WO2009129972A1 - Vorrichtung, verfahren und gelsystem zur analytischen und präparativen elektrophorese - Google Patents

Vorrichtung, verfahren und gelsystem zur analytischen und präparativen elektrophorese Download PDF

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WO2009129972A1
WO2009129972A1 PCT/EP2009/002852 EP2009002852W WO2009129972A1 WO 2009129972 A1 WO2009129972 A1 WO 2009129972A1 EP 2009002852 W EP2009002852 W EP 2009002852W WO 2009129972 A1 WO2009129972 A1 WO 2009129972A1
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gel
electrophoresis
chamber
separating
molecules
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PCT/EP2009/002852
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Inventor
Erwin Robert Schmidt
Rudolf Baader
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Johannes Gutenberg Universität Mainz
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor
    • G01N27/44773—Multi-stage electrophoresis, e.g. two-dimensional electrophoresis
    • G—PHYSICS
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    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones

Definitions

  • the present invention relates to an electrophoresis device and a gel system for the analytical or preparative separation of biological molecules, such as nucleic acids or proteins. Furthermore, the invention relates to a method for the isolation of biological molecules from an electrophoresis gel and a method for the electrophoretic separation and collection of biological molecules by a two-dimensional gel electrophoresis.
  • Electrophoresis is still considered to be the most efficient method for the separation of biological molecules, in particular of nucleic acids (eg DNA, RNA) or proteins.
  • An important area of application of electrophoresis is the analysis and preparation of DNA fragments or proteins.
  • carrier materials of separating gels in practice mainly different types of agarose gels (for the separation of nucleic acids) or polyacrylamide gels (for the separation of proteins) are used.
  • the electrophoresis method is also used for the preparation of DNA or proteins via gel extraction methods.
  • the molecules are labeled with special marker substances so that their position, optionally with the aid of physical aids (eg UV light), becomes visible in the gel.
  • the aid of physical aids eg UV light
  • the part of the gel with the molecules contained therein is cut out and the desired molecules are isolated from the gel piece.
  • the process is quite complicated and requires a variety of reagents for its implementation. Further, in the gel extraction method, a considerable part of the sample amount is often lost by the method.
  • two-dimensional gel electrophoresis also called 2D gel electrophoresis
  • 2D gel electrophoresis The combination of two orthogonal electrophoresis steps achieves a high-resolution separation of the individual molecules.
  • rotation of the gel is after the first
  • a device for collecting biological molecules via a preparative electrophoresis device is also described in DE 225 44 89 A1.
  • the device described therein has a funnel-shaped zone for the electrophoresis gel, which at its lower end merges into a narrow opening and communicates with an elution chamber.
  • the elution chamber is provided with an outlet for the electrophoretically separated eluate.
  • this device is not suitable. Furthermore, due to the different migration rate of the molecules, it is difficult to obtain precisely separated fractions.
  • electrophoresis gels are poured between two glass plates which are sealed by two laterally arranged spacers or spacers.
  • Such plate gel systems are used in particular in vertical gel electrophoresis.
  • the gel strength is specified here by the height of the spacer elements.
  • Vertical gel electrophoresis allows a much higher separation of the molecular fractions than, for example, horizontal gel electrophoresis, which is frequently used for the separation of DNA fragments, in which the separating gel (then without plates) lies in a horizontal position in the electrophoresis medium on a slide in the gel chamber.
  • the samples in this chamber must be mixed with a weighting agent (eg glycerin) so that no washout of the samples from the Gelases through the electrophoresis medium.
  • a weighting agent eg glycerin
  • a collecting gel is often used for sample concentration in addition to the separating gel.
  • the present electrophoresis device is characterized in that a sample collector designated here as a collector is used, which consists of one or more juxtaposed sample collecting containers and delimits the separating gel from at least one side.
  • the collector is preferably strip-shaped in shape and at the same time serves as a spacer element for the two gel plates of a gel system of a vertical electrophoresis device.
  • two collectors of the same size as conventional spacers are arranged between the glass plates opposite each other laterally.
  • the individual sample collection vessels of the collector serve to fractionate and collect the electrophoretically separated samples from the separation gel by electrophoretically collecting the molecules into the sample collection vessels.
  • the sample collection containers are cylindrical or cuboid.
  • the method of electrophoretic separation and collection of biological molecules by two-dimensional gel electrophoresis comprising the steps of:
  • the procedure is preferably as follows.
  • the individual sample collection containers are first sealed with liquid gel material at the foot end.
  • the spacer element is expediently placed in a dish with liquid gel material so that the liquid is drawn by cohesive forces into the lumen of the individual sample collecting containers.
  • the sample collection containers are closed at the bottom. The thus sealed collector is then inserted between the two glass plates as a spacer element and the gel is poured as usual between the gas plates.
  • the gel system consisting of separating gel and the two glass plates is inserted into the electrophoresis chamber.
  • guide grooves are preferably formed on the wall of the gel chamber, which have a profile which makes it possible for the gel system to be used in a predetermined orientation.
  • a first electrophoresis step the size-dependent separation of the biological molecules takes place.
  • the invention is not limited to any particular type of biological molecules. All gelelektrophoretisch separable molecules are encompassed by the invention, but in particular nucleic acids such as DNA, RNA or proteins.
  • the first electrophoresis step is carried out until the desired separation of the molecules has taken place. The degree of separation can be monitored by means of a conventional marker in the field.
  • the gel system After performing the first electrophoresis step, the gel system is removed from the gel chamber and rotated through an angle of 90 °, so that the collector is now arranged with the sample collection containers on the underside of the separating gel.
  • the molecules separated in the separation gel by the first electrophoresis step according to their size are allowed to run into the individual sample collection vessels of the collector and collected there.
  • the individual molecules are now fractionated according to their molecular size in the individual sample collection containers.
  • the gel can be removed from the gel chamber and the collected samples isolated from the individual sample collection containers (eg pipetted).
  • This process can also be automated.
  • a capillary is provided in a preferred embodiment, in the hollow cylinder of which an ejection member is arranged, which can be pushed out after being immersed in the sample collecting container of the spacer element that the residual gel after the immersion, which could clog the capillary, are removed.
  • a Multipipettier consisting of several capillaries, all sample collection container of the collector can be treated in a single pipetting step and further processed the samples so removed for analysis or preparation.
  • the collector according to the invention is suitable for both horizontal and vertical Elektrophoresevoriquesen. It is only necessary to ensure that migration of the molecules due to the electric field can take place in the separating gel. In a first step, the size-dependent separation of the molecules takes place and in the second step the collection of the thus separated molecules into the sample collection container of the collector takes place. As a result, the process is suitable for both analytical and preparative separation.
  • FIG. 1 to 3 are isometric views of an embodiment of the electrophoresis device according to the invention.
  • FIG. 4 is a side view of a gel system with the two formed as a collector spacers with sample collection container,
  • FIG. 5 is an isometric view of the gel system shown in FIG. 4; FIG.
  • FIG. 6 shows an embodiment of the chamber bottom of the gel chamber
  • Fig. 7 shows an embodiment of the guide channel for the gel system
  • FIG. 8 shows a further embodiment of the electrophoresis chamber according to the invention for the separation of proteins. Ways to carry out the invention and commercial usability:
  • a first embodiment of the electrophoresis chamber according to the invention is shown. Visible is the gel chamber 10 and the gel system used therein, consisting of a separating gel 3, a glass plate as a front plate 24 and a glass plate as back plate 26. As laterally delimiting spacer elements according to the invention designed as a collector individual sample collection container 22 can be seen directly to the separating gel 3 adjacent.
  • the gel chamber 10 is filled with electrophoresis medium 20 for operation and covered with a cover 8 for protection. Power is supplied via the electrical connections 12, 14.
  • the electrical contact elements 16, 18 (conductor wires) for establishing an electric field for the electrophoresis are arranged in the two chamber halves of the gel chamber 10.
  • the positive contact wire in the front half of the chamber in the region of the chamber bottom 6 (contact element 16).
  • the contact element 16 is protected on the side with an insulating tube 21.
  • the contact element 18 is arranged in the region of the chamber ceiling.
  • FIG. 2 shows an isometric view of the electrophoresis device shown in FIG.
  • the gel system consisting of faceplate 24, backplate 26 and separator gel 3 disposed therebetween is removed from the gel chamber and rotated through an angle of 90 °, so that the sample collection container 22 of the spacer disposed on the underside of the separation gel 3 are.
  • a guide groove 15 formed on the wall of the gel chamber 10 is provided. The guide channel 15 separates the gel chamber 10 into two comb halves, in which the electrical contact elements 16, 18 are arranged as described above.
  • FIG. 3 shows a top view of the electrophoresis device according to the invention.
  • the gel system is inserted into the guide channel 15 of the gel chamber 10.
  • Fig. 4 the gel system according to the invention is shown in more detail.
  • This consists of the two glass plates 24, 26 and the interposed separating gel 3.
  • a sample application bag 25 can be seen for the sample application.
  • the two glass plates 24, 26 are held together by connecting means 23.
  • the collector with the sample collection containers 22 also serves as a spacer for the two glass plates 24, 26.
  • the sample collection containers 22 are sealed at their base with gel material 28 to prevent diffusion of molecules from the containers during the second electrophoresis step.
  • two spacer elements are provided with sample collection containers 22, which are arranged opposite each other and limit the separating gel 3 on both sides.
  • Fig. 5 shows a preferred variant of the gel system according to the invention, in which the front plate 24 has a smaller diameter than the back plate 26.
  • Fig. 6 it is shown how the glass plates 24, 26 are used to the chamber bottom 6.
  • the different sized glass plates 24, 26 have been found to be advantageous to produce a directed electric field through the separating gel 3.
  • 6 is in the chamber bottom in the
  • Chamber half with the smaller front plate 24, a retaining plate 27 is provided, which closes the otherwise open separating gel 3 at the bottom laterally.
  • FIG. 7 shows a further preferred embodiment of the electrophoresis device according to the invention.
  • the two glass plates 24, 26 may be inserted into the gel chamber 10 in a predetermined orientation.
  • the guide groove 15 is designed such that the orientation when inserting the gel system is predetermined if the two glass plates 24, 26 are of different sizes.
  • FIG. 8 shows a further embodiment of the electrophoresis device according to the invention. This is a chamber for separation of proteins by SDS-PAGE.
  • the vertical arrangement achieves high resolution of the molecules to be separated.
  • the separation principle is similar to the method described above.
  • the spacer elements according to the invention with the sample collection containers 22 can be used in any conventional gel chamber. It is only necessary to ensure that a directed flow of current through the separating gel 3 takes place. Further embodiments of the electrophoresis device according to the invention will become apparent to the person skilled in the art with reference to the present invention description.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Elektrophoresevorrichtung bestehend aus einer Gelkammer (10) zur Aufnahme von Elektrophoresemedium (20), einem in der Gelkammer (10) angeordneten, herausnehmbaren Gelsystem mit einem Trenngel (3) zur elektrophoretischen Auftrennung von biologischen Molekülen, wie Nukleinsäuren oder Proteinen, elektrischen Kontaktelementen (16, 18) zur Erzeugung eines elektrischen Feldes durch das Trenngel (3) gegebenenfalls einem Deckel (8) zur Anbringung auf die Gelkammer (10), dadurch gekennzeichnet, dass das Trenngel (3) an wenigstens einer Seite von einem als Kollektor ausgebildeten Abstandselement begrenzt wird, das mehrere nebeneinander angeordnete Probenauffangbehälter (22) zum Fraktionieren und zum Einsammeln der elektrophoretisch aufgetrennten Moleküle umfasst. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur elektrophoretischen Auftrennung und Einsammlung biologischer Molekühle durch eine zweidimensionale Gelelektrophorese.

Description

Beschreibung:
Vorrichtung, Verfahren und Gelsystem zur analytischen und präparativen Elektrophorese.
Technisches Gebiet:
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Elektrophoresevorrichtung und ein Gelsystem zur analytischen oder präparativen Auftrennung biologischer Moleküle, wie Nukleinsäuren oder Proteinen. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung biologischer Moleküle aus einem Elektrophoresegel und ein Verfahren zur elektrophoretischen Auftrennung und Einsammlung biologischer Moleküle durch eine zweidimensionale Gelelektrophorese.
Stand der Technik:
Die Elektrophorese gilt nach wie vor als die leistungsfähigste Methode zur Auftrennung biologischer Moleküle, insbesondere von Nukleinsäuren (z. B. DNA, RNA) oder Proteinen. Ein wichtiger Anwendungsbereich der Elektrophorese besteht in der Analyse und Präparation von DNA-Fragmenten oder Proteinen. Als Trägermaterialien von Trenngelen kommen in der Praxis hauptsächlich verschiedene Arten von Agarose-Gelen (zur Auftrennung von Nukleinsäuren) oder Polyacrylamid-Gelen (zur Auftrennung von Proteinen) zum Einsatz.
Neben der analytischen Auftrennung von Molekülen wird das Elektrophoreseverfahren auch zur Präparation von DNA oder Proteinen über Gelextraktionsverfahren eingesetzt. Die Moleküle werden hierbei mit speziellen Markersubstanzen markiert, so dass deren Position, gegebenenfalls unter Zuhilfenahme physikalischer Hilfsmittel (z. B. UV-Licht), im Gel sichtbar wird. Zur Präparation wird der Teil des Gels mit den darin enthaltenen Molekülen ausgeschnitten und die erwünschten Moleküle aus dem Gelstück isoliert. Das Verfahren ist recht aufwendig und benötigt eine Vielzahl von Reagenzien für dessen Durchführung. Ferner geht bei dem Gelextraktionsverfahren häufig ein beachtlicher Teil der Probenmenge durch die Methode verloren.
Bei bestimmten Analysen kommt die zweidimensionale Gelelektrophorese (auch 2D- Gelelektrophorese genannt) zum Einsatz. Durch die Kombination von zwei orthogonal durchgeführten Elektrophoreseschritten wird eine hochauflösende Auftrennung der einzelnen Moleküle erreicht. Bei den meisten heute verwendeten zweidimensionalen Gelelektrophoreseverfahren ist eine Drehung des Gels nach dem ersten
BESTÄT1GUN6SK0PSE Elektrophoreseschritt zur Durchführung des zweiten Elektrophoreseschrittes notwendig. Eine Vorrichtung für eine zweidimensionale Elektrophorese ist beispielsweise in der US-Patentschrift 5,041,203 oder der US-2005/0040042 A1 beschrieben.
Eine Vorrichtung zum Einsammeln biologischer Moleküle über eine präparative Elektrophoresevorrichtung ist ferner in der DE 225 44 89 A1 beschrieben. Die darin beschriebene Vorrichtung besitzt eine trichterförmige Zone für das Elektrophoresegel, welche an ihrem unteren Ende in eine enge Öffnung übergeht und in Verbindung mit einer Eluierungskammer steht. Die Eluierungskammer ist mit einem Ausgang für das elektrophoretisch getrennte Eluat versehen. Für eine zweidimensionale Elektrophorese ist diese Vorrichtung nicht geeignet. Ferner ist es aufgrund der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit der Moleküle schwierig, genau aufgetrennte Fraktionen zu erhalten.
Darstellung der Erfindung:
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Elektrophoresevorrichtung bereit zu stellen, mit der eine analytische oder präparative Auftrennung und Isolierung von biologischen Molekülen ohne Anwendung einer Gelextraktion schnell und effizient möglich ist.
Diese Aufgabe wird gelöst durch eine Elektrophoresevorrichtung gemäß Anspruch 1 und ein Verfahren zur elektrophoretischen Auftrennung und Einsammlung biologischer Moleküle gemäß Anspruch 9.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung finden sich in den Unteransprüchen wieder.
Üblicherweise werden Elektrophoresegele zwischen zwei Glasplatten gegossen, die von zwei seitlich angeordneten Abstandshaltern oder Abstandselementen (Spacer) abgedichtet sind. Solche Plattengelsysteme kommen insbesondere bei der vertikalen Gelelektrophorese zum Einsatz. Die Gelstärke wird hierbei durch die Höhe der Abstandselemente vorgegeben. Die vertikale Gelelektrophorese ermöglicht eine wesentlich höhere Auftrennung der Molekülfraktionen als beispielsweise die für die Auftrennung von DNA-Fragmenten häufig verwendete horizontale Gelelektrophorese, bei der das Trenngel (dann ohne Platten) in horizontaler Lage im Elektrophoresemedium auf einem Schlitten in der Gelkammer liegt. Zum Probenauftrag müssen die Proben bei dieser Kammer mit einem Beschwerungsmittel (z. B. Glycerin) vermischt werden, damit keine Auswaschung der Proben aus den Geltaschen durch das Elektrophoresemedium erfolgt. Bei Proteingelen wird zur Probenkonzentrierung neben dem Trenngel häufig ein Sammelgel verwendet.
Die vorliegende Elektrophoresevorrichtung ist dadurch gekennzeichnet, dass ein hier als Kollektor bezeichneter Probensammler verwendet wird, der aus einem oder mehreren nebeneinander angeordneten Probenauffangbehältern besteht und das Trenngel von wenigstens einer Seite begrenzt. Der Kollektor ist der Form nach vorzugsweise leistenförmig und dient gleichzeitig als Abstandselement für die beiden Gelplatten eines Gelsystems einer vertikalen Elektrophoresevorrichtung. Der Einfachheit halber werden vorzugsweise zwei gleich große Kollektoren wie herkömmliche Abstandshalter zwischen den Glasplatten gegenüberliegend seitlich angeordnet. Die einzelnen Probenauffangbehälter des Kollektors dienen dem Fraktionieren und Einsammeln der elektrophoretisch aufgetrennten Proben aus dem Trenngel, indem die Moleküle elektrophoretisch in die Probenauffangbehälter gesammelt werden. Vorzugsweise sind die Probenauffangbehälter zylinderförmig oder quaderförmig ausgebildet.
Das Verfahren zur elektrophoretischen Auftrennung und Einsammlung biologischer Moleküle durch eine zweidimensionale Gelelektrophorese, umfassend die Schritte:
a) Durchführen eines ersten Elektrophoreseschrittes unter Anlegen eines elektrischen Feldes in einer mit Elektrophoresemedium gefüllten Elektrophoresekammer mit einem Gelsystem, das wenigstens ein Trenngel umfasst, wodurch eine größenabhängige Wanderung der Moleküle durch das Trenngel bewirkt wird, b) Herausnehmen und Drehen des Gelsystems um einen Winkel von
90°, c) Durchführen eines zweiten Elektrophoreseschrittes unter Anlegen eines elektrischen Feldes in der gleichen oder einer anderen mit Elektrophoresemedium gefüllten Elektrophoresekammer zum Einsammeln der während des ersten Elektrophoreseschrittes größenabhängig aufgetrennten biologischen Moleküle, wobei zum Einsammeln ein als Kollektor ausgestaltetes Abstandselement verwendet wird, dass das Trenngel wenigstens an einer Seite begrenzt und ein oder mehrere nebeneinander angeordnete Probenauffangbehälter zum Einsammeln der elektrophoretisch aufgetrennten Moleküle umfasst. Bei dem Verfahren wird vorzugsweise wie folgt vorgegangen. Die einzelnen Probenauffangbehälter werden zunächst mit flüssigem Gelmaterial an deren Fußende versiegelt. Hierzu wird das Abstandselement zweckmäßigerweise in eine Schale mit flüssigem Gelmaterial gegeben, so dass die Flüssigkeit durch Kohäsionskräfte in das Lumen der einzelnen Probenauffangbehälter gezogen wird. Nach dem Aushärten des Gelmaterials sind die Probenauffangbehälter unten verschlossen. Der so versiegelte Kollektor wird dann zwischen den beiden Glasplatten als Abstandselement eingesetzt und das Gel wie üblich zwischen die Gasplatten gegossen.
Nach dem Aushärten des Gels wird das Gelsystem, bestehend aus Trenngel und den beiden Glasplatten, in die Elektrophoresekammer eingesetzt. Vorzugsweise sind hierzu an der Wand der Gelkammer Führungsrinnen ausgebildet, die ein Profil aufweisen, die es ermöglichen, dass das Gelsystem in einer vorgegebenen Orientierung einsetzbar ist.
In einem ersten Elektrophoresesschritt erfolgt die größenabhängige Auftrennung der biologischen Moleküle. Die Erfindung ist nicht auf eine bestimmte Art von biologischen Molekülen begrenzt. Sämtliche gelelektrophoretisch auftrennbare Moleküle sind von der Erfindung umfasst, insbesondere aber Nukleinsäuren, wie DNA, RNA oder Proteine. Der erste Elektrophoreseschritt wird so lange durchgeführt, bis die gewünschte Auftrennung der Moleküle erfolgt ist. Der Auftrennungsgrad kann anhand eines auf dem Gebiet üblichen Markers verfolgt werden.
Nach der Durchführung des ersten Elektrophoreseschrittes wird das Gelsystem aus der Gelkammer entnommen und um einen Winkel von 90° gedreht, so dass der Kollektor mit den Probenauffangbehältern nun an der Unterseite des Trenngels angeordnet ist. Durch Anlegen einer zweiten elektrischen Spannung zur Erzeugung eines zweiten elektrischen Feldes durch das Trenngel, werden die im Trenngel durch den ersten Elektrophoreseschritt entsprechend ihrer Größe aufgetrennten Moleküle in die einzelnen Probenauffangbehältern des Kollektors laufen gelassen und dort gesammelt. Die einzelnen Moleküle sind nun entsprechend ihrer molekularen Größe in den einzelnen Probenauffangbehältern fraktioniert.
Nach dem zweiten Elektrophoreseschritt kann das Gel aus der Gelkammer herausgenommen und die gesammelten Proben aus den einzelnen Probenauffangbehältern isoliert (z.B. pipettiert) werden. Dieser Prozess kann auch automatisiert werden. Für eine automatisierte Entnahme der Proben ist in einer bevorzugten Ausführungsform eine Kapillare vorgesehen, in deren Hohlzylinder ein Auswurfsglied angeordnet ist, das nach dem Eintauchen in den Probenauffangbehälter des Abstandselementes herausdrückbar ist, so dass die nach dem Eintauchen vorhandenen Gelreste, welche die Kapillare verstopfen könnten, entfernt werden. Mit Hilfe einer Multipipettiereinrichtung, bestehend aus mehreren Kapillaren, können sämtliche Probenauffangbehälter des Kollektors in einem einzigen Pipettierschritt behandelt und die so entnommenen Proben für die Analyse bzw. Präparation weiterverarbeitet werden. Auch das Zugeben von chemischen Substanzen oder die Durchführung von enzymatischen Reaktionen ist in den Probenauffangbehältem selbst durchführbar. Eine aufwendige Extraktion der Moleküle aus dem Gel mit den damit verbundenen Nachteilen ist nicht mehr erforderlich. Durch die erfindungsgemäße zweidimensionale Gelelektrophorese wird eine feinauflösende Auftrennung ein einfaches Einsammeln der Molekülfraktionen erreicht.
Der erfindungsgemäße Kollektor ist sowohl für horizontale als auch für vertikale Elektrophoresevorrichtungen geeignet. Es ist lediglich darauf zu achten, dass eine Migration der Moleküle aufgrund des elektrischen Feldes in dem Trenngel stattfinden kann. In einem ersten Schritt erfolgt die größenabhängige Auftrennung der Moleküle und in dem zweiten Schritt das Einsammeln der so aufgetrennten Moleküle in den Probenauffangbehältem des Kollektors. Dadurch eignet sich das Verfahren sowohl für eine analytische als auch eine präparative Auftrennung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen
Fig. 1 bis Fig. 3 isometrische Darstellungen einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung,
Fig. 4 eine Seitenansicht eines Gelssystems mit den beiden als Kollektor ausgebildeten Abstandselementen mit Probenauffangbehältem,
Fig. 5 das in Fig. 4 gezeigte Gelsystem in isometrischer Darstellung,
Fig. 6 eine Ausführungsart des Kammerbodens der Gelkammer,
Fig. 7 eine Ausführungsart der Führungsrinne für das Gelsystem und
Fig. 8 eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrophoresekammer zur Auftrennung von Proteinen. Wege zur Ausführung der Erfindung und gewerbliche Verwertbarkeit:
In Fig. 1 ist eine erste Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrophoresekammer gezeigt. Erkennbar ist die Gelkammer 10 und das darin eingesetzte Gelsystem, bestehend aus einem Trenngel 3, einer Glasplatte als Frontplatte 24 und einer Glasplatte als Rückplatte 26. Als seitlich begrenzende Abstandselemente sind die erfindungsgemäß als Kollektor ausgestalteten einzelnen Probenauffangbehälter 22 zu sehen, die direkt an das Trenngel 3 angrenzen. Die Gelkammer 10 wird zum Betrieb mit Elektrophoresemedium 20 gefüllt und zum Schutz mit einem Deckel 8 abgedeckt. Die Stromversorgung erfolgt über die elektrischen Anschlüsse 12, 14. Die elektrischen Kontaktelemente 16, 18 (Leiterdrähte) zum Aufbau eines elektrischen Feldes für die Elektrophorese sind in den beiden Kammerhälften der Gelkammer 10 angeordnet. Bei der vertikalen Elektrophorese befindet sich der positive Kontaktdraht in der vorderen Kammerhälfte im Bereich des Kammerbodens 6 (Kontaktelement 16). Um eine Seitenwanderung der Moleküle bei der Elektrophorese zu vermeiden, ist das Kontaktelement 16 an der Seite mit einem Isolierschlauch 21 geschützt. In der nach hinten angeordneten Kammerhälfte ist das Kontaktelement 18 im Bereich der Kammerdecke angeordnet. Durch die Z-förmige Anordnung der Kontaktelemente 16 ,18 wird ein gerichtetes elektrisches Feld durch das Trenngel 3 erzeugt, wodurch eine Migration der Moleküle von oben nach unten im Trenngel 3 und damit eine größenabhängige Auftrennung bewirkt wird.
In Fig. 2 ist eine isometrische Darstellung der in Fig. 1 gezeigten Elektrophoresevorrichtung gezeigt. Nach dem Durchführen des ersten Elektrophoreseschrittes wird das Gelsystem, bestehend aus Frontplatte 24, Rückplatte 26 und dem dazwischenliegend angeordneten Trenngel 3 aus der Gelkammer entnommen und um einen Winkel von 90° gedreht, so dass die Probenauffangbehälter 22 des Abstandselementes an der Unterseite des Trenngels 3 angeordnet sind. Zum Einsetzen des Gelsystems ist eine an der Wand der Gelkammer 10 ausgebildete Führungsrinne 15 vorgesehen. Die Führungsrinne 15 trennt die Gelkammer 10 in zwei Kammhälften, in denen die elektrischen Kontaktelemente 16, 18 wie oben beschrieben angeordnet sind.
In Fig. 3 erkennt man eine Draufsicht der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung. Das Gelsystem ist in die Führungsrinne 15 der Gelkammer 10 eingesetzt.
In Fig. 4 ist das erfindungsgemäße Gelsystem genauer gezeigt. Dieses besteht aus den beiden Glasplatten 24, 26 und dem dazwischen angeordneten Trenngel 3. In dem Trenngel 3 ist eine Probenauftragetasche 25 für den Probenauftrag zu erkennen. Die beiden Glasplatten 24, 26 werden über Verbindungsmittel 23 zusammengehalten. Der Kollektor mit den Probenauffangbehältern 22 dient zugleich als Abstandshalter für die beiden Glasplatten 24, 26. Die Probenauffangbehälter 22 sind an deren Fußende mit Gelmaterial 28 abgedichtet, um eine Diffusion von Molekülen aus den Behältern während des zweiten Elektrophoreseschrittes zu vermeiden. Vorzugsweise sind zwei Abstandselemente mit Probenauffangbehältern 22 vorgesehen, die gegenüberliegend angeordnet sind und das Trenngel 3 beidseitig begrenzen.
In Fig. 5 erkennt man eine bevorzugte Variante des erfindungsgemäßen Gelsystems, bei der die Frontplatte 24 einen geringeren Durchmesser aufweist als die Rückplatte 26. In Fig. 6 ist gezeigt, wie die Glasplatten 24, 26 bis zum Kammerboden 6 eingesetzt werden. Die unterschiedlich großen Glasplatten 24, 26 haben sich als vorteilhaft herausgestellt, um ein gerichtetes elektrisches Feld durch das Trenngel 3 zu erzeugen. Um eine Seitendiffusion von Molekülen aus dem Trenngel 3 zu vermeiden, ist am Kammerboden 6 in der
Kammerhälfte mit der kleineren Frontplatte 24 ein Rückhalteplättchen 27 vorgesehen, welche das ansonsten offene Trenngel 3 an der Unterseite seitlich abschließt.
In Fig. 7 ist eine weitere bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung gezeigt. Je nach Gelsystem kann es erforderlich sein, dass die beiden Glasplatten 24, 26 in eine vorgegebene Orientierung in die Gelkammer 10 eingesetzt werden. Die Führungsrinne 15 ist so ausgestaltet, dass die Orientierung beim Einsetzen des Gelsystems vorgegeben wird, wenn die beiden Glasplatten 24, 26 unterschiedlich groß sind.
In Fig. 8 ist eine weitere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elekrophoresevorrichtung gezeigt. Es handelt sich hierbei um eine Kammer zur Auftrennung von Proteinen durch SDS- PAGE. Durch die vertikale Anordnung wird eine hohe Auflösung der aufzutrennenden Moleküle erreicht. Das Auftrennungsprinzip gleicht dem zuvor beschriebenen Verfahren.
Die erfindungsgemäßen Abstandselemente mit den Probenauffangbehältern 22 können in jede herkömmliche Gelkammer eingesetzt werden. Dabei ist lediglich darauf zu achten, dass ein gerichteter Stromfluss durch das Trenngel 3 erfolgt. Weitere Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung werden dem Fachmann anhand der vorliegenden Erfindungsbeschreibung ersichtlich werden.

Claims

Patentansprüche:
1. Elektrophoresevorrichtung, bestehend aus einer Gelkammer (10) zu Aufnahme von Elektrophoresemedium (20), - einem in der Gelkammer (10) angeordneten, herausnehmbaren Gelsystem mit einem Trenngel (3) zur elektrophoretischen Auftrennung von biologischen Molekülen, wie Nukleinsäuren oder Proteinen, elektrischen Kontaktelementen (16, 18) zur Erzeugung eines elektrischen Feldes durch das Trenngel (3), dadurch gekennzeichnet, dass das Trenngel (3) an wenigstens einer Seite von einem als Kollektor ausgebildeten Abstandselement begrenzt wird, das mehrere nebeneinander angeordnete Probenauffangbehälter (22) zum Fraktionieren und zum Einsammeln der elektrophoretisch aufgetrennten Moleküle umfasst.
2. Elektrophoresevorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die
Probenauffangbehälter (22) zylinderförmig oder quaderförmig ausgebildet sind und im Fußbereich mit Gelmaterial (28) abgedichtet sind.
3. Elekrophoresevorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gelsystem aus zwei Glasplatten (24, 26) mit einem dazwischen angeordneten Trenngel (3) besteht, das seitlich von zwei Abstandselementen mit Probenauffangbehältern (22) begrenzt wird.
4. Elektrophoresevorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trenngel (3) zwischen einer kleineren Frontplatte (24) und einer größeren Rückplatte (26) angeordnet ist, wobei das Gelsystem (3, 24, 26) über eine in der Gelkammerwand ausgebildeten, profilierten Führungsrinne (15) in die Gelkammer (10) in einer vorgegebenen Orientierung einsetzbar ist.
5. Elektrophoresevorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das das Gelsystem (3, 24, 26) in die Gelkammer (10) vertikal eingesetzt wird und die Gelkammer (10) in zwei Kammerhälften unterteilt, wobei ein elektrisches Kontaktelement (18) im Kopfbereich der einen Kammerhälfte der Gelkammer (10) angeordnet ist, während das zweite elektrische Kontaktelement (16) im Fußbereich der anderen Kammerhälfte der Gelkammer (10) angeordnet ist.
6. Elektrophoresevorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass am Kammerboden (6) in der Kammerhälfte mit der kleineren Frontplatte (14) ein Rückhalteplättchen (27) angeordnet ist, welches das Trenngel (3) an der Unterseite seitlich abschließt.
7. Elekrophoresevorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gelsystem in der Gelkammer (10) entweder horizontal oder vertikal angeordnet ist.
8. Elektrophoresevorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung einen Deckel (8) zur Anbringung auf die Gelkammer (10) aufweist.
9. Verfahren zur elektrophoretischen Auftrennung und Einsammlung biologischer Moleküle durch eine zweidimensionale Gelelektrophorese, umfassend die Schritte:
a) Durchführen eines ersten Elektrophoreseschrittes unter Anlegen eines elektrischen Feldes in einer mit Elektrophoresemedium gefüllten Elektrophoresekammer mit einem Gelsystem, das wenigstens ein Trenngel umfasst, wodurch eine größenabhängige
Wanderung der Moleküle durch das Trenngel bewirkt wird, b) Herausnehmen und Drehen des Gelsystems um einen Winkel von 90°, c) Durchführen eines zweiten Elektrophoreseschrittes unter Anlegen eines elektrischen Feldes in der gleichen oder einer anderen mit
Elektrophoresemedium gefüllten Elektrophoresekammer zum Einsammeln der während des ersten Elektrophoreseschrittes größenabhängig aufgetrennten biologischen Moleküle, wobei zum Einsammeln ein als Kollektor ausgestaltetes Abstandselement verwendet wird, dass das Trenngel wenigstens an einer Seite begrenzt und ein oder mehrere nebeneinander angeordnete Probenauffangbehälter zum Einsammeln der elektrophoretisch aufgetrennten Moleküle umfasst.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren mit einer
Elektrophoresevorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 durchgeführt wird.
11. Verwendung einer Elektrophoresevorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Durchführung einer präparativen oder analytischen Gelelektrophorese.
12. Gelsystem zur Durchführung einer präparativen oder analytischen Gelelektrophorese, bestehend aus
- einer Frontplatte (24), einer Rückplatte (26), einem zwischen Frontplatte (24) und Rückplatte (26) angeordneten Trenngel (3), das an zwei gegenüberliegenden Seiten von Abstandselementen begrenzt wird, dadurch gekennzeichnet, dass das Trenngel (3) an wenigstens einer Seite von einem als Kollektor ausgestalteten Abstandselement begrenzt wird, das mehrere nebeneinander angeordnete Probenauffangbehälter (22) zur Fraktionierung und zum Einsammeln der elektrophoretisch aufgetrennten Moleküle umfasst.
13. Gelsystem nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenauffangbehälter (22) in ihrem Fußbereich mit Gelmaterial (28) abgedichtet sind.
14. Verfahren zur Isolierung biologischer Moleküle, wie Nukleinsäuren oder Proteine, unter Verwendung eines Gelsystems nach einem der Ansprüche 12 oder 13.
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