SE452853B - Sett att tillfora buffertlosningar vid elektroforetisk separation - Google Patents

Description

452 853 _ 2 _ elektroforesen, trots de reaktioner som sker vid respektive elektrod. De viktigaste faktorerna som bestämmer buffert- kapaciteten är valet av buffertkomponenter, koncentrationen av dessa samt buffertlösningens volym.

Traditionellt genomföres elektroforesen som nämnts med utrustningar som har speciella bufferttankar, vilka fylls med önskad volym av respektive buffert. Det är emellertid svårt att använda lösningar med hög koncentration vid vissa applikationer p g a de vätskeströmningar som uppstår genom kapillärkrafterna bl a i kanterna på gelmatrisen. Genom att hålla en låg elektrodbuffertkoncentration kan man undvika störningar eller rent av kortslutning i separationsgelens elektriska fält på grund av sådan vätskeströmning. Låg elektrodbuffertkoncentration kan kompenseras genom en ökning av buffertvolymen vilket emellertid förutsätter att elektro- foresutrustningen har tillräckligt stora buffertkärl.

Speciellt i sådana system där man arbetar med förhållandevis små gelmatriser, t ex i mer eller mindre automatiserade system, innebär hanteringen av buffertlösningar praktiska pproblem och det föreligger ett behov av att minska hante- ringen av vätskevolymer så mycket som möjligt.

I US37l5295 har man identifierat detta problem och föreslår att bufferten blandas med någon substans som gör att man får bufferten i "halvfast" form. En föredragen utföringsform innebär att bufferten inkorporeras i silikapartiklar var- efter en halvfast substans tillföres. Oberoende av vilken "halvfast" form som väljes, överföres en lämplig volym av denna till en fördjupning i vardera ändan av elektrofores- utrustningens stödplatta varefter separationsgelen placeras på plattan så att det blir direkt vätskekontakt mellan separationsgel och buffert. Det skall observeras att ut- rustningen i detta fall, liksom ovan nämnts, kräver sär- skilda buffertbehållare. Huvudsakliga skillnaden jämfört med det normala förfarandet är att bufferten ej utgöres av en lösning. Värt att notera i sammanhanget är att, trots att detta patent publicerades redan 1973, har metoden ej kommit att utnyttjas i någon väsentlig grad. 452 853 Vi har nu funnit att ett betydligt förenklat förfarande uppnås om buffertsubstansen inkorporeras i ett gelmaterial, som placeras i kontakt med separationsmatrisen vid respek- tive ände, varefter elektroderna av traditionell typ anslu- tes till buffertgelerna. Speciellt fördelaktigt är förfaran- det vid horisontell elektrofores då den nya tekniken möjlig- gör att en buffertreservoar i form av ett gelstycke helt enkelt placeras ovanpå separationsmatrisen vid respektive ände. Provet sättes därefter på separationsgelen, och sedan det elektriska fältet lagts på, vandrar provkomponenterna i detta, i det utrymme av separationsgelen som avgränsas genom de två buffertgelerna. Analogt kan buffertgelerna användas även vid andra typer av elektrofores genom att de bringas i kontakt med motstående ändar av matrisen.

Till fördelarna med tekniken enligt föreliggande uppfinning hör att elektroforesutrustningen ej behöver innehålla kärl för flytande eller halvfast elektrodbuffert, vilket gör utrustningen enklare och vidare att de buffertgeler som används vid utövandet av uppfinningen är synnerligen enkla att handskas med, dvs att de har en god mekanisk häll- fasthet. Genom att elektrodbufferten är ingjuten i "fast" gel förekommer ingen vätsketransport p g a kapillärkraf- terna. Detta gör det möjligt att använda betydligt högre koncentrationer av elektrodbuffert än vad som annars skulle vara möjligt, vilket medför att buffertvolymen kan hållas låg. En annan fördel med "fast" gelbuffert är att elektrod- reaktionernas produkter hindras att nå separationsgelen där de skulle kunna tänkas påverka resultatet. Vid elektrodreak- tionerna förändras buffertsammansättningen nära elektrodytan och under elektroforesens gång förändras buffertlösningen allt längre ut från elektrodytan. I Fig l àskádliggörs detta förlopp under en elektroforetisk separation. (l) är separationsmatrisen i form av en gelplatta. De två elektrodbuffertinnehállande gelerna (2) och (3) är placerade i kontakt med separationsmatrisen vid två motsatta ändar av 452 855 denna. De två elektroderna (4) och (5) har direktkontakt med buffertgelerna (2) respektive (3). Den elektroforetiska separationen påbörjas när ett elektriskt fält appliceras mellan elektroderna och den förändring i elektrodbuffertarnas sammansättning (skuggat omrâde) som sker på grund av elektrod- reaktionerna åskådliggörs i fig 1 a-c, vilka visar status vid 0,25 respektive 100 % av totala elektroforestiden.

Gelmaterialet för användning som stabilisator för elektrod- bufferten väljes ur den stora grupp av i och för sig kända, och åtminstone vid rumstemperatur, vattenolösliga polymerer, vilka skall uppfylla kriteriet att ha låg egenladdning.

Detta är en förutsättning för att gelmatrisen ej skall fungera som en s k elektroendosmotisk pump. Exempel på lämpliga material är naturligtvis de agaroskvalitêer som utvecklats speciellt för elektroforetiska tillämpningar och vilka uppfyller nämnda kriterium, t ex Agaros IEF (Pharmacia AB, Uppsala, Sverige). Koncentrationen av agaros i den komposi- tion som utgöres av buffertinnehållande vattenhaltig gel ligger lämpligen i intervallet 1 - 4 viktsprocent, förse trädesvis omkring 2 %. Andra material som ligger nära till hands att använda är polyakrylamid med en halt av omkring 10 % och en tvärbindningsgrad som ligger i intervallet 2 - 7 %.

De buffertar som inkorporeras i gelmaterialet är sådana som normalt användes vid elektroforetisk separation. Exempel på sådana lösningar är t ex en blandning av trishydroxymetyl- aminometan (TRIS), glycin och saltsyra; alanin; ättiksyra; och olika natriumfosfater med tillsats av natriumdodecyl- sulfat (SDS). Lämpliga koncentrationer av de ovan nämnda liksom ytterligare exempel återfinnes i Polyacrylamide Gel Electrophoresis, Laboratory Techniques (Pharmacia AB, Uppsala. Sverige). Innehållet av elektrodbuffert i respek- tive gelstycke ligger vanligen i intervallet 80 - 99 vikts- procent.

“NSU-W 452 ess En övre gräns för koncentrationen av buffertkomponenter i gelmaterialet ges av mättnadsgränser i vattenlösning för dessa komponenter, samt av att det i vissa fall sker oëpskade reaktioner som t ex utsaltning av gelmatrisen.

Detta sker i fallet agaros vid hög koncentration av buffertsalter. En undre gräns för koncentrationen av buffertkomponenter i gelmaterialet kan bestämmas genom metodologiska studier, t ex mätning av pH i bufferten vilket visar när dess buffertkapacitet ej längre räcker till. Dessa gränser för olika kombinationer av gelmaterial och buffertkomponenter kan fackmannamässigt utprovas i varje enskilt fall. _ExemEel l En buffertlösning för nativ gradientgel elektrofores be- reddes genom att 15 gram trishydroxymetylaminometan (TRIS) och 65 gram alanin löstes i 500 ml vatten. 10 gram agaros tillsattes och bufferten kokades under omrörning tills agarosen löst sig. Lösningen fylldes på formar med måtten 40 x 10 x 6 mm och ställdes att svalna. Sedan gelbufferten stelnat blir den med denna dimension lämplig att applicera på separationsgeler med ungefärliga dimensionen 40 x 40 x 0,3 mm som exempelvis innehåller en 0,026 M TRIS-, 0,033 M ättiksyra-buffert.

Exemgel 2 En buffertlösning för SDS gradientgel elektrofores bereddes genom att 12,1 gram trishydroxymetylaminometan (TRIS), 17,9 gram tricin och 2,8 gram natriumdodecylsulfat (SDS) löstes i 500 ml vatten. 10 gram agaros tillsattes och bufferten kokades under omrörning tills agarosen löst sig.

Lösningen fylldes på formar med måtten 40 x 10 x 6 mm och ställdes att svalna. Sedan gelbufferten svalnat är den färdig för applicering på separationsgeler med dimensioner enl ovan.

Claims (1)

1. 452 -855 6 PATENTKRAV Sätt att tillföra buffertlösningar vid horisøñtell elektroforetisk separation i en stödmatris i form av en a v att de båda, eventuellt olika och från separationsbufferten skilda, gelplatta k ä n n e t e c k n a t elektrodbuffertarna är inkorporerade i var sitt gel- stycke som placeras i kontakt med stödmatrisen på sådant sätt att matrisen mellan gelstyckena utgör det tillgängliga separationsomrâdet. Sätt enligt krav 1 k ä n n e t e c k n a t a v att gelstyckena består av agaros eller polyakrylamid. Förfarande enligt krav 2 k ä n n e t e c k n a t a v att innehållet av elektrodbuffert i respektive gelstycke ligger i intervallet 80 - 99 viktsprocent.