DE1176098B - Vorrichtung und Verfahren zur elektro-phoretischen Trennung - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Internat. Kl.: B Ol d

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

Deutsche Kl.: 12 d-1/05

B 70187IV a / 12 d
31. Dezember 1962
20. August 1964

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur elektrophoretischen Trennung hochmolekularer organischer eiweißartiger Stoffe und ein Verfahren unter Anwendung der Vorrichtung gemäß Erfindung.

Bekannte Vorrichtungen zur elektrophoretischen Trennung weisen Nachteile auf, die ihre Anwendbarkeit beschränken und die Arbeit mit ihnen mehr oder weniger schwerfällig gestalten. Dies gilt insbesondere für die elektrophoretische Trennung in senkrecht angeordneten Säulen, deren Elektrolyt gegen eine unkontrollierte Konvektion dadurch stabilisiert worden ist, daß er mit einer Trägersubstanz aus reaktionsträgem Material wie Stärke, Zellulosepulver od. dgl., Agar oder verschiedenen Gelarten vermischt wurde. Infolge des verhältnismäßig komplizierten Aufbaues bekannter Vorrichtungen ist der Zusammenbau und das Auseinandernehmen derselben vor und nach dem Betrieb zeitraubend und aufwendig. Dies ist besonders dann der Fall, wenn die Stabilisierungssubstanz in Form eines Stoffes mit Dichtegefälle oder in Form eines Dextrangels angesetzt werden soll.

Außerdem kommen in den bekannten Vorrichtungen Elektroden mit verhältnismäßig kompliziertem Aufbau zur Verwendung, wobei es beispielsweise notwendig ist, Elektroden oder Elektrodendrähte in U- oder S-förmig gebogene Glasröhren einzusetzen, welche mit einem Elektrolyt gefüllt sind und mehr oder weniger indirekt mit den Enden der beschickten Säule in Verbindung stehen.

Theoretisch soll die Elektrodenanordnung so gehalten sein, daß sie in unmittelbarer Nähe des Bodens und der Oberseite der Trennsäule angebracht werden kann. Auf diese Weise ist der Abstand zwischen den Enden der Elektroden annähernd gleich oder etwas größer als die Wirklänge der Trennsäule. Bei den bekannten U- oder S-Rohr-Elektrophorese-Trennsäulen ist es dagegen nicht möglich, dieses für die Durchführung der Elektrophorese günstige Verhältnis zu erzielen. Wenn der Quotient aus Elektrodenabstand und Wirklänge der Trennsäule berechnet wird, beträgt er im letzteren Fall etwa zwei oder mehr. Aus praktischen Gründen soll außerdem die Elektrodenanordnung so gehalten sein, daß sie die Verwendung verschiedener Säulentypen mit unterschiedlicher Länge gestattet. Außerdem soll der Aufbau freien Zugang zur Oberseite und zum Boden der Säule vor, während und nach der Elektrophoresetrennung ohne unbeabsichtigte Veränderung des stabilisierten Inhalts der Trennsäule ermöglichen. Bei der Vorrichtung nach der Erfindung sind die vorerwähnten Nachteile ausgeschaltet.

Vorrichtung und Verfahren zur elektrophoretischen Trennung

Anmelder:

LKB-Produkter AB, Stockholm

Vertreter:

Dipl.-Ing. H. Wiemuth, Patentanwalt,

Düsseldorf-Oberkassel, Hansa-Allee 159

Als Erfinder benannt:

Bengt Göran Flemming Bergrahm, Stockholm

Beanspruchte Priorität:

Schweden vom 4. Januar 1962 (82)

Die Erfindung geht aus von einer Vorrichtung zur elektrophoretischen Trennung von Mischsubstanzen in Bestandteile verschiedener Wanderungsgeschwindigkeiten, welche aus einer senkrecht angeordneten, mit einer Trägersubstanz zu füllenden Säule besteht, deren beide Enden an je eine Flüssigkeitselektrode, die mittels eines Schlauches oder Rohres mit einem Blektrolytgefäß verbunden ist, angeschlossen sind.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist gekennzeichnet durch je ein an beiden Enden der Säule lösbar zu befestigendes, im wesentlichen T-förmiges Gehäuse, dessen durchgehende, mit der Säule im wesentlichen koaxial verlaufende Mittelbohrung an dem von der Säule abgekehrten Ende durch einen herausnehmbaren Stopfen verschließbar ist und dessen Querbohrung unter Zwischenschaltung einer semipermeablen Membran mit einer Flüssigkeitselektrode lösbar zu verbinden ist.

In der Zeichnung sind die Hauptteile eines Ausführungsbeispieles nach der Erfindung schematisch dargestellt, das im folgenden näher beschrieben wird.

Der Anschlußblock 1 weist die an beiden Seiten offene senkrechte Mittelbohrung 2 auf, deren eines Ende an eine (nicht dargestellte) Trennsäule anschließbar und deren anderes Ende mit dem herausnehmbaren Stopfen 3 für den freien Zugang zum Inneren der Säule versehen ist. Rechtwinklig zu der senkrechten Mittelbohrung 2 weist der Anschlußblock die sich waagerecht nach außen erstreckende Querbohrung 4 auf. Die Mittelbohrung 2 des Anschlußblocks bildet eine Fortsetzung der Trennsäule. Je nach der angewendeten Elektrophoresetechnik und dem Typ der verwendeten Säule ist die senk-

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rechte Mittelbohrung 2 des Anschlußblocks meist Doppelrohrverbindung mit dem betreffenden Elektrostabilisiert, kann jedoch auch einen nicht stabilisier- lytgefäß möglich ist, mittels einer Pumpe einen ten Volumenanteil des Elektrolyts enthalten, wohin- Pufferkreislauf vom Elektrolytgefäß über eine Abgegen der in der Trennsäule enthaltene Elektrolyt Zweigleitung 10 des Elektrodenanschlußstücks zur stets durch eine Kapillarträgersubstanz (oder durch 5 Elektrodenkammer 7 und über die zweite Abzweig-Dichtegefälle) stabilisiert ist. Durch Verwendung leitung 11 zurück zum Elektrolytgefäß in Gang zu eines geeigneten Stopfens in der Bodenöffnung des setzen, wie er durch die Pfeile 17, 18 angedeutet ist. unteren Anschlußblocks bzw. in der oberen Öffnung Durch das Vorhandensein des Elektrodendrahtes

des oberen Anschlußblocks ist es möglich, die Trenn- 14 in einer der Abzweigleitungen, der in unmittelsäule in einer Weise zu verschließen, die einen leich- io barer Nähe der zwischen dem Anschlußblock 1 und ten Zugang nicht nur vor und nach der Elektro- dem seitlichen Elektrodenanschlußstück 6 vorgesephorese, sondern auch während derselben gestattet. henen semipermeablen Membran 5 endet, werden Die Austrittsöffnung der waagerechten Querboh- einige der vorerwähnten wesentlichen Vorteile bei rung 4 des Anschlußblocks 1 ist durch die semi- der Elektrophorese erreicht.

permeable Membran 5 abgedeckt, welche sowohl 15 Der Stopfen 3 kann vorzugsweise mit einer oder einen Flüssigkeitsdurchlauf als auch eine Wanderung mehreren Bohrungen 20, 21 versehen sein, um das hochmolekularer Bestandteile verhindert, wohin- Einbringen oder Ablassen von Pufferlösungen oder gegen die Ionen des Elektrolyten ungehindert durch- Eiweißlösungen zu ermöglichen. Die mit 22 bezeichgelassen werden. nete andere Ausführungsform eines Stopfens kann

Das seitliche Elektrodenanschlußstück, welches 20 verwendet werden, wenn während der Elektrophoresekoaxial zur Querbohrung 4 des Anschlußblocks an- trennung eine mechanische Pumpwirkung durch das geordnet ist, weist das Gehäuse 6 mit der im wesent- Säulensystem erforderlich ist.

liehen zentralen waagerechten Bohrung 7 auf, welche Es braucht kaum darauf hingewiesen zu werden,

die Elektrodenkammer bildet. Der Austrittsstutzen an daß das Material, aus welchem die Teile der Vorder Vorderwandung des Gehäuses ist mittels der BoI- 25 richtung gefertigt sind, Flüssigkeiten gegenüber, die zen 8,9 od. dgl. lösbar am Anschlußblock 1 befestigt, mit den Wandungen derselben in Berührung kommen, wobei die semipermeable Membran 5 zwischengelegt reaktionsträge sein muß. Geeignete Werkstoffe sind ist. Die waagerechte Bohrung (Elektrodenkammer) beispielsweise Quarz, Glas oder synthetische Harze, des Elektrodengehäuses 6 gabelt sich nach außen deren mit den Flüssigkeiten in Berührung kommende etwa in Form eines liegenden »Y« in die Abzweig- 30 Flächen erforderlichenfalls mit einem unlöslichen leitungen 10, Ii, die an der Rückwandung des Ge- hochträgen Stoff, wie Silikon oder Polytetrafluorhäuses austreten und mittels der Rohre 12, 13 mit äthylenharze, ausgekleidet sein können, dem mit einer Pufferlösung gefüllten offenen Elektro- Mit Hilfe der Elektrophoresevorrichtung gemäß

lytgefäß (nicht dargestellt) verbunden sind. Erfindung ist es möglich, unterschiedliche Techni-

Von dem Elektrolytgefäß erstreckt sich durch 35 ken beim Ansetzen der verschiedenen Formen eines eins der Rohre (beispielsweise das Rohr 12) der Stabilisierungsmediums anzuwenden. (Um die Säule frei liegende Elektrodendraht 14, der in der Elek- gegen Konvektion zu stabilisieren, wird vorzugsweise trodenkammer 7 in der kugelförmigen Verdickung 15 ein Kapillarsystem oder ein kombiniertes Kapillarendet, um eine Beschädigung der Membran 5 durch Dichtegefälle-System innerhalb der Bohrung des undie Spitze des Drahtes zu verhindern. Um zu ver- 40 teren Anschlußblocks bzw. der Trennsäule angemeiden, daß der Draht die innere Wandung des setzt.) Der neuartige Aufbau der Elektrophorese-Rohres berührt, sind die im Abstand voneinander vorrichtung gemäß Erfindung, der einen freien Zuangeordneten Kugeln 16 aus Isoliermaterial vor- gang zur Trennsäule während der Elektrophorese gesehen. gestattet, ermöglicht, verglichen mit der in einer

Infolge der erzielbaren dichten (flüssigkeitsdichten) 45 Vertikal-Säulen-Elektrophorese-Vorrichtung bekann-Verbindung des Anschlußblocks 1 und des seitlichen ter Bauart erzielbaren Elektrophorese, eine bedeutende Elektrodenanschlußstücks 6 ist es möglich, eine Erweiterung der Möglichkeiten der potentiellen durchgehende Rohrverbindung zwischen den beiden elektrophoretischen Trennung. Außerdem ist der am oberen und unteren Elektrodengehäuse der Elek- Aufbau des Anschlußblocks 1 mit dem seitlich antrophoresevorrichtung angeschlossenen Elektrolyt- 5<> gebrachten Elektrodenanschlußstück 6, welches das gefäßen herzustellen: Elektrolytgefäß I, Doppel- Elektrodensystem umgreift und selbst die Elektrodenrohr I, seitliches Elektrodenanschlußstück I, An- kammer bildet, derart gehalten, daß die Nachteile, schlußblock I, Trennsäule, Anschlußblock II, seit- welche bei der Elektrophoresetrennung infolge der an liches Elektrodenanschlußstück II, Doppelrohr II, den Elektroden stattfindenden elektrochemischen Elektrolytgefäß II. (Oberes Elektrodensystem = I; 55 Prozesse auftreten (in der Hauptsache Säure-, Basenunteres = II.) Diese durchgehende Rohrverbindung und Gasbildung), ausgeschaltet sind, ist jedoch an zwei Stellen durch die vorerwähnten, Die verbesserte Elektrophoresevorrichtung gemäß

zwischen dem Anschlußblock 1 und dem seitlichen Erfindung wird in ihrem Aufbau sowohl den theo-Elektrodenanschlußstück 6 der oberen und unteren retischen als auch den praktischen Erfordernissen ge-Elektrodenanordnung vorgesehenen semipermeablen ⁶° recht. Die Vorrichtung gestattet auf einfache Weise Membranen 5 unterbrochen. Auf diese Weise ist die die Entnahme der abgetrennten Substanzen. So ist es Trennsäule durch die semipermeablen Membranen bei der Entleerung der Säule nicht notwendig, die von dem Elektroden- und Elektrolytgefäßsystem nicht stabilisierten Volumenanteile auf der Elekabgetrennt, wohingegen die elektrische Leitfähigkeit trodenseite des Membransystems in der Bohrung 7 des Systems infolge Durchdringbarkeit der Mem- 65 des Elektrodenanschlußstückes zu berücksichtigen, branen durch die Ionen erhalten bleibt. Während der Elektrophoresetrennung sollen die

Ein wichtiges und neuartiges Merkmal nach der Flüssigkeitsspiegel der zwei Pufferlösungen, die sich Erfindung ist dadurch gegeben, daß es durch die in je einem der mit den seitlichen Elektroden-

anschlußstücken in Verbindung stehenden Elektrolytgefäßen befinden, auf gleicher Höhe mit der Oberseite der Trennsäule, vorzugsweise darüber liegen.

Nach Beendigung einer Elektrophoresetrennung kann die in den Hohlräumen der Elektrodenanordnung befindliche Pufferlösung durch das Ablaufrohr 19 abgelassen werden, welches zu diesem Zweck an der Unterseite des Gehäuses 6 des Elektrodenanschlußstücks vorgesehen ist.

Wie bereits erwähnt, weisen bekannte Ausführungen von Vorrichtungen für Senkrecht-Säulen-Elektrophorese infolge der elektrochemischen Prozesse an den Elektroden (Säure-, Basen- und Gasbildung) Nachteile auf, da es bei den bekannten Vorrichtungen nicht in einfacher Weise möglich ist, die Ansammlung saurer und alkalischer, an den Elektroden gebildeter Stoffe zu verhindern, ohne den stabilisierten Volumenanteil in der Trennsäule in Mitleidenschaft zu ziehen. Daher war es früher notwendig, das Elektrodensystem in erster Linie dem Zweck der teilweisen Kompensation der Säuren- und Basenbildung anzupassen, indem große Elektrolytgefäßanordnungen vorgesehen wurden und man die Enden der Elektrodenstäbe in verhältnismäßig großer Entfernung von den Enden der Trennsäule enden ließ, und zweitens, indem man Vorsorge traf, daß das gebildete Gas die Elektrophoresevorrichtung durch das nicht stabilisierte System ungehindert verlassen konnte.

Einer der größten Vorteile, die mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung erreichbar sind, liegt darin, daß bei Verwendung der Vorrichtung in üblicher Weise ohne Zirkulation der Pufferlösungen in den jeweiligen Elektrodensystemen die Elektroden in unmittelbarer Nähe der Oberseite und des Bodens der Trennsäule angeordnet sind, und zwar in der Weise, die einen freien Zugang zur Säule nicht nur vor und nach der Elektrophorese, sondern auch während derselben gestattet.

Infolge der Möglichkeit einer Zirkulation der Pufferlösung hinter der Verbindung mit der Oberseite und dem Boden der Trennsäule ist es außerdem auf einfache Weise möglich, die Säure- und Basenbildung fortlaufend zu »kompensieren«. Natürlich ist es bei diesem Aufbau möglich, das Volumen des nicht stabilisierten Anteils innerhalb des Elektrodensystems zu verändern.

Durch gesteuerte Vermischung der in den Elektrolytgefäßen enthaltenen Pufferlösungen ist es bei der Lösung biologischer Trennaufgaben möglich, die Elektrophorese zusätzlich in günstiger Weise zu verbessern. Sowohl Kationen als auch Anionen wandern ständig durch die Elektrophoresevorrichtung, und das Risiko der Ionenerschöpfung, die bei der bekannten Senkrecht-Säulen-Elektrophorese (d. h. bei nicht zirkulierenden und nicht vermischten Pufferlösungen) leicht auftritt, wird noch gründlicher verhindert.

Durch eine dritte Pufferlösung, die sich in einem Gefäß auf der Seite des Anoden- oder Katodengefäßes befindet, und dadurch, daß die dritte Pufferlösung als nicht stabilisierter Volumenanteil mit dem Boden oder der Oberseite der Trennsäule verbunden und ein mechanisch steuerbarer Pufferstrom durch die gesamte Trennsäule oder einen Teil derselben (je nach Ausführungsform der Trennsäule) während der Elektrophorese in Gang gesetzt wird, ist es möglich, die Wanderung der abzutrennenden Eiweißlösungen in die gewünschte Richtung zu lenken, d. h. auf die Anode oder die Katode zu. Wenn beispielsweise die Pufferlösung zur Anode hin gelenkt werden soll, wird der dritte nicht stabilisierte Volumenanteil mit dem Katodenende der Trennsäule verbunden. Die der Trennsäule zugesetzte Pufferlösung wird am Boden der Trennsäule abgeleitet.

Die Erfindung wurde an Hand eines bestimmten Ausführungsbeispiels beschrieben. Für den Fachmann ist es klar, daß mit den offenbarten Lehren zahlreiche Abwandlungen innerhalb des Erfindungsgedankens möglich sind. Dem Fachmann ist durch die Erfindung eine anpaßbare Vorrichtung in die Hand gegeben, welche die Verwendung unterschiedlicher Typen von Säulen und Anordnungen gestattet, die jeweils den bei der Elektrophorese gestellten Aufgaben entsprechen.

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Vorrichtung zur elektrophoretischen Trennung von Mischsubstanzen in Bestandteile mit verschiedener Wanderungsgeschwindigkeit, welche aus einer senkrecht angeordneten, mit einer Trägersubstanz zu füllenden Säule besteht, deren beide Enden an je eine Flüssigkeitselektrode, die mittels eines Schlauches oder Rohres mit einem Elektrolytgefäß verbunden ist, angeschlossen sind, gekennzeichnet durch je ein an beiden Enden der Säule lösbar zu befestigendes, im wesentlichen T-förmiges Gehäuse (1), dessen durchgehende, mit der Säule im wesentlichen koaxial verlaufende Mittelbohrung (2) an dem von der Säule abgekehrten Ende durch einen herausnehmbaren Stopfen (3) verschließbar ist und dessen Querbohrung (4) unter Zwischenschaltung einer semipermeablen Membran (5) mit einer Flüssigkeitselektrode verbunden ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jede Flüssigkeitselektrode aus einem eine als durchgehende Mittelbohrung (7) ausgebildete Elektrodenkammer aufweisenden, koaxial zur Querbohrung (4) lösbar am Gehäuse (1) zu befestigenden Elektrodenanschlußstück (6) besteht, an dessen Mittelbohrung (7) je eine Abzweigleitung (10, 11) als Zu- und Ableitung (17, 18) für einen umlaufenden Elektrolyt anschließbar ist, wobei eine drahtförmige Elektrode (14) durch die Zuleitung (17) innerhalb der Elektrodenkammer bis nahe an die semipermeable Membran (5) herangeführt ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuleitung (17) des Elektrolyten an ednen an der Rückwand des Gehäuses (6) koaxial zur Elektrodenkammer angeordneten Rohrstutzen anschließbar und die Ableitung (18) an einen an der Rückwand des Gehäuses (6) vorgesehenen zweiten Rohrstutzen anschließbar ist, der über eine Bohrung mit der Elektrodenkammer verbunden ist.

4. Verfahren zur elektrophoretischen Trennung von Mischsubstanzen in Bestandteile mit verschiedener Wanderungsgeschwindigkeit unter Verwendung der Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Elektrolyt an beiden Enden der Trennsäule in ununterbrochenem Kreislauf von je einem Elektrolyt-

gefäß in eine Elektrodenkammer an einer semipermeablen Membran vorbei- und zurückbewegt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß den Elektrodenkammern an

den Enden der Elektrophoresesäule Pufferlösungen von zwei Elektrolytgefäßen zugeführt werden und daß der Elektrophoresesäule gegebenenfalls von einem dritten Elektrolytgefäß eine Pufferlösung zugeführt wird.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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