DE2847444C2 - Mikroelektrophoretische Vorrichtung zum Trennen und Identifizieren von Komponenten von zwei oder mehr Proteinsystemen - Google Patents
Mikroelektrophoretische Vorrichtung zum Trennen und Identifizieren von Komponenten von zwei oder mehr ProteinsystemenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine mikroelektrophoretische Vorrichtung zum Trennen und Identifizieren von Komponenten
von zwei oder mehr Proteinsystemen, mit einer durch Stege unterteilten und mit Gel gefüllten Schale,
die in voneinander getrennten Abteilen zu untersuchende Eiweißgemische enthält.
Eine derartige Vorrichtung ist beispielsweise aus der US-PS 36 16 387 bekannt, wobei es dort um die Übertragung
von Testsubstanzen, z. B. Blutsera, aus mehreren Kammern in durch Stege voneinander getrennte
Abteile geht, die mit Gel gefüllt sind. Die Applikatorcinheit ist zu diesem Zweck dort mit mehreren Zungen
versehen, zwischen denen Kapillarhohlräume ausgebildet sind. Die Applikatoreinheit ist dort im wesentlichen
senkrecht zu den Kammern angeordnet, so daß die Übertragung dadurch erfolgt, daß die Zungen in die
zugeordneten Kammern eintauchen, anschließend herausgezogen werden und anschließend in die verschiedenen
Abteile eingetaucht werden. Bei der dort beschriebenen Vorrichtung ist es j?doch problematisch, nach der
Elektrophorese die getrennten Bestandteile der Probe sichtbar zu machen und das Ergebnis dauerhaft zu speichern.
Angaben über den Aufbau von geeigneten Membranen sowie speziellen Reagenzien zu IJntersuchungszwecken
lassen sich dieser Druckschrift nicht entnehmen.
Aus der DE-AS 16 42 821 ist eine Vorrichtung zum Herstellen eines Objektträgers für elektrophoretisch zu
untersuchende Proben bekannt, wobei dort die einzelnen Proben mit einem geeigneten und spezifischen Reugens
in Form eines Filmes versehen werden, das mit den Proben reagieren kann. Zu diesem Zweck wird das jeweilige
Reagens dort nach Durchführung der Elektrophorese in Tropfenform aufgebracht und mittels eines
Glasstabes gleichmäßig verteilt Ein derartiges Verfahren ist jedoch beim Aufbringen des Reagens relativ umständlich,
ferner ist nicht sichergestellt, daß das Reagens wirklich gleichmäßig über den Gelfilm verteilt wird,
denn die Benetzungseigenschaften zwischen Gelfilm und Reagens können von Fall zu Fall recht verschieden
sein. Aus diesem Grunde muß dort auch eine relativ große Menge an flüssigem Reagens aufgebracht werden,
so daß es anschließend erforderlich ist, die überschüssige Flüssigkeit dann von dem verwendeten Glasstab
abzustreifen.
Schließlich ist es aus der Veröffentlichung LABO, Sonderheft Labormedizin, Mai 1977, Seiten 514 und 517
an sich bekannt, eine Membran zu verwenden, die eine mit Antiserum getränkte Cclluloseazetatfolie aufweist
Aus dieser Druckschrift läßt sich jedoch nicht entnehmen, welchen Aufbau eine entsprechende Membran haben
soll. Auch fehlen Angaben darüber, mit welchen Arten von Substanzen eine Membran bei einer derartigen
Vorrichtung imprägniert sein soll. Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung der
eingangs genannten Art anzugeben, die in der Praxis eine rasche und zuverlässige Untersuchung von Proteinsyslemen
ermöglicht und dabei ein hohes Maß an Standardisierung sowie eine Speichermöglichkeit der
jo ermittelten Ergebnisse bietet.
Die erfindungsgemäße Lösung besteht darin, daß die Vorrichtung eine Membran aufweist, die eine Polymer-Grundschicht
und eine darauf aufgebrachte Celluloseacelatschicht aufweist und die durch Schlitze in Streifen
J5 unterteilt ist, welche in Abteile der Schale passen und in direkte Berührung mit dem Gel bringbar sind, daß jeder
Streifen mit einem farbbildenden Reagens, das für ein polymorphes Proleinsystem spezifisch ist, vorimprägnicrl
ist, und daß dieses Reagens aus der Gruppe gcwählt ist. die folgende Substanzen umfaßt: Milchsäure,
Dehydrogcnasc (LDH), alkalische Phosphatase (AP), Kreatin-Phosphokinase (CPK), Erythrocytsäure-Phosphatasc
(EAP), Glukosc-6-Phosphat-Dehydrogenase (G-6PD), Adenylatkinase (AK), gruppenspezifische
Komponente (Gc), Lipoprotein (Lp), Adcnosin-Deaminase (ADA), 6-Phosphoglukonat-Deliydrogenase
(6-PGD), Glutamin-Pyruvin-Transaminase (GPT), Esterasc
D(EsD).
In Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichlung
ist vorgesehen, daß die Polymer-Grundschicht aus Polyester, Polyamid, Polyimid, Polyethylen oder halogeniertcm
Polyethylen besteht.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung bietet in vorteilhafter Weise die Möglichkeit einer praktikablen, rasch
durchführbaren Untersuchung von Proteinsystemen auf den verschiedensten Gebieten, wobei eine gleichzeitige
Analyse von verschiedenen Parametern möglich ist, die verschiedenen Komponenten in einfacher Weise rasch
sichtbar gemacht werden können und die erzeugten bo Elcktrophorctogramme dauerhaft lagerfähige Aufzeichnungen
darstellen. Insofern ist eine derartige Vorrichtung gemäß der Erfindung nicht nur auf medizinisch-diagnostischem
Gebiet geeignet, sondern auch für Massenuntersuchungen auf dem Gebiet der Phänotypie
H5 sowohl für die genetische Forschung als auch zu Identifizicrungszwcckcn
bei gerichtlichen Untersuchungen od. dgl.
Beispielsweise können unter Verwendung der erfin-
dungsgemäßen Vorrichtung die folgenden Faktoren im Bbt bestimmt werden:
— Milchsäure-Dehydrogenase (LDH)
— alkalische Phosphatase (AP)
— Kreatin-Phosphokinase (CPK)
— Erythrocytsäure-Phosphatase (EAP)
— Glucose-B-phosphal-Dehydrogenase (G-6PD)
— Adenylatkinase (AK)
— Hämoglobin (Hb)
— Haptoglobin(Hp)
— gruppenspezifische Komponente (Gc)
— Lipoprotein (Lp)
— Adenosin- Deaminase (A D A)
— 6- Phosphoglucona t- Dehydrogenase (6- PG D)
— Glyoxylase I (GLO-I)
— Glutamin-pyruvin-transaminase (GPT)
— Esterase D(EsD)
— Gluthathion-Reduktase (GsR)
— Immunoglobuline (fg).
Die Erfindung wird nachstehend anhand der Beschreibung von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme
auf die Zeichnung näher erläutert. Die Zeichnung zeigt in
Fig. IA bis Fig. IJ eine auseinandergezogene Darstellung
im Schnitt von zwei Ausführungsformen der Vorrichtung, links mit einer Membran und einer Membranbrücke,
rechts mit einer Gelschale und einer GeI-temperaturkontrollplatie;
Fig.2 einen Schnitt durch die zusammengesetzte Vorrichtung mit Membran und Membranbrücke;
F i g. 3 eine Vorderansicht eines Tanks der Vorrichtung gemäß F i g. 1 mit eingebauter Gelschale und Temperaturkontrollplatte;
F i g. 4A bis F i g. 4D auseinandergezogene Vorderansichten der Vorrichtung gemäß Fig. 2 mit Membran
und Membranbrücke;
Fig.5 eine Seitenansicht der Tempcraturkontrollplatte
für die Gelschale;
Fig.6 eine Detailansicht einer Applikatorspitze der
Vorrichtung gemäß Fig. 1;
Fig. 7 eine Draufsicht auf eine in Abteile unterteilte
Schale;
F i g. 7A und F i g. 8 Querschnitte durch die Gelschale mit Abteilen gemäß Fi g. 7 sowie einer Gelschale ohne
Abteile;
Fig.9 eine Draufsicht auf einen einrastenden, dicht
schließenden Deckel für die Gelschalen gemäß F i g. 7 und 8;
Fig. 10 und F i g. 11 Vorderansichten im Schnitt einer
mit Abteilen versehenen Gelschale sowie eine? darin aufzunehmenden Gleitdeckels;
Fig. 12 und Fig. 13 Vorderansichten im Schnitt von weiteren Ausführungsformen der Gelschale mit Abteilen
und einem entsprechenden Gleitdeckel;
Fig. 14 eine Vorderansicht im Schnitt einer Schale mit Deckel, wobei die Schale ein Gel mit einer darüberliegenden,
geschlitzten Membran enthält;
Fig. 15 eine Draufsicht auf eine Schale mit vier Abteilen,
die ein Gel und eine darübergelegte, geschlitzte Membran enthält;
Fig. 16 eine Vorderansicht im Schnitt einer Schale gemäß Fig. 15 mit einem cinschiebbarcn Gleitdcckel;
Fi g. 17 eine Draufsicht auf ein geschlitztes Filtcrpapierblatt,
das mit verschiedener. Entwicklergemischen zum Entwickeln von clektrophoresierten Proteinen imprägniert
ist;
Fig. 18 eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform
des geschlitzten Blattes gemäß Fig. 17 aus einer Polyester-Grundschicht mit einer Celluloseacetatschicht;
Fig. 18A einen Schnitt durch das Blatt gemäß Fig. 17;
Fig. 19 einen Teil eines entwickelten Elektrophoretogramms,
auf dem drei Proteingemische in Gegenwart von jeweils zwei geeigneten Protein-Standardpräparaten
in zwei verschiedenen Konzentrationen getrennt sind;
F i g. 20 eine Draufsicht auf eine viereckige Schale mit einer eingegossenen Schicht eines mit Ampholinen vermischten
Geles zum Elektrofokussieren;
Fig.21 eine Draufsicht auf eine mit eingegossenem
Gel gefüllte viereckige Schale zur Elektrophorese von Haptoglobin-Hämoglobin-Komplexen und anderen
Proteinen;
F i g. 22 eine Vergrößerung eines Bereiches der Scha-Ie
gemäß Fig. 21, in der Vertiefungen in dem Gel zur Aufnahme der Probe angeordnet sind;
F i g. 22A den Bereich der Schale gemäß F i g. 22, der mit einer entfernbaren geschlitzten Wegwerfschablone
aus Kunststoffmaterial versehen ist;
Fig.22B eine Vorderansicht im Schnitt der Schalen-Schablonen-Einheit
gemäß F i g. 22A; und in
F:g. 23 eine Draufsicht auf eine mit eingegossenem Gel gefüllte Schale für die Überkreuz-Elektrophorese.
Die Vorrichtung besteht aus einem Tank bzw. Behäl-
jo ter 10, welcher eine Elektrolytlösung (nicht dargestellt)
enthält. In dem Behälter sind Zwischenwände 19 fest angeordnet. Weiterhin sind entfernbare Zwischenwände
24, eine Scheidewand 23, Elektrodenrahmen 26 und 28, welche sich aus Schlitzen in der Innenwand 8 bis in
Schlitze in der Innenwand 9 erstrecken, vorgesehen. Auf der Scheidewand 23 sitzen ein Membranhalter 14 und
zwei der entfernbaren Zwischenwände 24. Man erkennt weiterhin die Nut 20 des Membranhalters 14, die am
oberen Ende der Scheidewand 23 anliegt. Der Membranhalter 14 weist Zungen 21,22 und Zähne 18 auf. Die
Zähne 18 greifen in Perforationslöchern in einer Membran 16 ein und halten den Mittelteil der Membran gespannt.
Die Enden der Membran 16 tauchen in die Elektrolytlösung (nicht dargestellt) ein. Die Membran muß
aus einem Material hergestellt sein, das die Elektrolytlösung in alle Bereiche derselben saugt, so daß die Membran
stets gesättigt bleibt. Darüber hinaus muß die Membran eine ausreichende Festigkeit aufweisen, um
der Kraft der Zähne zu widerstehen, wenn sie naß ist.
so Die Membran kann beispielsweise aus Celluloseacetat,
Papier oder dem Material Cellogel hergestellt sein. Eine Celluloseacetatmembran kann als beständiger Nachweis
der Analyse aufbewahrt und gelagert werden.
Eine Applikatorcinheit 30 paßt auf die Abdeckung 12.
Eine Applikatorcinheit 30 paßt auf die Abdeckung 12.
Die Applikatoreinheit ist mit zwei Füßen 33, 34 ausgestattet. Der Fuß 34 weist einen von ihm abstehenden
Registrierstift 38 auf, während der Fuß 33 mit einem abstehenden Laufstift 35 ausgestattet ist. Der Registrierstift
38 und der Laufstift 35 sind so ausgebildet, daß
W) sie in einen Laufstiftschlitz bzw. Registrierstiftloch an
der Abdeckung 12 bzw. dem Probenhalter eingreifen können.
Die Abdeckung 12 weist mannliche und weibliche Verbindungen 11, 13 auf, welche den Kontakt mit dem
b5 Elektrodendraht 29 über Federzwischenverbindungen
15 b/.w. 17 an dem Elektrodenrahmen 926 herstellen. Wenn die Abdeckung 12 von dem Behälter 10 abgenommen
wird, wird die elektrische Verbindung zu dem Elek-
trodendraht 29 durch die Federverbindungen unterbrochen. Der Elektrodendraht 29 ist in seinen Einzelheiten
in Fig. IB dargestellt. Ein Platindraht 29 läuft um den
geschlitzten Umfang des Elektrodenrahmens 26. Der Draht ist mit Metallkontakten 25 und 27 verbunden, die
eine Leitung zu den Federverbindungen 15 und 17, die in F i g. 2 dargestellt sind, herstellen. Wie man aus F i g. 4D
erkennt, sind die beiden Elektrodenrahmen 26 und 28 in den Behälter 10 eingesetzt, welcher in seinen Wänden
Schlitze aufweist, die die Rahmen aufnehmen können.
In den Fig. IF und 4A ist die Applikatoreinheit dargestellt,
welche mehrere Applikatorknöpfe 39 aufweist, die ihrerseits dazu dienen, einen Applikator zu halten,
der in seinen Einzelheiten in F i g. 6 dargestellt ist.
Die Applikatorknöpfe 39 werden mit einer Anzahl von Blattfedern 45 gehalten, die jeden "Knopf einzeln an
seinem Platz halten. Ein Freigabeknopf 40 ist mit einem verlängerten Arm 41 ausgestattet, der sich über alle
parallel ausgerichteten Blattfedern 45 erstreckt. Wird der Knopf 40 nach unten gedrückt, so werden alle Blattfedern
freigesetzt, was dazu führt, daß alle Applikatorknöpfe 39 infolge der Schwerkraft nach unten fallen.
Der Freigabeknopf 40 ist mit einer Nut 42 ausgestattet,
in welche, wenn der Knopf in der heruntergedrückten Stellung ist, ein Verschlußstab 44 eingreift, so daß der
Freigabeknopf in der unteren Stellung gehalten wird. Wird der Applikator nicht betätigt, so sitzt eine Schutzkappe
(nicht dargestellt) über der öffnung in der Abdekkung 12.
In Fig.6 sind weitere Einzelheiten der Applikatorspitze
46 gezeigt. Die Applikatorspitze weist eine Kapillaröffnung
47 zur Aufnahme der Probenflüssigkeit auf. Die Applikatorspitze 46 wird durch zwei unter Federkraft
stehende Splinte 49 an ihrer Stelle gehalten, so daß die Spitze leicht entfernt werden kann.
Die Applikatorspitze 46 kann unterschiedliche Länge oder Breite aufweisen, um so beispielsweise die Menge
der darin enthaltenen Probe zu verändern oder um mehr als eine Aufbringungssteile zu versorgen.
In den Fig. ID und 4C ist der Membranhalter 14 in
allen Einzelheiten dargestellt. Der Mcmbranhalter ist einstückig aus einem flexiblen Plastikmatcrial gegossen.
Der Halter weist Zähne 18 auf und läßt sich nach innen biegen, so daß die Zähne 18 in die entsprechenden Perforationslöcher
in einer Membran 16 eingreifen. Nach dem Freigeben geht von dem Haller 14 eine Zugkraft
auf die Membran aus, so daß letztere gespannt gehallen wird. Um ein Reißen der Membran zu verhindern, sind
die Zähne 18 vorzugsweise halbzylindrische oder zylindrische Vorsprünge, während die Membran-Perforationslöcher
113, siehe F i g. 19, rund sind.
Das elektrophoretische Gelsystem wird durch die Fig. 1A, 1B, 1F bis 1J,3 und 5 verdeutlicht, welche einen
auseinandergezogenen Querschnitt und eine Vorderansicht der zusammengesetzten Teile zeigen. In diesem
System sind die Membran 16 und der Membranhalter 14 durch eine Gelplatte oder -schale 103, eine Geltemperaturkontrollplatte
80 und einen Fließpapierstreifen 107 ersetzt.
Die Temperaturkontrollplatte 80 ist mit vier Haltern ausgestattet, von denen zwei, nämlich 82 und 84. gezeigt
sind. Die Halter 82 und 84 dienen dazu, eine viereckige
Schale 103 aufzunehmen und an der Stelle zu halten. Die Schale 103 enthält das Gelmaterial 104. z. B. ein AgarosegeL
welches zur Lipoproteintrennung verwendet werden kann. Eine Temperaturkontrollflüssigkeit. die von
der Flüssigkeitszufuhr 99 durch die Zuführöffnung 100 zugeführt und durch die Abführöffnung 102 abgeführl
wird, zirkuliert in der Platte 80; vgl. F i g. 5.
In F i g. 3 ist die Tcmperaturkontrollplatte 80 in dem
Behälter 10 angeordnet. Die quadratische Schale 103 mit dem Gel 104 ist auf die Platte 80 gesetzt und wird
r> von den Haltern 82, 84 an Ort und Stelle gehalten. Die
Schale 103 ist vorzugsweise aus einem Material hergestellt, das eine gute elektrische Isolierungswirkung hat
und eine gute thermische Leitfähigkeit aufweist. Darüber
hinaus muß die Schale gegenüber der Elcktrolytflüssigkeit inert sein. Da die Platte zur Aufnahme einer
quadratischen Schale ausgebildet ist, ist eine Drehung des Gelmediums um 90° möglich. Eine größere Auftrennung
kann erreicht werden, wenn man zwei Wanderungsrichtungen auf dem Gel 104 zuläßt. Zuerst wird die
Probe auf einem linearen Weg durch den elektrischen Strom iiuscinandcrgc/.ogeii. Danach wird die Gelschale
um 90" gedreht und es wird eine zweite Trennung in einer Richtung senkrecht zur ersten Richtung vorgenommen.
Der Kontakt mit der Elektrolytlösung erfolgt über die
Dochte 106, 108, welche an den Rändern auf dem Gel aufliegen und sich nach unten durch Dochtlöcher (nicht
dargestellt) in der Platte 80 in die Elektrolytlösung erstrecken. Der Behälter 10 weist Dochthalter 110 und 111
auf, die die unteren Enden der Dochte aufnehmen und diese in der Elektrolytlösung an der Stelle halten. Die
Dochthalter verhindern, daß die Dochte von dem Gel abgleiten und sie richten die Dochte aus, so daß sie das
Gel 104 gleichmäßig über die ganze Oberfläche berühren. Die Ausrichtung der Dochte verhindert, daß sich
ein Kontaktgradient ausbildet. Die Dochte 106 und 108 können beispielsweise aus Filterpapier oder einem
Kunststoffschwamm-Material bestehen.
Während des Elektrophoreseprozesses fließt elektrischer Strom durch das Gel 104 und bewirkt dabei die
Entstehung von Wärme in dem Gel. Durch die thermische Leitfähigkeit in dem Gel werden die Banden verbreitert,
was zu Fehlern führt infolge einer ungenügenden Auftrcnnung. Diese Verbreiterung der Banden wird
erleichtert, wenn man eine Flüssigkeit durch die Platte 80 leitet, deren Temperatur niedriger ist als die Umgebungstemperatur.
Bei einigen Maßnahmen hat es sich als günstig erwiesen, wenn die Plattentemperatur bei
etwa 4°C liegt. Fließpapierstreifen 107. die aus dcmselbcn
Material hergestellt sind wie die Dochte 106, 108 und die mit der Elektrolytlösung imprägniert sind, sind
längs der Ränder der Oberfläche des Gels 104 angeordnet,
um den elektrischen Kontakt zwischen dem Gel und den Dochten während der Elektrophorese zu erleichtern.
Die restlichen Figuren erläutern verschiedene Ausführungsformen von Schalen und Deckein bzw. Abdekkungen(Fig.
7 bis 16 und 20 bis 21A) sowie von Membranen (Fig. 17 bis 19) gemäß vorliegender Erfindung.
die in der eingangs erwähnten Apparatur zur Durchführung diagnostischer Untersuchungen und zu Identifizierungzwecken
verwendet werden können.
In F i g. 7 erkennt man eine Draufsicht auf eine Elektrophoreseschale
120, welche im wesentlichen aus ei-
nem quadratischen Behälter mit flacher Bodenfläche 128 und einer umlaufenden Wand 122 besteht Eine Anzahl
von geraden Unterteilungsrippen 121 trennen die Schalenfläche in einzelne Abteile, die dauerhaft gekennzeichnet
sind, indem in jedes Abteil 160 ein Buchstabe eingedruckt ist Die umlaufende Wand kann mit einer
oberen Kante 123 versehen sein, die eine Schulter 129 bildet, die mit einem entsprechenden umlaufenden Rand
an einer Abdeckung zusammenwirkt Die in Abteile un-
terteilte Schale 120 ist in F i g. 7A im Querschnitt dargestellt.
In Fig.8 ist daneben, ebenfalls im Querschnitt,
eine Ausführungsform einer üblichen Gelschale 103 dargestellt, die mit einer Gelschicht 104 gefüllt ist.
F i g. 9 zeigt eine Art einer Abdeckung für Gelschalcn 103, 120, welche im wesentlichen aus einer dünnen flachen
Platte 127 besteht, welche einen umlaufenden Rand 126 aufweist und so ausgebildet ist, daß sie dicht in
den umlaufenden Rand 123 an der Schulter 129 der Gelschalen 103, 120 paßt. Eine zusammengesetzte Anordnung
aus Schale und Abdeckung erkennt man in Fig. 14. Diese besteht aus der Schale 120, der Abdekkung
125, der Gelschicht 104 und der geschlitzten Membran 95, alle im Querschnitt dargestellt. Die Ausführungsformen
aus Schale und aufpreßbarer Abdeckung, die in den F i g. 7 bis 9 und 14 dargestellt sind, können
außerdem mit verschiedenen üblichen Hilfsmitteln zum dichteren Verschließen der Einheit und zum Stapeln
versehen sein.
Die Fig. 10 bis 13zeigen weitere Ausführungsformen
der Schalen und Abdeckungen gemäß vorliegender Erfindung, wobei entweder eine Abdeckung 135 in einer
von den Wänden einer Schale 130 gebildeten Laufrille oder aber eine Schale 140 in einer von den Wänden
einer Abdeckung 145 gebildeten Laufrille gleitet. Eine ausreichende Abdichtung der zusammengefügten Einheiten
aus Schale und Abdeckung kann auf verschiedene Weise erreicht werden. Beispielsweise können sowohl
die Schale 140 als auch die Abdeckung 145 an gegenüberliegenden Seiten mit senkrecht zu den Laufrillenwänden
131, 132 verlaufenden Endwänden (nicht dargestellt) versehen sein, so daß die Enden der Einheit
geschlossen sind. Es ist auch möglich, flache ebene Flächen (nicht dargestellt) oder Schultern in den Endwandbereichen
der Schalen vorzusehen, die dicht mit den Abdeckungsflächen zusammenpassen und so eine zusätzliche
Abdichtung bilden.
Fig. 15 zeigt in der Draufsicht eine Schale, die der
von Fig. 14 entspricht, jedoch mit der Ausnahme, daß
die Schale nur drei sie unterteilende Stege bzw. Rippen 121 aufweist. Kreisförmige Löcher 113 dienen zur Aufnahme
der Zähne 18 des Membranhalters 14, der in den Fig. ID und 4C gezeigt ist. In der Fig. 15 sowie im
Querschnitt derselben Schale, die in Fi g. 16 gezeigt ist,
erkennt man also eine Schale 130 mit vier Abteilen, die von den drei Stegen bzw. Rippen 121 gebildet werden.
Man erkennt weiterhin in Fig. 16 die zwischen den Laufrillen 131 gleitende Abdeckung 135. Die Abteile
sind mit einem Gel 104 gefüllt, auf welchem die Elektrophorese verschiedener Blutenzym- und Proteinsysteme
durchgeführt worden ist, sowie eine geschlitzte Membran 95, welche vier Streifen 160 aufweist, die mit den
Buchstaben A, B, C und D markiert und durch Schlitze 96 getrennt sind. Die geschlitzte Membran liegt über
dem GeL so daß sie die Proteine auf dem Gel mit den Enzymsubstraten oder Farbreagentien, mit denen sie
zuvor imprägniert worden ist, in Berührung bringt Auf diese Weise ist beispielsweise eine Blutserumprobe,
welche die Isoenzyme der Milchsäure-Dehydrogenase (LDH) enthält, auf das Gel 104 im Abteil A der Schale
130 aufgebracht worden, welche nach der elektrophoretischen Trennung mit dem Streifen A der Membran 95
in Berührung gebracht wurde, der zuvor mit Tetrazoliumfarbstoff
oder anderen üblichen Komponenten imprägniert worden ist, die dazu dienen können, das Elektrophoretogramm
dieses bestimmten Enzymsystems sichtbar zu machen. In entsprechender Weise wurden
die anderen Abteile und Streifen (B. C, D) verwendet.
um die Komponenten verschiedener polymorpher Enzyme des Blutes sowie anderer Proteinsysteme entweder
aus der gleichen Blutprobe oder aus Blutproben verschiedenen Ursprungs festzustellen und zu identifi-
1S zieren. In den übrigen Abteilen und unter Verwendung
der Streifen B. Cbzw. Dwurden so Kreatin-Phosphokinase
(CPK), alkalische Phosphatase (AP) und Gesamt-Protcin gleichzeitig elektrophoretisiert und entwickelt;
vgl.ebenfalls Fig. 15.
DieFig. 17 und 18 zeigen Draufsichten auf Teile von
zwei verschiedenen geschlitzten Membranen, die mit Substraten oder anderen farberzeugenden Reagentien
vorimprägniert worden sind, welche für die Proteinsysteme, die in den Zeichnungen angegeben sind, erforderlichsind.
So erkennt man in Fig. 17 fünf Streifen 116 einer durch Schlitze 96 getrennten Membran 115, die mit den
Buchstaben A, B, C, D und £ bezeichnet sind und die sich bis zu den umlaufenden Randflächen 116 erstrecken.
Die ganze Membran 115 kann aus Filterpapier hergestellt
sein, wobei die Randflächen 116 mit Paraffin getränkt
und die einzelnen Streifen mit Substraten oder Entwicklungsflüssigkeiten imprägniert sind, die für die
angezeigten Enzym- und Proteinsysteme, nämlich LDH (A), CPK (B), Plasmaprotein (C), Hämoglobin (D) sowie
andere Systeme (XYZ) (E) erforderlich sind. Nach dem Entwickeln kann die getrocknete Membran als dauerhafter
Nachweis des Elektrophoretogramms aufbewahrt werden.
In den Fig. 18 und 18A ist ein undurchlässiger Typ einer Membran dargestellt. Auch hier ist die Membran
136 wiederum durch Schlitze 96 in Streifen geteilt, wobei jeder Celluloseacetatstreifen (A, B, C, D) mit einem
bestimmten Enzymsubstrat und/oder Farbentwick-
J5 lungsystem wie angezeigt, nämlich CPK, LDH, Phosphoglucomutase (PGM) sowie anderen Systemen
(XYZ) auf dem Streifen A, B, C bzw. D imprägniert ist.
Ein wesentliches Kennzeichen dieser bestimmten Membran ist jedoch, daß die Celluloseacetatstreifen 138 von
einer inerten, resistenten und nicht porösen Polyesterplatte 137 (Mylar-Polyester) getragen werden, wie sich
besonders deutlich aus Fig. 18A ergibt, einem Querschnitt durch die Membran von Fig. 18. Weitere Polymersubstanzen
wie Polyamide, Polyimide, Polyäthylen, halogenierte Polyäthylene u. ä. können ebenfalls anstelle
eines Polyesters als inerte nicht poröse Unterlageplatte dienen, wenn dies im Einzelfall erwünscht ist.
Fig. 19 zeigt den Typ eines Musters, das sich auf
einer Membran nach der Trennung und der Farbentwicklung zeigt. Drei Streifen 200, 201 und 202 einer
Membran 95, welche durch Schlitze 96 getrennt sind, sind dargestellt. Jeder Streifenteil weist drei mit A, B
und C bezeichnete Kolonnen 160 auf. Auf jeden Streifen war eine andere polymorphe Blutenzymprobe aufgebracht
worden, die anschließend elektrophoretisch auseinandergezogen, d.h. zur Wanderung weg vom ursprünglichen
Aufbringungspunkt gebracht worden ist Der Aufbringungspunkt ist die erste Reihe (I) unter dem
Punkt A; von diesem aus geht die Wanderung zu den
M) Strichen, die in den Entfernungen II, HI, IV, V und Vl angezeigt sind. Standardpräparate polymorpher Systeme
laufen zusammen mit jeder unbekannten Probe in zwei unterschiedlichen Konzentrationen Bund C um so
die Identifizierung und die Mengenbestimmung der unbekannten Proben zu unterstützen. Durch Vergleich der
Komponenten der unbekannten Substanz in Kolonne A des Streifens 200 mit den benachbarten Kolonnen Bund
C läßt sich leicht erkennen, daß die Komponente IV der
10
15
20
25
Probe offensichtlich höher in der Konzentration ist als normal (B, C). Dasselbe gilt für die Menge der Komponente
VI der Probe im Streifenteil 202. Bei der Probe im Streifen 201 erkennt man andererseits, daß die Komponente
V fehlt und daß eine Komponente Vl aufscheint, die in den Standardpräparaten ßund Cnicht vorhanden
ist. In diesem Fall handelt es sich also um den Typ des gleichzeitig hergestellten Ein-Blatt-Nachweises, der mit
der Vorrichtung und der Arbeitsweise gemäß vorliegender Erfindung durchgeführt werden kann und der zur
Identifizierung und quantitativen Bestimmung von bis zu 10 verschiedenen oder gleichen Proteinsyslemen aus
einer Blutprobe oder von bis zu 10 Blutproben dienen kann. Mit solchen Profilen wird die Aufgabe der Diagnostizierung
verschiedener klinischer Zustände oder die Identifizierung von Klassen von Individuen erheblich
vereinfacht infolge der Menge an Information, die gleichzeitig auf einem Elektrophoretogramni erzeugt
und beobachtet werden kann.
F i g. 20 stellt eine Draufsicht auf die bereits beschriebene quadratische Schale 103 dar, welche mit einem
Polyacrylamid-Gel 104, in welchem Ampholinc dispergiert
sind, gefüllt ist; diese Art von Isomeren von PoIyaminopolycarbonsäuren werden üblicherweise für Elektrofokussierungsverfahren
mit hoher Trennschärfe verwendet. Nach Anlegen eines elektrischen Feldes mit Hilfe von speziellen Elektroden (nicht dargestellt), welche
direkt auf die Oberfläche des Gels gesetzt werden, bildet sich ein linearer pH-Gradient aus und die in einem
solchen Gradienten elektrophoresierten Proteinmoleküle konzentrieren sich in sehr schmalen Zonen, in welchen
die elektrische Nettoladung an einem gegebenen Molekül Null ist. In einem solchen System ist die einzige
Variable, die die Trennung beeinflußt, der isoelektrische Punkt eines gegebenen Proteins. Es ist nicht erforderlich,
in den Behälter 10 der Grundapparatur gemäß Fig. IA eine Pufferlösung zu geben. Die Kühlung des
Gels mit der Platte 80 gemäß Fig.3 und 5 ist sehr
wichtig, weil eine sehr hohe Spannung angelegt wird, die eine hohe Stromstärke zur Folge hat, was wiederum die
Entwicklung einer großen Wärmemenge bedeutet, die sofort abgeführt werden muß. Die erfindungsgemäße
Apparatur erlaubt es, die Elektroden in beliebiger Richtung anzubringen. Darüber hinaus bietet sie eine einfache,
leicht standardisierbare Alternative zu der schwierigen Herstellung von Gelen unmittelbar vor der Verwendung,
eine Alternative, die hinsichtlich der Handhabung, des Transportes und der Lagerung den bisher
handelsüblichen flexiblen Platten überlegen ist.
F i g. 21 ist eine Draufsicht auf eine Schale 103, welche ein zuvor eingegossenes Gel 104 enthält. In dem Gel
sind in einer Reihe 10 rediieckige Vertiefungen i4S zur
Aufnahme von Proben gemacht worden. Der Teil der Schale, der die zur Probenaufnahme bestimmten Vertiefungen
148 enthält, ist in vergrößertem Maßstab in F i g. 22 dargestellt, um weitere Einzelheiten zu zeigen.
Die Schalen-Schablonen-Einheit erkennt man weiterhin in der Fig.22A (in Draufsicht) und in Fig.22B (im
Querschnitt).
In diesen Figuren erkennt man, daß die umlaufende ω
Wand 122 der Schale 103 mit zwei zylindrischen Vertiefungen 149 versehen ist, die zur Aufnahme von Stiften
151 dienen, mit welchen ein entfernbarer Kunststoffeinsatz bzw. eine solche Schablone 15 in der Schale befestigt
werden kann. Die dargestellte Schablone 150 weist zehn Zungen 152 auf. mittels welcher die Vertiefungen
148 in dem Gel ausgebildet werden, wenn dasselbe zuerst in die Schale 103 gegossen wird und um die Vcrticfungen
in der Zeit zwischen der Herstellung und der Verwendung des Einsatzes frei von Flüssigkeit zu halten.
Die in Fig. 21 dargestellte Schale mit dem eingegossenen
Gel wurde also in der Weise hergestellt, daß zunächst der Einsatz bzw. die Schablone 150 in eine
leere Schale 103 eingesetzt wurde, indem die Stifte 151 in die Vertiefungen 149 gesteckt wurden. Ein Gel bildendes
flüssiges Präparat wurde dann in die Schale gegossen, so daß sich nach dem Abkühlen das Gel 104
bildete. Die Schale mit dem Gel wurde mit einer geeigneten Abdeckung (nicht dargestellt) versehen; in dieser
Form kann die Einheit zum Versand gebracht oder gelagert werden, ohne daß eine Beschädigung befürchtet
werden muß, bis sie für die Elektrophorese gebracht wird. Zu diesen^ Zeitpunkt wird der Plastikeinsatz bzw.
die Schablone !50 entfernt und Proteinproben und Slandardpräparate können in die Vertiefungen 148 des
Gels für die Elektrophorese gegeben werden. Diese vorstehend beschriebene Art einer Schale wird hauptsächlich
für die genetische Typisierung von polymorphen Proteinen verwendet, beispielsweise für die die Bestimmung
des Haptoglobin-Hämoglobin-Komplexes; sie kann jedoch auch zur Trennung vieler anderer Proleingemischc,
die ein hochwirksames Trennmedium wie Acrylamidge! erfordern, verwendet werden. Das PoIyacrylamidgcl
in der Schale kann entweder eine durchgehend gleichmäßige Polymerkonzentration oder eine
sich linear oder stufenweise ändernde Konzentration aufweisen. Die Polyacrylamidmoleküle wirken als ein
mechanisches Sieb, welches sowohl die Trennung als auch die Abscheidung unterstützt.
In F i g. 23 ist eine quadratische Schale mit einem eingegossenen
Gel dargestellt, in welcher die Verwendung spezifischer Anliseren bei der Kreuz-und-Quer-Elektrophorese
bei der Analyse von australischem Antigen (infektiöse Hepatitis), Syphilis und anderen Infektionskrankheiten
möglich ist. Die Schale und die Methode können auch zur Artenidentifizierung bei der Prüfung
von frischem oder getrocknetem Blut oder anderen physiologischen Flüssigkeiten eingesetzt werden. Man
erkennt aus den Zeichnungen, daß die vorbereitete GcI-schalc
103 im Grundsätzlichen der von Fig.21 entspricht, jedoch mit der Ausnahme, daß die Gelschicht
104 mit drei Linienpaaren von je 10 Vertiefungen 148 verschen ist, wobei die Linien mit 1,2,3,4, 5 und 6 (160)
bezeichnet sind. Die Schalen werden in derselben Weise hergestellt wie die von Fig. 21, wobei jedoch 6 Plaslikschablonen
anstelle einer einzigen (150), die für die Schalen der Fig. 21 bis 22B benutzt wurde, verwendet
werden müssen.
Die Schablonenstifte 151 (Fig.22A und 22B) fassen
in zylindrische Vertiefungen J4S und die Schale- wird
dann in der bereits beschriebenen Weise mit Gel gefüllt. Vor der Verwendung werden die Schablonen
entfernt, so daß die Vertiefungen 148 zur Aufnahme von Antigen- und Antiserumproben frei liegen. Die Gelvertiefungen
werden paarweise verwendet wobei die Antigenprobe in die Vertiefung gegeben wird, die auf der
elektrisch negativen Seite des Paares (Reihen 1,3 und 5) liegt, die durch ein Minuszeichen (—), welches auf die
linke Seite der umlaufenden Schalenwand 122 gedruckt ist, angezeigt ist; die spezifische Antiserumprobe wird in
die Vertiefung auf der positiven Seite des Paares (Reihen 2, 4 und 6) gegeben. Wird Spannung an die bis zu
30 Proben in der Schale gelegt, so wandern die Antigen- und Antiserumproteine aufeinander zu und reagieren,
wenn sie sich kreuzen oder treffen, und erzeugen eine sichtbare Nicderschlagslinic. Neun solcher Linien 205,
40
50
55
11
die sich nur zwischen bestimmten Paaren gebildet haben,
sind in Fig. 23 zu erkennen. Das Kehlen einer solchen
Niederschlagslinie zwischen einem Paar von Vertiefungen zeigt die Abwesenheit des spezifischen Antigens
in der Probe, die in die linke Vertiefung des Paares 5 gegeben worden war, an.
Bei der Herstellung der verschiedenen vorbereiteten Gelschalen und Membranen der vorstehend beschriebenen
Art ist es möglich, die Zugabe aller instabilen Subitrate und Reagentien zu dem vorbereiteten Gel 10
bzw. der vorbereiteten Membran bis zum Augenblick der Verwendung hinauszuzögern. Im Falle von Membranen
ist es jedoch auch möglich, instabile lngredientien sicher zum Zeitpunkt der Herstellung der Membran
einzuschließen, indem man die Technik der Gefrier- 15 trocknung anwendet.
Hierzu 7 Blatt Zeichnungen
20
25
JO
40
45
50
55
60
65
Claims (2)
1. Mikroelektrophcretische Vorrichtung zum
Trennen und Identifizieren von Komponenten von zwei oder mehr Proteinsystemen, mit einer durch
Stege unterteilten und mit Gel gefüllten Schale, die in voneinander getrennten Abteilen zu untersuchende
Eiweißgemische enthält,
dadurch gekennzeichnet,
daß sie eine Membran (16,95,115,136,160) aufweist, die eine Polymer-Grundschicht (137) und eine darauf aufgebrachte Celluloseacetatschicht (138) aufweist und die durch Schlitze (96) in Streifen (116, 138) unterteilt ist, welche in Abteile (160) der Schale (120, 130,140) passen und in direkte Berührung mit dem Gel (104) bringbar sind,
daß sie eine Membran (16,95,115,136,160) aufweist, die eine Polymer-Grundschicht (137) und eine darauf aufgebrachte Celluloseacetatschicht (138) aufweist und die durch Schlitze (96) in Streifen (116, 138) unterteilt ist, welche in Abteile (160) der Schale (120, 130,140) passen und in direkte Berührung mit dem Gel (104) bringbar sind,
daß jeder Streifen (116,138) mit einem farbbildenden
Reagens, das für ein polymorphes Proteinsystem spezifisch ist, vorimprägniert ist.
und daß dieses Reagens aus der Gruppe gewählt ist die folgende Substanzen umfaßt: Milchsäure, Dehydrogenase (LDH), alkalische Phosphatase (AP). Kreatin-Phosphokinase (CPK), Erythrocytsäure-Phosphatase (EAP), Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase (G-6PD), Adenylatkinase (AK), gruppenspezifische Komponente (Gc), Lipoprotein (Lp), Adcnosin-Deaminase (ADA), 6-Phosphoglukonat-Dehydrogenase (6-PGD), Glutamin-Pyruvin-lransaminase(GPT), Esterase D (EsD).
und daß dieses Reagens aus der Gruppe gewählt ist die folgende Substanzen umfaßt: Milchsäure, Dehydrogenase (LDH), alkalische Phosphatase (AP). Kreatin-Phosphokinase (CPK), Erythrocytsäure-Phosphatase (EAP), Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase (G-6PD), Adenylatkinase (AK), gruppenspezifische Komponente (Gc), Lipoprotein (Lp), Adcnosin-Deaminase (ADA), 6-Phosphoglukonat-Dehydrogenase (6-PGD), Glutamin-Pyruvin-lransaminase(GPT), Esterase D (EsD).
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß die Polymer-Grundschicht (137) aus Polyester, Polyamid, Polyimid, Polyethylen oder halogeniertem
Polyethylen besteht.
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