DE2828179C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Elektro­ phoresetrennung von Material, wie beispielsweise Proteinen, Protein-Subeinheiten und Nukleinsäuren. Die Vorrichtung wird verwendet als die zweite Trennung in einem zweidimensionalen Trennsystem, welches mit der isoelektrischen Trennung von Arten (Spezies) längs eines dünnen, langgestreckten oder spaghettiartigen Gel-Mediums beginnt. Bei der ursprünglichen Trennung wandern Proteine, Aminosäuren oder andere Proben­ materialien üblicherweise nach unten zu einem zuvor festge­ legten pH-Punkt innerhalb des Gels, wo die Spezies der Probe elektrisch neutral ist, d. h. die Wanderung erfolgt zu ihrem isoelektrischen Punkt. Trennungen dieser Arten sind bekannt und bei Kombination mit einer zweidimensionalen Elektrophore­ setrennung kann die bislang höchste Auflösung für Protein und Protein-Subeinheiten erreicht werden. In der zweiten Elektro­ phoresetrennung wandern Probenspezies durch ein als Sieb wir­ kendes Gel zu einem durch ihr Molekulargewicht bestimmten Punkt.

Die anfängliche isoelektrische Trennung wird in üblicher Wei­ se ausgeführt. Ein isoelektrisches Fokussiergel, beispiels­ weise Akrylamid mit Katalysator, Fokussierverbindungen und Vernetzungs­ agentien werden ausgebildet und einem vorfokussierenden elektri­ schen Potential unterworfen, und zwar zwischen einer Alkali- und einer Säurepuffer-Lösung, beispielsweise NaOH und H₃PO₄. Dadurch wird ein pH-Gradient entlang des spaghettiartigen iso­ elektrischen Gels erzeugt. Das Probenmaterial wird in die Obersei­ te des Gelbehälterrohrs eingebracht und kann unter dem Einfluß eines elektrischen Potentials zwischen den oberen und unteren Pufferlösungen wandern. Nach einer Periode von ungefähr 20 Stun­ den sind die verschiedenen Probenspezies zu isoelektrischen Punk­ ten neutraler Ladung gewandet. Die Proben können sodann aus ihren Behältermaterialien entfernt werden, und zwar in Vorbereitung für eine zweidimensionale Elektrophoresetrennung.

Die Trennung in der zweiten Dimension erfolgt durch eine Natrium­ dodecylsulfat-Elektrophorese innerhalb eines zweidimensionalen Akrylamidgels. Die Gelzusammensetzungen sind bekannt und enthal­ ten Polymerisations- und auch Vernetzungs-Agentien zusammen mit einem Gelpuffer. Gele dieser Art wurden bislang von Hand zwischen Glasplatten mit Laborklemmvorrichtungen angeordnet und elektri­ schem Strom zwischen getrennten oberen und unteren Pufferlösun­ gen ausgesetzt. Eine derartige Vorrichtung und ein solches Ver­ fahren reichen zur Durchführung gelegentlicher Elektrophorese­ trennungen von Proteinproben, ist aber recht schwierig zu hand­ haben und auch zeitaufwendig, wenn eine große Anzahl von Proben verarbeitet werden soll, wie dies beispielsweise bei genetischen Untersuchungen und klinischen Diagnosen der Fall ist. Bei diesen Vorrichtungen tritt häufig Pufferlösung an den mit Dichtungen versehenen Abdichtungen aus, wo die Formgelhalter aus dem oberen Pufferlösungsbehälter verlaufen. Wegen dieser Ein­ schränkungen konnten nur wenige Formgele zugleich der Elektro­ phorese ausgesetzt werden und es war ein beträchtlicher Aufwand an Überwachungszeit durch Laboranten erforderlich.

Hinsichtlich des Standes der Technik sei auf die folgenden Litera­ turstellen hingewiesen, in denen Vorrichtungen zur Form- Gel-Elektrophorese und zweidimensionalen Elektrophorese für Proteine beschrieben werden.

Reid und Bieleski beschreiben in einem Artikel "A Simple Apparatus for Vertical Flat-Sheet Polyacrylamide Gel Electro­ phoresis" in Analytical Biochemistry, 22, 374-381 (1968), eine Vorrichtung zur Trennung komplizierter Mischungen mit Proteinen und Nukleinsäuren innerhalb eines Form-Gel­ mediums. Die Elektrophorese erfolgt zwischen einem oberen und einem unteren Puffertrog. Der Formgelhalter ist auf der Stirn­ fläche eines Vertikaltisches festgeklemmt, wobei sich eine Dich­ tung an ihrem Platz befindet, um das Lecken von Pufferlösung in den unteren Puffertrog zu verhindern. Da die Formgelanord­ nung an einem Vertikalglied und einer Dichtung festgeklemmt werden muß, kann jeweils nur eine Formgelprobe in einer solchen Vorrichtung in bequemer Weise gehandhabt werden.

Studier beschreibt in "Analysis of Bacteriophage T7 Early RNAs and Proteins on Slab Gels" (Journal of Molecular Biology, 79, 237-248 (1973)) ein Verfahren zur Formgel-Elektrophoresetren­ nung zur Trennung und Identifizierung von RNA's und Proteinen der Bakteriophage T7 in einem Polyakrylamidgel. Auf Seite 240 dieser Veröffentlichung ist eine Elektrophoresevorrichtung ge­ zeigt, welche der von Reid und Bieleski recht ähnlich ist. Es ist notwendig, eine Flüssigkeitsdichtung am Formgelhalter inner­ halb der oberen Pufferkammer vorzusehen. Dies wird dadurch er­ reicht, daß man geschmolzenes Agar in Ausnehmungen tropft, die an der Oberfläche des Glasplattenhalters und der Pufferkammer vorgesehen sind. Das Agar verfestigt sich zur Bildung einer Dichtung.

Ein Artikel von O'Farrel mit dem Titel "High Resolution, Two- Dimensional Electrophoresis of Protein" (The Journal of Biologi­ cal Chemistry, Band 250, Nr. 10, 4007-4021, May 1975) beschreibt ein Verfahren zur Durchführung einer zweidimensionalen Elektro­ phoresetrennung in Polyakrylamidgel, um eine außerordentlich hohe Auflösung von Protein zu erhalten. Dabei wird eine Vorrich­ tung gemäß Reid und Bieleski modifiziert gemäß Studier verwendet.

Die US-PS 38 88 758 bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Gel-Elektrophorese, und zwar insbesondere auf eine Vorrichtung zur Übertragung der Ergebnisse der analytischen Gel-Elektro­ phorese auf die präparative Trennung in größerem Maßstab. Die­ se Vorrichtung ist insbesondere zum Studium komplexer Proteine oder Enzymsysteme geeignet. Man geht dabei davon aus, daß man durch Elektrophorese in Polyacrylamid und Stärkegelen eine ausgezeichnete Auflösung bei Proteinmischungen erhält, wobei aber Schwierigkeiten bei präparativen Mengen auftreten. Diese Schwierigkeiten sind teilweise mechanischer Art bei der Stabi­ lisierung eines großen Gelblocks, und teilweise bestehen Prob­ leme hinsichtlich der Wärmeverteilung und der Gleichförmigkeit des elektrischen Feldes.

Im Hinblick auf die Schwierigkeiten beim Stand der Technik hat sich die Erfindung zum Ziel gesetzt, eine Vorrichtung zur elektrophoretischen Trennung vorzusehen, die in bequemer Weise eine Vielzahl von Formgelen in einem einzigen Elektrophoresevorgang unterbringen kann. Weiterhin hat sich die Erfindung zum Ziel gesetzt, eine Elektrophoresevorrichtung vor­ zusehen, welche die schwierigen Probleme hinsichtlich der Pufferlö­ sungsleckage minimiert oder eliminiert. Ferner sieht die Erfindung eine Elektrophoresevorrichtung vor, in der eine große Anzahl von Formgelhaltern in einfacher Weise mit Proben zur Verarbeitung zu­ sammengebaut werden kann. Die Erfindung sieht ferner eine Elektro­ phoresevorrichtung mit Formgelhaltern vor, die eine verbesserte Konsistenz bei der Formgeldicke gestatten.

Die Erfindung sieht eine Vorrichtung zur Elektrophoresetrennung von Proben innerhalb eines Form-Gels vor. Die Vorrich­ tung weist ein Reservoir für eine Pufferlösung auf, und zwar aufgeteilt in eine innere und zwei äußere Kammern mit ersten und zweiten in Längsrichtung verlaufenden Unterteilungen. Jede dieser Unterteilungen weist ausgerichtete vertikale Spalten auf, die von den Oberseiten aus durch einen Teil ihrer Höhe hinweg verlaufen und einen kontinuierlichen Bodenrand übriglassen. Eine Vielzahl von Formgelhaltern ist in ausgerichteten Spaltenpaaren innerhalb der Unterteilungen angeordnet. Die Formgelhalter be­ sitzen vertikale Kantenteile mit freiliegenden Gelkanten an ihren Seiten hinweisend in die äußeren zwei Reservoirkammern für die elektrische Kontaktierung der Pufferlösung. Die Elektrophorese­ probe wird in einem dieser vertikalen Kantenteile angeordnet. Die äußeren Hauptoberflächen der Formgelhalter berühren gleitend Klappen oder Oberflächen anderer Art aus elektrisch isolierendem Material innerhalb der Vertikalspalten, um einen hohen Widerstands­ wert gegenüber dem elektrischen Stromfluß durch die Pufferlösungen vorzusehen. Jede der äußeren Pufferkammern ist mit Elektroden ausgestattet, um eine elektrische Potentialdifferenz zwischen den Pufferlösungen in den zwei äußeren Kammern aufzubauen. Auf diese Weise wird ein elektrischer Strom durch das Formgelmedium gelei­ tet, und zwar zum Zwecke der Elektrophorese des Probenproteins, der Subprotein-Gruppen, der Aminosäuren, der Nukleinsäuren oder anderen Probenmaterials über das Formgel hinweg.

Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die gleiche Pufferlösung in die drei Pufferkammern auf das gleiche Niveau unterhalb der oberen Oberfläche des Formgelhalters eingefüllt. Dieser Formgelhalter kann auch zwei Platten aufweisen, die an einer Horizontalkante mit einem gegenseitig verbundenen Gelenk ausgestattet sind. Abstandsstreifen sind an den Innenoberflächen einer dieser Platten befestigt, wobei ein Band oder Streifen aus Klebematerial innerhalb einer unterhalb ausgebildeten Sei­ tennut angeordnet ist. Derartige auf diese Weise befestigte Streifen sehen eine verbesserte Konsistenz für die Formgeldicken vor.

Weitere Vorteile, Ziele und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich insbesondere aus den Ansprüchen sowie aus der Beschrei­ bung von Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnung; in der Zeichnung zeigt

Fig. 1 eine perspektivische Ansicht einer erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung mit einer Vielzahl von Formgelen;

Fig. 2 einen Querschnitt durch die Vorrichtung der Fig. 1;

Fig. 3 eine Schnitt-Endansicht der Vorrichtung gemäß Fig. 1;

Fig. 4 eine perspektivische Ansicht eines Formgelhalters mit an ihrem Platz befindlicher Probe und Gel;

Fig. 5 eine vergrößerte perspektivische Teilansicht der Proben­ halter an ihrem Platz innerhalb der Vorrichtung;

Fig. 6 einen Teilschnitt der Probe innerhalb des Probenhalters.

Die Fig. 1, 2 und 3 zeigen ein Reservoir oder einen Behälter 11, der eine Pufferlösung 13 enthält. Aus Gründen der Klarheit ist die Pufferlösung 13 in Fig. 1 nicht dargestellt. Der Behälter 11 ist in Längsrichtung in zwei äußere Kammern 15 und 17 auf jeder Seite einer Innenkammer 19 durch zwei parallele Unterteilungen oder Trennwände 20 und 21 unterteilt. Die Unterteilungen 20, 21 sind abdichtend in den End- und Bodenwänden des Behälters befestigt.

Elektroden 23 und 25 aus Drahtverbindungen und Trägern oder anderen geeigneten Gebilden sind in Berührung mit der Puffer­ lösung innerhalb der Kammern 15 bzw. 17 vorgesehen. Der Behäl­ ter 11 und die Unterteilungen 20, 21 bestehen aus einem elek­ trisch isolierenden Material, weil beispielsweise einem Kunst­ stoff auf Polyacrylatbasis, so daß ein von Leistungsversorgung 24 an die Elektroden 23 und 25 angelegtes elektrisches Poten­ tial eine Potentialdifferenz zwischen der Pufferlösung inner­ halb der Kammern 15 und 17 erzeugt. Ein Kunststoff auf Poly­ acrylatbasis und andere ähnliche Materialien sind als Bauma­ terialien gut geeignet, da sie sowohl elektrisch isolierend als auch transparent sind, so daß während des Betriebs eine visuelle Beobachtung möglich ist. Die Unterteilungen 20 und 21 sind mit einer Vielzahl von Spalten (Schlitzen) 27 ausgestat­ tet, die sich von der oberen Oberfläche der Unterteilungen aus zu einer Stelle kurz vor dem Unterteilungsboden erstrecken, wobei ein solider Teil 29 in Längsrichtung entlang des Bodens der Unterteilung übrigbleibt. Ein Bogen oder eine Tafel oder Platte aus flexiblem, elektrisch isolierendem Material, wie beispielsweise Gummi oder Silikongummi 31 wird über den nach innen weisenden Oberflächen der Unterteilungen, die die Innen­ kammer 19 bilden, durch geeignete Plastikstreifen 33 (Fig. 2) gehalten. Die Bogen 31 erstrecken sich über einen hinreichen­ den Teil der Unterteilungshöhe, um die volle Höhe der Spalte 27 zu bedecken. Die nicht unterstützten Teile der Bogen 31, die direkt über die Spalten 27 verlaufen, sind mit mittig an­ geordneten Schlitzen 35 ausgestattet, damit sich diese Teile der Bogen in Klappen 37 (vgl. Fig. 5) innerhalb der Spalten 27 oder zwischen den Streifen 33 öffnen können. Die unteren Enden der Schlitze 35 können mit einem umgekehrten T-Schlitzteil 36 (vgl. Fig. 2) ausgestattet sein, um das Öffnen der Klappen 37 zu erleichtern.

Eine Vielzahl von Probenhaltern 39 ist innerhalb entsprechen­ der aufeinanderzuweisender Schlitze 27 der Unterteilungen 20 und 21 angeordnet. Die Klappen 37 können zur gleichen Seite hingelenkt werden, und zwar durch das Einsetzen der Proben­ halter und durch deren Bewegung in seitlicher Richtung. Wenn sich sämtliche Pro­ benhalter an ihrem Platz am Boden der Spalten 27 befinden, wobei die elektrisch isolierenden Klappen 37 eng an die Hauptoberflä­ chen der Probenhalter gepreßt sind, so wird dem durch die Puffer­ lösung von Kammer 15 zur Kammer 17 fließenden elektrischen Strom ein beträchtlicher elektrischer Widerstandswert entgegengesetzt. Alle drei Kammern 15, 17 und 19 sind mit Pufferlösung 13 ange­ füllt, aber nur bis zu einem Niveau etwas unterhalb der oberen Oberfläche der Probenhalter 39, wie dies in Fig. 3 gezeigt ist.

Eine Kühlschlange 41 ist innerhalb der inneren Pufferkammer 19 vorgesehen, und zwar zusammen mit geeigneten Rührmitteln 43, wie beispielsweise einem motorgetriebenen Propellerflügel oder einer Zirkulationspumpe. Die sich durch den Stromfluß durch die Proben und durch die Pufferlösung an den abdichtenden und elektrisch isolierenden Klappen 37 ergebende Wärme kann aus der Pufferlösung innerhalb der Innenkammer 19 abgeführt werden.

Die im einzelnen in den Fig. 4, 5 und 6 gezeigten Probenhalter 39 weisen zwei starre Plattenglieder 45 aus Glas oder einem anderen geeigneten transparenten und elektrisch isolierenden Material auf. Die Platten 45 sind aneinander an einer Kanten­ oberfläche durch einen flexiblen Streifen 47 angelenkt, der sich über die Breite der Platten hinweg erstreckt. Der Streifen 47 besteht aus einem geeigneten zähen und elektrisch isolierenden Material, wie beispielsweise Gummi, Silikongummi oder einem anderen gummiartigen Material. Er kann durch einen festen Sili­ kongummikleber an den Glasplattenkanten befestigt werden. Wie deutlich in den Fig. 3 und 5 gezeigt ist, sieht der flexible Streifen 47 eine flüssigkeits- und elektrisch isolierende Ab­ dichtung an der Bodenoberfläche des Schlitzes 27 vor, wenn sich der Probenhalter 39 an seinem Platz befindet.

Ein oder mehrere Abstandsstreifen 49 sind an einer Innenober­ fläche einer der Probenhalterplatten 45 befestigt. Die Streifen 49 erstrecken sich über die Breite der Platte hinweg und definieren die Dicke des Formgels 51. Die Strei­ fen 49 bestehen aus einem starren harten Material, wie beispiels­ weise Polyvinylchlorid und können durch Klebung an der Platten­ oberfläche mittels eines Streifens oder einer Füllung 53 aus Klebematerial befestigt sein, welches in einer unterhalb verlau­ fenden Seitennut der Streifen 49 angeordnet ist. Ein im Handel verfügbarer, bei Raumtemperatur vulkanisierender Silikongummi­ kleber reicht für diesen Zweck aus. Durch die Verwendung des Streifens 53 aus Kleber als Mittel zur Befestigung der Streifen an den Probenplatten wird eine Verbesserung hinsichtlich der Dickenkonsistenz für die verschiedenen Formgele erhalten.

Ein langgestrecktes Muster oder eine Probe 55 ist in Fig. 4 und 6 gezeigt und erstreckt sich über eine Kantenoberfläche des Form­ gels zwischen den Abstandsgliedern 49. Beim Einbau in die Vor­ richtung ist die Probe vertikal positioniert. Die Probe kann Proteine, Protein-Subeinheiten, Aminosäuren oder Nukleinsäuren enthalten, die durch Elektrophorese getrennt werden sollen. Die Probenmuster können innerhalb eines langgestreckten zylindrischen oder spaghettiartigen Gels enthalten sein, und sie können in die Kantenoberfläche des Formgels mit beispielsweise Agarosegel ab­ gedichtet sein. Alternativ können die Proben durch Pipette auf die obere Kante des Formgels aufgebracht werden und mit einem geeigneten Gel oder gelartigen Material abgedichtet werden, be­ vor der Probenhalter verdreht wird, um die Proben in einer Ver­ tikalorientierung zu positionieren.

Eine hohe Auflösung der Proteine und anderer Probenmaterialien kann durch die Verwendung von zweidimensionalen Trennungen er­ halten werden. In der ersten Trennung werden die Proteine ent­ sprechend ihrem isoelektrischen Punkt durch isoelektrische Fokus­ sierung längs eines dünnen zylindrischen Gels innerhalb eines Rohrs mit kleinem Durchmesser getrennt. Das spaghettiartige Gel, welches die verschiedenen entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt getrennten Proteine enthält, kann aus dem Rohr herausge­ drückt werden und längs der Kantenoberfläche von Formgel 51 ange­ ordnet werden, wie dies bei 55 in den Fig. 4 und 6 dargestellt ist. Die Proteine können sodann längs einer zweiten Dimension über die Formbreite hinweg getrennt werden, um eine zusätzliche Auflösung gemäß ihrem Molekulargewicht vorzusehen.

Die Verfahren zur Ausführung derartiger zweidimensionaler iso­ elektrischer und elektrophoretischer Trennungen sind bekannt; vgl. dazu beispielsweise die oben genannte O'Farrell-Litera­ turstelle. Die Gele für die isoelektrische Fokussierung werden in Glasrohren mit kleinem Durchmesser, beispielsweise mit einem Innendurchmesser von 1-3 mm, hergestellt, deren Böden anfangs mit Paraffin abgedichtet sind. Lediglich als Beispiel sei darauf hingewiesen, daß ein Fokussiergel für die Analyse menschlicher Serumproteine folgende Zusammensetzung aufweisen kann: 8,25 Gramm Harnstoff; 750 Milliliter Ampholyte (amphote­ re Elektrolyte), pH 3,5 bis 10; 2 Milliliter 30 Gew.-% Akryl­ amid in Wasser plus 1,8 Gew.-% Bisakrylamid in Wasser; 6 Mil­ liliter Wasser; 300 Mikroliter Detergens; 30 Mikroliter Ammo­ niumpersulfat; und 20 Mikroliter N,N,N,N′-Tetramethyläthylen­ diamin (TEMED). Dies würde als Ausbeute ein Volumen von unge­ fähr 15 ml ergeben, was für eine Batterie von ungefähr 25 iso­ elektrischen Fokussiergelen ausreichen würde. Diese Lösung wird entgast, bevor der Katalysator TEMED hinzugefügt wird, und in die Gelrohre zur Polymerisation eingegeben. Die Gellö­ sung kann mit Injektionsspritzen eingegeben werden, oder aber in bequemerer Weise durch Versetzung der Gellösung aus einem Behälter oder Vorrat um die Rohrböden herum in die Rohre hi­ nein. Dieses letztgenannte Verfahren kann dadurch ausgeführt werden, daß man lediglich eine Batterie von Gelrohren absenkt, deren untere Enden in einen Vorrat aus nicht polymerisierten Gel untergetaucht waren, und zwar in ein Reservoir von Wasser oder einer anderen Flüssigkeit, die weniger dicht ist als die Gellösung. Sodann läßt man die Polymerisation für ungefähr 1 Stunde andauern.

Bevor die Proben hinzugegeben werden, können die Gele vor­ fokussiert werden, um einen pH-Gradienten entlang ihrer Länge aufzubauen, während eine Potentialdifferenz von ungefähr 200 V an die Gelendteile angelegt wird. Die Gelenden können in ver­ dünnte Konzentrationen von ungefähr 0,02 M NaOH und 0,01 M H₃PO₄ an den entgegengesetzten Enden eingetaucht werden. Die Proben von Proteinen oder anderem Material in beispielsweise konzentriertem Harnstoff werden in das Alkaliende des isoelektri­ schen Fokussierrohrs eingeführt, welches sodann bei ungefähr 400 bis 800 V 1 bis 20 Stunden lang betrieben wird, wie dies zur Trennung der individuellen Proteine zu ihren isoelektrischen Punkten hin erforderlich ist.

Das isoelektrische Fokussiergel wird beispielsweise mit einer Injektionsspritze aus Wasser extrudiert, und zwar in eine Natrium­ dodecylsulfat-Lösung (SDS) bis zum Gleichgewicht, um Ampholyte herauszuweichen. Die spaghettiartigen Probengele sind sodann be­ reit für die Einbringung in die Formgelprobenhalter 39, wie dies bei 55 in Fig. 4 gezeigt ist.

Die Zusammensetzungen der bei 51 in Fig. 4 gezeigten Formgele sind bekannt und sie sind in der obengenannten O'Farrell-Litera­ turstelle beschrieben. Es kann ein Akrylamidgel in gleichförmiger oder Gradienten-Konzentration über die Formbreite oder Formstück­ breite hinweg verwendet werden. Die beste Trennung der Proteine erreicht man unter Verwendung eines exponentiellen Akrylamid­ gradientengels.

Die Formgel-Lösungen in Monomerform werden in die Probenhalter 39 eingefüllt, und zwar aus einem üblichen und im Handel verfügba­ ren Gradientenmischer. Die Gradientenmischung kann eine sich kontinuierlich ändernde Konzentration von beispielsweise Akrylimid während des Füllvorgangs vorsehen. Zur Verhinderung des Mischens des Gradienten während der Füllung kann der Halter für die Einführung der Gel­ lösung mit einer Ecke nach unten weisend gehaltert sein. Das Ein­ füllen kann mit einer gemäßigten Strömungsrate erfolgen, wobei das weniger dichte Material zuerst und die höher konzentrierte Akrylamidlösung zuletzt eingegeben wird. Wenn sich das Füllver­ fahren dem Ende nähert, so kann der Formgelhalter langsam verdreht werden, so daß ein konsistenter Dichtegradient des Akrylamids über das Formgel hinweg erzeugt wird. Das Füllen kann auch in der gleichen Weise dadurch fortschreiten, daß man die Akrylamidlösung über die Bodenkantenoberfläche hinweg zuführt, von einem flachen V-förmigen Trichter aus, um das Mischen zu minimieren.

Eine typische Formgellösung enthält vor der Polymerisation fol­ gendes: Von ungefähr 5 bis 22,5 Gew.- % Akrylamid, 0,1 Gew.-% Natriumdodecylsulfat, 0,375 M Tris (Hydroxymethyl)-Aminomethan- HCl, pH 8,8 und der Rest Wasser. Ebenfalls enthalten sind in kleinen Volumenanteilen Ammoniumpersulfat in Wasser und der Poly­ merisationskatalysator TEMED. Eine Glycerinlösung kann an Stelle von Wasser dort verwendet werden, wo hohe Konzentrationen von Akrylamid hergestellt werden. Nachdem man das Gel ungefähr 1 Stunde lang hat polymerisieren lassen, wird die restliche nicht polymerisierte Gelmischung und das Wasser von der Geloberfläche entfernt. In einigen Anwendungsfällen kann eine sekundär-Butanol- Wassermischung vor der Polymerisation der Geloberfläche hinzuge­ geben werden, um eine flache Oberfläche sicherzustellen. Das Form­ gel kann sodann durch Aufbringen eines Stapelgels mit einer niedrigeren Akrylamidkonzentration, beispielsweise 5 Gew.-% oder weniger, auf der für die Probenaufbringung vorgesehenen Oberfläche erzeugt werden. Die Verwendung des Stapelgels ist ein bekanntes Verfahren zum Schärfen der individuellen Proteinvolumina oder anderen zuvor entsprechend ihren isoelektrischen Punkten getrennten Probenmaterials auf eine refraktile Dicke.

Das in der zuvor beschriebenen Weise hergestellte langgestreckte Probengel wird auf einer geeigneten Oberfläche ausgelegt und auf die Oberseite des Stapelgels ausgerollt zwischen den zwei Glasplatten 45 des Probenhalters 39. Nach der Glättung am Platz wird eine darüberliegende Lage von Agarose verwendet, um das Probengel in seiner Position zu halten. Der zuvor zum Heraus­ weichen der Ampholyte in dem isoelektrischen Fokussiergel verwende­ te Gleichgewichtspuffer kann Bromphenol-Blau oder einen anderen geeigneten Farbstoff enthalten, um die Probe leicht sichtbar zu machen. Somit kann das Fortschreiten der Probe über das Form­ gel hinweg während der Elektrophorese leicht beobachtet werden.

Die Formgelhalter 39 mit den Formgelen 51 und den Proben 55 an ihrem Platz werden in die Position in Schlitzen 27 innerhalb der Unterteilungen 20 und 21 geschoben. Die elektrisch isolieren­ den Klappen 37 sind gegenüber den Hauptoberflächen der Proben­ halter ausgerichtet. Wenn einige Paare der Spalten 27 nicht ge­ füllt sind, so schließen die flexiblen elektrisch isolierenden Bogen an den Schlitzen 35 und minimieren den elektrischen Kontakt und Strömungsmittelfluß zwischen den Pufferlösungen innerhalb der 3 Kammern 15, 17 und 19. Bei den meisten Anwendungsfällen sind die isoelektrisch fokussierten Proben ausgerichtet längs einer vertikalen Gelkante in Berührung mit der Pufferlösung der gleichen äußeren Kammer. Die Klappen 37 öffnen sich in aus­ reichender Weise, um die Probenhalter aufzunehmen, wenn sie ein­ gesetzt werden, und sie dichten ab gegenüber den Halterober­ flächen.

Das Reservoir 11 ist vorzugsweise mit einer einzigen Pufferlösung in allen drei Kammern 15, 17 und 19 gefüllt, und zwar bis zu einem Niveau unterhalb der oberen Oberfläche des Halters 39. Wenn Serumproteine untersucht werden, so kann diese Lösung ty­ pischerweise folgendes enthalten: Ungefähr 0,02 bis 0,2 M Tris(Hydroxymethyl)-Aminomethanglycin (pH 8,3) in Wasser mit ungefähr 0,05 Gew.-% SDS. Es können auch andere bekann­ te Pufferlösungen in einer oder mehreren der Kammern verwendet werden. Wenn jedoch unterschiedliche Pufferlösungen in unter­ schiedlichen Kammern verwendet werden, so kann eine gewisse Zwischendiffusion zwischen Klappen 37 und Halter 39 auftreten.

Die Leistungsversorgung 24 liefert ungefähr 200 bis 800 V Gleich­ spannung bei bis zu einem Ampère für 10 parallel betriebene Probengele. Die Elektrophoresetrennung kann für ungefähr 4 bis 8 Stunden fortgesetzt werden, um eine zweite dimensionsmäßige Trennung der Probenproteine, Protein-Subeinheiten oder Nuklein­ säuren entsprechend dem Molekulargewicht zu ergeben. Die Sieb­ wirkung des ansteigenden Dichtegradienten des Akrylamid er­ reicht diese Trennung.

Bei dieser Trennung in der zweiten Dimension heftet sich das Dodecylsulfat (SDS) an die Proteine und Protein-Subgruppen an, um die Ladung oder den isoelektrischen Effekt zu negieren, der andernfalls die Wanderung beeinflussen würde. Infolgedessen wandert jede molekulare Spezies zu einer durch ihre Größe oder Molekulargewicht bestimmten Stelle. In einem transparenten Tank aus Glas oder einem Kunststoff auf Polyacrylatbasis kann die Bewegung der Farbstoff-Front ohne weiteres für eine Viel­ zahl von Gelen beobachtet werden, und der Vorgang kann dann beendet werden, wenn der Farbstoff das entgegengesetzte Ende der Formgelbreite erreicht.

Das sich ergebende Formgel enthält ein Probenmaterial, welches entsprechend seinen isoelektrischen Eigenschaften in einer Di­ mension und entsprechend seinem Molekulargewicht in einer zweiten Dimension aufgelöst ist. Die individuellen Probenspe­ zies können durch geeignete und bekannte Färbe- und Entfärbe­ Verfahren festgelegt werden, wie beispielsweise durch einen blauen Säurefarbstoff in 12%iger Trichloressigsäure, gefolgt von einer Entfärbung mit mehrmaligem Wechsel von 7%iger Es­ sigsäure. Bei anderen Anwendungsfällen können Radioisotope in den verschiedenen Probenspezies enthalten sein und Autoradio­ graphien werden hergestellt durch Anordnung der Formgele nahe einem geeigneten Film.

Die Formgele, deren Proteinspezies in zwei Dimensionen ge­ trennt sind und deren Lage durch die oben erwähnten Verfahren identifiziert ist, können sodann mit Formgelen verglichen wer­ den, die zuvor ermittelte Kontrollproben enthalten. In anderen Fällen können die Formgele mit anderen unbekannten Proben ver­ glichen werden, die der zweidimensionalen Auflösung unterwor­ fen wurden, um qualitative Ergebnisse zu erzielen. Fotografi­ sche und autoradiographische Bilder der aufgelösten Proben in zwei Dimensionen können durch Computerverfahren analysiert werden, um die Handhabung großer Anzahlen von Proben zu er­ möglichen.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung gestattet die gleichzeitige Auflösung nach der zweiten Dimension von einer Vielzahl von Formgelen ohne Pufferlösungsleckage, wodurch sich neue Möglichkeiten für die zweidimensionale Proteinauflösung ergeben. Beispielsweise bei der genetischen Untersuchung von Serumproben einer großen Anzahl von Einzelpersonen zur Feststellung von Mutanten und anderen genetischen Änderungen kann die erfindungs­ gemäße Vorrichtung zweckmäßig verwendet werden. Oftmals werden Mutantenproteine durch Änderungen ihrer Ladung oder ihrer OH- und H-Gruppen festgestellt. Die hier beschriebene Elektrophorese­ vorrichtung würde verwendet werden, um durch das Molekularge­ wicht ein Protein zu identifizieren, welches seinen isoelektri­ schen Punkt an einer neuen Stelle infolge seiner Mutations-Ladung gefunden hat. Untersuchungen dieser Art sind außerordentlich wichtig zur Bestimmung des Effekts von Umweltverunreinigungen von sowohl chemischer als auch radioaktiver Natur.

Die Erfindung kann auch klinische Anwendungen erfahren, beispiels­ weise bei der Identifizierung eines Verlustes an Transferin, was den Eisentransfer innerhalb von Blutproben ausführt. Ferner könn­ te auch die Wilson'sche Krankheit bestimmt werden durch Identi­ fikation eines geringen oder fehlenden Ceruloplasmingehalts. Durch Verwendung verschiedener Densitometer, die zur Quantifi­ zierung von Farbmengen bekannt sind und somit auch für Protein­ mengen, können weitere diagnostische Verfahren entwickelt werden, die sich auf Herzschläge und Arteriosklerose beziehen. Beispiels­ weise könnten Blutproben untersucht werden, um die Mengen und Arten an Serumlipoproteinen zu vergleichen, und zwar zwischen normalen Blutproben und den Blutproben von Patienten, die mög­ licherweise diese Art von Problemen haben. Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung können neue Verfahren zur Neu­ beschreibung und Neudefinition menschlicher Erkrankungen ent­ wickelt werden, und zwar ausgedrückt in den Teilen, aus denen die­ se Zellen bestehen.

Es können verschiedene Lösungen und Gele verwendet werden, wo­ bei diese bekannt sind und durch andere Materialien als die bereits genannten ersetzt werden könne. Abwandlungen sind im Rahmen der Erfindung möglich.

Zusammenfassend sieht die Erfindung somit eine Vorrichtung vor, um gleichzeitig elektrophoretische Trennungen an einer Vielzahl von Formgelen auszuführen, die Proben von Protein, Protein- Subeinheiten oder Nukleinsäuren enthalten. Ein Reservoir an Pufferlösung ist in drei Kammern durch zwei parallele Untertei­ lungen unterteilt, welche Vertikalspalten mit Abstand längs ihrer Länge angeordnet aufweisen. Ein Bogen aus flexiblem, elektrisch isolierendem Material ist an jeder der Untertei­ lungen befestigt und mit Vertikalschlitzen, ausgerichtet mit den Spalten versehen. Die Formgelhalter werden innerhalb der Spalte aufgenommen, wobei das flexible Material nach außen gefaltet wird in der Form von Klappen von den Schlitzen aus, um über Teilen der Halteroberflächen zu liegen und dadurch als elektrische und Flüssigkeits-Dichtungen zu dienen. Ein lang­ gestrecktes spaghettiartiges, die Proben enthaltendes Gel, was zuvor durch isoelektrische Fokussierverfahren getrennt wurde, wird vertikal längs eines Randkantenteils des Formgels posi­ tioniert. Beim Anlegen eines elektrischen Potentials zwischen den zwei äußeren Kammern der Pufferlösung wird eine zweite dimensionsmäßige elektrophoretische Trennung gemäß dem Moleku­ largewicht vorgenommen, wenn die Probenmoleküle über das Form­ gel hinwegwandern.

Claims (10)

1. Vorrichtung zur Formgel-Elektrophorese mit ersten und zweiten mit Abstand angeordneten Kammern (15, 17), die Elektroden (23, 25) von entgegengesetzter elektrischer Polarität und zwischen den Kammern angeordnete Formgele (51) aufweisen, die die Proben (55) enthalten, wobei entgegengesetzt liegende Kantenoberflächen auf eine Kammer mit Elektroden entgegen­ gesetzter Polarität hinweisen, dadurch gekennzeichnet, daß die Kammern (15, 17) in einem gemeinsamen Reservoir für die Pufferlösung (13) durch erste und zweite mit Abstand angeordnete Unterteilungen (20, 21) als äußere Längskammern ausgebildet sind und wobei jede Unterteilung (20, 21) entsprechende Vertikalschlitze (27) von deren oberer Kante aus aufweist, und wobei ferner eine Vielzahl von Formgelhaltern (39) jeweils in einem Paar von Schlitzen (27) innerhalb der Unterteilung (20, 21) angeordnet ist, und wobei die Halter vertikale, freiliegende Formgelkantenteile aufweisen, die in die zwei äußeren Reservoirkammern (15, 17) weisen, um eine Pufferlösung (13) zu kontaktieren, und wobei ferner elektrisch isolierendes Abdichtmaterial (31, 37) zwischen den Vertikal­ schlitzen der zwei Unterteilungen (20, 21) und den Formgel­ haltern (39) angeordnet ist.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gleiche Pufferlösung in die innere und die zwei äußeren Kammern eingefüllt ist, und zwar auf im wesentlichen das gleiche Niveau unterhalb der oberen Oberfläche der Formgelhalter (39).

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß mindestens einer der Formgelhalter (39) ein Paar von starren Platten aus elektrisch isolierendem Material aufweist, die eine gegenseitige Gelenkverbindung an einer Kante besitzen, um die Schwenkpositionierung der nach innen weisenden Hauptoberflächen zur Aufnahme eines Formgels zu gestatten.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß auf einer der Platten auf einer nach innen weisenden Haupt­ oberfläche Abstandsmittel vorgesehen sind.

5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da­ durch gekennzeichnet, daß die Abstandsmittel Horizontalstreifen von gleichförmiger Dicke sind, wobei jedem der Streifen (53) eine Nut zugeordnet ist, die einen Füllkörper oder Streifen (53) aus Klebematerial an der darunterliegenden Oberfläche aufweist, und zwar angeordnet gegenüber der Plattenoberfläche.

6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Formgelhalter in der Vorrichtung an­ geordnet sind mit der Gelenkverbindung an einer unteren Horizontalkante des Halters am Boden der Vertikalspalten innerhalb der ersten und zweiten Unterteilungen, wobei die Gelenkverbindung einen Streifen aus flexiblem gummiartigen Material aufweist, um eine elektrische und eine Flüssigkeits­ Abdichtung zwischen der Pufferlösung in den äußeren und inneren Kammern vorzusehen.

7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Formgelhalter mit seiner freiliegenden Oberfläche vertikal angeordnete, langgestreckte, Gel enthaltende Probensubstanzen enthält, die entlang der Länge des langgestreckten Gels entsprechend ihren isoelektrischen Eigenschaften getrennt sind.

8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterteilungen jeweils eine Spalten aufweisende Platte aufweisen, wobei ein Bogen aus flexiblem elektrisch nicht leitendem Material an einer Hauptoberfläche befestigt ist, um eine elektri­ sche Abdichtung zwischen den inneren und äußeren Kammern vorzusehen, und wobei der Bogen Vertikalschlitze in Teilen besitzt, die innerhalb der Spalten zur Aufnahme der Formgelhalter freiliegen.

9. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere nach Anspruch 8, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Formgelhalter innerhalb der Vertikalschlitze derart positioniert sind, daß die Klappenteile des elektrisch isolierendem Bogens über den Oberflächenteilen der Halter liegen.

10. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß Mittel zum Kühlen und zum Rühren der Flüssigkeit innerhalb der Innenkammer vorgesehen sind.