DE69637485T2

DE69637485T2 - Vorrichtung und Verfahren zur Elektrophorese

Info

Publication number: DE69637485T2
Application number: DE69637485T
Authority: DE
Inventors: Shmuel Cabilly; Uri Yogev
Original assignee: Ethrog Biotechnology Ltd
Current assignee: Life Technologies Israel Ltd
Priority date: 1995-04-26
Filing date: 1996-04-26
Publication date: 2008-11-27
Anticipated expiration: 2016-04-27
Also published as: NZ306974A; EP0824689A1; ES2305661T3; EP1486783A1; AU5569396A; AU706048B2; DE69632820D1; DE69632820T2; JPH11505325A; ATE391291T1; DE69637485D1; CA2219536C; DK1486783T3; EP0824689A4; US5865974A; ATE270428T1; EP0824689B1; WO1996034276A1; US5582702A; IL118033A0

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Elektrophorese im Allgemeinen und eine Vorrichtung, in der ein Elektrophoresetest ausgeführt wird, im Besonderen.
Allgemeiner Stand der Technik
Es werden sehr viele Diagnoseverfahren und Laborforschungen betrieben, in denen DNS, RNS oder Proteine gemäß ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften mittels Elektrophorese getrennt werden. Dieser Prozess findet weithin Verwendung und hat viele Anwendungsmöglichkeiten. Zum Beispiel wird er zur Analyse von DNS-Molekülen gemäß ihrer resultierenden Größe verwendet, nachdem sie durch Restriktionsenzyme digeriert wurden. Er wird auch zum Analysieren der Produkte einer Polymerasekettenreaktion (PKR) verwendet.
In der Regel findet die Elektrophoresetrennung in einem Trennungsmedium, wie zum Beispiel einem Agarose- oder Acrylamid-Gel oder einer Kombination aus beiden, statt. Gewöhnlich werden Agarose-Gele in offenen Schalen gegossen und bilden eine Gelplatte, während Acrylamid-Gele zwischen zwei Glasplatten gegossen werden.
Um die elektrophoretische Trennung herbeizuführen, werden zwei gegenüberliegende Enden der Gele mit einem elektrisch leitfähigen Puffer in Kontakt gebracht, der mittels Elektroden, in der Regel Kohlenstoff oder Platin, mit einer elektrischen Stromquelle verbunden wird. Sobald die elektrische Stromquelle eingeschaltet wird, veranlasst das elektrische Feld die negativ geladenen Moleküle, sich in Richtung der Anode zu bewegen, und die positiv geladenen Moleküle, sich in Richtung der Kathode zu bewegen. Ein Charakteristikum der herkömmlichen Elektrophorese ist die Verwendung großer Volumen von Puffer mit einer relativ niedrigen Salzkonzentration, um das benötigte elektrische Feld aufrecht zu erhalten.
DNS wird negativ geladen, und darum bewegen sich in den Agarose- oder Acrylamid-Gelen, die eine Siebwirkung ausüben, die DNS-Moleküle in Richtung der Anode mit einer Rate, die von ihrer Größe abhängt, wobei sich die Moleküle umso schneller bewegen, je kleiner sie sind.
In der Regel ist es wünschenswert, die Ergebnisse des elektrophoretischen Trennungstests sichtbar zu machen und zu dokumentieren. Bei der elektrophoretischen Trennung von DNS-Molekülen geschah dies durch Eintauchen der Gelplatte – nach Vollendung der elektrophoretischen Trennung – in eine Lösung einer fluoreszenten Verbindung, die sichtbares Licht aussendet, wenn sie mit ultraviolettem (UV-)Licht bestrahlt wird. Eine weithin verwendete Verbindung ist Ethidiumbromid.
Herkömmliche Systeme zur elektrophoretischen Trennung haben viele Schwächen, von denen einige im Folgenden genannt werden.
Zum Stand der Technik gehörende Systeme zur Elektrophoresetrennung sind eine mögliche Kontaminierungsquelle für die Arbeitsumgebung, in der die Tests ausgeführt werden. Die zwei Hauptquellen einer Kontaminierung sind Ethidiumbromid und PKR-Produkte. Ethidiumbromid ist aufgrund ihrer mutagenen Aktivität eine Gefahrenchemikalie, und darum kann der Kontakt mit Ethidiumbromid bösartige Tumoren hervorrufen. PKR ist insofern ein überaus empfindliches Verfahren, als ein einziges Molekül eines DNS-Produkts aus einer PKR (aus den Milliarden Molekülen, die entstehen) die anschließende PKR so stören kann, dass sie falsche Ergebnisse hervorbringt.
Die herkömmliche Elektrophorese hat noch weitere Schwächen, von denen eine der Zeitaufwand ist.
Es sind verschiedene Versuche unternommen worden, die Schwächen der herkömmlichen Elektrophorese zu beseitigen. Die meisten Versuche richteten sich auf die Beseitigung des Schwachpunktes herkömmlicher Elektrophoresesysteme mit Bezug auf die Verwendung von Puffern in ihnen.
US-Patent 4,874,491 an Stalberg beschreibt ein Elektrophoresesystem mit einem hochkonzentrierten gelhaltigen Puffer.
US-Patent 4,892,639 an Sarrine und Mitarbeiter beschreibt eine Elektrophoreseplatte mit verbesserter Pufferzirkulation.
US-Patent 5,045,164 an Tansamrit und Mitarbeiter beschreibt eine Elektrophoreseplatte mit verdickten Enden als Pufferreservoire.
US-Patent 5,209,831 an MacConnel beschreibt eine pufferlose Wegwerfkassette mit offenen Enden und leitfähigen Filmelektroden.
US-Patent 5,407,552 an Lebacq beschreibt eine Elektrophoresevorrichtung mit einer einstückigen Kartusche, die aus einem Hohlprofil mit zwei gegenüberliegenden offenen Seiten hergestellt ist, von denen das eine mit einem abnehmbaren Kammelement versiegelt ist, während das andere mit einer abnehmbaren Abdeckung versiegelt ist.
Kurzdarstellung der Erfindung
Es ist darum eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine verbesserte Vorrichtung zur Elektrophorese bereitzustellen.
Eine vorrangige Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer geschlossenen Kassette für die Elektrophorese, die vor, während und nach einem darin ausgeführten Elektrophoresetest im Wesentlichen geschlossenen ist.
Die Kassette der vorliegenden Erfindung beseitigt Nachteile in Verbindung mit zum Stand der Technik gehörenden Elektrophoresekassetten oder -platten. Da die Kassette eine geschlossene Form hat, unterliegt ihre Umgebung keiner Kontaminierung. Da sie außerdem gebrauchsfertig ist, spart man die Vorbereitungszeit, die für die Vorbereitung von Kassetten des Standes der Technik benötigt wird.
Eine weitere Ausgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Elektrophoresesystems, bei dem sowohl die elektrophoretische Trennung als auch die Sichtbarmachung ihrer Ergebnisse ausgeführt werden, während sich die Kassette an ihrem Platz befindet.
Gemäß einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine im Wesentlichen geschlossene Kassette bereit, in der eine Elektrophorese ausgeführt wird, wobei die Kassette Folgendes umfasst: ein Gehäuse mit mindestens einer Bodenwand und Seitenwänden, die eine Kammer definieren, wobei die Kammer in Kontakt zwischen diesen Folgendes umfasst: einen Körper aus Trenngel, in dem die Elektrophorese ausgeführt wird und der eine oder mehrere Mulden umfasst; mindestens eine Ionenquelle mit einem Volumen, das kleiner ist als das Volumen des Körpers aus Trenngel, und Elektroden zum Verbinden der Kammer mit einer externen elektrischen Stromquelle, um das Anregen der Elektrophorese zu ermöglichen; und eine Abdeckung, welche die Kammer schließt, um die im Wesentlichen geschlossene Kassette zu bilden, wobei die Abdeckung oder die Kammer mindestens eine Öffnung über der einen oder den mehreren Mulden umfasst.
Gemäß einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Elektrophoreseverfahren bereit, das folgende Schritte umfasst: Einbringen einet Testprobe in einen Körper aus Trenngel durch mindestens eine Öffnung in einer Abdeckung einer im Wesentlichen geschlossenen Kassette, wobei die Kassette den Körper aus Trenngel und mindestens eine Ionenquelle umfasst, deren Volumen kleiner als das Volumen des Körpers aus Trenngel ist; Anlegen eines elektrischen Feldes an das Gel; und Anregen der Elektrophorese durch Bereitstellen von Ionen, die für das Anregen der Elektrophorese benötigt werden, durch die mindestens eine Ionenquelle innerhalb der im Wesentlichen geschlossenen Kassette.
Gemäß einem dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Elektrophoresesystem bereit, das Folgendes umfasst: eine erfindungsgemäße Kassette; und einen Halter für die Kassette, wobei der Halter Kontaktpunkte für die Elektroden umfasst.
Die Erfindung beinhaltet eine im Wesentlichen geschlossene Wegwerfkassette mit Öffnungen zum Einbringen einer Probe aus Molekülen in die Kassette, wobei die Öffnungen vorzugsweise erst kurz vor dem Elektrophoresetest geöffnet werden.
Die Erfindung beinhaltet eine Kassette, die sämtliche chemischen Verbindungen enthält, die zum Anregen der elektrophoretischen Trennung benötigt werden, und, wenn die DNS-Moleküle getrennt sind, die Verbindungen enthält, die benötigt werden, um die getrennte DNS anzufärben.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist das Volumen der Ionenquelle, die zum Bereitstellen der für die Elektrophoresetrennung benötigten Ionen verwendet wird, kleiner als das Volumen des Gels, das als die Elektrophoresetrennungsmatrix verwendet wird, und vorzugsweise kleiner als das Volumen von Gel, das für die eigentliche Trennung während eines Elektrophoresetests verwendet wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung entstammen die Ionen (Kationen und Anionen), die zum Anregen der elektrophoretischen Trennung benötigt werden, einer Kationenaustauschmatrix bzw. einer Anionenaustauschmatrix.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt die Kationenaustauschmatrix auch die Kationen bereit, die zum Anfärben der getrennten Moleküle benötigt werden, um ihre Sichtbarmachung zu ermöglichen, wenn die Kassette mit einer UV-Lichtquelle bestrahlt wird.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung entstammen die Ionen, die zum Anregen der Elektrophoresetrennung benötigt werden, einem Reservoir, vorzugsweise einer zerbrechbaren Ampulle, die einen Puffer enthält, der durch eine relativ hohe Konzentration dieser Ionen gekennzeichnet ist.
Ein Vorteil der Kassette der vorliegenden Erfindung ist, dass sie wegwerfbar ist.
Ein weiterer Vorteil der Kassette der vorliegenden Erfindung ist, dass der Benutzer keinem gefährlichen chemischen Bestandteil ausgesetzt wird, wie zum Beispiel Ethidiumbromid, wie bei Kassetten des Standes der Technik.
Ein weiterer Vorteil der Kassette der vorliegenden Erfindung ist, dass PKR-DNS-Produkte in der Kassette gehalten werden und zusammen mit ihr entsorgt werden, so dass die Kontaminierung der Arbeitsumgebung, in der die Tests ausgeführt werden, wesentlich verringert wird.
Es wird also gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung zum Durchführen einer Elektrophoresetrennung darin bereitgestellt, die ein Gehäuse mit mindestens einer Bodenwand und Seitenwänden, die eine Kammer definieren, enthält, wobei die Kammer in Kontakt zwischen ihnen Folgendes enthält: einen Gel-Körper, in dem die Elektrophoresetrennung ausgeführt wird, mindestens eine Ionenquelle für das Bereitstellen von Ionen zum Anregen der Elektrophorese, wobei die mindestens eine Ionenquelle ein Volumen aufweist, das kleiner als das Volumen des Gel-Körpers ist, und Elektroden zum Verbinden der Kammer mit einer externen elektrischen Stromquelle, wodurch das Anregen der Elektrophoresetrennung ermöglicht wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird des Weiteren eine im Wesentlichen geschlossene Kassette bereitgestellt, in der die Elektrophoresetrennung ausgeführt wird und die Folgendes enthält: eine geschlossene Kammer, in der sich ein Gel-Körper zum Durchführen der Elektrophoresetrennung befindet, mindestens eine Ionenquelle für das Bereitstellen von Ionen zum Anregen der Elektrophoresetrennung, und Elektroden zum Verbinden der Kassette mit einer externen elektrischen Stromquelle, wodurch das Anregen der Elektrophoresetrennung ermöglicht wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird des Weiteren eine Vorrichtung zum Durchführen einer Elektrophoresetrennung bereitgestellt, die ein Gehäuse mit mindestens einer Bodenwand und Seiten wänden enthält, die eine Kammer definieren, die in Kontakt zwischen ihnen Folgendes enthält: einen Gel-Körper, in dem die Elektrophoresetrennung ausgeführt wird, mindestens einen Ionenaustauschmatrix-Körper für das Bereitstellen von Ionen zum Anregen der Elektrophoresetrennung, und Elektroden zum Verbinden der Kammer mit einer externen elektrischen Stromquelle, wodurch das Anregen der Elektrophoresetrennung ermöglicht wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Volumen der mindestens einen Ionenquelle kleiner als das Volumen des Gel-Körpers, der bei der Elektrophoresetrennung verwendet wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die mindestens eine Ionenquelle einen Ionenaustauschmatrix-Körper. Des Weiteren enthält der Ionenaustauschmatrix-Körper einen Kationenaustauschmatrix-Körper für das Bereitstellen der Kationen zum Anregen der Elektrophoresetrennung und einen Anionenaustauschmatrix-Körper für das Bereitstellen der Anionen zum Anregen der Elektrophoresetrennung. Des Weiteren ist die Kationenaustauschmatrix an einem Ende des Körpers aus Trenngel angeordnet, und der Anionenaustauschmatrix-Körper ist an einem zweiten Ende des Trenngels angeordnet.
Während des Betriebes tauscht die Kationenaustauschmatrix Protonen, die aus der Elektrolyse gewonnen wurden, mit den Kationen zum Anregen der elektrophoretischen Trennung aus, und die Anionenaustauschmatrix tauscht Hydroxylionen, die aus der Elektrolyse gewonnen wurden, mit den Anionen zum Anregen der elektrophoretischen Trennung aus.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthalten die Kationenaustauschmatrix und die Anionenaustauschmatrix Teilchen, die in eine Trägermat rix eingelassen sind. Vorzugsweise besteht die Trägermatrix aus dem gleichen Gel wie der Gel-Körper, in dem die Elektrophoresetrennung ausgeführt wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die Vorrichtung außerdem einen zusätzlichen Gel-Körper von geringer Gel-Festigkeit, der zwischen der Seitenwand der Kammer und der Anionenaustauschmatrix angeordnet ist, wobei der Gel-Körper von niedriger Gel-Festigkeit während der Elektrophoresetrennung schrumpft, wodurch ein Volumen entsteht, in dem sich Gase ansammeln, die in der Nähe einer Anode der Kammer erzeugt werden.
Des Weiteren enthält die Vorrichtung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Pufferlösung in Kontakt mit dem Körper aus Trenngel, den mindestens einen Ionenaustauschmatrix-Körper und die Elektroden. Der Puffer ist vorzugsweise ein TAE-Puffer, so dass die Kationenaustauschmatrix Tris-Kationen freisetzt und die Anionenaustauschmatrix Acetat-Anionen freisetzt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die Kationenaustauschmatrix außerdem Ethidium-Kationen.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die mindestens eine Ionenquelle ein geschlossenes Reservoir, in dem sich eine Pufferlösung befindet, die eine höhere Konzentration aufweist als eine Konzentration einer Pufferlösung des Gel-Körpers, in dem die Elektrophoresetrennung ausgeführt wird, wobei das geschlossene Reservoir erst kurz vor der Elektrophoresetrennung geöffnet wird, um die Ionen zum Anregen der Elektrophoresetrennung bereitzustellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das geschlossene Reservoir eine zerbrechbare Ampulle. Des Weiteren kann die zerbrechbare Ampulle von einem Raum umgeben sein, der mindestens teilweise mit der Pufferlösung in einer Konzentration gefüllt ist, die allgemein ähnlich der Konzentration des Gel-Körpers ist, in dem die Elektrophoresetrennung ausgeführt wird. Vorzugsweise ist der Puffer ein TAE-Puffer. Außerdem kann der Puffer auch Ethidium-Kationen enthalten.
Die Vorrichtung und die Kassette der vorliegenden Erfindung sind des Weiteren durch eine beliebige Kombination der folgenden Merkmale gekennzeichnet:
Die Kammer oder die Abdeckung können mindestens eine Öffnung zum Einbringen mindestens einer Testprobe in den Gel-Körper enthalten. Vorzugsweise wird die mindestens eine Öffnung vor der Elektrophoresetrennung durch einen Kamm geschlossen.
Die Kammer und/oder die Abdeckung können für ultraviolette (UV-)Strahlung durchlässig sein.
Die Kammer oder die Abdeckung kann des Weiteren mindestens ein Entlüftungsloch enthalten, das vor dem Elektrophoresetest geschlossen wird und kurz vor dem Elektrophoresetest geöffnet wird.
Des Weiteren enthalten gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Elektroden ein leitfähiges Material, das in der Lage ist, mindestens einen Teil von mindestens einem der Gase zu adsorbieren, die während der Elektrophoresetrennung erzeugt werden. Vorzugsweise besteht die mindestens eine zur Adsorption befähigte Elektrode im Wesentlichen aus einem Material, das unter Aluminium und Palladium ausgewählt ist.
Außerdem gehört zu den Gasen Sauerstoff, der in der Nähe der Anode während der Elektrophoresetrennung erzeugt wird und mit dem Aluminium reagiert. Alternativ gehört zu den Gasen Wasserstoff, der in der Nähe der Kathode während der Elektrophoresetrennung erzeugt wird, wobei der Wasserstoff durch das Palladium adsorbiert wird.
In einer alternativen Ausführungsform enthält die mindestens eine Elektrode einen Streifen aus leitfähigem Material. Vorzugsweise ist der Streifen aus leitfähigem Material an einer Schräge angebracht, die in einem Winkel relativ zu der Bodenwand geneigt ist, wodurch Gase, die in der Nähe des Streifens während der Elektrophoresetrennung erzeugt werden, in ein Leervolumen geleitet werden, das die Gase aufnimmt.
Schließlich kann die Vorrichtung oder Kassette des Weiteren mindestens ein Leervolumen zum Auffangen von Gasen enthalten, die während des Elektrophoresetests erzeugt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird des Weiteren ein System zum Durchführen einer Elektrophoresetrennung bereitgestellt, das Folgendes enthält: eine elektrische Stromquelle, eine im Wesentlichen geschlossene Wegwerfkassette, vorzugsweise, aber nicht unbedingt, die Vorrichtung oder Kassette der vorliegenden Erfindung, und einen Träger zum Tragen der im Wesentlichen geschlossenen Kassette und zum Verbinden der elektrischen Stromquelle mit den leitfähigen Elementen der Kassette.
Des Weiteren kann das System noch eine UV-Lichtquelle enthalten, wobei die Kassette für UV-Licht durchlässig ist und wobei die Kassette außerdem ein UV-empfindliches Material enthält, das mit den Molekülen, die einer Elektrophoresetrennung unterzogen werden, in Wechselwirkung treten kann und Licht aussenden kann, wodurch es ermöglicht wird, die Elektrophoresetrennung auszuführen und sichtbar zu machen, während sich die Kassette an ihrem Platz befindet. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das UV-empfindliche Material Ethidiumbromid.
Des Weiteren kann das System noch ein Kameramittel zum Dokumentieren der Ergebnisse der Elektrophoresetrennung enthalten. Das System kann auch einen Computer enthalten, der mindestens eine Bildanalyseanwendung zum Analysieren der Ergebnisse der Elektrophoresetrennung enthält.
Außerdem kann das System ein Kühlsystem zum Kühlen der Kassette während des Elektrophoresetests enthalten.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird des Weiteren ein Elektrophoreseverfahren bereitgestellt, das folgende Schritte enthält: Einbringen mindestens einer Testprobe in einen Gel-Körper, Anlegen eines elektrischen Feldes an den Gel-Körper und Anregen einer Elektrophoresetrennung durch Bereitstellen von Ionen, die zum Anregen der Elektrophoresetrennung benötigt werden, durch mindestens eine Ionenquelle, die ein Volumen kleiner als das Volumen des Gels aufweist.
Und schließlich wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer im Wesentlichen geschlossenen Kassette, in der eine Elektrophoresetrennung ausgeführt wird, bereitgestellt, das folgende Schritte enthält: Bereitstellen eines Gehäuses mit einer Bodenwand und Seitenwänden, die eine offene Kammer definieren, Montieren – innerhalb der Kammer in Kontakt zwischen ihnen – eines Gel-Körpers, in dem die Elektrophoresetrennung ausgeführt wird, mindestens einer Ionenquelle für das Bereitstellen von Ionen zum Anregen der Elektrophoresetrennung, wobei die mindestens eine Ionenquelle ein Volumen aufweist, das kleiner als das Volumen des Gel-Körpers ist, und von Elektroden zum Verbinden der Kammer mit einer externen elektrischen Stromquelle, und Schließen des offenen Gehäuses mit einer Abdeckung, wodurch eine im Wesentlichen geschlossene Kassette gebildet wird, in der die Elektrophoresetrennung ausgeführt werden kann.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung lässt sich anhand der folgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den angehängten Zeichnungen besser verstehen, wobei in diesen Zeichnungen Folgendes zu sehen ist:
1 ist eine schematische isometrische Illustration einer Elektrophoresekassette, die gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert.
2 ist eine schematische Querschnittsdarstellung entlang der Linie II-II in 1.
3 ist eine schematische isometrische auseinandergezogene Illustration der Elektrophoresekassette von 1.
4 ist eine schematische Querschnittsdarstellung entlang der Linie IV-IV in 3.
5 ist eine schematische isometrische auseinandergezogene Illustration einer Elektrophoresekassette, die gemäß einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert.
6 ist eine schematische Querschnittsdarstellung entlang der Linie VI-VI in 5.
7 ist eine schematische isometrische Illustration einer Elektrophoresekassette, die gemäß einer dritten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert.
8 ist eine schematische isometrische auseinandergezogene Illustration der Elektrophoresekassette von 7.
9 ist eine schematische Querschnittsdarstellung entlang der Linie IX-IX in 7.
10 ist eine schematische Querschnittsdarstellung entlang der Linie X-X in 7.
11 ist eine schematische Querschnittsdarstellung entlang der Linie XI-XI in 7.
12 ist eine schematische isometrische Illustration einer Elektrophoresekassette, die gemäß einer vierten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert.
13 ist eine umgedrehte aufgeschnittene schematische isometrische Illustration der Elektrophoresekassette von 12.
14 ist eine schematische isometrische auseinandergezogene Illustration der Elektrophoresekassette von 12.
15 ist eine schematische Querschnittsdarstellung entlang der Linie XV-XV in 14.
16 ist eine schematische isometrische Illustration eines Systems zur Elektrophorese, das gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert.
Detaillierte Beschreibung der vorliegenden Erfindung
Wenden wir uns nun den 1–4 zu, wo eine Elektrophorese-Wegwerfkassette veranschaulicht ist, die allgemein mit 10 bezeichnet ist und die gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert.
Kassette 10, wie am besten in 1 zu sehen, ist eine geschlossene Wegwerfkassette, die vorzugsweise, aber nicht unbedingt, für einen einzelnen Elektrophoresetest verwendet wird. Kassette 10 enthält alle chemischen Verbindungen, die zum Anregen der Elektrophoresetrennung und zum Ermöglichen der Sichtbarmachung ihrer Ergebnisse, wenn DNS- sowie RNS- oder Protein-Moleküle getrennt wurden, benötigt werden.
Wie am besten in 3 zu sehen, umfasst die Kassette 10 vorzugsweise eine dreidimensionale Kammer 11, die vorzugsweise im Wesentlichen flach ist und eine Bodenwand und Seitenwände, die mit 12 bzw. 14 bezeichnet sind, und eine Abdeckung 16, welche die Deckenwand der Kassette bildet, aufweist. Die Bodenwand 12 (4) und die Abdeckung 16 bestehen vorzugsweise aus einem beliebigen geeigneten UV-durchlässigen Material, wie zum Beispiel dem TPX-Kunststoff, der auf dem freien Markt bei MITSUI in Japan zu beziehen ist, oder dem PMMA-Kunststoff, der auf dem freien Markt bei Repsol Polivar S.P.A in Rom zu beziehen ist. In einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung der Kassette 10 wird ein Kunststoffformungsprozess verwendet, bei dem ein Rohaglas-Formungspulver verwendet wird, das auf dem freien Markt bei der Sidas GmbH in Darmstadt, Deutschland, zu beziehen ist.
Wie am besten in der Querschnittsdarstellung von 4 zu sehen, umfasst die Kammer 11 vorzugsweise eine Gelmatrix 18, bei der es sich um eine beliebige geeignete Gelmatrix für die Elektrophorese handeln kann, wie zum Beispiel ein Agarose-Gel oder ein Gel aus Acrylamid, eine Kationenaustauschmatrix 20 und eine Anionenaustauschmatrix 22, die zusammen als die Ionenaustauschmatrices 20 und 22 bezeichnet werden. Die Kammer 11 umfasst des Weiteren zwei leitfähige Stäbe, die mit 24 und 26 bezeichnet sind, wie zum Beispiel Edelstahlstäbe, die, wenn sie an eine externe elektrische Gleichstromquelle angeschlossen werden, das elektrische Feld erzeugen, das zum Anregen der elektrophoretischen Trennung benötigt wird. In der veranschaulichten Ausführungsform ist der Stab 24 die Anode, und der Stab 26 ist die Kathode. Die Kammer 11 umfasst des Weiteren zwei Leervolumen 28 und 30, in denen sich Gase, die während des Elektrophoresetests gebildet werden, ansammeln können. Alternativ kann die offene Abdeckung 16 zwei Entlüftungslöcher 32 und 34 enthalten, die nur in 3 gezeigt sind, um die Gase, die sich in den Leervolumen 28 und 30 angesammelt haben, abzulassen.
Ein besonderes Merkmal der Kassette 10, wie am besten in den 3 und 4 gezeigt, ist, dass das Volumen der Ionenquelle, der Ionenaustauschmatrices 20 und 22 in der veranschaulichten Ausführungsform, kleiner ist als das Volumen des Gels 18, das als die Elektrophoresetrennungsmatrix verwendet wird, und vorzugsweise kleiner ist als das Volumen von Gel, das für die eigentliche Trennung während eines Elektrophoresetests verwendet wird.
Es versteht sich, dass, wenn die Kassette 10 Entlüftungslöcher 32 und 34 enthält, diese vor Beginn des elektrophoretischen Tests abgedichtet werden und erst kurz vor dem Beginn des Elektrophoresetests geöffnet werden und wieder geschlossen werden, nachdem der Test beendet ist, um die Möglichkeit einer von dort ausgehenden Kontaminierung wesentlich zu verringern.
Vorzugsweise stehen das Gel 18, die Ionenaustauschmatrices 20 und 22 und die leitfähigen Stäbe 24 und 26 in Kontakt und sind in einer relativ kleinen Menge einer Agarose-Matrix versenkt, die hergestellt wurde und eine Pufferlösung, wie zum Beispiel einen TAE-Puffer, enthält, wodurch die Mobilität der Moleküle, die einer Trennung unterzogen werden, und der Ionen, die durch die Ionenaustauschmatrices 20 und 22 bereitgestellt werden, verbessert wird.
Es ist ein besonderes Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass die Ionen, die zum Anregen der elektrophoretischen Trennung benötigt werden, durch die Ionenaustauschmatrices 20 und 22 vorzugsweise durch den Austausch mit Protonen und Hydroxylionen, die aus der Elektrolyse von H₂O gewonnen werden, bereitgestellt werden. Während des Betriebes wird ein Gleichstrom über die Stäbe 24 und 26 angelegt, um die Elektrolyse zu initiieren, was wiederum den Betrieb der Ionenaustauschmatrices initiiert.
Die Kationenaustauschmatrix 20 und die Anionenaustauschmatrix 22 setzen die Kationen und Anionen frei, die zum Anregen der Elektrophoresetrennung benötigt werden. Ein Beispiel eines geeigneten Kations ist das Tris⁽⁺⁾-Kation, und ein Beispiel eines geeigneten Anions ist Acetat^(–). Vorzugsweise, aber nicht unbedingt, werden die durch die Ionenaustauschmatrices 20 und 22 freigesetzten Ionen mit adsorbierten Protonen bzw. Hydroxyl-Anionen ausgetauscht. Alternativ oder zusätzlich dazu können die durch die Ionenaustauschmatrices 20 und 22 adsorbierten Ionen auch durch die Stäbe 24 und 26 bereitgestellt werden.
Es versteht sich, dass die Verwendung der Ionenaustauschmatrices 20 und 22 einen allgemein gleichmäßigen pH-Wert in der gesamten Zelle erzeugt, da jede Protonenansammlung nahe der Anode 24 dadurch kompensiert wird, dass sie durch die benachbarte Kationenaustauschmatrix 20 absorbiert wird, und eine Hydroxyl-Ansammlung nahe der Kathode 26 wird dadurch kompensiert, dass sie durch die Anionenaustauschmatrix 22 absorbiert wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Kationenaustauschmatrix 20 und die Anionenaustauschmatrix 22 in eines der Materialien versenkt werden, die zur Herstellung des Gels verwendet werden.
Ein geeignetes Kationenaustauschmaterial ist CM-25-120 Sephadex, und geeignete Anionenaustauschmaterialien sind WA30 und A-251-20, die alle auf dem freien Markt bei der Sigma, Inc. in St. Louis, USA, zu beziehen sind.
Die Kassette 10 enthält vorzugsweise auch Mulden 36 in dem Gel 18. Die Mulden 36 werden dafür verwendet, Proben der Moleküle, die einer elektrophoretischen Trennung unterzogen werden sollen, einzubringen. Die Mulden 36 können durch ein beliebiges geeignetes Verfahren gebildet werden, wie zum Beispiel durch Einbringen einer kammartigen Struktur 40 (2) in das Gel während des Einbaus des Gels. Der Kamm 40 wird über entsprechende Öffnungen 38 (1) in der Abdeckung 16 in das Gel eingebracht. Die Öffnungen 38 können als ein zusätzlicher Raum zum Einladen der Molekularproben kurz vor Beginn des Elektrophoresetests nach der Entnahme des Kamms 40 verwendet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, wie am besten aus 2 zu erkennen, werden die Mulden 36 durch den Kamm 40 bedeckt, der bei ihrer Herstellung verwendet wurde. Der Grund dafür ist, dass bei dem Kammverfahren über die Öffnungen 38 in der oberen Abdeckung 16 eine Kammstruktur in das Gel eingesetzt wird, wobei der Kamm erst kurz vor dem Elektrophoresetest herausgezogen wird.
Es ist ein besonderes Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass die Kassette 10 eine geschlossene Kassette ist, die durch den Kamm 40 bedeckt wird, der kurz vor dem Elektrophoresetest selbst herausgenommen wird.
Die Kassette 10 enthält auch eine Quelle für Ethidium-Kationen, die für die ultraviolette (UV-)Sichtbarmachung der getrennten DNS-Moleküle verwendet werden. Im Gegensatz zu Elektrophoresesystemen des Standes der Technik, bei denen Ethidiumbromid nach der Trennung der Moleküle eingebracht wird, in der Regel durch Versenken des Gels in einer Ethidiumbromid-Lösung, enthält die Kassette 10 eine interne Quelle für Ethidium-Ionen. Vorzugsweise setzt die Kationenaustauschmatrix 20 nicht nur die TRIS-Kationen frei, sondern auch Ethidium-Kationen, die mit den Molekülen, die einer elektrophoretischen Trennung unterzogen werden, in Wechselwirkung treten.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Kationenaustauschmatrix 20 einen kontinuierlichen Fluss von Ethidium-Kationen während des Elektrophoresetests bereit, wodurch die DNS-Moleküle so angefärbt werden, dass ihre Sichtbarmachung und Analyse an Ort und Stelle unter Verwendung eines geeigneten Elektrophoresesystems ermöglicht wird, wie zum Beispiel des Systems, das mit Bezug auf 16 unten beschrieben wird.
Die folgenden Beispiele, die nicht den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung einschränken sollen, veranschaulichen, wie die Kationenaustauschmatrix 20 und die Anionenaustauschmatrix 22 hergestellt werden. Das folgende Beispiel betrifft eine Kassette, deren äußere Länge, Breite und Höhe 100 Millimeter (mm), 80 mm bzw. 6 mm betragen. Es versteht sich, dass eine Kassette mit diesen äußeren Abmessungen im Wesentlichen flach ist.
BEISPIEL 1
Die Kationenaustauschmatrix 20 wurde folgendermaßen hergestellt:

A. Etwa 5 Gramm CM-25-120 Sephadex-Teilchen wurden unter Verwendung von drei Volumen TAE-Lösung mit einer Konzentration gewaschen, die 50-mal höher war als die Konzentration des TAE-Puffers, der während des Elektrophoresetests verwendet wurde (hier eine 50-fache TAE-Lösung). In diesem Beispiel betrug die Konzentration, die in dem Elektrophoresetest selbst verwendet wurde, 0,04 Mol Tris-Acetat mit 0,002 Mol EDTA.
B. Die CM-25-120 Sephadex-Teilchen wurden mit destilliertem Wasser gewaschen.
C. Zwei Gramm der gewaschenen CM-25-120 Sephadex-Teilchen wurden mit 50 ml 0,5-fachem TAE-Puffer und 5 Mikrolitern Ethidiumbromid vermischt.
D. Man ließ das Gemisch ohne Rühren eine Stunde lang ruhen, damit sich die CM-25-120 Teilchen setzen konnten.
E. 25 ml des Gemischs wurden herausgefiltert, so dass 25 ml Lösung erhalten wurden, welche die 2 Gramm CM-25-120 Sephadex-Teilchen enthielten.
F. Die erhaltenen 25 ml Gemisch, welche die CM-25-120 Sephadex-Teilchen enthielten, wurden in ein 4-prozentiges Agarose-Gel versenkt, wodurch die Kationenaustauschmatrix 20 entstand.

Die Anionenaustauschmatrix 22 wird folgendermaßen hergestellt:

A. Etwa 3 Gramm WA 30-Teilchen wurden unter Verwendung von drei Volumen der 50-fachen Lösung gewaschen, die zum Waschen der Kationenaustauschteilchen verwendet wurde.
B. Die WA 30-Teilchen wurden mit destilliertem Wasser gewaschen.
C. Ein Gramm WA 30-Teilchen wurden in ein 4-prozentiges Agarose-Gel versenkt, wodurch die Anionenaustauschmatrix 22 entstand.

BEISPIEL 2
Die Kationenaustauschmatrix 20 wird folgendermaßen hergestellt:

A. 20 Gramm aufgequollene CM-25-120 Sephadex-Teilchen wurden in eine Standardkolonne eingebracht und mit 500 ml 1,2-molarer TAE-Lösung, deren pH-Wert mit HCl auf 9,3 eingestellt war, gewaschen.
B. Die CM-25-120 Sephadex-Teilchen wurden mit 7 Volumen destilliertem Wasser gewaschen.
C. Die CM-25-120 Sephadex-Teilchen wurden aus der Kolonne entfernt und in zwei Volumen 0,6-fachem TAE-Puffer aufbewahrt.
D. 1 ml aufgequollene CM-25-120 Sephadex-Teilchen wurden mit Ethidiumbromid bis zur Sättigung adsorbiert, und die Bromid-Ionen wurden herausgewaschen.
E. 1,2 ml der CM-25-120-Teilchen, die in dem TAE-Puffer aufbewahrt wurden (Schritt C), und 3 Mikroliter der Teilchen, die mit Ethidium adsorbiert wurden (Schritt D), wurden in 1,5 ml 2%-iges Agarose-Gel, das die Agarose-Matrix bildet, versenkt, wodurch die Kationenaustauschmatrix 20 für die Kassette 10 entstand.

Die Anionenaustauschmatrix 22 wurde folgendermaßen hergestellt:

A. 25 Gramm DEAE Sephadex A-25-120-Teilchen wurden in eine Standardkolonne eingebracht und mit 500 ml 1-molarer Natriumacetat-Lösung, deren pH-Wert mit Essigsäure auf 7 eingestellt war, gewaschen.
B. Die A-25-120-Teilchen wurden mit 7 Volumen destilliertem Wasser gewaschen.
C. Die A-25-120 Sephadex-Teilchen wurden aus der Kolonne entfernt und in zwei Volumen 0,6-fachem TAE-Puffer aufbewahrt.
D. 1,2 ml der A-25-120-Teilchen, die mit Acetat-Ionen adsorbiert wurden (Schritt C), wurden in 1,5 ml 2%-iges Agarose-Gel, das die Agarose-Matrix bildet, versenkt, wodurch die Anionenaustauschmatrix 22 für die Kassette 10 entstand.

Wenden wir uns nun den 5 und 6 zu, in denen eine Elektrophoresekassette, die allgemein mit 25 bezeichnet ist, veranschaulicht ist, die gemäß einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert.
Die Kassette 25 ähnelt allgemein in Aufbau und Funktionsweise der Kassette 10 (1–4), d. h. sie ist eine geschlossene Wegwerfkassette, die vorzugsweise für einen einzelnen Elektrophoresetest verwendet wird und die ein Gel 18 und Ionenaustauschmatrices 20 und 22 umfasst. Darum werden ähnliche Elemente der Kassetten 10 und 25 mit ähnlichen Bezugszahlen bezeichnet (zum Beispiel Kamm 40).
Die Kammer 60 umfasst, ähnlich wie die Kammer 11, eine Gelmatrix 18 und Ionenaustauschmatrices 20 und 22. Jedoch unterscheidet sich die Kammer 60 von der Kammer 11 in Aufbau und Funktionsweise mit Bezug auf die Anode und die Kathode und den Gasauffang- und -ablassmechanismus.
Die Kammer 60 umfasst zwei leitfähige Streifen 21 und 23, welche die Kathode bzw. die Anode bilden. Die Kathode 21 wird diagonal durch eine diagonale Schräge 27 gestützt, die vorzugsweise einen integralen Teil der Kammer 60 bildet. Die Anode 23 ist unter der Ionenaustauschmatrix 20 und einer zusätzlichen Gelmatrix 29 angeordnet, die während der Elektrophorese infolge von Elektroendosmose schrumpft, wie weiter unten noch ausführlich beschrieben wird. Die Gelmatrix 29 ist vorzugsweise das gleiche Gel wie die Gelmatrix 18, jedoch ist ihre Gel-Festigkeit geringer als die des Gels 18. Zum Beispiel besteht die Gelmatrix 18 aus 2% Agarose, während die Gelmatrix 29 0,3% Agarose umfasst.
Während des Betriebes fließt während eines Elektrophoresetests Wasser infolge von Elektroendosmose von der Anodenseite zur Kathodenseite der Gel-Matrices. Folglich schrumpft die Gelmatrix 29 allmählich, wodurch ein Raum gebildet wird, in dem sich Gase ansammeln, die in der Nähe der Anode 23 entstehen.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bestehen die Kathode 21 und die Anode 23 aus einem leitfähigen Material, das Gase adsorbieren kann, die während des elektrophoretischen Trennungsprozesses entstehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die Kathode 21 und die Anode 23 aus Aluminium. Während der Elektrophorese reagiert der Sauerstoff, der in der Nähe der Anode 23 erzeugt wird, mit der Aluminium-Anode, wobei Aluminiumoxid entsteht, wodurch weniger freier Sauerstoff auf der Anoden-Seite entsteht. Die Verringerung des Volumens des erzeugten Gases mindert in Verbindung mit dem Raum, der durch das Schrumpfen der Gelmatrix 29 für eine Gasansammlung gebildet wird, die Notwendigkeit eines Entlüftungslochs auf der Anoden-Seiten der Kassette 25. Darum braucht die Kassette 25 in ihrer Abdeckung 62 nur ein einzelnes Entlüftungsloch 35 oberhalb des Leervolumens 30, das sich neben der Kathode befindet, zu enthalten.
In einer alternativen Ausführungsform besteht die Anode aus Aluminium, wie oben beschrieben, während die Kathode aus Palladium oder einem beliebigen anderen geeigneten leitfähigen Material besteht, das Wasserstoff auf der Kathoden-Seite adsorbiert.
Ein weiteres besonderes Merkmal der Kassette 25 ist, dass die Kathode 21 diagonal durch die Schräge 27 gestützt wird. Dies ermöglicht einen kontinuierlichen Kontakt zwischen der Kathode und der Oberfläche der Anionenaustauschmatrix 22, die über der Kathode 21 liegt, wodurch frei werdende Gasblasen, die in der Nähe der Kathode 21 gebildet werden, zu dem Leervolumen 30 gerichtet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Schräge 27 als ein integraler Teil der Kammer 60 ausgebildet und ist zu der Bodenwand 12 in einem Winkel von etwa 45 Grad geneigt.
Wenden wir uns nun den 7–11 zu, in denen eine Elektrophoresekassette, die allgemein mit 125 bezeichnet ist, veranschaulicht ist, die gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert. Die Kassette 125 ist, ähnlich den Kassetten 10 und 25, eine geschlossene Wegwerfkassette, die für einen einzelnen Elektrophoresetest verwendet wird und die alle chemischen Verbindungen enthält, die zum Anregen der Elektrophoresetrennung und für das Ermöglichen der Sichtbarmachung ihrer Ergebnisse, wenn die DNS- sowie die RNS- oder Protein-Moleküle getrennt wurden, benötigt werden.
Die Kassette 125 umfasst eine dreidimensionale Kammer 160, die allgemein der Kammer 60 der Kassette 25 ähnelt, und eine Abdeckung 162, die allgemein der Abdeckung 62 der Kassette 25 ähnelt. Die Kassette 125 unterscheidet sich von der Kassette 25 in ihrer Ionenquelle zum Anregen der Elektrophoresetrennung. In der veranschaulichten Ausführungsform sind Elemente, die allgemein den Elementen der Kassetten 10 und 25 ähneln, mit ähnlichen Bezugszahlen bezeichnet (zum Beispiel Gel 18).
In der Kammer 160 ist der Gel-Körper 18 zwischen zwei Räumen 120 und 122 angeordnet, die eine Pufferlösung, wie zum Beispiel die oben beschriebene TAE-Pufferlösung, enthalten. In jedem Volumen 120 und 122 befindet sich ein geschlossenes Reservoir, das den gleichen Puffer enthält, nur mit einer höheren Konzentration, um die Ionen zum Anregen der Elektrophoresetrennung bereitzustellen. In der veranschaulichten bevorzugten Ausführungsform sind die geschlossenen Reservoire zerbrechbare Ampullen 116 und 134, welche die Pufferlösungen 124 bzw. 132 enthalten, die eine höhere Konzentration haben als die der Volumen 120 und 122. Als ein nicht-einschränkendes Beispiel ist die Konzentration der Lösungen 124 und 132 fünfzigfach höher als die der Pufferlösungen der Räume 120 und 122.
Es versteht sich, dass die Ampullen 116 und 134 aus einem beliebigen geeigneten versiegelten Material bestehen, das wasserundurchlässig ist, wie zum Beispiel Kunststoff oder Glas, so dass die darin befindlichen konzentrierten Pufferlösungen 124 und 132 nicht in Kontakt mit den Pufferlösungen kommen, mit denen die Volumen 120 und 122 befüllt sind.
In der veranschaulichten Ausführungsform werden die Ampullen 116 und 134 durch Ampullenträger 106 getragen. Während des Betriebes zerbricht der Benutzer die Ampullen 116 und 134, um die Ionen in den hochkonzentrierten Puffern 124 bzw. 132 bereitzustellen, um die Ionen bereitzustellen, die für die Durchführung des Elektrophoresetests benötigt werden, vorzugsweise nachdem der Gleichstrom an die Kassette 125 angelegt wurde.
In der veranschaulichten Ausführungsform wird jede der Ampullen 116 und 134 unter einer flexiblen Abdeckung 110 getragen. Die flexiblen Abdeckungen 110 bestehen aus einem beliebigen flexiblen Material, das unter mechanischer Krafteinwirkung nachgibt, wie zum Beispiel Gummi, um ein Zerbrechen der Ampullen 116 und 134 zu ermöglichen, nachdem Druck auf sie ausgeübt wird, wodurch ihr Inhalt in die Pufferräume 120 bzw. 122 freigesetzt wird.
Optional enthält die konzentrierte Pufferlösung 124 auch ein geeignetes Material zum Anfärben von DNS, vorzugsweise eine beliebige Quelle für Ethidium-Kationen, wie zum Beispiel Ethidiumbromid, um eine Sichtbarmachung der getrennten DNS-Proben unter UV-Einstrahlung zu ermöglichen, wie oben beschrieben. In diesem Fall besteht die Kammer 160 aus einem UV-durchlässigen Material.
Wenden wir uns nun den 12–15 zu, in denen eine Elektrophoresekassette, die allgemein mit 225 bezeichnet ist, veranschaulicht ist, die gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert. Die Kassette 225 ähnelt der Kassette 125 und ist, ähnlich wie die Kassetten 10 und 25 und 125, eine geschlossene Wegwerfkassette, die für einen einzelnen Elektrophoresetest verwendet wird und die alle chemischen Verbindungen enthält, die zum Anregen der Elektrophoresetrennung und zur Sichtbarmachung ihrer Ergeb nisse, wenn die DNS- sowie die RNS- oder Protein-Moleküle getrennt wurden, benötigt werden.
Die Kassette 225 ähnelt allgemein der Kassette 125 in Aufbau und Funktionsweise, und ähnliche Elemente werden durch ähnliche Bezugszahlen bezeichnet. Die Kassette 225 unterscheidet sich von der Kassette 125 in ihrer Ampulle und ihrem Mechanismus zum Zerbrechen der Ampulle.
Die Kassette 225 umfasst zwei Ampullen 216 und 234, die allgemein den Ampullen 116 und 134 ähneln und die schmelzen können, wenn ein elektrischer Strom durch sie hindurchgeleitet wird. Wie am besten in 13 zu sehen, ist ein leitfähiger Draht 240 in die Wand der Ampullen 216 und 234 eingebettet. In der veranschaulichten Ausführungsform ist der leitfähige Draht 240 ein einzelner Draht von hohem spezifischem Widerstand mit zwei Enden 226, an die elektrischer Strom in einem geschlossenen Kreis angelegt werden kann.
Während des Betriebes werden die Ampullen 216 und 234 geschmolzen, kurz bevor der elektrophoretische Test begonnen wird, indem ein Strom durch den leitfähigen Draht 240 geleitet wird, indem eine elektrische Stromquelle an die Kontakte 226 angeschlossen wird. Vorzugsweise sind die Abschnitte des leitfähigen Drahtes 240, die nicht in die Ampullen 216 und 234 eingebettet sind, mit einem Isoliermaterial beschichtet, um sie zu isolieren.
Wenden wir uns nun 16 zu. 16 ist eine schematische isometrische Illustration eines Systems zum Durchführen mehrerer Elektrophoresetests, das dafür geeignet ist, die Ergebnisse der Elektrophoresetests an Ort und Stelle sichtbar zu machen und zu dokumentieren, und das gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert. Das System, das allgemein mit 100 bezeichnet ist, umfasst vorzugsweise ein Halter- oder Trägergehäuse 102 zum Tragen der Kassetten 10, 25, 125 oder 225, eine Stromversorgung 104 für das Erzeugen des Gleichstroms, der zum Anregen des Elektrophoresetrennungsprozesses benötigt wird, ein Kabel 105 zum Verbinden der Kassetten 10, 25, 125 und 225 mit der Stromversorgung 104 und eine ultraviolette (UV-)Lichtquelle 106 zum Bestrahlen der Kassetten 10, 25, 125 oder 225.
Der Halter 102 umfasst vorzugsweise zwei (nicht gezeigte) Kontaktpunkte, an die die Stäbe 24 und 26 der Kassette 10 oder die Streifen 21 und 23 der Kassetten 25, 125 oder 225 angeschlossen werden, um an sie das elektrische Feld anzulegen, das für die Elektrophoresetrennung benötigt wird.
Optional umfasst das System 100 auch ein zweites Kabel 107 zum Erzeugen des Stroms, der zum Erhitzen des leitfähigen Drahtes 240 benötigt wird, falls die Kassette 225 verwendet wird. Dementsprechend enthält der Halter 102 ein zusätzliches Paar Kontakte, an die die Kontakte 226 der Kassette 225 angeschlossen werden, um an sie den elektrischen Strom anzulegen, der zum Erhitzen des leitfähigen Drahtes 240 benötigt wird.
Ein weiteres optionales Merkmal des Systems 100 ist ein Mittel zum Kühlen der Kassetten 10, 25, 125, oder 225 während des Elektrophoresetests, wie zum Beispiel ein Strom gekühlten Gases, zum Beispiel flüssiger Stickstoff, was schematisch durch die Gasflasche 112 und den Schlauch 114 veranschaulicht ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das System 100 auch Mittel zum Dokumentieren der Ergebnisse der Elektrophoresetrennung. In der veranschaulichten Ausführungsform gehören dazu eine Kamera, vorzugsweise eine Videokamera 116, und ein Computer 119, der mit der Kamera 116 wirkverbunden ist und eine beliebige geeignete Anwendung zur Bildanalyse der Ergebnisse der Elektrophoresetrennung ausführt.
Es ist ein besonderes Merkmal des Systems 100, dass sowohl der Elektrophoresetest, die Sichtbarmachung der Ergebnisse des Elektrophoresetests als auch optional die Dokumentierung und die Analyse der Ergebnisse des Elektrophoresetests ausgeführt werden, wenn sich die Kassette an Ort und Stelle, d. h. im Halter 102, befindet.
Im Gegensatz zu den zum Stand der Technik gehörenden Elektrophoresesystemen für die Trennung von DNS-Molekülen, wo das Gel genommen und nach dem Test in einen UV-empfindlichen Marker, in der Regel Ethidiumbromid, getaucht wird, enthalten die Kassetten 10, 25, 125 und 225 vorzugsweise Ethidium-Kationen, wie oben beschrieben, um die Sichtbarmachung und somit die Dokumentierung und Analyse der Ergebnisse des Elektrophoresetests zu ermöglichen.
In der in 16 veranschaulichten Ausführungsform ist der Halter 102 eine eigenständige offene kastenartige Konstruktion, die eine Trägerfläche 108 enthält, auf der die Kassetten 10, 25, 125 oder 225 angeordnet werden. Alternativ kann er eine UV-durchlässige Bodenfläche enthalten.
Ein weiteres besonderes Merkmal des Systems 100 ist, dass im Vergleich zum Stand der Technik eine kleinere Anzahl von Operationen durch den Benutzer ausgeführt werden muss, um einen Elektrophoresetest unter Verwendung der Kassetten 10, 25, 125 oder 225 auszuführen. Diese Schritte für die Elektrophoresetrennung von DNS-Molekülen sind:

A. Eine Probe, welche die zu trennenden DNS-Moleküle enthält, wird in Mulden eingebracht.
B. Nur für die Kassetten 125 und 225 werden die Ampullen 116 und 134 zerbrochen.
C. Der elektrische Strom wird eingeschaltet.
D. Wenn es gewünscht wird, die Trennung zu beschleunigen, so wird auch ein gekühlter Gasstrom verwendete.
E. Als ein Ergebnis der Schritte A und C; A, B und C; A, C und D; oder A, B, C und D finden sowohl die Elektrophoresetrennung als auch die Wechselwirkung einer UV-detektierbaren Verbindung mit den getrennten DNS-Molekülen gleichzeitig statt.
F. Die UV-Lampe 106 wird eingeschaltet, um die Ergebnisse der Trennung sichtbar zu machen. Die Ergebnisse können auch mit der Videokamera 116 aufgezeichnet werden.
G. Die Ergebnisse können online zu dem Computer 119 für eine quantitative Echtzeitanalyse der Ergebnisse des Elektrophoresetests übertragen werden.
H. Der Benutzer entsorgt die Kassette 10.

Es versteht sich, dass die oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen lediglich beispielhaft beschrieben sind und dass zahlreiche Modifikationen daran vorgenommen werden können, die alle in den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung fallen. Zum Beispiel kann jede der Kassetten der vorliegenden Erfindung eine Kombination der Ionenaustauschmatrix, die auf einer Seite des Gels 18 angeordnet ist, und des geschlossenen Reservoirs, das am anderen Ende des Gels 18 angeordnet ist, enthalten. Ein weiteres Beispiel, das in den Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung fällt, ist eine zweidimensionale Kassette, in der die Ionenquellen auf allen vier Seiten des Gels 18 angeordnet sind.
Dem Fachmann ist klar, dass die vorliegende Erfindung nicht auf das beschränkt ist, was oben im Einzelnen gezeigt und beschrieben wurde. Vielmehr wird der Geltungsbereich der vorliegenden Erfindung allein durch die folgenden Ansprüche definiert.

Claims

Eine im Wesentlichen geschlossene Kassette für das Durchführen von Elektrophorese darin, wobei die Kassette folgendes umfasst: ein Gehäuse, das zumindest Boden-(12) und Seitenwände (14) aufweist, die eine Kammer (11) definieren, wobei diese Kammer in Kontakt zwischen diesen Folgendes umfasst: einen Grundkörper mit Trenngel (11) für das Durchführen dieser Elektrophorese darin, der einen oder mehr als einen Well (36) umfasst; zumindest eine Ionenquelle (20, 22) für das Bereitstellen von Ionen für das Durchführen dieser Elektrophorese, wobei diese zumindest eine Ionenquelle ein Volumen kleiner als das Volumen des Grundkörpers mit Trenngel aufweist, und Elektroden (24, 26) für das Verbinden dieser Kammer mit einer externen Stromquelle, um das Durchführen dieser Elektrophorese zu ermöglichen; und eine Abdeckung (16), welche diese Kammer schließt, um die im Wesentlichen geschlossene Kassette bereitzustellen, wobei diese Abdeckung oder diese Kammer zumindest eine Öffnung (38) über diesen einen oder mehr als einen Well (36) umfasst.
Eine Kassette gemäß Anspruch 1, wobei diese zumindest eine Ionenquelle (20, 22) einen Körper von Ionenaustauscher-Matrix umfasst.
Eine Kassette gemäß Anspruch 2, wobei dieser Körper von Ionenaustauscher-Matrix folgendes umfasst: einen Körper von Anionenaustauscher-Matrix für das Bereitstellen der Anionen für das Durchführen dieser Elektrophorese.
Eine Kassette gemäß Anspruch 3, wobei dieser Körper von Anionenaustauscher-Matrix an einem Ende dieses Grundkörpers mit Gel angebracht ist.
Eine Kassette gemäß Anspruch 2, wobei dieser zumindest eine Körper von Ionenaustauscher-Matrix einen Körper von Kationenaustauscher-Matrix für das Bereitstellen der Kationen für das Durchführen dieser Elektrophorese umfasst.
Eine Kassette gemäß Anspruch 5, wobei dieser Körper von Kationenaustauscher-Matrix an einem Ende dieses Grundkörpers mit Gel angebracht ist.
Eine Kassette gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei zumindest ein Element aus der Kammer oder der Abdeckung für ultraviolette Strahlung durchlässig ist.
Eine Kassette gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, die ferner eine Kammstruktur (40), die in diese zumindest eine Öffnung (38) eingeführt ist, umfasst.
Eine Kassette gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei diese Kassette im Wesentlichen flach ist.
Eine Kassette gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei dieser Grundkörper mit Gel zwischen zwei Räumen, die eine Pufferlösung umfassen, angebracht ist.
Eine Kassette gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei diese Kassette zumindest ein Leervolumen (28, 30) umfasst.
Eine Kassette gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei diese Abdeckung (16) zumindest ein Belüftungsloch (32) umfasst, das vor diesem Elektrophoresetest geschlossen ist und unmittelbar vor diesem Elektrophoresetest geöffnet wird.
Eine Kassette gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei diese Kassette eine äußere Länge, Breite und Höhe von jeweils 100 mm, 80 mm und 6 mm aufweist.
Eine Kassette gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei es sich dabei um eine Einwegvorrichtung handelt.
Eine Kassette gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, wobei dieses Gel Agarose oder Acrylamid umfasst.
Eine Kassette gemäß Anspruch 1, wobei diese Abdeckung (16) geöffnet werden kann.
Eine Kassette gemäß Anspruch 1, wobei diese Kassette eine oder mehr als eine chemische Verbindung für das Ermöglichen von Visualisierung von DNA, RNA oder Proteinmolekülen während der Verwendung derselben umfasst.
Eine Kassette gemäß Anspruch 17, wobei diese Kassette eine oder mehr als eine chemische Verbindung für das Ermöglichen von Visualisierung von DNA oder RNA während der Verwendung derselben umfasst.
Eine Kassette gemäß Anspruch 1, wobei diese Abdeckung oder diese Kammer zumindest zwei Öffnungen (38) über zwei oder mehr als zwei Wells (36) umfasst.
Eine Kassette gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dieser zumindest einen Ionenquelle um einen Kathodenpuffer handelt.
Eine Kassette gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dieser zumindest einen Ionenquelle um einen Anodenpuffer handelt.
Eine Kassette gemäß Anspruch 1, wobei diese Kassette ein Leervolumen in Nähe der Kathode umfasst.
Eine Kassette gemäß Anspruch 22, wobei diese Abdeckung ein Belüftungsloch oberhalb dieses Leervolumens in Nähe der Kathode umfasst.
Eine Kassette gemäß Anspruch 1, wobei dieses Gel DNA, RNA oder Protein umfasst.
Eine Kassette gemäß Anspruch 1, wobei dieses Gel DNA oder RNA umfasst.
Eine Kassette gemäß Anspruch 1, wobei dieses Gel DNA umfasst.
Ein Elektrophorese-Verfahren, das die folgenden Schritte umfasst: Einbringen einer Testprobe in einen Grundkörper mit Trenngel (18) über zumindest eine Öffnung (38) in einer Abdeckung (16) einer im Wesentlichen geschlossenen Kassette (10), wobei die Kassette diesen Grundkörper mit Trenngel (18) und zumindest eine Ionnenquelle (20, 22), das ein Volumen kleiner als das Volumen dieses Grundkörpers von Trenngel aufweist, umfasst; Anlegen eines elektrischen Felds bei diesem Gel; und Durchführen von Elektrophorese durch Bereitstellen von Ionen, die für das Durchführen dieser Elektrophorese erforderlich sind, durch zumindest eine Ionenquelle innerhalb dieser im Wesentlichen geschlossenen Kassette.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei es sich bei dieser Kassette um eine Einwegvorrichtung handelt.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 27 oder 28, wobei zumindest ein Element aus der Kammer oder Abdeckung für ultraviolette Strahlung durchlässig ist.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 27 bis 29, wobei dieses Verfahren ferner das Öffnen eines Belüftungslochs in dieser Abdeckung dieser Kassette vor dem Anlegen eines elektrischen Felds bei diesem Gel umfasst.
Ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 27 bis 30, wobei es sich bei dem Einbringen einer Testprobe in diesen Grundkörper mit Gel um das Einbringen einer Testprobe durch diese zumindest eine Öffnung in einen oder mehr als einen Well dieses Grundkörpers mit Gel handelt.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei dieses Verfahren ferner das Entfernen einer Kammstruktur (40), die in diese zumindest eine Öffnung vor diesem Einbringen einer Testprobe in diesen Grundkörper mit Gel eingeführt wurde, umfasst.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 27, welches das Einbringen einer Testprobe, die DNA, RNA oder Protein umfasst, in diesen Grundkörper mit Gel umfasst.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 27, welches das Einbringen einer Testprobe, die DNA oder RNA umfasst, umfasst.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 27, welches das Einbringen einer Testprobe, die DNA umfasst, in diesen Grundkörper mit Gel umfasst.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 28, wobei diese Kassette eine oder mehr als eine chemische Verbindung für das Ermöglichen von Visualisierung von DNA, RNA oder Proteinmolekülen umfasst.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 36, wobei diese Kassette eine oder mehr als eine chemische Verbindung für das Ermöglichen von Visualisierung von DNA oder RNA umfasst.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 27, welches das Durchführen von Elektrophorese durch das Bereitstellen von Ionen, die für das Durchführen dieser Elektrophorese erforderlich sind, durch einen Anodenpuffer, der ein Volumen kleiner als das Volumen dieses Grundkörpers mit Gel aufweist, umfasst.
Ein Verfahren gemäß Anspruch 27, welches das Durchführen von Elektrophorese durch Bereitstellen von Ionen, die für das Durchführen dieser Elektrophorese erforderlich sind, durch einen Kathodenpuffer, der ein Volumen kleiner als das Volumen von diesem Grundkörper mit Gel aufweist, umfasst.
Ein Elektrophorese-System (100), das folgendes umfasst: eine Kassette gemäß einem der Ansprüche 1 bis 26; und eine Halterung (102) für diese Kassette, wobei diese Halterung Kontaktpunkte für diese Elektroden umfasst.
Das System gemäß Anspruch 40, wobei diese Kassette chemische Verbindungen für das Ermöglichen von Visualisierung von DNA, RNA oder Proteinmolekülen umfasst, bevorzugt erfolgt die Visualisierung der Ergebnisse der elektrophoretischen Trennung in situ.
Das System gemäß einem der Ansprüche 40 oder 41, das ferner Mittel für das Dokumentieren von Ergebnissen von elektrophoretischer Trennung umfasst.
Das System gemäß einem der Ansprüche 40 bis 42, wobei dieses Mittel für das Dokumentieren von Ergebnissen von elektrophoretischer Trennung eine Kamera (116) und einen damit operativ verbundenen Computer (119) umfasst, ☐ wobei dieser Computer in der Lage ist, jede beliebige geeignete Anwendung zur Bildanalyse auszuführen und bevorzugt erfolgt das Dokumentieren und Analysieren der Ergebnisse der elektrophoretischen Trennung in situ.
Das System gemäß Anspruch 40, das ferner Folgendes umfasst: eine Stromquelle (104) oder Mittel für das Kühlen dieser Kassette.
Das System gemäß Anspruch 40, wobei zumindest eine Wand dieser Kassette für ultraviolette Strahlung durchlässig ist und das bevorzugt ferner eine Quelle von ultraviolettem Licht (106) umfasst.