DE2254489A1

DE2254489A1 - Praeparative elektrophoresevorrichtung

Info

Publication number: DE2254489A1
Application number: DE2254489A
Authority: DE
Inventors: Henk Van Welzen; Marius Hendrik Johan Zuidweg
Original assignee: Gist Brocades NV
Current assignee: Gist Brocades NV
Priority date: 1971-11-08
Filing date: 1972-11-07
Publication date: 1973-05-10
Also published as: NL7115364A; GB1359918A; JPS4859898A; US3773648A

Description

DIPL.-IIfG. HANS W. GROENING DIPL.-CHEM. DR. ALFRED SCHÖN

7. November 1972

GIST-BROGADES N. V. Delft / Holland

Präparative Elektrophoresevorrichtung.

Die Erfindung betrifft eine präparative Elektrophoresevorrichtung mit großer Trennkraft. . · ^: .

Präparative Elektropharesevorrichtungen weisen normalerweise, eine obere Elektrodenzone, eine Trennzone, die. ein zylindrisch geformtes Gel enthält, eine Eluierungs- oder Sammelzone und eine untere Elektrodenzone auf. Die Trennung der Komponenten» die durch ein Potentialgefälle im Gel bewirkt wird, hat zur Folge, daß die Komponenten mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten wandern, so daß sie das Gel nacheinander .verlassen und in die Eluierungszone eintreten. Diese Zone wird von einer gepufferten Lösung durchströmt» die die Komponenten mitnimmt,, beispielsweise zu einem Praktionensammler, dem.sie zwecks weiterer Untersuchung entnommen werden können.

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Es sind bereits die verschiedensten Konstruktionen von Elektrophoresevorrichtungen "bekannt und man hat der Gestalt der Eluierungskammer, die mehrerere zum Teil sich widersprechende Bedingungen zu erfüllen hat, große Aufmerksamkeit gewidmet. Toter Raum darf nicht vorhanden sein und eine relativ hohe Fließgeschwindigkeit ist erforderlich, um die Gefahr einer Verunreinigung vorhergehender Fraktionen zu vermeiden. Der größere Teil der Vorrichtungen hat den Auslaß an der Seite (vgl. z. B. P.H. Duesberg, Anal. Biochem. U_ (1965), 342). Dies ist wegen des Vorhandenseins einer Schwelle am Auslaß ungünstig. Die von Schenkein (Anal. Biochem. J25 (1968), 387) vorgeschlagene Eluierungszone hat einen nach unten gerichteten Ausgang und vermeidet somit die Schwelle.

Eine hohe Fließgeschwindigkeit der gepufferten Lösung in der Eluierungskammer, die nötig ist, um eine möglichst scharfe Trennung der Komponenten zu erzielen, kenn eine übermäßige Verdünnung der Komponenten zur Folge haben, so daß deren Analyse schwieriger gemacht wird. Dies kann man durch Verringerung der Abmessungen der Eluierungskammer verbessern. Duesberg (loc. cit.) verwendete ein kegelförmiges unterea Ende eines hauptsächlich zylindrischen Geles, so daß eine kleinere Eluierungskammer genügte.

Außerdem besteht der Boden der Trennzone im allgemeinen aus einer semipermeablen Membran, die die Ionen hindurchwandern läßt und dadurch für elektrischen Kontakt sorgt, die aber die Komponenten des zu untersuchenden Materiales (normalerweise Proteinkomponenten) nicht durchgehen läßt.

Membranen haben jedoch Nachteile, z. B. wegen des sogenannten Bethe-Toropoff-Effektes (H. Svensson, Adv. Protein Chem. _4 (1948) 251) und der Möglichkeit der Denaturierung oder Absorption. Ein gesinterter Glasboden wird in einer von Porath (Nature 182 (1958) 744) beschriebenen Vorrichtung vorgeschlagen,

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in der eine Abwärtsbewegung der Komponenten der. Probe durch einen aufwärts gerichteten Eluß gepufferter Lösung verhindert, wird.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer Elektrophoresevorrichtung, in der die oben genannten Torteile mit anderen Torteilen, die tinten noch beschrieben werden, kombiniert und die Nachteile eliminiert sind. ,

Die erfindungsgemäße präparative ElektrophoresevorriGhtung ist gekennzeichnet durch eine trichterförmige Zone für das Elektrophoresegel, die an der oberen Seite offen ist; eine Zone für den Umlauf einer ersten gepufferten Lösung -darüber, ' die eine erste Elektrode enthält, wobei die'trichterförmige Zone an ihrem unteren Ende in eine enge Öffnung übergeht, die einen Boden besitzt, der flüssigkeit durchgehen läßt, das Gel jedoch hält, die enge Öffnung in Verbindung mit einer Eluierungskammer steht, die direkt mit einem Auslaß verbunden ist, die Eluierungskammer außerdem mit einem dünnen kegeligen Mantel um die kegelförmige Zone herum in Terbindung steht, der kegelförmige Mantel mit einer Zone verbunden ist, die eine zweite Elektrode enthält und einen Einlaß aufweist, um eine zweite gepufferte Lösung zirkulieren zu lassen, der Einlaß sich zwischen der Zone, die die zweite Elektrode enthält und der Eluierungskammer befindet, die Eluierungskammer darüber hinaus mit einem abwärts gerichteten Ausgang für das Eluat ausgestattet ist -und die Vorrichtung außerdem noch Einrichtungen zum Kühlen der Flüssigkeiten und des G-eles aufweist, ' ...-"■

Bei dieser Konstruktion gibt es keine Membran zum Zurückhalten der Komponenten des zu untersuchenden Materiales, dies ist auch nicht notwendig, da die zweite gepufferte Lösung zwischen d.er Eluierungskammer. und der Zone der zweiten Elektrode' eingeleitet wird, so daß bei richtiger'Einstellung der Fließge-'" schwindigkeit der zweiten gepufferten Lösung alle abgetrennten

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Komponenten mitgenommen werden, ohne daß die Gefahr "besteht, daß Komponenten von der Eluierungskammer zur zweiten Elektrode wandern und einer Untersuchung entfliehen. Das Fehlen der Membran hat einen weiteren Vorteil, es wird nämlich eine Absorption vermieden und elektrische Effekte der Membran entfallen. Ein Vorteil der trichterförmigen Trennzone ist der, daß die Probe in einer relativ dünnen Schicht aufgebracht werden kann, was ein hohes Trennvermögen zur Folge hat. Darüber hinaus ist die Eluierungskammer der erfindungsgemäßen Vorrichtung klein und die gepufferte Lösung wird in ringförmiger Weise eingeleitet, ein Einleitungsrohr erübrigt sich daher. Dies hat den Vorteil, daß es keinen toten Raum gibt, während die kleinen Abmessungen der Eluierungskammer und die Art der Einführung der gepufferten Lösung das Trennvermögen weiter steigert, da ein Vermischen von Fraktionen weitgehend vermieden wird. Das Volumen der Eluierungskammer ist klein, es beträgt etwa 0,01 - 1 ml, vorzugsweise 0,05 - 0,2 ml. Die erfindungsgemäße Konstruktion gestattet eine sehr wirkungsvolle Eluierung, ohne daß der Gebrauch einer zu großen Menge gepufferte Lösung nötig ist, zu starke Verdünnungen werden daher vermieden, was für die weiteren Untersuchungen des Eluates von Vorteil ist.

Ein zusätzlicher Vorteil der erfindungsgemäßen Konstruktion ist der, daß der Teil des Geles wo das elektrische Feld und somit die Wärmebildung am größten ist, nämlich am unteren Ende der trichterförmigen Zone, am intensivsten durch die gepufferte Lösung gekühlt wird, da die Fließgeschwindigkeit der gepufferten Lösung in dieser Region des kegeligen Mantels am höchsten ist.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer Vorrichtung,bestehend: aus einem oberen Teil, der einen kegelförmigen Teil der V/and, die die trichterförmige Zone umgrenzt, eine äußere Wand, die die Umlaüfzone für die erste gepufferte Lösung umgrenzt und die erste Elektrode aufweist; einem unteren

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Teil, in den der öftere Teil, eingepaßt ist, der die äußere Wand des kegelförmigen Mantels, die zweite Elektrode, die Zufuhrung für die zweite gepufferte Lösung und am unteren Ende der kegelförmigen Wand einen etwas auseinandergehenden Teil,, der zu einem mit einem zentralen, vertikalen Durchgang versehenen Pfropfen paßt, aufweist, wobei das ganze so eingerichtet ist, daß die Seitenwände der Eluierungskammer,von dem unteren Teil, die obere Wand davon von dem oberen Teil und' der Boden von dem Pfropfen gebildet werden. Diese Ausführungsform hat den Vorteil, daß die Abmessungen der Eluierungskammer scharf umrissen sind und dennoch für die Reinigung und um das Gel in den oberen . Teil zu gießen, gut zugänglich sind. Es ist klar, daß ein Träger in Pulverform, wie Sephadex (Warenzeichen) oder Glaspulver verwendet werden kann. In einer vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besitzen die verschiedenen Teile an den Verbindungsstellen Glasschliffe. Darüber hinaus-sind die Umlaufzonen für die gepufferten Lösungen vorzugsweise mit Überläufen ausgestattet, so daß zu große Flüssigkeitsdrucke vermieden werden. Die Umlaufzone der ersten gepufferten Lösung weist vorzugsweise einen Kühlfinger auf, der in die trichterförmige Zone ragt, während ein Kühl'gefäß um den dünnen kegelförmigen Mantel und um einen Teil der Zuführung für die zweite gepufferte Lösung angewendet wird. Dieser Kühlfinger ist vorzugsweise mit einem zusätzlichen Mantel ausgestattet, der am unteren Ende der Zone für die erste gepufferte Lösung endet und an seinem unteren Ende um die Peripherie herum Öffnungen besitzt, die die Einführung der ersten gepufferten Lösung gestatten. Auf diese Weise kann die erste gepufferte Lösung mit einer angemessen genauen Temperatur in das Umlauf gefäß eingeführt werden.

In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform besteht.· der Boden des unteren Endes der trichterförmigen Zone aus gesintertem Glas. Außerdem ist die erste Elektrode vorzugsweise in der Höhe regulierbar. Durch eine richtige Einstellung dieser Elektrode kann die Trennung optimalisiert werden. Der Boden

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der Sammelzone kann außerdem einen Bodenring "besitzen, um das Volumen der Eluierungskammer zu verringern.

Die Erfindung wird nun anhand der beigefügten Zeichnungen, die eine vorteilhafte Atisführungsforrn der Erfindung zeigen, weiter erläutert.

Figur 1 zeigt einen vertikalen Schnitt durch die

erfindungsgemäi3e Elektrophoresevorrichtung.

Figur 2 seigte eine Einzelheit - in vergrößertem Maßstab - des Ln Figur 1 mit dem gestrichelten Rechteck A umschriebenen Teiles.

Die in Figur I dargestellte Vorrichtung besteht aus einem oberen Teil I und einem unteren Teil 2, die mit Hilfe eines Glasschliffee 3 passend zusammengesetzt sind. Der obere Teil 1 umfaßt eine trichterförmige Trennzone 4, in der das Elektrophoresegel etwa bis zur Höhe der gestrichelten Linie 5 verwendet werden kann. Die darüber liegende Zone 6 ist für den Umlauf einer gepufferten Lösung eingerichtet,und es wird eine in der Höhe verstellbare Elektrode 7 in dieser Zone verwendet. In der in den Zeichnungen gezeigten Vorrichtung ist die Elektrode ringförmig ausgebildet, um ein so gut homogenes elektrisches Feld wie möglich zu erzeugen. Diese Elektrode ist nach außen über einen Rohransatz 8 verbunden und ist in der Höhe regulierbar. Die Elektrode kann in ihrer tiefsten Stellung in einer ririgfönnigen Rinne 3^CJ ruhen, so daß die tiefste Stellung der Elektrode festliegt.

Die Zone 6 ist außerdem mit einem Zufuhrungsrohr 9 für die Einführung der zu untersuchenden Probe und einem Überlauf zur Entfernung der gebrauchten gepufferten Lösung verbunden. Das obere Ende der Zone 6 hat außerdem einen G-laaschliff, in den ein Kühlfinger 12 eingesetzt wird. Der KUhlfinger besitzt ein zentrales EinleLtungsrohr 1'S fur die Kühlflüssigkeit» dcis

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von einem ersten Mantel 14 für die Rückführung der Kühlflüssigkeit umgehen ist. Das untere Ende des Einleitungsrohres 13 steht in Yerhindung mit dem Mantel 14, der in diesem Gebiet kegelförmig ist, um eine Stöi'ung der Homogenität des elektrischen Feldes minimal zu halten. !Der Mantel 14 wird von einem zweiten Mantel 16 umgehen, der unmittelbar über der gestrichelten Linie 5 endet. Das untere Ende des Mantels 16 ist um die Peripherie herum mit Öffnungen 1? versehen. Die gepufferte Lösung kann auf dem Weg durch den Mantel 16 in diese Zone eingeführt vrerden. Die gepufferte Lösung dient dazu, den elektrischen Kontakt zwischen der Elektrode 7 und dem in der Trennzone 4 verwendeten Gel herzustellen.

Das untere Ende der Trennzone 4 (im Detail in Figur 2 gezeigt) besitzt einen Boden' 18, der nicht nur als Boden der Trennzone 4 dient j sondern auch als Durchgang für die durch die Elektrophorese "getrennten Komponenten dient. Der Boden besteht aus gesintertem Glas„ Die getrennten Komponenten werden in der Eluierungskammer 19, die von Wänden von drei Teilen der Vorrichtung gebildet wirdy wie unten beschrieben, gesammelt. * -

Der untere Teil 2 der Vorrichtung weist eine kegelförmige Wand 20 auf, die so eingerichtet ist, daß wenn der obere Teil 1 auf den unteren Teil 2 gesetzt wird, ein sehr schmaler Raum zwischen der Wand der Trennzone 4 und der Wand 20 gebildet wird. In der dargestellten Ausführungsform beträgt der Abstand zwischen den Wänden 0,4 mm, dieser Abstand kann aber ,je nach Wunsch größer oder kleiner gewählt-werden.

Die Wand 20 ist über eine schmale Auflage 21 mit einer zylindrischen Wand 22 verbunden. Die zylindrische Wand ist an dem !Äußeren Teil des Glasschliffes 3 befestigt. An der Wand 22 befindet sich ein Überlaufrohr 23. Lie Wand 20 hat ungefähr in der Mitte einen Satz nahezu axial- angeordnete3? .Einleitungsrohre j'\, die gleichmäßig um ο en Unifang herum verteilt

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sind. Der ganze Satz Einleitungsrohre 24 let ein Teil eines Zweigrohres, das mit einem gemeinsamen Zuleitungsrohr 25 verbunden ist.

Das Rohr 25 erlaubtdie Einführung einer zweiten gepufferten Lösung, die durch den kegelförmigen Raum und die Eluierungskammer 19 geht, wobei sie die abgetrennten Komponenten mitnimmt und durch einen Auslaß 31 mit einem Eusätzlichen Anschluß 32 über eine Pumpe zu beispieleweise einem Fraktionssammler, transportiert. Ein Teil der gepufferten Lösung fließt zu dem Raum in der zylindrischen Wand 22 und wird durch den Überlauf 23 entfernt. Bei dem Durchgang durch den Raum in der Wand 22 passiert die gepufferte Lösung die zweite Elektrode 26, die an der Vorrichtung befestigt ist und auf der Auflage 21 ruht. Diese Elektrode ist durch die Wand 22 mit der Außenseite verbunden. Der elektrische Kontakt mit dem Gel in der Zone 4 wird durch die gepufferte Lösung in dem kegelförmigen Raum und im Boden 18 hergestellt.

Das untere Ende des kegelförmigen Raumes, der von der kegelförmigen Wand der Trennzone 4 und der Wand 20 gebildet wird, endet in der Eluierungskammer 19. Die Seitenwände der Eluierungskammer werden von einem zylindrischen Teil 27 des unteren Endes der Wand 20 gebildet. Den oberen Teil der Eluierungskammer bildet der Boden 18 und das untere Ende wird von dem oberen Teil 28 eines ringförmigen AuffüllStückes 29 eines Stopfens 30 gebildet. Der Stopfen 30 besitzt einen zentralen Kanal 31, der mit der Eluierungskammer 19 verbunden ist. Das untere Ende des Kanales 31 ist mit einem zusätzlichen Glied des Stopfens verbunden. Ein flexibler Ableitungsschlauch kann daran angeschlossen werden und stellt die Verbindung zu beispielsweise einer fein regulierbaren Saugpumpe her, die die Fließgeschwindigkeit der gepufferten Lösung steuert. Das obere Ende 28 des AuffüllStückes 29 ist in der dargestellten Ausführungsform zum Mittelpunkt hin kegelig gestaltet, so daß die gepufferte Lösung in der Eluierungskammer 19, die mit den

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Komponenten gemischt i.stj leicht entfernt wurden kann, Bej? Stopfen 30 sitzt dicht in dgm GlLasgichiiff Jf, der sicn im Boil en 34 befindet und Teil einer ppilzone d#s -unteren Teiles 2 ist, pie Kühlzone wird außerdem von einer zylindrisehen Seitenwand 35 und einer konisch' sich verengenden Wand 36, die mit der zylindriseilen Wand 22 verbunden ist,¹ eingerschlossen, wobei die konisqhs Wand 36- die kegelige Wa&d 20 •mit dem Zweigroiir 24 umsclilieit. Bine duroih ein Roiü? 3t in den unteren ?eil 34 eingeführte Eünlfloissigkeit kann in der Eühlzone umlaufen» Die Kühlflüssigkeit wird durch: ein Rohr 38 in der konischen Wand 36 entfernt..

Der Stopfen 30 kann auoh mit einem kleineren Sehliffstüek ■verwendet werden, was das Auf füll stück 29 überflüssig macht.

Die dargestellte Yorriehtung besteht praktisch ganz aus &las (mit Elektroden aus einer Pt-Ir-L'egierung), es ist jedoch klar, daß auch andere Materialien verwendet werden können,, vorausrgesetzt sie isolieren elektrisch, sind thermisch leitend,, mechanisch fest und chemisch indifferent gegenüber den verwendeten Chemikalien,

Die Forrichtuns arbeitet wie folgt; Man gibt ein geeignetes Gel in die 'f rennzone 4 und baut die forrichtung zusammen, in-

dem man den oberen Teil 1, der das Gel enthält, ⁱⁿ 4en unteren Teil 2 setzt und den Kühlfirtger 12 in seine Bosititon bringt. Eine zu untersuchende Irobe wird durch das" Sphr 9 auf das Gel aufgebracht. Durch den Mantel 16-und daß Einleitungsrohr

25 werden gepufferte Lösungen eingeführt. Man beginnt zu kühlen und legt eine Spannung zwischen den Elektroden 7 und

26 an, so daß die Probe in dem Gel in der trichterförmigen Zone 4 der Wirkung der 'Elektrophorese unterworfen und in die Komponenten getrennt wird. Wegen der kegelförmigen Gestalt der Zone 4 findet eine Konznetrierung der Scheiben der getrennten Komponenten während der Elektrophorese statt» Die

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Komponenten verlassen das Gel nacheinander durch den ge-^ Sinterten Glasboden 18 und treten in die Eluierungskpipier 19 ein, wo jede der eingetretenen Komponenten mit der durch die Eluierungskammer gehenden Pufferlösung vermischt wird, und die Komponenten werden nacheinander durch den Auslaßk®.nal 31 mitgenommen, der mit Hilfe eines flexiblen Schlauches an eine fein regulierbare Pumpe angeschlossen ist, die die gepufferte Lösung mit den Komponenten zu einem FraMipnssamm pumpt, der die Komponenten in der gepufferten Lösung getrennt auffängt,

Zur Kühlung mit Hilfe des Kühlfingers kann es ausreichen, wenn die Kühlflüssigkeit im Kühlfinger nicht läuft» Manchmal ergibt dies bessere Ergebnisse als bei laufender Kühltlüssig«- keit.

Wegen der Kleinheit der Eluiacungakainmer (etwa 0,4 ml), dem Fehlen von totem Raum und der Tatsache, daß das Eluat in einem parallelen Strom von der gepufferten Lösung mitgenommen wird, ist das Trennvermögen der Vorrichtung groß, wobei die symmetrische Gestalt der Trennzone und der Eluierungs^ kammer (was die Herstellung eines sehr homogenen elektrischen Feldes ermöglicht) darüber hinaus zu einem hohen Trennvermögen beitragen.

Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert. In allen Beispielen wurde die oben beschriebene Vorrichtung verwendet.

Beispiel 1

Eine Probe aus Bromphenol blau, Methylrot, Supracenvialett und Ponceau-S wird als Versucheprobe verwendet, Pit Trennung wird bei pH 9,3 und einer Temperatur von 0^g C in ein©» die» kontiimierlichtn anodisch gepufferten System mit Ohlarid «Is

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Leition O'lpading ion") und 6-Aminocapro:nsäure als Schleppion ("trailing ion"). Die Elektrode 7 wird immer als Kathode verwendet. Yariiert wurden die Spannungen, der Gebrauch des Kühlfingers, die Lage der Kathode und die Rate des Abtransportes.

Ergebnisse:

a) Spannungsvariationen: Stellt man die Spannung

so ein, daß der Strom 10 mA Jiicht übersteigt, so werden keine Siede-Phänoinene im unteren leil des Geles verursacht und die Elektrophorese verläuft richtig. Unter den vorliegenden Umständen beträgt die Anfangsspannung 200 .- 250 Y bei entsprechenden Strömen von 7 - 9 mA. Der Strom kann später verstärkt werden und es werden Spannungen über 750 Y angewendet} ohne daß dadurch das normale Bild gestört würde. Derart hohe Spannungen werden normalerweise nicht angewendet, da die gepufferte Lösung mit einer unzweckmäßig großen Geschwindigkeit durchgeleitet werden müßte, um das TrennVermögen nicht nachteilig zu beeinflussen. Die oben genannte Parbstoffmischung wird richtig getrennt, vorausgesetzt die oben genannten Bedingungen werden erfüllt. -.·"."

b) Gebrauch des Kühlfingers: Man erhält die besten Ergebnisse, wenn der Kühlfinger mit Kühlflüssigkeit gefüllt ist, letztere jedoch nicht zirkuliert.

c) Stellung der Elektrode 7: Die besten Ergebnisse erhält man mit dieser Elektrode in ihrer tiefsten Stellung. Bei höherer Einstellung der Elektrode werden die Scheiben konvexer.

d) Wegbeförderungsrate: Die Wegbeförderungsrate wird mehr oder weniger durch die angewendete Spannung bestimmt. Wenn die Wegbeförderung zu langsam erfolgt,treten Verluste auf, da die Komponenten zumindest teilweise in Richtung der Elektrode

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entweichen. Bei zu hoher Wegbeförderungsrate wird leicht das Eluat zu stark verdünnt. Bei den Versuchen dieses Beispiels werden gute Ergebnisse bei einer Wegbeförderungsrate von etwa 0,5 ml pro Minute erzielt.

Beispiel 2

In diesem Beispiel wird eine Protease, die durch einen amylaseerzeugenden Bacillusstamm erzeugt worden ist, als Probe verwendet. Die Trennung wird unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen durchgeführt. Elektrode 7 wird in ihre tiefste Stellung gebracht und man benutzt den Kühlfinger, gefüllt mit Kühlflüssigkeit, die aber nicht fließt. Die gepufferten Lösungen werden mehrere Stunden lang bei etwa 5° C vor dem Gebrauch entlüftet und im Vakuum bis zum Gebrauch aufbewahrt.

Man trägt eine 100 mg Probe Protease auf das Gel auf. Der Versuch wird bei einer Spannung von 250 V und einem entsprechenden Strom von 6 mA begonnen. Der ganze Versuch dauert 24 Stunden. Man benutzt einen Fraktionssammler,zum Auffangen der Komponenten, die separat von der gepufferten Lösung mitgenommen werden. Der Fraktionssammler wird alle 10 Minuten angetrieben. Die Wegbeförderung wird auf 11 Tropfen pro Minute eingestellt, so daß am Anfang Fraktionen von 7 ml gesammelt v/erden. Aliquote der'oben erhaltenen Fraktionen bringt man auf eine Gelplatte ("gel slab") für eine andere Elektrophoresevorrichtung für analytische Zwecke, nämlich eine Vorrichtung vom Typ 470 der E.G.Company. Ein Aliquot der Ausgangsprobe wird ebenfalls auf die Gelplatte gebracht. Man führt eine Elektrophorese durch und nach Beendigung der Elektrophorese bringt man die Gelatineseite der Gelplatte auf eine fotografische Platte, in der an Stellen, wo proteolytlsche Aktivität vorhanden ist, Löcher gebildet werden. Das Ergebnis ist in der schematischen Darstellung der Figur 3 gezeigt, in der die während der zweiten Elektrophorese zurückgelegte Entfernung

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auf der horizontalen Achse aufgetragen ist, "beginnend vom
Start, "bezeichnet mit "A". Die ΪΓο. der Fraktion läßt sich
von der vertikalen Achse ablesen. Der Startfleck der Probe
ist mit "B" "bezeichnet. Die verschiedenen Komponenten können in Figur 3 unterschieden werden; sie sind mit a_t "b, c_f d und e "bezeichnet (die _t Komponente e stellt bei weitem den größten Teil der Probe dar), wobei die mit gestrichelten Linien angedeuteten Flächen schwächer sichtbar sind als- die Gebiete mit ausgezogenen Linien. Figur 3 zeigt das große Trennvermögen
der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung. Die Ausbeute liegt in der Größenordnung von

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Claims

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1. Präparative Elektrophoresevorrichtung, gekennzeichnet durch eine trichterförmige Zone für das Elektrophoresegel, die oben offen ist, eine Zone darüber für den Uralauf einer ersten gepufferten Lösung, die eine erste Elektrode enthält, wobei die trichterförmige Zone an ihrem unteren Ende in eine enge Öffnung übergeht, die einen Boden besitzt, der Flüssigkeit durchgehen läßt aber das Gel hält, die enge Öffnung in Verbindung mit einer Eluierungskammer steht, die direkt mit einem Auslaß verbunden ist, die Eluierungskammer außerdem in Verbindung mit einem schmalen kegeligen Hantel um die trichterförmige Zone herum steht, der kegelige Mantel mit einer eine zweite Elektrode aufweisenden Zone verbunden ist und mit einer Zuleitung für den Umlauf einer zweiten gepufferten Lösung ausgestattet ist, die Zuleitung sich zwischen der die zweite Elektrode aufweisenden Zone und der Eluierungskammer befindet, die Eluierungskammer einen abwärts gerichteten Auslaß für das Eluat aufweist und die Vorrichtung außerdem Einrichtungen zum Kühlen der Flüssigkeiten und des Geles aufweist.

2. Vorrichtimg nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Eluierungskammer ein Volumen von 0,01 - 1 ml hat.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Eluierungskammer ein Volumen von 0,05 - 0,2 ml hat.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch einen oberen 'Ceil, der einen kegelförmigen Teil der Wand, die

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die trichterförmige Zone umgrenzt, eine äußere. Viand, die die Umlaufzone für die erste gepufferte Lösung umgrenzt und die erste Elektrode aufweist; einen unteren Teil, in den der öftere Teil eingepaßt ist, der die äußere Wand des Kegelförmigen Mantels, die zweite Elektrode, die Zuführung für die zweite gepufferte Lösung und am unteren Ende der kegelförmigen Wand einen etwas auseinandergehenden Teil, der mit einem einen zentralen -vertikalen Durchgang besitzenden Stopfen zusammenpaßt, aufweist, wobei das Ganze so eingerichtet ist, daß die Seitenwände der Eluierungskammer von dem unteren Teil, die obere Wand der Eluierungskammer von dem oberen Teil und der' Boden der Eluierungskammer von dem Pfropfen gebildet werden,

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Elektrode in der Höhe verstellbar ist.

6. Yorrichtung nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die verschiedenen Teile mit G-las schliffen ausgestattet sind, .

7. Vorrichtung nach Anspruch 1,■dadurch gekennzeichnet, daß die Umlaufzone für die gepufferten Lösungen Überläufe auf- weist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß· in der Umlauf zone der ersten gepufferten Lösung ein Kühlfinger verwendet wird, der in die kegelförmige Zone ragt, während ein Kühlgefäß um den dünnen kegeligen Mantel herum und um einen Teil der Zuführung für die zweite gepufferte Lösung herum verwendet wird.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Kühlfinger mit einem zusätzlichen Mantel ausgestattet ist, der am unteren Ende der Zone für die erste gepufferte Lösung endet und an seinem unteren Ende entlang der Peripherie

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Öffnungen besitzt, die eine Einführimg der ersten gepufferten Lösung gestatten.

10. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Boden des unteren Endes der kegelförmigen Zone aus
gesintertem Glas besteht.

11. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Boden der Eluierungskammer einen Bodenring aufweist,
um das Volumen der Eluierungskammer zu verringern.

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