KR102083514B1 - 적혈구 변형성 측정장치 및 측정방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 적혈구 변형성 측정장치 및 측정방법에 관한 것으로, 구체적으로 적혈구의 막 커패시턴스의 변화 정도를 측정하는 단계를 포함하는 적혈구 변형성 측정 방법 및 이를 위한 적혈구 변형성 측정 장치이고, 이를 통해 측정 결과의 정확성이 높으면서 측정 방법도 편리하여 매우 효과적이고 임상 적용에 실용적인 적혈구 변형성 측정 방법 및 측정 장치를 얻을 수 있다.
Description
본 발명은 적혈구 변형성 측정장치 및 측정방법에 관한 것으로서, 구체적으로 적혈구의 막 커패시턴스를 이용하여 적혈구의 변형성을 효과적으로 측정할 수 있는 적혈구 변형성 측정 장치 및 특정 방법에 관한 것이다.
우리 인체를 구성하고 있는 조직의 세포들이 살아가기 위해서는 각 세포에 영양분과 산소가 공급되어야 된다. 이러한 물질 전달 기능을 혈액이 담당하고 있으며, 질량 전달을 효과적으로 해주기 위해 아주 미세한 모세 혈관을 혈액이 지나게 된다. 일반적으로 모세혈관의 크기는 2∼5 ㎛이고 적혈구는 그 크기가 평균 7∼8㎛이므로 모세 혈관의 직경이 피 속에 있는 혈구의 크기보다 작다. 이 때문에 혈구들이 자기보다 작은 모세 혈관 속으로 지나 갈 수 있도록 그 형태를 변형시켜야 한다. 혈액을 구성하는 물질들 중에서 적혈구는 거의 50% 정도의 부피를 차지하고 있다. 이러한 적혈구들의 탄력성이 줄어들 경우에는 혈액이 모세 혈관을 지나 갈 수 없게 되어 모세 혈관이 막히게 되고 이에 따라 주위의 세포가 죽게 되어 신장염, 허혈, 심지어 시력을 잃어버리게 된다. 특히 이러한 적혈구는 낮은 세포질 점성, 높은 표면적과 부피 비율 및 충분히 유연한 막을 포함하는 몇 가지 요소에 의해 크게 변형될 수 있고 이러한 높은 변형성 때문에, 적혈구는 크기가 적혈구의 직경보다 더 작은 모세관 네트워크를 통해 통과하는 능력을 갖는다. 그러나, 혈액 질환은 적혈구 변형성을 현저하게 감소시키는 원인이 된다. 낮은 변형성은 모세 혈관에서 혈류를 방해하거나 막게 되는데, 이는 최후에 장기기능 저하를 이끌고, 이에 겸상 적혈구 빈혈증, 당뇨 등의 심혈관계 질환과 연관되는 것으로 알려져 있다. 전혈 점도(whole blood viscosity)에 영향을 주는 많은 결정 인자, 예를 들어 헤마토크리트, 적혈구 변형성, 응집, 침강, 혈장 점도 등이 있다. 그 중에서도 주어진 샘플 부피에 대한 적혈구의 부피비로 정의되는 헤마토크리트(적혈구 용적률)는 전혈 점도에 영향을 미치는 가장 두드러진 생물 물리학적 지표이다. 그리고 적용된 힘에 의해 모양을 변화시키는 능력에 의해 정의되는 적혈구 변형성은 전혈 점도의 이차 결정 요인이다.
병리학적 관점에서 이들은 당뇨병의 위험 인자가 될 수 있다. 일반적으로 당뇨병 환자의 혈중 인슐린 농도가 높으면 적혈구 전구 세포의 증식이 촉진된다. 그 이후, 헤마토크리트를 의미하는 적혈구 수가 증가한다. 반면에 고인슐린혈증이나 인슐린 저항성에 의한 대사 증후군은 세포의 산화적 스트레스를 증가시킨다. 적혈구의 경우, 그의 막은 산화적 스트레스에 의해 손상되어 적혈구의 변형성이 악화된다. 결과적으로, 전혈 점도는 이 두 현상으로 인해 상승하고, 증가된 점도는 제2유형 당뇨병과 관련 있다고 보고되어 있다.
적혈구의 변형성을 측정하기 위해 레이저 회절 측정법을 기반으로 변형성을 측정하기 위한 거시적 규모의 장비가 있다. 현미경으로는 접촉 방식이나 비 접촉 방식으로 분류된다. 접촉 방법의 경우, 단일 적혈구는 원자력 현미경 검사 (AFM) 를 위한 마이크로피펫 또는 캔틸리버에 의해 접촉된다. 적혈구의 음압 또는 표면 분포에 대응하는 단일 적혈구의 흡인 속도는 변형성 측정을 위해 제공될 수 있다. 비접촉 방법의 경우, 이들은 또한 측정에 사용된 샘플의 유형에 따라 분류된다. 단일 적혈구의 경우, 단일 적혈구의 광학 족집게 또는 회절 패턴을 사용하여 변형된 형상이 변형성 측정을 위해 측정될 수 있다. 다른 한편, 희석된 혈액 샘플로부터 나온 신장된 적혈구의 이미지가 직접 분석될 수 있다. 그리고 마이크로 채널을 통과하는 희석된 혈액 샘플에서 적혈구에 의한 전류 변화를 전극을 이용하여 측정한다. 변화하는 전류 신호의 정도는 적혈구의 변형성을 의미한다. 최근에는 헤마토크리트가 높은 혈액 샘플 (4-50%)의 경우 여과-기반 방법이 개발되었다. 마이크로채널 어레이를 사용함으로써 혈류의 평균 속도의 시간 변화를 모니터링함으로써 변형성을 예측할 수 있다. 그리고, 랏쳇(ratchet)-유사 여과 구조는 진동 흐름 하에서 변형성에 기초하여 적혈구를 분류할 수 있다. 여과 방법은 적혈구의 변형성을 측정하기 쉽지만 적혈구의 변형성 뿐만 아니라 백혈구, 대형 파편, 적혈구 응집체와 같은 다른 요소의 영향을 받을 수 있다. 그리고 그것은 신뢰할 수 있는 측정을 위해 불필요한 물질을 배제하기 위한 샘플 준비가 필요하다는 것을 의미한다 (도 1 참조).
따라서, 측정 결과의 정확성이 높으면서 측정 방법도 편리하여 매우 효과적이고 임상 적용에 실용적인 적혈구 변형성 측정 방법 및 측정 장치가 요구된다.
본 발명은 측정 결과의 정확성이 높으면서 측정 방법도 편리하여 매우 효과적이고 임상 적용에 실용적인 적혈구 변형성 측정 방법 및 측정 장치를 제공하고자 한다.
상기 상술한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, 적혈구의 막 커패시턴스(membrane capacitance, CPE)의 변화 정도를 측정하는 단계를 포함하는 적혈구 변형성 측정 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 적혈구의 막 커패시턴스(membrane capacitance, CPE)의 변화 정도를 측정하는 단계는 제1 전단 속도에서의 적혈구의 막 커패시턴스를 측정하는 단계와, 상기 제1 전단 속도와 상이한 제2 전단 속도에서의 적혈구의 막 커패시턴스를 측정하는 단계를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 제1 전단 속도는 0 /s 초과 100 /s 미만이고 상기 제2 전단 속도는 100 /s 이상 10000 /s 미만인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 제1 전단 속도는 10 /s이고 상기 제2 전단 속도는 500 /s 인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 상기 적혈구의 막 커패시턴스(membrane capacitance, CPE)의 변화 정도를 측정하는 단계 이전에, 혈액을 원심분리하여 적혈구를 분리하는 단계와 상기 분리된 적혈구에 경화 화학 물질을 처리하는 단계를 포함하고, 적혈구의 막 커패시턴스(membrane capacitance, CPE)의 변화 정도를 측정하는 단계 이후에, 상기 두 전단 속도에서의 막 커패시턴스의 변화율을 계산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법의 경화 화학 물질은 글루타르알데하이드, 디아미드(diamide) 또는 이들 모두인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 적혈구의 막 커패시턴스를 측정하는 막 커패시턴스 측정부를 포함하는 적혈구 변형성 측정 장치를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 장치의 막 커패시턴스 측정부는 한 쌍의 전극이 간격을 두고 위치하여 샘플의 통과 채널을 형성한 인쇄 기판 회로(PCB)이고, 상기 장치는 PDMS 블록과, 상기 인쇄 기판 회로의 채널과 동일한 형상의 구멍을 갖는 양면 테이프로서, 상기 인쇄 기판 회로 및 PDMS 블록 사이에 위치하는 양면 테이프를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 장치의 막 커패시턴스 측정부의 단면적은 0.01 ~ 5 x 0.001 ~ 2 mm2 인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 장치의 한 쌍의 전극의 전극간 간격은 0.01 ~ 3 mm 인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 상술한 적혈구 변형성 측정 장치를 사용하여 적혈구 막 커패시턴스를 측정하는 단계를 포함하는 적혈구 변형성 측정 방법을 제공한다.
본 발명은 혈액의 임피던스 스펙트럼을 분석하기 위한 장치를 사용하여 적혈구 변형성을 효과적으로 측정할 수 있다.
본 발명에 따른 변형성 측정에는 적혈구 막의 커패시턴스가 사용된다. 본 발명에 따른 변형성 측정 방법에 따르면 전혈이 샘플 범주에 포함되므로 희석과 같은 샘플 준비는 필요하지 않고, 또한 단일 적혈구 또는 희석 혈액 샘플의 결과와 비교하여 전혈의 결과가 더 대표적인 것으로 여겨진다.
따라서, 이를 통해 측정 결과의 정확성이 높으면서 측정 방법도 편리하여 매우 효과적이고 임상 적용에 실용적인 적혈구 변형성 측정 방법 및 측정 장치를 얻을 수 있다.
도 1은 적혈구 변형성 측정의 종래 방법에 관한 도면이다.
도 2는 a) 본 발명에 따른 적혈구 변형성 측정을 위한 전기적 장치 구성에 관한 도면, b) 상기 전기적 장치 내 PCB 채널과 전극의 확대도, c) 본 발명에 따라 제조된 장치의 사진이다.
도 3은 LabVIEW에 의한 적혈구 변형성 측정의 예시이다. 그래프의 Y 축에 표시된 최대 거리에 따라 피팅 타원 (파란색)이 적혈구의 윤곽 (노란색)과 잘 일치하면 코드는 장축 (X), 보조 축 (Y) 및 변형 지수 (DI)를 제공한다. 또한, 적혈구가 더 변형되고 늘어날 때 변형 지수 (DI)는 0.979에서 0.525로 감소한다. 피팅 타원이 윤곽과 잘 일치하지 않으면 이 경우는 수행되지 않는다.
도 4는 전혈의 임피던스 스펙트럼 및 등가 회로 모델에 기초한 핏팅 곡선이다. 비선형 곡선 핏팅에 의해, 혈액 회로 모델의 구성 요소; 혈장 저항, 세포질의 저항, 막 커패시턴스(CPE)은 전혈의 임피던스 스펙트럼으로부터 추출될 수 있다.
도 5는 적혈구 막의 분자 구성의 모식도이다. 적혈구가 변형되기 시작하면 안키린과 스펙트린이 일시적으로 분리되고, 일단 적혈구가 원래 모양이 되면 두 개의 단백질은 재부착된다.
도 6 중 (A)는 정상 및 비정상 샘플의 변형 지수로서, 정상 샘플의 경우 변형 지수 (0.59 - 0.61)가 비슷한 수준이지만, 비정상 샘플의 경우 변형 지수는 정상 샘플에 비해 증가한다. 또한 화학 경화 정도에 따라 변형 지수가 0.66에서 0.81로 증가한다. (B)는 정상 및 비정상 샘플의 ΔCPE로서, 정상 샘플의 ΔCPE 값은 유사 (-80.1 ~ -81.3 %)하고 비정상 샘플의 ΔCPE 값은 감소한다 (-74.5 ~ -50.1 %). (C)는 변형 지수와 ΔCPE 사이의 선형 관계로서, ΔCPE는 변형 지수와 상관 관계가 있음을 알 수 있다.
도 7 중 (A)는 다양한 변형 지수를 갖는 혈액 샘플의 점도 측정으로서, 변형 지수 0.65, 0.77 및 0.88 인 혈액 샘플에 대한 혈액 점도는 마이크로 점도계에 의해 측정된다. 높은 변형 지수에 대한 혈액 점도는 뉴턴 유체 점도 처럼 전단 속도에 의존하지 않는다. (B)는 혈액 샘플의 흐름 지속성 지수로서, 세 샘플에 대한 흐름 지속성 지수는 고 변형 지수에 대해 6.4에서 4.8 cP로 감소한다. (C)는 혈액 샘플의 흐름 거동 지수로서, 세 샘플에 대한 흐름 거동 지수는 고 변형 지수에 대해 0에 가깝다 (-0.109 내지 -0.051). 이는 고 변형 지수의 적혈구는 고 전단 속도에서 잘 변형될 수 없기 때문이다.
도 2는 a) 본 발명에 따른 적혈구 변형성 측정을 위한 전기적 장치 구성에 관한 도면, b) 상기 전기적 장치 내 PCB 채널과 전극의 확대도, c) 본 발명에 따라 제조된 장치의 사진이다.
도 3은 LabVIEW에 의한 적혈구 변형성 측정의 예시이다. 그래프의 Y 축에 표시된 최대 거리에 따라 피팅 타원 (파란색)이 적혈구의 윤곽 (노란색)과 잘 일치하면 코드는 장축 (X), 보조 축 (Y) 및 변형 지수 (DI)를 제공한다. 또한, 적혈구가 더 변형되고 늘어날 때 변형 지수 (DI)는 0.979에서 0.525로 감소한다. 피팅 타원이 윤곽과 잘 일치하지 않으면 이 경우는 수행되지 않는다.
도 4는 전혈의 임피던스 스펙트럼 및 등가 회로 모델에 기초한 핏팅 곡선이다. 비선형 곡선 핏팅에 의해, 혈액 회로 모델의 구성 요소; 혈장 저항, 세포질의 저항, 막 커패시턴스(CPE)은 전혈의 임피던스 스펙트럼으로부터 추출될 수 있다.
도 5는 적혈구 막의 분자 구성의 모식도이다. 적혈구가 변형되기 시작하면 안키린과 스펙트린이 일시적으로 분리되고, 일단 적혈구가 원래 모양이 되면 두 개의 단백질은 재부착된다.
도 6 중 (A)는 정상 및 비정상 샘플의 변형 지수로서, 정상 샘플의 경우 변형 지수 (0.59 - 0.61)가 비슷한 수준이지만, 비정상 샘플의 경우 변형 지수는 정상 샘플에 비해 증가한다. 또한 화학 경화 정도에 따라 변형 지수가 0.66에서 0.81로 증가한다. (B)는 정상 및 비정상 샘플의 ΔCPE로서, 정상 샘플의 ΔCPE 값은 유사 (-80.1 ~ -81.3 %)하고 비정상 샘플의 ΔCPE 값은 감소한다 (-74.5 ~ -50.1 %). (C)는 변형 지수와 ΔCPE 사이의 선형 관계로서, ΔCPE는 변형 지수와 상관 관계가 있음을 알 수 있다.
도 7 중 (A)는 다양한 변형 지수를 갖는 혈액 샘플의 점도 측정으로서, 변형 지수 0.65, 0.77 및 0.88 인 혈액 샘플에 대한 혈액 점도는 마이크로 점도계에 의해 측정된다. 높은 변형 지수에 대한 혈액 점도는 뉴턴 유체 점도 처럼 전단 속도에 의존하지 않는다. (B)는 혈액 샘플의 흐름 지속성 지수로서, 세 샘플에 대한 흐름 지속성 지수는 고 변형 지수에 대해 6.4에서 4.8 cP로 감소한다. (C)는 혈액 샘플의 흐름 거동 지수로서, 세 샘플에 대한 흐름 거동 지수는 고 변형 지수에 대해 0에 가깝다 (-0.109 내지 -0.051). 이는 고 변형 지수의 적혈구는 고 전단 속도에서 잘 변형될 수 없기 때문이다.
상기 상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 적혈구의 막 커패시턴스(membrane capacitance, CPE)의 변화 정도를 측정하는 단계를 포함하는 적혈구 변형성 측정 방법 및 적혈구의 막 커패시턴스를 측정하는 막 커패시턴스 측정부를 포함하는 적혈구 변형성 측정 장치를 제공하는 것을 특징으로 한다. 이하 도면을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 적혈구의 막 커패시턴스의 변화 정도를 측정하는 단계를 포함하는 적혈구 변형성 측정 방법을 제공한다. 상기 적혈구의 막 커패시턴스는 전기적 방법에 의하여 측정할 수 있으며, 이는 구체적으로 혈액의 임피던스 데이터를 측정하기 위한 장치를 사용하여 측정할 수 있다.
상기 적혈구의 막 커패시턴스의 변화는 일례로 적혈구의 전단 속도 변화에 따른 변화일 수 있다. 따라서, 상기 적혈구의 막 커패시턴스의 변화 정도는 제1 전단 속도에서의 막 커패시턴스 (CPEr1) 대비 제2 전단 속도에서의 막 커패시턴스 (CPEr2)의 변화 정도를 백분율로 나타낼 수 있다. (식 1 참조)
[식 1]
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 적혈구의 막 커패시턴스의 변화 정도를 측정하는 단계는 제1 전단 속도에서의 적혈구의 막 커패시턴스를 측정하는 단계와, 상기 제1 전단 속도와 상이한 제2 전단 속도에서의 적혈구의 막 커패시턴스를 측정하는 단계를 측정하는 단계를 포함한다.
한편, 일반적으로 적혈구는 전단 속도가 약 100 /s 일 때 변형되기 시작하기 때문에, 상기 적혈구의 변형성 측정을 위해 수행하는 막 커패시턴스의 변화 비교는 적혈구의 변형이 되기 전 및 후를 비교하는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 적혈구의 전단 속도가 100 /s 미만인 경우의 막 커패시턴스(CPEr1)과 100 /s 이상인 경우의 막 커패시턴스(CPEr2)의 변화 정도를 비교할 수 있고, 구체적으로 제1 전단 속도는 0 /s 초과 100 /s 미만이고 상기 제2 전단 속도는 100 /s 이상 10000 /s 미만이고, 더 구체적으로 제1 전단 속도는 0.01 /s 내지 50 /s 이고 제2 전단 속도는 200 /s 내지 1000 /s이고, 가장 구체적으로는 제1 전단 속도는 10 /s이고 제2 전단 속도는 500 /s 인 경우의 막 커패시턴스의 변화 정도를 측정하여 비교할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 혈액을 원심분리하여 적혈구를 분리하는 단계, 상기 분리된 적혈구에 경화 화학 물질을 처리하는 단계, 제1 전단 속도에서의 적혈구의 막 커패시턴스(CPEr1)을 측정하는 단계, 제2 전단 속도에서의 적혈구의 막 커패시턴스(CPEr2)을 측정하는 단계를 측정하는 단계 및 상기 두 전단 속도에서의 막 커패시턴스의 변화율(%)을 계산하는 단계를 포함한다.
즉, 본 발명의 적혈구 변형성 측정 방법은 전혈을 사용하여 분석할 수 있지만, 전혈로부터 통상적인 방법을 사용하여 적혈구를 분리하여 분석을 위한 혈액 샘플을 준비할 수 있다. 일례로 막 커패시턴스 측정을 위해 혈액을 원심분리를 수행하여 적혈구를 분리하는 단계를 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 적혈구 변형성 측정 방법은 분리된 적혈구에 경화 화학 물질을 처리할 수 있다. 상기 사용될 수 있는 경화 화학 물질에는 글루타르알데하이드, 디아미드(diamide) 등이 사용될 수 있고, 구체적으로 글루타르알데하이드일 수 있다.
본 발명은 또한 적혈구의 막 커패시턴스를 측정하는 막 커패시턴스 측정부를 포함하는 적혈구 변형성 측정 장치를 제공한다. 본 발명의 적혈구 변형성 측정 장치는 구체적으로 일정하게 로드한 샘플(일례로 혈액)에 대한 임피던스 데이터를 측정하기 위한 전기적 임피던스 측정 또는 전기적 임피던스 토모그래피(EIT) 장치를 활용할 수 있다. 이러한 장치는 신호 공급원, 신호 검출기 및 컴퓨터를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 신호 공급원은 입력 신호로서 전류를 제공하고, 상기 신호 검출기는 출력 신호로서 전압을 검출할 수 있다. 또는, 상기 신호 공급원은 입력 신호로서 전압을 제공하고, 상기 신호 검출기는 출력 신호로서 전류를 검출할 수 있다.
상기 입력 신호는 공급원을 사용하여 전극을 통해 상기 물질에 인가되고 동일 또는 다른 전극에 존재하는 상기 결과값인 출력 신호는 상기 검출기를 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 과정은 입력 신호의 다른 주파수 동안 반복된다. 예를 들어, 상기 전기 신호는 주파수 의존 전기적 임피던스 데이터를 상기 물질에 대해 얻도록 하기 위해, 0 Hz(직류 전류) 내지 100 MHz 사이의 많은 주파수에서 상기 신호 공급원에 의해 인가될 수 있다.
상기 임피던스 측정을 위해 사용되는 상기 전극의 분리는 상기 물질이 분석되어지는 해상도 또는 스케일을 결정한다. 상기 전기적 임피던스 측정값은 예상되는 기대 스케일(예를 들어, 마이크로-미터 또는 밀리미터 범위)에서 얻어질 수 있다. 상기 기대 스케일의 일 예로서, 혈액세포일 수 있다. 연속적으로 상기 얻어진 전기적 임피던스 데이터는 상기 물질에 대한 복수 개의 전기적 임피던스 특성을 결정하기 위해 가정된 전기적 모델의 전달 함수를 사용하여 분석될 것이다. 상기 사용된 전기적 모델은 상기 임피던스 측정의 해상도/스케일에 의존적일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 장치의 막 커패시턴스 측정부는 한 쌍의 전극이 간격을 두고 위치하여 샘플의 통과 채널을 형성한 인쇄 기판 회로(PCB)이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 장치의 막 커패시턴스 측정부의 단면적은 0.01 ~ 5 x 0.001 ~ 2 mm2 일 수 있고, 구체적으로 0.1 ~ 3 x 0.01 ~ 1 mm2 일 수 있고, 더 구체적으로 2 x 0.5 mm2 일 수 있다. 상기 단면적의 넓이가 너무 좁으면 측정에 사용되는 혈액의 양이 줄어들어 측정된 막 커패시턴스가 가지는 대표성이 낮아질 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 장치의 한 쌍의 전극의 전극간 간격은 0.01 ~ 3 mm 일 수 있고, 구체적으로 0.1 ~ 1 mm 일 수 있고, 더 구체적으로 0.8 mm 일 수 있다. 상기 단면적의 넓이가 너무 넓으면 동일한 전단 속도 (예를 들면, 500 /s) 획득을 위해 소모되는 혈액 샘플의 양이 증가할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 장치는 PDMS 블록, 유리 슬라이드(glass slide) 등을 더 포함한다. 이를 통해 상기 인쇄 기판 회로의 한면 또는 양면 모두를 덮을 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 장치는 인쇄 기판 회로의 채널과 동일한 형상의 구멍을 갖는 양면 테이프를 인쇄 기판 회로 및 PDMS 블록 사이에 포함한다.
이하, 도 2를 참조하여 본 발명의 일 구현예에 따른 적혈구 변형성 측정 장치를 설명한다.
도 2A에 도시된 것처럼, 본 발명의 장치는 적혈구의 막 커패시턴스를 측정할 수 있는 막 커패시턴스 측정부인 한 쌍의 전극을 포함하는 PCB, 그 위 아래를 덮는 테이프 및 상기 양 테이프를 각각 덮는 PDMD 바닥과 PDMS 뚜껑으로 구성된다. 상기 막 커패시턴스 측정부인 한 쌍의 전극은 간격을 두고 위치하여 혈액 샘플의 통과 채널을 형성하고 있으며, 상기 테이프는 상기 혈액 샘플의 통과 채널과 동일한 형상의 채널을 가져서 PCB를 덮더라도 샘플의 통과 채널의 상부는 테이프로 직접 덮히지 않는다. 상기 채널의 양 끝에는 원형의 저장부가 형성되어 있어 준비한 혈액 샘플을 넣을 수 있으며, 이 때 혈액은 한 방향으로 흐르면서 상기 채널에서 단면적을 통과하여 막 커패시턴스를 측정한다.
구체적으로 상기 혈액 샘플은 소자의 좌측 원형 입구단을 통해 주입된 후, 내부의 채널을 통과한 뒤 우측 출구단으로 배출된다. 혈액 샘플이 담긴 주사기는 주사기 펌프 (syringe pump)를 이용해 주입하게 되는데, 이 때 혈액 샘플의 전단 속도는 소자 내부 채널의 단면적과 혈액 샘플의 주입 유량을 바탕으로 결정된다. 일반적으로 소자 내부 채널의 단면적은 능동적인 변경이 불가능하기 때문에, 혈액 샘플의 주입 유량을 변경함으로써 전단 속도를 조절할 수 있다.
도 2B에 도시된 것처럼, 본 발명의 장치의 막 커패시턴스 측정부는 한 쌍의 전극을 포함하는 PCB로 구성된다. 임피던스를 측정하는 상기 한 쌍의 전극은 소자 내부 채널의 벽면에 마주보는 형태로 위치하고, 상기 한 쌍의 전극은 임피던스 분석기 (impedance analyzer)와 직접 연결되고, 한 쌍의 전극 사이에 위치한 혈액 샘플의 임피던스를 측정한다. 일례로, 상기 측정부의단면적의 넓이는 2.0 x 0.5 mm2이고 두 전극 사이의 간격은 0.8 mm이고, 혈액의 임피던스 스펙트럼을 주파수 1kHz 내지 5 MHz에서 측정하고, 이 때 사용되는 주파수의 개수 (임피던스 데이터 개수)는 총 801 개 (데이터 포인트)이다.
본 발명은 또한 상술한 적혈구 변형성 측정 장치를 사용하여 적혈구 막 커패시턴스를 측정하는 단계를 포함하는 적혈구 변형성 측정 방법을 제공한다.
이하, 실시 예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
적혈구 및 적혈구 변형성 측정 장치는 한 쌍의 전극과 PDMS 블록이 있는 PCB로 구성된다. 이전에는 PCB 및 PDMS 블록이 액상 에폭시로 접합되어 있다. 그러나, 이는 전극 표면을 쉽게 덮어 제조 과정에서 채널 부분으로 몰래 들어간다. 그 대신, 채널 형태의 구멍이 있는 양면 테이프가 절단 플로터 기계를 사용하여 준비된다. 이전 방법에 비해 훨씬 쉽고 신뢰할 수 있는 방법이다. 이 장치의 단면적은 2.0 x 0.5 mm2이고 두 전극 사이의 간격은 0.8 mm 이다 (도 2 참조).
샘플 준비를 위해 적혈구와 혈장을 원심 분리를 통해 분리하여 다양한 헤마토크리트 수준의 샘플을 준비한다. 변형성 측정을 위해, 경화 화학 물질 (글루타르알데하이드 용액, H2O 내 25 중량%, 시그마 알드리치, 미국)을 첨가하여 적혈구 막의 강성을 조절한다. 일단 적혈구가 원심 분리 (4,000 rpm, 6분) 에 의해 전혈로부터 분리되면, PBS(인산완충식염수) 중의 적혈구 현탁액이 제조된다. 그리고 0 - 0.5 % 농도 범위의 글루타르알데하이드를 현탁액에 넣고 90 분간 그대로 둔다. 다시 원심 분리 후, 현탁액으로부터 화학 처리된 적혈구를 얻을 수 있었다. 마지막으로 화학적으로 처리된 적혈구는 적혈구 용적률을 목표로 하여 혈장에 혼합된다.
임피던스 분석기 (IM 3570, HIOKI, 일본)는 1 kHz ~ 5 MHz의 주파수에서 혈액의 임피던스 스펙트럼을 획득하는 데 사용된다. 그리고 혈액의 등가 회로 모델에 따라 세포질, 혈장 및 적혈구 막의 전기적 특성을 추출하기 위해 임피던스 스펙트럼의 곡선 피팅을 위한 소프트웨어 (Zview, Scribner, NC, 미국)가 사용된다.
적혈구 변형성 평가를 위한 실험실 기준 시스템이 준비되었다. 이미지 획득을 위해 광학 현미경 (IX71, 올림푸스, 일본)과 고속 카메라 (MotionPro X3, Redlake 미국)가 사용된다. 마이크로 채널 내부를 흐르는 적혈구의 이미지 시퀀스는 고속 카메라를 통해 얻어진다. 이미지 분석을 위해 LabVIEW 코드는 관심 영역(region of interest, ROI)에 배치된 적혈구의 윤곽을 인식한다. 마이크로 채널의 단면적의 높이가 2μm이므로, 상기 마이크로 채널 내 적혈구는 흐름 방향만 따라 변형되는 것으로 제안된다. 따라서, 타원형 적혈구의 장축과 단축의 비율로 정의되는 변형 지수 (DI)가 계산될 수 있으며 이는 0에서 1까지의 숫자이다. DI가 0에 가까울수록 그것은 변형 가능하다는 것을 의미한다. 다른 한편, 적혈구는 DI가 1에 가까울 때 변형할 수 없다. 기준 시스템에서, 임의의 형태의 적혈구의 윤곽이 강도 프로파일에 따라 검출될 수 있다. 그런 다음, 적혈구의 윤곽선에 맞는 타원이 DI를 계산하기 위해 제공된다. 자동화된 LabVIEW 코드를 사용하여 지속적으로 수행된다 (도 3 참조).
[실시예 2]
일반적으로, 전혈의 단순화된 등가 회로에는 세 가지 성분, 세포질의 저항 (Ri), 혈장의 저항 (Rp) 및 막 커패시턴스 (membrane capacitance, CPE)이 있다 (도 4 참조).
적혈구 변형성 측정의 경우, 막 커패시턴스의 변화 정도가 적혈구 변형 정도와 관련이 있다고 가정한다. 적혈구 막에는 적혈구 변형에 중요한 역할을 하는 안키린 (ankyrin)과 스펙트린 (spectrin)이 있다 (도 5 참조). 이들이 변형에 의해 가역적으로 부착되고 분리될 수 있기 때문에, 적혈구 막의 두께는 변형에 의해 변한다. 즉, 적혈구 커패시터의 형상은 변형에 의해 변화한다. 기하학적 변화는 커패시턴스의 변화를 가져오므로 커패시턴스의 변화는 적혈구의 변형과 관련이 있다. 이러한 의미에서, CPE(constant phase element, 막 커패시턴스)가 사용된다. 일반적으로 적혈구 막은 균일하지 않은 특성으로 인해 이상적인 축전기가 아니다. 따라서 CPE는 순수 커패시터 대신 널리 사용된다. 이 장치를 사용함으로써, 변형 및 변형되지 않은 상태의 적혈구에 대한 CPE의 차이를 따랐다.
[식 2]
. 
일반적으로 적혈구는 전단 속도가 약 100 /s 일 때 변형되기 시작한다. 따라서, 변형된 적혈구에 대해 500 /s의 전단 속도가 선택된다. 적혈구 침강의 영향을 배제하기 위해 정적 조건 대신에 전단율 10 /s를 사용한다. 그리고, 전기적 방법으로 얻은 적혈구의 변형성을 실험실에서 만들어진 기준 시스템과 비교하여 이미지 분석을 통해 적혈구의 변형성을 평가할 수 있다.
[실시예 3]
다음 표에서 설명한 바와 같이 6 개의 표본에 대한 변형 색인은 실험실에서 작성한 참조 시스템으로 얻는다. 정상 샘플의 경우 변형 지수 (deformation index, DI)는 동일한 수준이다(0.59 - 0.61). 그러나 비정상 샘플의 경우 변형 지수가 정상 샘플보다 높다. 또한 화학 경화 정도에 따라 증가한다.
| 스탁 번호 |
샘플 번호 | 분류 (정상/비정상) |
글루타르알데하이드 용액 농도(%) |
| #1 | #1-1 | 정상 | 0 |
| #1-2 | 비정상 | 0.2 | |
| #2 | #2-1 | 정상 | 0 |
| #2-2 | 비정상 | 0.3 | |
| #3 | #3-1 | 정상 | 0 |
| #3-2 | 비정상 | 0.4 |
전기적 방법의 경우 정상 및 비정상 샘플에 대해 식 (2)에 의해 정의된 ΔCPE가 측정된다. CPE는 전단 속도에 따라 감소하므로, ΔCPE는 음의 값을 나타낸다. 정상 샘플의 경우, 거의 동일한 수준 (-80.1 내지 -81.3%) 이다. 비정상 샘플의 경우, ΔCPE의 등급은 정상 샘플보다 작다. 또한 경화 화학 물질의 농도 (-74.5 내지 -50.1%)에 따라 감소한다. 감소된 ΔCPE는 적혈구 변형의 정도가 화학적 경화의 정도에 따라 점점 작아지는 것을 반영한다. 그 후, 전기적 방법에서 ΔCPE와 이미지 분석으로부터 얻은 변형 지수 사이에 선형 상관 관계가 있음을 알 수 있다. 도 6(C)의 피팅 곡선을 사용함으로써, 변형 지수는 전기적 방식으로 추정될 수 있다 (도 6 참조).
적혈구 변형성인 전혈 점도에 영향을 미치는 결정 인자의 효과를 증명하였다. 그리고, 흐름 지속성 지수 (k, Flow consistency indices)와 흐름 거동 지수 (n, Flow behavior indices) 인 power law 모델의 계수를 이용하여 정량적으로 검증하였다. 흐름 지속성 지수(k)는 매우 낮은 전단 속도에서의 점도를 나타낸다. 흐름 거동 지수 (n)는 점도의 전단 의존성 거동의 정도를 의미한다.
다양한 변형 지수 (0.65, 0.77 및 0.88)를 갖는 샘플의 전혈 점도가 측정된다. 경화된 적혈구 (파란색과 녹색 동그라미)는 주어진 전단 속도 조건에서 정상 적혈구만큼 (빨간색 원) 변형될 수 없기 때문에, 고 전단 속도 (~ 1,000 /s)에서 점도가 경화된 적혈구에 상대적으로 높다. 흐름 거동 지수 (n)에 대해, 경화된 적혈구를 갖는 샘플은 뉴톤 유체의 점도의 경우인 제로에 가까워진다 (도 7 참조).
이를 통해, 적혈구 변형성인 전혈 점도에 영향을 미치는 결정 요인을 단일 장치에서 측정한다. CPE인, 세포질, 혈장 및 막 커패시턴스의 전기 저항은 전기 임피던스 분광법을 통해 두 가지 결정 요인을 측정하는 데 활용된다. 장치 자체에 관해서는 제작 절차가 이전 버전보다 더 신뢰할 수 있다. 또한, 적혈구 변형성에 대한 정보를 제공할 수 있고,ΔCPE와 이미지 분석의 변형 지수와의 상관 관계를 보여준다. 마지막으로, 적혈구 변형성의 효과는 두 가지 결정 인자에 다양한 조건을 가짐으로써 입증된다.
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시 예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (11)
- 적혈구의 막 커패시턴스(membrane capacitance, CPE)의 변화 정도를 측정하는 단계를 포함하는 적혈구 변형성 측정 방법으로서, 상기 적혈구의 막 커패시턴스의 변화 정도를 측정하는 단계는, 제1 전단 속도에서의 적혈구의 막 커패시턴스를 측정하는 단계와, 상기 제1전단 속도와 상이한 제2 전단 속도에서의 적혈구의 막 커패시턴스를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 적혈구 변형성 측정 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 제1 전단 속도는 0 /s 초과 100 /s 미만이고 상기 제2 전단 속도는 100 /s 이상 10000 /s 미만인 것을 특징으로 하는 적혈구 변형성 측정 방법. - 제1항에 있어서, 상기 제1 전단 속도는 10 /s이고 상기 제2 전단 속도는 500 /s 인 것을 특징으로 하는 적혈구 변형성 측정 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 적혈구의 막 커패시턴스(membrane capacitance, CPE)의 변화 정도를 측정하는 단계 이전에, 혈액을 원심분리하여 적혈구를 분리하는 단계와 상기 분리된 적혈구에 경화 화학 물질을 처리하는 단계를 포함하고,
상기 적혈구의 막 커패시턴스(membrane capacitance, CPE)의 변화 정도를 측정하는 단계 이후에, 상기 두 전단 속도에서의 막 커패시턴스의 변화율을 계산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 적혈구 변형성 측정 방법. - 제5항에 있어서, 상기 경화 화학 물질은 글루타르알데하이드 디아미드(diamide) 또는 이들 모두인 것을 특징으로 하는 적혈구 변형성 측정 방법.
- 적혈구의 막 커패시턴스를 측정하는 막 커패시턴스 측정부를 포함하는 적혈구 변형성 측정 장치로서, 상기 막 커패시턴스 측정부는 제1전단 속도에서의 막 커패시턴스 대비 제2전단 속도에서의 막 커패시턴스의 변화정도를 측정하는 것을 특징으로 하는 적혈구 변형성 측정 장치.
- 제7항에 있어서, 상기 막 커패시턴스 측정부는 한 쌍의 전극이 간격을 두고 위치하여 샘플의 통과 채널을 형성한 인쇄 기판 회로(PCB)이고,
상기 장치는 PDMS 블록과,
상기 인쇄 기판 회로의 채널과 동일한 형상의 구멍을 갖는 양면 테이프로서, 상기 인쇄 기판 회로 및 PDMS 블록 사이에 위치하는 양면 테이프
를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 적혈구 변형성 측정 장치. - 제8항에 있어서, 상기 막 커패시턴스 측정부의 단면적은 0.01 ~ 5 x 0.001 ~ 2 mm2 인 것을 특징으로 하는 적혈구 변형성 측정 장치.
- 제8항에 있어서, 상기 한 쌍의 전극의 전극간 간격은 0.01 ~ 3 mm 인 것을 특징으로 하는 적혈구 변형성 측정 장치.
- 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 적혈구 변형성 측정 장치를 사용하여 적혈구 막 커패시턴스를 측정하는 단계를 포함하는 적혈구 변형성 측정 방법.
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