DE2454105A1

DE2454105A1 - Vorrichtung zur isotachophoretischen trennung

Info

Publication number: DE2454105A1
Application number: DE19742454105
Authority: DE
Inventors: Tord Lennart Arlinger
Original assignee: LKB Produkter AB
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1973-11-14
Filing date: 1974-11-14
Publication date: 1975-05-15
Also published as: JPS5081397A; FR2250993A1; FR2250993B1; JPS5653695B2; DE2454105B2; US3948753A; SE7315417L; SE386742B; GB1475200A

Description

2454105 Patentanwälte Liedl, Dr. Pontani, Nöth, Zeitler

München 22, Steinsdorfstraße 21-22, Telefon 089/29 84 62

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Vorrichtung zur isotachophoretisohen Trennung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf 'eine Vorrichtung zur isotachophoretischen Trennung, welche eine zwischen zwei Elektroden angeordnete Kapillarsäule aufweist, wobei die der Trennung unterliegende Probe zwischen einem leitenden bzw. einem Endelektrolyten eingeführt wird und ein Anzeiger zum Nachweis unterschiedlicher Probezonen in einer Stellung längs der Säule angeordnet ist.

Bei der Isotachophorese wird eine Trennung einer ionisierten Probe, welche Ionen einer bestimmten Polarität enthält, in der Weise durchgeführt, daß man die Probe in eine zwischen zwei Elektroden angeordnete Säule einführt, wobei man einen Leiterelektrolyten in denjenigen Teil der Säule einbringt, welcher sich zwischen der Probe und der Elektrode befindet, gegen welche die Ionen wandern, wenn eine Spannung an die Elektroden angelegt wird, wobei dieser leitende Elektrolyt Ionen der gleichen Polarität, jedoch mit größerer Beweglichkeit enthält als die Probeionen, und wobei ein Endelektrolyt in denjenigen Teil der Säule eingeführt wird, welcher sich zwischen der Probe und der anderen Elektrode .befindet, wobei ferner der Endelektrolyt Ionen dieser Polarität, jedoch mit einer geringeren Beweglichkeit

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als die Probeionen enthält. In die gesamte Säule wird auch eine Ionenart der entgegengesetzten Polarität eingeführt, ein sogenanntes Gegenion. Das Gegenion sollte zweokmäßigerweise Puffereigenschaften besitzen. Die Isotachophorese ist eingehender beschrieben beispielsweise in Analytioa Chimica Acta 38 (1967) Seiten .233 bis 237, wo sie als »Verdrängungselektrophorese" bezeichnet ist, sowie in der deutschen Patentschrift 2 127 391.

Bei einer isotaehophoretischen Trennung von Ionen erzielt man eine große Schärfe beim Trennen und man erhält eine scharfe Trennungslinie zwischen den Zonen, welohe durch die Ionen gebildet werden. Die Konzentration der Ionen in den verschiedenen Probezonen ist von der Beweglichkeit jedes entsprechenden Ions abhängig und demzufolge wird ein bestimmtes Ion im Vergleioh zu seiner Konzentration im anfänglichen Probengeraisch im allgemeinen konzentriert. Diese spezifischen Merkmale der Isotachophorese, welche eine Folge der Anwesenheit eines Leiter- bzw. Endelektrolyten, wie oben beschrieben, sind, machen die isotachophoretische Trennung sehr vorteilhaft im Vergleich zur allgemeinen Zonenelektrophorese, bei welcher jede Probenlcomponentenzone sich verbreitert und mit dem Durchführen der Trennung als Ergebnis der Diffusion weniger scharfe Grenzlinien erhält und wo die Konzentration jeder Probenkomponenten sich während der Trennung vermindert. Die Vorteile der Isotachophorese sind besonders hervorragend in einer Säule, welche aus einem Kapillarrohr besteht, in welchem stabilisierende Medien wie Gele nicht angewandt zu werden brauchen.

Bei der Durchführung einer isotachophoretischen Trennung ist im allgemeinen ein Anzeiger an der Säule angeordnet, um die erzielten Zonengrenzlinien nachzuweisen. Ein Zweck dieses Nachweises besteht in der Beurteilung, wann sich als Anzeige vollendeter Trennung scharfe Zonengrenzlinien zwischen allen Probezonen gebildet haben. Ein anderer Zweck eines solchen Nachweises besteht in der Führung eines in vielen Fällen gebrauchten Gegenstromes,

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damit die Zonehgrenzlinie zwischen leitungselektrolyt und Probengemisch in der Säule stationär gehalten wird, wie dies in der oben erwähnten Patentschrift beschrieben ist.

Oft wird eine elektrophoretisch^ Trennung, beispielsweise eine isocachophoretische Trennung, für analytische Zwecke durchgeführt. Es ist dann von Interesse, die verschiedenen in der Säule anwesenden Probezonen bis zur höchstmöglichen Schärfe bei Trennung und Nachweis zu studieren. Analytische Trennungen werden oft mit kleinstmöglichem Probenvolumen durchgeführt. Dies gestattet kurze Trennungszeit. Bei der analytischen Isotachophorese verwendet man zweckmäßigerweise eine oben erwähnte Kapillarsäule. In einer Kapillarsäule ist ein Naohweis bis zur großen Schärfe der Probenkomponentenzoneh relativ einfach zu erzielen, beispielsweise mittels eines thermischen oder optischen Anzeigers, welcher an der Säule angeordnet ist.

In anderen Fällen wird die elektrophoretische Trennung zu präparativen Zwecken durchgeführt wenn es gewünscht wird, die unterschiedlichen Probezonen nach der Abtrennung getrennt zu sammeln. Bei der Zonenelektrophorese in einer Säule hat die präparative Arbeit das Entleeren der Kolonne von seinem Inhalt zur Folge, nachdem die Abtrennung vollendet und die Elektrodenspannung abgeschaltet ist. Während des Entleerens verbreitern sich dann die Zonen infolge Diffusion weiter und die Grenzlinien werden unschärfer, d.h. die Schärfe der Trennung vermindert sich. Präparative Trennungen werden im allgemeinen mit ziemlich großen Probenvolumina durchgeführt, welche Makrosäulen und relativ lange Trennzeiten erfordern. Der Nachweis bis zu ziemlich guter Schärfe der Probenkomponentenzonen, wie diese in der Säule nach vollendeter Trennung vorliegen, könnte nur mit großer Schwierigkeit erzielt werden und der Nachweis bei präparativer Trennung wird gewöhnlich nach einer Eluierung der Probenkomponenten durchgeführt und zwar mit der genannten Verminderung der Trennschärfe, Die Eluierung einer Makrosäule wird erschwert durch die Anwesenheit der Stabilisierungsmedien, beispielsweise Gel, welches in

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solchen Säulen bei Trennungen verwendet werden soll.

Verbesserte Schärfe der Abtrennung nach der Eluierung aus einer Makrosäule könnte mittels einer Säule erzielt werden, wo die unterschiedlichen Probekomponenten, duroh daa elektrische Feld beeinflußt, zu dem einen Ende der Säule wandern und dann, in richtiger Weise durch das elektrische Feld noch beeinflußt, aus der Säule eluiert werden. Eine solche Vorrichtung ist in der deutschen Patentschrift 2 101 885 beschrieben. Diese Vorrichtung ist für Proben im Makromaßstab vorgesehen.

Es ist jedoch wünschenswert, auch sehr klein© Probemengen präparativ abzutrennen. Eine Vorrichtung zur präparativen isotachophoretischen Trennung im Mikromaßstab_s d.h. unter Benutzung einer Kapillarsäule j ist nicht bekannt.

Ziel der Erfindung ist die Schaffung einer Vorrichtung, mittels welcher isotaohophoretisohe Trennung präparativ im Mikromaßstab vollzogen werden kann. Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung erzielt man Trennungen, welche in kurzen Trennzeiten sehr große Schärfe zeigen. Die getrennten Probekomponentenzonen können beim Nachweis vor dem Sluieren bis zu großer Schärfe nachgewiesen werden.

Erfindungagemäß gabelt sioh von dar Säule ein Shuntrohr ab, welches vorzugsweise geringeren Querschnitt als die Säule besitzt. Vorzugsweise zweigt das Shuntrohr von der Säule so dicht wie praktisch möglich an der Stelle ab, an welcher der Nachweis mittels eines Anzeigers durchgeführt wird. Ferner zeigt die erfindungsgemäße Vorrichtung Einrichtungen zum Schaffen eines Stromes des Leitelektrolyten in der Richtung entgegengesetzt zur Wanderungsrichtung der Probenzonen.

Die Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung und den Patentansprüchen. Ferner sei die Erfindung un-

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ter Bezugnahme auf die anliegenden Zeichnungen näher erläutert. i

Pig. 1a und b veranschaulicht schematisch daa Prinzip der j Isotachophorese und

Fig. 2 zeigt schematisoh eine bevorzugte AuBführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung,

In den Pig. 1a und 1b bezeichnet die Bezugszahl 1 eine Säule, in welche eine Anode 2 und eine Katho.de 3 eingeführt sind. In Pig. 1a wird die Probe, welche getrennt werden soll, in denjenigen Teil der Säule eingeführt, welcher mit S bezeichnet ist. Diese Probe weist Salze mit drei unterschiedlichen Anionen ^Gi""^f °2~ ^{und G}3~ ^au^» wobei angenommen wird, daß 0^" eine größere Beweglichkeit besitzt als Cg^-I von welchem wiederum angenommen wird, daß dieses eine größere Beweglichkeit als C,"" besitzt. Der Teil der Säule, welcher mit L bezeichnet ist, wird mit dem oben erwähnten Leiterelektrolyten gefüllt, welcher das Anion A~ aufweist, welohea größere Beweglichkeit besitzt als alle Anionen der P.robe. Der Teil T der Säule, welcher der Kathode zugewandt ist, ist mit einem Elektrolyten gefüllt, der ein Anion B~ enthält, welches eine Beweglichkeit besitzt, die geringer ist als alle interessierenden Anionen in der Probe. In L befindet sich eine Kationenart, ein sogenanntes Gegenion H⁺, welches zweckmäßig Puffereigenschaften besitzen sollte. Wenn eine Gleichspannung an die Elektroden 2 und 3 angelegt wird, so wandern die Kationenarten nach 3 hin und bilden ein gemeinsames Kation für alle Anionen, während die Anionen zur Anode 2 hinwandern. Als . Folge der unterschiedlichen Beweglichkeit der Anionen steigert sich dann stufen- und zonenweise die elektrische Feldstärke über die Zonen L, S beziehungsweise T hinweg. Dies führt jedoch dazu, daß die Anionen in der Zone S gemäß ihrer Beweglichkeit getrennt werden, sodaß die Ionen C₁", welche die. größere Beweglichkeit besitzen, eine Zone bilden, die dem leiterelektrolyten am näohsten ist, woraufhin eine Zone aus dp"* und schließlich eine Zone aus CU^- folgt, welch letztere dem Endelektrolyten am nächsteh ist

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(siehe Fig. 1b). Natürlich ergeben sich entsprechende Bedingungen bei der Trennung von Kationen.

In Pig. 2 bezeichnet die Bezugsziffer 4 eine Säule aus einem Kapillarrohr, In welchem die Trennung ausgeführt wird. Die Bezugszahl 5 bezeichnet die eine Elektrode, welche sich in einem Elektrodengefäß 6 befindet, welches mit Leiterelektrolyt gefüllt ist. Es sei angenommen, daß die Wanderung, welohe die Trennung vollzieht, in Richtung des Pfeiles erfolgt. Die Bezugszahl 7 bezeichnet die andere Elektrode, welche in einem Elektrodengefäß enthalten ist, welches den Endelektroiyten enthält. Derjenige Teil der Säule, welcher sich zwischen der Probe und dem Elektrodengefäß 6 befindet, enthält den Leiterelektrolyten während jener Teil der Säule, welcher sich zwischen der Probe und dem Elektrodengefäß 8 befindet, den Endelektrolyten enthält. Die Säule ist gegen die Elektrodengefäße durch semipermeable Membranen 9 bzw. 10 abgegrenzt. Die Elektroden 5 und 7 sind mit einer in der Zeichnung nicht gezeigten Spannungsquelle verbunden. Die Bezugszahl bezeichnet einen Kühlmantel, welcher einen Kühlkanal 12 bildet, der die Säule umschließt. Der Kühlkanal 12 enthält ein fließfähiges Kühlmedium. Die Bezugszahl 13 bezeichnet eine Lichtwegvorrichtung mit einem Liohtweg 14» der die Säule von einer in der Zeichnung nicht gezeigten Lichtquelle her, welche auf der einen Seite des Kühlmantels gelagert ist, zu einem ebenfalls in der Zeichnung nicht gezeigten photometrischen Anzeiger, der auf der anderen Seite des Kühlmantels gelagert ist, durchquert. In dichter Annäherung des Lichtweges zweigt von der Säule ein Shuntrohr 15 ab. Das Shuntrohr ist durch einen Zylinder 16 aus Plexiglas oder dergleichen mechanisch stabilisiert, wobei der Zylinder durch den Kühlmantel 11 durch die Öffnung 17 hindurch geführt ist. Zwischen dem Kühlmantel und dem Zylinder ist eine Dichtung 18 angebracht. An demjenigen Teil der Säule, welcher sich zwischem dem Lichtweg 14 und dem Elektrodengefäß 6 befindet, ist eine Pumpe 19 angeordnet. An demjenigen Teil der Säule, welcher sich zwischem dem Anzeiger und dem Elektrolytgefäß 8 befindet, ist eine Probeneinspritzvorrichtung 20 angeordnet. Die

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Bezugszahl 21 bezeichnet einen Streifen Filterpapier, welcher über in der Fig. nicht gezeigte Rollen läuft, wobei dieser Streifen eine Samme!vorrichtung für die^;erhaltenen Probenkomponenten bildet.

Bei einer präparativen isotachophoretisohen Trennung wird das ProbengemiBch in die Säule an der Probeneinspritzvorrichtung 20 eingeführt, welche als Scheidewand ausgebildet sein kann, die durch eine Injektionsspritze durohstoßen wird. Dann sollte nach allgemeiner Regel der Leiterelektrolyt in die Säule zwischen der Probe und der Membrane 9» sowie der Bndelektrolyt zwischen der Probe und der Membrane 10 eingeführt werden. Das äußere Ende des Shuntrohres 15 wird dann durch einen Deokel geschlossen, welcher in der Zeichnung nicht gezeigt ist. An die Elektroden 5 und 7 wird Spannung angelegt und die Probenkomponenten wandern isotachophoretisch in Richtung auf die Iiichtwegvorriohtung 13 zu. Wenn der zur Verfügung stehende Wanderungsabstand zu kurz ist, so kann die Trennung mittels eines öegenstromes vollzogen werden, welcher durch die Pumpe 19 gemäß der obigen deutschen Patentschrift 2 127 391 erzeugt wird. Bevor die Probenzonen den Anzeiger passiert haben, wird der Deckel des Shuntrohres 15 abgehoben und die Pumpe 19 beim Zuführen des Streifens 21 in Gang gesetzt. Unmittelbar nach dem Nachweis werden die Probenkomponentenzonen durch das Shuntrohr 15 herausgeführt. Es ist bevorzugt, daß das Shuntrohr einen geringeren Querschnitt besitzt als die Säule.

Das Material, welches durch das Shuntrohr hindurch herausgeführt wird, wird durch eine geeignete Sammelvorrichtung gesammelt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorriohtung besteht die Sammeleinrichtung aus einem Träger, welcher mit gegebener Geschwindigkeit am äußeren Ende des Shuntrohres vorbeigeführt wird und einem zwisohen dem Ende des Rohres und dem Träger befindlichen Luftspalt. Der Träger besteht zweckmäßig aus einem Streifen porösen Materials, beispielsweise Filterpapier, welches geeigneten Zufuhrrollen zugeliefert wird. Da isotachophoretische Bedingungen während des Austretens der Proben-

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komponenten vorliegen sollten, ist zwisohen den Elektroden 5 und 7 Spannung angelegt, welche eine Potentialdifferenz zwischen dem Träger in der Sammelvorrichtung und dem äußeren Ende des Shuntrohres herbeiführt· Bei einer bestimmten !Tropfengröße, welche von der Potentialdifferenz und der Breite des Luftapaltes abhängig ist, springt der gebildete Tropfen auf den Träger über und bildet auf diesem einen kreisförmigen Fleck.

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Claims

24541 Patentansprüche

1. Vorrichtung zur isotachophoretischen Trennung, welche eine Säule aufweist, die aus einem Kapillarrohr besteht, welches zwischen zwei Elektroden angeordnet ist, wobei die der Trennung unterworfene Probe in die Säule zwischen Leit- und Bndelektrolyte eingeführt wird und ein Anzeiger zum Nachweis unterschiedlicher Probezonen in einer Stellung längs der Säule angeordnet ist, gekennzeichnet durch ein Shuntrohr (15), welches sich von der Säule (4) in enger Nachbarschaft der Lage des Anzeigers gabelt, wobei das Shuntrohr (15) einen geringeren Durchmesser besitzt als die Säule (4)und ein offenes äußeres Ende aufweist, welches mit einem verschließbaren Deckel versehen ist, sowie Mittel zum Schaffen eines Stromes des Leitelektrolyten in Richtung auf. die Probezonen zu.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Sammelvorrichtung für die Probezonen vorgesehen ist, welche am äußeren Ende des Shuntrohres (15)angeordnet ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Sammelvorrichtung einen"Träger aufweist, welcher mit bestimmter Geschwindigkeit am äußeren Ende des Shuntrohres (15) vorbeigeführt wird und ein Luftspalt zwischen dem Bohrende und dem Träger vorgesehen ist, wobei ein elektrisches Potential zwischen dem Rohrende und dem Träger aufrecht erhalten ist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus einem Filterpapierstreifen(21) besteht.

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