CN107075441A - 诊断血红蛋白病症和监测血细胞的生物芯片 - Google Patents

诊断血红蛋白病症和监测血细胞的生物芯片 Download PDF

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Abstract

与具有极小血液样本体积兼容的生物芯片用于检测血红蛋白病症且以临床上有意义的方式监测与异常血细胞变形和粘附相关的疾病，包括疾病严重性，即将来临的疼痛危象，治疗反应和治疗效果。

Description

诊断血红蛋白病症和监测血细胞的生物芯片
相关申请
本申请要求于2014年7月30日提交的美国临时专利申请第62/030,964号的优先权，其主题通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及生物芯片，并且特别地涉及快速和容易地诊断或识别血红蛋白病症的生物芯片，所述血红蛋白病症例如血红蛋白病(例如，镰状细胞病(SCD))，以及基于血细胞分析监测患者健康和疾病进展的生物芯片。
背景技术
根据疾病控制和预防中心的数据，全世界约有300万人患有镰状细胞病(SCD)，主要在非洲、印度和中东地区，在美国估计有100,000人受影响。SCD影响在美国出生的375名非裔美国新生儿中的1名。“U.S.Preventive Services Task Force.Screening forHemoglobinopathies(美国预防服务工作队。筛查血红蛋白病)”。参见：Guide to ClinicalPreventive Services，第二版。第二版，International Medical Publishing(国际医学出版社)；485-494(1996)。
世界卫生组织(WHO)已宣布SCD是公共卫生优先事项[1-3]。SCD的最大负担是在低收入国家，特别是在非洲。由于缺乏诊断，估计在非洲出生的患有SCD的婴儿中有50-80％死于5岁以前(即每天有600多名婴儿死亡)[2,4]。因为运行传统测试所需的高成本和技能水平，在非洲很少有婴儿进行筛查[5]。目前的方法成本太高，需要花费太多时间(2-6周)来实现公平和及时的诊断以挽救生命[5]。据世界卫生组织估计，70％的SCD相关死亡可通过简单、成本效益高的干预措施预防，如早期的即时(POC)诊断，新生儿筛查，然后治疗和护理[6]。诊断屏障可以用低成本的POC工具打破，便于出生后立即早期检测[5]。
在非洲每天有超过800名患有SCD的儿童出生，由于缺乏诊断和早期治疗，其中一半以上死于儿童期。Modell等人，“Global epidemiology of hemoglobin disorders andderived service indicators”。Bulletin of the World Health Organization(世界卫生组织通报)，86：480-487(2008)；Makani等人，“Mortality in sickle cell anemia inAfrica：a prospective cohort study in Tanzania”PloS one 6：e14699(2011)；和McGann等人，“A prospective newborn screening and treatment program for sicklecell anemia in Luanda，Angola，American journal of hematology 88：984-989(2013)。在美国的全部50个州和哥伦比亚特区，强制进行新生儿的血红蛋白筛分从而早期诊断SCD，以便可以立即开始监测和治疗。参见：National Institutes of Health.The Management of Sickle Cell Disease 4th Ed.，NIH PublicationNo.02-2117NIH National Heart，Lung and Blood Institute(肺和血液研究所)(2002)。
通过新生儿筛查进行早期诊断，然后进行简单干预，大大降低了美国的SCD相关死亡率。然而，由于资源有限，这些策略在非洲和其他第三世界国家没有广泛提供。需要的是即时基于生物芯片的血红蛋白筛查方法。
发明概述
本文所述的实施方案涉及用于检测血红蛋白病症(例如镰状细胞病(SCD))的电泳生物芯片和系统。生物芯片包括壳体、第一缓冲端口和第二缓冲端口、样本加载端口以及第一电极和第二电极。壳体还包括从壳体的第一端延伸到第二端的微通道。微通道含有用碱性缓冲溶液至少部分饱和的醋酸纤维素纸。第一缓冲端口和第二缓冲端口分别通过壳体的第一端和第二端延伸到微通道和醋酸纤维素纸。第一缓冲端口和第二缓冲端口能够接收使醋酸纤维素纸至少部分饱和的碱性缓冲溶液。样本加载端口可以接收血液样本并且穿过壳体的第一端延伸到微通道和醋酸纤维素纸。第一电极和第二电极可以产生穿过纤维素乙酸酯纸的电场，有效地促进血液样本中的血红蛋白变体沿着醋酸纤维素纸的迁移。第一电极和第二电极可分别穿过第一缓冲端口和第二端口延伸到醋酸纤维素纸。
在一些实施方案中，外壳可以包括用于可视化醋酸纤维素纸和血红蛋白变体迁移的观察区域。电泳生物芯片可以进一步包括成像系统，用于对导入到样本装载端口中的血液样本显示和量化沿着醋酸纤维素纸的血红蛋白变体迁移。
第一电极和第二电极可以连接到电源。电源可以产生约1V至约400V的电场。在一些实施方案中，由电极施加到生物芯片的电压不超过250V。
在其它实施方案中，引入到样本加载端口中的血液样本可以小于约10微升。在一些实施方案中，缓冲溶液可以包括碱性tris/硼酸盐/EDTA缓冲溶液。第一电极和第二电极可以包括石墨电极或碳电极。
在一些实施方案中，壳体可以包括顶盖、底盖和介于顶盖和底盖之间的通道隔离件。通道间隔件可以在壳体中限定通道。顶盖、底盖和通道间隔件可以由玻璃或塑料中的至少一种形成。
在其他实施方案中，成像系统可以包括可视化和量化血红蛋白变体迁移的移动电话成像系统。移动电话成像系统可以包括用于对血红蛋白变体迁移进行成像的移动电话以及识别和量化血红蛋白带类型和厚度以做出诊断决定的软件应用。在一些实施方案中，血红蛋白带类型可以包括血红蛋白类型C/A，S，F和A0。
在其它实施方案中，电泳生物芯片可用于诊断受试者是否具有血红蛋白基因型HbAA，HbSS，HbSA和HbSC或HbA2。在其它实施方案中，电泳生物芯片可用于诊断受试者是否患有SCD或SCD的风险增加。
在一些实施方案中，电泳生物芯片可用于将来自受试者的血液样本引入样本装载口的方法中。血液样本包括至少一个血细胞。可以对醋酸纤维素纸施加电场，然后用成像系统对在醋酸纤维素纸中形成的血红蛋白带成像，以确定受试者的血红蛋白表型。血红蛋白表型可包括HbAA，HbSA，HbSS，HbSC或HbA2。
在一些实施方案中，HbAA血红蛋白表型诊断受试者为正常，HbSA血红蛋白表型诊断受试者具有镰状细胞性状，HbSS血红蛋白表型诊断受试者患有镰状细胞病，HbSC血红蛋白表型诊断受试者具有血红蛋白SC疾病，HbA2血红蛋白表型诊断受试者患有地中海贫血。
本文所述的其它实施方案涉及包括壳体的微流体生物芯片装置。壳体包括限定至少一个细胞粘附区域的至少一个微通道。所述至少一个细胞粘附区域涂覆有至少一种生物亲和配体，当含有细胞的流体通过所述至少一个微通道时，所述生物亲和配体粘附感兴趣的细胞。生物亲和配体可包括纤连蛋白、层粘连蛋白、选择蛋白、血管性血友病因子因子、血栓调节蛋白或C146抗体中的至少一种。该装置还包括成像系统，当流体通过通道时，成像系统测量粘附到至少一个微通道内的至少一个生物亲和配体的细胞的量。
在一些实施方案中，生物芯片装置可以对受试者的红细胞和白细胞的膜、细胞和粘附性质定量，以临床上有意义的方式监测疾病严重性，即将到来的疼痛危象，治疗响应和治疗有效性。
在一些实施方案中，壳体可以包括多个微通道。每个微通道可以包括涂覆有至少一种生物亲和配体的单独的细胞粘附区域。在其他实施方案中，至少两个或至少三个微通道可以包括不同的生物亲和配体。在其他实施方案中，多个微通道可以包括相同的生物亲和配体。
在一些实施方案中，至少一个微通道可以包括涂覆在微通道的细胞粘附区域上的至少两种不同的生物亲和配体。不同的生物亲和配体可以位于至少一个微通道的细胞粘附区域内的不同位置。例如，层粘连蛋白、选择蛋白、血管性血友病因子、血栓调节蛋白和C146抗体中的至少一种位于沿着至少一个微通道的不同位置。
在一些实施方案中，壳体是由基底层、中间层和覆盖层形成的多层结构，所述至少一个微通道可以形成在中间层中。壳体可以包括分别与每个微通道的第一端和第二端流体连通的入口端口和出口端口。至少一个微通道的尺寸设计成接受微升或毫升体积的血液或含有待粘附细胞的溶液。
在一些实施方案中，成像系统是无透镜成像系统。例如，无透镜成像系统可以是电荷耦合器件传感器和发光二极管。
在其他实施方案中，细胞是从受试者获得的血细胞，并且成像系统可以量化每个相应通道中的粘附细胞以监测从其获得细胞的受试者的健康。在其他实施方案中，成像系统可以量化每个相应通道中粘附的细胞，以监测从其获得细胞的受试者的疾病(例如镰状细胞病)的进展。在其它实施方案中，成像系统可以量化每个通道中粘附的细胞，以测量施用于从其获得细胞的受试者的治疗性治疗的功效。
在一些实施方案中，微流体生物芯片装置可用于这样的方法中，其中将包含来自受试者的至少一个血细胞的血液样本引入微通道中，并且将粘附于至少一个微通道内的所述至少一个生物亲和配体的细胞量成像。生物芯片装置可以对受试者的红细胞和白细胞的膜、细胞和粘附性质定量，以临床有意义的方式监测疾病严重性，即将到来的疼痛危象，治疗反映和治疗有效性。
附图说明
图1(A-E)示出了用于诊断血红蛋白病症(包括镰状细胞病和地中海贫血)的HemeChip。(A)HemeChip由包含单条醋酸纤维素纸(4)的PMMA(1-3,5-6)的多层层压制成。(B)HemeChip有一个紧凑的设计(5厘米x2厘米x 0.6厘米)，可以携带在口袋里。(C)说明所有可能的血红蛋白类型的分离：正常血红蛋白(Hb A0)，胎儿血红蛋白(Hb F)，镰状血红蛋白(Hb S)和血红蛋白C(Hb C)或A2。(D)通过在阳极(+)和阴极(-)之间通过石墨电极产生的施加电场，在HemeChip中发生血红蛋白分离。(E)示出了HemeChip原型，其具有被分离成血红蛋白带的微小量的血液样本。
图2(A-B)示出了显示微流体凝胶电泳试验的时间流逝的图像。(A)来自所执行的HemeChip测试的时间推移图像，i)在加入血液但没有施加电流的情况下开始测试，ii)在施加电流4分钟后的血液样本，iii)在施加电流8分钟后的血液样本。电流已停止，样本处于最终位置。(B)具有侧视图的A的过程的图示，i)在加入血液但没有施加电流的情况下开始测试，ii)在施加电流4分钟后的血液样本，iii)在施加电流8分钟后的血液样本。电流已停止，样本处于最终位置。
图3(A-B)说明使用HemeChip进行具有不同血红蛋白组成的血液样本中的血红蛋白类型的鉴定和定量。示出了(A)SS样本，具有胎儿血红蛋白(HPFH)的遗传性持续性的SCD，和(B)SA样本，镰状细胞性状(SCT)。(i)HemeChip中形成的血红蛋白带(用丽春红染色)识别C/A2，S，F和A0血红蛋白。(ii)通过HemeChip长度测量和平均化的每个像素的强度揭示了识别血红蛋白类型A0和S的强度峰。通过计算每种血红蛋白类型的强度峰下的面积(AU代表任意单位)来量化Hb量。(iii)通过图像处理获得的血红蛋白带像素强度的3D表面轮廓。(iv)比较使用HemeChip，HPLC和台式电泳测得的血红蛋白百分比。
图4(A-F)示出了HemeChip血红蛋白定量与HPLC标准的比较。(A-E)用于比较HPLC与HemeChip血红蛋白定量效力的相关绘图示出了对于个体和所有血红蛋白类型Hb C/A2，HbS，Hb F和Hb A0的高正相关(PCC>0.96，p<0.001)。(E)数据集由总共12个不同的患者血液样本(2xSS，1x SS HPFH，1x脐带血(Cord Blood)，3x SC，5x SA)和43个单独实验组成。(F)Bland-Altman绘图显示估计和实际％HbS之间的强一致性(SD差异＝7％HbS)(实线＝均差；虚线＝2SD差异)。实际和估计的HbS之间的大部分差异(95.5％)在差异的均值的2个标准差内。血红蛋白类型由点颜色指示。
图5(A-B)示出了每个血红蛋白带行进的距离。(A)在设定条件(250V，1-2mA，8分钟)下每个血红蛋白带从应用点行进的距离(mm)。这些距离将用于标记HemeChip，用于识别每种血红蛋白类型的分离和存在，用于整体诊断。数据集由11个不同的患者血液样本(3x SS，2xSS HPFH，2x Cord Blood，2x SC，2x SA)和32个实验组成，其产生多个血红蛋白带(20x HbC/A2，28x Hb S，11x Hb F和7x Hb A0)。每个血红蛋白组的单独水平线表示数据集的均值。血红蛋白组之间的水平线表示基于单因素方差分析(ANOVA)测试的统计学显著差异(p<0.001)。(B)接受者操作特性(ROC)曲线显示了基于距样本施加点的行进距离来区分相邻血红蛋白带之间的灵敏度和特异性。示出了定义的带行进距离阈值(o＝7.5mm，Δ＝10.0mm，□＝12.5mm)。对于定义的阈值，ROC曲线显示用于血红蛋白类型的识别的超过0.89的灵敏度和0.86特异性。
图6(A-C)示出了另外的样本分析以及与标准方法的比较。曲线图(ii)的阴影红色区域表示为血红蛋白定量所选择的区域。(A)具有血红蛋白SC病(HbSC)的样本。(B)具有高HbF水平的脐带血。(C)具有低水平的HbS和高水平的HbA0的SCT(HbSA)的样本。
图7示出基于web的图像处理数据流和结果比较。
图8(A-B)示出了评估细胞、膜和粘附(CMA)相互作用的微流体生物芯片。(A)示出了SCD中细胞和亚细胞组分之间潜在相互作用的子集。异常相互作用可以发生在如下之中：i)含有HbS的氧化的RBC；ii)可溶性桥连蛋白(即，例如血小板反应蛋白(TSP)和/或血管性血友病因子(vWF))；iii)细胞因子和/或白细胞(例如，CD11b+单核细胞)；iv)包含分子的活化的内皮细胞，包括但不限于整联蛋白、整联蛋白受体、粘附分子和选择蛋白；iv)内皮下基质组分，包括但不限于TSP、vWF、纤连蛋白和层粘连蛋白；和iv)活化的WBC(MAC-1+，LFA-1+，VLA-4+嗜中性粒细胞)，它们也直接粘附于内皮。(B)SCD微流体生物芯片的一个实施方案的示意图。插图：包含填充有用于分析的外周血样本的微流体通道的生物芯片的照片。
图9(A-C)示出用于评估生理流动条件下红细胞(RBC)粘附和变形性的SCD微流体生物芯片系统的概述。(A)包含可以询问未加工的全血的50μm高通道的微流体生物芯片。将微流体生物芯片置于自动化显微镜载物台上，用于单个RBC的高分辨率图像记录和分析。(B)在微流体生物芯片中在3D层流速度分布的存在下，纤连蛋白官能化表面上流动和粘附的RBC的图示。(C)示例性数据显示在微流体通道中观察到的粘附的镰状RBC形态的异质性。来自相同血液样本的具有不同水平的镰状效应的RBC显示为：(i)轻度受影响的RBC，(ii)中度受影响的RBC，和(iii)高度受影响的RBC。比例尺表示5μm长度。
图10(A-C)示出了在无流动，流动和分离条件下呈现健康(含HbA)和镰状RBC(含HbS的可变形和非可变形的)的纵横比(AR)和变形性的示例性数据。(A)显示了无流动，流动和分离条件下的健康的和镰状RBC。在每个柱下面记录导致RBC在不同实验组中分离的流速。白色虚线表示在无流动条件下RBC的初始位置。流向用箭头表示。比例尺表示5μm长度。在图像的左下方提供每个帧中的细胞的纵横比(AR)。(B)在无流动，流动和脱离条件下测量不同RBC组的细胞AR。虽然HbA细胞呈现从无流动到分离的AR的连续减少，HbS非可变形的细胞在分离的整个过程中保存它们的初始AR。(C)健康和镰状RBC的变形性(例如，相对于无流动条件的％细胞AR变化)。HbA和HbS可变形RBC的变形性从流动到分离显著增加，而HbS非可变形RBC保持相同。
图11(A-E)示出了与含有HbA和HbS的可变形RBC相比，在相对较高的流速、剪切应力和阻力下含HbS的非可变形RBC分离的示例性数据。(A)使用倒相显微镜在相差模式下记录流动期间RBC的连续图像。粘附的和自由流动的RBC都显示在图像分析中。(B)示出了微通道内局部测量的流速和计算的平均流速之间的相关性(Pearson相关系数为0.94，p<0.001)。(C)在微通道中粘附的HbA，HbS非可变形和HbS可变形RBC相对于通道宽度(x轴)和在分离时刻的平均局部流速(虚线)的相对位置。HbS非可变形RBCs在流速方面与HbA和HbS可变形RBC显著不同。(D)HbA，HbS非可变形和HbS可变形RBC在分离时的剪切应力的相对差异。(E)在分离时HbA，HbS非可变形和HbS可变形RBC之间的阻力的相对差异。
图12(A-L)示出了示例性数据，其显示了基于对含有HbA和HbS的RBC的流动起始时的投影细胞轮廓的分析来确定细胞粘附位点。投影在0.28秒内进行的三个连续帧中的个体RBC的轮廓以反映响应于流体流动的起始的细胞的运动：(A-D)含有HbA的RBC；(E-H)含HbS的可变形RBC；和(I-L)含HbS的非可变形RBC。
图13(A-D)示出了SCD生物芯片(SCD-Biochip)的开发步骤的概述。(A)来自免疫球蛋白超家族(IgSF)BCAM/LU和整联蛋白家族(α4β1)的粘附受体被靶向用于粘附到内皮和亚内皮相关蛋白，FN和LN。(B)FN和LN通过交联剂(GMBS)和自组装硅烷单层涂层(APTES)共价连接到载玻片上。(C)SCD生物芯片的组装，由聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)盖构成，具有微加工入口和出口，限定通道形状和高度的双面粘合剂(DSA)层，以及玻璃载玻片基底组成的。(D)放置在用于活细胞成像的显微镜载物台上的SCD-Biochip。
图14(A-F)示出了SCD血红蛋白表型中FN和LN官能化微通道中RBC粘附的变化的示例性数据。(A-B)FN或LN中的微通道的高分辨率图像。(C-D)在FN和LN固定微通道中，具有HbSS>HbSC/Sβ+>HbAA的受试者的样本中粘附的RBC的数量显著更高。各组之间的水平线表示基于单因素ANOVA检验的统计学显著差异(P<0.05)。数据点交叉条表示均值。'N'表示受试者的数量。(EF)接受者操作特征(ROC)曲线显示用于基于RBCs对FN和LN的粘附进行SS-AA，SC-AA和SS-SC血红蛋白表型之间的区分的真阳性率(灵敏度)和假阳性率(1-特异性)。在ROC上粘附的RBC数量的定义阈值如图所示(对于FN，◇＝9，□＝9和o＝30；对于LN，◇＝16，□＝16，和o＝170)。与区分SS和SC相比，ROC在区分AA和SS或SC方面最强。
图15(A-B)示出与高(>％8)HbF相比，具有低(<％8)HbF的HbSS受试者中RBC的RBC粘附更大的示例性数据。(A-B)在具有高和低HbF水平的HbSS患者的血液样本中定量RBC粘附。与来自FN和LN固定微通道中具有高HbF水平的受试者的血液样本相比，来自具有低HbF水平的受试者的血液样本中粘附的RBC的数量显著更高。各组之间的水平线表示基于单因素ANOVA检验的统计学显著差异(P<0.05)。数据点交叉条表示均值，'n'表示受试者的数量。
图16(A-D)示出了HbSS中RBC粘附和乳酸脱氢酶(LDH)，血小板计数(plts)和网织红细胞计数(retics)之间的关联的示例性数据。(A-B)在具有(A)高LDH(>500U/L)和(B)高plts(>320×10 9/L)的血液样本中，FN微通道中粘附的RBC的数量显著更高。(C-D)与具有低LDH(<500U/L)与retics(<320 109/L)相比，具有(C)高LDH(>500u/L)和(D)retics(>320×109/L)的血液样本中的RBC显示出显著更高的对LN固定微通道的粘附性。各组之间的水平线表示基于单因素ANOVA检验的统计学显著差异(P<0.05)。数据点交叉条表示均值，'n'表示受试者的数量。
图17(A-G)示出了FN官能化微通道中粘附的RBC的异质性的示例性数据及其与血清LDH水平的关联。(A-C)在逐步增加的流速下在HbSS血液样本中分析粘附的RBC的数量和形态；(A)0.8mm/s，(B)3.3mm/s和(C)41.7mm/s。(D-E)基于形态学表征来确定可变形(具有特征双凹形状)和非可变形RBC(无特征双凹形状)。比例尺表示5μm的长度。(F)计算在0.8mm/s流速下的总粘附RBC的可变形RBC和非可变形RBC的百分比。在0.8mm/s流速下可变形RBC和非可变形RBC的百分比之间没有显著差异(P＝0.266)，然而，非可变形RBC的百分比显著高于在41.7mm/s的流速下可变形RBC的百分比。各组之间的水平线表示基于单因素ANOVA检验的统计学显著差异(P<0.05)。误差条表示均值的标准误差，“n”表示受试者的数量。(G)在0.8mm/s下粘附的非可变形RBC和LDH的百分比之间观察到统计学显著相关性(Pearson相关系数为0.79，n＝21个样本)。
发明详述
定义
为了便于理解本发明，下面定义了许多术语。本文定义的术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。诸如“一”，“一个”和“该”的术语不旨在仅指单数实体，而是指多个实体，并且还包括可以使用特定示例来说明的一般类别。本文中的术语用于描述本发明的具体实施方案，但是它们的用法不限制本发明，除非在权利要求中概述。
如本文所用的术语“微通道”是指通过允许液体和气体移动的介质(例如，硅)的途径。微通道因此可以连接其他部件，即保持部件“处于液体连通”。尽管不希望本发明受到通道的精确尺寸的限制，但是通道的示例性范围如下：通道的深度在0.35μm和100μm之间(优选50μm)，宽度在50μm和1000μm之间(优选400μm)。通道长度可以在4mm和100mm之间，或约27mm。“电泳通道”是基本上填充有帮助生物物质(例如全细胞，蛋白质，脂质，核酸等)的差异迁移的材料(例如琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶，醋酸纤维素纸))的通道。特别地，电泳通道可以基于其各自的血红蛋白含量的突变而帮助血细胞的差异迁移。
如本文所使用的术语“微制作”，“微机械加工”和/或“微制造”是指在小规模(例如，其中部件具有微米尺寸维度)或微尺度上构建、构造、组装或形成装置。在一个实施方案中，电泳装置是在大约毫米至厘米尺寸范围内的微制作(“微制作电泳装置”)。
术语“琼脂糖凝胶”，“聚丙烯酰胺凝胶”和“醋酸纤维素”是本领域技术人员理解的术语，是指抑制进行电泳的流体相的对流混合并且有助于分子筛的介质。例如，聚丙烯酰胺凝胶可以是交联的或非交联的。术语“交联”是指聚合物(例如，聚丙烯酰胺)的链彼此连接，使得作为网络的聚合物变得更强并且更耐溶解，并且当用于电泳时允许更好地分离样本组分。双丙烯酰胺是用于聚丙烯酰胺电泳中的交联剂的实例。
术语“聚合物”是指由两种或更多种相同物质的分子形成的物质。聚合物的实例是凝胶、交联凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。聚合物还可以是线性聚合物。在线性聚合物中，分子主要以彼此平行或几乎平行的链排列。在非线性聚合物中，不要求分子的平行排列。
本文所用的术语“微电泳装置”是指用于执行电泳的小(例如，微米尺寸部件)型装置。在一个实施方案中，预期微电泳装置包含约4000μm或更小(宽)×2000μm或更小(深度)的电泳通道。
本文所用的术语“电极”是指电流通过其进入或离开例如电泳凝胶或其它介质的电导体。
本文所使用的术语“通道间隔件”是指能够支持光刻蚀刻的固体基材。通道间隔件可以包括一个或多个微通道，并且分别使用在顶盖和底盖之间的双重粘合剂膜与外部环境密封。
本文所使用的术语“无透镜成像系统”是指基于与光波相对的电子信号收集图像的光学配置。例如，可以通过由来自发光二极管的发射激发电荷耦合器件传感器(CCD)来形成无透镜图像。
本文所使用的术语“电荷耦合器件(CCD)”是指用于使电荷通常从器件内移动到可以操纵电荷的区域(例如，转换为数字值)的器件。当使用其中像素由p掺杂MOS电容器表示的CCD图像传感器时，CCD提供数字成像。
如本文所使用的术语“怀疑具有”是指由患者展现的不足以提供鉴别诊断的医学状况或一组医学状况(例如，初步症状)。尽管如此，展示的状况将证明应进一步测试(例如，自身抗体测试)以获得进一步的诊断基础的信息。
如本文所使用的术语“处于风险中”是指由患者展现的可能使患者易患特定疾病或病痛的医学状况或一组医学状况。例如，这些状况可以由包括但不限于行为、情绪、化学、生化或环境影响的影响产生。
如本文所使用的术语“症状”是指由患者观察到的疾病或身体干扰的任何主观或客观证据。例如，主观证据通常基于患者自我报告，并且可以包括但不限于疼痛、头痛、视觉障碍、恶心和/或呕吐。或者，客观证据通常是医学测试的结果，包括但不限于体温、全血细胞计数、脂质组、甲状腺组、血压、心率、心电图、组织和/或身体成像扫描。
本文所用的术语“疾病”或“医学状况”是指中断或改变生命功能的性能的活的动物或植物体或其部分之一的正常状态的任何损伤。通常表现为区别的体征和症状，通常是对以下的反应：i)环境因素(作为营养不良，工业危害或气候)；ii)特异性感染剂(如蠕虫，细菌或病毒)；iii)生物体的固有缺陷(作为遗传异常)；和/或iv)这些因素的组合。
本文使用的术语“患者”或“受试者”是人或动物，并且不需要住院治疗。例如，门诊患者、疗养院的人是“患者”。患者可以包括任何年龄的人或非人动物，因此包括成年人和幼年人(即，儿童)。不希望术语“患者”意味着需要医学治疗，因此，患者可以自愿或不自愿地作为临床或支持基础科学研究的实验的一部分。
本文所用的术语“亲和力”是指物质或颗粒之间的任何吸引力，其导致它们进入并保持化学组合。例如，对受体具有高亲和力的抑制剂化合物将提供比具有低亲和力的抑制剂更大的预防受体与其天然配体相互作用的功效。
本文所用的术语“取自”是指化合物或样本的来源。在一个方面，化合物或样本可以取自生物体或特定物种。
术语“抗体”是指通过免疫原(抗原)在动物中诱发的免疫球蛋白。期望抗体显示对免疫原中包含的表位的特异性。术语“多克隆抗体”是指由多于一个浆细胞克隆产生的免疫球蛋白；相反，“单克隆抗体”是指由单个浆细胞克隆产生的免疫球蛋白。
当在提及抗体和蛋白质或肽的相互作用时所使用的术语“特异性结合”或“特异性结合”是指相互作用取决于特定结构的存在(即，例如，抗原性决定簇或表位)；换句话说，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而不是一般的蛋白质。例如，如果抗体对表位“A”是特异性的，则在含有标记的“A”和抗体的反应中存在的含有表位A(或游离的，未标记的A)的蛋白质将减少结合到抗体的标记的A的量。
如本文所使用的术语“样本”以其最广泛的含义使用，并且包括环境和生物样本。环境样本包括来自环境的材料，例如土壤和水。生物样本可以是动物，包括人、流体(例如血液，血浆和血清)、固体(例如粪便)，组织、液体食物(例如牛奶)和固体食物(例如蔬菜)。生物样本可以包括从细胞中分离的细胞，组织提取物、体液、染色体或染色体外元素，基因组DNA(在溶液中或结合到固体支持物，例如用于Southern印迹分析)，RNA(在溶液中或结合到固体支持物，例如用于Northern印迹分析)，cDNA(在溶液中或与固体支持物结合)，等等。
本文使用的术语“生物亲和配体”，“结合组分”，“感兴趣分子”，“感兴趣试剂”，“配体”或“受体”可以是大量不同分子、生物细胞或聚集体，并且这些术语可互换使用。每个结合组分可以固定在固体基底上并结合于被检测的分析物。蛋白质，多肽，肽，核酸(核苷酸，寡核苷酸和多核苷酸)，抗体，配体，糖，多糖，微生物例如细菌、真菌和病毒，受体，抗生素，测试化合物(特别是通过组合化学产生的那些)，植物和动物细胞，每个和其它生物实体的组织或部分可以各自是结合组分。如果相同的话，每个反过来也可以被认为是分析物结合到微流体生物芯片上的结合组分。
如本文所使用的术语“结合”或“粘附”包括任何物理附着或紧密关联，其可以是永久的或临时的。通常，氢键，疏水力，范德华力，共价键和离子键等的相互作用促进感兴趣的分子和被测量的分析物之间的物理附着。“结合”相互作用可以是短暂的，如在结合导致化学反应发生的情况下。当结合组分是酶并且分析物是酶的底物时，这是典型的。由于结合剂和分析物之间的接触而产生的反应也用于本发明的目的的结合的定义内。
本文所用的术语“基底”是指可包含微通道的表面以及固相。在一些情况下，基底是固体并且可以包含PDMS。基底还可包括包括但不限于玻璃，硅，石英，塑料或能够支持光刻的任何其它组合物的组件。
本文所使用的术语“光刻”，“光学光刻”或“UV光刻”是指在微加工中用于图案化薄膜的部分或基底的主体的工艺。它使用光将几何图案从光掩模转移到基底上的光敏化学“光致抗蚀剂”或简称为“抗蚀剂”。然后，一系列化学处理或者将曝光图案雕刻在光致抗蚀剂下面的材料上，或者使得能够以期望的图案将新材料沉积在光致抗蚀剂下面的材料上。例如，在复杂的集成电路中，现代CMOS晶片将经过光刻循环达到50次。
本文所述的实施方案涉及生物芯片以及生物芯片用于快速且容易地诊断血红蛋白病症(例如血红蛋白病(例如，镰状细胞病(SCD)))并且定量受试者的血细胞(例如红细胞和白细胞)的膜、细胞和粘附性质的用途，以临床有意义的方式监测疾病严重性，即将到来的疼痛危象，治疗反应和治疗有效性。
镰状细胞病(SCD)
SCD被认为是遗传性血液病症，其可以由血红蛋白基因中的单一突变引起。由“镰状”血红蛋白引起的贫血首先在美国在1910年被临床描述，并且在1949年鉴定了突变的可遗传镰状血红蛋白分子。Herrick J.，“Peculiar elongated and sickle-shaped red bloodcell corpuscles in a case of severe anemia(在严重贫血的情况下特异的伸长和镰刀形红细胞小体)“Archives of Internal Medicine(内科医学档案)，1910；和Pauling等，“Sickle cell anemia,a molecular disease(镰状细胞贫血，分子病)”，“Science(科学)，109：443，1949。
血红蛋白是携带氧的红细胞中的蛋白质。据信SCD的病理生理学是脱氧镰状血红蛋白的异常聚合的结果，其影响红细胞膜性质，形状，密度和/或完整性。还认为这些作用导致炎性细胞和内皮细胞功能的变化。SCD的一些临床后果可以包括但不限于：疼痛危象，广泛的器官损伤和早期死亡率。
正常血红蛋白(HbA)通常由α和β链组成。继承一个镰状突变β链的拷贝和一个正常β链的一个拷贝的个体具有镰状细胞性状(HbAS)。这些人是健康的，但可能在不知不觉中向他们的孩子传递SCD。继承两个镰状突变β链(HbSS)拷贝的个体产生SCD。携带镰状链的一个拷贝和异常β链C的一个拷贝的个体具有复合杂合HbSC。HbSC赋予较温和但仍然衰弱的SCD形式。Nagel等人，“The paradox of hemoglobin SC disease(血红蛋白SC病的矛盾)”，BloodReviews(血液评论)17：167-178(2003)。在目前诊断的SCD群体中，约三分之二被认为是纯合的HbSS，四分之一具有复合杂合HbSC性状。剩余的SCD群体由HbSbeta地中海贫血的患者组成，其中形成HbS和少量(或无)量的HbA。
SCD是公认的分子疾病，并且由血红蛋白中的β珠蛋白基因的突变引起。Pauling等人，Science(科学)，110(2865)：543-548(1949)。用β-珠蛋白链的第6位置中的疏水性氨基酸替代亲水性氨基酸导致细胞内HbS的聚合和细胞内硬质血红蛋白聚合物结构的形成。Barabino等，Annual review of biomedical engineering(生物医学工程年度评论)，12：345-367(2010)。这种突变折磨全世界数百万人，并伴有相当大的发病率和死亡率。Piatt等人，N.Engl.J.Med.，330(23)：1639-1644(1994)。
SCD的病理生理学是异常血红蛋白聚合及其对RBC膜、形状、密度、粘附和变形性的有害影响的结果。Hillery等人，Blood(血液)，87(11)：4879-4886(1996)；Kaul等人，Microcirculation(微循环)16(1)：97-111(2009)；Kaul等人，Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America(美利坚合众国国家科学院院报)86(9)：3356-3360(1989)；Hebbel等人，The New England journal ofmedicine(新英格兰医学杂志)302(18)：992-995(1980)；Stuart等人，364(9442)：1343-1360(2004)；和Hoover等人，Blood 54(4)：872-876(1979)。健康的RBC具有特征双凹形状，其允许细胞容易地变形并通过身体中的微小血管和毛细血管。然而，镰状红细胞经历根本的形态变化，导致变形性降低，刚度增加和异常粘连，导致被称为血管闭塞的血管堵塞。这种血管阻塞的后果包括痛苦的危象、广泛的器官损伤和早期死亡。An等人，Britishjournal of haematology(英国血液学杂志)141(3)：367-375(2008)；Mohandas等人，血液112(10)：3939-3948(2008)；Lipowsky，H.H.，Microcirculation(微循环)12(1)：5-15(2005)；和Hofrichter等，Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America(美利坚合众国国家科学院院报)71(12)：4864-4868(1974)。
红细胞(RBC)的变形性，粘附，溶血和流动的改变被认为是镰状细胞病(SCD)的病理生理学症状。Barabino等，Annual Review Of Biomedical Engineering 12：345-367(2010)；和Alexy等人，Transfusion 46(6)：912-918(2006)。已经研究了镰状红细胞的许多方面，包括血红蛋白聚合，细胞变形性，粘附，血液动力学变化和/或临床异质性。Hebbel R.P.，Blood 77(2)：214-237(1991)；Ferrone，Microcirculation 11(2)：115-28(2004)；Noguchi等人，Annual review of biophysics and biophysical chemistry 14：239-263(1985)；Nash等人，Blood 63(1)：73-82(1984)；Brandao等，European journal of hematology 70(4)：207-211(2003)；Mohandas等人，Journal of Clinical Investigation 76(4)：1605-1612(1985)；Montes等人，American journal of hematology 70(3)：216-227(2002)；Hillery等，Blood 87(11)：4879-4886(1996)；Kasschau等，Blood 87(2)：771-780(1996)；Bartolucci等人，Blood 120(15)：3136-3141(2012)；Kaul等人，Microcirculation 16(1)：97-111(2012)；Kaul等人，The Journal of clinical investigation 72(1)：22-31(1983)；Lei等人，Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 110(28)：11326-11330(2013)；Bunn等人，The New England journalof medicine 337(11)：762-769(1997)；Ballas等，Microcirculation 11(2)：209-225(2004)；和Kaul等人，Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnited States of America 86(9)：3356-3360(1989)。
具体地，镰状红细胞粘附(即，例如，粘性)和变形性已经被鉴定为涉及血管闭塞的生物物理学因素，并且已经显示与SCD严重性相关。Hebbel等人，Journal of ClinicalInvestigation 100(11)：S83-S86(1997)；Hebbel等人，The New England journal ofmedicine 302(18)：992-995(1980)；和Ballas等人，Blood 79(8)：2154-2163(1992)。由于直接分析来自不同临床表型的血液样本所面临的重大技术障碍，这些因素没有单独研究。这种挑战对复杂的生物物理现象在理解异质多方面临床病症如SCD中的有效整合提出了重大的限制。
RBCs的形态，物理和血液动力学性质的显着变化是由HbS聚合引起的。Barabino等，Annual review of biomedical engineering 12：345-367(2010)。早期的研究表明，SCD患者中的RBCs在密度、形态和功能上是异质的。Kaul等人，The Journal of clinicalinvestigation 72(1)：22-31(1983)，Fabry等人，Blood 60(6)：1370-1377(1982)；Kaul等人，Microvascular research 26(2)：170-181(1983)；Lipowsky等人，The Journal ofclinical investigation 80(1)：117-127(1987)；和Kaul等，Blood 68(5)：1162-1166(1986)。本文呈现的数据显示含有HbS的RBC在变形性、粘附强度和粘附位点的数目方面也不同。此外，可变形的含HbS的RBCs较少粘附，而不可变形的细胞更加粘附于纤连蛋白(FN)。在最近的研究中，使用细胞计数术和Percoll分离的镰状红细胞的激光背散射测量的减少的变形性和RBC聚集，显示与溶血相关。Connes等人，British journal of hematology 165(4)：564-572(2014)。因此，据信RBC粘附和变形性是患者SCD的受试者中的血管闭塞和溶血的组分。
非β链血红蛋白病例如α地中海贫血也是儿童，特别是在亚洲的主要的世界范围的健康问题。预期在一些实施方案中，一旦已经建立了β链异常(例如HbSS和HbSC)的电泳诊断，本发明可用于测试该群体。也有可能该技术适应于检测其他突变体血红蛋白(例如血红蛋白Bart(4胎胎儿β型γ链)或HbH(4成人β型链)的需要，其在α地中海贫血中升高)。
SCD中的病理生理学变化包括但不限于镰状红细胞(RBC)、活化白细胞(WBC)、活化内皮、循环内皮细胞的异常数目和循环造血前体细胞的异常数目之间的粘附变化。(图8A)。然而，由于技术限制和仅局部专门知识，观察到的病理生理学相关性尚未被广泛测试。
已经报道，SCD中镰状红细胞和WBC对异常的内皮粘附可能是由炎症和异常细胞粘附介导的疼痛和血管病变的可能原因。Hebbel等人，“Erythrocyte adherence to endotheliumin sickle-cell anemia.A possible determinant of disease severity”N Engl J Med302：992-995(1980)；Hebbel等人，“Erythrocyte/endothelial interactions and thevasocclusive severity of sickle cell disease”Prog Clin Biol Res 55：145-162(1981)；Barabino等人，“Endothelial cell interactions with sinle cell，sickletrait，mechanical injured，and normal erythrocytes under controlled flow”Blood70：152-157(1987)；和Barabino等人，Rheological studies of erythrocyteendothelialcell interactions in sickle cell disease“Prog Clin Biol Res 240：113-127(1987)。可以设想在含有HbS的RBC，活化的WBC和活化的内皮细胞之间的多种相互连接的异常相互作用，导致SCD中的疼痛和破坏(图8A)。在SCD中可能存在异常的单核细胞、嗜中性粒细胞、血小板和内皮细胞活化和粘附，并且血管闭塞危象的互补模型描述了初始网织红细胞和嗜中性粒细胞粘附激活的内皮和/或内皮下基质(即，例如，包括LN，FN，vWF)，随后是致密的(不可逆镰状的)红细胞捕获和血管闭塞。Setty等人，“"Role of erythrocytephosphatidylserine in sickle red cell endothelial Adhesion”Blood 99：1564-1571(2002)；Kaul等人，“Sickle red cell-endothelium interactions”Microcirculation16：97-111(2009)；以及Frenette等人，“Sickle cell disease:old discoveries,newconcepts,and future promise”J.Clin Invest 117：850-858(2007)。
或者，离体和体内实验已经表明内皮被细胞因子和白细胞活化，白细胞主要是单核细胞，其本身被镰状红细胞衍生的因子激活。Belcher等人，“Activated monocytes insickle cell disease：potential role in the activation of vascular endotheliumand vaso-occlusion”Blood 96：2451-2459(2000)；Natarajan等人，“Adhesion of sicklered blood cells and damage to interleukin-1beta stimulated endothelial cellsunder flow in vitro”Blood 87：4845-4852(1996)；Perelman等人，“Placenta growthfactor activating monocytes and correlates with sickle cell disease severity”Blood 102：1506-1514(2003)；和Zennadi等人，“Sickle red cells induce adhesion oflymphocytes and monocytes to endothelium”Blood 112：3474-3483(2008)。这些因素组合以增加RBC和白细胞(主要是嗜中性粒细胞)彼此之间以及与内皮和内皮下的粘附性。也可以涉及可溶性桥连因子(即，例如TSP，FN和vWF)，尽管这些相互作用没有被定量。Stone等人，“Effects of density and of dehydration of sickle cells on their adhesionto cultured endothelial cells”Am J Hematol 52：135-143(1996)；Kaul等人，“Sickleerythrocyte-endothelial interactions in microcirculation：the role of vonWillebrand factor and implications for vasoocclusion”Blood 81：2429-2438(1993)：Wick等人，“Unusually large von Willebrand factor multimers increasesadhesion of sickle erythrocytes to human endothelial cells under controlledflow“J Clin Invest 80：905-910(1987)；Brittain等人，“Thrombospondin fromactivated platelets promotes sickle erythrocyte adherence to humanmicrovascular endothelium under physiologic flow：a potential role forplatelet activation in sickle cell vaso-occlusion”Blood 81：2137-2143(1993)；Sugihara等人，“Thrombospondin mediates adherence of CD36+sickle reticulocytesto endothelial cells”Blood 80：2634-2642(1992)；Barabino等人，“Inhibition ofsickle erythrocyte adhesion to immobilized thrombospondin by von Willebrandfactor under dynamic flow conditions”Blood 89：2560-2567(1997)；Finnegan等人，“Adherent leukocytes capture sickle erythrocytes in an in vitro flow model ofvaso-occlusion”Am J Hematol 82：266-275(2007)；Turhan等人，“Primary role foradherent leukocytes in sickle cell vascular occlusion：a new paradigm”ProcNatl Acad Sci U S A 99：3047-3051(2002)。此外，活化的内皮细胞和造血前体细胞以非常高的水平在SCD中循环，并与终末器官损伤相关。一些膜/细胞相互作用已经在血管嵌塞危象期间或在动物模型中被强烈证明，但是没有广泛的临床相关研究。Hebbel等人，“Erythrocyte adherence to endothelium in sickle-cell anemia”New Engl J Med302：992-995(1980)；Solovey等人，“Circulating activated endothelial cells insickle cell anemia”N Engl J Med 337：1584-1590(1997)；Strijbos等人，“Circulatingendothelial cells：a potential parameter of organ damage in sickle cellanemia？”Blood Cells Mol Dis 43：63-67(2009)；van Beem等人，“Elevated endothelialprogenitor cells during painful sickle cell crisis”Exp Hematol 37：1054-1059(2009)；以及Jang等人，“CXCL1 and its receptor，CXCR2，mediate murine sickle cellvaso-occlusion during hemolytic transfusion reactions”J Clin Invest 121：1397-1401。
红细胞粘附
在所有脊椎动物中，除了白血鱼(Channichthyidae)之外，氧通过RBC从肺携带到组织，这使得该细胞在几乎所有生理过程中都是一个整体。研究RBC在毛细血管中的运输是特别重要的，因为即使心血管系统负责血液的分布，也是微毛细管网络，其确保氧气和营养物质递送到组织和器官。体循环中总压降的大约80％发生在微循环中。微循环中的血流取决于固有的RBC生物力学性质，即变形性和粘附性。当RBC通过狭窄的毛细血管时，紧密挤压使得细胞的整个圆周暴露于血管壁粘附分子，与大血管相比，这使得微血管更容易受到RBC粘附的有害影响。RBC变形性和粘附性在许多疾病状态中受损，导致微毛细管网络中的血流阻塞。
RBC的变形能力降低、粘连增加和PS暴露与许多疾病有关，包括贫血，脓毒症，疟疾，狼疮，重金属暴露，输血并发症，糖尿病，癌症，肾脏疾病，心血管疾病、肥胖症等和神经病症中的微循环障碍。这些疾病影响全球数亿人口，每年有数百亿美元的社会经济负担。例如，在镰状贫血中，RBC粘附与血流阻塞、疾病严重性和器官损伤有关。RBC是汞的重要目标，甚至低水平的汞也可以诱导PS暴露和循环中的粘附。铅暴露已显示损害RBC膜，导致降低的变形性和降低的膜弹性。血液储存已经显示诱导氧化应激、渗透压、PS暴露和RBCs中降低的变形性，其已经与器官衰竭相关。对RBC的粘附亲和力、变形性和PS暴露的基本和统一的理解将潜在地导致微循环障碍的新的监测和治疗策略，其可以改善数百万人的生活。
血红蛋白生物芯片(HemeChip)
本文所述的一些实施方案涉及准确鉴定和量化来自受试者的血红蛋白蛋白的电泳生物芯片和系统。电泳生物芯片可用于检测血红蛋白病症，例如血红蛋白病，地中海贫血，镰状细胞病，镰状细胞性贫血，先天性红细胞生成性贫血和轻度慢性贫血的系统。
参考图1和图2，电泳生物芯片可以包括具有第一缓冲端口和第二缓冲端口的外壳、样本加载端口，以及第一电极和第二电极。壳体还包括从壳体的第一端延伸到第二端的微通道。微通道包含用碱性缓冲溶液至少部分饱和的醋酸纤维素纸。第一缓冲端口和第二缓冲器分别通过壳体的第一端和第二端延伸到微通道和醋酸纤维素纸。第一缓冲端口和第二缓冲端口能够接收使醋酸纤维素纸至少部分饱和的碱性缓冲溶液。样本加载端口可以接收血液样本并且穿过壳体的第一端延伸到微通道和醋酸纤维素纸。第一电极和第二电极可以产生穿过纤维素乙酸酯纸的电场，有效地促进血液样本中的血红蛋白变体沿着醋酸纤维素纸的迁移。第一电极和第二电极可分别通过第一缓冲端口和第二端口延伸到醋酸纤维素纸。
在一些实施方案中，壳体可以包括顶盖、底盖和插入在顶盖和底盖之间的通道隔离件。通道间隔件可以在壳体中限定通道。顶盖、底盖和通道间隔件可以由玻璃或塑料中的至少一种形成。
在一些实施方案中，电泳生物芯片可以进一步包括成像系统，用于对于引入到样本加载端口中的血液样本显示和量化沿着醋酸纤维素纸的血红蛋白变体迁移。外壳可以包括用于可视化醋酸纤维素纸和血红蛋白变体迁移的观察区域。
第一电极和第二电极可以连接到电源。电源可以产生约1V至约400V的电场。在一些实施方案中，由电极施加到生物芯片的电压不超过250V。
生物芯片可以是微工程的，并且能够处理小的血液体积(例如，指刺体积或足跟体积)。
在其它实施方案中，引入样本加载端口的血液样本可以小于10微升。缓冲溶液可以包括碱性tris/硼酸盐/EDTA缓冲溶液。第一电极和第二电极可以包括石墨电极或碳电极。
在其他实施方案中，成像系统可以包括可视化和量化血红蛋白变体迁移的移动电话成像系统。例如，如图7所示，移动电话成像系统可以包括用于对血红蛋白变体迁移进行成像的移动电话以及识别和量化血红蛋白带类型和厚度以做出诊断决定的软件应用。血红蛋白带类型可以包括血红蛋白类型C/A，S，F和AO。
在其它实施方案中，移动成像和量化算法可以集成到生物芯片装置中。该算法可以对在生物芯片装置的所有资源设置中收集的数据实现可靠且可重复的测试结果。
可以使用移动应用来执行电泳生物芯片的成像和数据分析，以增强血液分析的可靠性和再现性。Wang等人，“Micro-a-fluidics ELISA for rapid CD4 cell count at thepoint-of-care”Scientific Reports 4：3796(2014)。简言之，图像处理算法可以通过使用示例性样本端口作为位置标记来初始识别微流体生物芯片通道。然后，可以从彩色图像中提取红色(R)像素值并相对于背景进行归一化。红色像素强度直方图可以沿着通道自动绘制，由此确定最高强度的位置。(图7)应用程序分割、计数和量化对应于不同Hb类型的条带，因此对应于HemeChip上的不同Hb病症。例如，可以使用直方图绘图为每个样本确定HbA和/或HbS位置，并将结果显示在屏幕上。图形用户界面包括基本特征，包括引导用户正确对准相机视野的基准标记。应用程序可以输入日期、位置和唯一的患者标识符。
在一些实施方案中，电泳生物芯片可用于诊断受试者是否具有血红蛋白基因型HbAA，HbSS，HbSA，HbSC或HbA2。在其他实施方案中，电泳生物芯片可用于诊断受试者是否患有镰状细胞病或者镰状细胞病的风险增加。
在一些实施方案中，电泳生物芯片可用于将来自受试者的血液样本引入到样本装载口的方法中。血液样本包括至少一个血细胞。然后形成在醋酸纤维素纸上的血红蛋白带用成像系统成像以确定受试者的血红蛋白表型。血红蛋白表型可以选自HbAA，HbSA，HbSS，HbSC和HbA2构成的组。
在一些实施方案中，HbAA血红蛋白表型诊断受试者为正常，HbSA血红蛋白表型诊断受试者具有镰状细胞性状，HbSS血红蛋白表型诊断受试者患有镰状细胞病，HbSC血红蛋白表型诊断受试者具有血红蛋白SC疾病，HbA2血红蛋白表型诊断受试者患有地中海贫血。
在其它实施方案中，电泳生物芯片可用于能够鉴定早期SCD诊断的血红蛋白筛分方法中。在一个实施方案中，对新生儿进行早期诊断。在另一个实施方案中，对成年人进行早期诊断。在其它实施方案中，该方法区分健康个体、镰状细胞性状携带者和SCD患者。
在一些实施方案中，电泳生物芯片包括生物医学级聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA，McMaster-Carr)基底和双面胶粘膜(DSA)(3M公司)，已经表明其生物医学和临床应用中的生物相容性和非细胞毒性。可以使用微加工平台(例如，X-660激光器，通用激光系统)来制造生物芯片，以产生多种结构，包括但不限于入口端口，出口端口，样本端口，微流体通道，反应室和/或电泳通道。(图1A)微流体通道尺寸可以控制在10微米内。在其他实施方案中，微流体生物芯片系统允许快速手动组装并且是一次性的(例如，例如单次使用的生物芯片)，以防止患者之间的潜在的交叉污染。
电泳生物芯片设计的一个优点是其适用于在现场护理技术中提供效率的大规模生产。电泳生物芯片可以提供用于SCD(和其他血红蛋白疾病)的低成本筛分测试，其运行花费10分钟。它是移动和易于使用的；它可以由任何人在短期(30分钟)训练之后执行。本文所述的电泳生物芯片可以与移动设备(例如，IPhone，IPod)集成以产生客观的和定量的结果。如果需要，生物芯片和/或它们的组分可以灭菌(例如通过UV光)，并在无菌层流罩中组装。无菌生物医学级硅管(Tygon Biopharm Plus)可以集成到生物芯片中，生物芯片可以被密封以防止任何泄漏。此外，如果需要，管道允许简单连接到其他平台，例如体外培养系统用于额外的分析。
微流体生物芯片
本文所述的其它实施方案涉及微流体生物芯片系统和用于在单细胞水平下同时询问血细胞变形性和对微血管系统模拟表面的粘附性的分析方法。在一些实施方案中，微流体生物芯片装置或系统可量化受试者的红细胞和白细胞的膜、细胞和粘附性质，以临床上有意义的方式监测疾病严重性，即将到来的疼痛危象，治疗响应和治疗有效性。在一个实施方案中，血细胞源自筛分和/或监测镰状细胞病(SCD)进展的患者的全血。
微流体生物芯片装置包括壳体和在壳体中限定至少一个细胞粘附区域的至少一个微通道。所述至少一个细胞粘附区域涂覆有至少一种生物亲和配体，当含有细胞的流体通过所述至少一个微通道时，所述生物亲和配体粘附感兴趣的细胞。生物亲和配体可包括纤连蛋白、层粘连蛋白、选择蛋白、血管性血友病因子、血栓调节蛋白或C146抗体中的至少一种。该装置还包括成像系统，当流体通过通道时，成像系统测量粘附到至少一个微通道内的至少一个生物亲和配体的细胞的量。
图8和图9示出了根据一个实施方案的微流体生物芯片。微流体生物芯片包括限定包括细胞粘附区域的多个通道的外壳。每个通道在一端连接到入口端口，在另一端连接到出口端口。尽管图8仅示出三个通道，但是微流体装置可以包括多于或少于三个通道。通道的直径应当足够大以防止血液通过通道时通道的堵塞。
图13示出了微流体生物芯片可以包括由基底层、中间层和覆盖层形成的多层结构。通道形成在中间层中；入口和出口形成在盖中。每个通道的第一端与其对应的入口端口对齐，并且每个通道的第二端与其对应的出口端口对准，从而形成从入口端口经由通道到相应的出口端口的流动通道。在一些实施方案中，通道稍微延伸超过它们各自的入口和出口。通道的尺寸设定为接受例如微升或毫升体积的血液或含有待粘附或捕获的细胞的溶液。还可以进一步调整通道的尺寸和形状以影响细胞的粘附或捕获。
基底层为细胞粘附区域提供结构支撑，并由合适厚度(例如约0.1mm至约2mm，例如约1.6mm)的足够刚性的材料(例如聚甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)或玻璃形成，厚度是由制造和装配限制确定的。覆盖层包含用于将血液进出通道的血液的入口和出口。覆盖层厚度可以为约1mm至约10mm，例如约3.6mm，并且由集成和组装要求确定。入口直径和出口直径可以是约0.3mm至约3mm，例如约1mm，其中下限由制造限制确定，上限由血液的流动条件确定。
在一些实施方案中，可根据需要使用激光切割器，以将较大的PMMA块切割成用于微流体芯片的所需尺寸，并切割用于入口端口和出口端口的孔。
中间层可以由粘附到基底层和覆盖层二者的材料形成。例如，通过在中间层中激光切割多边形(例如矩形截面)来形成通道，中间层本身被激光切割成期望的尺寸(例如，基底层的尺寸)。通道的高度可以由中间层的厚度确定，这将在下面更详细地讨论。
在一些实施方案中，确定装置几何形状和尺寸以适应用于血液的均匀层流条件，其确定捕获效率和流速。通道宽度可以为约1mm至约15mm，例如约3.5mm，其中最小宽度由入口和出口直径确定，并且通道宽度的上限由受限通道中的血液的流动特性确定。通道长度可以为约4mm至约100mm，例如约27mm。较低的通道长度尺寸由受限通道中的血液的流动特性确定，并且上限由细胞捕获效率确定。通道高度可以为约10μm至约500μm，例如约50μm，其由受限通道中的血液的流体力学定律和约束和流动特性确定。
在将通道切割成中间层之后，将中间层粘附到基底层。可以具有与基底层和中间层相同的横向尺寸的覆盖层可以粘附到中间层的暴露侧上，从而封闭通道。在图13所示的实施方案中，微流体生物芯片装置被定向成使得覆盖层在顶部。在其他实施方案中，细胞分离装置可以定向成使得覆盖层在底部上。
微流体生物芯片装置的细胞粘附区域可包括其上提供有至少一种生物亲和配体的层或涂层的表面。生物亲和配体可以包括纤连蛋白、层粘连蛋白、选择蛋白、血管性血友病因子、血栓调节蛋白或CI46抗体中的至少一种。生物亲和配体可以粘附、官能化或化学官官能化到每个通道的细胞粘附区域。
本文所用的术语“官能化”或“化学官能化”是指通过化学反应将官能团添加到材料的表面上。如本领域技术人员容易理解的，官能化可用于材料的表面改性，以实现所需的表面性质，例如生物相容性，润湿性等。类似地，本文所用的术语“生物官能化”，“生物官能化的”等意指对材料表面的改性，使得其具有所需的生物学功能，这将是相关领域的技术人员容易理解的，如生物工程。
生物亲和配体可以共价或非共价地官能化至细胞粘附区域。连接子可用于提供生物亲和配体与细胞粘附区域的共价连接。连接子可以是可用于连接多种实体的连接子。
在一些实施方案中，连接子可以是同双功能连接子或异双功能连接子，这取决于待缀合的分子的性质。同双功能连接子具有两个相同的反应基团。异双功能连接子具有两个不同的反应基团。各种类型的市售连接子与一个或多个以下基团反应：伯胺，仲胺，巯基，羧基，羰基和碳水化合物。胺特异性连接子的实例是双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯，双[2-(琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜，辛二酸二琥珀酰亚胺酯，酒石酸二琥珀酰亚胺酯，己二酸二甲酯2HCl，二甲基庚二酰亚胺二盐酸二甲酯，乙二醇双[琥珀酰亚胺基]]，二硫醇双(丙酸琥珀酰亚胺酯)和3,3'-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺丙酸酯)。与巯基反应的连接子包括双马来酰亚胺己烷，1,4-二-[3'-(2'-吡啶基二硫代)-丙酰胺基)]丁烷，1-[对叠氮基水杨酰胺]-4-[碘乙酰氨基]丁烷和N-[4-(对叠氮基水杨酰胺基)丁基]-3'-[2'-吡啶基二硫代]丙酰胺。优选与碳水化合物反应的连接子包括叠氮苯甲酰肼。优选与羧基反应的连接基包括4-[对叠氮基水杨酰胺基丁胺]。
与胺和巯基反应的异双官能连接子包括N-琥珀酰亚胺基-3-[2-吡啶基二硫代]丙酸酯，琥珀酰亚胺基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯，琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯，m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯，磺基琥珀酰亚胺基6-[3-[2-吡啶基二硫代]丙酰胺基]己酸酯和磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯。与羧基和胺基反应的异双功能连接子包括1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]-碳二亚胺盐酸盐。与碳水化合物和巯基反应的异双官能连接子包括4-[N-马来酰亚胺甲基]-环己烷-1-羧基酰肼HCl，4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酰肼2HCl和3-[2-吡啶基二硫代]丙酰肼。
或者，生物亲和配体可以非共价地涂敷被在细胞粘附区上。生物亲和配体到细胞粘附区的非共价沉积可涉及使用聚合物基质。聚合物可以是天然存在的或非天然存在的，并且可以是任何类型的，包括但不限于核酸(例如DNA，RNA，PNA，LNA等或其模拟物、衍生物或组合)，氨基酸(例如，肽，蛋白质(天然的或变性的)等)或其模拟物，衍生物或组合，脂质，多糖和官能化嵌段共聚物。受体可吸附到和/或包埋在聚合物基质内。
或者，生物亲和配体可以与聚合物共价缀合或交联(例如，其可以“接枝”到官能化聚合物上)。
合适的肽聚合物的实例是聚赖氨酸(例如聚-L-赖氨酸)。其它聚合物的实例包括包含聚乙二醇(PEG)，聚酰胺，聚碳酸酯，聚烷撑，聚亚烷基二醇，聚环氧烷，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙交酯，聚硅氧烷，聚氨酯，烷基纤维素，羟烷基纤维素，纤维素醚，纤维素酯，硝基纤维素，丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物，甲基纤维素，乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟丁基甲基纤维素，乙酸纤维素，丙酸纤维素，乙酸丁酸纤维素，乙酸纤维素邻苯二甲酸酯，羧乙基纤维素，三乙酸纤维素，硫酸纤维素钠盐，聚甲基丙烯酸甲酯，聚甲基丙烯酸乙酯，聚甲基丙烯酸丁酯，聚甲基丙烯酸异丁酯，聚甲基丙烯酸异癸酯，(甲基丙烯酸月桂酯)，聚(甲基丙烯酸苯酯)，聚(丙烯酸甲酯)，聚丙烯酸异丙酯，聚(丙烯酸异丁酯)，聚(丙烯酸十八烷基酯)，聚乙烯，聚丙烯，聚(乙二醇)，聚(环氧乙烷)，聚(对苯二甲酸乙二醇酯)，聚(乙烯醇)，聚乙酸乙烯酯，聚氯乙烯，聚苯乙烯，聚透明质酸，酪蛋白，明胶，谷蛋白，聚酸酐，聚丙烯酸，藻酸盐，壳聚糖，聚甲基丙烯酸甲酯，聚甲基丙烯酸丁酯，聚甲基丙烯酸丁酯，聚(甲基丙烯酸异丁酯)，聚甲基丙烯酸己酯，聚甲基丙烯酸异癸酯，聚甲基丙烯酸月桂酯，聚甲基丙烯酸苯酯，聚丙烯酸甲酯，聚丙烯酸异丙酯，聚(丙烯酸异丁酯)，和聚(丙烯酸十八烷基酯)，聚(丙交酯-乙交酯)，共聚草酸酯，聚己内酯，聚酯酰胺，聚原酸酯，聚羟基丁酸，聚酐，聚(苯乙烯-b-异丁烯-b-苯乙烯)(SIBS)嵌段共聚物，乙烯乙酸乙烯酯，聚(甲基)丙烯酸，乳酸和乙醇酸的聚合物，聚酸酐，聚(原酸酯)，聚氨酯，聚(丁酸)，聚(戊酸)和聚(丙交酯-共聚己内酯)，和天然聚合物如藻酸盐和其它多糖，包括葡聚糖和纤维素，胶原，白蛋白和其它亲水蛋白，玉米醇溶蛋白和其它醇溶蛋白和疏水蛋白，其共聚物和混合物，及其化学衍生物，包括化学基团的取代和/例如烷基、亚烷基、羟基化、氧化和本领域技术人员常规制备的其它修饰物的添加。
在一些实施方案中，每个微通道可以包括用至少一种生物亲和配体包被的单独的细胞粘附区。至少两个或至少三个微通道可以包括不同的生物亲和配体。在其他实施方案中，多个微通道可以包括相同的生物亲和配体。
在其它实施方案中，至少一个微通道可以包括包被在微通道的细胞粘附区域上的至少两种不同的生物亲和配体。不同的生物亲和配体可以位于至少一个微通道的细胞粘附区域内的不同位置。例如，层粘连蛋白、选择蛋白、血管性血友病因子、血栓调节蛋白和C164抗体中的至少一种位于沿着至少一个微通道的不同位置。
在一些实施方案中，成像系统可以是基于透镜的成像系统或无透镜成像系统。例如，无透镜成像系统可以是电荷耦合器件传感器和发光二极管。在一些实施方案中，移动成像和量化算法可以集成到生物芯片装置中。该算法可以对于在生物芯片装置的所有资源设置中收集的数据实现可靠且可重复的测试结果。
在其它实施方案中，细胞可以是从受试者获得的血细胞，并且成像系统可以量化每个相应通道中的粘附的细胞以监测从其获得细胞的受试者的健康。在其他实施方案中，成像系统可以量化每个相应通道中粘附的细胞，以监测从其获得细胞的受试者的疾病(例如镰状细胞病)的进展。在其它实施方案中，成像系统可以量化每个通道中粘附的细胞，以测量施用于从其获得细胞的受试者的治疗性治疗的功效。
在一些实施方案中，微流体生物芯片装置可用于这样的方法中，其中将包含来自受试者的至少一个血细胞的血液样本引入微通道中，并且将至少一个微通道内的粘附于所述至少一个生物亲和配体的细胞量成像。生物芯片装置可以量化受试者的红细胞和白细胞的膜、细胞和粘附性质，以临床上有意义的方式监测疾病严重性，即将到来的疼痛危象，治疗响应和治疗有效性。
可以预期，本文公开的微流体生物芯片平台适用于在更大临床多样种群中的受试者内的粘附细胞的单细胞异质性的研究，并且可以提供除了SCD之外的复杂疾病表型的重要见解。例如，异常的RBC对微血管表面的粘附已经涉及其它多系统疾病，例如β-地中海贫血，糖尿病，遗传性球形红细胞增多症，真性红细胞增多症和疟疾。Connes等人，British journalof haematology(英国血液学杂志)165(4)：564-572(2014)；Colin等人，Current opinionin hematology(血液学中的当前观点)21(3)：186-192(2014)；和Cooke等人，Parasitology(寄生虫学)107：359-368(1993)。
已经证明在毛细血管后静脉中发生了镰状红细胞对血管壁的粘附。在一个实施方案中，本发明涉及包括至少一个具有约60μm宽度和在约1-10mm/sec范围内的流体流速的微通道的微流体SCD生物芯片，其已报道用于后毛细血管静脉。Kaul等人，Microcirculation(微循环)16(1)：97-111(2009)；Kaul等人，Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America(美利坚合众国国家科学院院报)86(9)：3356-3360(1989)；Lipowsky，H.H.，Microcirculation(微循环)12(1)：5-15(2005)；和Turitto，V.T.，Progress in hemostasis and thrombosis(止血和血栓形成的进展)6：139-177(1982)。
在文献中已经报道了使用基于来自SCD中的生理状态的外推的类似流动条件的研究。Montes等人，American journal of hematology 70(3)：216-227(2002)；Kasschau等人，Blood 87(2)：771-780(1996)；Lei等人，Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 110(28)：11326-11330(2013)。然而，没有研究使用在60μm的微血管尺度的全血分析含有HbS的RBC粘附和变形性。本文提供的数据证明了在模拟微血管的微流体通道中检查的SCD血液样本中在单细胞水平下测量的含HbS的RBC粘附性和变形性的异质性。
在一个实施方案中，微流体生物芯片可用于利用病理生理学相关性的SCD测试方法，包括但不限于在基线和血管闭塞性危象期间对HbSS和HbSC中的粘附和膜特性的分析，以及治疗，并且在末端器官损伤存在的情况下。SCD测试方法可在不到十分钟内完成。在一些实施方案中，SCD测试方法提供了RBC、WBC、循环造血前体细胞和循环内皮细胞中CMA性质的高度特异性分析。在一个实施方案中，使用便携式、高效率、微流体生物芯片和微小血液样本(<15μl)执行SCD测试方法。SCD测试方法可以提供复杂和临床相关的策略，可以在SCD疾病进展期间连续检查患者血液样本的细胞/膜/粘附性质。
在一些实施方案中，生物芯片可使用单滴血准确地量化细胞相互作用和膜特性。生物芯片和方法可验证关于SCD中的疾病机制的见解，并且可以揭示疾病异质性与急性和/或慢性SCD并发症之间的相关性。
微流体生物芯片还可以通过查询一系列临床表型中的许多公认的异常来评估膜和细胞异常。迄今为止，在临床报告，测试结果，干预和/或图表评论之间的各种相关SCD研究中讨论了这些表型。Lorch等人，“An elevated estimated estimated pulmonary arterialsystolic pressure，whenever measured，is associated with excess mortality inadults with sickle cell disease”Acta Haematol 125：225-229(2011)；Powars等人，“Outcome of sickle cell anemia：a 4-decade observational study of1056patients”Medicine(Baltimore)84：363-376(2005)；Nouraie等人，“Therelationship between the severity of hemolysis，clinical manifestations andrisk of death in 415patients with sickle cell anemia in the US and Europe”Haematologica 98：464-472(2013)；Piatt等人，“Mortality in sickle celldisease.Life expectancy and risk factors for early death”N Engl J Med 330：1639-1644(1994)；Ohene-Frempong等人，“Cerebrovascular accident in sickle celldisease：rate and risk factors”Blood 91：288-294(1998)；West等人，“Laboratoryprofile of sickle cell disease：a cross-sectional analysis.The CooperativeStudy of Sickle Cell Disease”J Clin Epidemiol 45：893-909(1992)；Charache等人，“Effect of hydroxyurea on the frequency of painful crises in sickle cellanemia.Investigators of the Multicenter Study of Hydroxyurea in Sickle CellAnemia”N Engl J Med 332：1317-1322(1995)。Lettre等人，“DNA polymorphisms at theBCL11A，HBS1L-MYB，and beta-globin loci associated with fetal hemoglobin levelsand pain crises in sickle cell disease”Proc Natl Acad Sci U S A 105：11869-11874(2008)；Milton等人，“Genetic determinants of haemolysis in sickle cellanemia”Br J Haematol 161：270-278(2013)；Bae等人，“Meta-analysis of 2040sicklecell anemia patients：BCL11A and HBS1L-MYB are the major modifiers of HbF inAfrican Americans”Blood 120：1961-1962(2012)；和Milton等人，“A genome-wideassociation study of total bilirubin and cholelithiasis risk in sickle cellanemia”PLoS One 7：e34741(2012)。
众所周知，在常见的血液病症中，通常通过检查细胞膜性质和细胞活化，SCD是可检测的。例如，自从20世纪80年代以来，已经对膜和细胞异常以及它们与SCD中的临床并发症的关系进行了许多观察。然而，大多数病理生理学研究是在单个机构的单个时间点以适度数目的受试者进行的。此外，不可能对单个患者样本进行多于一次的分析，例如同时评价膜性质、炎症细胞活化和循环内皮细胞数目。通常，有希望的“前沿”或生物照明相关测试太昂贵、复杂或难以‘导出’到其他中心。本方法的这些缺点阻止了对病理生理学终点例如RBC，WBC和内皮(和内皮下)的细胞间粘附的纵向检查的广泛接近。
此外，第三世界国家承担SCD的负担。因此，提供疾病活动鉴别和诊断的廉价且简单的即时检验装置在世界范围内是极有价值的工具。Yang等人，“A simple，rapid，low-costdiagnostic test for sickle cell disease“Lab on a Chip 13：1464-1467(2013)。Yang等人描述了使用纸的镰状细胞病(SCD)的诊断测试色谱法。这里，目前公开的SCD监测和测试的改进通过微流体SCD生物芯片技术拓宽了病理生理学终点可用性。在一个实施方案中，微流体SCD生物芯片执行测量细胞粘附的测试方法。在一个实施方案中，SCD生物芯片测量红细胞(RBC)与层粘连蛋白(LN)的结合。在一个实施方案中，SCD生物芯片测量白细胞与选择蛋白的结合。在一个实施方案中，SCD生物芯片测量细胞活化，包括但不限于白细胞活化、内皮细胞活化和/或造血前体细胞活化。
本实施方案具有优点，因为现有的常规方法不能评估具有CMA性质的纵向和大规模SCD临床相关性。在一个实施方案中，本发明涉及使用SCD生物芯片检查细胞性质和相互作用的方法。在一个实施方案中，这些细胞性质和相互作用包括但不限于红细胞(RBC)细胞和粘附性质，白细胞(WBC)细胞和粘附性质，循环内皮特征和造血前体细胞特征。在一个实施方案中，本发明涉及用于在异质SCD群体(包括但不限于HbSS和HbSC)中，在一定年龄范围内，以及在具有急性和慢性并发症和与正常HbAA对照比较的那些中，关联SCD生物芯片功能的方法。
尽管本数据验证了SCD细胞特性的聚焦面板，但是本领域技术人员将认识到该技术可以更广泛地适用于SCD中的其他病理性细胞相互作用。图8。因此，SCD生物芯片允许病理生理疾病相关的广泛临床应用，迄今为止是不可行的。该方法进一步可以产生独特有价值的研究材料，例如已经涉及SCD发病机理的精确分离的细胞群体(例如内皮细胞和炎性细胞)。此外，SCD生物芯片的一些实施方案可以探索用于将来治疗试验的终点，其可应用于美国和世界范围内SCD最普遍的资源有限环境，例如南美洲和非洲。
本文所述的微流体生物芯片技术可以研究通常使用常规技术例如荧光激活细胞分选(FACS)、免疫组织化学或显微成像方法测量的表面特征。在FACS中，分离、广泛加工感兴趣的细胞，利用针对细胞蛋白质(例如，整联蛋白，受体，粘附分子)产生的荧光标记对感兴趣细胞抗体温育，并通过光学识别分选。在一个实施方案中，本发明涉及包含询问抗体的微流体生物芯片(例如，微流体SCD生物芯片)。在一个实施方案中，抗体包被微通道表面。在一个实施方案中，抗体捕获感兴趣的细胞群体，而不进行预处理，孵育或体外操作。
在一个实施方案中，微流体生物芯片量化细胞群体对亚细胞组分的粘附，所述亚细胞组分包括但不限于木质素、粘附分子或选择蛋白。在一些实施方案中，微流体生物芯片可基于膜性质和粘附性捕获和量化RBC、WBC和循环内皮细胞和造血前体细胞。例如，微流体生物芯片包含用针对BCMA/LU，CD11b，CD34和/或CD146的木质素、选择蛋白、抗生物素蛋白和/或生物素化抗体官能化的多个微通道。
除了在危机期间，粘附的简单测试将允许探索其在SCD的慢性并发症中的作用。可以使用微流体生物芯片作为粘合剂表面来测试选择蛋白，代替培养的内皮细胞。内皮选择蛋白被认为介导白细胞粘附和在内皮表面上滚动。例如，在SCD的实验模型中，P-选择蛋白(P-selectin)在血管内皮上广泛表达，内皮E-选择蛋白(E-selectin)对血管闭塞是重要的。Wood等人，“Differential expression of E-and P-selectin in the microvasculatureof sickle cell transgenic mice”Microcirculation 11：377-385(2004)；Wood等人，“Endothelial cell P-selectin mediates a proinflammatory and prothrombogenicphenotype in cerebral venules of sickle cell transgenic mice”American JournalOf Physiology Heart And Circulatory Physiology 286：H1608-1614(2004)；和Hidalgo等人，“Heterotypic interactions enabled by polarized neutrophil microdomainsmediate thromboinflammatory injury”Nat Med 15：384-391(2009)。SCD中的中性粒细胞通过嗜中性粒细胞MAC-1，LFA-1和对SCD特异的VLA-490显示更强的内皮附着，其可以用有效的疗法改变。Almeida等人，“Hydroxyurea and a cGMP-amplifying agent haveimmediate benefits on acute vaso-occlusive events in sickle cell diseasemice”Blood 120：2879-2888(2012)。
在一个实施方案中，本发明涉及包含具有至少一个固定P-选择蛋白和/或E-选择蛋白粘附分子的至少一个微通道的微流体SCD生物芯片。与HbAA对照相比，预期SCD样本显示更大的WBC对选择蛋白的粘附性。在基线和危机时检查SCD样本，可以评估疾病活动的变化。例如，与来自相同样本的SCB微流体生物芯片上的未操作的WBC相比，可以通过FACS在选择蛋白捕获的血液WBC上测量MAC-1，LFA-1和VLA-4表达。
固定选择蛋白与RBC相互作用是可能的。如果这妨碍WBC相互作用的分析，则RBC可以在分析前裂解。Matsui等人，“P-selectin mediates the adhesion of sickleerythrocytes to the endothelium(P-选择蛋白介导镰状红细胞对内皮的粘附)”Blood98：1955-1962(2001)。RBC粘附性可以在患者之间变化，因此是信息性的，并且如果是这样，可以量化。值得注意的是，WBC粘附的常规体外测量需要内皮细胞培养，通过使用微流体生物芯片系统来避免这样做。
单核细胞被认为是SCD中内皮活化的主要炎症介质。Belcher等人，“Activatedmonocytes in sickle cell disease:potential role in the activation of vascularendothelium and vaso-occlusion(在镰状细胞病中的活化单核细胞：在活化血管内皮和血管闭塞中的潜在作用)”Blood 96：2451-2459(2000)；和Perelman等人，“Placentagrowth factor activates monocytes and correlates with sickle cell diseaseseverity(胎盘生长因子活化单核细胞，并与镰状细胞病的严重程度相关)”Blood 102：1506-1514(2003)。在一个实施方案中，包含CD11b的SCD微流体生物芯片分离活化的WBC。在一个实施方案中，活化的WBC是单核细胞。
在其它实施方案中，微流体生物芯片可包括涂覆有CD146抗体的微通道，以对成熟的循环内皮细胞定量。在另一个实施方案中，本发明涉及包含vWF或血栓调节蛋白以通过图像分析定量CEC的微流体SCD生物芯片。Lin等人，“Origins of circulating endothelialcells and endothelial outgrowth from blood(血液循环内皮细胞和内皮长出的起源)”J Clin Invest 105：71-77(2000)。尽管稀有CEC的隔离在技术上是有挑战性的，但是这些细胞已经通过FACS在未操作的血液中使用CD146标记物鉴定。Samsel等人，“Imaging flowcytometry for morphologic and phenotypic characterization of rare circulatingendothelial cells(成像流式细胞术用于罕见循环内皮细胞的形态学和表型表征)”Cytometry Part B,Clinical Cytometry(2013)。
本文所述的微流体生物芯片中的单个细胞的生物物理探测需要精确控制，测量和估计粘附细胞附近的流速。这些测量值和估计值使能进行关于微流体通道中的流动的理论计算。可以通过围绕粘附的细胞的颗粒图像跟踪并使用非粘附的流动细胞作为测量局部流速的自由流动颗粒来进行这些预测的流速的精度与测量的局部流速相比较的验证。(图11A)当自由流动的颗粒(例如细胞)在相对长的照相机曝光时间成像时，由于运动模糊，它们表现为直线，这也被称为条纹。这些条纹的长度与流动的颗粒速度成比例。(图11A)。通过使用等式1将条纹线长度(Lp)减去平均细胞尺寸(dp)除以相机曝光持续时间(tp)来确定用于流动细胞的局部流速(vp)：
Vp＝(Lp-dp)/tp (1)
然后，分析测量的局部流速和由体积流量(Q)和微通道的尺寸(宽：wc，和高：hc)确定的预测平均流速(vm)之间相关性，使用公式2：
vm＝Q/(wcxhc) (2)
数据表明，测量的局部流速显示与预测流速的显著相关性(Pearson 相关系数为0.94，p<0.001，n＝9，R2＝0.88)。(图11B)因此，使用平均理论流速来确定用于分离含有HbA和HbS的RBC的剪切应力和阻力水平。(图11C，11D和11E)。
测定粘附的RBC的相对位置和粘附的RBC的流速，以及在分离时作用于细胞上的剪切应力和阻力力。将粘附的RBC定位在微通道的中间区域中，其中流动速度在通道上是均匀的。数据表明：i)高达4.3倍的更大的流速(图11C)；ii)4.3倍大的剪切应力(图11D)；和iii)与含有HbS的可变形RBC相比，需要4.1倍更大的阻力(图11E)来分离非可变形的含HbS的RBC(p<0.05，用Fisher's事后检验的单因素ANOVA)。相比之下，含HbA的RBC和可变形的含HbS的RBC在分离时在流速、剪切应力和阻力方面没有不同(p>0.05，用Fisher's事后检验的单因素ANOVA)。这些结果证实含有HbS的RBC在其对FN的粘附强度方面是异质的。
使用在0.28秒内拍摄的连续高分辨率显微镜图像评价流动起始时粘附的RBC的运动，以分析HbA，HbS可变形和HbS非可变形的RBC中的粘附位点。(图12A-L)。数据表明，HbA和HbS可变形细胞响应于流体流动方向而显示旋转运动，指示单个粘附枢转点。(图12D和12H)。另一方面，HbS非可变形的细胞不响应于流体流动方向而显示旋转运动，这意味着多个粘附位点。(图12L)。重要的是，这些观察表明，HbS非可变形细胞的较高的粘附强度可能是由于更多的粘附位点而引起。
实施例
实施例1
HemeChip技术为临床设施在诊断SCD中面临的挑战提供了新颖和创新的解决方案。在短短十分钟内，HemeChip使用醋酸纤维素电泳将少于5微升的血液分离成显示基本类型的血红蛋白A，A2，S，C和F的条带。运行和制造每个芯片的成本小于$2.00，Hemechip系统易于使用和运输。此外，该芯片的简单设计易于批量生产。Hemechip技术提供了一种准确，高效，快速和廉价的诊断SCD的方法。
材料和方法
HemeChip材料
1.5mm厚的聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)片材购自McMaster-Carr(Elmhurst，IL)，并且1/32”厚的PMMA片材购自ePlastics(San Diego，CA)。3M光学透明双面胶(DSA)(8142型)购自iTapeStore(Scotch Plains，NJ)。从用去离子水(MilliQ Academic，Billerica，MA)稀释的10×TBE缓冲溶液(Invitrogen TM，Carlsbad，CA)制备1×Tris/硼酸盐/EDTA(TBE)缓冲溶液(pH 8.3)。醋酸纤维素膜购自Apacor并由VWR International LLC(Radnor，PA)分销。300V电源从VWR International LLC(型号302，Radnor，PA)购买。Ponceau S Stain，血红蛋白AFSC对照和Super Z微量施用器购自Helena Laboratories(Beaumont，TX)。乙酸冰酸盐购自Fisher Scientific(Waltham，MA)。石墨电极(0.9mm)购自Amazon(Seattle，WA)。黑色1/8”直径点购自Mark-It(Tonawanda，NY)。
HemeChip制造和装配
使用1.5mm和1/32”厚度的PMMA片材制造HemeChip。有5层PMMA(50mm×25mm)，并且这些层使用DSA组装(图1A)。我们使用用于制造单独的PMMA层的VersaLASER系统(UniversalLaser Systems Inc.，Scottsdale，AZ)，激光微加工系统，以及用于附接层的DSA。HemeChip的顶层和底层由1/32”厚的PMMA片材制成，其余的层由1.5mm厚的PMMA片材制成。DSA具有50μm的厚度。用于实验的醋酸纤维素纸也使用VersaLASER系统切割(39mm×9mm)。我们还使用与PMMA类似的制造方法制造了用于HemeChip的样本加载单元。将该单元与通过手动分析血液样本应用的横截面积和重复性的手动冲压进行比较。
使用CorelDRAW Suite X6(Corel Corporation，Ottawa，Ontario)和SolidWorks 3DCAD(Waltham，MA)绘制HemeChip的CAD设计(图1B)。设计被导出到VersaLASER系统的界面，用于制作这些层。VersaLASER系统的切割功率通过设置激光器强度调整的“矢量切割”来准备。对于“矢量切割”，以45％的设置(最小：-50％，最大：50％)切割PMMA片材和DSA。我们使用-40％的设置来切割醋酸纤维素纸。在纤维素纸的塑料背部的两端形成用于弯曲纸的非贯穿切口(图1C)。弯曲有利于用于电泳的缓冲溶液和纸接触。使用在激光器的强度调节下的“Raster”设置的50％(最小：-50％，最大：50％)的设置，在离开端部3.0mm处产生非贯穿切口。
血液制备
在机构审查委员会(IRB)批准下，从University Hospital's Hematology andOncology Division(Cleveland，OH)获得被丢弃和去标识的患者血液样本。将血样收集到含有EDTA抗凝血剂(BD，Franklin Lakes，NJ)的Vacutainer管中。将全血样本在10℃下储存，并通过重力分离成血浆和血细胞比容。将每个样本的血细胞比容与去离子水以1:5的比例混合，并置于冰块上15分钟以裂解红细胞。将制备的样本在10℃下储存在单独的密封微管中，并在使用前温和混合。使用样本并从接收日期起储存至两周。或者，可以用1％皂苷+TBE缓冲液在芯片上裂解全血样本。
HemeChip分析
将醋酸纤维素纸用40μL的1×TBE缓冲液经由移液管浸泡通过HemeChip的样本加样口，直到通过毛细管作用完全饱和。使剩余的缓冲液干燥或重新分布通过纸5分钟。使用微量施加器通过样本加载端口将小于1μL的制备的血液样本冲压到纸上。将大约200μL的1x TBE缓冲液移液到每个缓冲液端口中。石墨电极(1英寸长)垂直放入缓冲液端口。HemeChip使用小型电源在250V的恒定电压和5mA的最大电流下运行8分钟。任选地，将丽春红染料(25μL)吸移到纸上，并静置浸泡5分钟。使用5％乙酸洗涤液以除去染色剂，直到血红蛋白带可见并且纸恢复其原始白色。四个黑色1/8”直径点被放置在每个角落，用于移动和基于web的图像处理软件。
图像处理
使用具有40mm f/2.8G AF-S DX Micro NIKKOR透镜(Tokyo，Japan)的Nikon D3200照相机来捕获每个HemeChip的近距离照片。使用ImageJ版本1.48对于没有额外的插件的Windows处理图像。在每个图像中，只有纸被裁剪并用于分析。减去背景特征用于应用具有25个像素的半径的“滚动球”算法，以从纸张去除平滑连续的背景噪声。使用绘图轮廓工具(Plot Profile)、表面绘图(Surface Plot)和凝胶绘图(Gel Plot)工具来可视化和定量血红蛋白带。绘图轮廓工具提供沿着纸的相对像素强度，并用于识别对应于每种类型的血红蛋白带的峰。使用凝胶绘图工具计算每个峰下的面积，并且表示成相对血红蛋白百分比。使用气相色谱中常用的谷-谷方法概述每个峰的面积。使用表面绘图工具获得血红蛋白带的3D表面轮廓。在MATLAB中计算带距离以鉴定轮廓图上每个峰的坐标。使用从ImageJ获得的HemeChip长度-像素比将它们从像素转换为mm。使用相同的程序来量化来自标准台式电泳装置的血红蛋白结果。
数据分析
使用条形图和相关绘图分析和比较从HemeChip，HPLC和台式电泳获得的血红蛋白百分比。对用于HemeChip实验的相同血液样本的HbC/A2，HbF，HbS和HbA0的血红蛋白鉴定在大学医院病例医疗中心的核心实验室通过高性能液相色谱(HPLC)使用Bio-RadVariant II仪器(Bio-Rad，蒙特利尔，QC，加拿大)来进行。还用我们实验室的传统台式电泳装置(HelenaLaboratories(海伦娜实验室)型号G4063000，Beaumont，TX)分析样本。
基于Web的图像处理和量化
图像处理算法：在该示例中，使用MATLAB软件开发图像处理算法。简而言之，算法首先读取彩色图像，检测参考点并校准芯片和通道的图像尺寸。然后，算法识别沿着位于通道中间的参考线的每个像素的红色、蓝色和绿色值的变化。该识别导致峰值的检测，其对应于通道中的微红色区域。一旦确定了该微红色区域，则计算每个区域的面积和距起始点的位移。面积和距离用于确定血红蛋白病的类型。
为了具有独立于移动操作系统的图像分析系统，我们设计了与云计算资源兼容的图像处理模块。因此，具有web浏览器和因特网连接的任何移动设备可以用于从HemeChip获取图像，将图像传送到云计算服务器以用于分析并在web浏览器上接收/显示结果。
我们使用MATLAB Compiler SDK TM(软件开发工具包)从MATLAB代码产生一个.dll文件以在.NET框架中处理。生成的.dll文件和Bootstrap框架用于开发Asp.Net项目。首先，网页将HemeChip的图像转换为mw数组(mwArray)对象，并将其传输到在后台运行MATLAB代码的.NET库。然后该函数的输出生成另一个mwArray对象，并传回网页进行显示。我们计划通过去除ASP.NET层和集成完全可扩展的云计算系统来提高图像分析的时间效率。在该设计中，图像处理请求将被传送到排队服务。排队服务将向后台工作者分发处理请求以便执行请求，并且将基于请求量自动执行可伸缩性。还可以开发移动设备应用，而不是在web浏览器上运行分析工具。在移动设备上具有应用允许控制相机特征并获取校准的HemeChip图像。
统计分析
使用单因素方差分析(ANOVA)测试统计评估不同血红蛋白类型的带运行距离(Minitab16软件，Minitab Inc.，State College，PA)。使用皮尔森积矩(Pearson-product-moment)相关系数和Bland-Altman分析评价HemeChip和HPLC测量的血红蛋白浓度之间的相关性和一致性。在Bland-Altman分析中的一致限度被定义为平均差±1.96乘以差异的标准差。所有测试的统计显著性设置在95％置信水平(p<0.05)。利用接受者操作曲线来评估不同血红蛋白表型基于其在HemeChip中的行进距离的分化。灵敏度计算为#真阳性/(#真阳性+#假阴性)，特异性计算为#真阴性/(#真阴性+#假阳性)。在本研究中获得的HemeChip数据报告为均值±标准差。图中的误差棒表示标准差。
结果
HemeChip设计和操作
该技术的基础是血红蛋白电泳并简要解释。血红蛋白类型C，A2，S，F和A0在缓冲液中具有净负电荷，pH在6.5至9.0的范围内。我们使用1x Tris/硼酸盐/EDTA(TBE)缓冲液以在pH8.3下提供用于导电性的必要离子。当置于电场中时，血红蛋白的总体负净电荷导致它们朝向正电极行进。血红蛋白迁移率的差异允许在筛分介质(醋酸纤维素)内发生分离，如图1C所示。HbA0具有最高的移动性和行进最远。相比之下，HbC/A2具有最低的迁移率并且行进最少。在本文中，归因于它们相似的迁移率，我们将HbC和HbA2组合一起。
我们在开发HemeChip中利用微工程设计和多层层压方法。HemeChip由聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)基底组成，其包括电极、缓液端口和其中发生血红蛋白分离的醋酸纤维素纸(图1A)。微芯片系统允许快速手动组装，并利用微小量的血液工作(图1D)。将指尖或足跟体积血样(20μL)与去离子水混合用于细胞裂解，并将少于1μL的血样冲压在HemeChip中的醋酸纤维素纸上。
使用石墨铅笔铅作为电极以施加由电源(VWR，型号302)产生的恒定电压。样本的分析在高达5mA的恒定250V下需要8分钟。图2显示在这些条件下HemeChip上患者样本与镰状细胞性状(SCT)的血红蛋白分离的时间流逝。HbS和HbA0带之间的分离对于肉眼是可见的(图2A，iii)。由于低血细胞比容水平的结果，使用丽春红染色对于具有较暗带的样本是任选的。这个过程可以在HemeChip上完成。
HemeChip量化
使用数码相机捕获所得的血红蛋白带。然后使用ImageJ中的各种工具对它们进行可视化和定量。我们绘制了沿着醋酸纤维素纸的长度的血红蛋白带的强度分布(图3，ii)。每个图的原点对应于样本施加点的中心。每个峰表示血红蛋白带，每个峰下的面积表示该带的血红蛋白的相对量。我们将血红蛋白的量表示为相对于样本中其他血红蛋白带的百分比(图3，iv)。3D表面绘图也用于可视化横跨醋酸纤维素纸的血红蛋白带(图3，iii)。我们使用这种方法分析了12个血样，总共43个实验。这些样本包括以下：2x HbSS，1x HbSS HPFH，1x脐带血(高HbF)，3x HbSC和5x HbSA。HemeChip结果针对HPLC(Bio-Rad VARIANTTM II血红蛋白测试系统)和传统的台式电泳(Helena Laboratories型号G4063000，Beaumont，TX)进行基准比对。
图3A显示了具有遗传性胎儿血细胞凝集素(HPFH)持续性的SCD患者、纯合HbSS的分析。HemeChip分析表明，高水平的HbS和低水平的HbC/A2和HbF。这些结果与通过HPLC和台式电泳获得的结果一致(图3A，iv)。类似地，图3B显示具有镰状细胞性状(SCT)、杂合HbSA的患者的分析。HemeChip结果显示高水平的HbS和一些HbA0，符合标准临床方法。相比之下，HemeChip能够检测具有低HbS和高HbA0的样本的SCT，这也符合标准方法(图6，C)。在视觉上和定量上成功地识别了C/A2，S，F和A0血红蛋白类型。对Hemogblin SC病，HbSC的类似分析显示在图1中。总体而言，HemeChip能够区分不同类型的血红蛋白疾病，包括纯合HbSS(SCD)，杂合HbSA(SCT)和HbSC(血红蛋白SC疾病)。
HemeChip诊断功效
为了评估HemeChip的诊断功效，我们将血红蛋白百分比与从12个血液样本的HPLC获得的那些进行比较，总共有43个实验。这些样本包括以下：2x HbSS，1x HbSS HPFH，1x脐带血(高HbF)，3x HbSC和5x HbSA。图。图4A-E显示HemeChip与HPLC血红蛋白百分比的相关性图。每个数据点代表来自单个样本的平均血红蛋白百分比。实线对角线表示每个数据集的趋势线。我们使用皮尔森积矩相关系数(PCC)来评估两种方法之间的一致性。血红蛋白类型C/A2，S，F和A0显示高正相关性，p<0.001，(PCCHbC/A2-0.99，PCCHbs-0.99，PCCHbF-0.99，PCC，HbA0-0.96)。对于所有组合的血红蛋白类型，也观察到高正相关(p<0.001，PCC＝0.99)(图4E)。
我们还使用Bland-Altman图评估了HemeChip和HPLC结果之间的一致性。图4F显示估计(HemeChip)和实际(HPLC)％HbS之间的强一致性(SD差异＝7％HbS)。实线表示平均差，虚线表示两个标准偏差的差。实际和估计的％HbS(95.5％)之间的大部分差异在差异的平均值的两个标准差内。血红蛋白类型由有色点表示。
通过在设定条件(250V，<5mA，8分钟)下分析来自施加点的每个条带的行进距离(mm)来完成血红蛋白条带鉴定。图5A比较每种血红蛋白类型的行进距离。数据集由11个不同的患者血液样本(3x SS，2x SS HPFH，2x脐带血(高HbF)，2x SC，2x SA)和32个实验，产生多个血红蛋白带(20x HbC/A2，28x HbS，11×HbF和7×HbA0)。每个血红蛋白组的单独水平线代表数据集的均值(HbC/A2＝6.3±0.9mm，HbS＝9±1mm，HbF＝10.9±0.7mm；和HbA0＝13±1mm)。血红蛋白组组之间的水平线表示基于单因素方差分析(ANOVA)测试的统计学显著差异(p<0.001)。使用接受者操作曲线(ROC)来基于其在HemeChip中的行进距离来评估不同血红蛋白表型的分化(图5B)。HbC/A2与HbS的比较产生灵敏度＝0.90和特异性＝0.89。HbS与HbF的比较产生灵敏度＝0.09和特异性＝0.92。HbF与HbA0的比较产生灵敏度＝1.00和特异性＝0.86。
使用新颖的HemeChip，我们已经能够成功地鉴定和量化血红蛋白类型C/A2，S，F和A0。我们已经表明，HemeChip可以区分不同类型的血红蛋白病症，包括纯合HbSS(SCD)，杂合HbSA(SCT)和HbSC(血红蛋白SC疾病)。肉眼可见血红蛋白带之间的分离。定量分析显示HemeChip血红蛋白百分比与HPLC和台式电泳结果相当。
HemeChip提供了超过当前诊断SCD的方法的几个优点。第一个优点是HemeChip的低成本。对于不到$2.00，我们可以生产HemeChip所有必要的试剂。相比之下，我们的实验室目前在大学医院案例医疗中心(Cleveland，OH)的核心实验室为HPLC分析每样本支付19.25美元。类似地，我们实验室的标准台式电泳设备需要比HemeChip多大约15倍的醋酸纤维素纸和试剂的材料。与HemeChip相比，包括这些标准系统的初始投资显著增加了成本差异。
第二个优点是用于POC诊断的HemeChip的便携性和易用性。HemeChip目前需要电源、相机和计算机。这意味着HemeChip可以在任何带电源插座的地方使用，并且不需要专门的实验室环境。HemeChip上的样本处理非常简单，包括准备样本，加载缓冲液，打开电源。尽管本文中的样本主要是在ImageJ中分析的，但我们已经开发了一个用于移动设备的基于Web的初步图像分析软件。讨论原型并将其与图7中的手动图像处理进行比较。结果分析将简单地涉及拍摄HemeChip的图片并将其上传到自动化应用程序。该软件将进一步提高HemeChip的便携性和易用性。与HPLC和台式电泳相比，HemeChip的总体简单性允许任何具有基本实验室技能的用户便宜且准确地检测SCD，SCT和血红蛋白SC疾病。
HemeChip的第三个优点是其运行时间短。在20分钟内，HemeChip技术可以处理、分析和向用户显示结果(不包括染色)。诊断时间的这种显著减少允许在临床技术人员的数量有限的情况下有更高的患者吞吐量。由于HemeChip是为个体样本设计的，患者可以在测试完成后立即收到结果。相比之下，标准台式电泳通常分批运行，这将结果延迟给患者。这在缺乏用于在患者离开POC之后联系患者的系统的领域中是至关重要的。
使用脐带血样本，我们另外能够理解新生儿患者中胎儿血红蛋白(HbF)的高表达。胎儿血红蛋白表达在健康婴儿中为50-95％，并在6个月的过程中下降。到成年期，小于总血红蛋白的1％是HbF。个体RBC病症如SCD和β-地中海贫血中HbF表达也增加。这种血红蛋白的高表达在许多新生儿中掩盖经典的SCD表型，在6个月后变得有症状。HemeChip检测HbF，并且它可以与HbA和HbS二者区分开。为了提高HemeChip装置的诊断精度，我们研究了可以减少血液样本中HbF表达的方法。
正在开发新的方案，其中使用柠檬酸盐磷酸盐从RBC沉淀HbA和HbS。在洗脱后，成体血红蛋白升高到在管底部的含有胎儿血红蛋白的细胞上方。然后将含有成体血红蛋白的上清液用于运行HemeChip实验。利用这个新的方案，RBC的裂解步骤被绕过，胎儿血红蛋白浓度降低。到目前为止，我们已经发现，在未离心的样本中，柠檬酸磷酸盐的暴露使HbF蛋白浓度降低50％。
实施例2
微流体生物芯片制造
通过使用VersaLASER系统(Universal Laser Systems Inc.，Scottsdale，AZ)切割入口和出口(直径0.61mm，间隔26m)制备PMMA顶部部件。双面胶(DSA)膜(iTapestore，ScotchPlains，NJ)被切割以适应PMMA部分和28×4mm通道的尺寸。然后将DSA附接到PMMA顶部部分，以在DSA膜的轮廓之间包括入口和出口。金密封玻璃载玻片然后与PMMA-DSA结构组装以形成微流体通道。
表面化学
通过在0.25mL DMSO中溶解25mg GMBS来制备GMBS储备溶液，并用乙醇稀释储备溶液以获得0.28％v/v GMBS工作溶液。FN用PBS稀释以产生(1:10)FN工作溶液。通过在1mL PBS中溶解3mg冻干的BSA制备BSA溶液。
组装后，用30μLPBS和乙醇洗涤通道。接下来，将20μL交联剂GMBS工作溶液注入通道两次并温育15分钟。在GMBS孵育后，用30μL乙醇和PBS洗涤通道两次。接下来，将20μL的FN溶液注入通道中并在室温下温育1.5小时。
然后通过注入30μL的BSA溶液并在4℃下过夜孵育来钝化表面。在处理血液样本之前，用PBS冲洗通道。
血液处理
丢弃的去标识的患者血液样本从大学医院的血液学和肿瘤学部在机构审查委员会(IRB)批准下获得。将血液样本收集到含有EDTA的紫色帽Vacutainer管中。在用于实验之前，将血液样本等分到密封的微管和密封的注射器中以使暴露于环境空气最小化。使用NewEra NE-300注射泵系统(Farmingdale，NY)施加通过通道的血流和遵循FCSB流动步骤。在注入微通道之前和期间，将血样保持密封并直立在1mL的一次性注射器中。接下来，以28.5μL/min将血液引入微通道，直到通道充满血液，然后以2.85μL/min的流速注射15μL血液样本。接下来，更换注射器，并以10μL/分钟的流速将120μL的FCSB引入通道以除去未粘附的细胞。使用倒置荧光显微镜(Olympus IX83)和荧光显微镜照相机(EXi Blue EXI-BLU-R-F-M-14-C)观察通道中的附着RBC。在实时显微镜成像和以7fps速率的高分辨率视频记录期间，施加以逐步增量的受控流体流，直到从微通道表面观察到RBC分离。
微流控通道可视化和图像处理
在该研究中，使用具有Olympus Cell Sense活细胞成像和分析软件的Olympus 1X83倒置机动化显微镜来获得实时显微镜记录。Olympus(20x/0.45ph2和40x/0.75ph3)长工作距离物镜用于微通道中单个RBC的相衬成像。(图9A)。视频以7fps记录，并转换为单帧图像以进行进一步处理和分析。通过使用Adobe Photoshop软件(San Jose，CA)分析细胞尺寸。
根据记录的图像中的流动的生物物理性质分析粘附的RBC，并且我们利用自由流动的细胞(在1.5ms照相机曝光时间作为模糊线出现)用于确定局部流速。(图10A)。此外，在以每秒7帧拍摄的记录的连续图像中重新分析细胞粘附、细胞流动变形和细胞分离。
数据分析
使用描述矩形通道中的压力驱动流的等式3和4计算粘附的RBC上的流速：
其中x，y和z是主轴，h和w是通道高度和宽度，n是流体粘度，dp/dx是沿x轴的压力变化，Q是体积流量。参见表1。
表1 在RBC分离时的阻力量化中使用的参数
值
测得的RBC宽度 4.47-8(μM)
HBA 6.73-8(μM)
HbS可变形 4.8-7.84(μM)
HbS非可变形 4.47-7.36(μM)
RBC厚度 2.25(μM)
微通道高度 50(μM)
微通道宽度 4(mm)
缓冲液密度 993Kg/m3
缓冲液粘度 0.001 Pa-d
使用阻力方程式(等式5)计算施加在粘附的RBC上的阻力：
其中Fd是阻力力，p是流体密度，Cd是阻力系数，A是参考面积。根据圆盘平行于低雷诺数流动下的细胞的流动假设，Cd计算为13.6/Re，其中Re是雷诺数。Munson等人，见：Fundamentals of Fluid Mechanics，第七版；John Wiley&Sons Canada：Mississauga，ON，Canada，2012；P792。A，参考面积通过使用典型的RBC厚度和在分离时测量的RBC宽度计算。粘附表面上的剪切应力(7)使用等式6计算：
T＝6nQ/wh2 (6)
统计分析
在本研究中获得的数据被报告为均值±均值的标准误差。使用Fisher's事后检验的方差分析(ANOVA)多重比较(每组n＝3-6个血液样本)，对细胞纵横比，纵横比变化(变形性)，流速，剪切应力和阻力进行统计学评估(Minitab 16软件，Minitab Inc.，State College，PA)。所有测试的统计显著性设置在95％置信水平(p<0.05)。图中的误差条表示均值的标准误差。
数据聚类：使用K-均值聚类方法分析全血细胞计数的各个组分和粘附的RBC的数量之间的关系。使用K-均值将患有HbSS的患者聚类成两组，并且评价所得组的疾病严重性的差异。在K-均值聚类中使用全血细胞计数的单一组分以及多种组分来鉴定两个亚组。一旦鉴定了亚组，使用单因素ANOVA试验测试这些组之间粘附的RBC的数量之间的差异的统计学显著性。测试水平(α)设定为0.05(双侧)。本文报道了根据粘附的RBC数目之间的差异导致显著亚组的一种或多种组分。使用(The MathWorks，Inc，Natick，MA)进行K均值聚类。
接受者操作特性(ROC)曲线：接受者操作曲线用于测定SCD-Biochip对血红蛋白表型之间的分化的准确性。使用(MathWorks，Inc，Natick，MA)产生曲线。除了曲线下的面积之外，如下计算灵敏度、特异性、阳性和阴性似然比以及阳性和阴性预测值：灵敏度计算为#真阳性/(#真阳性+#假阴性)，特异性为#真阴性/(#真阴性+#假阳性)。阳性似然比定义为灵敏度/(1-特异性)。阴性似然比是(1-敏感性)/特异性。阳性预测值为#真阳性/(#真阳性+#假阳性)，阴性预测值为#真阴性/(#真阴性+#假阴性)。
实施例3
本实施例描述了包括至少一个包含纤连蛋白(FN)官能化玻璃表面的蚀刻微通道的微流体生物芯片。生物芯片还包括具有蚀刻入口和蚀刻出口的聚(甲基丙烯酸甲酯)塑料顶部。顶部还包括在中间的限定微通道的轮廓和宽度(例如，大约50μm)的双面粘合剂膜。(图9A和13C)。此外，微流体系统可以放置在用于高分辨率活单细胞图像记录和分析的OlympusIX83倒置机动显微镜载物台上。
FN在血浆中循环并存在于内皮细胞膜中。FN被认为是粘附性糖蛋白，已经显示其在HbSRBC对内皮壁的粘附中起作用。Kasschau等，Blood(血液)87(2)：771-780(1996)；Wick等人，Current opinion in hematology(血液学中的当前观点)3(2)：118-124(1996)；Mosher，D.F.，Annual Review of Medicine(年度医学评论)35：561-575(1984)；和Kumar等，Blood(血液)88(11)：4348-4358(1996)。FN固定在微流体通道表面上以部分模拟内皮壁特征。微流体设计允许精确控制与微脉管系统中的生理条件类似的流速，导致在表面上具有直的和平行流线的层流条件。Lipowsky，H.H.，Microcirculation 12(1)：5-15(2005)。微流体通道中的层流轮廓使得流动的RBC与FN固定的表面相互作用，并且能够附着具有增加的粘附性质的那些RBC。(图9B)。所得数据显示出，来自患有HbS的受试者的血液样本中形态学异质性RBC群体的粘附。(图9C)。当测试HbA血液样本时未观察到该粘附(数据未显示)。粘附的RBC包括来自单个含HbS的血液样本的相同视野内的轻度镰状(图9C(i))，中度镰状(图9C(ii)和高度镰状(图9C(iii))细胞形态。
在三种条件下分析这些数据的纵横比(AR)和单一含HbA或HbS的RBC的变形性：(1)无流动，(2)流动，和(3)分离时。数据显示了在变形性方面的含有HbS的RBC的两个亚组：HbS可变形的和HbS非可变形的。(图10A)。相对于没有流动条件的细胞纵横比变化被用作变形性的量度，其中细胞纵横比的更大变化转化为更多的变形性，因此更少的刚度。流速以逐步的方式增加。在时间流逝实验中分离之前，在最大流速下评估每个RBC的细胞变形性。该分析提供了粘附的细胞的最大变形估计。(图10B和10C)。
含HbA的RBC在无流动时显示出比含HbS的RBC显著更大的细胞纵横比(即，例如圆形度)(p<0.05，用Fisher's事后检验的单因素ANOVA)。在流动存在下，HbA RBC的纵横比显著降低(p<0.05，用Fisher's事后检验的单因素ANOVA)，这意味着更高的变形性。与无血流条件相比，含有HbS的可变形RBC仅在分离瞬时呈现纵横比显著降低(p<0.05，用Fisher's事后检验的单因素ANOVA)。实际上，HbS非可变形RBC的纵横比在任何流动条件下都不改变(p>0.05，用Fisher's事后检验进行单因素ANOVA(图10B)。
与HbS非可变形的RBC相比，HbS可变形RBC在无流动时显示出显著更大的细胞纵横比，在分离时显示出显著更大的变形性(p<0.05，用Fisher's事后检验的单因素ANOVA)。(图10B和10C)。在所有流动条件下，含有HbA的RBC的变形性显著大于含有HbS的RBC(p<0.05，用Fisher's事后检验的单因素ANOVA)。当在流动期间测量时以及在分离时测量时，含有HbA和HbS的可变形RBC的变形性显著不同(p<0.05，使用Fisher's事后检验的单因素ANOVA)。然而，在这些相同的条件下，HbS非可变形的RBC在该间隔期间不显示任何显著的变形性差异(p>0.05，用Fisher's事后检验的单因素方差分析)。当含有HbS的RBC粘附在模拟SCD中正常血流的特征的表面(即，例如FN官能化的表面)上时，其纵横比和变形性是异质的。(图10C)。
在另一个实施例中，微流体通道由用FN或LN官能化的玻璃表面，聚(甲基丙烯酸甲酯)塑料顶部(包括入口和出口)和夹在中间的50μm厚的双面胶带组成，所述双面胶带限定微通道的高度和形状(图13)。FN是在血浆中循环并存在于内皮细胞膜中的糖蛋白。FN在SCD RBC粘附中起作用，通过RBC整联蛋白α4β1与内皮壁的相互作用。LN是亚内皮的并且结合来自免疫球蛋白超家族BCAM/LU的重要RBC表面蛋白，其在β-肾上腺素能刺激期间被磷酸化。
在FN或LN固定的微流体通道内量化粘附的RBC的数量。我们观察到RBCs在来自患有SCD的受试者的血液样本中的异常粘附。另一方面，来自正常受试者的血液样本中的RBC的粘附是可忽略的(未示出)。在SCD-Biochip内的FN和LN涂覆的微通道表面的高分辨率相称图像揭露粘附的RBC的异种镰状形态。在具有多种临床表型的患者中观察到一系列RBC粘附。
我们分析了来自患有HbAA、复合杂合HbSC或HbS+β-地中海贫血(HbSC/S+)或纯合HbSS的受试者的血液样本中的FN和LN官能化微通道中每单位面积(32mm2)的粘附的RBC的数量，使用来自微流体通道的高分辨率图像(图14)。在具有不同血红蛋白表型的血液样本中，粘附的RBC的数量在FN(P＝0.023和P＝0.002)和LN(P＝0.024和P＝0.011，图14C和图14D)中的HbSS>HbSC/Sβ+>HbAA血液样本中显著更高。此外，在FN(P＝0.002)和LN(P＝0.027)官能化微通道(图14C和14D)中，HbSC/Sβ+血液样本显示比HbAA血液样本显著更高数量的粘附RBC。
接下来，我们绘制接受者操作特征(ROC)曲线，以评估SCD-Biochip通过粘附精确测定血红蛋白表型的能力(图14E和14F)。对于粘附的RBC数目的选定阈值(图10E和10F)，我们观察到0.93个真阳性率和0.00个假阳性率，用于HbSS和HbAA表型之间的区分。对于FN和LN，区分HbSS和HbAA的曲线下的面积大于0.85。这些结果证明了SCD生物芯片通过细胞粘附区分血红蛋白表型的能力。这些数据可以进一步支持异常细胞粘附在说明SCD表型中起作用，其中HbSS更溶血，HbSC较少溶血。
由于HbF在SCD中的改善作用，我们研究了具有低(<％8)和高(>％8)HbF水平的HbSS血液样本中的RBC粘附(图15)。当比较时，在FN(P＝0.015，图15A)和LN(P＝0.022，图15B)官能化微通道中，来自具有低HbF的受试者的血液样本中的粘附的RBC的数量显著高于高HbF水平。这些研究结果建立SCD生物芯片作为SCD的功能表型的体外粘附测定的基础依据，以及对这些表型的新型治疗的影响。
基于护理标准血液测试结果和血红蛋白测试结果的单一组分，我们利用K均值聚类分析来识别HbSS患者中的亚组。我们分析了来自患有各种临床表型(包括高和低乳酸脱氢酶(LDH)，血小板计数(plts)和网织红细胞计数(retics))的患者的HbSS血液样本中的FN和LN微通道的RBC粘附(图16)。我们观察到高LDH水平(>500u/L)患者的血液样本中的FN(P＝0.0003)和LN(P＝0.003)固定微通道的粘附的RBC的数目显著高于具有低LDH水平(500u/l)的患者(图16A和16C)。此外，来自具有高plts(>320×109/L)的患者的血液样本中的RBC显示出比具有低plts(<320×109/L)的患者对FN固定的微通道(P＝0.046)的显著更高的粘附性(图16B)。此外，与具有低retics(<320 109/L)的患者相比，我们观察到来自具有高retics(>320×109/L)的患者的血液样本中的对LN官能化微通道的显著高的RBC粘附(P＝0.014)(图16D)。
然后，我们分析了FN官能化微通道中粘附的RBC的异质性(图17)。在以0.8mm/s，3.3mm/s和41.7mm/s的逐步增加的流速控制细胞分离后，对HbSS血液样本中的粘附的RBC的形态和数量进行定量(图17A-C)。基于形态学表征，将粘附的RBC分类为可变形的(图17D)和非可变形的(图13E)RBC。计算在0.8mm/s流速下的总粘附RBC的可变形和非可变形RBC的百分比(图17F)。可变形和非可变形的RBC百分比在0.8mm/s时没有显著差异(P＝0.266)。另一方面，在41.7mm/s下，非可变形RBC的百分比显著高于非可变形RBC的百分比(P＝0.047，图17F)。此外，与0.8mm/s相比，可变形RBC的百分比在3.3mm/s和41.7mm/s处显著更低(分别为P＝0.001和P<0.001)。此外，可变形RBC的百分比在41.7mm/s时显著低于在3.3mm/s时(P<0.001)。然而，在0.8mm/s和41.7mm/s之间观察到非可变形RBC的百分比的唯一显著差异(P＝0.003，图17F)。此外，我们观察到在我们受试者中粘附的非可变形的RBC(％)和血清LDH水平之间的显著关联(图13G，皮尔森相关系数为0.79，p<0.005)。这些结果表明粘附RBC中的形态和定性异质性以及溶血和粘附的非可变形RBC之间的关联。
从本发明的上述描述，本领域技术人员将认识到改进、变化和修改。这样的改进、变化和修改在本领域技术范围内，并且旨在由所附权利要求覆盖。本文中标识出的所有专利和出版物通过引用整体并入。
参考文献
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Claims (68)

1.用于检测血红蛋白病症的电泳生物芯片，包括：
外壳，其包括从所述外壳的第一端延伸到第二端的微通道，所述微通道包含至少部分被碱性缓冲溶液饱和的醋酸纤维素纸；
分别通过所述外壳的第一端和第二端延伸到所述微通道和醋酸纤维素纸的第一缓冲端口和第二缓冲端口，所述第一缓冲端口和所述第二缓冲端口能够接收使醋酸纤维素纸至少部分饱和的碱性缓冲溶液；
用于接收血液样本的样本加载端口，所述样本加载端口穿过所述壳体的第一端延伸到所述微通道和所述醋酸纤维素纸；和
用于产生穿过醋酸纤维素纸的电场的第一电极和第二电极，所述第一电极和第二电极分别通过第一缓冲端口和第二端口延伸到所述醋酸纤维素纸。
2.根据权利要求1所述的电泳生物芯片，还包括成像系统，用于对引入所述样本加载端口的血液样本，沿所述醋酸纤维素纸显示和量化血红蛋白变体迁移。
3.根据权利要求1所述的电泳生物芯片，所述外壳包括用于使所述醋酸纤维素纸和血红蛋白变体迁移可视化的观察区域。
4.根据权利要求1所述的电泳生物芯片，其中所述第一电极和所述第二电极连接到电源，所述电源产生约1V至约400V的电场。
5.根据权利要求4所述的电泳生物芯片，其中由所述电极施加到所述生物芯片的电压不超过250V。
6.根据权利要求1所述的电泳生物芯片，其特征在于，导入所述样本加载端口的血液样本小于10微升。
7.根据权利要求1所述的电泳生物芯片，其中所述缓冲溶液包含碱性tris/硼酸盐/EDTA缓冲溶液。
8.根据权利要求1所述的电泳生物芯片，其中所述第一电极和所述第二电极包括石墨电极。
9.根据权利要求1所述的电泳生物芯片，其中所述壳体包括顶盖、底盖和介于所述顶盖和所述底盖之间的通道间隔件，所述通道间隔件在所述壳体中限定所述通道。
10.根据权利要求1所述的电泳生物芯片，其中所述顶盖、底盖和通道间隔件包括玻璃或塑料中的至少一种。
11.根据权利要求2所述的电泳生物芯片，所述成像系统包括用于可视化和量化血红蛋白变体迁移的移动电话成像系统。
12.根据权利要求11所述的电泳生物芯片，其中所述移动电话成像系统包括用于对血红蛋白变体迁移进行成像的移动电话和识别和量化血红蛋白带类型和厚度以做出诊断决定的软件应用。
13.根据权利要求12所述的电泳生物芯片，其中所述血红蛋白带类型包括血红蛋白类型C/A，S，F和A0。
14.根据权利要求11所述的电泳生物芯片，诊断受试者是否具有血红蛋白基因型HbSS，HbSA，HbSC或HbA2。
15.根据权利要求1所述的电泳生物芯片，诊断受试者是否患有镰状细胞病。
16.用于诊断受试者中的镰状细胞病的电泳生物芯片系统，包括：
壳体，其包括从所述壳体的第一端延伸到第二端的微通道，所述微通道包含至少部分被碱性缓冲溶液饱和的醋酸纤维素纸；
分别通过所述外壳的第一端和第二端延伸到所述微通道和醋酸纤维素纸的第一缓冲端口和第二缓冲端口，所述第一缓冲端口和所述第二缓冲端口能够接收使醋酸纤维素纸至少部分饱和的碱性缓冲溶液；
用于接收血液样本的样本加载端口，所述样本加载端口穿过所述壳体的第一端延伸到所述微通道和醋酸纤维素纸；
用于产生穿过所述醋酸纤维素纸的电场的第一电极和第二电极，所述第一电极和第二电极分别通过所述第一缓冲端口和所述第二端口延伸到所述醋酸纤维素纸；和
成像系统，用于对导入样本装载口的血液样本，沿着醋酸纤维素纸显示和量化血红蛋白变体迁移，并且确定受试者是否患有镰状细胞病。
17.根据权利要求16所述的电泳生物芯片系统，所述外壳包括用于使所述醋酸纤维素纸和血红蛋白变体迁移可视化的观察区域。
18.根据权利要求16所述的电泳生物芯片系统，其中所述第一电极和所述第二电极连接到电源，所述电源产生约1V至约400V的电场。
19.根据权利要求18所述的电泳生物芯片系统，其中由所述电极施加到所述生物芯片的电压不超过250V。
20.根据权利要求16所述的电泳生物芯片系统，其中，引入所述样本加载端口的血液样本小于10微升。
21.根据权利要求16所述的电泳生物芯片系统，其中所述缓冲溶液包含碱性tris/硼酸盐/EDTA缓冲溶液。
22.根据权利要求16所述的电泳生物芯片系统，其中所述第一电极和所述第二电极包括石墨电极。
23.根据权利要求16所述的电泳生物芯片系统，其中所述外壳包括顶盖、底盖和介于所述顶盖和所述底盖之间的通道间隔件，所述通道间隔件在所述壳体中限定所述通道。
24.根据权利要求16所述的电泳生物芯片系统，其中所述顶盖、底盖和通道间隔件包括玻璃或塑料中的至少一种。
25.根据权利要求16所述的电泳生物芯片，成像系统包括用于可视化和量化血红蛋白变体迁移的移动电话成像系统。
26.根据权利要求16所述的电泳生物芯片，其中所述移动电话成像系统包括用于对血红蛋白变体迁移进行成像的移动电话和识别和量化血红蛋白带类型和厚度以做出诊断决定的软件应用。
27.根据权利要求16所述的电泳生物芯片，其中所述血红蛋白带类型包括血红蛋白类型C/A，S，F和A0。
28.方法，包括：
提供电泳生物芯片系统，所述电泳生物芯片系统包括：
壳体，其包括从所述壳体的第一端延伸到第二端的微通道，所述微通道包含至少部分被碱性缓冲溶液饱和的醋酸纤维素纸；
分别通过所述外壳的第一端和第二端延伸到所述微通道和醋酸纤维素纸的第一缓冲端口和第二缓冲端口，所述第一缓冲端口和所述第二缓冲端口能够接收使醋酸纤维素纸至少部分饱和的碱性缓冲溶液；
用于接收血液样本的样本加载端口，所述样本加载端口穿过所述壳体的第一端延伸到所述微通道和醋酸纤维素纸；
用于产生穿过所述醋酸纤维素纸的电场的第一电极和第二电极，所述第一电极和第二电极分别通过所述第一缓冲端口和所述第二端口延伸到所述醋酸纤维素纸；和
成像系统，用于对导入样本装载口的血液样本，沿着醋酸纤维素纸显示和量化血红蛋白变体迁移；
将来自受试者的血液样本引入所述样本加载端口，所述血液样本包括至少一个血细胞；和
用所述成像系统对形成于所述醋酸纤维素纸上的血红蛋白带成像，以确定所述受试者的血红蛋白表型。
29.根据权利要求28的方法，其中所述血红蛋白表型选自由HbAA，HbSA，HbSS，HbSC和HbA2构成的组。
30.根据权利要求29的方法，其中所述HbAA血红蛋白表型诊断所述受试者为正常。
31.根据权利要求29的方法，其中所述HbSA血红蛋白表型诊断受试者具有镰状细胞性状。
32.根据权利要求29的方法，其中所述HbSS血红蛋白表型诊断受试者患有镰状细胞病。
33.根据权利要求29的方法，其中所述HbSC血红蛋白表型诊断受试者患有血红蛋白SC疾病。
34.根据权利要求29的方法，其中所述HbA2血红蛋白表型诊断受试者患有地中海贫血。
35.根据权利要求28所述的方法，所述外壳包括用于使所述醋酸纤维素纸和血红蛋白变体迁移可视化的观察区域。
36.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一电极和所述第二电极连接到电源，所述电源产生约1V至约400V的电场。
37.根据权利要求36所述的方法，其中由所述电极施加到所述生物芯片的电压不超过250V。
38.根据权利要求28所述的方法，其中引入所述样本加载端口的血液样本小于10微升。
39.根据权利要求28所述的方法，其中所述缓冲溶液包含碱性tris/硼酸盐/EDTA缓冲溶液。
40.根据权利要求28所述的方法，其中所述第一电极和所述第二电极包括石墨电极。
41.根据权利要求28所述的方法，所述成像系统包括用于可视化和量化血红蛋白变体迁移的移动电话成像系统。
42.根据权利要求41所述的方法，所述移动电话成像系统包括用于对血红蛋白变体迁移进行成像的移动电话以及识别和量化血红蛋白带类型和厚度以做出诊断决定的软件应用。
43.根据权利要求28所述的方法，其中所述血红蛋白带类型包括血红蛋白类型C/A，S，F和A0。
44.微流体生物芯片装置，包括：
外壳，其包括：限定至少一个细胞粘附区域的至少一个微通道，所述至少一个细胞粘附区域涂覆有至少一种生物亲和配体，当含有细胞的流体通过所述至少一个微通道时，至少一种生物亲和配体粘附到感兴趣的细胞；以及成像系统，当所述流体通过所述通道时，所述成像系统测量粘附到所述至少一个微通道内的所述至少一个生物亲和配体的细胞的量，所述生物亲和配体包含纤连蛋白、层粘连蛋白、选择蛋白、血管性血友病因子因子，血栓调节蛋白或CI46抗体中的至少之一。
45.根据权利要求44所述的装置，其中所述成像系统包括无透镜成像系统。
46.根据权利要求45所述的装置，其中所述无透镜成像系统包括电荷耦合器件传感器和发光二极管。
47.根据权利要求44所述的装置，其中所述细胞是从所述受试者获得的血细胞。
48.根据权利要求44所述的装置，其中所述成像系统量化每个相应通道中粘附的细胞以监测从其获得所述细胞的受试者的健康。
49.根据权利要求44所述的装置，其中所述成像系统量化每个相应通道中粘附的细胞以监测从其获得所述细胞的受试者的疾病的进展。
50.根据权利要求49所述的装置，其中所述疾病是镰状细胞病。
51.根据权利要求44所述的装置，其中所述成像系统量化每个通道中粘附的细胞以测量施用于从其获得所述细胞的受试者的治疗性治疗的功效。
52.根据权利要求44所述的装置，所述外壳包括多个微通道，每个微通道具有涂覆有至少一种生物亲和配体的单独的细胞粘附区域。
53.根据权利要求52所述的装置，至少两个微通道包括不同的生物亲和配体。
54.根据权利要求52所述的装置，至少三个微通道包括不同的生物亲和配体。
55.根据权利要求52所述的装置，所述多个微通道包括相同的生物亲和配体。
56.根据权利要求52所述的装置，至少一个微通道包括涂覆在所述微通道的细胞粘附区域上的至少两种不同的生物亲和配体。
57.根据权利要求52所述的装置，其中不同的生物有效配体位于至少一个微通道的细胞粘附区域内的不同位置。
58.根据权利要求44所述的装置，其中所述壳体是由基底层、中间层和覆盖层形成的多层结构，所述至少一个微通道形成在所述中间层中。
59.根据权利要求44所述的装置，所述壳体包括分别与每个微通道的第一端和第二端流体连通的入口端口和出口端口。
60.根据权利要求44所述的装置，其中所述至少一个微通道的尺寸设定为接受微升或毫升体积的血液或含有待粘附细胞的溶液。
61.根据权利要求44所述的装置，其中层粘连蛋白、选择蛋白、血管性血友病因子因子、血栓调节蛋白和C146抗体中的至少一种位于沿所述至少一个微通道的不同位置。
62.一种方法，包括：
提供微流体生物芯片装置，包括外壳，所述外壳包括限定至少一个细胞粘附区域的至少一个微通道，所述至少一个细胞粘附区域涂覆有至少一种生物亲和配体，当含有细胞的流体通过所述至少一个微通道时，至少一种生物亲和配体粘附到感兴趣的细胞；以及成像系统，当所述流体通过所述通道时，所述成像系统测量粘附到所述至少一个微通道内的至少一个生物亲和配体的细胞的量，所述生物亲和配体包含纤连蛋白、层粘连蛋白、选择蛋白、血管性血友病因子因子，血栓调节蛋白或C146抗体中的至少一种；
将源自受试者的血液样本引入所述微通道，其中所述血液样本包含至少一种血细胞；和
对粘附到所述至少一个微通道内的所述至少一种生物亲和配体的细胞的数量进行成像。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述成像系统包括无透镜成像系统。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述无透镜成像系统包括电荷耦合器件传感器和发光二极管。
65.根据权利要求62所述的方法，其中每个相应通道中粘附的细胞的量指示从其获得所述细胞的受试者的健康。
66.权利要求62的方法，其中每个相应通道中粘附的细胞的量指示从其获得所述细胞的受试者的疾病的进展。
67.权利要求66的方法，其中所述疾病是镰状细胞病。
68.权利要求62的方法，其中每个相应通道中粘附的细胞的量指示施用于从其获得所述细胞的受试者的治疗性治疗的功效。
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