DE69632820T2

DE69632820T2 - Vorrichtung und verfahren zur elektrophorese

Info

Publication number: DE69632820T2
Application number: DE69632820T
Authority: DE
Inventors: Shmuel Cabilly; Uri Yogev
Original assignee: Ethrog Biotechnology Ltd
Current assignee: Life Technologies Israel Ltd
Priority date: 1995-04-26
Filing date: 1996-04-26
Publication date: 2005-07-07
Anticipated expiration: 2016-04-27
Also published as: EP1486783A1; IL118033A0; CA2219536A1; EP0824689A4; DE69637485D1; EP0824689A1; JPH11505325A; AU706048B2; CA2219536C; WO1996034276A1; US5582702A; NZ306974A; DE69637485T2; US5865974A; ES2305661T3; JP4053592B2; ATE270428T1; IL118033A; EP0824689B1; DE69632820D1

Description

TECHNISCHER BEREICH
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Elektrophorese und insbesondere Vorrichtungen, um darin einen Elektrophoresetest durchzuführen.
STAND DER TECHNIK
Es werden zahlreiche diagnostische Verfahren und Labortests durchgeführt, bei denen DNA, RNA oder Proteine nach ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften mittels Elektrophorese getrennt werden. Dieser Vorgang findet breite Verwendung und es gibt für ihn viele Anwendungen. Er wird beispielsweise verwendet, um DNA-Moleküle nach ihrer Größe zu analysieren, die sie aufweisen, nachdem sie durch Restriktionsenzyme aufgeschlossen worden sind. Er wird auch verwendet, um die Produkte einer Polymerasekettenreaktion (PCR) zu analysieren.
Typischerweise wird eine elektrophoretische Trennung in einem Trennmedium wie Agarose-Gel oder Acrylamid-Gel oder einer Kombination dieser beiden Gele durchgeführt. Gewöhnlich werden Agarose-Gele auf offene Tabletts gegossen und bilden eine Platte, während Acrylamid-Gele zwischen zwei Glasplatten gegossen werden.
Das US-Patent 5,407,552 offenbart eine Elektrophoresevorrichtung mit einer Patrone, die mit einem geeigneten und wahlweise gefärbten Gel gefüllt ist und aus einem hohlen Abschnitt besteht, der zwei einander gegenüber liegende offene Seiten aufweist, von denen eine mit einem abnehmbaren Kammelement verschlossen ist, um in dem Gel Eindrücke auszubilden, während die andere mit einer abnehmbaren Abdeckung verschlossen ist.
Um die elektrophoretische Trennung zu bewirken, werden zwei einander gegenüber liegende Enden der Gele mit einem elektrisch leitenden Puffer in Kontakt gebracht, der mittels Elektroden, die typischerweise aus Kohle oder Platin bestehen, an eine elektrische Stromquelle angeschlossen wird. Sobald die elektrische Stromquelle eingeschaltet wird, veranlasst das elektrische Feld negativ geladene Moleküle sich zur Anode zu bewegen und positiv geladene Moleküle sich zur Kathode zu bewegen. Ein Merkmal der herkömmlichen Elektrophorese ist die Verwendung großer Volumen an Puffer mit einer relativ niedrigen Salzkonzentration, um das erforderliche elektrische Feld aufrechtzuerhalten.
DNA ist negativ geladen und daher bewegen sich DNA-Moleküle in Agarose- oder Acrylamid-Gelen, die eine Siebwirkung besitzen, zur Anode hin, wobei ihre Geschwindigkeit von ihrer Größe abhängt und die Moleküle sich umso schneller bewegen, je kleiner sie sind.
Typischerweise ist es wünschenswert die Ergebnisse einer elektrophoretischen Trennung zu visualisieren und zu dokumentieren. Bei der elektrophoretischen Trennung von DNA-Molekülen erfolgt dies, indem die Gelplatte, nachdem die elektrophoretischen Trennung abgeschlossen ist, in eine Lösung einer fluoreszierenden Verbindung eingetaucht wird, die sichtbares Licht emittiert, wenn sie mit ultraviolettem (UV) Licht bestrahlt wird. Eine häufig verwendete Verbindung ist Ethidiumbromid.
Herkömmlich Systeme zur elektrophoretischen Trennung weisen in verschiedenen Hinsichten Mängel auf, von denen einige im Folgenden aufgeführt werden.
Systeme zur elektrophoretischen Trennung, die dem Stand der Technik entsprechen, sind eine potenzielle Quelle von Kontaminationen der Arbeitsumgebung, in der die Tests durchgeführt werden. Die zwei wichtigsten Kontaminationsquellen sind Ethidiumbromid und PCR-Produkte. Ethidiumbromid ist wegen seiner mutagenen Wirkung ein Gefahrenstoff, und der Kontakt mit Ethidiumbromid kann bösartige Tumoren verursachen. PCR ist ein äußerst empfindliches Verfahren, und zwar in dem Ausmaß, dass ein einziges Molekül eines DNA-Produkts aus einer PCR (von den Billionen erzeugter Moleküle) eine nachfolgende PCR so stören kann, dass sie zu einem falsches Ergebnis führt.
Die herkömmliche Elektrophorese weist auch in anderen Hinsichten Mängel auf, von denen einer darin besteht, dass sie sehr zeitaufwändig ist.
Es sind verschiedene Versuche unternommen worden die Mängel der herkömmlichen Elektrophorese zu beseitigen. Die meisten Versuche galten der Beseitigung des Mangels herkömmlicher Elektrophorese-Systeme, der mit der Verwendung von Puffern zusammenhängt.
Das an Stalberg erteilte US-Patent Nr. 4,874,491 beschreibt ein Elektrophorese-System mit einem Gel, das einen hoch konzentrierten Puffer enthält.
Das an Sarrine et al. erteilte US-Patent Nr. 4,892,639 beschreibt eine Elektrophoreseplatte mit verbesserter Pufferzirkulation.
Das an Tansamrit et al. erteilte US-Patent Nr. 5,045,164 beschreibt eine Elektrophoreseplatte mit verdickten Enden, die als Pufferreservoirs dienen.
Das an MacConnel erteilte US-Patent Nr. 5,209,831 beschreibt eine pufferfreie Einwegkassette mit offenen Enden und Elektroden aus einer leitenden Folie.
DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, eine verbesserte Vorrichtung für die Elektrophorese verfügbar zu machen.
Eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine geschlossene Kassette für die Elektrophorese verfügbar zu machen, die in Wesentlichen vor, während und nach einem darin durchgeführten Elektrophoresetest geschlossen ist.
Gemäß einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Kassette um eine Einwegkassette.
Die Kassette gemäß der vorliegenden Erfindung vermeidet Nachteile, die mit herkömmlichen Elektrophoresekassetten oder -platten einhergehen. Da die Kassette geschlossen ist, kann ihre äußere Umgebung nicht kontaminiert werden. Da sie weiter gebrauchsfertig ist, wird die Zeit gespart, die zur Vorbereitung von herkömmlichen Kassetten erforderlich ist.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Elektrophorese-System verfügbar zu machen, in dem sowohl die elektrophoretische Trennung als auch die Visualisierung von deren Ergebnis durchgeführt wird, während sich die Kassette in situ befindet.
Gemäß einem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird eine im Wesentlichen geschlossene Einwegkassette verfügbar gemacht mit Öffnungen, um eine Probe von Molekülen einzubringen, wobei die Öffnungen vorzugsweise erst unmittelbar vor dem Elektrophoresetest geöffnet werden.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung enthält die Kassette alle chemischen Verbindungen, die zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung erforderlich sind und, falls DNA-Moleküle getrennt werden, die Verbindungen, die erforderlich sind, um die getrennte DNA zu färben.
Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung ist das Volumen der Ionenquelle, die zur Bereitstellung der für die elektrophoretische Trennung erforderlichen Ionen verwendet wird, kleiner als das Volumen des Gels, das als Trennmatrix für die Elektrophorese verwendet wird, und vorzugsweise ist es auch kleiner als das Volumen des Gels das für die eigentliche Trennung während eines Elektrophoresetests verwendet wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Ionen (Kationen und Anionen), die zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung erforderlich sind, von einer Kationenaustauschermatrix bzw. einer Anionenaustauschermatrix geliefert.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liefert die Kationenaustauschermatrix auch die Kationen, die zum Färben der getrennten Moleküle erforderlich sind, um deren Visualisierung zu ermöglichen, wenn die Kassette mit einer UV-Lichtquelle bestrahlt wird.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung erforderlichen Ionen von einer Reservoir geliefert, bei dem es sich vorzugsweise um eine Brechampulle handelt, die einen Puffer enthält, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine relativ hohe Konzentration an diesen Ionen enthält.
Ein Vorzug der Kassette gemäß der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass es sich um ein Einwegprodukt handelt.
Ein weiterer Vorzug der Kassette gemäß der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass der Benutzer nicht wie bei herkömmlichen Kassetten in Kontakt mit Gefahrenstoffen wie Ethidiumbromid kommt.
Noch ein Vorzug der Kassette gemäß der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass PCR-DNA-Produkte in der Kassette enthalten bleiben und mit ihr entsorgt werden, so dass die Kontamination der Arbeitsumgebung, in der die Tests durchgeführt werden, wesentlich verringert wird.
Somit wird gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung verfügbar gemacht, um darin eine elektrophoretische Trennung durchzuführen, die ein Gehäuse umfasst, das wenigstens Boden- und Seitenwände aufweist, die eine Kammer definieren, wobei die Kammer in Kontakt miteinander befindlich einen Gelkörper als Träger für die elektrophoretische Trennung, wenigstens eine Ionenquelle, die die Ionen zum Antreiben der Elektrophorese liefert und ein Volumen aufweist, das kleiner als das Volumen des Gelkörpers ist, sowie Elektroden enthält, über die die Kammer an eine externe Stromquelle angeschlossen wird, wodurch die elektrophoretische Trennung angetrieben werden kann.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird auch eine im Wesentlichen geschlossene Kassette verfügbar gemacht, um darin eine elektrophoretische Trennung durchzuführen, die eine geschlossene Kammer enthält, in der sich ein Gelkörper als Träger für die elektrophoretische Trennung, wenigstens eine Ionenquelle, die die Ionen zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung liefert, sowie Elektroden befinden, über die die Kammer an eine externe Stromquelle angeschlossen wird, wodurch die elektrophoretische Trennung angetrieben werden kann.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird weiter eine Vorrichtung verfügbar gemacht, um darin eine elektrophoretische Trennung durchzuführen, die ein Gehäuse umfasst, das wenigstens Boden- und Seitenwände aufweist, die eine Kammer definieren, wobei die Kammer in Kontakt miteinander befindlich einen Gelkörper als Träger für die elektrophoretische Trennung, wenigstens eine Ionenquelle, die die Ionen zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung liefert, sowie Elektroden enthält, über die die Kammer an eine externe Stromquelle angeschlossen wird, wodurch die elektrophoretische Trennung angetrieben werden kann.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Volumen der wenigstens einen Ionenquelle kleiner als das Volumen des Gelkörpers, der bei der elektrophoretischen Trennung verwendet wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die wenigstens eine Ionenquelle einen Ionenaustauschermatrixkörper. Weiter umfasst der Ionenaustauschermatrixkörper einen Kationenaustauschermatrixkörper, um die Kationen zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung zu liefern, und einen Anionenaustauschermatrixkörpen, um die Anionen zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung zu liefern. Darüber hinaus ist die Kationenaustauschermatrix an einem Ende des Trenngelkörpers angeordnet, und die Anionenaustauschermatrix ist an einem zweiten Ende des Trenngels angeordnet.
Im Betrieb tauscht die Kationenaustauschermatrix aus Elektrolyse stammende Protonen gegen die Kationen zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung aus, und die Anionenaustauschermatrix tauscht aus der Elektrolyse stammende Hydroxyl-Ionen gegen Anionen zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung aus.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die Kationenaustauschermatrix und die Anionenaustauschermatrix Partikel, die in eine Trägermatrix eingetaucht sind. Vorzugsweise besteht die Trägermatrix aus demselben Gel, wie der Gelkörper, der als Träger der darin durchgeführten elektrophoretischen Trennung dient.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Vorrichtung noch einen zusätzlichen Gelkörper niedriger Gelfestigkeit, der zwischen der Seitenwand der Kammer und der Anionenaustauschermatrix angeordnet ist, wobei der Gelkörper niedriger Gelfestigkeit während der elektrophoretischen Trennung schrumpft und dadurch Volumen freigibt, in dem sich Gase, die in der Umgebung einer Anode der Kammer bilden, ansammeln.
Weiter umfasst die Vorrichtung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Pufferlösung, die sich mit dem Trenngelkörper, dem wenigstens einen Ionenaustauschermatrixkörper und den Elektroden in Kontakt befindet. Der Puffer ist vorzugsweise ein TAE-Puffer, so dass die Kationenaustauschermatrix Tris-Kationen freisetzt und die Anionenaustauschermatrix Acetat-Ionen freisetzt.
Außerdem enthält die Kationenaustauschermatrix gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Ethidiumkationen.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die wenigstens eine Ionenquelle ein geschlossenes Reservoir, in dem sich eine Pufferlösung befindet, die eine höhere Konzentration aufweist als eine Konzentration einer Pufferlösung des Gelkörpers, der als Träger der elektrophoretischen Trennung dient, wobei das geschlossene Reservoir unmittelbar vor der elektrophoretischen Trennung geöffnet wird, um die Ionen zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung zu liefern.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das geschlossene Reservoir eine Brechampulle. Weiter kann die Brechampulle von einem Raum umgeben sein, wobei der Raum wenigstens teilweise mit der Pufferlösung gefüllt ist in einer Konzentration, die im Allgemeinen ähnlich derjenigen des Gelkörpers ist, der als Träger der elektrophoretischen Trennung dient. Der Puffer ist vorzugsweise ein TAE-Puffer.
Die Vorrichtung und die Kassette gemäß der vorliegenden Erfindung sind weiter durch eine beliebige Kombination der folgenden Merkmale gekennzeichnet:
Die Kammer oder die Abdeckung kann wenigstens eine Öffnung aufweisen, um wenigstens eine Testprobe in den Gelkörper einzubringen. Die wenigstens eine Öffnung ist vor der elektrophoretischen Trennung vorzugsweise mittels eines Kamms geschlossen.
Die Kammer und/oder die Abdeckung können für Ultraviolett-Strahlung (UV) durchlässig sein.
Die Kammer oder die Abdeckung kann auch wenigstens ein Entlüftungsloch aufweisen, das vor der Durchführung des Elektrophoresetests geschlossen ist und unmittelbar vor dem Elektrophoresetest geöffnet wird.
Weiter umfassen die Elektroden gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein leitendes Material, das wenigstens einen Teil wenigstens eines der während der elektrophoretischen Trennung entstehenden Gase adsorbieren kann. Die wenigstens eine adsorptionsfähige Elektrode besteht vorzugsweise im Wesentlichen aus einem Material, das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Aluminium und Palladium.
Außerdem gehört zu den Gasen Sauerstoff, der während der elektrophoretischen Trennung in der Umgebung der Anode entsteht und mit dem Aluminium reagiert. Alternativ gehört zu den Gasen Wasserstoff, der während der elektrophoretischen Trennung in der Umgebung der Kathode entsteht, wobei der Wasserstoff von dem Palladium adsorbiert wird.
In einer alternativen Ausführungsform umfasst die wenigstens eine Elektrode einen Streifen leitfähigen Materials. Der Streifen leitfähigen Materials ist vorzugsweise auf eine abgeschrägt Fläche aufgebracht, wobei die abgeschrägte Fläche um einen Winkel gegenüber der Bodenwand geneigt ist, wodurch Gase, die während der elektrophoretischen Trennung in der Umgebung des Streifens entstehen, zu einem leeren Volumen geleitet werden, das die Gase aufnimmt.
Schließlich kann die Vorrichtung oder Kassette auch wenigstens ein leeres Volumen umfassen, um Gase anzusammeln, die während des Elektrophoresetests entstehen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auch ein System zur Durchführung einer elektrophoretischen Trennung vorgesehen, das Folgendes umfasst: eine Stromquelle, eine im Wesentlichen geschlossene Einwegkassette, vorzugsweise, aber nicht notwendig die Vorrichtung oder Kassette gemäß der vorliegenden Erfindung, und eine Haltevorrichtung, um die im Wesentlichen geschlossene Kassette zu halten und die Stromquelle an die leitenden Elemente der Kassette anzuschließen.
Weiter kann das System auch eine UV-Lichtquelle umfassen, wobei die Kassette für UV-Licht durchlässig ist und wobei die Kassette auch ein UV-empfindliches Material umfasst, das mit den Molekülen, die die elektrophoretische Trennung durchlaufen, wechselwirken und Licht emittieren kann und es somit ermöglicht, die elektrophoretische Trennung durchzuführen und sie, während sich die Kassette in situ befindet, zu visualisieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das UV-empfindliche Material Ethidiumbromid.
Darüber hinaus kann das System auch ein Kameramittel umfassen, um die Ergebnisse der elektrophoretischen Trennung zu dokumentieren. Das System kann auch einen Computer umfassen, der wenigstens eine Bildanalyseanwendung umfasst, um die Ergebnisse der elektrophoretischen Trennung zu analysieren.
Außerdem kann das System ein Kühlsystem umfassen, um die Kassette während des Elektrophoresetests zu kühlen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auch ein Elektrophoreseverfahren vorgesehen, das die folgenden Schritte umfasst: Einbringen wenigstens einer Testprobe in einen Gelkörper, Anlegen eines elektrischen Felds an den Gelkörper und Antreiben der elektrophoretischen Trennung durch Bereitstellen von Ionen, die zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung erforderlich sind, mittels wenigstens einer Ionenquelle, deren Volumen kleiner als das Volumen des Gels ist.
Schließlich ist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein Verfahren vorgesehen zur Herstellung einer im Wesentlichen geschlossenen Kassette, um darin eine elektrophoretische Trennung durchzuführen, das die folgenden Schritte umfasst: Bereitstellen eines Gehäuses, das Boden- und Seitenwände aufweist, die eine offene Kammer definieren; einen Gelkörper als Träger für die elektrophoretische Trennung, wenigstens eine Ionenquelle, um Ionen zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung zu liefern, wobei die wenigstens eine Ionenquelle ein Volumen besitzt, das kleiner ist als dasjenige des Gelkörpers, sowie Elektroden, um die Kammer an eine äußere Stromquelle anzuschließen, in der Kammer in wechselseitigem Kontakt einsetzen; Abdecken des Gehäuses mit einer Abdeckung, wodurch eine im Wesentlichen geschlossene Kassette gebildet wird, die geeignet ist, um darin eine elektrophoretische Trennung durchzuführen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung kann anhand der folgenden detaillierten Beschreibung in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen besser verstanden und beurteilt werden. Bei den Zeichnungen ist
1 eine schematische isometrische Darstellung eine Elektrophoresekassette, die gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert;
2 eine schematische Querschnittsdarstellung entlang den Linien II-II in 1.
3 eine schematische isometrische Explosionsdarstellung der Elektrophoresekassette aus 1;
4 eine schematische Querschnittsdarstellung entlang den Linien IV-IV in 3;
5 eine schematische isometrische Explosionsdarstellung einer Elektrophoresekassette, die gemäß einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert;
6 eine schematische Querschnittsdarstellung entlang den Linien VI-VI in 5;
7 eine schematische isometrische Darstellung einer Elektrophoresekassette, die gemäß einer dritten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert;
8 eine schematische isometrische Explosionsdarstellung der Elektrophoresekassette aus 7;
9 eine schematische Querschnittsdarstellung entlang der Linien IX-IX in 7;
10 eine schematische Querschnittsdarstellung entlang der Linien X-X in 7;
11 eine schematische Querschnittsdarstellung entlang der Linien XI-XI in 7;
12 eine schematische isometrische Darstellung einer Elektrophoresekassette, die gemäß einer vierten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert;
13 eine schematische isometrische Darstellung in Schnittperspektive der Elektrophoresekassette aus 12 mit nach oben gekehrtem Boden;
14 eine schematische isometrische Explosionsdarstellung der Elektrophoresekassette aus 12;
15 eine schematische Querschnittsdarstellung entlang der Linien XV-XV in 14; und
16 eine schematische isometrische Darstellung eines Elektrophorese-Systems, das gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
Es wird jetzt auf die 1–4 Bezug genommen, die eine allgemein mit der Bezugsziffer 10 bezeichnete Einwegkassette zur Durchführung einer Elektrophorese darstellen, die gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert.
Wie am besten in 1 zu sehen ist, ist die Kassette 10 eine geschlossene Einwegkassette, die vorzugsweise, aber nicht notwendig für einen einzigen Elektrophoresetest verwendet wird. Die Kassette 10 enthält alle chemischen Verbindungen, die zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung und zur Visualisierung ihrer Ergebnisse nach vollzogener Trennung von DNA- oder RNA- oder Proteinmolekülen erforderlich sind.
Wie am besten in 3 zu sehen ist, umfasst die Kassette 10 vorzugsweise eine im Wesentlichen flache dreidimensionale Kammer 11, die mit den Bezugsziffern 12 bzw. 14 bezeichnete Boden- und Seitenwände aufweist und eine Abdeckung 16, die die obere Wand der Kassette bildet. Die Bodenwand 12 (4) und die Abdeckung 16 bestehen vorzugsweise aus einem geeigneten für UV durchlässigen Material wie dem Kunststoff TPX, der im Handel von MITSUI in Japan erhältlich ist, oder dem Kunststoff PMMA, der im Handel von Repsol Polivar S. P. A. in Rom erhältlich ist. In einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung der Kassette 10 wird ein Kunststoff-Formverfahren eingesetzt, bei dem ein Rohaglas-Presspulver verwendet wird, das im Handel von der Sidas GmbH in Darmstadt, Deutschland erhältlich ist.
Wie am besten in der Querschnittsdarstellung in 4 zu sehen ist, umfasst die Kammer 11 vorzugsweise eine Gelmatrix 18, bei der es sich um irgendeine für Elektrophorese geeignete Gelmatrix handeln kann, beispielsweise ein Agarose-Gel oder ein aus Acrylamid hergestelltes Gel, eine Kationenaustauschermatrix 20 und eine Anionenaustauschermatrix 22, die zusammen als die Ionenaustauschermatrizes 20 und 22 bezeichnet werden. Die Kammer 11 umfasst weiter zwei mit den Bezugsziffern 24 und 26 bezeichnete leitende Stäbe, beispielsweise Stäbe aus rostfreien Stahl, die, wenn sie an eine externe Gleichstromquelle angeschlossen werden, das elektrische Feld liefern, das zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung erforderlich ist. In der dargestellten Ausführungsform ist der Stab 24 die Anode und der Stab 26 die Kathode. Die Kammer 11 umfasst weiter zwei leere Volumen 28 und 30, in denen sich Gase, die während des Elektrophoresetests entstehen, ansammeln können. Alternativ kann die offene Abdeckung 16 zwei nur in 3 gezeigte Entlüftungslöcher 32 und 34 aufweisen, um die in den leeren Volumen 28 und 30 angesammelten Gase abzulassen.
Ein besonderes Merkmal der Kassette 10, das am besten in den 3 und 4 zu sehen ist, besteht darin, dass das Volumen der Ionenquelle, der Ionenaustauschermatrizes 20 und 22, in der dargestellten Ausführungsform kleiner ist als das Volumen des Gels 18, das als Trennmatrix für die Elektrophorese verwendet wird, und dass es vorzugsweise kleiner ist als das Volumen des Gels, das für die eigentliche Trennung während des Elektrophoresetests verwendet wird.
Es versteht sich, dass die Entlüftungslöcher 32 und 34, falls sie in der Kassette 10 vorhanden sind, vor dem Beginn des Elektrophoresetests verschlossen sind und dass sie unmittelbar vor Beginn des Elektrophoresetests geöffnet werden und nach Beendigung des Tests wieder verschlossen werden, um die Möglichkeit einer daher rührenden Kontamination stark zu verringern.
Vorzugsweise sind das Gel 18, die Ionenaustauschermatrizes 20 und 22 und die leitenden Stäben 24 und 26 jeweils untereinander in Kontakt und in eine relativ kleine Menge einer Agarosematrix eingetaucht, die einen Puffer, beispielsweise einen TAE-Puffer enthält, was die Beweglichkeit der Moleküle, die getrennt werden, und der von den Ionenaustauschermatrizes 20 und 22 gelieferten Ionen erhöht.
Es ist ein besonderes Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass die Ionen, die zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung erforderlich sind, von den Ionenaustauschermatrizes 20 und 22 geliefert werden, und zwar vorzugsweise durch Austausch von Protonen und Hydroxyl-Ionen, die aus der Elektrolyse von H₂O stammen. Im Betrieb wird ein Gleichstrom über die Stäbe 24 und 26 angelegt, um die Elektrolyse in Gang zu setzen, die ihrerseits den Betrieb der Ionenaustauschermatrizes in Gang setzt.
Die Kationenaustauschermatrix 20 und die Anionenaustauschermatrix 22 setzen die Kationen und Anionen frei, die zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung erforderlich sind. Ein Beispiel für ein geeignetes Kation ist das Tris⁽⁺⁾-Kation und ein Beispiel für ein geeignetes Anion ist Acetat^(–). Die von den Ionenaustauschermatrizes 20 und 22 freigesetzten Ionen werden vorzugsweise, aber nicht notwendig gegen adsorbierte Protonen bzw. Hydroxyl-Ionen ausgetauscht. Alternativ oder zusätzlich können die von den Ionenaustauschermatrizes 20 und 22 adsorbierten Ionen auch von den Stäben 24 und 26 geliefert werden.
Es versteht sich, dass die Verwendung der Ionenaustauschermatrizes 20 und 22 einen im Allgemeinen gleichmäßigen pH-Wert in der gesamten Zelle ergibt, da die Freisetzung eines jeden Protons an der Anode 24 durch die Protonenabsorption in der nahe gelegenen Kationenaustauschermatrix 20 ausgeglichen wird und die Freisetzung von Hydroxyl-Ionen an der Kathode 26 durch die Absorption dieser Ionen in der Anionenaustauschermatrix 22 ausgeglichen wird.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Kationenaustauschermatrix 20 und die Anionenaustauschermatrix 22 in eines der Materialien eingetaucht sein, die zur Zubereitung des Gels verwendet werden.
Ein geeignetes Kationenaustauschermaterial ist CM-25-120 Sephadex und geeignete Anionenaustauschermaterialien sind WA-30 und A-25-120, die alle im Handel von Sigma Inc. in St. Louis, USA erhältlich sind.
Die Kassette 10 weist in dem Gel 18 vorzugsweise auch Vertiefungen 36 auf. Die Vertiefungen 36 werden verwendet, um Proben der Moleküle, die der elektrophoretischen Trennung unterzogen werden, einzubringen. Die Vertiefungen 36 können mittels eines beliebigen geeigneten Verfahrens geformt werden, beispielsweise indem in das Gel eine kammähnliche Struktur 40 (2) eingelassen wird, während das Gel aufgebaut wird. Der Kamm 40 wird über entsprechende Öffnungen 38 (1) in der Abdeckung 16 in das Gel eingelassen. Die Öffnungen 38 können als zusätzlicher Raum für das Einbringen der Molekülproben unmittelbar vor Beginn des Elektrophoresetests genutzt werden, nachdem der Kamm 40 entfernt worden ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Vertiefungen 36, wie am besten in 2 zu sehen ist, mit dem Kamm 40 abgedeckt, der bei ihrer Herstellung verwendet wird. Der Grund hierfür liegt darin, dass das Kammverfahren das Einführen einer Kammstruktur in das Gel durch die Öffnungen 38 in der oberen Abdeckung 16 mit sich bringt, wobei der Kamm erst unmittelbar vor dem Elektrophoresetest herausgezogen wird.
Es ist ein besonderes Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass die Kassette 10 eine geschlossene Kassette ist, auf der der Kamm 40 liegt, der unmittelbar vor dem Elektrophoresetest selbst entfernt wird.
Die Kassette 10 enthält auch eine Quelle für Ethidiumkationen, die zur Visualisierung der getrennten DNA-Moleküle mittels ultravioletter (UV) Strahlung verwendet werden. Anders als herkömmliche Elektrophorese-Systeme, bei denen Ethidiumbromid nach der Trennung der Moleküle eingebracht wird, was typischerweise durch Eintauchen des Gels in eine Ethidiumbromidlösung erfolgt, enthält die Kassette 10 eine interne Quelle für Ethidiumionen. Vorzugsweise setzt die Kationenaustauschermatrix 20 nicht nur die TRIS-Kationen, sondern auch die Ethidiumionen frei, die mit den Molekülen, die der elektrophoretischen Trennung unterzogen werden, wechselwirken.
In einer bevorzugten Ausführungsform liefert die Kationenaustauschermatrix 20 während des Elektrophoresetests einen kontinuierlichen Fluss von Ethidiumkationen, um die DNA-Moleküle zu färben und somit ihre Visualisierung und Analyse in situ unter Verwendung eines geeigneten Elektrophorese-Systems, wie es im Folgenden unter Bezugnahme auf 16 beschrieben wird, zu ermöglichen.
Die folgenden Beispiele, die nicht als Einschränkung des Anwendungsbereichs der vorliegenden Erfindung gedacht sind, illustrieren, wie die Kationenaustauschermatrix 20 und die Anionenaustauschermatrix 22 hergestellt werden. Das folgende Beispiel bezieht sich auf eine Kassette, deren äußere Länge, Breite und Höhe 100 Millimeter (mm), 80 mm und 6 mm betragen. Es versteht sich, dass eine Kassette dieser äußeren Abmessungen im Wesentlichen flach ist.
BEISPIEL 1
Die Kationenaustauschermatrix wurde folgendermaßen hergestellt:

A. Ungefähr 5 Gramm CM-25-120 Sephadex-Partikel wurden unter Verwendung von drei Volumen TAE-Lösung mit einer Konzentration, die 50-mal höher als die Konzentration des während des Elektrophoresetests verwendeten TAE-Puffers betrug, (in diesem Dokument × 50 TAE Lösung genannt) gewaschen. In diesem Beispiel wurde im Elektrophoresetest selbst eine Lösung verwendet, deren Konzentration 0,04 M Tris-Acetat und 0,002 M EDTA betrug.
B. Die CM-25-120 Sephadex-Partikel wurden mit destilliertem Wasser gewaschen.
C. Zwei Gramm der gewaschenen CM-25-120 Sephadex-Partikel wurden mit 50 ml 0,5 × TAE Puffer und 5 Mikrolitern Ethidiumbromid gemischt.
D. Das Gemisch wurde ohne Rühren eine Stunde stehen gelassen, damit sich die CM-25-120-Partikel absetzen konnten.
E. 25 ml des Gemischs wurden ausgefiltert, um 25 ml Lösung einschließlich der 2 Gramm CM-25-120 Sephadex-Partikel zu erhalten.
F. Die erhaltenen 25 ml Gemisch einschließlich der CM-25-120 Sephadex-Partikel wurde in ein 4-prozentiges Agarose-Gel eingetaucht, um die Kationenaustauschermatrix 20 zu erhalten.

Die Anionenaustauschermatrix 22 wird folgendermaßen hergestellt:

A. Ungefähr 3 Gramm WA-30-Partikel wurden unter Verwendung von drei Volumen der zum Waschen der Kationenaustauscherpartikel verwendeten 50 ×-Lösung gewaschen.
B. Die WA-30-Partikel wurden mit destilliertem Wasser gewaschen.
C. Ein Gramm der WA-30-Partikel wurde in einem 4-prozentigen Agarose-Gel eingetaucht, um die Anionenaustauschermatrix 22 zu erhalten.

BEISPIEL 2
Die Kationenaustauschermatrix 20 wird folgendermaßen hergestellt:

A. 20 Gramm gequollener CM-25-120 Sephadex-Partikel wurden in eine Standardsäule gegeben und mit 500 ml 1,2 M TAE-Lösung gewaschen, deren pH-Wert mit HCl auf 9,3 eingestellt war.
B. Die CM-25-120 Sephadex-Partikel wurden mit 7 Volumen destillierten Wassers gewaschen.
C. Die CM-25-120 Sephadex-Partikel wurden aus der Säule genommen und in zwei Volumen 0,6 × TAE-Puffer aufbewahrt.
D. Ethidiumbromid wurde in 1 ml gequollenem CM-25-150 Sephadex bis zur Sättigung adsorbiert, und die Bromidionen wurden ausgewaschen.
E. 1,2 ml der im TAE-Puffer aufbewahrten CM-25-120-Partikel (Schritt C) und 3 Mikroliter der Partikel, an denen Ethidium adsorbiert war, (Schritt D) wurden in 1,5 ml eines 2-prozentigen Agarose-Gels, das die Agarosematrix bildet, eingetaucht, um die Kationenaustauschermatrix 20 für die Kassette 10 zu erhalten.

Die Anionenaustauschermatrix 22 wurde folgendermaßen hergestellt:

A. 25 Gramm DEAE Sephadex A-25-120-Partikel wurden in eine Standardsäule gegeben und mit 500 ml 1 M Natriumacetatlösung gewaschen, deren pH-Wert mit Essigsäure auf 7 eingestellt war.
B. Die A-25-120-Partikel wurden mit 7 Volumen destillierten Wassers gewaschen.
C. Die A-25-120 Sephadex-Partikel wurden aus der Säule genommen und in zwei Volumen 0,6 × TAE-Puffer aufbewahrt.
D. 1,2 ml der A-25-120-Partikel wurden, nachdem sie Acetationen adsorbiert hatten (Schritt C), in 1,5 ml 2-prozentigen Agarose-Gels eingetaucht, das die Agarosematrix bildet, um die Anionenaustauschermatrix 22 für die Kassette 10 zu erhalten.

Es wird jetzt Bezug auf die 5 und 6 genommen, die eine Elektrophoresekassette darstellen, die allgemein mit der Bezugsziffer 25 bezeichnet wird und gemäß einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert.
Die Kassette 25 ist hinsichtlich Aufbau und Betrieb im Allgemeinen der Kassette 10 (1–4) ähnlich, d. h. es ist eine geschlossene Einwegkassette, die vorzugsweise für einen einzelnen Elektrophoresetest verwendet wird und die ein Gel 18 und Ionenaustauschermatrizes 20 und 22 umfasst. Daher werden ähnliche Elemente der Kassetten 10 und 25 mit ähnlichen Bezugsziffern bezeichnet (z. B. Kamm 40).
Die Kammer 60 umfasst ähnlich der Kammer 11 eine Gelmatrix 18 und Ionenaustauschermatrizes 20 und 22. Die Kammer 60 unterscheidet sich jedoch von der Kammer 11 in Aufbau und Betrieb hinsichtlich der Anode und der Kathode und des Mechanismus der Gasansammlung und Entlüftung.
Die Kammer 60 umfasst zwei leitende Streifen 21 und 23, die die Kathode bzw. die Anode bilden. Die Kathode 21 liegt diagonal auf einer diagonal abgeschrägten Fläche 27, die abgeschrägte Fläche 27 ist vorzugsweise in einem Stück mit der Kammer 60. Die Anode 23 befindet sich unter der Ionenaustauschermatrix 20 und einer zusätzlichen Gelmatrix 29, die während der Elektrophorese aufgrund von Elektroosmose schrumpft, wie es im Folgenden detailliert beschrieben ist. Die Gelmatrix 29 besteht vorzugsweise aus demselben Gel wie die Gelmatrix 18, ihre Gelfestigkeit ist jedoch geringer als diejenige des Gels 18. Zum Beispiel enthält die Gelmatrix 18 2% Agarose, während die Gelmatrix 29 0,3% Agarose enthält.
Im Betrieb während eines Elektrophoresetests fließt aufgrund von Elektroosmose Wasser von der Anodenseite zur Kathodenseite der Gelmatrizes. Demzufolge schrumpft die Gelmatrix 29 allmählich und gibt dadurch Raum frei, in dem sich Gase, die im Bereich der Anode 23 entstehen, ansammeln.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bestehen die Kathode 21 und die Anode 23 aus einem leitenden Material, das Gase, die während des Vorgangs der elektrophoretischen Trennung entstehen, adsorbieren können.
In einer bevorzugten Ausführungsform bestehen die Kathode 21 und die Anode 23 aus Aluminium. Während der Elektrophorese reagiert der Sauerstoff, der im Bereich der Anode 23 entsteht, mit der Aluminiumanode und bildet Aluminiumoxid, wodurch an der Anodenseite weniger freier Sauerstoff entsteht. Die Verringerung des Volumens an entstehendem Gas mindert zusammen mit dem Raum, der durch das Schrumpfen der Gelmatrix 29 für die Ansammlung von Gas entsteht, die Notwendigkeit einer Entlüftungsöffnung an der Anodenseite der Kassette 25. Somit braucht die Kassette in ihrer Abdeckung 62 nur eine Entlüftungsöffnung 35 über dem leeren Volumen 30 aufzuweisen, das an die Kathode angrenzt.
In einer alternativen Ausführungsform besteht die Anode wie vorstehend beschrieben aus Aluminium während die Kathode aus Palladium oder einem anderen geeigneten leitenden Material besteht, das Wasserstoff an der Kathodenseite adsorbiert.
Ein weiteres besonderes Merkmal der Kassette 25 besteht darin, dass die Kathode 21 auf der abgeschrägten Fläche 27 aufliegt. Dies erleichtert den ständigen Kontakt zwischen der Kathode und der Oberfläche der Anionenaustauschermatrix 22, die über der Kathode 21 liegt, wodurch freigesetzte Gasblasen, die im Bereich der Kathode 21 entstehen, zu dem leeren Volumen 30 gelenkt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die abgeschrägte Fläche 27 so ausgebildet, dass sie in einem Stück mit der Kammer 60 ist und unter einem Winkel von ungefähr 45 Grad zur Bodenwand 12 hin geneigt ist.
Es wird jetzt Bezug auf die 7–11 genommen, die eine Elektrophoresekassette darstellen, die allgemein mit der Bezugsziffer 125 bezeichnet wird und gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert. Die Kassette ist ähnlich wie die Kassetten 10 und 25 eine geschlossen Einwegkassette, die für einen einzigen Elektrophoresetest verwendet wird und alle chemischen Verbindungen enthält, die zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung und zur Visualisierung ihrer Ergebnisse nach der Trennung von DNA- oder RNA- oder Proteinmolekülen erforderlich sind.
Die Kassette 125 umfasst eine dreidimensionale Kammer 160, die im Allgemeinen der Kammer 60 der Kassette 25 ähnlich ist und eine Abdeckung 162, die im Allgemeinen der Abdeckung 62 der Kassette 25 ähnlich ist. Die Kassette unterscheidet sich von der Kassette 25 durch ihre Ionenquelle zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung. In der dargestellten Ausführungsform werden Elemente die allgemein Elementen der Kassetten 10 und 25 ähnlich sind mit ähnlichen Bezugsziffern bezeichnet (z. B. Gel 18). In der Kammer 160 ist der Gelkörper 18 zwischen zwei Räumen 120 und 122 angeordnet, die eine Pufferlösung enthalten, beispielsweise die vorstehend beschriebene TAE-Pufferlösung. Jedes der Volumen 120 und 122 umfasst ein geschlossenes Reservoir, das denselben Puffer enthält, jedoch in einer höheren Konzentration, um die Ionen zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung zu liefern. In der dargestellten bevorzugten Ausführungsform sind die geschlossenen Reservoire Brechampullen 116 und 134, die die Pufferlösungen 124 und 132 enthalten, deren Konzentration höher ist als diejenige der Volumen 120 und 122. In einem Beispiel, das den allgemeinen Erfindungsgedanken nicht einschränkt, ist die Konzentration der Lösungen 124 und 132 fünfzigmal höher als die Konzentration der Pufferlösungen in den Räumen 120 und 122.
Es versteht sich, dass die Ampullen 116 und 134 aus jedem geeigneten dichten Material bestehen können, das wasserundurchlässig ist, beispielsweise Kunststoff oder Glas, so dass die darin enthaltenen konzentrierten Pufferlösungen 124 und 132 keinen Kontakt mit der Pufferlösungen haben, die die Volumen 120 und 122 ausfüllen.
In der dargestellten Ausführungsform werden die Ampullen 116 und 134 von Ampullenhaltern 106 gehalten. Im Betrieb bricht der Benutzer die Ampullen 116 und 134, damit die Ionen in den Puffern hoher Konzentration 124 bzw. 132 freigesetzt werden, um die Ionen zu liefern, die erforderlich sind, um den Elektrophoresetest durchzuführen, vorzugsweise, nachdem der Gleichstrom an die Kassette 125 angelegt ist.
In der dargestellten Ausführungsform wird jede der Ampullen 116 und 134 unter einer flexiblen Abdeckung 110 gehalten. Die flexiblen Abdeckungen 110 bestehen aus einem beliebigen flexiblen Material, das unter Einwirkung mechanischer Kräfte nachgibt, beispielsweise Gummi, um das Brechen der Ampullen 116 und 134 zu ermöglichen, wenn darauf Druck ausgeübt wird, so dass die Ampullen ihren Inhalt in die Pufferräume 120 bzw. 122 freigeben.
Die Pufferlösung 124 enthält optional auch ein geeignetes Material zur DNA-Färbung, vorzugsweise eine Quelle von Ethidiumionen, beispielsweise Ethidiumbromid, um die UV-Visualisierung von getrennten DNA-Proben zu ermöglichen, wie es vorstehend beschrieben wurde. In diesem Fall besteht die Kammer 160 aus einem Material, das für UV-Strahlung durchlässig ist.
Es wird jetzt Bezug auf die 12–15 genommen, die eine Elektrophoresekassette darstellen, die allgemein mit der Bezugsziffer 225 bezeichnet wird und gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert. Die Kassette 225 ist der Kassette 125 ähnlich und sie ist ähnlich wie die Kassetten 10 und 25 und 125 eine geschlossen Einwegkassette, die für einen einzigen Elektrophoresetest verwendet wird und alle chemischen Verbindungen enthält, die zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung und zur Visualisierung ihrer Ergebnisse nach der Trennung von DNA- oder RNA- oder Proteinmolekülen erforderlich sind.
Die Kassette 225 ist hinsichtlich Aufbau und Betrieb der Kassette 125 im Allgemeinen ähnlich und ähnliche Elemente werden mit ähnlichen Bezugsziffern bezeichnet. Die Kassette 225 unterscheidet sich von der Kassette 125 hinsichtlich der Ampullen und des Mechanismus, mittels dessen sie gebrochen werden.
Die Kassette 225 umfasst zwei Ampullen 216 und 234, die allgemein den Ampullen 116 und 134 ähnlich sind und die schmelzen können, wenn ein elektrischer Strom durch sie fließt. Wie am besten in 13 zu sehen ist, ist in die Wand der Ampullen 216 und 234 ein leitender Draht 240 eingebettet. In der dargestellten Ausführungsform handelt es sich bei dem leitenden Draht 240 um einen einzelnen Draht hohen Widerstands mit zwei Enden 226, an die in einem geschlossenen Stromkreis ein elektrischer Strom angelegt werden kann.
Im Betrieb schmelzen die Ampullen 216 und 234 unmittelbar, bevor der Elektrophoresetest beginnt, indem dadurch, dass eine Stromquelle an die Kontakte 226 angeschlossen wird, ein Strom durch den leitenden Draht 240 fließt. Die Bereiche des leitenden Drahts 240, die nicht in den Ampullen 216 und 234 eingebettet sind, sind vorzugsweise mit einem isolierenden Material beschichtet, damit sie isoliert sind.
Es wird jetzt auf 16 Bezug genommen, bei der es sich um eine schematische isometrische Darstellung eines Systems zur Durchführung einer Vielzahl von Elektrophoresetests handelt, das sich dafür eignet, die Ergebnisse der Tests in situ zu visualisieren und zu dokumentieren und das gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgebaut ist und funktioniert. Das System, das allgemein mit der Bezugsziffer 100 bezeichnet wird, umfasst vorzugsweise ein Halte- oder Tragegehäuse 102, um irgendeine der Kassetten 10, 25, 125 oder 225, eine Stromquelle 104 zu Bereitstellung des Gleichstroms, der zum Antreiben der elektrophoretischen Trennung erforderlich ist, ein Kabel 105 zum Anschließen einer der Kassetten 10, 25, 125 oder 225 an die Stromquelle 104 und eine Ultraviolettlichtquelle 106 zum Bestrahlen der Kassette 10, 25, 125 oder 225 aufzunehmen.
Der Halter 102 umfasst vorzugsweise zwei (nicht gezeigte) Kontaktpunkte, an die die Stäbe 24 und 26 der Kassette 10, oder die Streifen 21 und 23 der Kassetten 25, 125 oder 225 angeschlossen werden, damit ihnen das elektrische Feld zugeführt wird, das für die elektrophoretische Trennung erforderlich ist.
Optional umfasst das System 100 auch ein zweites Kabel 107, um den Strom zuzuführen, der erforderlich ist, um den leitenden Draht 240 zu heizen, falls die Kassette 225 verwendet wird. Dementsprechend umfasst der Halter 102 ein zusätzliches Paar von Kontakten, an die die Kontakte 226 der Kassette 225 angeschlossen werden, um ihnen den elektrischen Strom zuzuführen, der zum Heizen des leitenden Drahts 240 erforderlich ist.
Ein weiteres optionales Merkmal des Systems 100 ist ein Mittel zum Kühlen irgendeiner der Kassetten 10, 25, 125 oder 225 während des Elektrophoresetests, beispielsweise ein Strom gekühlten Gases wie flüssiger Stickstoff, was schematisch durch den Ballon 112 und das Rohr 114 dargestellt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das System 100 auch ein Mittel zum Dokumentieren der Ergebnisse der elektrophoretischen Trennung. In der dargestellten Ausführungsform gehören dazu eine Kamera, vorzugsweise eine Videokamera 116, und ein Computer 119 der mit der Kamera 116 verbunden ist und auf dem eine zur Bildanalyse der Ergebnisse der elektrophoretischen Trennung geeignete Anwendung ausgeführt wird.
Ein besonderes Merkmal des Systems 100 besteht darin, dass sowohl der Elektrophoresetest als auch die Visualisierung seiner Ergebnisse und optional deren Dokumentation und Analyse durchgeführt werden, solange sich die Kassette an Ort und Stelle, d. h. im Halter 102 befindet.
Anders als herkömmliche Elektrophorese-Systeme zur Trennung von DNA-Molekülen, bei denen das Gel nach dem Test herausgenommen und in einen UV-empfindlichen Marker getaucht wird, typischerweise Ethidiumbromid, enthalten die Kassetten 10, 25, 125 und 225 wie vorstehend beschrieben vorzugsweise Ethidiumkationen, um die Visualisierung und somit die Dokumentation und Analyse der Ergebnisse des Elektrophoresetests zu ermöglichen.
Bei der in 16 dargestellten Ausführungsform besitzt der Halter 102 eine frei stehende, offene kastenähnliche Konstruktion, die eine Tragefläche 108 umfasst, auf die irgendeine der Kassetten 10, 25, 125 oder 225 aufgelegt wird. Alternativ kann er eine für UV-Licht durchlässige Bodenfläche aufweisen.
Ein weiteres besonderes Merkmal des Systems 100 besteht darin, dass verglichen mit herkömmlichen Systemen weniger Arbeitsschritte durch den Benutzer ausgeführt werden müssen, um einen Elektrophoresetest unter Verwendung irgendeiner der Kassetten 10, 25, 125 oder 225 durchzuführen. Diese Schritte zur elektrophoretischen Trennung von DNA-Molekülen umfassen:

A. Eine Probe, die die zu trennenden DNA-Moleküle enthält, wird in die Vertiefungen eingebracht;
B. Nur im Fall der Kassetten 125 und 225 werden die Ampullen 116 und 134 gebrochen;
C. Der elektrische Strom wird eingeschaltet;
D. Falls die Trennung beschleunigt werden soll, wird auch der Strom gekühlten Gases eingesetzt;
E. Infolge der Schritte A und C; A, B und C; A, C und D; oder A, B, C und D; erfolgen sowohl die elektrophoretische Trennung als auch die Wechselwirkung zwischen einer UV-empfindlichen Verbindung und den getrennten DNA-Molekülen zur gleichen Zeit;
F. Die UV-Lampe 106 wird eingeschaltet, um die Ergebnisse der Trennung zu visualisieren. Die Ergebnisse können auch mittels der Videokamera 116 aufgezeichnet werden;
G. Die Ergebnisse können zur sofortigen quantitativen Analyse der Ergebnisse des Elektrophoresetests online zum Computer 119 übertragen werden; und
H. Der Benutzer entsorgt die Kassette 10.

Es versteht sich, dass die vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen nur als Beispiele beschrieben sind und dass zahlreiche Abwandlungen davon möglich sind, die alle im Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung liegen. Zum Beispiel kann jede der Kassetten gemäß der vorliegenden Erfindung eine Kombination enthalten, bei der die Ionenaustauschermatrix an einer Seite des Gels 18 angeordnet ist und das geschlossene Reservoir an dessen anderem Ende angeordnet ist. Ein weiteres Beispiel, das im Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung liegt, ist eine zweidimensionale Kassette, bei der die Ionenquellen auf allen vier Seiten des Gels 18 angeordnet sind.
Für den Fachmann versteht es sich, dass die vorliegende Erfindung nicht darauf beschränkt ist, was vorstehend ausdrücklich gezeigt und beschrieben wurde. Vielmehr wird der Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung ausschließlich durch die folgenden Ansprüche definiert:

Claims

Vorrichtung um elektrophoretische Trennung durchzuführen, umfassend: ein Gehäuse, das wenigstens eine Bodenwand (12) und Seitenwände (14) aufweist, durch die eine Kammer definiert ist, wobei die Kammer, dazwischen in Kontakt befindlich, umfasst: einen Gelkörper (18) als Träger der darin erfolgenden genannten elektrophoretischen Trennung; wenigstens eine Ionenquelle (20, 22), um die Ionen für das Antreiben der genannten Elektrophorese zu liefern, wobei die genannte wenigstens eine Ionenquelle ein Volumen aufweist, das kleiner als das Volumen des genannten Gelkörpers ist; und Elektroden (24, 26) zum Anschluss der genannten Kammer an eine externe elektrische Spannungsquelle, wodurch die genannte elektrophoretische Trennung angetrieben werden kann.
Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei die genannte wenigstens eine Ionenquelle einen Ionenaustauschermatrixkörper umfasst.
Vorrichtung gemäß Anspruch 2, wobei der genannte Ionenaustauschermatrixkörper umfasst: einen Kationenaustauschermatrixkörper, um die Kationen zum Antreiben der genannten elektrophoretischen Trennung zu liefern; und einen Anionenaustauschermatrixkörper um die Anionen zum Antreiben der genannten elektrophoretischen Trennung zu liefern.
Vorrichtung gemäß Anspruch 3, wobei die genannte Kationenaustauschermatrix an einem Ende des genannten Trenngelkörpers angeordnet ist und der genannte Anionenaustauschermatrixkörper an einem zweiten Ende des genannten Trenngels angeordnet ist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 3, wobei die genannte Kationenaustauschermatrix aus Elektrolyse gewonnene Protonen gegen die Kationen zum Antreiben der genannten elektrophoretischen Trennung austauscht und die genannte Anionenaustauschermatrix aus der genannten Elektrolyse gewonnene Hydroxyl-Ionen gegen die Anionen zum Antreiben der genannten elektrophoretischen Trennung austauscht.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 3, wobei die genannte Kationenaustauschermatrix und die genannte Anionenaustauschermatrix in eine Trägermatrix eingetauchte Partikel umfassen.
Vorrichtung gemäß Anspruch 6, wobei die genannte Trägermatrix das genannte Trenngel umfasst.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 3 weiter umfassend eine Gelkörper niedriger Gelfestigkeit, der zwischen der genannten Seitenwand der genannten Kammer und der genannten Kationenaustauschermatrix angeordnet ist, wobei der genannte Gelkörper niedriger Gelfestigkeit während der genannten elektrophoretischen Trennung schrumpft und dadurch Volumen freigibt, in dem sich Gase, die in der Umgebung einer Anode der genannten Kammer bilden, sammeln.
Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, die auch eine Pufferlösung umfasst, die sich mit dem genannten Trenngelkörper, dem genannten wenigstens einen Ionenaustauschermatrixkörper und den genannten Elektroden in Kontakt befindet.
Vorrichtung gemäß Anspruch 9, wobei der genannte Puffer ein TAE-Puffer ist, die genannte Kationenaustauschermatrix Tris-Kationen freisetzt und die genannte Anionenaustauschermatrix Acetat-Ionen freisetzt.
Vorrichtung gemäß Anspruch 3, wobei die genannte Kationenaustauschermatrix weiter Ethidium-Kationen umfasst.
Vorrichtung gemäß Anspruch 1, wobei die genannte wenigstens eine Ionenquelle ein geschlossenes Reservoir umfasst, in dem eine Pufferlösungen enthalten ist, die eine höhere Konzentration aufweist als eine Pufferlösung des genannten Gelkörpers, der als Träger der genannten elektrophoretischen Trennung darin dient, wobei das geschlossene Reservoir unmittelbar vor der genannten elektrophoretischen Trennung geöffnet wird, um die genannten Ionen zum Antreiben der genannten elektrophoretischen Trennung zu liefern.
Vorrichtung gemäß Anspruch 12, wobei das genannte geschlossene Reservoir eine Brechampulle ist.
Vorrichtung gemäß Anspruch 13, wobei die genannte Brechampulle von einem Raum umgeben ist und der genannte Raum wenigstens teilweise mit der genannten Pufferlösung gefüllt ist in einer Konzentration, die im Allgemeinen ähnlich derjenigen des genannten Gelkörpers ist, der als Träger der genannten elektrophoretischen Trennung darin dient.
Vorrichtung gemäß Anspruch 1 weiter umfassend eine Abdeckung, um die genannte Kammer zu schließen und dadurch eine im Wesentlichen geschlossene Vorrichtung zu schaffen.
Vorrichtung gemäß Anspruch 15, wobei die genannte Kammer oder Abdeckung weiter wenigstens eine Öffnung darin umfasst um wenigstens eine Testprobe in den genannten Gelkörper einzubringen.
Vorrichtung gemäß Anspruch 16, wobei die genannte wenigstens eine Öffnung vor der elektrophoretischen Trennung mittels eines Kamms geschlossen ist.
Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die genannte Kammer für Ultraviolett-Strahlung (UV) durchlässig ist.
Vorrichtung entsprechend Anspruch 15, wobei die genannte Abdeckung für Ultraviolett-Strahlung (UV) durchlässig ist.
Vorrichtung entsprechend Anspruch 15, wobei die genannte Abdeckung wenigstens ein Entlüftungsloch umfasst, das vor der Durchführung des genannten Elektrophoresetests geschlossen ist und unmittelbar vor dem genannten Elektrophoresetest geöffnet wird.
Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die genannte Vorrichtung im Wesentlichen flach ist.
Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die genannte Vorrichtung ein Einwegprodukt ist.
Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei wenigstens eine der genannten Elektroden ein leitendes Material umfasst, das wenigstens einen Teil wenigstens eines der während der genannten elektrophoretischen Trennung entstehenden Gase adsorbieren kann.
Vorrichtung gemäß Anspruch 23, wobei die genannte wenigstens eine adsorptionsfähige Elektrode im Wesentlichen aus einem Material besteht das aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: Aluminium und Palladium.
Vorrichtung gemäß Anspruch 24, wobei zu den genannten Gasen Sauerstoff gehört, der während der genannten elektrophoretischen Trennung in der Umgebung der genannten Anode entsteht und mit dem genannten Aluminium reagiert.
Vorrichtung gemäß Anspruch 24, wobei zu den genannten Gasen Wasserstoff gehört, der während der genannten elektrophoretischen Trennung in der Umgebung der genannten Kathode entsteht und wobei der genannte Wasserstoff von dem genannten Palladium adsorbiert wird.
Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die genannte wenigstens eine Elektrode einen Streifen leitfähigen Materials umfasst.
Vorrichtung gemäß Anspruch 27, wobei der genannte Streifen leitfähigen Materials auf eine abgeschrägt Fläche aufgebracht ist, wobei die genannte abgeschrägte Fläche um einen Winkel gegenüber der genannten Bodenwand geneigt ist, wodurch Gase, die während der genannten elektrophoretischen Trennung in der Umgebung des genannten Streifens entstehen, zu einem leeren Volumen geleitet werden, das die genannten Gase aufnimmt.
Vorrichtung gemäß einem der vorherigen Ansprüche, weiter umfassend ein Mittel, das die Visualisierung der genannten elektrophoretischen Trennung ermöglicht.
Vorrichtung gemäß Anspruch 15, weiter umfassend wenigstens ein leeres Volumen, um die während des genannten Elektrophoresetests entstehenden Gase anzusammeln.
Verfahren zur Herstellung einer im Wesentlichen geschlossenen Kassette, um darin eine elektrophoretische Trennung durchzuführen, umfassend das Verfahren zur Bereitstellung eines Gehäuses, das eine Bodenwand und Seitenwände aufweist, die eine offene Kammer definieren; Einrichtung in der genannten Kammer und miteinander in Kontakt stehend eines Gelkörpers als Träger für die darin erfolgende elektrophoretische Trennung, wenigstens einer Ionenquelle, um die Ionen für das Antreiben der genannten Elektrophorese zu liefern, wobei die genannte wenigstens eine Ionenquelle ein Volumen aufweist, das kleiner als das Volumen des genannten Gelkörpers ist, sowie von Elektroden zum Anschluss der genannten Kammer an eine externe elektrische Spannungsquelle; und Schließen des genannten offenen Gehäuses mit einer Abdeckung, wodurch eine im Wesentlichen geschlossene Kassette entsteht, in der die genannte elektrophoretische Trennung durchgeführt werden kann.