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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Gießen eines
Elektrophoresegels und eine Elektrophoresekassette zur Verwendung
in dem Verfahren.
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Die
Trennung verschiedener biologischer Materialien wie Proteine, RNA
und DNA erfolgt im allgemeinen durch Elektrophorese. Diese Technik
basiert auf der Messung der Molekülmobilität in einem elektrischen Feld.
Die Wanderungsgeschwindigkeit eines Moleküls in einem elektrischen Feld
hängt von der
elektrischen Feldstärke,
der elektrischen Nettoladung auf das Molekül und dem Reibungswiderstand ab.
Wird dem Gel ein Detergenz wie Natriumdodecylsulfat (SDS) zugegeben,
basiert die Trennung lediglich auf Größenunterschieden.
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Eine
elektrophoretische Trennung findet in einem Gel statt, z.B. einem
Agarosegel oder einem Polyacrylamidgel. Insbesondere die letztgenannten Gele
sind sehr dünn
und werden durch Polymerisation einer noch flüssigen Polyacrylamidlösung zwischen
zwei Glasplatten hergestellt. Die Dicke des Gels wird durch die
sogenannten Abstandshalter, die zwischen den Glasplatten angeordnet
sind, bestimmt.
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Da
eine zunächst
flüssige
Gellösung
den Ausgangspunkt darstellt, muss der Raum zwischen den Glasplatten
eine dichte Kammer sein, da ansonsten die Gellösung sofort wieder aus dem
Raum zwischen den Glasplatten herausfließen würde. Zu diesen Zweck besteht
eine Gelkassette aus zwei Glasplatten, zwei seitlichen Abstandshaltern
und einem Pfropfen, der die Unterseite des Zwischenraumes verschließt. Die
Abstandhalter an den Seitenbereichen des Gels haben eine Doppelfunktion,
zum einen definieren sie die Gießkammer und zum anderen zur
elektrischen Isolierung des Gels zwischen den Glasplatten im Hinblick
auf den Puffer außerhalb
der Glasplatten.
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Die
Unterseite der Glasplatten wird vor dem Gießen des Gels verschlossen.
Dabei kann z.B. ein Agarose-Pfropfen oder ein Polyacrylamid-Pfropfen eingesetzt
werden. Der Vorteil dabei ist, dass die aus den Glasplatten und
den Seitenabstandshaltern bestehende Gelkassette direkt in der Elektrophoreseapparatur
montiert und dort auch verbleiben kann. Ein großer Nachteil dabei ist jedoch,
dass das Gießen
eines Gels auf diese Weise viel Zeit in Anspruch nimmt. Zudem hat
der Agarose-Pfropfen den Nachteil, dass die Elektrophorese dadurch
verlangsamt werden kann.
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Es
ist ferner ebenfalls möglich,
ein Dichtungsprofil auf der Unterseite der Gelkassette anzuordnen,
wobei das Auslaufen der flüssigen
Gellösung aus
dem Raum zwischen den Glasplatten mit Hilfe von Klammern verhindert
wird. Dabei ist häufig
der Einsatz eines Abdichtbandes ebenfalls notwendig. Doch selbst
dadurch wird nicht immer eine dichte Gelkassette erhalten. Diese
Vorgehensweise weist zudem den Nachteil auf, dass Befestigung und
Entfernung des Bandes zusätzliche
Arbeitsschritte erfordern. Ferner kann die Gelkassette nur nach
der Polymerisation des Gels in die Elektrophoreseapparatur eingesetzt
werden, da das Dichtungsprofil, die Klammern und das optionale Dichtband
vor der Elektrophorese aber nur nach der Polymerisation des Gels entfernt
werden können.
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In
der
US-A-5 232 573 wird
eine Gelkassette offenbart, die zwei Glasplatten und einen H-förmigen Abstandshalter umfasst,
der aus zwei seitlichen Streifen und einem dazwischen angeordneten
querlaufenden Streifen gebildet wird. Die seitlichen Streifen des
Abstandshalters weisen im wesentlichen die Länge der Glasplatten auf, und
deren obere Enden erstrecken sich über die Platten hinaus. Der
Querstreifen ist an diesem oberen Ende angebracht. Eine solche Kassette
kann zum Gießen
eines Elektrophoresegels eingesetzt werden. Wenn eine solche Kassette
zum Gießen
eines Gels eingesetzt wird, muss der Querstreifen in zerstörender Weise
entfernt werden, damit die Probe eingesetzt werden kann und der elektrische
Kontakt des Elektrophoresepuffers mit dem Gel vereinfacht wird.
Der Abstandshalter ist somit nur für den einmaligen Gebrauch geeignet.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es unter anderem ein Verfahren zum
Gießen
eines Elektrophoresegels und eine Elektrophoresekassette für den Einsatz
bei dem Verfahren zur Verfügung
zu stellen, durch welche die zuvor genannten Nachteile vermieden
werden.
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Die
Aufgabe wird durch das in Anspruch 1 beanspruchte Verfahren zum
Gießen
eines Elektrophoresegels gelöst.
Bei Verwendung eines im wesentlichen H- oder U-förmigen Abstandshalters werden
beide Seiten und die Unterseite des Raumes zwischen den Glasplatten
während
des Gießens durch
den Abstandshalter abgedichtet. Die beiden vertikalen Seitenteile
des Abstandshalters ragen vorzugsweise über die Glasplatte hinaus.
Nach der Polymerisation der Gellösung
zwischen den Glasplatten werden die vertikalen Teile des Abstandshalters
nach unten gedrückt,
wodurch der Abstandshalter absinkt und die Unterseite des Gels freigegeben
wird. Dabei entsteht der erforderliche elektrische Kontakt zwischen
der Unterseite des Gels und dem umgebenden Puffer. Die Seite des
Gels bleibt durch den Abstandshalter weiterhin vom Puffer getrennt.
Unterhalb des Gels bleibt ein kleiner Raum zwischen den Glasplatten,
in dem kein Gel vorhanden ist.
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In
einer anderen Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung eine wie in Anspruch 8 beschriebene
Gelkassette. Eine solche Gelkassette ist für den Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren
geeignet.
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Die
Verwendung der erfindungsgemäßen Gelkassette
ermöglicht
die schnelle Herstellung eines dichten Raumes zwischen Glasplatten,
in welchen das Gel gegossen werden kann.
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Da
ein Gel nach der Polymerisation geringfügig schrumpft, ist es nicht
länger
mit den Seitenteilen des Abstandshalters verbunden. Es können daher keine
Proben auf die Kante des Gels aufgebracht werden, da es aufgrund
des Raumes zwischen dem Gel und dem Abstandshalter zu Schwankungen
beim Gradienten und dem elektrischen Feld und damit im Bandenmuster
kommen kann. Um dies zu verhindern, sind die während des Einsatzes im wesentlichen
vertikalen Teile des Abstandshalters an ihrem Ende, welches vom
Teil des Gels, das beim Einsatz im wesentlichen horizonal ist, entfernt
liegt, breiter.
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Das
heißt
in der Praxis, dass bei einem Abstandshalter, der nach unten gedrückt wird,
die oberen Seiten der vertikalen Teile des Abstandshalters breiter
sind, während
bei einem Abstandshalter, der nach oben gezogen wird, z.B. ein Abstandshalter
mit Kamm, im Gegensatz dazu die unteren Enden der vertikalen Teile
breiter sind. Die nach außen
weisende Kante der vertikalen Teile verläuft vorzugsweise gerade, wohingegen
die nach innen weisende Kante sich zum äußeren Ende hin konvex, konkav
oder linear verjüngen
kann.
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Während des
Gießens
des Gels können
am Boden schwer zu entfernende und gegebenenfalls Fehlfunktionen
des Gels verursachende Luftblasen entstehen. Um dies zu verhindern,
ist der Abstandshalter an der Verbindungsstelle des horizontalen Teils
auf dem vertikalen Teil vorzugsweise mit einer Schulter versehen.
Durch Neigen der Gelkassette steigt die Luftblase entlang des horizontalen
Teils des Abstandshalters in Richtung des vertikalen Teils der Schulter
auf. Dort angekommen, bewegt sie sich entlang des vertikalen Schulterteiles
und schließlich
entlang des horizontalen Schulterteiles und kommt letztendlich am
vertikalen Abstandsteil zum Stillstand. Wird die Gelkassette wieder
aufrecht gestellt, kann die Luftblase nicht mehr auf den Boden des
Gels zurückfallen,
da dies eine Abwärtsbewegung
darstellen würde,
die von einer Luftblase niemals ausgeführt wird. Die Luftblase kann
möglicherweise
entlang des vertikalen Abstandshalterteiles aufsteigen, oder in der
Ecke zwischen dem vertikalen Abstandshalterteil und dem horizontalen
Schulterteil verweilen. In dieser Position hat die Luftblase keinerlei
Auswirkung auf die Elektrophorese.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung weist der horizontale Teil des Abstandshalters
die Form eines Kammes auf. Bei Verwendung eines solchen Abstandshalters wird
das Gel auf dem Kopf stehend gegossen. Wenn der Abstandshalter nach
der Polymerisation des Gels leicht in Richtung der normalerweise
oberen Seite des Gels geschoben wird, hinterlassen die Zähne des
Kamms sogenannte Kerben im Gel, in welche die Probe zur Elektrophorese
angeordnet werden kann. Da das Gel umgekehrt gegossen wird, kann
ein solcher Abstandshalter mit integriertem Kamm nicht bei Gradientengelen,
bei denen die schwerste Lösung am
Boden des Gels platziert sein muss, verwendet werden. Beim Gießen ist
dies der obere Teil des Gels.
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Der
Vorteil einer Gelkassette, bei der der Abstandshalter einen integrierten
Kamm umfasst, liegt darin, dass durch die Tatsache, dass das Gel
umgedreht auf dessen Unterseite gegossen wird, keine Lücke zwischen
den Glasplatten, wo kein Gel anwesend ist, verbleibt.
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Im
Prinzip kann jedes geeignete Material zur Herstellung des Abstandshalters
eingesetzt werden. Es muss jedoch vorzugsweise eine Reihe von Bedingungen
erfüllen.
Es muss den Raum zwischen den Glasplatten während des Gießens des
Gels flüssigkeitsdicht
verschließen
können.
Es muss des Weiteren das Gel ordnungsgemäß vom umgebenden Puffer elektrisch
isolieren. Zudem muss das Material ausreichend glatt sein, um im
Hinblick auf die Bewegung des Abstandshalters nach der Polymerisation des
Gels leichtgängig
zwischen den Glasplatten zu gleiten. Das Material muss ferner so
fest sein, dass sich die Unterseite während des Verschiebens des Abstandshalters
zwischen den Glasplatten nicht zu wölben beginnt, wobei die Mitte
des Abstandshalters auf der Unterseite zwischen den Glasplatten
verbleiben kann. Teflon ist besonders bevorzugt. Der Kamm wird vorzugsweise
aus Teflon von der Rolle hergestellt. Der Vorteil liegt darin, dass
das Material ein wenig gekrümmt
ist, wodurch der Kamm leichter zwischen den Glasplatten eingesetzt
werden kann. Es ist ebenso möglich,
verschiedene Materialien zu kombinieren. Die Erfindung betrifft
auch den Abstandshalter als einzelne Komponente.
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Der
horizontale Teil des Abstandshalters kann mit auf das Gel gerichteten
Zähnen
versehen sein. Dies verhindert die Bildung eines Vakuums unter dem
Gel, wenn der Abstandshalter nach unten gedrückt wird. Das Gel könnte durch
das Einstehen eines Vakuum beschädigt
werden.
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Die
vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Zeichnungen,
bei welchen gleiche Komponenten mit gleichen Bezugszeichen versehen sind,
näher erläutert:
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1 zeigt
eine teilweise aufgebrochene perspektivische Darstellung einer erfindungsgemäßen Gelkassette;
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2 zeigt
eine teilweise aufgebrochene perspektivische Darstellung einer Elektrophoreseapparatur
mit darin befindlicher Gelkassette;
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3 zeigt
eine Schnittzeichnung entlang Linie IV-IV aus 2;
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4 zeigt
eine teilweise aufgebrochene perspektivische Darstellung einer zweiten
Ausführungsform
einer erfindungsgemäßen auf
dem Kopf gestellten Gelkassette;
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5 zeigt
eine teilweise aufgebrochene perspektivische Darstellung der in
einer Elektrophoreseapparatur befindlichen Gelkassette aus 4.
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1 zeigt
zwei Glasplatten 1 und 2, wobei der obere Teil
der Glasplatte 2 teilweise abgesenkt ist, um das Platzieren
der Proben auf dem Gel zu erleichtern. Ein Abstandshalter 3 ist
zwischen den Glasplatten angeordnet. Der Abstandshalter besteht aus
vertikalen Seitenteilen 4 und einem horizontalen Teil 5.
Die Glasplatte 2 ist am Boden etwas länger als Glasplatte 1.
Der Abstandshalter ist derart zwischen den Glasplatten angeordnet,
dass er zwei vorstehende Bereiche 6 an seiner Oberseite
aufweist. In dem Zwischenraum, der durch die beiden Glasplatten
und dem Abstandhalter definiert wird, ist das Gel 7 angeordnet.
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Die
Platzierung der Gelkassette in der Elektrophoreseapparatur wird
in 2 gezeigt. Die obere Kammer 9 steht mit
dem Gel über
den abgesenkten Bereich des oberen Teils der Glasplatte 2 in
Kontakt. Der untere Teil des Gels steht mit dem Puffer in der unteren
Pufferkammer 10 in Kontakt. In der in 2 dargestellten
Anordnung ist der Abstandshalter noch nicht nach unten gedrückt worden.
Daher besteht noch kein Konakt zwischen dem Gel und dem Puffer in
der unteren Kammer 10.
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3 zeigt
ein Schnittbild, bei dem der Abstandshalter nach unten gedrückt wurde,
wodurch der Puffer aus Pufferkammer 10 in Kontakt mit dem unteren
Teil des Gels 7 steht. Der Stromkreis wird geschlossen,
wenn über
die Kontaktpunkte 11 und 12 eine Spannung zwischen
die beiden Pufferkammern 9 und 10 gelegt wird.
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4 und 5 zeigen
eine alternative Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Abstandshalters. 4 zeigt
eine Gelkassette, bestehend aus Glasplatten 1 und 2,
zwischen welchen ein U-förmiger
Abstandshalter 19 angebracht ist. Der Abstandshalter 19 besteht
aus den vertikalen Teilen 20 und einem horizontalen kammförmigen,
mit Zähnen 23 versehenen
Teil 22. Nach dem Gießen
und der Polymerisation des Gels kann der Kamm aus dem Gel durch Drücken der
vorstehenden Bereiche 21 entfernt werden. Diese Ausführungsform
des Abstandshalters kann gegebenenfalls H-förmig ausgestaltet sein. In diesem
Fall sind die vorstehenden Bereiche 21 auf der anderen
Seite des Abstandshalters angeordnet. Der Vorteil besteht darin,
dass, wenn die Gelkassette in ihre Einsatzposition gewendet wird,
der Kamm 22 aus dem Gel herausgezogen werden kann, während die
Kassette in der mit Puffer befüllten
Elektrophoreseapparatur angeordnet ist. Die freigegebenen Kerben
füllen
sich umgehend mit dem Puffer, wodurch eine Gasakkumulation in den
Kerben verhindert wird. Dadurch ist ein Ausspritzen der Kerben zur
Entfernung von Luftblasen nicht länger notwendig. Diese Ausführungsform
ist hier nicht gezeigt.
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5 zeigt
diese Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung in ihrer Einsatzposition. Die Gelkassette
ist hier in einem Pufferbehälter 8 positioniert,
und man sieht deutlich, wie die Zähne 23 des Abstandshalterkamms
Kerben 24 hinterlassen, in die Proben angeordnet werden.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
und die erfindungsgemäße Gelkassette
weisen eine Reihe von Vorteilen auf. Vor allem wird es möglich, auf
einfache Weise eine dichte Gelkassette aufzubauen. Die Ausführungsform
mit integriertem Kamm weist den zusätzlichen Vorteil auf, dass
kein separater Kamm mehr notwenig ist. Der gesamte Gießvorgang kann
nun mit einer einzigen Kompontente ausgeführt werden.