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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Elektrophoresevorrichtung und ein
Gelsystem zur analytischen oder präparativen Auftrennung biologischer Moleküle, wie
Nukleinsäuren
oder Proteinen. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur
Isolierung biologischer Moleküle
aus einem Elektrophoresegel und ein Verfahren zur elektrophoretischen
Auftrennung und Einsammlung biologischer Moleküle durch eine zweidimensionale
Gelelektrophorese.
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Die
Elektrophorese gilt nach wie vor als die leistungsfähigste Methode
zur Auftrennung biologischer Moleküle, insbesondere von Nukleinsäuren (z. B.
DNA, RNA) oder Proteinen. Ein wichtiger Anwendungsbereich der Elektrophorese
besteht in der Analyse und Präparation
von DNA-Fragmenten oder Proteinen. Als Trägermaterialien von Trenngelen
kommen in der Praxis hauptsächlich
verschiedene Arten von Agarose-Gelen (zur Auftrennung von Nukleinsäuren) oder
Polyacrylamid-Gelen (zur Auftrennung von Proteinen) zum Einsatz.
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Neben
der analytischen Auftrennung von Molekülen wird das Elektrophoreseverfahren
auch zur Präparation
von DNA oder Proteinen über
Gelextraktionsverfahren eingesetzt. Die Moleküle werden hierbei mit speziellen
Markersubstanzen markiert, so dass deren Position, gegebenenfalls
unter Zuhilfenahme physikalischer Hilfsmittel (z. B. UV-Licht),
im Gel sichtbar wird. Zur Präparation
wird der Teil des Gels mit den darin enthaltenen Molekülen ausgeschnitten
und die erwünschten
Moleküle
aus dem Gelstück
isoliert. Das Verfahren ist recht aufwendig und benötigt eine
Vielzahl von Reagenzien für
dessen Durchführung.
Ferner geht bei dem Gelextraktionsverfahren häufig ein beachtlicher Teil
der Probenmenge durch die Methode verloren.
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Bei
bestimmten Analysen kommt die zweidimensionale Gelelektrophorese
(auch 2D-Gelelektrophorese
genannt) zum Einsatz. Durch die Kombination von zwei orthogonal
durchgeführten
Elektrophoreseschritten wird eine hochauflösende Auftrennung der einzelnen
Moleküle
erreicht. Bei den meisten heute verwendeten zweidimensionalen Gelelektrophoreseverfahren
ist eine Drehung des Gels nach dem ersten Elektrophoreseschritt
zur Durchführung des
zweiten Elektrophoreseschrittes notwendig. Eine Vorrichtung für eine zweidimensionale
Elektrophorese ist beispielsweise in der
US-5,041,203 A oder der
US-2005/0040042 A1 beschrieben.
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Eine
Vorrichtung zum Einsammeln biologischer Moleküle über eine präparative Elektrophoresevorrichtung
ist ferner in der
DE
225 44 89 A beschrieben. Die darin beschriebene Vorrichtung
besitzt eine trichterförmige
Zone für
das Elektrophoresegel, welche an ihrem unteren Ende in eine enge Öffnung übergeht
und in Verbindung mit einer Eluierungskammer steht. Die Eluierungskammer
ist mit einem Ausgang für
das elektrophoretisch getrennte Eluat versehen. Für eine zweidimensionale
Elektrophorese ist diese Vorrichtung nicht geeignet. Ferner ist
es aufgrund der unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeit der
Moleküle
schwierig, genau aufgetrennte Fraktionen zu erhalten.
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Es
ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Elektrophoresevorrichtung
bereit zu stellen, mit der eine analytische oder präparative
Auftrennung und Isolierung von biologischen Molekülen ohne
Anwendung einer Gelextraktion schnell und effizient möglich ist.
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Diese
Aufgabe wird gelöst
durch eine Elektrophoresevorrichtung gemäß Anspruch 1 und ein Verfahren
zur elektrophoretischen Auftrennung und Einsammlung biologischer
Moleküle
gemäß Anspruch
9.
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Bevorzugte
Ausführungsfarmen
der Erfindung finden sich in den Unteransprüchen wieder.
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Üblicherweise
werden Elektrophoresegele zwischen zwei Glasplatten gegossen, die
von zwei seitlich angeordneten Abstandshaltern oder Abstandselementen
(Spacer) abgedichtet sind. Solche Plattengelsysteme kommen insbesondere
bei der vertikalen Gelelektrophorese zum Einsatz. Die Gelstärke wird
hierbei durch die Höhe
der Abstandselemente vorgegeben. Die vertikale Gelelektrophorese ermöglicht eine
wesentlich höhere
Auftrennung der Molekülfraktionen
als beispielsweise die für
die Auftrennung von DNA-Fragmenten häufig verwendete horizontale
Gelelektrophorese, bei der das Trenngel (dann ohne Platten) in horizontaler
Lage im Elektrophoresemedium auf einem Schlitten in der Gelkammer
liegt. Zum Probenauftrag müssen
die Proben bei dieser Kammer mit einem Beschwerungsmittel (z. B. Glycerin)
vermischt werden, damit keine Auswaschung der Proben aus den Geltaschen
durch das Elektrophoresemedium erfolgt. Bei Proteingelen wird zur
Probenkonzentrierung neben dem Trenngel häufig ein Sammelgel verwendet.
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Die
vorliegende Elektrophoresevorrichtung ist dadurch gekennzeichnet,
dass ein hier als Kollektor bezeichneter Probensammler verwendet
wird, der aus einem oder mehreren nebeneinander angeordneten Probenauffangbehältern besteht
und das Trenngel von wenigstens einer Seite begrenzt. Der Kollektor
ist der Form nach vorzugsweise leistenförmig und dient gleichzeitig
als Abstandselement für die
beiden Gelplatten eines Gelsystems einer vertikalen Elektrophoresevorrichtung.
Der Einfachheit halber werden vorzugsweise zwei gleich große Kollektoren
wie herkömmliche
Abstandshalter zwischen den Glasplatten gegenüberliegend seitlich angeordnet.
Die einzelnen Probenauffangbehälter
des Kollektors dienen dem Fraktionieren und Einsammeln der elektrophoretisch
aufgetrennten Proben aus dem Trenngel, indem die Moleküle elektrophoretisch
in die Probenauffangbehälter
gesammelt werden. Vorzugsweise sind die Probenauffangbehälter zylinderförmig oder
quaderförmig
ausgebildet.
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Das
Verfahren zur elektrophoretischen Auftrennung und Einsammlung biologischer
Moleküle durch
eine zweidimensionale Gelelektrophorese, umfassend die Schritte:
- a) Durchführen
eines ersten Elektrophoreseschrittes unter Anlegen eines elektrischen
Feldes in einer mit Elektrophoresemedium gefüllten Elektrophoresekammer
mit einem Gelsystem, das wenigstens ein Trenngel umfasst, wodurch
eine größenabhängige Wanderung
der Moleküle
durch das Trenngel bewirkt wird,
- b) Herausnehmen und Drehen des Gelsystems um einen Winkel von
90°,
- c) Durchführen
eines zweiten Elektrophoreseschrittes unter Anlegen eines elektrischen
Feldes in der gleichen oder einer anderen mit Elektrophoresemedium
gefüllten
Elektrophoresekammer zum Einsammeln der während des ersten Elektrophoreseschrittes
größenabhängig aufgetrennten biologischen
Moleküle,
wobei zum Einsammeln ein als Kollektor ausgestaltetes Abstandselement verwendet
wird, dass das Trenngel wenigstens an einer Seite begrenzt und ein
oder mehrere nebeneinander angeordnete Probenauffangbehälter zum
Einsammeln der elektrophoretisch aufgetrennten Moleküle umfasst.
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Bei
dem Verfahren wird vorzugsweise wie folgt vorgegangen. Die einzelnen
Probenauffangbehälter
werden zunächst
mit flüssigem
Gelmaterial an deren Fußende
versiegelt. Hierzu wird das Abstandselement zweckmäßigerweise
in eine Schale mit flüssigem
Gelmaterial gegeben, so dass die Flüssigkeit durch Kohäsionskräfte in das
Lumen der einzelnen Probenauffangbehälter gezogen wird. Nach dem Aushärten des
Gelmaterials sind die Probenauffangbehälter unten verschlossen. Der
so versiegelte Kollektor wird dann zwischen den beiden Glasplatten
als Abstandselement eingesetzt und das Gel wie üblich zwischen die Gasplatten
gegossen.
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Nach
dem Aushärten
des Gels wird das Gelsystem, bestehend aus Trenngel und den beiden Glasplatten,
in die Elektrophoresekammer eingesetzt. Vorzugsweise sind hierzu
an der Wand der Gelkammer Führungsrinnen
ausgebildet, die ein Profil aufweisen, die es ermöglichen,
dass das Gelsystem in einer vorgegebenen Orientierung einsetzbar
ist.
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In
einem ersten Elektrophoresesschritt erfolgt die größenabhängige Auftrennung
der biologischen Moleküle.
Die Erfindung ist nicht auf eine bestimmte Art von biologischen
Molekülen
begrenzt. Sämtliche
gelelektrophoretisch auftrennbare Moleküle sind von der Erfindung umfasst,
insbesondere aber Nukleinsäuren,
wie DNA, RNA oder Proteine. Der erste Elektrophoreseschritt wird
so lange durchgeführt,
bis die gewünschte
Auftrennung der Moleküle erfolgt
ist. Der Auftrennungsgrad kann anhand eines auf dem Gebiet üblichen
Markers verfolgt werden.
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Nach
der Durchführung
des ersten Elektrophoreseschrittes wird das Gelsystem aus der Gelkammer
entnommen und um einen Winkel von 90° gedreht, so dass der Kollektor
mit den Probenauffangbehältern
nun an der Unterseite des Trenngels angeordnet ist. Durch Anlegen
einer zweiten elektrischen Spannung zur Erzeugung eines zweiten
elektrischen Feldes durch das Trenngel, werden die im Trenngel durch
den ersten Elektrophoreseschritt entsprechend ihrer Größe aufgetrennten
Moleküle
in die einzelnen Probenauffangbehältern des Kollektors laufen
gelassen und dort gesammelt. Die einzelnen Moleküle sind nun entsprechend ihrer
molekularen Größe in den
einzelnen Probenauffangbehältern fraktioniert.
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Nach
dem zweiten Elektrophoreseschritt kann das Gel aus der Gelkammer
herausgenommen und die gesammelten Proben aus den einzelnen Probenauffangbehältern isoliert
(z. B. pipettiert) werden. Dieser Prozess kann auch automatisiert
werden. Für eine
automatisierte Entnahme der Proben ist in einer bevorzugten Ausführungsform
eine Kapillare vorgesehen, in deren Hohlzylinder ein Auswurfsglied
angeordnet ist, das nach dem Eintauchen in den Probenauffangbehälter des
Abstandselementes herausdrückbar
ist, so dass die nach dem Eintauchen vorhandenen Gelreste, welche
die Kapillare verstopfen könnten,
entfernt werden. Mit Hilfe einer Multipipettiereinrichtung, bestehend
aus mehreren Kapillaren, können
sämtliche
Probenauffangbehälter
des Kollektors in einem einzigen Pipettierschritt behandelt und die
so entnommenen Proben für
die Analyse bzw. Präparation
weiterverarbeitet werden. Auch das Zugeben von chemischen Substanzen
oder die Durchführung
von enzymatischen Reaktionen ist in den Probenauffangbehältern selbst
durchführbar.
Eine aufwendige Extraktion der Moleküle aus dem Gel mit den damit
verbundenen Nachteilen ist nicht mehr erforderlich. Durch die erfindungsgemäße zweidimensionale
Gelelektrophorese wird eine feinauflösende Auftrennung ein einfaches
Einsammeln der Molekülfraktionen
erreicht.
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Der
erfindungsgemäße Kollektor
ist sowohl für
horizontale als auch für
vertikale Elektrophoresevorrichtungen geeignet. Es ist lediglich
darauf zu achten, dass eine Migration der Moleküle aufgrund des elektrischen
Feldes in dem Trenngel stattfinden kann. In einem ersten Schritt
erfolgt die größenabhängige Auftrennung
der Moleküle
und in dem zweiten Schritt das Einsammeln der so aufgetrennten Moleküle in den
Probenauffangbehältern
des Kollektors. Dadurch eignet sich das Verfahren sowohl für eine analytische
als auch eine präparative
Auftrennung.
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Die
Erfindung wird in den nachfolgenden Zeichnungen näher erläutert. Es
zeigen
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1 bis 3 isometrische
Darstellungen einer Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung,
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4 eine
Seitenansicht eines Gelssystems mit den beiden als Kollektor ausgebildeten
Abstandselementen mit Probenauffangbehältern,
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5 das
in 4 gezeigte Gelsystem in isometrischer Darstellung,
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6 eine
Ausführungsart
des Kammerbodens der Gelkammer,
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7 eine
Ausführungsart
der Führungsrinne
für das
Gelsystem und
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8 eine
weitere Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Elektrophoresekammer
zur Auftrennung von Proteinen.
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In 1 ist
eine erste Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Elektrophoresekammer
gezeigt. Erkennbar ist die Gelkammer 10 und das darin eingesetzte
Gelsystem, bestehend aus einem Trenngel 3, einer Glasplatte
als Frontplatte 24 und einer Glasplatte als Rückplatte 26.
Als seitlich begrenzende Abstandselemente sind die erfindungsgemäß als Kollektor
ausgestalteten einzelnen Probenauffangbehälter 22 zu sehen,
die direkt an das Trenngel 3 angrenzen. Die Gelkammer 10 wird
zum Betrieb mit Elektrophoresemedium 20 gefüllt und
zum Schutz mit einem Deckel 8 abgedeckt. Die Stromversorgung
erfolgt über
die elektrischen Anschlüsse 12, 14.
Die elektrischen Kontaktelemente 16, 18 (Leiterdrähte) zum Aufbau
eines elektrischen Feldes für
die Elektrophorese sind in den beiden Kammerhälften der Gelkammer 10 angeordnet.
Bei der vertikalen Elektrophorese befindet sich der positive Kontaktdraht
in der vorderen Kammerhälfte
im Bereich des Kammerbodens 6 (Kontaktelement 16).
Um eine Seitenwanderung der Moleküle bei der Elektrophorese zu
vermeiden, ist das Kontaktelement 16 an der Seite mit einem
Isolierschlauch 21 geschützt. In der nach hinten angeordneten
Kammerhälfte
ist das Kontaktelement 18 im Bereich der Kammerdecke angeordnet.
Durch die Z-förmige
Anordnung der Kontaktelemente 16, 18 wird ein
gerichtetes elektrisches Feld durch das Trenngel 3 erzeugt,
wodurch eine Migration der Moleküle
von oben nach unten im Trenngel 3 und damit eine größenabhängige Auftrennung
bewirkt wird.
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In 2 ist
eine isometrische Darstellung der in 1 gezeigten
Elektrophoresevorrichtung gezeigt. Nach dem Durchführen des
ersten Elektrophoreseschrittes wird das Gelsystem, bestehend aus Frontplatte 24,
Rückplatte 26 und
dem dazwischenliegend angeordneten Trenngel 3 aus der Gelkammer
entnommen und um einen Winkel von 90° gedreht, so dass die Probenauffangbehälter 22 des
Abstandselementes an der Unterseite des Trenngels 3 angeordnet
sind. Zum Einsetzen des Gelsystems ist eine an der Wand der Gelkammer 10 ausgebildete Führungsrinne 15 vorgesehen.
Die Führungsrinne 15 trennt
die Gelkammer 10 in zwei Kammhälften, in denen die elektrischen
Kontaktelemente 16, 18 wie oben beschrieben angeordnet
sind.
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In 3 erkennt
man eine Draufsicht der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung.
Das Gelsystem ist in die Führungsrinne 15 der
Gelkammer 10 eingesetzt.
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In 4 ist
das erfindungsgemäße Gelsystem
genauer gezeigt. Dieses besteht aus den beiden Glasplatten 24, 26 und
dem dazwischen angeordneten Trenngel 3. In dem Trenngel 3 ist
eine Probenauftragetasche 25 für den Probenauftrag zu erkennen. Die
beiden Glasplatten 24, 26 werden über Verbindungsmittel 23 zusammengehalten.
Der Kollektor mit den Probenauffangbehältern 22 dient zugleich
als Abstandshalter für
die beiden Glasplatten 24, 26. Die Probenauffangbehälter 22 sind
an deren Fußende mit
Gelmaterial 28 abgedichtet, um eine Diffusion von Molekülen aus
den Behältern
während
des zweiten Elektrophoreseschrittes zu vermeiden. Vorzugsweise sind
zwei Abstandselemente mit Probenauffangbehältern 22 vorgesehen,
die gegenüberliegend
angeordnet sind und das Trenngel 3 beidseitig begrenzen.
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In 5 erkennt
man eine bevorzugte Variante des erfindungsgemäßen Gelsystems, bei der die
Frontplatte 24 einen geringeren Durchmesser aufweist als
die Rückplatte 26.
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In 6 ist
gezeigt, wie die Glasplatten 24, 26 bis zum Kammerboden 6 eingesetzt
werden. Die unterschiedlich großen
Glasplatten 24, 26 haben sich als vorteilhaft
herausgestellt, um ein gerichtetes elektrisches Feld durch das Trenngel 3 zu
erzeugen. Um eine Seitendiffusion von Molekülen aus dem Trenngel 3 zu
vermeiden, ist am Kammerboden 6 in der Kammerhälfte mit
der kleineren Frontplatte 24 ein Rückhalteplättchen 27 vorgesehen,
welche das ansonsten offene Trenngel 3 an der Unterseite
seitlich abschließt.
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In 7 ist
eine weitere bevorzugte Ausführungsform
der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung
gezeigt. Je nach Gelsystem kann es erforderlich sein, dass die beiden
Glasplatten 24, 26 in eine vorgegebene Orientierung
in die Gelkammer 10 eingesetzt werden. Die Führungsrinne 15 ist
so ausgestaltet, dass die Orientierung beim Einsetzen des Gelsystems
vorgegeben wird, wenn die beiden Glasplatten 24, 26 unterschiedlich
groß sind.
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In 8 ist
eine weitere Ausführungsform der
erfindungsgemäßen Elekrophoresevorrichtung gezeigt.
Es handelt sich hierbei um eine Kammer zur Auftrennung von Proteinen
durch SDS-PAGE.
Durch die vertikale Anordnung wird eine hohe Auflösung der aufzutrennenden
Moleküle
erreicht. Das Auftrennungsprinzip gleicht dem zuvor beschriebenen
Verfahren.
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Die
erfindungsgemäßen Abstandselemente mit
den Probenauffangbehältern 22 können in
jede herkömmliche
Gelkammer eingesetzt werden. Dabei ist lediglich darauf zu achten,
dass ein gerichteter Stromfluss durch das Trenngel 3 erfolgt.
Weitere Ausführungsformen
der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung
werden dem Fachmann anhand der vorliegenden Erfindungsbeschreibung
ersichtlich werden.