DE2722175C2 - Elektrophorese-Vorrichtung - Google Patents

Description

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Schicht aufweist, wird durch das Rohrstück 6, das sie Eludierkammer 5 und poröser Schicht 11 aus der Form

gegen eine Anlagschulter des Gehäuses 4 preßt, in Posi- von selbst abgeschleudert; der Oberstand kann auch

tion gehalten. Ein O-Ring 8, der in eine Ringnut des einfach mit Hilfe eines Messers entfernt werden, wobei

Rohrstückes 6 eingelagert ist, bringt einen fugendichten die öffnungen für die Röhrchen 9 und das Röhrchen 12

Abschluß zwischen diesem Rohrstück 6 und dem Ge- s mittels eines Wolfram-Karbid-Bohrers hergestellt wer-

häuse 4 und sichert zugleich das Rohrstück 6 klemmsitz- den können.

artig in der korrekten Position; das Gelaufnahmerohr 3 Abgesehen von den korrosionsfesten Stahlröhrchen 9 ist zur zuordnungsgerechten Ausrichtung seiner unte- und 12, den Viton-O-Ringen 7 und 8 der Sinterglas-Eluren Stirnfläche eisfach gegen die Eludierkammer 5 ge- dierkammer 5 mit ihrer Silikongummi-Dichtung und der drückt und wird dort durch einen O-Ring 7, der wieder- io porösen Schicht 11, sind alle übrigen Bauteile der AnIaum einen dichten Paßsitz vermittelt, gehalten. Eine Trä- ge aus Perspex (Polymethacrylaten) gefertigt
ger- bzw. Pufferlösung wird durch drei korrosionsfeste Eine Gelsäule steht direkt auf der Eludierkamrner 5 Stahlröhren 9 (in F i g. 1 ist nur ein Röhrchen darge- oder einem Scheibchen aus Glasfieberpapier an der stellt) eingebracht Diese Röhrchen 9 sind so angeord- Oberseite der Eludierkammer 5 und braucht nicht durch net daß jedes Paar einander benachbarter Röhrchen 9 15 den hydrostatischen Druck der Eludier-Pufferlösung abeinen Winkel von 45° einschließt Ober eine Leitung 10 gestützt zu werden.

(Rohr) wird eine Hilfsströmung einer Eludier-Pufferlö- Die vorliegende Erfindung kann auch an anderen

sung der Unterseite der porösen Schicht 11 zugeführt Vorrichtungen günstigst Verwendung finden, wie Groß-

Diese hochbeschleunigte Hilfsströmung dient zur Küh- anlagen zur präparativen Elektrophorese mit zentraler

lung der Eludierkammer 5 sowie des Gels. Der über die 20 Eludierung und Gelkühlung. Bei solcher sind Verarbei-

Leitung 10 zugeführte Überschuß an Eludier-Pufferlö· tung und Kontrolle ebenso einfach,

sung kehrt über einen schmalen Spalt zwischen iier Lei- In der beschriebenen Anlage zur preparativen Elek-

tung 10 und dem Rohrstück 6 in die Elektrodenkammer trophorese strömt die homogene Pufferlösung in die

zurück und wird erneut in den Kreislauf eingebracht poröse Eludierkammer 5, um zu verhindern, daß die

Die Strömungsbahnen der Eludier-Pufferlösung sind in 25 Komponenten auf den Boden der Eludierkammer 5 ge-

Fig.6 dargestellt Der elektrische Strom für die Elek- langen, sei es durch das Konvektionsphänomen oder

trophorese führt über den erwähnten schmalen Spalt durch eine hochgradig freie elektrophotoretische Mobi-

Durch Änderung der Strömungsgeschwindigkeit (An- lität oder Teilchenwandung aufgrund der Schwere, so derung der Pumpleistung) der durch die Leitung 13 strö- daß es durch Anpassung der Ionenstärke der unmittelmenden Pufferlösung oder Änderung des Spaltmaßes 30 bar unter dem Gel verlaufenden Pufferlösung möglich zwischen Leitung 10 und dem Rohrstück 6, kann der ist, die Komponenten aus der unmittelbaren Nachbar-Druck mit Hilfsströmung der Eludier-Pufferlösung in schaft des Geles schnell zu evakuieren, so daß der Verder gewünschten Weise reguliert werden und folglich zögerungseffekt bei der elektrophoretischen Wandeauch der durch die Schicht 11 hindurchtretende Strö- rung durch die Hilfs-Pufferlösung, welche entgegen der mungsanteil der Eludier-Pufferlösung. 35 Teichenwanderung strömt, selektiv erhöht werden

Die Eludier-Pufferlösungen werden über ein korro- kann, bspw. durch die !oncnstärke, den PH-Wert, die

sionsfreies Stahlröhrchen 12 durch eine genau einstell- Viskosität und Dichte der Pufferlösung. Die Eludierung

bare, nicht dargestellte Pumpe abgeführt und von dort ist dadurch hochwirksam. Es ist überdies dei Nacijteil

aus bspw. über ein Spektrophotometer einem Teilchen- vermieden, daß die Komponenten mit dem Boden der

kollektor zugeführt 40 Eludierkammer in Kontakt kommen.

Die Eludierkammer 5 ist aus hartem, porösem Materi- Die poröse Eludierkammer unterbindet das Konvekal, wie Sinterglas, vorzugsweise Pyrex P 2, gebildet; bei tionsphenomen, das Wandern der Komponenten aufder dargestellten Anlage beträgt das Flüssigkeitsvolu- grand der Schwere und das Entstehen bevorzugter Kamen der Kammer 5 etwa 0,13 mL näle in der Eludierkammer für die Eludier-Pufferlösun-

Die poröse Schicht 11 an der Unterseite der Eludier- 45 gen. Die Eludier-Pufferströmungen im obigen Sinne kammer 5 kann als Dialyse-Membrane ausgebildet sein, werden durch Einleiten zweier Eludier-Pufferst römunin welchem Falle die aus einer Pufferlösung bestehende gen in die Eludierkammer 5 erreicht, wobei eine Puffer-Hilfsströmung an der Unterseite der Membrane unter lösung gleichmäßig auf die Oberfläche der Eludierkamhohem Druck gehalten werden kann. Die poröse mer 5 verteilt wird, und zwar in einer Richtung entge-Schicht 11 besteht jedoch aus Sinterglas anderer Poren- 50 gengesetzt der Richtung der in der Eludierkammer 5 größe als das der Eludierkammer 5, weist eine Dicke stattfindenden Elektrophorese und eine Pufferlösung von 0,5 mm auf und kann in vorteilhafter Weise durch gleichmäßig senkrecht zur Richtung der Elektrophore-Sinterung mit der Eludierkammer 5 verbunden sein. Die se. Eint gleichmäßige Verteilung* der Eludier-Pufferporöse Schicht 11 ist vorzugsweise aus Pyrex P 5 gefer- strömung auf die Oberfläche der Eludierkammer 5 ist tigt Die Abdichtung der Eludierkammer 5 oder gegebe- 55 durch Pumpen oder Säugen der betreffenden Fufferlönenfalls der Baueinheit aus Eludierkammer 5 und porö- sung durch die poröse Schicht 11 hindurch, die an der ser Schicht 11 gegenüber dem Gelrohr 3, dem Gehäuse Bodenseite der Eludierkammer 5 angeordnet ist, er-

4 und dem Rohrstück 6 ist durch Anformen bzw. -brin- reicht, wobei der Strömungswiderstand der Pufferlögen einer passend gestalteten Lage aus elastischem Ma- sung hauptsächlich durch die poröse Schicht 11 beterial, wie bspw. polymerisiertem Silikongummi, er- 60 stimmt wird.

reicht Hier ist formbarer, im Handel bekannter Silikon- Die oben erläuterte Bauform der Eludierkaimmer 5

gummi auf die betreffenden Zonen der Eludierkammer und der dazugehörigen Teile vereinfacht die Handha-

5 oder der aus Eludierkammer 5 und poröser Schicht 11 bung der Vorrichtung und ihre Anwendung für die prägebildeten Baueinheit aufgebracht Das Ganze wird für parative Elektrophorese erheblich. Die Vorrichtung ist das Anformen des Silikongummis an das Sinterglas, vor- 65 flexibel und in einfacher Weise für den jeweiligen spezugsweise in eine Form, primär aus Teflon, eingebracht ziellen Prozeß einsetzbar, z. B. durch Auswahl einer an-Etwaige Silikongummi-Uberstände (Grate) werden bei deren Eludierkammer oder eines anderen Gel-Gehäu-Entnahme der Eludierkammer 5 bzw. der Baueinheit aus ses. Die Gelkühlung ist einfach. Wie gefunden wurde,

reicht die Kühlwirkung durch die Puffer-Hilfsströmung tischen und andererseits einem präparativen Gel beigein der Leitung 10 völlig aus. Die Vorrichtung kann leicht gelien und einer präparativen Gel-Elektrophorese unsorgfältig gereingt werden. Die Funktion der Vorrich- teraogen. Der Spannungsgradient in dem präparativen tung wird anhand des nachstehend beschriebenen An- Gelt lag bei 4 V/cm. Die Pumpleistung für die Hilfsströwendungsbeispieles erläutert: 5 mumg der Eludier-Pufferlösung, welche entgegen der

Richtung der Elektrophorese lag, belief sich auf 1,5 ml/h. Beispiel I Die Summe der Pumpleistung der Eludier-Pufferlösung

betrug 6 ml/h.

Teile einer homodispersen 3H-poly(U) Mischung (ei- Etwa 50 μg einer RNA wurden einem analytischen

ne homodisperse Mischung aus Tritium und Poly(Uridi- io Gel und etwa 150μ^ einer RNA einem präparativen ne), eines synthetischen, in der Biochemie üblichen Poly- Gel zugeschlagen. Die obere Diagramm-Darstellung in mers) werden einem 3 mm hohen, 9%igen Polyacryla- Fi ig. 3 zeigt die Veränderungen im Ausklingen des anamid beigegeben. Vorher wurde sichergestellt, daß die lytiischen Gels und die untere Darstellung der F i g. 3 die Radioaktvität in wenigstens 8,5 Min. völlig aus dem Gel Veränderungen im Ausklinken der Eludier-Pufferlöbeseitig ist Die Radioaktivität dient zur Meßdatenerfas- is suing. Die Fähigkeit, unterschiedliche Komponenten sung. Es wird festgestellt, mit welcher Geschwindigkeit voneinander zu trennen hat sich durch die Eludierung sie aus dem Gel austritt Damit liegt fest, wieviel Radio- nie ht bemerkbar verschlechtert und die Form der Spitaktivität pro Zeiteinheit in die Eludierkammer eintritt zen V, 2' im präparativen Muster ist jeweils symme-Die Radioaktivität, die mit der Pufferlösung mitgeführt triüch ausgebildet wird, ist dann ein Maß für die Menge an Pufferlösung, 20

die durch die Eludierkammer gepumpt wird. Die Sum- Beispiel III

me der Pumpleistungen der beiden Eludier-Pufferlösun-

een wurde zwischen 2 und 10 ml/h festgelegt Die Teile einer hoch-molekularen RNA werden einem äu-

Pumpleistung der Hilfsströmung der Eludier-Pufferlö- Bellst schwachen 2,20%igen Polyacrylamid-Gel beigesung. die entgegengesetzt zur Richtung der Elektropho- 25 geben. Das Gel wurde auf Glasfiber-Papierscheiben porese verläuft, wurde auf 1JS ml/h konstant gehalten. lynierisierK Etwa 6 μg der RNA wurde analytisches Gel

Die Pumpleistung wurde durch Messung des Trans- und etwa SM μg der RNA ein präparatives Gel beigegeports von angereichertem Wasser während der Elektro- beu.

phorese festgelegt Die Pumpleistung der Hilfsströme Hn der oberen Darstellung in F i g. 4 ist die Verände-

der Eludier-Pufferlösung führt zu einer Wanderung der 30 rung im Ausklinken des analytischen Gels gezeigt und in Eludier-Pufferlösung in die Eludierkammer 5, und zwar deir unteren Zeichnung der F i g. 4 die der Eludier-Pufmit der gleichen Geschwindigkeit wie die freie Elektro- ferlösung.

phorese der RNA, jedoch in Gegenrichtung. Der Span- In den F i g. 3 und 4 bedeutet die Eintragung E 260

nungsgradient im Gel belief sich auf 6 V pro cm bei neben der Ordinate »Extinktion bei 260 nm«. einem Strom von 10 mA. Die Konzentration der EIu- 35 Die Abstützung des Gels durch die Eludierkammer 5 dier-Pufferlösungen war dreimal so hoch wie die der und das üiasfieber-Papier erweist sieh zur Erlangung Gel-Pufferlösung, außer der Natrium-Sulfat-Konzen- einer guten Eludierung mit einem sehr schwachen Gel tration. die überall 0,2% betrug. als geeignet Die relativ hohen Basislinien zwischen den

Spitzen im Muster sind nicht Auswirkungen eines Resultat 40 schlechteren Ergebnisses, sondern durch Bestandteile

im Gel, die ebenfalls auflösende Phänomene darstellen,

Durch Bestimmung der Radioaktivität der Teichen- hervorgerufea

ansammlung ergab sich, daß mit 0,6 ml der Eludier-Puff-

erlösung bei allen Pumpgeschwindigkeiten eine Eludie- Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

rung von mehr als 99% der Radioaktivität erreicht wur- 45 de. wenn eine Korrektur der Bandbreite des Beispieles durchgeführt wurde. Dies bedeutet, daß die Eludierkammer 5 von einem Anteil der Pufferlösung ausgespült wird, der dem fünffachen des Flüssigkeitsvolumens der Eludierkammer 5 entspricht oder dem neunfachen des 50 Flüssigkeitsvolumenanteils der Eludierkammer 5, das sich senkrecht unterhalb dem Gei befindet In dieser Berechnung sind weder Korrekturen bezüglich der Diffusion des Geles noch für die Bandbreite im Röhrensystem zum Teikhensammler enthalten. Der tatsächliche 55 Eludiergrad ist daher noch effizienter als erwähnt Die Eludierung ist daher optimal. Der Anteil der Radioaktivität war immer höher als 96%. F i g. 2 zeigt die Veränderung der Radioaktivität in der Eludier-Pufferlösung bei einer Pumpleistung von 2 ml/h. Die Kurvenform des 60 Diagramms macht deutlich, daß die Eludierung bei einer solch niedrigen Pumpleistung gut vor sich geht, trotz hoher elektrophoretischer Mobilität der RNA.

Beispiel II 65

Teile einer niedrig-molekularen RNA wurden zur Durchführung zweier Versuche einerseits einem analy-

Claims (6)

1 2 dem, daß Komponenten unter dem Einfluß der rapiden Patentansprüche: freien Elektrophorese oder aufgrund von Konvektions- phänomenen oder Schwerkraft in die Nähe des Bodens

1. Elektrophorese-Vorrichtung, bestehend aus ei- der Eludierkammer geraten und sich damit aufgrund des nem Rohr zur Aufnahme einer Gelsäure, einer am s Durchtritts durch den Boden der Eludierkammer ein unteren Ende des Rohres vorgesehenen Eludier- Komponentenverlust einstellt Eine zufriedenstellende kammer, einer Einlaßleitung für eine Pufferlösung in Eludierung ist jedoch nicht möglich, weil die Kompodie Eludierkammer und einem Auslaß zum Austritt nenten auf den Boden der Eludierkammer wandern und der Pufferlösung aus der Eludierkammer, wobei der sich dort ablagern können. Wenn eine solche Membrane Auslaß in bezug auf die Einlaßleitung so angeordnet io den Boden der Eludierkammer bildet, besteht überdies ist, daß die Pufferlösung die Eludierkammer im we- die Gefahr eines Denaturierens, einer Absorption und sentlichen senkrecht zur Mittelachse des Gelaufnah- einer Adsorption der Komponenten.

merohres durchströmt, dadurch gekenn- Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine

zeichnet, daß die Eludierkammer (5) durch einen eiiifache Elektrophorese-Vorrichtung zu schaffen, die

flachen Körper aus hartem porösem Material gebil- 15 leicht bedient werden kann und nicht die oben erwähn-

det ist, der im wesentlichen senkrecht zur Mittelach- tan Nachteile aufweist, ferner eine zufriedenstellende

se des Gelaufnahmerohres (3) liegende Hauptflä- Eludierung liefert, dies sowohl bei schwachen als auch

chen hat, und daß die Leitung (10) zur Zuführung bei starkem Gel und mit Komponenten möglich ist, die

einer Hüfsstrcfflung der Pufferlösung gegen die dem sowohl eine hohe als auch niedrige freie elektrophoreti-

Geiaufnahmerohr (3) abgewandte Hauptfläche des 20 sehe Mobilität besitzen.

die Eludierkammer (5) bildenden Körpers vorgese- Gelöst ist diese Aufgabe durch die im Anspruch 1

hen ist angegebene Erfindung.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekenn- Die Unteransprüche sind vorteilhafte Weiterbildunzeichnet, daß zwischen der Eludierkammer (5) und gen des Gegenstandes der Erfindung.

der Leitung (10) für die Hilfsstrcmung eine Schicht 25 Zufolge solcher Ausgestaltungen ist ein*: Anlage von (11) aus porösem Material angeordnet ist, das die erhöhtem Gebrauchswert geschaffen; sie ist baulich einPufferlösung einen höheren Durchflußwiderstand fach und zeichnet sich durch einen hohen Wirkungsgrad als der die Eludierkammer (5) bildende Körper hat aus. Die Haupt-Trägerlösung, die über einen ersten Ein-

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch laßanschluß zum Auslaß gelangt, vereinigt sich mit einer gekennzeichnet daß der die Eludierkammer (5) bil- 30 Hilfs-Trägerlösung (Pufferlösung) und bildet mit dieser dende Körper aus Sinterglas besaht eine gleichmäßige, die Eludierkammer passierende Trä-

4. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekenn- gerströmung, wodurch verhindert ist, da aus dem Gel zeichnet, daß die poröse Schicht ^,1) aus Sinterglas austretende Komponenten den Boden der Eludierkambesteht. mer erreichen.

5. Vorrichtung nach den Ansprüchen 1 bis 4, da- 35 Weitere Vorteile und Einzelheiten des Gegenstandes durch gekennzeichnet, daß der die Eludierkammer der Erfindung sind nachstehend anhand eines zeichne-(5) bildende Körper und die aus porösem Material risch veranschaulichten Ausführungsbeispieles näher bestehende Schicht (11) durch Sintern miteinander erläutert Es zeigt

verbunden sind. F i g. 1 einen Vertikalschnitt durch die Elektrophore-

6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden 40 se-Vorrichtung,

Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der die Fig.2bis4Kurvendiagramme,
Eludierkammer (5) bildende Körper gegenüber dem F i g. 5 einen Ausschnitt der Anlage in Art einer Ex-Gelaufnahmerohr (3) durch eine auf den Körper auf- plosionszeichnung und

gebrachte Schicht aus gummiartigem Material, wie F i g. 6 einen vergrößerten Schnitt der Anlage unter

aufvulkaniseiertem Silicongummi, abgedichtet ist. 45 Verdeutlichung der Strömungsbahnen.

Die in F i g. 1 dargestellte Anlage weist eine obere

Elektrodenkammer 1 mit Elektrode 13 und eine untere

Elektrodenkammer 2 mit Elektrode 14 auf. Die Elektroden 1 und 14 sind aus Platindraht hergestellt und in

Die Erfindung betrifft eine Elektrophorese-Vorrich- 50 Ringnuten eines entsprechenden Isolationskörpers aus

tung, bestehend aus einem Rohr zur Aufnahme einer Perspex (Polymethacrylat) untergebracht Ein Ringkäfig

Gelsäure, einer am unteren Ende des Rohres vorgesehe- aus diesem genannten Material kann sich mit Abstand

nen Eludierkammer, einer Einlaßleitung für eine Puffer- um diesen Platindraht herum erstrecken, so daß die

lösung in die Eludierkammer und einem Auslaß zum Elektroden vor Beschädigungen geschützt unterge-

Austriti der Pufferlösung aus der Eludierkammer, wobei 55 bracht sind. Die Platindrähte sind je mit einem korro-

der Auslaß in bezug auf die Einlaßleitung so angeordnet sionsfesten Stahlbolzen, der in eine korrosionsfeste

ist, daß die Pufferlösung die Eludierkammer im wesent- Mutter eingeschraubt ist, verbunden. Diese Muttern

liehen senkrecht zur Mittelachse des Gelaufnahmeroh- können mit einer Stromquelle verbunden werden. Die

res durchströmt. Bolzen selbst sind vor Berührung mit dem Elektrolyt-ln-

Aus der US-PS 35 39 493 ist eine ELektrophorese- 60 halt der Elektrodenkammer durch Isolationsbeschich-

Vorrichtung der eingangs genannten Art bekannt, bei tung geschützt.

der als Eludierkammer ein Spalt vorgesehen ist, der zwi- Zwischen den Kammern 1 und 2 befinden sich ein

sehen einer Glasscheibenmembrane und einer Gelsäure zylindrisches Gelaufnahmerohr 3 (Innendurchmesser

ausgebildet ist. Die Glasscheibenmembrane hat Poren ca. 10 mm) für das Gel, ein Gehäuse 4 für eine Eludier-

mit einem Durchmesser von etwa 400 nm, so daß zwar 65 kammer 5 (letztere hat einen Durchmesser von 15 mm

Ionen hindurchtreten können, jedoch für molekulare und eine Dicke von 1,5 mm) und ein Rohrstück 6, wel-

Materialien eine Sperre besteht. Die Glasscheibenmem- ches in eine Bohrung des Gehäuses 4 paßt. Die Eludier-

brane ist notwendig, um bei der Eludierung zu verhin- kammer 5, welche an ihrer Unterseite eine poröse