DE1517927B2 - Vorrichtung zur dichtegradienten elektrophorse - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft eine verbesserte Vorrichtung irisches Feld angelegt, und die Teilchen wandern in

zur Dichtegradienten-Elektrophorese, welche eine einer Richtung und mit einer Geschwindigkeit, die

Abtrennung und Isolierung von gelösten Bestand- von ihrer elektrophoretischen Beweglichkeit abhängt,

teilen komplexer Mischungen gestattet. Bei dieser Methode wird das zu trennende Material

Die Elektrophorese beruht auf der Wanderung von 5 als schmales Band in das Gel eingebracht und nicht geladenen Teilchen unter der Einwirkung eines elek- gleichmäßig durch das Gel verteilt. Diese Methode frischen Feldes und kann zur Auftrennung von liefert daher Banden oder Zonen der je nach dem Stoffgemischen auf Grund der verschiedenen Beweg- Vorzeichen ihrer elektrophoretischen Beweglichkeit lichkeit der Teilchen benutzt werden. Im allgemeinen aufwärts oder abwärts wandernden Stoffe. Diese erfolgt die Auftrennung an einer in einem leitenden io Arbeitsweise hat den Vorteil, daß die Beeinträch-Medium suspendierten oder gelösten flüssigen Probe. tigung der Auflösung infolge von Diffusionseffekten Beim Anlegen eines elektrischen Feldes an das im wesentlichen ausgeschaltet wird. Bei Aufgabe der Trägermedium wandern die Teilchen des zu trennen- Probe in der Mitte der Gelsäule ist ferner eine gleichden Materials in eine vom Vorzeichen ihrer elek- zeitige Trennung von Materialien mit positiven und irischen Ladung abhängigen Richtung, wobei die 15 negativen Beweglichkeiten möglich. Andererseits Wanderungsgeschwindigkeit der Ladung direkt eignet sich diese Arbeitsweise nicht für eine Überproportional und den Reibungskräften umgekehrt wachung der Abtrennung während des laufenden proportional ist. Die Reibungskräfte, welche die Teil- Verfahrens. Die Lage der verschiedenen Teilchenchen im umgebenden Medium stationär zu halten zonen kann nach der Trennung durch geeignete suchen, hängen von der Form und Größe der Teil- ao Methoden, beispielsweise die Lichtabsorption bechen ab. stimmt werden; jedoch lassen sich solche Messungen

Es sind bereits verschiedene Methoden zur Durch- kaum während der laufenden elektrophoretischen

führung elektrophoretischer Trennungen bekannt- Trennung durchführen. Ein weiterer Nachteil besteht

geworden. Bei der klassischen Methode mit wandern- - darin, daß die Wanderungsgeschwfndigkeit auch von

den Grenzflächen wird von einer gleichmäßigen 25 Absorptions- und Desorptionseffekten zwischen den

Mischung des zu trennenden Materials mit einem zu trennenden Teilchen und dem Trägergel abhängt.

Trägermedium, gewöhnlich Wasser mit einem Gehalt Die Wanderungsgeschwindigkeiten der Teilchen sind

an Puffersalzen ausgegangen. Das Medium wird in somit nicht notwendigerweise ihrer elektrophore-

ein senkrechtes Rohr eingebracht und mittels am tischen Beweglichkeit proportional. Dies stellt bei der

Rohr angebrachter Elektroden ein elektrisches Feld 30 Messung elektrophoretischer Beweglichkeiten einen

angelegt. Zur Aufrechterhaltung des hydrostatischen erheblichen Nachteil dar.

Gleichgewichtes und zur Vermeidung des Durch- Ein weiteres bekanntes Verfahren ist die sotretens von an den Elektroden gebildeten Bläschen genannte Dichtegradienten-Elektrophorese. Diese durch den zu beobachtenden Bereich ist das Rohr Arbeitsweise hat zwar gewisse Ähnlichkeit mit der U-förmig gebogen. Im Verlaufe der Trennung 35 Gelsäulenmethode, jedoch wird dabei an Stelle einer wandern die einzelnen Bestandteile der Probe mit ver- Gelsäule eine Dichtegradientensäule als Trägerschiedenen, von ihrer elektrophoretischen Beweglich- medium verwendet. Die Vorteile dieses Verfahrens keit abhängenden Geschwindigkeiten durch das beruhen insbesondere auf der Tatsache, daß die Trägermedium abwärts. Dabei bildet sich am oberen Wanderungsgeschwindigkeit der Banden oder Zonen Ende jeder sich abwärts bewegenden Säule von 40 der Teilchen aus deren elektrophoretischer Beweg-Einzelteilchen einer bestimmten Art eine Grenzfläche lichkeit berechnet werden kann,
aus. Wenn das das Trägermedium enthaltende Rohr *Die bekannten Vorrichtungen zur Dichteaus durchsichtigem Material besteht, kann man das gradienten-Elektrophorese gestatten jedoch nur nach obere Ende der abwärts wandernden Säule nach beendeter Trennung und Entfernung der Dichtedem Brechungsindexgradienten-Verfahren bestim- 45 gradientensäule aus der Apparatur eine Bestimmung men. Dieses Verfahren hat jedoch unter anderem der endgültigen Lage der Zonen und nicht eine Überzwei schwerwiegende Nachteile. Einerseits ist der wachung der Lage der Zonen während der Durch-Konzentrationsbereich der einzelnen Teilchenarten führung der Trennung.

begrenzt, da zur Aufrechterhaltung einer stabilen Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine ve£ Grenzfläche die unter dieser liegende Flüssigkeit eine 50 besserte Vorrichtung zur Dichtegradienten-Elektrohöhere Dichte besitzen muß als die Flüssigkeit ober- phorese anzugeben, welche die vorstehend erwähnten halb der Grenzfläche. Die Konzentration muß daher Nachteile vermeidet und sowohl eine bequeme Eingenügend hoch sein, so daß die Dichte der Flüssigkeit führung der Dichtegradientensäule und der Probe in unterhalb der Grenzfläche merklich größer ist als die die Apparatur als auch ein getrenntes Abziehen der Trägerflüssigkeit oberhalb der Grenzfläche. Dies stellt 55 Fraktionen nach der Durchführung des elektroinfolge der Agglomeration der Probeteilchen bei phoretischen Verfahrens ermöglicht,
hohen Konzentrationen häufig eine Schwierigkeit dar. Diese Aufgabe wird mit einer Vorrichtung zur Andererseits verwischen sich die Grenzflächen leicht Dichtegradienten-Elektrophorese mit einem vertikal infolge der Diffusion der Teilchen. Schließlich ist es angeordneten Rohr aus elektrisch isolierendem Maauch schwierig, die Vorrichtung so anzuordnen, daß 60 terial zur Aufnahme einer Dichtegradientenflüssigkeit man die Wanderung von sowohl aufwärts als auch und Vorrichtungen zur Erzeugung eines elektrischen abwärts wandernden Grenzflächen untersuchen kann. Feldes zwischen mit axialem Abstand voneinander im

Eine weitere bekannte Methode wird im allge- Rohr gelegenen Punkten dadurch gelöst, daß die

meinen als Gelsäulen-Elektrophorese bezeichnet. Bei Elektroden zur Erzeugung des elektrischen Feldes

dieser Anordnung wird die Probe am oberen oder 65 jeweils in durch semipermeable Membranen vom

unteren Ende oder in der Mitte einer leitfähigen Innenraum des Rohres getrennte Elektrolytgefäße

Säule aus einem halbfesten Gel aufgegeben. Am eingetaucht sind und daß eine Vorrichtung zur rever-

oberen und unteren Ende des Geles wird ein elek- siblen Verschiebung der Dichtegradientenflüssigkeit

mittels einer Verdrängungsflüssigkeit relativ zu einem bestimmten Rohrabschnitt vorgesehen ist.

Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird also das vertikal angeordnete Rohr mit einer Dichtegradientenflüssigkeit beschickt, und im unteren Teil des Rohres wird an die Dichtegradientenflüssigkeit anschließend eine dichte Verdrängungsflüssigkeit eingebracht. Die Elektroden tauchen in elektrolytische Lösungen ein, die von dem Rohr durch semipermeable Membranen getrennt sind, so daß durch diese ein Ionenstrom hindurchtreten kann. Zur Fraktionierung einer Testsubstanz in ihre Bestandteile werden die Elektroden an eine Gleichstromquelle angeschlossen, so daß durch die Flüssigkeitssäule ein Strom fließt. Hierdurch wird eine Wanderung der Teilchen der Testsubstanz erzeugt, wobei die Wanderungsgeschwindigkeit der elektrophoretischen Beweglichkeit der Teilchen entspricht. Während der Wanderung sammeln sich die Teilchen mit ähnlicher elektrophoretischer Beweglichkeit in Zonen.

In einer Ausgestaltung der Erfindung ist am Rohr zwischen den den beiden Elektroden zugeordneten Membranen eine auf die Konzentration der im Rohr enthaltenen Flüssigkeit ansprechende Vorrichtung angeordnet, so daß das Ausmaß der Fraktionierung der Testsubstanz in den Zonen beobachtet werden kann.

Diese auf die Konzentration der Flüssigkeit ansprechende Vorrichtung enthält vorzugsweise einen Lichtwandler sowie eine Lichtquelle, deren Licht durch im Rohr vorgesehene Lichtdurchlässe hindurch auf den Lichtwandler fällt. Damit ist eine photometrische Ausmessung der fraktionierten Dichtegradientenflüssigkeit möglich.

Besonders exakte Meßergebnisse lassen sich mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung erzielen, wenn die Innenwand des Rohres aus einem nicht benetzbaren Material besteht.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand der Ausführungsbeispiele zeigenden Figuren näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 einen senkrechten, zentrischen Querschnitt durch eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung,

F i g. 2 einen vergrößerten Teilausschnitt des mittleren Teiles der in F i g. 1 dargestellten Vorrichtung,

F i g. 3 eine vereinfachte Darstellung gemäß F i g. 1 zur Erläuterung der Lage der verschiedenen Flüssigkeitssäulen in einer Stufe des Elektrophoreseverfahrens,

F i g. 4 eine weitere vereinfachte Darstellung der Vorrichtung gemäß F i g. 1 zur Erläuterung der Lage der verschiedenen Flüssigkeitssäulen während einer anderen Stufe des Elektrophoreseverfahrens und

F i g. 5 eine schematische Darstellung der Gesamtanordnung der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung.

Die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung enthält ein senkrechtes Rohr 10 aus einem Material mit guter Wärmeleitfähigkeit, beispielsweise Aluminium. Die Innenwand des Rohres 10 ist durch zwei zueinander axial ausgerichtete Rohre 11 und 11' aus einem geeigneten, im wesentlichen nicht benetzbaren, keinen Wasserfilm absorbierenden und elektrisch nichtleitenden Kunststoff, beispielsweise Polypropylen, ausgekleidet. Die elektrophoretische Trennung der Testsubstanz erfolgt in den Rohren 11 und 11', wie weiter unten im einzelnen beschrieben wird. Das äußere Metallrohr 10 ist durch eine mittlere Öffnung eines Metallblockes 12 geführt. Zur Abdichtung sind Dichtungsringe 13 vorgesehen. Der Block 12 besteht ebenfalls aus einem Material mit guter Wärmeleitfähigkeit, beispielsweise Aluminium, und besitzt in seinen gegenüberliegenden Wandungen zueinander ausgerichtete Öffnungen 15 und 15'. Die Öffnung 15 führt zu einer Bohrung größeren Durchmessers zur Aufnahme einer Lichtquelle, vorzugsweise eines

ίο Teiles einer Lampe 16, die zweckmäßig an elastischen Polstern 17 anliegen kann, um eine gleichbleibende Orientierung der Lichtquelle relativ zum optischen System aufrechtzuerhalten. Zur Abdeckung der Lampe 16 ist zweckmäßig am Metallblock 17 ein Gehäuse 18 mit geeigneten Mitteln befestigt, welches vorteilhaft Öffnungen zur Wärmeabfuhr aufweist.

Wie insbesondere aus F i g. 2 zu ersehen ist, sind an gegenüberliegenden Stellen der Wandung des Metallrohres 10 Öffnungen 20 und 20' vorgesehen,.

welche mit den öffnungen 15 und 15' im Block 12 verbunden sind. Zwischen den einander zugewandten Enden der Rohre 11 und 11' ist ein ringförmiges Quarzfenster 21 eingesetzt. In die mit einem Innengewinde versehene Öffnung 15' ist ein mit einem "entsprechenden Außengewinde versehenes Metallgehäuse 22 mit einer auf die Öffnung 20' ausgerichteten Bohrung 25, einem dahinter angeordneten Lichtfilter 23 und einer Photozelle 24 eingeschraubt. Das Licht der Lampe 16 kann daher durch die Öffnung 20, das Quarzfenster 21, die Öffnungen 20' und 25 und das Lichtfilter 23 auf die Photozelle 24 fallen.

Im oberen Teil der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung ist ein Rohr (27) aus durchsichtigem, von Wasser nicht benetzbarem Kunststoff, beispielsweise Polycarbonat, mit seinem unteren Ende durch eine zentrische Öffnung in einem oberen Halterungsteil 29 vorzugsweise aus durchsichtigem, nichtleitendem Kunststoff, beispielsweise Polymethylmethacrylat geführt. Zur Dichtung sind Dichtringe 28 vorgesehen. Die Rohre 11 und 27 haben den gleichen Innendurchmesser und stoßen mit ihren Enden unmittelbar aufeinander. Im unteren Abschnitt des Rohres 27 sind vier in einem Winkelabstand von 90° angeordnete Öffnungen 30 vorgesehen, deren jede über entsprechende radiale Hohlräume 31 mit radialen Öffnungen 32 in der Außenwand des Halterungsteiles 29 in Verbindung steht. Am Halterungsteil 29 ist eine ringförmige zylindrische Wanne 34, vorzugsweise aus durchsichtigem, nichtleitendem Kunststoff befestigt, welche eine Puffersalzlösung 35 enthält, in die eine obere Elektrode 36 eintaucht. Durch Entlüftungsöffnungen 37 im Halterungsteil 29 kann die Luft beim Einfüllen der Puffersalzlösung 35 aus den Hohlräumen 31 entweichen, so daß diese vollständig mit der Puffersalzlösung gefüllt sind. Die Öffnungen 30 im Rohr 27 sind durch eine rohrförmige, semipermeable Membran 38, beispielsweise aus Cellophan abgedeckt. Der Ionenstrom von der Elektrode 35 wird durch die Puffersalzlösung geleitet und tritt durch die Membran 38 hindurch in die im Rohr 27 enthaltene Flüssigkeit über. Die Membran 38 dient dazu, eine Flüssigkeitsströmung zwischen dem Rohr 27 und der Puffersalzlösung 35 zu verhindern. Das Rohr 27 nimmt die Dichtegradientensäule auf und bietet den notwendigen Raum für eine elektrisch leitende Abdeckflüssigkeit oberhalb der Dichtegradientensäule.

Das obere Ende des Halterungsteiles 29 hat einen

geringeren Durchmesser und trägt ein Gewinde zur Aufnahme des mit einem Gewinde versehenen Endes eines Kühlmantelrohres 40 aus durchsichtigem Kunststoff. Auf das obere Ende des Rohres 27 ist ein Kappenteil 41 aufgeschraubt, welcher eine mittlere Bohrung für das obere Ende des Rohres 27 und eine Schlauchtülle 42 aufweist. In die Mittelbohrung des Kappenteiles 41 ist ein Rohranschlußstück 43 eingeschraubt. Ein ähnliches Kühlmantelrohr 44 aus durchsichtigem Kunststoff ist mit seinen Enden auf den verjüngten Endabschnitten des Blockes 12 und des Halterungsteiles 29 befestigt. Das Halterungsteil 29 besitzt ferner eine Mehrzahl von in Längsrichtung durchlaufenden Rohren 45 zum Durchtritt der Kühlflüssigkeit.

Im unteren Teil der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung ist in ähnlicher Weise ein dem Rohr 27 entsprechendes Kunststoffrohr 47 angeordnet, dessen mit einem Außengewinde versehenes Unterteil in einer mit einem Gewinde versehenen mittleren Öffnung in einem unteren Halterungsteil 50 festliegt, das zweckmäßig aus dem gleichen Material besteht wie das obere Halterungsteil 29. In der Wandung des Rohres 47 sind ebenfalls vier Öffnungen 51 vorgesehen, deren jede normalerweise über einen entsprechenden Hohlraum 52 mit einer radialen Öffnung 53 in Verbindung steht. Die Öffnungen 51 sind ebenfalls durch eine rohrförmige, semipermeable Membran 55 abgedeckt. Das Halterungsteil 50 trägt einen inneren ringförmigen zylindrischen Trog 56 mit einer Mehrzahl von in dessen Außenwandung angeordneten Öffnungen 57, deren jede durch eine semipermeable Membran 58 verschlossen ist. Der Trog 56 enthält eine Puffersalzlösung 59 und ist an seiner Außenseite von einem zweiten ringförmigen zylindrischen Trog 60 umgeben, welcher eine Puffersalzlösung 61 enthält, in die eine Elektrode 46 eintaucht. Die Hohlräume 52 im Halterungsteil 50 stehen miteinander in Verbindung und weisen eine Entlüftungsöffnung 62 auf, um eine vollständige Füllung mit der Puffersalzlösung 59 sicherzustellen. ""Die Zwischenschaltung eines inneren Troges 56 ist deswegen erforderlich, weil die hohe Konzentration der dichten Lösung im Rohr 47 auf der Höhe der Öffnungen 51 sonst eine osmotische Strömung aus dem Trog 56 in das Rohr 47 verursachen würde, wenn nicht die Konzentration des Gelösten auch im Trog 56 hoch ist. Da eine derart hohe Konzentration jedoch leicht zu einer Verschmutzung der Elektroden

46 führt, wird die dichte Puffersalzlösung im inneren Trog 56 durch eine Membran 58 von einer Puffersalzlösung 61 geringerer Dichte getrennt. Im Vergleich zu einer osmotischen Strömung durch die Membran 38 am oberen Rohr 27 ist eine osmotische Strömung durch die Membran 55 am unteren Rohr

47 störend, da sie die Lage der Dichtegradientensäule innerhalb der Rohre 11 und 11' verändert. Demgegenüber wird durch eine osmotische Strömung durch die obere Membran 38 nicht die Stellung der Dichtegradientensäule, sondern lediglich die Höhe der auf der Dichtegradientensäule aufsitzenden Flüssigkeit geringerer Dichte beeinflußt. Zur Sicherstellung der photometrischen Ausmessung der Lage der getrennten Banden mittels des von der Lampe 16 durch das Quarzfenster 21 und das Lichtfilter 23 auf die Photozelle 24 fallenden Lichtes darf die Stellung der Dichtegradientensäule nicht verändert werden. Zur Verhinderung einer umgekehrten osmotischen Strömung durch die untere Membran 55 infolge des Druckes der Flüssigkeitssäule kann man die Konzentration des Gelösten im inneren Trog 56 niedriger halten als in der Flüssigkeit im Rohr 47. Dies erzeugt ein osmotisches Druckgefälle an der Membran 55, welche den Druck der Flüssigkeitssäule im Rohr 47 ausgleicht.

Zwischen dem unteren Halterungsteil 50 und dem Metallblock 12 ist ebenfalls ein Kühlmantelrohr 64

ίο angeordnet. Der Mantelraum steht über innere Durchlässe im Halterungsteil 50 mit einer an diesem befestigten Schlauchtülle 65 in Verbindung. Die Mantelrohre 40, 44 und 64 bestehen zweckmäßig aus dem gleichen Material. Während des Betriebes der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird zweckmäßig eine Kühlflüssigkeit, insbesondere Eiswasser durch die Kühlmantel geleitet. Der Metallblock 12 weist zu diesem Zweck ebenfalls in Längsrichtung verlaufende Durchlässe 66 auf. Das untere Ende des Rohres 47 endet in einem Leitungsanschlußteil 67.

Zur Beschickung der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann das mittlere Rohr zunächst durch das untere Anschlußteil 67 bis zur Höhe L mit einer _ Flüssigkeit hoher Dichte gefüllt werden. "Nach Abnehmen des oberen Anschlußteiles 43 kann die Dichtegradientenflüssigkeit auf die dichte Trägerfiüssigkeit aufpipettiert werden. Wenn die Flüssigkeitshöhe der Dichtegradientenflüssigkeit etwa die Mitte des Rohres 27 erreicht, wird die Pipette entfernt und zunächst eine Testlösung oder Suspensions eingeführt, die hinreichende Mengen an Gelöstem enthält, so daß ihre Dichte etwas geringer ist, als diejenige der unmittelbar darunterliegenden Dichtegradientensäule. Die Pipette zur Einführung der Testlösung wird entfernt und auf die Probe eine weitere Dichtegradientensäule aufgebracht, die in ihrem unteren Teil eine Dichte besitzt, die geringfügig kleiner ist, als die Dichte der Testlösung. Die obere Grenzfläche dieser Dichtegradientensäule entspricht dem Meniskus M.

Als nächstes wird durch das untere Anschlußteil 67 eine hinreichende Menge der dichten Trägerflüssigkeit abgezogen, so daß die Dichtegradientensäule und die Testlösung in die in F i g. 3 dargestellte Stellung gelangen. Fig. 3 entspricht der Fig. 1, wobei jedoch die Schraffierung und gewisse zum Verständnis unwesentliche Teile fortgelassen wurden. Anschließend wird über die Dichtegradientensäule eine Schicht einer Pufferlösung mit geringerer Dichte aufpipettiert. Nachdem die Tröge 34, 56 und 60 mit elektrisch leitenden Puffersalzlösungen gefüllt wurden, wird durch Anlegen eines Potentials an die Elektroden 36 und 46 in der Dichtegradientensäule ein elektrisches Feld erzeugt. Soweit sich in der Umgebung der Elektroden Bläschen bilden, werden diese durch die semipermeablen Membranen 38, 55 und 58 an einer Beeinträchtigung der Dichtegradientensäule im mittleren Rohr gehindert.

Nach einer zur teilweisen elektrophoretischen Auftrennung der Testlösung hinreichenden Zeit wird das Potential von den Elektroden abgeschaltet und die dichte Trägerflüssigkeit durch das Anschlußteil 67 langsam abgezogen. Auf diese Weise wird die Dichtegradientensäule mit den teilweise getrennten Zonen der Testlösung abwärts durch den Lichtstrahl der aus der Lampe 16, dem Filter 23 und der Photozelle 24 sowie einem geeigneten Anzeigegerät bestehenden Vorrichtung zur Messung der Lichtabsorption hin-

Claims (11)

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durch bewegt. Die gemessenen Absorptionswerte 60 eintauchenden Elektroden sind an eine Gleichkönnen durch ein Aufzeichnungsgerät in Form eines stromquelle 80 angeschlossen, die die erforderliche Diagrammes aufgezeichnet werden, in welchem die Spannung und Stromstärke zur Erzeugung eines Lichtabsorption und damit die Konzentration der elektrischen Feldes in der Dichtegradientensäule fraktionierten Zonen gegen deren Lage in der Dichte- 5 liefert. In eine Leitung 34 zwischen dem Dreiwegegradientensäule aufgetragen ist. hahn 75 und einer herkömmlichen Gradientenbil-

Die Stellung der Dichtegradientensäule nach dem dungsvorrichtung 85 ist eine durch einen Motor 83 ersten Durchgang durch das optische System ist in angetriebene Pumpe 82 eingebaut. Dieses System F i g. 4 dargestellt. Bei Erreichen dieser Stellung kann zur Einführung der Dichtegradientenflüssigkeit wird die Pumpe zum Abziehen der dichten Träger- io in den Mittelteil des Rohres dienen, anstatt diese in flüssigkeit stillgesetzt und an die Dichtegradienten- der weiter oben beschriebenen Weise auf die dichte kolonne erneut das elektrische Feld angeschlossen. Trägerflüssigkeit aufzupipettieren.
Nach einer hinreichenden Zeit weiterer Wanderung Zur Inbetriebnahme der Vorrichtung wird zu- und Auftrennung wird das elektrische Feld wieder nächst der Dreiwegehahn 75 so eingestellt, daß er die abgeschaltet und mittels der Pumpe durch das An- 15 Leitungen 84 und 76 verbindet. Wenn mittels des schlußteil 67 weitere dichte Trägerflüssigkeit in den Motors 83 die Hälfte des gewünschten Volumens an unteren Teil des mittleren Rohres eingedrückt. Hier- Dichtegradientenflüssigkeit in die Leitung 76 eingedurch wird die weiter fraktionierte Dichtegradienten- führt wurde, wird mittels eines Motors 86 und einer kolonne erneut langsam an der photometrischen Meß- Nockenscheibe 87 die Testlösung aus einer Kolbenanordnung vorbei aufwärts in die in F i g. 3 darge- 20 vorrichtung 88 in die Leitung 76 gedrückt. Die stellte Stellung verschoben. Während dieser Ver- Nockenscheibe 87 ist vorzugsweise so geformt, daß Schiebung zeichnet das Meßgerät erneut die Lage der die Verschiebungsgeschwindigkeit des Kolbens 88 in einzelnen Zonen in der Dichtegradientensäule auf. der Anfangsphase größer ist, als in der Endphase. Diese Bestimmung der Lage der Zonen in der Dichte- Dies trägt dazu bei, an der Grenzfläche unterhalb der gradientensäule durch abwechselnde Auf- und Ab- 25 Testlösungszone die Bildung eines umgekehrten wärtsbewegung derselben infolge der Zu- oder Dichtegradienten zu verhindern. Statt dessen kann die Abfuhr von dichter Trägerflüssigkeit kann beliebig oft Bildung eines instabilen, umgekehrten Dichtewiederholt werden. Sobald das Aufzeichnungsgerät gradienten an dieser Stelle auch durch Steigerung des eine hinreichende Auftrennung anzeigt, kann mittels durch die Vorrichtung 85 erzeugten Gradienten der Pumpe soviel weitere dichte Trägerflüssigkeit 30 während der Einführung der Testsubstanz in die in das Mittelrohr eingeführt werden, daß die Dichte- Leitung 76 gering gehalten werden. Die Leitung 77 gradientensäule durch das obere Anschlußstück 43 wird durch einen von einem Motor 89 exzentrisch hinaus gedrückt und zweckmäßig über ein Verteiler- angetriebenen Arm 90 in Vibration versetzt und zurohr in die Auffanggefäße eines herkömmlichen sammengedrückt, um eine gleichmäßige Vermischung Fraktionssammlers geleitet wird. 35 der Testlösung und der Dichtegradientenflüssigkeit

Zur Kühlung der Flüssigkeit im mittleren Rohr auf ihrem Wege zum mittleren Rohr der erfindungskann, wie schon erwähnt, durch den Mantel eine gemäßen Vorrichtung zu erzielen.
Kühlflüssigkeit, insbesondere Eiswasser geleitet Nach Einführung einer hinreichenden Menge an werden. Dies ist zweckmäßig, da der durch die Flüs- Testlösung in die Leitung 76 wird der Motor 86 absigkeitssäule fließende Strom eine Aufheizwirkung 40 geschaltet, während die Vorrichtung 85 bis zur Verbesitzt, welche ohne Kühlung zur Bildung von heißen vollständigung der Dichtegradientensäule weiterläuft. Stellen führen würde, welche eine Konvektionsströ- Dann wird der Dreiwegehahn 75 in die in F i g. 5 darmung innerhalb des Rohres verursachen und dadurch gestellte Stellung gedreht und mittels der Kolbenvordie Reinheit der getrennten Zonen beeinträchtigen richtung 72 eine Flüssigkeit hoher Dichte zugeführt, würde. Die durch die Schlauchtülle 65 zugeführte 45 bis die Dichtegradientensäule die in F i g. 3 darge-Kühlflüssigkeit zirkuliert durch das untere Halte- stellte Stellung erreicht hat. Die zur Erzeugung eines rungsteil 50, welches die Membran 55 umgibt, durch elektrischen Kontaktes mit der im oberen Trog 34 die senkrechten Öffnungen 66, in dem die Photozelle enthaltenen Puffersalzlösung über der Dichte- und die Lichtquelle beherbergenden Metallblock 12 gradientensäule aufzubringende Flüssigkeit geringerer und die senkrechten Durchlässe 45 im Halterungsteil 50 Dichte kann durch die obere Öffnung der Apparatur 29, welches die Membran 38 umgibt und strömt von Hand aufpipettiert oder durch eine geeignete dann durch die Schlauchtülle 42 ab. Die den äußeren Programmierung der Apparatur 85 zur Erzeugung Teil des Flüssigkeitsmantels bildenden Teile bestehen des Dicbtegradienten oder durch eine weitere in die vorteilhaft aus durchsichtigem Kunststoff. Leitung 76 fördernde, motorbetriebene Kolbenvor-

F i g. 5 zeigt eine schematische Darstellung der 55 richtung zugeführt werden.
Gesamtanordnung der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei welcher die aus dem oberen Anschlußteil

43 austretende Flüssigkeit mittels eines Verteiler- Patentansprücherohres 71 in die Auffanggefäße eines herkömmlichen

Fraktionssammlers 70 überführt wird. Eine durch 60

einen Motor 73 mit umkehrbarer Drehrichtung ange- 1. Vorrichtung zur Dichtegradienten-Elektrotriebene Kolbenvorrichtung 72 mit zugehöriger Leit- phorese mit einem vertikal angeordneten Rohr spindel 74 fördert die dichte Trägerflüssigkeit über aus elektrisch isolierendem Material zur Aufeinen Dreiwegehahn 75 und Leitungen 76 und 77 nähme einer Dichtegradientenflüssigkeit und zum unteren Anschlußteil 67 der erfindungsgemäßen 65 Vorrichtungen zur Erzeugung eines elektrischen Vorrichtung. Die Photozelle 24 ist über einen ge- Feldes zwischen mit axialem Abstand voneineigneten Verstärker 79 mit einem Aufzeichnungsgerät ander im Rohr gelegenen Punkten, dadurch 78 verbunden. Die in die zylindrischen Tröge34 und gekennzeichnet, daß die Elektroden (36;

46) zur Erzeugung des elektrischen Feldes jeweils in durch semipermeable Membranen (38; 55) vom Innenraum des Rohres (11, 11', 27, 47) getrennte Elektrolytgefäße (34; 56) eingetaucht sind und daß eine Vorrichtung zur reversiblen Verschiebung der Dichtegradientenflüssigkeit mittels einer Verdrängungsflüssigkeit relativ zu einem bestimmten Rohrabschnitt vorgesehen ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß am Rohr (11, 11', 27, 47) zwischen den den beiden Elektroden (36, 46) zugeordneten Membranen (38, 55) eine auf die Konzentration der im Rohr enthaltenen Flüssigkeit ansprechende Vorrichtung (16, 24) angeordnet ist.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Innenwand des Rohres (11, 11', 27, 47) aus einem nicht benetzbaren Material besteht.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die untere Elektrode (46) in ein Elektrolytgefäß (60) eingetaucht ist, das über eine semipermeable Membran (38) mit einem inneren, über eine semipermeable Membran (55) mit dem Rohrinnenraum verbundenes Elektrolytgefäß (56) verbunden ist.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die auf die Konzentration der Flüssigkeit ansprechende Vorrichtung einen Lichtwandler (24) sowie eine Lichtquelle aufweist, deren Licht durch im Rohr (11, 11', 27, 47) vorgesehene Lichtdurchlässe (20, 20') hindurch auf den Lichtwandler (24) fällt.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtdurchlässe (20, 20') aus Quarzfenstern, insbesondere aus einem Quarzring (21) bestehen.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch einen über ein Abnahmerohr (71) mit dem oberen Ende (27) des Rohres verbundenen Fraktionssammler (70) zum Auffangen der durch die Verdrängungsflüssigkeit herausgedrückten Fraktionen.

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet durch einen Behälter (88) für eine die zu fraktionierende Substanz enthaltende Flüssigkeit, durch Vorrichtungen (85) zur Bildung einer Dichtegradientenflüssigkeit, durch Vorrichtungen (83, 86) zur gesteuerten Zufuhr von Dichtegradientenflüssigkeit und testsubstanzhaltiger Flüssigkeit in das untere Ende (47) des Rohres sowie durch Vorrichtungen (89, 90) zum Vermischen der testsubstanzhaltigen Flüssigkeit und der Dichtegradientenflüssigkeit vor deren Einführung^

9. Vorrichtung nach einem der_ Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch Vorrichtungen (87) zur Steuerung der Zufuhrgeschwindigkeit der testsubstanzhaltigen Flüssigkeit.

10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, gekennzeichnet durch Vorrichtungen zur Erhöhung des Gradienten der Dichtegradientenflüssigkeit während der Zuführung der testsubstanzhaltigen Flüssigkeit.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gekennzeichnet durch einen flüssigkeitsdurchströmten Kühlmantel (40, 44, 64).

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen