen von Puffer erfordern, und sind sehr teuer herzustellen. Weiterhin müssen Halter für vertikale Aufsaugsysteme sehr fest sein, um eine enge Nähe des Gels und der Aufsaugmembran beizubehalten. Dies erfordert ein geräumiges Trägersystem, welches dazu neigt, die elektrische Ladung zu blockieren, was zu unscharfen Flecken führt. Die Grösse des Trägersystems begrenzt auch die Grösse der möglichen Gelflecken. Schliesslich können weiche Agarose-Gele, wie sie beispielsweise für eine Genom-Identifikation gefordert werden, nicht in einem vertikalen Elektroaufsaugsystem infolge des Gleitens, Rutschens und Zusammenfallens des Gels in dem Trägerhalter aufgesaugt werden.

Versuche an horizontalen Flecken, welche einige der oben im Hinblick auf ein vertikales Aufsaugsystem genannten Probleme vermeiden würden, sind weitgehend nicht erfolgreich gewesen. Während dem Elektroaufsaugen in horizontalen Aufsaugsystemen sind an der Kathode bzw. Anode während der Elektrolyse Sauerstoff- und Wasserstoffblase erzeugt worden. Die Blasen, welche von der Elektrode unterhalb der horizontal angeordneten Gelmembran abgegeben werden, sammeln sich an der unteren Oberfläche der Membran an, wobei sie teilweise die elektrischen Ladungen blok-kieren, was zu einem ungleichmässigen Aufsaugen führt.

Natürlich würde es höchst wünschenswert sein, ein horizontales Elektroaufsaugsystem zu schaffen, welches für die Benutzung im Zusammenhang mit weichen Agarosegelen und dergleichem geeignet ist, in welchem Blasen, welche an den Elektroden während der Elektrolyse erzeugt werden, in einer Weise zerstreut werden, dass die Ansammlung von Blasen an der Unterfläche einer sich horizontal erstreckenden Gelmembran vermieden wird.

Demgemäss ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung zur horizontalen Elektroauf- oder -ansaugung von elektrophoretisch transferiertem Material zu schaffen.

Diese Vorrichtung soll dabei besonders für die Verwendung mit weichen Gelen, beispielsweise Agarosegelen, geeignet sein.

Ferner soll die Vorrichtung die Ansammlung von Blasen an der Unterfläche der horizontal angeordneten Gelmembran verhindern.

Zudem soll die Vorrichtung einfach und wirtschaftlich herstellbar sein und zum Elektroansaugen geeignet sein.

Diese Aufgabe ist erfindungsgemäss durch die Merkmale im Kennzeichnungsteil des ersten Anspruches gelöst.

Die Trägereinrichtung umfasst erste und zweite zusammengeklammerte Tragflächen, um das Gel und die aufsaugende Rezeptormembran zusammenzuhalten. Als eine Folge der horizontalen Anordnung der Trägerflächen ist nur eine geringe Kompression erforderlich, um das Gel und die Membrane in Berührung zu halten, was die Verwendung von sehr schwachen weichen Gelen erlaubt.

Die Vorrichtung nach der vorliegenden Erfindung bietet signifikante Vorteile gegenüber den vorher erwähnten Verfahren. Erstens sind Arten von horizontal angeordneten Elektroaufsaugsystemen von Natur aus leichter zu benutzen als vertikale Systeme. Bezeichnenderweise erlaubt die Vorrichtung nach der vorliegenden Erfindung den Gebrauch von weichen, dünnen Gelen ohne die Besorgnis des Gleitens, welche in vertikalen Elektroaufsaugsystemen gegeben ist. Schliesslich wird die Blasenansammlung an der Unterfläche der Gelträgereinrichtung verhindert. Somit hat die Vorrichtung gegenüber herkömmlichen Ausführungen signifikante Vorteile.

Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel der erfin-dungsgemässen Vorrichtung anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 eine perspektivische, teilweise aufgelöst dargestellte Ansicht einer Elektroansaugvorrichtung gemäss den Grundsätzen der vorliegenden Erfindung;

Fig. 2 eine Draufsicht auf die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung;

Fig. 3 eine Vorderansicht der Vorrichtung nach Fig. 2;

Fig. 4 eine Aufrissansicht der rechten Seite von Fig. 2;

Fig. 5 eine teilweise Aufrissansicht der rechten Seite von Fig. 2, dargestellt mit dem Deckel in seiner geöffneten Stellung; und

Fig. 6 eine perspektivische Darstellung der unteren Trä-geroberfläche der Trägereinrichtung, welche in der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung verwendet wird.

Im einzelnen bezugnehmend auf die Zeichnungen umfasst die horizontale Elektroansaugvorrichtung 10 einen flüssigkeitsdichten Behälter mit einem Deckel 12, Seitenwänden 14, 16,18 bzw. 20 und einer Grundplatte 22, welche eine Kammer 24 umschliessen. Die Grundplatte 24 ist mit einer Elektrode 26 belegt, welche sich in die Seitenwand 20 erstreckt, wo sie mit einem elektrischen Anschluss 28 verbunden ist. Die Seitenwand 16 weist ein Paar Halterungen 30 auf, welche einen Stab 32 zwischen sich aufnehmen, der von U-förmigen Laschen 34 aufgenommen ist, die an der Unterseite des Deckels 12 angeordnet sind. Die Seitenwand 18 ist mit einem schwenkbaren Drehhebel 36 versehen, welcher in einer Stellung so angepasst ist, dass er von einer Vertiefung 38 aufgenommen wird, welche in dem Deckel 12 vorgesehen ist, so dass der Deckel in der in Fig. 5 gezeigten offenen Position gehalten wird.

Eine Trägereinrichtung, insgesamt durch die Bezugszahl 40 in Fig. 5 gekennzeichnet, wird vom Deckel 12 in die Kammer 24 herunterhängen gelassen, wenn der Deckel 12 in seiner in den Figuren 3 und 4 gezeigten geschlossenen Stellung ist. Die Trägereinrichtung umfasst eine erste obere Tragflächenanordnung 42 und eine zweite untere Tragflächenan-ordnung 44, welche durch Klammern 46 zusammengehalten sind, die an der unteren Tragflächenanordnung 44 vorgesehen sind. Wie am besten in Fig. 6 zu sehen ist, umfasst jede der Tragflächenanordnungen 42 und 44 einen Rahmen 48 mit einer Matte 50, welche in den Rahmen eingebaut und an ihrem Ort durch eine Aufspannplatte 52 mittels Schrauben 54 gehalten ist. Wie oben bemerkt ist die untere Tragflächenanordnung mit Klammern 46 versehen, welche an dem Rahmen 48 durch geeignete Schrauben und Muttern befestigt sind. Gemäss der vorliegenden Erfindung besteht die Matte 50 aus porösem (schwammartigem) Material, wie es beispielsweise unter dem Warenzeichen SCOTCH-BRITE von der Firma 3M verkauft wird. Ein geeignetes Material ist der General Purpose Scotch-Brite Layer Nr. 7447 (Scotch-Brite — Flies für allgemeine Zwecke Nr. 7447). Die Aufspannplatte 52 besteht bevorzugt aus einer Gitterrostanordnung, welcher der Pufferlösung ein Durchdringen und Eindringen in die Matte 50 erlaubt. Die Aufspannplatte muss

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eine ausreichende Steifigkeit haben, um eine gleichmässige Pressung der Matte innerhalb des Rahmens 48 zu gewährleisten.

Die Trägereinrichtung 40 ist vom Deckel 12 mittels kurzer Pfeiler 58 abgehängt, welche Schraubenbolzen 60 schraubbar aufnehmen. Die Schraubenbolzen 60 sind auf einer Hitzesperrplatte 62 aufgeklebt, welche frei hängend mittels Abstandhalter 64 von dem Deckel 12 räumlich getrennt angeordnet ist. Zwischen der Hitzesperrplatte 62 und der Trägereinrichtung 40 ist eine Wabenplatte 66 vorgesehen, welche Löcher 68 in sich aufweist. Die Schraubenbolzen 60 durchdringen die Löcher 68 und sind zum Halten der Wabenplatte 66 an ihrem Platz mit den Pfeilern 58 gesichert. Eine zweite Elektrode 70 ist an der Wabenplatte 66 vorgesehen und führt hoch zu einer Ringklemme 72, welche auf dem Deckel 12 angeordnet ist, wo sie einen Kontakt mit einem elektrischen Kontakt herstellt, der so angepasst ist, dass ein elektrischer Kontakt mit einem Anschluss 74 hergestellt wird, wenn der Deckel in seiner geschlossenen Position ist.

Gemäss der vorliegenden Erfindung ist in der Kammer zwischen der ersten Elektrode 26 in der Grundplatte 24 und der Trägereinrichtung 40 ein Nylonschirm 76 vorgesehen, welcher vom Deckel 12 abgehängt ist, um in der Pufferlösung erzeugte Blasen zwischen der ersten Elektrode 26 zu den Seiten der Kammer abzuleiten, um Blasenansammlungen an der Unterfläche der Trägereinrichtung 40 während des Elektroabsaugens von elektrophoretisch versetztem Material zu vermeiden. Gemäss der vorliegenden Erfindung sollte der Nylonschirm 76 (oder ein Schirm aus einem anderen geeigneten Material) eine Grösse und Form aufweisen, welche wenigstens im wesentlichen dieselbe ist, wie diejenige der Trägereinrichtung 40, so dass gewährleistet ist, dass die Blasen zu den Seiten der Kammer derart abgeleitet werden, dass eine Ansammlung an der Trägereinrichtung 40 vermieden wird. Der Schirm 76 ist an einem Paar von V-förmigen Stangen 78 befestigt derart, dass der Schirm 76 einen leichten Winkel in Bezug auf die Grundplatte 24 des Behälters bildet, um die Führung der Blasen weg zu der Seite des Behälters hin zu unterstützen. Es wurde herausgefunden, dass ein Winkel von ungefähr 0,6 cm pro 10 cm der horizontalen Exposition ideal ist, um die Blasen wegzuleiten. Der Schirm 76 ist an seinem Platz innerhalb der Kammer durch Befestigung der Stangen 78 in Sacklöchern 80 gehalten, welche in den Wänden 16 bzw. 20 des Behälters vorgesehen sind.

Die horizontale Elektroansaugvorrichtung der vorliegenden Erfindung arbeitet in folgender Weise. Der Deckel 12 der horizontalen Einheit, welche die Trägereinrichtung 40 und die an der Wabenplatte 66 befestigte Elektrode 10 beinhaltet, ist abgehoben von der Vorrichtung und am Arbeitsbereich auf den Kopf gelegt. Die Tragflächenanordnung 44 ist durch Wegbiegen der Klammern 46 abgenommen. Das verwendete Gel wird auf der Matte 50 der Trägerflächenan-ordnung 42 plaziert. Die Trägerflächenanordnung 44 wird dann zurück an ihren Platz geklammert, um das Gel als Zwischenschicht zwischen den Trägerflächenanordnungen 42 und 44 aufzunehmen. Der Deckel wird dann um die Stange 32 geschwenkt und geschlossen, damit die Trägereinrichtung 40 in die in der Kammer 24 vorhandene Pufferlösung eintaucht. Der elektrische Kontakt zwischen den Elektroden 26 und 70 wird über die elektrischen Anschlüsse 28 und 74 hergestellt und ein Gleichstrom von ungefähr 50 bis 150 Volt für eine Zeitspanne von 3 bis 5 Stunden angelegt. Nach Vollendung des Durchganges wird die Sandwicheinheit geöffnet und die Nylontransfermembran weggenommen.

Es muss dabei verständlich sein, dass die Erfindung nicht auf die hier beschriebene und gezeigte Darstellung beschränkt ist, welche als geeignet erscheint, um die besten Methoden darzustellen, um die Erfindung auszuführen und welche für Abwandlungen der Form, Grösse, Anordnung von Teilen und Einzelheiten des Betriebes zugänglich sind. Die Erfindung beabsichtigt vielmehr alle solche Modifikationen einzuschliessen, welche innerhalb des Gedankens und des Rahmens liegen, der durch die Ansprüche umrissen ist.

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PATENTANSPRÜCHE

1. Vorrichtung zum horizontalen elektrischen Ansaugen von elektrophoretisch transferiertem Material, gekennzeichnet durch einen flüssigkeitsdichten Behälter, der eine Grundplatte (22), einen Deckel (12) und Seitenwandeinrichtungen (14—20) aufweist, die sich zwischen der Grundplatte (22) und dem Deckel (12) erstrecken, um eine Kammer (24) zu umschliessen, mit einer Trägereinrichtung (40), welche in der Kammer (24) zum Aufnehmen des Materials angeordnet ist, welches elektrisch aufgesaugt wird, mit einer unter der Trägereinrichtung (40) vorgesehenen ersten Elektrode (26) und einer über der Trägereinrichtung (40) vorgesehenen zweiten Elektrode (70) und in der Kammer (24) zwischen der ersten Elektrode (26) und der Trägereinrichtung (40) vorgesehenen Einrichtungen (76) zum Ableiten von Blasen, welche von der ersten Elektrode erzeugt werden, um zu verhindern, dass die Blasen sich während des Elektroansaugens des elektrophoretisch transferierten Materials an der Trägereinrichtung (40) ansammeln.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung (76) zum Ableiten der Blasen eine Form und einen Oberflächenbereich aufweist, der im wesentlichen identisch ist mit der Form und dem Oberflächen-bereich der Trägereinrichtung (40).
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägereinrichtung (40) an dem Deckel (12) befestigt ist.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der zweiten Elektrode (70) und dem Deckel (12) ein Schirm (62) zum Abstrahlen der durch die zweite Elektrode (70) erzeugten Hitze vorgesehen ist.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Elektrode (26) in der Grundplatte (22) angeordnet ist.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung (76) zum Ableiten der Blasen eine Membran umfasst, welche in der Kammer (24) mit einem Winkel in Bezug auf die Grundplatte (22) angeordnet ist.
7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Einrichtung (76) zum Ableiten der Blasen elektrisch leitend ist.
8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite Elektrode (70) an einem porösen Träger (66) befestigt ist.
9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägereinrichtung (40) eine erste obere Trägerfläche (42) und eine zweite untere Trägerfläche (44) umfasst und Einrichtungen (46) zum Klammern der ersten Trägerfläche (42) an die zweite Trägerfläche (44).
10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sowohl die erste obere Trägerfläche (42) als auch die zweite untere Trägerfläche (44) einen Rahmen (48), eine in dem Rahmen (48) angeordnete Matte (50) und eine Aufspannplatte (52) zum Halten der Matte (50) in dem Rahmen (48) umfasst.
11. Vorrichtung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Matte (50) von poröser, durchlässiger Art ist.